THEME 1A – Expression, stabilité et variation du patrimoine génétique TP5 – La variabilité de l’ADN : les mutations

Certains produits chimiques (molécules cancérigènes …) et rayonnements (UV, rayons gammas, rayons X) sont dangereux pour la santé. Nous savons qu’ils

peuvent désorganiser le fonctionnement de la cellule en produisant des mutations. Nous allons voir un exemple concret de mutation chez les levures (Saccharomyces cerevisiae, souche Ade 2) à la suite d’une irradiation par les UltraViolets (UV). Problématique : Pourquoi les UV sont-ils dangereux, quel est leur effet sur l’ADN et plus généralement sur les organismes ?

Matériel : - Suspension de levures Ade2, boites de pétri stériles, pipette, étaleur, gants, lunettes, charlotte, masque - Ordinateur muni du logiciel MESURIM, photographies des résultats de l’expérience et du logiciel ANAGENE et du fichier Ade2.edi

Activités et déroulement des activités Capacités et critères de réussite Barème

1- Proposez une hypothèse pour répondre à la problématique et concevoir un protocole expérimental qui permettrait de vérifier votre hypothèse. Vous disposez du matériel suivant :

- Souche de levure Ade2, ces levures sont rouges mais deviennent blanches quand lors qu’une séquence (gène Ade2) d’ADN est mutée.

- Boites de pétri stériles contenant un milieu de culture pour les levures - Matériel stérile de mise en culture des levures - Lampe UV et matériel de protection (blouse, lunettes, gants, charlotte, masque)

2. Réalisez la manipulation dans les conditions les plus propres possibles. NB : La croissance des levures nécessite 4 à 7 jours. Pour la suite du TP, vous utiliserez donc les résultats

proposés par le professeur (photographies des boites de pétri à 7 jours). 3. Dénombrez les colonies rouges et blanches aux différents temps d’exposition. Grâce au logiciel Mesurim (voir fiche « aide technique Mesurim) et aux les photographies fournies. Consignez vos résultats dans un tableau à double entrée. REMARQUE : si les colonies sont trop nombreuses (boites 0 et 30 secondes), vous pouvez restreindre votre comptage à la moitié ou le quart de la boite (attention aux calculs nécessaires). 4. Comparer les séquences Ade2 des levures rouges et blanches au moyen du logiciel ANAGENE. Ce gène Ade2 est responsable de la couleur des levures. Quelle différence observez-vous ? 5. Rédigez un texte scientifique qui résume vos observations. 6. Rangez le matériel utilisé.

Emettre une hypothèse Concevoir un protocole

(schématiser rapidement les différentes étapes afin de savoir quel matériel sera utile à quel moment)

Réaliser une manipulation en suivant un protocole expérimental

(Travailler proprement et TRES CALMEMENT)

Utiliser un logiciel de traitement de données (MESURIM)

(Suivre la fiche technique MESURIM) Réaliser un tableau à double entrée

Utiliser un logiciel de traitement de données (Suivre la fiche technique ANAGENE)

(ANAGENE)

Rédiger un texte scientifique (Utiliser le vocabulaire scientifique ; Phrases et

paragraphes courts)

Gérer et organiser le poste de travail

Protocole de mutagenèse chez les levures (Ade2) en conditions « pseudo » stérile

Matériel : (contenu dans un bac « pseudo »stérile : cotons imbibés d’alcool)

• Tube de suspension de Levures (souche rose Ade2- ) STERILE ! • Boîtes de Pétri avec milieu de culture gélosé STERILE ! • Plan de travail stérile : feuilles de papier emballées dans de l’aluminium STERILE ! • Etaleur plastique (vert) STERILE (sous plastique) ! • Pipette Pasteur STERILE (sous plastique) ! • Hotte à U.V. (allumée depuis 30 min.) et contenant un couvercle ‘coupé’ pour irradier par quart. • Alcool • Eau de Javel

Protocole Préparation de la paillasse : • Lire les consignes de sécurité liées à la manipulation (ci contre). • Nettoyer votre plan de travail avec de la Javel. • Se laver les mains et les désinfecter à l'alcool. • Déployer votre plan de travail stérile (ouvrir l’aluminium pour qu’on voie les feuilles de papier). • Sans ouvrir les boites, indiquer au feutre vos noms, votre classe, votre groupe, ainsi que les temps d’exposition. Pour cela, vous diviserez la boite en 4 quarts égaux : chaque quart servira pour un temps d’exposition. Mise en culture des levures : • Agiter la suspension de Levures (celles-ci se déposent au fond du tube) • Ouvrir le tube en prenant soin de ne pas faire entrer d’air et de ne pas toucher le bord du tube. • Sortir délicatement la pipette pasteur de son emballage. • Prélever un peu de la suspension avec la pipette Pasteur stérile. • Déposer deux gouttes au centre de la boîte de pétri maintenue entrouverte (travaillez le plus rapidement possible et refermez dès que c’est terminé). • Sortir délicatement l’étaleur de son emballage. • Etaler les 2 gouttes avec l'étaleur stérile sur le milieu gélosé de façon parfaitement uniforme (procédez comme pour étaler de la pâte à crêpe). Etalez la suspension jusqu'à ce que la surface soit sèche (mouvement circulaire et répété). Exposition aux UV : • Eteindre la lampe UV !!! Déposer la boîte sous la lampe à U.V, bien au centre (juste sous la lampe). • Enlever le couvercle de la boîte de Pétri et le placer à l'envers à coté de la boîte. • Placer le couvercle ‘coupé’ (avec un quart libre) de façon à exposer un quart de la boite. • Le chronométrage doit être fait avec 2 chronos (possibilité de faux départ) • Attention de ne pas exposer le quart pour le temps ZERO (témoin) ! • Exposer aux U.V. chaque quart en chronométrant précisément 30 puis 60 puis 120 secondes. • A chaque fois que vous déplacez le couvercle coupé, pensez à éteindre la lampe UV. • A la fin des expositions, éteindre la lampe et remettre le couvercle d'origine et laisser le couvercle coupé dans la boite à UV (retourné vers le haut). • Sortir la boîte de la hotte et scotcher le couvercle puis déposer votre boite sur la paillasse professeur. • Refermer la boite et rallumer la lampe UV pour que son intensité ne faiblisse pas et améliorer les conditions stériles. • Ranger la paillasse et déposer les chronos sur la boite.

Consignes de sécurité

1. Utilisation des rayons ultraviolets :

Les UV utilisés dans cette expérience sont très efficaces pour muter l’ADN (longueur d’onde spécifique) et ils sont très concentrés (forte intensité) !! Il faut éviter toute exposition aux U.V. puisqu'ils peuvent causer des lésions graves des yeux et de la peau. Le plastique est imperméable aux U.V. Pour cela, suivre impérativement les consignes suivantes : - Toujours vérifier que la lampe UV est éteinte avant d’ouvrir la boite à irradiation ! - Ne pas regarder la lampe de face : si la boite présente des reflets violets clairs : elle est allumée ! - Ne pas manipuler à mains nues (port de gants).

REMARQUE :

- le plastique arrête les UV (le risque est donc très faible tant que la boite à UV est fermée). - Ne pas oublier d’ouvrir les boites de Pétri sinon, les levures ne seront pas irradiées.

2. Les risques biologiques :

Faire pousser des Levures n'est pas un acte dangereux mais le milieu de culture utilisé convient très bien à d'autres microbes dont certains peuvent être pathogènes. Pour cette raison, la manipulation doit se faire dans des conditions les plus stériles possibles : Avant la manipulation : - La blouse est parfaitement propose et fermée ! - Les cheveux sont attachés et emballés dans une charlotte - Le plan de travail et le matériel ont été stérilisés. - Les mains devront être lavées au savon puis désinfectées à l'alcool (régulièrement), le reste du travail

se fera avec des gants qui pourront également être désinfectés. - Les manipulations des levures et des boites se feront au sein de plan de travail « pseudo » stérile (à

n’ouvrir qu’au dernier moment !) - Les déplacements et les gestes inutiles seront évités (valable pour toute la classe). - Ne pas tousser, rire, parler et souffler près du plan de travail (valable pour toute la classe). Pendant la manipulation : - Anticiper chaque geste pour éviter de se retrouver dans une situation contaminante. - Pensez à bien annoter vos boites (Noms, groupe, temps d’irradiation) - Ne rien ouvrir inutilement (perte de stérilité) - Limiter le temps où les boites, tubes, pipette et étaleur sont ouverts (plus le temps passe, plus la

contamination est importante) et travailler rapidement (mais proprement). - Ne pas toucher le col des tubes, les milieux, les parties des outils qui seront en contact avec les levures. - Pour éviter d'ouvrir la boîte de Pétri accidentellement, la faire glisser jusqu'au bord de la table pour

pouvoir la prendre à pleines mains. - En fin de manipulation, les boîtes seront fermées à l'aide de ruban adhésif. La lecture des résultats (4

jours à une semaine après) s'effectuera sans les ouvrir. Elles seront par la suite stérilisées avant d'être jetées.

FICHE TECHNIQUE : COMPTAGE OU MESURE AVEC MESURIM

Mesurer des angles Mesurer une surface

«Choix/Outil de mesure/Angle»

Tracer à la souris deux segments en partant du sommet de l’angle à mesurer, des flèches apparaissent à l’opposé du sommet.

la valeur de l’angle s’affiche en bas de l’écran ATTENTION : la valeur affichée est celle de l’angle compris entre

le premier et le deuxième segment dans le sens trigonométrique

et choisir sa couleur et son épaisseur «Image/Délimiter des zones» - Colorer grossièrement un élément, puis un autre avec une autre couleur et ainsi de suite, faire de même avec le fond - Cocher «étendre la classification à tous les pixels» : le résultat s’affiche pour chaque élément en % de la surface totale de l’image ou en unité de surface si l’échelle a été définie

Compter des objets et présenter graphiquement les résultats

Compter des objets - Cliquer «Outils/Comptage» - choisir dans la fenêtre flottante le nombre de séries à compter ; des couleurs par défaut sont attribuées à chaque série. Remplacer si nécessaire les numéros

par des noms plus évocateurs - cocher la ligne 1 et repérer dans l’image un objet appartenant à la classe 1 - cliquer sur l’objet, un point de la couleur de la classe s’affiche sur l’objet en même temps qu’il est comptabilisé dans le tableau. - faire de même avec les autres objets de la série - utiliser la même méthode pour les autres lignes.

Pour effacer un point cliquer dessus puis cliquer «oui» dans la fenêtre «Avertissement».

Construire un graphique - Cliquer «Outils/Tableau» et cocher la première ligne. - Reporter les valeurs du compteur dans le tableau (en X le n° des séries et en Y le nombre d’objets comptabilisés) - Double-cliquer sur le graphique pour modifier sa présentation.

REMARQUE : Il est possible d’enregistrer le tableau en fichier texte pour le traiter dans un tableur (Excel ou OpenOffice) et construire un histogramme.

Mesurer les dimensions d’un objet connaissant l’échelle Créer une échelle

- Sélectionner l’image.«Image/Créer/Modifier l'Échelle» - cocher «Échelle déjà mémorisée» et choisir le nom de l’échelle

à utiliser - tracer une ligne à la souris sur la partie de l’objet à mesurer : la

mesure s’affiche en bas à droite.

- «Image/Créer/Modifier l'Échelle» et cocher «Échelle à définir» - Tracer une ligne avec le curseur de la souris sur une partie de l’image de calibrage dont la

dimension est connue. - Reporter en bas dans les cases correspondantes, son unité et sa valeur. - «transférer l’échelle» et cocher «Ajout temporaire». Choisir un Nom pertinent.

Réaliser une lecture optique d’une bande d’électrophorèse

- Ouvrir une image scannée de la bande d’électrophorèse - tracer un trait à la souris sur la totalité de la bande - «Choix/Outil de mesure/Lumière sur une bande» - dans le menu flottant «Mesure d’intensité de couleur sur une ligne», choisir une largeur de bande d’une dizaine de pixels - cocher «Tout», «Mesure en absorption» et «Mesure linéaire» - mesurer pour afficher le graphique.

FICHE TECHNIQUE : COMPARAISON - CONVERSION AVEC ANAGENE

Les icônes de la barre d’outils Numérotation des éléments d’une séquence

Echelle de repérage des nucléotides

Echelle de repérage des acides aminés Attention au décalage des numéros

Cliquer sur l’échelle pour passer de l’échelle des nucléotides à celle des acides aminés.

Utiliser le curseur

Surligner pour sélectionner la partie de la séquence choisie. Cliquer sur l’icône « grand curseur ».

Bulles d’aide

Une bulle d’aide s’affiche sur l’objet pointé par le curseur de la souris

Editer une séquence Sélectionner une séquence

Sélectionner cette séquence dans l’un des répertoires d’Anagène :

Banque de séquences

Thèmes d’étude

Programmes et documents ou par «Fichier / Ouvrir / sauve»

Cliquer sur le bouton de sélection. La séquence sélectionnée s’inscrit sur fond blanc. On peut sélectionner plusieurs séquences. La flèche rouge indique la ligne pointée, sur laquelle il est possible d’obtenir des informations et que l’on peut déplacer à l’aide des flèches grises, haut - bas.

Convertir une séquence Comparer des séquences Menu «traiter / convertir ces séquences». Pour traiter une séquence, elle doit être au préalable sélectionnée.

ATTENTION : pour comparer, la séquence de référence est toujours celle qui est placée en premier. Menu «traiter / comparer les séquences» ou «convertir ces séquences». Pour traiter une séquence, elle doit être au préalable sélectionnée. La comparaison des séquences ne peut se faire que sur des séquences de même nature. Les flèches grises haut-bas permettent de placer la séquence de référence. Deux comparaisons possibles :

La comparaison par alignement permet de comparer avec discontinuité, en éliminant les décalages résultant de délétion(s) ou d’insertion(s), les valeurs affichées sont des ressemblances (identités),

La comparaison simple permet de comparer point par point des séquences sans aucun alignement, les valeurs affichées sont des différences.

Informations sur la ou les séquence(s) sélectionnée(s) Menu «informations / sur la ligne pointée» pour obtenir des informations sur la sélection : soit d’une ligne, soit de toutes les lignes en cliquant d’abord devant « traitement ». Attention : les pourcentages obtenus portent soit sur des différences soit sur des ressemblances.

Créer des séquences Menu «Fichier / créer». Choisir le type de séquence et le nommer. Taper ou choisir dans la fenêtre d'«édition de séquences», votre séquence.