These Benabdelkader Tarek 2012

Rsum

TTHHEESSEE En cotutelle prsente lENS de Kouba, Algrie

PPoouurr lloobbtteennttiioonn dduu ggrraaddee ddee

DDoocctteeuurr

ddee llEEccoollee NNoorrmmaallee SSuupprriieeuurree ddee KKoouubbaa--AAllggeerr,, AAllggrriiee eett

ddee llUUnniivveerrssiitt JJeeaann--MMoonnnneett ddee SSaaiinntt--EEttiieennnnee,, FFrraannccee

DDiisscciipplliinnee :: BBiioollooggiiee eett EEccoopphhyyssiioollooggiiee VVggttaallee

ppaarr

BBiiooddiivveerrssiitt,, BBiiooaaccttiivviitt eett BBiioossyynntthhssee ddeess CCoommppoosseess TTeerrppnniiqquueess VVoollaattiillss ddeess LLaavvaannddeess AAiilleess,, LLaavvaanndduullaa ssttooeecchhaass SSeennssuu LLaattoo,, uunn CCoommpplleexxee

ddEEssppcceess MMddiitteerrrraanneennnneess ddIInnttrrtt PPhhaarrmmaaccoollooggiiqquuee

Thse codirige par les Professeurs Abdelkrim KAMELI et Laurent LEGENDRE

Soutenue le octobre 2012 devant le jury compos de :

M. Nasserdine SABAOU, Professeur, Ecole Normale Suprieure de Kouba-Algrie Prsident

M. Chabane CHELGHOUM, Professeur, USTHB dAlger-Algrie Rapporteur M. Benoit ST-PIERRE, Professeur, Universit Franois Rabelais de Tours-France Rapporteur

M. Mohamed YOUSFI, Professeur, Universit Amar Tlidji de Laghouat-Algrie Examinateur

M. Abdelkrim KAMELI, Professeur, Ecole Normale Suprieure de Kouba-Algrie Directeur de thse

M. Laurent LEGENDRE, Professeur, Universit Jean Monnet de Saint Etienne-France Directeur de thse

M. Frdric JULLIEN, Matre de confrences, Universit Jean Monnet de Saint Etienne-France Invit

Thse ralise conjointement au laboratoire de Biotechnologies Vgtales appliques aux Plantes Aromatiques et Mdicinales (BVPAM-EA3061), Facult des Sciences et Techniques, Universit Jean Monnet de Saint Etienne, au laboratoire de Recherche sur les Produits Bioactifs et Valorisation de la Biomasse (LRPBVB) et au laboratoire de

Biologie des Systmes Microbiens (LBSM), Ecole Normale Suprieure de Kouba, Algrie

ECOLE NORMALE SUPERIEURE, KOUBA-ALGER DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

UNIVERSITE JEAN MONNET-SAINT ETIENNE FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

Ecole Doctorale : Sciences, Ingnierie et Sant

tel-0

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Thse de Doctorat

Ecole Normale Suprieure de Kouba-Alger/Universit Jean Monnet de Saint Etienne BBiiooddiivveerrssiitt,, BBiiooaaccttiivviitt eett BBiioossyynntthhssee ddeess CCoommppoosseess TTeerrppnniiqquueess VVoollaattiillss ddeess LLaavvaannddeess AAiilleess,, LLaavvaanndduullaa ssttooeecchhaass SSeennssuu LLaattoo,, uunn CCoommpplleexxee ddEEssppcceess MMddiitteerrrraanneennnneess

ddIInnttrrtt PPhhaarrmmaaccoollooggiiqquuee

BBiiooddiivveerrssiitt,, BBiiooaaccttiivviitt eett BBiioossyynntthhssee ddeess CCoommppoosseess TTeerrppnniiqquueess VVoollaattiillss ddeess LLaavvaannddeess AAiilleess,, LLaavvaanndduullaa ssttooeecchhaass SSeennssuu LLaattoo,, uunn CCoommpplleexxee

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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



Thse cofinance par une bourse de coopration Algro-Franaise (PROFAS ex. BAF) et

par une bourse CMIRA de la rgion Rhne Alpe-France

Adresse des Laboratoires :

Laboratoire de Biotechnologies Vgtales appliques aux Plantes Aromatiques et

Mdicinales

Facult des Sciences et Techniques

23 rue du Docteur Paul Michelon

42023 Saint-Etienne Cedex 2

France

Laboratoire de Recherche sur les Produits Bioactifs et Valorisation de la Biomasse

Laboratoire de Biologie des Systmes Microbiens

Ecole Normale Suprieure

BP 92 Kouba

16000 Alger

Algrie

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A la mmoire de ma mre qui ma quitte dlaisse au milieu de la route,

A mon pre,

A ma femme Hayet,

A mon fils Mohamed Ishak qui est venu au milieu de cette thse,

A mes frres et surs,

A tous ceux qui me sont chers,...

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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



RREEMMEERRCCIIEEMMEENNTTSS

En premier lieu et avant tout je tiens remercier DIEU le tous puissant qui ma donn le courage, la patience et la force de terminer ce travail.

La majorit de cette thse a t ralise au laboratoire de Biotechnologies Vgtale

applique aux plantes aromatiques et mdicinales (BVpam) de la Facult des Sciences et

Techniques de Saint Etienne, dirig par le Pr. Laurent LEGENDRE puis par le Pr. Sylvie

Baudino-Caissard et une petite partie aux laboratoires de Recherche sur les Produits

Bioactifs et Valorisation de la Biomasse (RPBVB) et sur la Biologie des Systmes

Microbiens de lENS dAlger, dirigs par le Pr. Nasserdine SABAOU. Je souhaite tous les remercier ici pour laccueil et les facilits quils mont rservs au sein des laboratoires.

Je tiens tout d'abord remercier mon co-directeur de thse Mr. L. LEGENDRE, qui a

bien voulu m'encadrer et m'accueillir dans son labo et dans son quipe pendant ce projet

et de m'avoir donn la chance de raliser un projet dans un domaine qui ne m'tait pas

vraiment familier et dans lequel j'ai beaucoup appris. Sans sa confiance et ses

encouragements, le projet n'aurait jamais pu s'acheminer. Il s'est d'autant plus investit, en

me permettant d'acqurir une exprience unique de recherche en biologie molculaire. De

plus, L. LEGENDRE m'a soutenu durant tout ce projet par ses conseils et son optimisme.

L'ambiance qu'il fait rgner dans son laboratoire a de plus grandement contribu au

maintien de ma motivation et au plaisir de travailler avec lui.

Dans un deuxime temps, je remercie d'une faon toute particulire, mon directeur de

recherche, Mr. Abdelkrim KAMELI, professeur chercheur l'Ecole Normale Suprieure

de Kouba. Je ne serais pas arriv jusque l sans laide de M. KAMELI. Je le remercie pour la qualit de ses conseils, pour sa disponibilit et pour son investissement constant.

Je remercie Mr. N. SABAOU de mavoir honor en acceptant la prsidence de ce jury de thse.

Je tiens exprimer ma reconnaissance aux membres du jury, Mr. Chabane

CHELGHOUM, Professeur, USTHB dAlger-Algrie, Mr. Benoit ST-PIERRE, Professeur, Universit Franois Rabelais de Tours-France et Mr. Mohamed YOUSFI,

Professeur, Universit Amar Telidji de Laghouat-Algrie, qui ont accepts dvaluer ce travail.

Je tiens galement dire un merci bien spcial Mr. Frdric JULLIEN et Mr. Jean-

Louis MAGNARD, Matres de confrences chercheurs au BVpam pour leur soutien,

d'orientation, de l'enthousiasme et les critiques constructives au cours de cette tude.

Le travail n'aurait jamais pu tre complt sans l'utilisation du GC/MS du CNRS de

Solaize-Lyon avec la participation de M. Herv CASABIANCA et Dany MAITRE et le

GC/MS de lIUT de Saint Etienne avec la participation de Mr. Alain PIOT.

Mes recherches nauraient pas t possibles sans les facilits octroyes par Mr. Bernard PASQUIER (Directeur du Conservatoire National des Plantes Parfum, Mdicinales,

Aromatiques et Industrielles de Milly la Fort), merci vous Mr. Bernard de nous avoir

ouvert laccs ton jardin et tes serres de la collection unique de lavandes.

Remerciements te

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Thse de Doctorat



Cette recherche de longue dure n'aurait pu se faire sans l'appui financier de la rgion

Rhne Alpe, France, ni sans la bourse de coopration Algro-Franaise. Tous ces

donateurs m'ont permis d'acheminer cette recherche l'abri des inquitudes montaires.

Jadresse de sincres remerciements lensemble de mes collgues et amis du BVpam que ce soit pour les conseils, les services et plus particulirement pour lamiti quils mont tmoigns. En l'occurrence, Romain, Janna, Nadine, Nicolas, Jean-Claude, Sandrine,

Florence N, Yann, Sylvain, Karine, Alison, Florence G et Audrey. Merci vous tous. Je

vous souhaite tous bonheur, russite et tout le bien que vous mritez.

Enfin, je voudrais remercier ma femme, HAYAT et mon fils, MOHAMED ISHAK qui ont

survcu aux alas d'un mari et dun pre proccup et souvent absent surtout en phase finale. Lachvement de cette tude n'aurait pas t possible sans leur amour

inconditionnel, le soutien et la patience.

En terminant, je souhaite dmontrer ma plus sincre gratitude toutes les personnes ayant

particip de prs ou de loin la ralisation de ce projet, savoir, Leila, Ahmed, Tayeb,

Cherif, Abdeghani, Farida.

Merci tous !

T. Benabdelkader

Remerciements te

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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



Ce travail de thse a donn lieu prsentation des rsultats sous forme de :

Publications

Article1 (Annexe I): Tarek Benabdelkader, Abdelghani Zitouni, Yann Guitton, Frdric

Jullien, Dany Maitre, Hrve Casabianca, Laurent Legendre and Abdelkrim Kameli. 2011.

Essential

oils from wild populations of algerian Lavandula stoechas L.: composition,

chemical variability and in vitro biological properties. Chemistry & Biodiversity, 8(5),

937-953.

Communication en congrs internationales

Poster1 (Annexe II): Tarek Benabdelkader, Abdelghani Zitouni, Yann Guitton, Frdric

Jullien, Laurent Legendre, Abdelkrim Kameli. Variability in yield, chemical composition,

antimicrobial and antioxidant properties of essential oils of lavandula stoechas from

Algeria. 12me

Symposium international daromathrapie et plantes mdicinales, Grasse les 26, 27 & 28 mars 2010.

Poster2 (Annexe II): Tarek Benabdelkader, Jean-Louis Magnard, Yann Guitton, Karine

Fattarsi, Nicolas Boyer, Bernard Pasquier, Frdric Jullien, Abdelkrim Kameli and Laurent

Legendre. Lavandula terpenoids biosynthesis : clonning, sequencing and functional

characterization of three terpene synthases from a leaf cDNA library of Lavandula

pedunculata subsp. lusitanica. 13me

Symposium international daromathrapie et plantes mdicinales, Grasse les 01, 02 & 03 avril 2011.

Une publication est galement en prparation

Article2 : Tarek Benabdelkader, Abdelkrim Kameli and Laurent Legendre. Isoprenoid

biosynthesis in Lavender: Molecular cloning and functional characterization of three

terpene synthases from leaves of Lavandula stoechas Sensu Lato.

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Thse de Doctorat



RREESSUUMMEE

BBIIOODDIIVVEERRSSIITTEE,, BBIIOOAACCTTIIVVIITTEE EETT BBIIOOSSYYNNTTHHEESSEE DDEESS CCOOMMPPOOSSEESS TTEERRPPEENNIIQQUUEESS VVOOLLAATTIILLSS DDEESS

LLAAVVAANNDDEESS AAIILLEEEESS,, LLAAVVAANNDDUULLAA SSTTOOEECCHHAASS SSEENNSSUU LLAATTOO,, UUNN CCOOMMPPLLEEXXEE DDEESSPPEECCEESS MMEEDDIITTEERRRRAANNEEEENNNNEESS DDIINNTTEERREETT PPHHAARRMMAACCOOLLOOGGIIQQUUEE

Les terpnodes sont parmi les composs naturels les plus varis structurellement et

fonctionnellement. Ils jouent plusieurs rles critiques dans l'cologie chimique d'une large gamme

d'organismes. Les terpnes synthases (TPS) sont les enzymes cls impliques dans la biosynthse des

terpnodes, qui aboutit la production d'huile essentielle (HE) de nombreuses plantes aromatiques comme

les espces du genre Lavandula. Dans le but de dvelopper les productions locales de plantes aromatiques et

mdicinales, nous avons ralis une valuation de la composition et des activits biologiques des HEs

extraites des parties ariennes fleuries de L. stoechas sauvages rcoltes sur 11 sites diffrents dans le nord de

l'Algrie. Les huiles ont t analyses par GC/FID et GC/MS, o un total de 121 composs ont t identifis,

reprsentant de 69.88 91.2% du contenu total de l'huile. Nos 11 huiles diffraient considrablement de par

leur composition avec seulement 66 substances communes toutes les huiles. Les principaux constituants

taient le fenchone (11.27-37.48%), le camphre (1.94-21.8%), le 1,8-cinol (0.16-8.71%) et le viridiflorol

(2.89-7.38%). Les activits biologiques in vitro ont dmontr que les activits de pigeage du radical DPPH

et loxydation des lipides du couple -carotne/acide linolique diffraient dun facteur 8 et taient lies diffrents ensembles de molcules. Nos onze HEs ont prsent de bonnes activits antimicrobiennes envers la

plupart des 16 souches pathognes testes de bactries, de champignons filamenteux et de levures des

valeurs de concentration minimale inhibitrice (CMI) allant de 0.16 3.5 mg/ml.

Les analyses par GC/MS dextraits hexane des composs organiques volatils (COV) de feuilles de pieds individuels de lavandes Stoechas (L. pedunculata, L. stoechas et L. viridis) ont permis didentifier 124 composs dont la majorit taient des monoterpnes oxygns. Nous avons mis en vidence une variation de

la teneur des principaux COVs en accord avec les variations chmotypiques inter-spcifiques connues entre

les trois lavandes. Les trois pieds que nous avons slectionns correspondaient un chmotype fenchone (L.

pedunculata), un chmotype camphre (L. stoechas) et un chmotype 1,8-cinol (L. viridis). A laide damorces dgnres nous avons isol trois ADNc en pleine longueur, LpFENS, LpPINS et LpGEAS, de feuilles de L. pedunculata. Six ADNc homologues en pleine longueur, LsFENS, LsPINS, LsGEAS, LvFENS,

LvPINS et LvGEAS, ont t galement isols des feuilles de L. stoechas et L. viridis en utilisant des amorces

spcifiques aux trois premiers ADNc clons. Tous les clones d'ADNc ont t identifis en tant

quhomologues de TPSs par comparaison de squences prsentes dans la base de donnes GenBank. Lexpression htrologue dans E. coli et lanalyse de lactivit catalytique par GC/MS des enzymes natives recombinantes purifies de ces TPSs ont permis leur caractrisation fonctionnelle en tant que, -fenchol synthases (LpFENS, LsFENS et LvFENS), -pinne synthases (LpPINS, LsPINS et LvPINS) et germacrne A synthase (LpGEAS, LsGEAS et LvGEAS). Au meilleur de notre connaissance, nous rapportons ici pour la

premire fois trois squences de TPSs jamais publies pour le genre Lavandula. Il sagit aussi de la seconde

description dune activit -fenchol synthase chez les plantes et d-pinne synthase et germacrne A synthase chez les Lamiaces. Tous les gnes clons sont exprims dans les feuilles des trois lavandes

Stoechas diffrents niveaux en corrlation avec la teneur en composs associs dans la source vgtale.

Cela nous a permis de conclure que les activits de ces TPSs sont principalement rgules au stade

transcriptionnel. Larbre phylogntique reconstruit place nos TPSs dans deux sous-familles de TPSs. Les -fenchol synthases et les -pinne synthases sont intgres dans la sous-famille TPS-b et les germacrne A synthases dans la sous-famille TPS-a. Leurs plus proches homologues taient d'autres TPSs de Lavandula ou

de Lamiaces.

Mots cls : Lavandula stoechas ; L. pedunculata subsp. lusitanica ; L. viridis ; Lamiaces ; Terpnes ;

GC/MS ; Activit antioxydante ; Activit antimicrobienne ; -Fenchol synthase ; -Pinene synthase ; Germacrene A synthase.

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elarng noitcudortnI

tarotcoD ed eshT

enneitE tniaS ed tennoM naeJ tisrevinU/reglA-abuoK ed erueirpuS elamroN elocE sseennnneennaarrrreettiiddMM sseeccppssEEdd eexxeellppmmooCC nnuu ,,oottaaLL uussnneeSS ssaahhcceeoottss aalluuddnnaavvaaLL ,,sseelliiAA sseeddnnaavvaaLL sseedd sslliittaallooVV sseeuuqqiinnpprreeTT sseessooppmmooCC sseedd eesshhttnnyyssooiiBB ttee ttiivviittccaaooiiBB ,,ttiissrreevviiddooiiBB

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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



AABBSSTTRRAACCTT

English title BBIIOODDIIVVEERRSSIITTYY,, BBIIOOAACCTTIIVVIITTYY AANNDD BBIIOOSSYYNNTTHHEESSIISS OOFF VVOOLLAATTIILLEE TTEERRPPEENNEE CCOOMMPPOOUUNNDDSS OOFF

WWIINNGGEEDD LLAAVVEENNDDEERRSS,, LLAAVVAANNDDUULLAA SSTTOOEECCHHAASS SSEENNSSUU LLAATTOO,, MMEEDDIITTEERRRRAANNEEAANN SSPPEECCIIEESS

CCOOMMPPLLEEXX OOFF PPHHAARRMMAACCOOLLOOGGIICCAALL IINNTTEERREESSTT

Terpenoids are the most structurally and functionally diverse natural compounds that play a critical role

in the chemical ecology of a wide range of organisms. The terpene synthases (TPS) are key enzymes

involved in the biosynthesis of terpenoids which make the bulk of the essential oil (EO) of many aromatic

plants like Lavandula species. In an effort to develop local productions of aromatic and medicinal plants, we

have assessed the composition and the biological activities of EOs extracted from the aerial flowering parts

of wild-grown L. stoechas collected from 11 different locations in northern Algeria. The oils were analyzed

by GC/FID and GC/MS. A total of 121 compounds were identified that accounted for 69.88-91.2 % of the

total oil contents. Our 11 oils differed greatly in their composition and only 66 substances were common to

all oils. Major components were fenchone (11.27-37.48 %), camphor (1.94-21.8 %), 1,8-cineol (0.16-8.71 %)

and viridiflorol (2.89-7.38 %). In vitro biological activities demonstrated that the DPPH-based radical

scavenging and the -carotene/linoleic acid-based lipid anti-oxidation activities differed by an 8 fold factor and were linked to different sets of molecules in different EOs. Our 11 EOs exhibited good antimicrobial

activities against most of the 16 tested strains of pathogenic bacteria, filamentous fungi and yeast at

minimum inhibition concentration (MIC) values of 0.16 to 3.5 mg/ml.

GC/MS analyses of hexane extracts of volatile organic compounds (VOC) from leaves of individual

plants of Stoechas lavenders (L. pedunculata, L. stoechas and L. viridis) have identified 124 compounds,

most of them being oxygenated monoterpenes. We observed a variation in the content of the main VOCs in

agreement with the known inter-specific chemotypic variations between these lavenders. The three plants we

selected had a fenchone chemotype (L. pedunculata), a camphor chemotype (L. stoechas) and a 1,8-cineol

chemotype (L. viridis). The use of degenerate primers allowed us to isolate three full-length cDNAs,

LpFENS, LpPINS and LpGEAS, from the leaves of L. pedunculata. Six full-length homologous cDNAs,

LsFENS, LsFENS, LsPINS, LsGEAS, LvFENS, LvPINS and LvGEAS were also isolated from the leaves of L.

stoechas and L. viridis with specific primers designed on the cDNAs previously cloned. All cDNA clones

were identified as TPSs homologues by sequence comparison with sequences present in the GenBank

database. Heterologous expression in E. coli and GC/MS analysis of the catalytic activity of native

recombinant enzymes of these TPSs have led to their functional characterization as -fenchol synthases (LpFENS, LsFENS and LvFENS), -pinene synthases (LpPINS, LsPINS and LvPINS) and germacrne A synthases (LpGEAS, LsGEAS and LvGEAS). To the best of our knowledge, we report here for the first time

three TPSs sequences never reported before for the genus Lavandula. It is also the second description of an

-fenchol synthase activity in plants and of -pinene synthase and germacrene A synthase in Lamiaceae. All cloned genes are expressed in leaves of the three Stoechas lavenders at different levels in correlation with the

content of associated products in the plant source. This allowed us to conclude that the activities of these

TPSs are principally regulated at the transcriptional level. A phylogenetic reconstruction placed our cloned

TPSs in two separate TPSs sub-families. The -fenchol synthases and the -pinene synthases clustered in the TPS-b subfamily and the germacrene A synthases in the TPS-a subfamily. Their closest homologues were

other TPS genes from Lavandula or Lamiaceae.

Key words : Lavandula stoechas ; L. pedunculata subsp. Lusitanica ; L. viridis ; Lamiaceae ; Terpenes;

GC/MS; Antioxidant activity; Antimicrobial activity; -Fenchol synthase ; -Pinene synthase ; Germacrene A synthase.

Abstract te

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Thse de Doctorat



LLIISSTTEE DDEESS AABBRREEVVIIAATTIIOONNSS

A Adnosine

ADN Acide dsoxyribonuclique

ADNc ADN complmentaire

ADNg ADN gnomique

ARN Acide ribonuclique

ARNm ARN messager

BET Bromure dthidium

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

BSA Srum albumine de buf

BVpam Laboratoire de Biotechnologies Vgtales appliques aux Plantes Aromatiques

et Mdicinales

C Cytidine

CCM Chromatographie sur couche mince

CDPS Copalyl diphosphate synthase

CDPS Copalyl diphosphate synthase

CFU Colony-forming unit

CMI Concentration minimale inhibitrice

COV Composs organiques volatils

CPP Copalyl diphosphate

CTAB Bromure dhexadodcyltrimthylammonium

CTP Peptide de transit chloroplastidial

Da Dalton

DMAPP Dimthylallyl diphosphate

dNTP dsoxyribonuclotide triphosphate

DO Densit optique

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

DTT DiThioThritol

DXR 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase

EDTA Ethylne Diamine TtraActate

EST Expressed sequence tag

FENS Fenchol synthase

FID Dtecteur ionisation de flamme

FPP Farnsyl diphosphate

G Guanosine

GC Chromatographie en phase gazeuse

GC/MS Chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse

GEAS Germacrne A synthase

GGPP Granylgranyl diphosphate

GPP Granyl diphosphate

GST glutathione-S-transferase

HE Huile essentielle

IPP Isopentenyl diphosphate

IPTG Isopropyl thio -D-galactoside

KS ent-Kaurene synthase

Liste des abrviations te

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Thse de Doctorat



LB Milieu de Luria Bertani

LpFENS Lavandula pedunculata -fenchol synthase (GenBank: JX501511)

LpPINS Lavandula pedunculata -pinne synthase (GenBank: JX501512)

LpGEAS Lavandula pedunculata germacrne A synthase (GenBank: JX501513)

LsFENS Lavandula stoechas -fenchol synthase (GenBank: JX501514)

LsPINS Lavandula stoechas -pinne synthase (GenBank: JX501514)

LsGEAS Lavandula stoechas germacrne A synthase (GenBank: JX501514)

LvFENS Lavandula viridis -fenchol synthase (GenBank: JX501517)

LvPINS Lavandula viridis -pinne synthase (GenBank: JX501518)

LvGEAS Lavandula viridis germacrne A synthase (GenBank: JX501519)

LPP Linalyl diphosphate

MBP maltose binding protein

MEP Voie du 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate

MS Spectromtrie de masse

MVA Voie du mvalonate

NCBI National Center for Biotechnology Information

NJ Neighbor-Joining

NusA N-utilization substance protein A

PAGE Polyacrilamide gel electrophoresis

PAM Plantes aromatiques et mdicinales

pb paire de bases

PCR Polymerase Chaine Reaction

pI Point isolectrique

PINS Pinne synthase

PM Poids molculaire

PS Poids sec

PT Prnyl transfrases

RACE Amplifications rapides des extrmits des ADNc

RI Indice de rtention

ROS Les drivs actifs de l'oxygne

rpm rotation par minute

RT Temps de rtention

RT Transcription inverse

RT-PCR Reverse Transcription PCR

SD Erreur standard

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

T Thymidine

TAE Tris Actate EDTA

TB Milieu Turbo Broth

TEMED Ttramthylthylne Diamine

TPS Terpnes synthases

Tris Tris (hydroxymthyl)-aminomthane

TRX Thioredoxine

UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean

UTR rgion non traduite (untranslated region)

X-Gal X-Galactoside

Liste des abrviations te

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Nomenclature et abrviation des aminoacides

Aminoacide Code 3 lettres Code 1 lettre

Alanine Ala A

Arginine Arg R

Asparagine Asn N

Aspartique Asp D

Cyctine Cys C

Glutamine Gln Q

Glutamique Glu E

Glycine Gly G

Histidine His H

Isoleucine Ile I

Leucine Leu L

Lysine Lys K

Mthionine Met M

Phnylalanine Phe F

Proline Pro P

Serine Ser S

Thronine Thr T

Tryptophane Trp W

Tyrosine Tyr Y

Valine Val V

Nomenclature et abrviation des aminoacides te

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Thse de Doctorat



TTAABBLLEE DDEESS MMAATTIIEERREESS INTRODUCTION GENERALE 1

CCHHAAPPIITTRREE II.. RREEVVUUEE DDEE LLIITTTTEERRAATTUURREE 3

I.1. LES TERPENOIDES 4

I.1.1. Terme et signification 4

I.1.2. Structure gnrale et classification 5

I.1.3. Fonction 6

I.1.3.1. Fonctions mtaboliques primaires 7

I.1.3.2. Fonctions mtaboliques secondaires 7

I.1.4. Importance 10

I.1.5. Biosynthse 11

I.1.5.1. La formation des blocs de construction, IPP et DMAPP 12

I.1.5.2. La formation des prnyl diphosphates, GPP, FPP et GGPP 15

I.1.5.3. Compartimentation sub-cellulaire 16

I.1.5.4. Produits finaux 17

I.1.6. Site de biosynthse, accumulation et scrtion 20

I.1.7. Huiles essentielles 23

I.1.7.1. Dfinition et rpartition dans le rgne vgtal 23

I.1.7.2. Historique et importance 24

I.1.7.3. Mthode dextraction 24 I.1.7.4. Mthodes danalyses 26 I.1.7.5. Variation ecophysiologique de la composition dune HE 27

I.2. LES TERPENE SYNTHASES 28

I.2.1. Dfinition 28

I.2.2. Structures 30

I.2.2.1. Structures primaires 30

I.2.2.2. Structures tridimensionnelles 32

I.2.3. Classification 34

I.2.3.1. Sous-familles (sous-groupes) 34

I.2.3.2. Classes 36

I.2.4. Mcanismes ractionnels 37

I.2.5. Expression et rgulation 42

I.2.5.1. Rgulation spatiale 43

I.2.5.2. Rgulation temporelle 43

I.2.6. Evolution 45

I.2.7. Expression htrologue 46

I.3. LE GENRE LAVANDULA L. 46

I.3.1. Taxonomie 47

I.3.2. Diversit morphologique 50

I.3.2.1. Section Stoechas Ging. (L. stoechas Sensu Lato) 57

I.3.2.1.1. Lespce L. stoechas L. 58 I.3.2.1.2. Lespce L. pedunculata (Mill) Cav. 62 I.3.2.1.3. Lespce L. viridis L'Hr. 64

I.3.3. Rpartition gographique 66

I.3.4. Intrt commercial, nutritionnel et pharmacologique 67

I.3.5. Phytochimie 70

Table des matires

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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



I.3.5.1. Huiles essentielles 70

I.3.5.1.1. Variation inter-spcifique 70

I.3.5.1.2. Variation intra-spcifique 70

I.3.5.2. Flavonodes 74

I.3.6. Les gnes de TPSs de Lavandes 74

I.4. LES OBJECTIFS DE LA THESE 75

CCHHAAPPIITTRREE IIII.. MMAATTEERRIIEELLSS EETT MMEETTHHOODDEESS 78

II.1. Materiel vgtal 79

II.2. Souches de microorganismes 81

II.3. Produits chimiques et vecteurs gntiques 82

II.4. Conditions de culture 84

II.5. Extraction et caractrisation des huiles essentielles 86

II.5.1. Hydrodistillation 86

II.5.2. Calcul de rendement en huile essentielle 86

II.5.3. Extraction des volatils par macration dans lhexane 87 II.5.4. Analyse en GC/FID 87

II.5.5. Analyse en GC/MS 87

II.5.6. Identification des composes volatils 88

II.5.7. Quantification des composs volatils 89

II.6. Evaluation de lactivit antioxydante des huiles essentielles des populations de L. stoechas 89

II.6.1. Criblage rapide de lactivit antioxydante par chromatographie sur couche mince (CCM) 89

II.6.2. Evaluation de lactivit de pigeage du radical libre par la mthode de DPPH 89

II.6.3. Evaluation de lactivit antioxydante par la mthode -carotne/acide linolique 90

II.7. Evaluation de lactivit antimicrobienne des huiles essentielles des populations de L. stoechas 91

II.8. Obtention des extraits dADN, ARN et ADNc 91 II.8.1. Extraction de lADN gnomique des feuilles de lavandes 91 II.8.2. Extraction d'ADN plasmidique bactrien 92

II.8.3. Extraction des ARN totaux 93

II.8.4. Synthse dADN complmentaire 93 II.8.5. Dosage et contrles de la qualit des acides nucliques 94

II.9. Amplifications par PCR 95 II.9.1. Dfinition des amorces 95

II.9.2. Conditions ractionnelles 97

II.9.3. Stratgie RACE et marche gnomique 97

II.9.4. Dtermination de l'expression des gnes de TPSs 98

II.6.4. Electrophorse sur gel dagarose 99 II.6.5. Purification des fragments dADN 99

II.10. Techniques de clonage 100

II.10.1. Clonage de routine pour squenage 100

II.10.2. Clonages par technologie Gateway 100

II.10.3. Transformation bactrienne 102

II.10.4. Squenage dADN 103 II.11. Expression htrologue de TPSs de lavandes Stoechas et mesure dactivit 103

Table des matires

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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



II.11.1. Expression htrologue de TPSs 103

II.11.2. Extraction de protines de TPSs recombinantes 104

II.11.3. Purification partielle de protines de TPSs recombinantes par

chromatographie daffinit sur rsine de nickel 104 II.11.4. Dosage colorimtrique des protines 105

II.11.5. Electrophorse sur gel dnaturant (SDS-PAGE) 105

II.11.6. Mesure in vitro de lactivit de terpne synthases de lavandes Stoechas 107 II.12. Analyses bioinformatiques et statistiques de donnees 107

II.12.1. Alignement de squences 107

II.12.2. Analyses BLAST 107

II.12.3. Prdiction de peptide de transit chloroplastique (CTP) 108

II.12.4. Autres prdictions 108

II.12.5. Analyses phylogntiques 108

II.12.6. Analyses statistiques 109

CCHHAAPPIITTRREE IIIIII.. RREESSUULLTTAATTSS EETT DDIISSCCUUSSSSIIOONN 110

III.1. Variation et biodiversit des HEs accumules par des populations algriennes

de L. stoechas 112

III.1.1. Introduction 112

III.1.2. Rsultats 114

III.1.2.1. Rendements en huile essentielle de 11 populations algriennes de L.

stoechas 114

III.1.2.2. Composition chimique des huiles essentielles de 11 populations

algriennes de L. stoechas 115

III.1.2.3. Variabilit et biodiversit des huiles essentielles des 11 populations

algriennes de L. stoechas 122

III.1.3. Discussion 123

III.2. Activits biologiques in vitro des HEs accumules par des populations de L.

stoechas 128



III.2.2.1. Activit antioxydante des huiles essentielles de 11 populations de L.

stoechas 129

III.2.2.1.1. Evaluation de lactivit antioxydante par la mthode du DPPH 129 III.2.2.1.2. Evaluation de lactivit antioxydante par la mthode du -carotne/acide linolique 130

III.2.2.2. Activit antimicrobienne des huiles essentielles de populations de L.

stoechas 132


III.3. Biodiversit des COVs et variation chmotypique chez L. stoechas Sensu

Lato 141




III.4. Biosynthse des terpnes chez L. stoechas Sensu Lato 154



Table des matires

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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



III.4.2.1. Isolement de gnes de TPSs impliqus dans la biosynthse des terpnes

chez L. stoechas Sensu Lato 158

III.4.2.1.1. Amplification de fragments de TPSs avec des amorces dgnres sur

lADNg de L. pedunculata 158 III.4.2.1.2. Amplification de fragments de TPSs sur ADNc de L. pedunculata 162

III.4.2.1.3. Obtention de squences compltes de TPS de L. pedunculata par

RACE-PCR 163

III.4.2.1.4. Obtention de gnes homologues de LpFENS, LpPINS et LpGEAS

chez L. stoechas et L. viridis 164

III.4.2.2. Analyse des squences de TPS putatives de L. stoechas Sensu Lato 167

III.4.2.3. Expression htrologue et purification des TPSs recombinantes 171

III.4.2.4. Caractrisation fonctionnelle de nouvelles TPSs de lavandes 174

III.4.2.4.1. Identification des clones d'ADNc LpFENS, LsFENS et LvFENS en

tant que -fenchol synthases 175 III.4.2.4.2. Identification des clones d'ADNc LpPINS, LsPINS et LvPINS en tant

que -pinne synthases 176 III.4.2.4.3. Identification des clones d'ADNc LpGEAS, LsGEAS et LvGEAS en

tant que germacrne A synthases 178

III.4.2.5. Analyse par RT-PCR semi-quantitative de l'expression des gnes de

TPSs de L. stoechas Sensu Lato 179

III.4.2.6. Analyse phylogntique 181


CCHHAAPPIITTRREE IIVV.. CCOONNCCLLUUSSIIOONNSS EETT PPEERRSSPPEECCTTIIVVEESS 198

BBIIBBLLIIOOGGRRAAPPHHIIEE 205

AANNNNEEXXEESS 239

Table des matires

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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



LLIISSTTEESS DDEESS FFIIGGUURREESS

Figure Titre Page

1 Rles des terpnodes chez les plantes (daprs Owen & Penuelas, 2005) 7

2 Etapes enzymatiques des voies MEP et MVA dans la synthse dIPP et de DMAPP (modifie daprs Goto et al., 2010)

14

3 Schma gnral de la biosynthse des terpnodes (modifie daprs Bohlmann & Keeling, 2008)

15

4 Vue gnrale sur la compartimentation sub-cellulaire des voies

biosynthtiques des terpnodes chez les plantes (modifie daprs Chapell, 2002 ; Bouvier et al., 2005 ; Bouwmeester, 2006 ; Cheng et al., 2007)

17

5 Formation de terpnodes catalyse par divers types de TPSs (daprs Chen et al., 2011)

18

6 Schma dune coupe radiale anatomique dun trichome glandulaire pelt de menthe poivre (Mentha x piperita) (dprs Turner et al., 1999)

21

7 Diagramme en ruban de la linalool synthase cristallise illustrant le

domaine N-terminal (orange) et le domaine C-terminal du site actif (vert)

(daprs Hyatt et al., 2007)

33

8 Phylognie gnrale des TPSs (daprs Chen et al., 2011) 35

9 Mcanismes ractionnels des monoTPSs cycliques (A) et des monoTPSs

acycliques (B) initis par lionisation du substrat GPP (daprs Degenhardt et al., 2009)

39

10 Mcanismes ractionnels des sesquiTPSs initis par lionisation du substrat FPP (daprs Degenhardt et al., 2009)

41

11 Biosynthse des diterpnes implique l'ionisation et la cyclisation de GGPP

directement, et la cyclisation prliminaire au CPP par protonation de la

double liaison terminale (daprs Bohlmann et al., 1998)

42

12 Taxonomie du genre Lavandula (daprs Upson & Andrews, 2004) 49

13 Arbre de classification des espces du genre Lavandula bas sur les

squences nuclaire ITS (daprs Upson & Andrews, 2004) 50

14 Diversit de trichomes de L. pedunculata (daprs Zuzarte et al., 2010) 52

15 Diversit de formes et de contours des feuilles de certaines espces du

genre Lavandula (Collection BVpam)

52

16 Photographies des inflorescences (thyrses) reprsentatives de 8 sections du

genre Lavandula (Collection BVpam sauf pour la section Sabaudia dont la

photo est de Tim Upson (Upson, 2009))

53

17 Variation de la morphologie des corolles (fleurs) de certaines espces du

genre Lavandula (daprs Upson, 2002) 54

18 Variation des calices (lobes) de certaines espces du genre Lavandula

(daprs Upson, 2002) 55

19 Exemples illustrant la diversit des formes des bractes de certaines

espces du genre Lavandula (aprs Upson, 2002)

56

20 Exemples illustrant la diversit des formes des aknes (nucules) de

certaines espces du genre Lavandula (aprs Upson & Adrews, 2004)

57

21 Distribution gographique de L. stoechas (daprs Upson & Andrews, 2004)

59

22 Lavandula stoechas, tige fleurie x 1 et cyme agrandie x 4 (daprs Upson & Andrews, 2004)

60

23 Distribution gographique de L. pedunculata (daprs Upson & Andrews, 2004)

62

Liste des figures te

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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



24 Lavandula pedunculata, tige fleurie x 1 et cyme agrandie x 4 (daprs Upson & Andrews, 2004)

63

25 Distribution gographique de L. viridis dans la Pninsule Ibrienne

(daprs Upson & Andrews, 2004) 65

26 Lavandula viridis, tige fleurie x 1 et cyme agrandie x 4 (daprs Upson & Andrews, 2004)

65

27 Schmatisation de laire de rpartition des sections du genre Lavandula (daprs Guitton, 2011)

66

28 Origine gographique des 11 populations algriennes de L. stoechas

utilises dans cette tude

80

29 Vecteur pGEM-T easy (Promega) avec un site de clonage multiple ouvert

comportant les deux thymidines (T) libres

83

30 Vecteur donneur pENTR/D-TOPO (Invitrogen) avec deux sites de clonage

directionnel

83

31 Sries de vecteurs de destination (dexpression) avec une cassette attR1/attR2 de recombinaison Gateway

84

32 Reprsentation schmatique du systme Gateway 101

33 Variation des rendements dextractions par hydrodistillation des HEs de populations algriennes de L. stoechas

114

34 Structures chimique des composs majoritaires et de certains composs

dtects pour la premire fois dans des HEs de L. stoechas dAlgrie 121

35 Dendrogramme de lanalyse hirarchique de onze populations algriennes de L. stoechas

123

36 Activit antioxydante des HEs des populations de L. stoechas (LS1 - LS11)

et des standards contrle (BHT et -tocophrol) 131

37 CMI cumules de chaque HE des 11 populations de L. stoechas envers les

seize souches cibles

133

38 CMI cumules des 11 HEs de L. stoechas sur chaque souche de

microorganisme cible

134

39 Screening semi-quantitatif sur plaque de CCM de lactivit antioxydante au test DPPH des 11 HEs de L. stoechas en parallle avec le fenchone, le

camphre, le 1,8-cinol, leugnol, le carvacrol, le BHT et l-tocophrol

136

40 Teneurs et variation des classes chimiques des COVs de feuilles des

lavandes Stoechas

147

41 Teneurs et variation des constituants majoritaires des COVs de feuilles des

lavandes Stoechas

148

42 Composs en formules dveloppes identifis dans les COVs de feuilles

des lavandes Stoechas

149

43 Biosynthse d-fenchol, -pinne, 1,8-cinol, bornol et du camphre partir du granyl diphosphate via le -terpinyl cation

155

44 Arbre de regroupement de 62 TPSs de Lamiaces 160

45 Dfinition dune amorce dgnre sur une zone conserve 161

46 Reprsentation schmatique de la position et les motifs cibles des amorces

dgnres (TPS1dF, TPS2dF, TPS3dF, TPS4dF, TPS5dF, TPS6dR,

TPS7dR et TPS8dR) utilises pour lamplification des gnes partiels de TPS de L. pedunculata

161

47 Alignement des squences d'ADNc des TPSs putatives de L. pedunculata, L.

stoechas et L. viridis

165

48 Alignement des squences d'acides amins prdites des clones d'ADNc des

TPSs putatives des groupes FENS, PINS et GEAS de L. pedunculata, L.

stoechas et L. viridis

169


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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



49 Analyse par SDS-PAGE des TPSs recombinantes putatives de lavandes

exprimes dans E. coli, souche Rosetta et purifies par chromatographie

daffinit au Ni2+

173

50 Analyses par GC/MS des produits terpniques forms in vitro par les

enzymes recombinantes de TPSs des lavandes Stoechas avec le GPP ou le

FPP en tant que substrats

177

51 Analyse des niveaux relatifs des transcrits des gnes de TPSs par RT-PCR

dans les feuilles des trois lavandes

180

52 Relations phylogntiques des TPSs des lavandes Stoechas avec dautres TPSs connues

182

53 Proposition de fonctionnement des TPSs de lavandes Stoechas dcouvertes

dans cette tude

194

54 Rsidus d'acides amins impliqus dans la formation de l'intermdiaire

germacrne A et sa cyclisation additionnelle par la TEAS

196


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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



LLIISSTTEE DDEESS TTAABBLLEEAAUUXX

Tableau Titre Page

1 Classification des terpnodes 6

2 Distribution fonctionnelle et taxonomique des sous-familles de TPSs des

plantes (daprs Chen et al., 2011) 35

3 Variations inter-spcifiques et intra-spcifiques des principaux constituants des

HEs des espces du genre Lavandula dans la littrature

72

4 Tableau 4 : Distribution de diffrentes classes de flavonodes dans le genre

Lavandula (daprs Upson & Andrews 2004) 74

5 Sites de collecte (avec les abrviations) et principales caractristiques

cologiques des biotopes de 11 populations algriennes de L. stoechas qui ont

servi de source d'HE dans la prsente tude

79

6 Gnotypes et origines de souches dE. coli de clonage et dexpression utilises 82

7 Conditions opratoires GC/FID utilises pour lanalyse des COVs des populations de L. stoechas

87

8 Conditions opratoires des analyses GC/MS 88

9 Liste des amorces utilises pour les amplifications dADN 96

10 Elments des ractions damplification par PCR 97

11 Conditions des ractions damplification par PCR classique 97

12 Conditions des ractions damplification par RACE-PCR "Touchdown" 98

13 Recette du tampon de Laemmli, gels de SDS-PAGE et tampon de migration 106

14 Compositions chimiques des huiles essentielles des parties ariennes fleuries

de onze populations algriennes sauvages de L. stoechas

116

15 Activit antimicrobienne (CMI) des huiles essentielles des populations

algriennes de L. stoechas

133

16 Composition chimique des COVs de feuilles des lavandes Stoechas (L.

pedunculata, L. stoechas et L. viridis)

143

17 Rcapitulatif de terpne synthases de lavandes 158

18 Caractristiques des squences des gnes clons de TPSs putatives de L.

pedunculata, L. stoechas et L. viridis

168

19 Scores didentit de gnes clons de TPSs putatives de L. pedunculata, L. stoechas et L. viridis

170

20 Identification et caractristiques des produits volatils synthtiss in vitro par les

TPSs putatives recombinantes de L. stoechas Sensu Lato 175

21 Produits forms in vitro par les TPSs de L. stoechas Sensu Lato 176

Liste des tableaux te

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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



LLIISSTTEE DDEESS AANNNNEEXXEESS

Annexe I : Article huiles essentielles de populations algriennes de L. stoechas publi en

Chemistry & Biodiversity

Annexe II : Poster huiles essentielles de populations algriennes de L. stoechas prsent lors du

12me

Symposium International dAromathrapie et plantes mdicinales, Grasse mars 2010

Annexe III : Poster terpne synthases de L. pedunculta prsent lors du 13me

Symposium

International dAromathrapie et plantes mdicinales, Grasse avril 2011

Liste des annexes te

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Feb

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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



IINNTTRROODDUUCCTTIIOONN GGEENNEERRAALLEE

Les plantes sont une source immense de molcules chimiques complexes exploites

par lhomme dans plusieurs industries telles que lindustrie cosmtique, lindustrie agro-

alimentaire et lindustrie pharmaceutique. La diversit de ces molcules naturelles qui ne

sont pas essentielles la viabilit des plantes reste une nigme pour les biologistes qui

essayent de dcrypter leur rle dans la nature. De mme, l'lucidation des voies de

biosynthse conduisant des produits naturels originaux est un champ d'investigation

inpuisable pour les scientifiques. L'homme prhistorique, qui avait trs peu de moyens,

devait se nourrir des produits de cueillette et de chasse. En assimilant la flore locale, il a

dcouvert les plantes utiles et indispensables pour survivre. Ce rgime, essentiellement

vgtarien, a constitu le berceau de l'utilisation des produits naturels. A cette poque, bien

que les huiles essentielles ne soient pas signales nommment, les plantes aromatiques

taient largement employes.

Actuellement, une augmentation de l'utilisation de composs d'origine naturelle est

observe, justifiant laccroissement de la production de certaines plantes aromatiques et

mdicinales (PAM). Parmi ces PAM de nombreuses Lamiaces mditerranennes sont

utilises pour leurs proprits de leurs huiles essentielles (HE). Ces HE sont le rsultat de

la synthse et de l'accumulation des composs organiques volatils (COVs) qui, in planta,

agissent dans les interactions de la plante avec son environnement biotique (attraction de

pollinisateurs, dfense contre des pathognes) et abiotique (protection contre les UV). Les

HE des Lamiaces sont composes principalement de terpnes de bas poids molculaire,

de phnylpropanodes et de drivs dacides gras.

La valorisation des terpnes a conduit des recherches interdisciplinaires impliquant

la chimie, la biologie et la mdecine. Un des meilleurs exemples a t l'tude de la voie de

biosynthse du taxol, conduisant la production de diffrents anticancreux usage

humain. Par ailleurs, dautres tudes envisagent dans un futur proche la production de

terpnes comme biocarburants. Les approches gnomiques, le squenage complet

dorganismes modles mais aussi le dveloppement de mthodes de squenage haut

dbit ont permis une progression significative dans la caractrisation des gnes et enzymes

impliqus dans la biosynthse des terpnes. Laccumulation de connaissance dans la

biosynthse des terpnes, leur localisation cellulaire et leur rgulation devraient terme

faciliter la manipulation de leurs voies biosynthtiques afin damliorer certains caractres

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Introduction gnrale

Thse de Doctorat



agronomiques tels que les armes de fruits, le parfum floral, la dfense et la rsistance des

plantes envers les insectes et les microorganismes.

Au cours des dernires annes, l'exploitation conomique des espces du genre

Lavandula a augmente en raison de l'utilisation de leurs HEs. Ces huiles peuvent tre

obtenues de plantes sauvages ou cultives. Plusieurs travaux ont tudis la composition

chimique et lactivit biologique des huiles de lavande, mais trs peu de travaux ont port

sur les terpne synthases (TPS) du genre Lavandula et aucun travaux sur les TPSs des

lavandes Stoechas.

Depuis plusieurs annes, les lavandes, et plus exactement les espces de la section

Stoechas, constituent laxe de mes recherches. Les objectifs de ce travail de thse sont :

Une contribution une meilleure connaissance de la nature chimique des terpnes et

des variations chmotypique au sein des espces de la section Stoechas (L. stoechas,

L. pedunculata et L. viridis),

Une valuation des activits antioxydantes et antimicrobiennes des HEs des

populations algriennes de L. stoechas.

Une caractrisation des chmotypes de pieds individuels du complexe despces de

L. stoechas Sensu Lato (L. stoechas, L. pedunculata et L. viridis).

Une caractrisation fonctionnelle de trois terpnes synthase chez L. stoechas, L.

pedunculata et L. viridis.

Ces quatre axes de recherches sinscrivent dans une participation scientifique

lamlioration et la valorisation des huiles essentielles de Lavandula stoechas. Ils ont

donn lieu 2 prsentations crites sous forme de posters dans des congrs internationaux

et la soumission de 2 manuscrits dans des journaux internationaux comit de lecture.

Le prsent manuscrit est organis en 04 chapitres. Un premier chapitre est consacr

ltude bibliographique descriptive de la diversit structurelle et fonctionnelle et des voies

de biosynthse des terpnes, ainsi quun aperu gnral sur les TPSs, enzymes cls de la

synthse des terpnes. Enfin, il est termin par la prsentation du genre Lavandula, en

insistant sur la diversit morphologique des diffrentes espces, leur rpartition

gographique, et surtout leur intrt conomique. Le chapitre II sintresse aux

mthodologies utilises lors de la ralisation de cette thse. Le troisime chapitre,

subdivis en 4 sections, prsente les rsultats obtenus sur nos 4 objectifs de recherche.

Finalement, le dernier chapitre reprendra les conclusions et discutera des perspectives de

ce travail.

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Chapitre I. Revue de Littrature

Thse de Doctorat



RREEVVUUEE

DDEE LLIITTTTEERRAATTUURREE

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Thse de Doctorat



I.1. LES TERPENOIDES

I.1.1. Terme et signification

Les terpnodes reprsentent la plus ancienne famille de produits naturels. Les drivs

hopanodes taient prsent sur terre il y a 2.5 milliards annes (Brocks et al., 1999 ;

Summons et al., 1999). Les termes terpnodes, terpnes et isoprnodes sont souvent

utiliss de faon interchangeable et proviennent de trbenthine (lat. balsamum

terebinthinae), une huile essentielle (HE) dont les composs majeurs sont des terpnodes

et qui est obtenue par distillation de la rsine de conifres (Phillips & Croteau, 1999).

Cependant, le mot terpne dsigne au sens stricte des hydrocarbones insaturs drivant de

lisoprne (sufixe "ne") tandis que, terpnode est un terme plus gnrique utilis pour

indiquer quune substance possde le squelette carbon des terpnes, mais pas

ncessairement leur degr dinsaturation, tout en ayant ventuellement un, ou plusieurs,

groupes fonctionnels contenant de l'oxygne (alcool, aldhyde, ctone, acide, lactone etc.).

Dans toute la thse nous rfrerons ces composs par les deux termes "terpnes" ou

"terpnodes" sans diffrence. Nous nous concentrerons galement plus sur le rgne

vgtal.

Les terpnodes constituent la famille de produits naturels la plus diverse

structurellement, strochimiquement et fonctionnellement avec plus de 55 000 molcules

identifies ce jour dans toutes les formes de vie (Christianson, 2008). Des centaines de

nouvelles structures sont reportes chaque anne (Sacchettini & Poulter, 1997 ; Withers &

Keasling, 2007; Penuelas & Munne-Bosch, 2005). Leurs structures varient dune simple

chane linaire dhydrocarbones jusqu' des agencements complexes de cycles carbons

(Connolly & Hill, 1991). Alors que certains terpnodes exercent des fonctions

mtaboliques primaires essentielles pour la croissance et la reproduction chez de nombreux

organismes, la majorit fonctionne comme des mtabolites secondaires et contribue

ladaptation des espces leur niche cologique (Harborne, 1991).

Tous les terpnodes proviennent des prcurseurs simples 5 atomes de carbone,

lisopentnyl diphosphate (IPP) et son isomre le dimethylallyl diphosphate (DMAPP)

assembls et modifis de milliers de faons (Dewick, 1999). La remarquable diversit de la

chimiothque "terpenome" contredit ainsi ses racines simples avec des prcurseurs

universels 5 carbones, lIPP et le DMAPP (Christianson, 2007).

La majorit des terpnodes connus ont t isols partir de plantes o ils jouent le

rle de mtabolites primaires et secondaires. Chez les vgtaux, les terpnodes sont

produits par tous les tissus vgtatifs dont les racines mais aussi par les diverses pices

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florales (Dudareva et al., 2004). En raison de leurs nombreuses structures, les terpnodes

constituent un groupe htrogne de molcules avec diffrentes proprits physiques et

chimiques. Ils peuvent tre volatiles, semi-volatiles ou non-volatiles, satures et insatures,

chane droite, chane ramifie, cycliques ou acycliques, chiraux ou achiraux, portant

ventuellement divers groupes fonctionnels oxygns (ex. alcools, aldhydes, ctones,

esters et thers) ou contenant de l'azote ou du soufre et sont solubles ou insolubles dans

l'eau (Bohlmann & Keeling, 2008 ; Schwab et al., 2008). Certains terpnodes vgtaux

tels que les strols et les carotnes font partie du mtabolisme primaire et sont prsents

dans toutes les plantes. Cependant, la majorit des terpnodes vgtaux sont des

mtabolites secondaires (Chen et al., 2011). Les terpnodes volatils constituent une partie

importante des composs organique volatils biogniques (COVB) mis par les vgtaux

conjointement avec les oxylipines (drivs dacides gras) et les drivs aromatiques

(benznodes et phnylpropanodes issus de la phnylalanine) (Dudareva & Pichersky,

2000). Enfin, les terpnodes sont les constituants principaux des huiles essentielles, des

rsines et des cires de nombreuses plantes.

I.1.2. Structure gnrale et classification

La structure carbone de base des terpnodes est constitue dun assemblage dun

nombre variable dunits 2-mthylbutane (aussi appeles units isoprne - C5). Ces

assemblages peuvent tre modifis par ajout/soustraction de groupes mthyles ou ajout

datomes d'oxygne. La diversit chimique des terpnodes vgtaux provient alors de la

complexit de leurs voies biosynthtiques (Bohlmann & Keeling, 2008).

Les terpnodes sont classs selon le nombre dunits isoprne dans leur structure de

base comme illustr par le Tableau 1 (McGarvey & Croteau, 1995).

Les terpnodes peuvent galement tre classs selon le nombre de structures cycliques

qu'ils contiennent (cyclique, monocyclique, bicyclique) et larrangement des cycles (labdanes

par exemple).

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Tableau 1 : Classification des terpnodes Formules brutes correspondant aux formes hydrocarbons linaires possdant un nombre dinsaturation gal au nombre dunits isoprnes plus 1

Classe Formule brute n disoprne Exemples

Hmiterpnes C5H8 1

Monoterpnes C10H16 2

Sesquiterpnes C15H24 3

Diterpnes C20H32 4

Triterpnes C30H48 6

Ttraterpnes C40H64 8

Polyterpnes (C5H8)n 45-30000

le caoutchouc (cis-1,4-polyisoprne)

I.1.3. Fonction

Les terpnodes sont la plus large famille de produits naturels, et sont prsents et

souvent abondants dans tous les phylums du vivant. Comme rsum sur la Figure 1, un

nombre relativement faible mais quantitativement important des terpnodes sont

impliqus dans le mtabolisme primaire. Cependant, la grande majorit des terpnodes

sont classs comme des mtabolites secondaires, composs non-requis pour la croissance

et le dveloppement cellulaire, mais prsums avoir une fonction cologique (Harborne,

1991).

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Figure 1 : Rles des terpnodes chez les plantes (daprs Owen & Penuelas, 2005) Les points dinterrogations indiquent que ces fonctions nont pas t dmontres systmatiquement chez toutes les espces mettrices de ces terpnodes. ABA : acide absiscique.

I.1.3.1. Fonctions mtaboliques primaires

Beaucoup des terpnodes communs presque toutes les espces vgtales sont

essentiels la croissance, le dveloppement et le mtabolisme gnral (Croteau et al.,

2000). Leurs rles physiologiques, mtaboliques et structurels se situent, entre autre, au

niveau des pigments photosynthtiques (le phytol forme la chane latrale de la

chlorophylle et les carotnodes participent la fixation de la lumire), de plusieurs

phytohormones (e.g., l'acide abscissique, les brassinostrodes, les cytokinines et les

gibbrellines), des quinones transporteurs d'lectrons (e.g., plastoquinone et ubiquinone),

des composants structuraux membranaires (e.g., les phytostrols qui maintiennent

l'intgrit des membranes comme le campestrol, sitostrol et stigmastrol) et des

dolichols qui facilitent l'assemblage glycoprotine-polysaccharide. Certains terpnodes

remplissent, par des mcanismes inconnus, des fonctions purement dveloppementales

pour la plante. A forte concentration, lisoprne acclre, par exemple, la floraison chez

Arabidopsis thalinana (Terry et al., 1995).

I.1.3.2. Fonctions mtaboliques secondaires

La majorit des terpnodes sont classs comme des mtabolites secondaires non-

essentiels la croissance et au dveloppement cellulaire. Cette classe de composs

organiques inclut des hmiterpnes, monoterpnes, sesquiterpnes et diterpnes, qui

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prsentent la plus grande diversit structurelle et fonctionnelle parmi les produits naturels

terpnodiques. Ces mtabolites secondaires sont connus, ou prsupposs, avoir des

fonctions spcialises associes des interactions des plantes avec d'autres organismes

vivants dans le contexte de la reproduction, la dfense ou la symbiose (Dudareva et al.,

2004 ; Paschold et al., 2006 ; Gershenzon & Dudareva, 2007).

Les terpnodes forment une partie essentielle des systmes de dfense directs et

indirects contre les herbivores et les pathognes. Les terpnodes peuvent agir dans la

dfense directe envers les bactries, les champignons, les insectes ou les herbivores comme

des toxines, des antibiotiques ou des rpulsifs (Bohlmann & Keeling, 2008). Ils peuvent

galement constituer, des obstacles chimiques et physiques l'alimentation ou

l'oviposition dinsectes (Keeling & Bohlmann, 2006 ; Heiling et al., 2010), ou agir comme

des analogues des hormones d'insectes. Plusieurs tudes ont montr que l'alimentation des

insectes affecte lmission et la synthse des terpnes chez le mas (Turlings et al., 1990),

le coton (Rose et al., 1996), le tabac (Kessler & Baldwin, 2002) et les conifres

(Lewinsohn et al., 1991 ; Martin et al., 2002 ; Martin et al., 2003 ; Miller et al., 2005). Les

monoterpnes et les diterpnes fournissent la majorit des mtabolites constitutifs et

induits de lolorsine pour la protection des conifres (Bohlmann & Croteau, 1999 ;

Phillips & Croteau, 1999 ; Seybold et al., 2000 ; Trapp & Croteau, 2001a ; Martin et al.,

2002). Chez les conifres, ces terpnes participent au scellage des blessures suite un

dommage mcanique (olorsine chez le grand sapin, Abies grandis et l'pinette de Sitka,

Picea sitchensis). Les phytoalexines sont des composs de faible poids molculaire (PM)

produits dans le cadre du systme de dfense. Dans de nombreuses espces vgtales les

diterpnes et les sesquiterpnes agissent comme phytoalexines. Chez le riz (Oryza sativa),

par exemple, quatorze diterpnodes phytoalexines ont t identifis (Cheng et al., 2007).

Les terpnodes vgtaux peuvent influencer la communication entre insectes par des

actions de type phromone (Crock et al., 1997) ou comme des prcurseurs de phromones

(Pickett, 1991). Ils peuvent interfrer dans le dveloppement des insectes comme

analogues d'hormones (Bowers et al., 1976 ; Bowers, 1991). D'autres espces vgtales

sont connues pour leur capacit synthtiser des terpnes antimicrobiens comme une

dfense contre les bactries et les champignons pathognes (Stoessl et al., 1976).

Par des phnomnes de dfense indirecte, les plantes ont la capacit de se dfendre

contre les herbivores via le renforcement de l'efficacit des ennemis naturels des

herbivores. Ces caractristiques constitutives ou inductibles comprennent galement des

terpnodes de faible PM qui sont souvent librs en tant que substances volatiles de

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plantes avant ou pendant l'attaque par les herbivores. Un des exemples les plus tonnants

de la dfense indirecte des plantes est la libration d'un mlange de composs volatils qui

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