THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS XIIdoxa.u-pec.fr/theses/th0245450.pdfTHESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS XII Spécialité Neurosciences Présentée par Caroline BOUVRAIS-VERET

THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS XII

Spécialité Neurosciences

Présentée par

Caroline BOUVRAIS-VERET

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR EN SCIENCES de L’UNIVERSITE PARIS XII

Sujet de la thèse :

Etude des partenaires protéiques du transporteur de la dopamine et

Caractérisation des phénotypes nicotinique et dopaminergique des souris invalidées pour le gène de la protéine STOP

Soutenue le 14 Novembre 2006 devant la commission d’examen :

Pr Josette CADUSSEAU Présidente Pr Philip GORWOOD Rapporteur Dr Denis HERVE Rapporteur Pr Jean-Marie LAUNAY Examinateur Dr Philippe VERNIER Examinateur Dr Marie-Pascale MARTRES Directrice de thèse Dr Bruno GIROS Invité

BOUVRAIS-VERET – Thèse de Doctorat en Sciences – 2006 1

REMERCIEMENTS

Ce travail de thèse a été effectué au sein de l’unité INSERM U513, « Neurobiologie et Psychiatrie » dirigée par Bruno Giros, qui a également supervisé la première partie de mes travaux. Je tiens à le remercier de m’avoir donné la chance d’expérimenter la recherche et de m’avoir fait partager sa grande connaissance scientifique. Marie-Pascale Martres a dirigé la deuxième partie de ma thèse. Je la remercie sincèrement d’avoir pris la relève afin que je sois en mesure de soutenir cette thèse. Merci pour ses encouragements, sa disponibilité et les relectures attentives de ce manuscrit. Mes vifs remerciements à Denis Hervé, Philip Gorwood, Philippe Vernier et Jean-Marie Launay qui ont accepté de prendre le temps de juger ce travail. Je suis reconnaissante à Salah El Mestikawy de m’avoir initiée à la microscopie à fluorescence et aux logiciels de mise en forme d’images. Merci à Marika Nosten-Bertrand pour ses précieux conseils concernant le comportement et à Stéphane Jamain, qui a un jour sauvé mon ordinateur… Merci à Jacqueline Gilchrist pour ses conseils et à Marie-Aude Plamont, qui a participé avec rigueur à une partie de ce travail. Merci aux animaliers Laurent et Béatrice de s’être occupés avec douceur de mes petites souris. Ces cinq années passées au laboratoire m’ont permis de faire la connaissance et de lier amitié avec Stéphanie Weiss et Cécile Denis. Steph, merci pour tous ces échanges, ces moments de complicité entre thésardes et ces discussions pseudo-philosophiques interminables. Merci Cécile pour ta bonne humeur, ton dynamisme et tes petites histoires de nana. Un vrai grand merci les filles pour votre soutien et nos fou-rires ; vous m’avez rendu cette thèse plus agréable. Je pense également à tous les membres du laboratoire avec qui j’ai partagé des discussions scientifiques ou extra-scientifiques, composant des moments instructifs et agréables. Merci à Anne Amphoux, Vincent Vialou et Fabien Chevalier pour les bons moments passés ensemble. Merci à la patiente Laure Balasse pour son aide sur photoshop/illustrator, et merci à Odile Poirel pour sa gentillesse et ses délicieux renforts diététiques… ! J’ai également effectué ce travail de thèse grâce aux encouragements et au soutien constant de mon petit groupe d’amis scientifiques. Un immense merci à Christelle, Shirley et Annabelle pour leur présence, ainsi qu’à Margot, Mathilde et Roland. Merci à Quentin d’être là. Je remercie mon père pour ses encouragements quasi-quotidiens !

A ma maman


PREAMBULE

Cette thèse se compose de deux parties.

La première concerne l’étude des partenaires moléculaires du transporteur de la

dopamine. A mon arrivée au laboratoire, un crible double-hybride avait été réalisé pour

plusieurs transporteurs, dont le transporteur de la dopamine (DAT). J’ai choisi plusieurs

clones d’intérêt et tenté de valider et de caractériser leur interaction avec le DAT par

différentes méthodes. Des difficultés techniques, discutées dans la première partie de cette

thèse, ont empêché la bonne progression de mon travail, qui n’a pu aboutir à une

publication.

Je me suis donc tournée vers la caractérisation des souris invalidées pour la protéine

associée aux microtubules STOP (STOP KO ; Andrieux et al., 2002). Plus précisément, j’ai

étudié divers aspects des phénotypes nicotinique et dopaminergique de ces souris. Les

résultats de cette recherche font l’objet de la deuxième partie de cette thèse. Ces travaux ont

donné lieu à deux manuscrits, actuellement soumis pour publication ou en préparation.

L’introduction de la première partie présentera le système dopaminergique et le DAT,

son implication dans divers troubles mentaux et ses partenaires déjà identifiés. Suivront les

chapitres matériels et méthodes et résultats qui seront présentés et discutés en parallèle,

suivis d’une conclusion.

La deuxième partie est présentée sous forme d’articles, avec une introduction

définissant en premier lieu la schizophrénie ainsi que les données liant le système

nicotinique à cette maladie, puis présentant le modèle d’étude des souris STOP KO. Les

résultats seront présentés sous forme de deux articles et analysés dans un chapitre

discussion.


TABLE DES MATIERES

Remerciements___________________________________________________________ 1 Préambule_______________________________________________________________ 2 Table des matières________________________________________________________ 3 Liste des figures__________________________________________________________ 7 Liste des abreviations _____________________________________________________ 9

PARTIE 1_________________________________________________________ 11

INTRODUCTION _________________________________________________________ 12

A/ La neurotransmission dopaminergique ___________________________________ 13 1/ Les voies dopaminergiques centrales ___________________________________ 13 2/ Le métabolisme de la dopamine ________________________________________ 14 3/ Les récepteurs dopaminergiques_______________________________________ 16

a/ Propriétés et structure ______________________________________________________ 16 b/ Localisation ______________________________________________________________ 17

B/ Le transporteur de la dopamine (DAT) ____________________________________ 18 1/ Les transporteurs plasmiques neuronaux : aspects généraux _______________ 18

a/ Classification _____________________________________________________________ 18 b/ Fonction_________________________________________________________________ 20

2/ Clonage et propriétés structurales du transporteur de la dopamine __________ 21 a/ Clonage _________________________________________________________________ 21 b/ Structure ________________________________________________________________ 21 c/ Relation structure/fonction ___________________________________________________ 23 d/ Oligomérisation du DAT ____________________________________________________ 25

3/ Distribution tissulaire ________________________________________________ 26 a/ Localisation des ARNm _____________________________________________________ 26 b/ Localisation de la protéine___________________________________________________ 27 c/ Localisation ultrastructurale __________________________________________________ 27

4/ Mode de fonctionnement/électrophysiologie _____________________________ 27 a/ Stoechiométrie____________________________________________________________ 27 b/ Différents états de conductance ______________________________________________ 28 c/ Fonctionnement en mode inverse _____________________________________________ 28

5/ Pharmacologie ______________________________________________________ 29 a/ Liaison aux catécholamines _________________________________________________ 29 b/ Modèles cellulaires versus synaptosomes ______________________________________ 31 c/ Le DAT comme cible des psychostimulants _____________________________________ 32 d/ Le DAT comme cible de toxines ______________________________________________ 32

Table des matières


6/ Processus de régulation ______________________________________________ 33 a/ Régulation par glycosylation _________________________________________________ 33 b/ Régulation par phosphorylation_______________________________________________ 33 c/ Régulation par les substrats et les inhibiteurs ____________________________________ 34 d/ Régulation par les récepteurs dopaminergiques __________________________________ 35 e/ Régulation par interaction directe avec des protéines partenaires ____________________ 36

7/ Implication du DAT dans différentes pathologies psychiatriques ____________ 36 a/ La dépendance aux drogues : exemple de la cocaïnomanie ________________________ 36 b/ Le désordre de l’hyperactivité et du déficit d’attention (ADHD) _______________________ 40

8/ Les souris invalidées pour le DAT : modèle animal pour la schizophrénie et l’ADHD ? _____________________________________________________________ 43

a/ Phénotype _______________________________________________________________ 43 b/ Un modèle pour la schizophrénie ? ____________________________________________ 46 c/ Un modèle pour l’ADHD ? ___________________________________________________ 46

C/ DAT et protéines partenaires ____________________________________________ 47 1/ La protéomique : définition et intérêt____________________________________ 47 2/ Principe du double-hybride____________________________________________ 47 3/ Avantages et limites _________________________________________________ 50 4/ Les partenaires identifiés du DAT ______________________________________ 50

a/ Interaction directe avec l’extrémité carboxy-terminale du DAT _______________________ 51 b/ Interaction directe avec l’extrémité amino-terminale du DAT ________________________ 53 c/ Autres interactions_________________________________________________________ 54

MATERIELS ET METHODES _______________________________________________ 56

RESULTATS ____________________________________________________________ 61

A/ Etude de partenaires potentiels du DAT ___________________________________ 62 1/ Crible double-hybride ________________________________________________ 62 2/ Clones sélectionnés__________________________________________________ 63

a/ Sh2bp1 _________________________________________________________________ 63 b/ ACIII____________________________________________________________________ 64

3/ Etude anatomique ___________________________________________________ 64 4/ Co-expression avec le DAT ____________________________________________ 65

a/ Capture de [3H]-dopamine___________________________________________________ 65 b/ Immuno-fluorescence ______________________________________________________ 69

5/ Interaction en double-hybride__________________________________________ 71 a/ Résultats ________________________________________________________________ 72 b/ Difficultés rencontrées ______________________________________________________ 73 c/ Discussion _______________________________________________________________ 75

B/ Expression de la synucléine 1 chez les souris DAT KO ______________________ 76 1/ Expression des ARNm________________________________________________ 76 2/ Expression de la protéine _____________________________________________ 78 3/ Discussion _________________________________________________________ 79

Table des matières


CONCLUSION ___________________________________________________________ 81 A/ Etude de l’interaction DAT-partenaire _____________________________________ 82 B/ Etude du rôle fonctionnel de l’interaction DAT-partenaire ____________________ 83 C/ Etude de l’expression de la synucléine 1 chez les souris DAT KO _____________ 84

PARTIE 2_________________________________________________________ 86

INTRODUCTION _________________________________________________________ 87

A/ La schizophrénie ______________________________________________________ 88 1/ Définition et évolution ________________________________________________ 88 2/ Etiologie : deux composantes _________________________________________ 89

a/ Aspects génétiques ________________________________________________________ 90 b/ Aspects environnementaux __________________________________________________ 91

3/ Etiologie : les différentes hypothèses ___________________________________ 91 a/ L’hypothèse dopaminergique ________________________________________________ 91 b/ L’hypothèse glutamatergique ________________________________________________ 93 c/ La théorie neuro-développementale ___________________________________________ 95 d/ Une maladie de la synapse ? ________________________________________________ 96

4/ Le traitement de la schizophrénie ______________________________________ 98 5/ Les modèles animaux pour la schizophrénie _____________________________ 98

a/ Modèles pharmacologiques__________________________________________________ 99 b/ Modèles neuro-développementaux ____________________________________________ 99 c/ Modèles génétiques_______________________________________________________ 101

B/ Nicotine et schizophrénie ______________________________________________ 102 1/ Le système cholinergique ____________________________________________ 102

a/ Voies cholinergiques centrales ______________________________________________ 102 b/ Métabolisme de l’acétylcholine ______________________________________________ 103

2/ La transmission cholinergique ________________________________________ 104 a/ Les récepteurs muscariniques_______________________________________________ 104 b/ Les récepteurs nicotiniques neuronaux________________________________________ 105

3/ Relation entre nicotine et schizophrénie ________________________________ 111 a/ Etudes épidémiologiques __________________________________________________ 111 b/ Expression des récepteurs nicotiniques chez les schizophrènes ____________________ 112

4/ La nicotine comme forme d’auto-médication ____________________________ 113 a/ Amélioration des symptômes et des effets secondaires ___________________________ 113 b/ Amélioration des déficits sensoriels___________________________________________ 113 c/ Amélioration des déficits cognitifs ____________________________________________ 116

Table des matières


C/ La protéine STOP_____________________________________________________ 117 1/ Microtubules et protéines associées ___________________________________ 117

a/ Les microtubules _________________________________________________________ 117 b/ Les protéines associées aux microtubules _____________________________________ 118

2/ La protéine STOP ___________________________________________________ 118 3/ Les souris STOP KO ________________________________________________ 121

a/ Caractérisation anatomique et physiologique ___________________________________ 121 b/ Caractérisation biochimique ________________________________________________ 122 c/ Caractérisation comportementale ____________________________________________ 123 d/ Un modèle pour la schizophrénie ? ___________________________________________ 124

RESULTATS ___________________________________________________________ 125

ARTICLE I : Augmentation de la densité des récepteurs nicotiniques alpha7 chez les souris STOP KO et amélioration par la choline d’un déficit d’apprentissage de type associatif____________________________________________________________ 126

ARTICLE II : Altérations préférentielles du système dopaminergique limbique des souris STOP KO ______________________________________________________ 154 RESULTATS COMPLEMENTAIRES ______________________________________ 183

DISCUSSION___________________________________________________________ 186

A/ Altérations biochimiques des souris STOP KO ____________________________ 187 1/ Marqueurs nicotiniques/cholinergiques et dopaminergiques _______________ 187 2/ Altérations biochimiques ____________________________________________ 188

B/ Altérations comportementales des souris STOP KO________________________ 191 1/ Sensibilité aux psychostimulants______________________________________ 191 2/ Performances mnésiques ____________________________________________ 195

C/ Effets localisés de l’inactivation de STOP ________________________________ 197 D/ Validité du modèle d’étude STOP KO pour la schizophrénie _________________ 198

1/ Modélisation animale des maladies psychiatriques _______________________ 198 2/ Pertinence du modèle STOP KO : un modèle pour la schizophrénie ? _______ 199

REFERENCES__________________________________________________________ 202


LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Schéma illustrant les principaux corps cellulaires dopaminergiques et leurs projections dans

le cerveau de rat________________________________________________________________________ 14 Figure 2 : Schéma représentant les voies anabolique et catabolique de la dopamine_____________ 15 Figure 3 : Schéma d’une synapse dopaminergique__________________________________________ 17 Figure 4 : Tableau représentant les deux classes de transporteurs plasmiques neuronaux________ 19 Figure 5 : Représentation schématique d’une terminaison neuronale contenant les différents types de

transporteurs neuronaux. ________________________________________________________________ 20 Figure 6 : Représentation schématique de la structure secondaire prédite du transporteur de la

dopamine humain_______________________________________________________________________ 22 Figure 7 : Représentation schématique des différents domaines fonctionnels du DAT ____________ 24 Figure 8 : Constantes d’inhibition de différentes molécules pour le transporteur de la dopamine.___ 30 Figure 9 : Tableau présentant les affinités et les capacités de transport du DAT et du NET pour la

dopamine et la noradrénaline_____________________________________________________________ 31 Figure 10 : Représentation schématique des adaptations moléculaires touchant les synapses des

souris DAT KO _________________________________________________________________________ 44 Figure 11 : Le système du double-hybride en levure_________________________________________ 48 Figure 12 : Stratégie de double-hybride à grande échelle ____________________________________ 49 Figure 13 : Schéma des interactions démontrées entre le DAT et différentes protéines ___________ 55 Figure 14 : Clones sélectionnés, issus du crible double-hybride en levure dirigé contre le rDAT ___ 62 Figure 15 : Répartition des ARNm du DAT et de Sh2bp1_____________________________________ 65 Figure 16 : Capacité de transport moyenne de [3H]-dopamine par le DATco-exprimé avec la

synucléine 1 ou Sh2bp1 _________________________________________________________________ 66 Figure 17: Constante d’affinité moyenne du DAT pour la [3H]-dopamine co-exprimé avec la synucléine

1 ou Sh2bp1 ___________________________________________________________________________ 67 Figure 18 : Observation de la morphologie des cellules transfectées. __________________________ 70 Figure 19 : Marquage du DAT par immuno-fluorescence dans des cellules HEK293 _____________ 70 Figure 20 : Immuno-fluorescence du DAT, de la synucléine 1 sur des coupes de striatum de rat___ 71 Figure 21 : Tableau représentant les résultats des interactions étudiées par double-hybride en levure

______________________________________________________________________________________ 73 Figure 22 : Détection par western-blot de protéines de fusion pLEX sur différents extraits protéiques

de levures transformées _________________________________________________________________ 75 Figure 23 : Marquage des ARNm de la synucléine 1 par hybridation in situ de souris sauvages et DAT

KO____________________________________________________________________________________ 77 Figure 24 : Quantification des ARNm et de la protéine synucléine 1 chez des souris sauvages et DAT

KO____________________________________________________________________________________ 78

Liste des figures


Figure 25 : Expression de la protéine synucléine 1 au niveau du striatum et de la substance noire de

souris sauvages et DAT KO ______________________________________________________________ 79 Figure 26 : Evolution clinique et pathophysiologique de la schizophrénie _______________________ 89 Figure 27 : Modulations opposées de la transmission glutamatergique NMDA par les récepteurs

dopaminergiques D1 et D2 sur les neurones GABA « medium spiny » du striatum _______________ 94 Figure 28 : Etapes de l’hypothèse neuro-développementale conduisant à la schizophrénie _______ 95 Figure 29 : Schéma illustrant les principaux noyaux cholinergiques et leurs projections dans le

cerveau de rat_________________________________________________________________________ 103 Figure 30 : Représentation schématique des voies de signalisation médiées par les deux types de

récepteurs muscariniques_______________________________________________________________ 105 Figure 31 : Représentation schématique d’un récepteur nicotinique ancré dans la membrane

plasmique ____________________________________________________________________________ 106 Figure 32 : Représentation des sites allostériques d’un récepteur nicotinique __________________ 107 Figure 33 : Distribution différentielle des ARNm de différentes sous-unités des récepteurs nicotiniques

dans le cerveau de rat __________________________________________________________________ 109 Figure 34 : Représentation schématique de la localisation des récepteurs nicotiniques au niveau

terminal du neurone ou préterminal_______________________________________________________ 110 Figure 35 : Représentation schématique de récepteurs nicotiniques postsynaptiques ___________ 111 Figure 36 : Représentation du paradigme de l’inhibition du réflexe de sursaut__________________ 114 Figure 37 : Représentation du paradigme de la suppression de l’onde P50 ____________________ 115 Figure 38 : Représentation schématique d’un microtubule___________________________________ 117 Figure 39 : Structure du gène et protéines STOP __________________________________________ 120 Figure 40 : Analyse de la stabilité au froid de microtubules dans des cultures primaires neuronales de

souris sauvages et invalidées pour la protéine STOP _______________________________________ 121


LISTE DES ABREVIATIONS

3-AT : 3-amino-1,2,4-triazole 5-HT : 5-hydroxytryptophane (sérotonine) AC : Adénylate Cyclase AD: Activator Domain ADHD: Attention Deficit Hyperactivity Disorder ADNc : Acide DéoxyriboNucléique complémentaire AMPA : alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid AMPc : Adénosine Mono-Phosphate cyclique ARNm : Adénosine RiboNucléique messager ATP : Adénosine Tri-Phosphate ATV: Aire Tegmentale Ventrale CaMKII: Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II COMT : Catéchol-O-Méthyltransférase DAT : Dopamine Transporter DBD: DNA Binding Domain DTT: Dithiothréitol GABA: Gamma-AminoButyric Acid GTP : Guanosine Tri-Phosphate HEK293 : Human Embryonic Kidney 293 HPLC: High Pressure Liquid Chromatography Km: constante de Michaelis-Menten LTD: Long Term Depression LTP: Long Term Potentiation MAO : Mono-Amine Oxidase MAP : Microtubule-Associated Protein MDCK : Madin-Darby canine kidney MPP+ : 1-Méthyl-4-Phénylpiridinium MPTP : 1-Méthyl-4-Phényl-1,2,3,6-Tétrahydropyridine nAChR: nicotinic Acetylcholine Receptor NET : Norepinephrine Transporter NMDA: N-Méthyl-D-Aspartate PBS : Phosphate Buffered Saline PCP : Phencyclidine PCR: Polymerase Chain Reaction PICK1: Protein Interacting with C Kinase 1 PKA : Protéine Kinase A PKC : Protéine Kinase C PPI: Pre-Pulse Inhibition RACK1: Receptor for Activated C-Kinase 1 SERT : Serotonin Transporter Sh2bp1 : SH2 binding protein 1 SNAP: Synaptosomal Associated Protein SNARE: SNAP Receptor SNc : Substance Noire compacte STOP : Stable Tubule Only Polypeptide TH: Tyrosine Hydroxylase TM: Transmembrane Domain TPR: Tetratricopeptide Repeat

Liste des abreviations


VAChT : Vesicular Acetylcholine Transporter VGLUT1: Vesicular Glutamate Transporter 1 VMAT2: Vesicular Monoamine Transporter 2 Vmax: Vitesse maximale de transport


PARTIE 1


INTRODUCTION

Partie 1 - Introduction


Avant les travaux de Carlsson en 1958, la dopamine n’était connue qu’en tant

qu’intermédiaire métabolique de la voie de biosynthèse de la noradrénaline. Depuis, une

multitude de travaux a démontré son rôle de neuromédiateur à part entière et sa participation

essentielle à un grand nombre de fonctions du système nerveux telles que l’activité motrice,

l’éveil, les fonctions d’apprentissage et de mémoire, les émotions et les processus de

récompense. Des perturbations du système dopaminergique sont à l’origine de la maladie de

Parkinson et ont également été observées ou présumées dans des maladies psychiatriques

telles que la schizophrénie, le désordre de l’hyperactivité et du déficit d’attention (ADHD), le

syndrome Gilles de la Tourette et la dépendance aux drogues.

A/ La neurotransmission dopaminergique

1/ Les voies dopaminergiques centrales

Par différentes techniques d’anatomie (histofluorescence de la dopamine,

immunofluorescence de son enzyme de synthèse, anticorps anti-dopamine ; Lindvall et al.,

1984), une cartographie des voies neuronales dopaminergiques a été établie. Le système

dopaminergique central se compose de plusieurs noyaux constituant des systèmes

anatomiques distincts, dont le système tubéro-infundibulaire et le système mésencéphalique

(figure1).

Le premier, qui régule la sécrétion des hormones hypophysaires, comprend de

nombreux noyaux hypothalamiques (A11 à A14) dont les axones se projettent au niveau de

l’éminence médiane et dans le système porte au niveau du lobe intermédiaire de l’hypophyse

(Lindvall et al., 1984).

Le second, qui contient la majorité des neurones dopaminergiques, est un système à

projections longues et se divise en trois noyaux :

A8 : ou extension postéro-latérale de la substance noire, envoyant ses projections dans

la partie ventrale du striatum ;

A9 : ou substance noire compacte (SNc), projetant majoritairement dans le striatum

dorsal (Anden et al., 1965), constituant la voie nigro-striée, impliquée dans le contrôle de

l’activité motrice (pour revue, voir Amalric and Koob, 1993). La dégénérescence de ces

neurones est à l’origine de la maladie de Parkinson (Hornykiewicz, 1966) ;



A10 : ou aire tegmentale ventrale (ATV), se projetant, d’une part, dans les aires frontale,

cingulaire et entorhinale du cortex (Emson and Koob, 1978; Swanson, 1982) constituant la voie

méso-corticale; d’autre part, dans le noyau accumbens et les tubercules olfactifs, ainsi que

d’autres structures limbiques comme le septum, l’amygdale, l’hippocampe et le cortex piriforme

(Swanson, 1982), formant ainsi la voie méso-limbique. Ces deux voies interviennent dans le

contrôle des fonctions cognitives, des émotions et des processus de dépendance aux drogues

(pour revue, voir Hyman, 1996; Koob, 1996).

Figure 1 : Schéma illustrant les principaux corps cellulaires dopaminergiques et leurs projections dans le cerveau de rat. ARC : noyau arqué

2/ Le métabolisme de la dopamine

La dopamine appartient à la famille des catécholamines, comprenant également la

noradrénaline et l’adrénaline et, comme tous les neuromédiateurs ne franchit pas la barrière

hémato-encéphalique. En revanche, ses précurseurs, les acides aminés phénylalanine et

tyrosine, la traversent. La synthèse neuronale de dopamine se déroule dans le cytoplasme,

essentiellement au niveau des terminaisons axonales, mais aussi au niveau des corps

cellulaires et des dendrites. La L-tyrosine captée par le neurone est transformée en L-DOPA

par la tyrosine hydroxylase (TH), enzyme limitante de cette voie de synthèse, puis en dopamine

par la DOPA décarboxylase (figure 2). La dopamine synthétisée est alors concentrée dans des

vésicules présynaptiques au niveau des terminaisons neuronales grâce au transporteur

vésiculaire des monoamines VMAT-2. Ce stockage protège la dopamine de la dégradation

enzymatique intracellulaire réalisée par les monoamine-oxydases (MAO), au sein des

mitochondries, de l‘oxydation et de la génération de radicaux libres, toxiques pour la cellule. La

Pituitary

ARC



dopamine libérée dans l’espace synaptique est catabolisée par une enzyme gliale, la catéchol-

O-méthyltransférase (COMT) et par la MAO, aboutissant aux métabolites finaux : acide 3,4-

dihydrophénylacétique (DOPAC), 3-méthoxytyramine (3-MT) et acide homovanillique (HVA).

Sous l’influence d’un potentiel d’action, la dopamine est libérée par exocytose dans

l’espace synaptique et se lie à des récepteurs spécifiques pré- ou post-synaptiques afin

d’exercer son action.

La fin du signal se fait par l’élimination physique du neurotransmetteur de l’espace

synaptique. Plusieurs mécanismes entrent en jeu : diffusion ; recapture de la dopamine par les

terminaisons qui l’ont libérée via son transporteur spécifique, le transporteur de la dopamine

(DAT) ; capture par les cellules gliales avoisinantes ou encore dégradation enzymatique, au

niveau extracellulaire, par la COMT.

Figure 2 : Schéma représentant les voies anabolique et catabolique de la dopamine. COMT : catéchol-O-méthyltransférase ; DA : dopamine ; DOPAC : acide 3,4-dihydrophénylacétique ; DOPA DEC : dopa-décarboxylase; HVA : acide homovanillique; MAO : monoamine-oxydase; TH : tyrosine hydroxylase; 3-MT : 3-méthoxytyramine



3/ Les récepteurs dopaminergiques

a/ Propriétés et structure

Contrairement aux acides aminés excitateurs (glutamate, aspartate) et inhibiteurs

(GABA, glycine) qui activent des récepteurs-canaux, engendrant une variation immédiate du

potentiel membranaire, la dopamine est plutôt considérée comme un neuromodulateur car elle

agit via des récepteurs métabotropiques, aboutissant à une réponse cellulaire plus lente.

Historiquement, les récepteurs dopaminergiques D1 et D2 ont été différenciés par leurs

propriétés pharmacologiques et biochimiques, en fonction de leur capacité à lier différents

ligands et de leur couplage à l’adénylate cyclase (Kebabian and Calne, 1979). Depuis, par des

techniques de biologie moléculaire, cinq gènes codant pour cinq récepteurs dopaminergiques

ont été clonés (voir Sibley and Monsma, 1992; Sokoloff et al., 1995; Jaber et al., 1996). Ces

récepteurs à sept domaines transmembranaires sont classés en deux sous-familles : ceux

appartenant à la famille D1 (D1, D5), couplés à une protéine Gs ou Golf, stimulant l’activité de

l’adénylate cyclase et donc la synthèse d’AMPc et les autres, constituant la famille D2 (D2, D3,

D4), couplés à une protéine Gi ou Go, inhibant l’activité de l’adénylate cyclase (figure 3). On

peut également mentionner que les récepteurs dopaminergiques peuvent être couplés à

d’autres voies de transduction, telles que la régulation de l’activité de canaux calcium et

potassium et la libération d’acide arachidonique.

Au niveau structurel, on peut distinguer les récepteurs de la famille D1, qui possèdent

une longue extrémité C-terminale cytoplasmique et une troisième boucle cytoplasmique courte

tandis que les récepteurs de la famille D2 ont une extrémité C-terminale très courte mais une

troisième boucle cytoplasmique beaucoup plus longue (pour revue, voir Sibley and Monsma,

1992). D’autre part, contrairement aux récepteurs de la famille D1, les récepteurs de la famille

D2 possèdent un certain nombre d’introns qui interrompent la séquence codante de leur gène.

L’existence de ces introns est à l’origine d’isoformes dont les plus connues et étudiées sont les

formes courte (D2-S) et longue (D2-L) du récepteur D2 (Giros et al., 1989).

Il existe également des différences d’affinité de la dopamine pour ses récepteurs : de

l’ordre du micromolaire pour les récepteurs D1 et D2, submicromolaire pour les récepteurs D4

et D5 et nanomolaire pour le D3.



Figure 3 : Schéma d’une synapse dopaminergique

AC : adénylate cyclase ; AMPc : adénosine monophosphate cyclique ; DA : dopamine ; DAT : transporteur de la dopamine

Les récepteurs D2 et D3 sont également présents au niveau présynaptique en tant

qu’autorécepteurs où ils exercent un rétrocontrôle négatif sur la libération finale de dopamine.

En effet, leur activation au niveau terminal provoque l’inhibition de l’activité de la TH et/ou

réprime la libération de dopamine suscitée par la dépolarisation des terminaisons ; au niveau

somatodendritique, leur stimulation par la dopamine, libérée par les varicosités dendritiques,

engendre une hyperpolarisation membranaire, conduisant à l’inhibition de l’activité électrique du

neurone.

b/ Localisation

Il y a une quinzaine d’années, il n’existait pas ou peu de radioligand sélectif, capable de

discriminer un seul sous-type de récepteur dopaminergique, rendant les expériences de

radioliaison difficiles. On s’est donc tourné majoritairement vers des techniques d’hybridation in

situ, afin de localiser les ARNm des différents récepteurs.

Le récepteur D1 est le plus abondant ; son ARNm est retrouvé au niveau d’aires

régulées par la dopamine (striatum, noyau accumbens, tubercules olfactifs) et au niveau



limbique, thalamique et hypothalamique. Dans certaines régions, l’ARNm du D1 n’est pas

exprimé, bien que la protéine le soit (globus pallidus, substance noire réticulée) : cela signifie

que le récepteur est porté par des neurones de projection. L’expression du récepteur D5 est

réduite à quelques régions comme l’hippocampe et à deux noyaux : le noyau mamillaire latéral

et le noyau parafasciculaire du thalamus (Meador-Woodruff et al., 1991; Tiberi et al., 1991).

Le récepteur D2 est retrouvé au niveau pré-et post-synaptique : il est majoritairement

exprimé dans le striatum, les tubercules olfactifs, le noyau accumbens et porté par les neurones

dopaminergiques de la SNc et de l’ATV. Il est également exprimé dans l’hypophyse où il régule

la production et sécrétion de prolactine et de l’hormone de croissance (Caron et al., 1978).

Dans le striatum, le récepteur D1 est exprimé par les neurones GABA/substanceP/dynorphine

tandis que le récepteur D2 est lui exprimé par une population distincte de neurones GABA, co-

libérant les enképhalines (Le Moine and Bloch, 1995). Le récepteur D3 est plus faiblement

exprimé et restreint au niveau d’aires limbiques telles que le noyau accumbens (« core » et

« shell »), les tubercules olfactifs, les ilots de Calleja et également au niveau de la SNc et de

l’ATV (en tant qu’autorécepteur) et du cervelet (Sokoloff et al., 1990; Bouthenet et al., 1991;

Diaz et al., 1995). Enfin, l’ARNm du récepteur D4 est exprimé au niveau du cortex frontal, de

l’amygdale, de l’hippocampe, de l’hypothalamus, du mésencéphale et très faiblement au niveau

du striatum.

Dans le système nerveux central de rat, l’abondance relative des différents récepteurs

dopaminergiques serait : D1≥D2>>D3≥D5≥D4.

B/ Le transporteur de la dopamine (DAT)

1/ Les transporteurs plasmiques neuronaux : aspects généraux

a/ Classification

Il existe deux familles de transporteurs plasmiques neuronaux à haute affinité, classées

selon leur dépendance ionique : les transporteurs Na/Cl dépendants et les transporteurs Na/K

dépendants (figure 4; pour revue, Masson et al., 1999).



Dépendance Nom Substrat Référence DAT dopamine (Giros et al., 1991) NET noradrénaline (Pacholczyk et al., 1991) Na+/Cl- SERT sérotonine (Blakely et al., 1991) GAT1-3 GABA (Guastella et al., 1990) GLYT1-2 glycine (Guastella et al., 1992) EAAT1 L-Glu/ L-Asp (Storck et al., 1992) EAAT2 L-Glu (Pines et al., 1992) Na+/K+ EAAT3 L-Glu (Kanai and Hediger, 1992) EAAT4 L-Glu (Fairman et al., 1995) EAAT5 L-Glu (Arriza et al., 1997)

Figure 4 : Tableau représentant les deux classes de transporteurs plasmiques neuronaux

L-Asp : L-aspartate ; DAT: transporteur de la dopamine; EAAT1-5: transporteurs des acides aminés excitateurs de type 1-5 ; GAT1 : transporteur de l’acide gamma-amino butyrique ; L-Glu : L-glutamate ; GLYT1 : transporteur de la glycine ; NET : transporteur de la noradrénaline ; PROT : transporteur de la proline ; SERT : transporteur de la sérotonine

• Les transporteurs Na/Cl dépendants

Cette famille comprend les transporteurs des monoamines (dopamine, noradrénaline,

sérotonine), les transporteurs des acides aminés (GABA, glycine, proline et taurine) et les

transporteurs d’osmolites (bétaïne, créatine). Ces transporteurs sont 40 à 60% homologues et

partagent la même topologie prédite, c'est-à-dire une structure à douze domaines

transmembranaires, des extrémités N- et C-terminales intracellulaires et une deuxième boucle

intracytoplasmique contenant des sites potentiels de N-glycosylation.

Ils utilisent comme source d’énergie le gradient électrochimique de sodium créé et

maintenu de part et d’autre de la membrane par la pompe (Na/K)-ATPase (figure 5). Ces

transporteurs sont électrogéniques puisque, pour chaque molécule de substrat transportée, il y

a génération d’une charge positive. Pour le DAT, la stoechiométrie prédite est : 2Na+/1Cl-/1

zwitterion.



Figure 5 : Représentation schématique d’une terminaison neuronale contenant les différents types de transporteurs neuronaux.

Les transporteurs plasmiques et vésiculaires n’utilisent pas directement l’ATP comme source d’énergie, mais le gradient électrochimique généré par des pompes ATPase membranaire et vacuolaire, permettant, respectivement, l’accumulation du neurotransmetteur dans la terminaison et le remplissage des vésicules. Nt : neurotransmetteur ; T : transporteur plasmique ; VT : transporteur vésiculaire

• Les transporteurs Na/K dépendants

Cette famille regroupe les transporteurs des acides aminés excitateurs (glutamate et

aspartate). Ils possèdent six à dix domaines transmembranaires, utilisent également l’énergie

générée par la pompe Na/K et contiennent des sites putatifs de régulation par les protéines

kinases A et C.

b/ Fonction

Afin d’assurer une neurotransmission correcte, il est essentiel que le signal cellulaire soit

bref : après une libération massive de neurotransmetteur, la concentration synaptique doit

rapidement retourner à son niveau de base. Pour une majeure partie, le neurotransmetteur est

ainsi chassé de l’espace extracellulaire par un transporteur plasmique présynaptique ou glial

qui régule donc l’amplitude et la durée de la transmission. Ces transporteurs permettent aussi le

recyclage du neurotransmetteur, qui, une fois recapté peut à nouveau être internalisé au sein

de vésicules grâce à l’action du transporteur vésiculaire, entretenant ainsi le stock de



neurotransmetteur libérable. Dans certains cas, les transporteurs plasmiques neuronaux et

gliaux maintiennent l’intégrité du tissu neuronal. Ainsi, il n’existe pas d’enzyme dégradant le

glutamate dans l’espace synaptique. Les transporteurs plasmiques empêchent alors une

excitotoxicité due à une trop grande concentration extracellulaire de glutamate.

Le rôle essentiel des transporteurs plasmiques des monoamines dans la régulation de la

neurotransmission est illustré par le fait que toute substance qui modifie leur activité a des

effets psychotropes majeurs. Ces transporteurs constituent ainsi la cible primaire des

psychostimulants (cocaïne, amphétamine, ecstasy), de neurotoxines (MPP+, 6-OHDA) et

d’agents thérapeutiques comme les antidépresseurs et le méthylphénidate (Ritalin ; Amara and

Sonders, 1998).

2/ Clonage et propriétés structurales du transporteur de la dopamine

a/ Clonage

Le clonage du transporteur du GABA au début des années 1990 (Guastella et al., 1990)

et celui du transporteur de la noradrénaline (Pacholczyk et al., 1991) ont rapidement permis le

clonage par homologie ou par expression des autres transporteurs Na/Cl dépendants. Le

transporteur de la dopamine a tout d’abord été cloné chez le rat (rDAT, Giros et al., 1991; Kilty

et al., 1991; Shimada et al., 1991), le bœuf (bDAT, Usdin et al., 1991) puis chez l’homme

(hDAT, Giros et al., 1992) et la souris (mDAT, Donovan et al., 1995), mais aussi chez le

nématode C. elegans (CeDAT, Jayanthi et al., 1998).

Le hDAT est composé de 620 acides aminés (rDAT : 619 acides aminés) et partage

92% d’identité en acides aminés avec la séquence de rat. Le gène du hDAT (SLC6A3) est

localisé sur le chromosome 5p15.3 (Giros et al., 1992).

b/ Structure

Comme les autres transporteurs de sa famille, le DAT, selon l’étude de son profil

d’hydrophobicité, est composé de douze segments transmembranaires et possède une longue

boucle extra-cytoplasmique (50-65 résidus) entre le troisième et quatrième domaine

transmembranaire. Les extrémités N- et C-terminales sont intra-cytoplasmiques (figure 6).



Figure 6 : Représentation schématique de la structure secondaire prédite du transporteur de la dopamine humain (hDAT).

Les extrémités N- et C-terminales du DAT sont cytoplasmiques. Il est formé de 12 domaines transmembranaires et contient une longue deuxième boucle extracytoplasmique. Les sites putatifs de liaison à la PKA, PKC, CaMKII, les motifs leucine zippers et les sites de glycosylation sont indiqués. CaMKII: calcium/calmodulin dependent protein kinase II; PKA : protéine kinase A ; PKC : protéine kinase C

Des études d’immunocytochimie en microscopie électronique assurent la localisation

intracellulaire des extrémités (Nirenberg et al., 1997), la localisation extracellulaire de résidus

asparagine impliqués dans la glycosylation (Vandenbergh et al., 1992) et la localisation

intracellulaire de résidus sérine et thréonine impliqués dans la phosphorylation du DAT (Povlock

and Amara, 1998). De plus, un homologue bactérien des transporteurs plasmiques Na/Cl

dépendants a récemment été cristallisé et confirme la structure à douze domaines

transmembranaires et la localisation des extrémités protéiques (Yamashita et al., 2005).

Résidu différant du DAT de rat Site de glycosylation

DAT humain



L’analyse de la séquence primaire du DAT, ainsi que des résultats de mutagenèse et de

biochimie, ont révélé l’existence de plusieurs sites de N-glycosylation au sein de la deuxième

boucle extracellulaire. Des études de marquage par photoaffinité montrent que 20 à 25% de la

masse du DAT mature serait composé de sucres (Vaughan et al., 1996). La séquence du DAT

montre également des sites potentiels de phosphorylation par les protéines kinases PKA, PKC

et CaMKII. L’importance de ces sites sera discutée plus loin dans le paragraphe 6/ Régulations.

La présence de résidus cystéine au niveau de la deuxième boucle extracellulaire suggère

l’existence de ponts disulfure intra- ou extra-moléculaires. De même, deux motifs « leucine-

zipper », impliqués dans les interactions protéine-protéine, ont été détectés dans les deuxième

et neuvième domaines transmembranaires (Giros et al., 1992).

c/ Relation structure/fonction

De précieuses informations sur le lien entre la structure du DAT et sa fonction ont été

obtenues soit par modifications chimiques, soit en jouant sur la séquence primaire, par

mutagenèse dirigée ou par construction de chimères entre DAT et NET. Après transfection

transitoire ou stable des ADN recombinants du DAT (principalement rDAT ou hDAT) dans

différentes lignées cellulaires ou synaptosomes, des expériences de transport de [3H]-dopamine

ou d’autres substrats ont permis de déterminer les paramètres biochimiques (Vmax : vitesse

maximale de transport et Km : constante d’affinité) caractérisant le transporteur mutant et ainsi

de mesurer l’effet fonctionnel de la mutation.

• Expériences de mutagénèse dirigée

Les acides aminés les plus souvent substitués sont les résidus aromatiques, chargés ou

polaires (fonctions amine et hydroxyle), phénylalanine (F), proline (P), tyrosine (Y) et

tryptophane (W). De par leur nature chimique, ces résidus peuvent jouer un rôle déterminant

dans la structure et l’interaction du ligand et de son transporteur. Pour une liste exhaustive des

multiples travaux réalisés jusqu’à présent, se reporter aux revues de Chen and Reith, 2000; Uhl

and Lin, 2003.

La plupart des mutations affectant les résidus localisés dans les régions reliant les TM 1

à 8 ont pour effet de diminuer la vitesse de transport de la dopamine. Au contraire, les

mutations portant sur les acides aminés des régions extracellulaires n’induisent pas ou peu de

réduction du transport (Norregaard et al., 1998; Loland et al., 1999). Des études se sont

également intéressées au transport de la neurotoxine dopaminergique MPP+ et montrent que

certains résidus sérine (S) sont spécifiques du transport de ce produit. Ainsi, les mutations

S350A, S352A S527A, Y533F et S538A affectent la capacité de transport ou l’affinité du DAT



pour le MPP+ (Kitayama et al., 1993; Mitsuhata et al., 1998) sans forcément affecter celles pour

la dopamine.

• Construction de chimères

Des transporteurs chimériques DAT-NET, dans lesquels une partie du transporteur natif a été

échangée symétriquement avec la séquence de l’autre transporteur, ont permis de dégager

trois principaux domaines fonctionnels du DAT (Buck and Amara, 1994; Giros et al., 1994; Buck

and Amara, 1995 ; figure 7) :

Figure 7 : Représentation schématique des différents domaines fonctionnels du DAT.

la partie N-terminale jusqu’au TM5 serait impliquée dans le mécanisme de capture et

la dépendance vis-à-vis des ions (Giros et al., 1994; Syringas et al., 2000). Cette région

est la plus conservée au sein des transporteurs de monoamines, il parait donc probable

qu’elle soit responsable d’une fonction commune à ces trois transporteurs.

Les régions TM5-TM8 gouverneraient les interactions avec les inhibiteurs (cocaïne,

amphétamines et dérivés,..) et l’efficacité de translocation du substrat. La région TM1-

TM3 a également été identifiée comme impliquée dans la reconnaissance des

inhibiteurs (Buck and Amara, 1995).



L’extrémité C-terminale serait engagée dans la stéréosélectivité des substrats. Cette

partie jouerait également un rôle déterminant dans l’adressage du DAT à la membrane

(Torres et al., 2003). En effet, des troncations progressives engendrent des réductions

progressives de la capacité de transport, résultant en l’incapacité de ces mutants à

atteindre la membrane plasmique.

D’autres expériences de chimères entre hDAT et bDAT ont montré que le TM3 était

important pour le transport de la dopamine et la liaison au radioligand [3H]-CFT, un analogue de

la cocaïne (Lee et al., 1998).

Un des buts importants de ces recherches est la lutte contre la pharmacodépendance.

En identifiant les régions distinctes du DAT responsables de la reconnaissance de la cocaïne et

du transport de la dopamine, on peut envisager de synthétiser un composé qui empêcherait la

liaison de la drogue sans pour autant affecter la reconnaissance et le transport de dopamine

(Uhl and Lin, 2003; voir paragraphe 7/ a/).

d/ Oligomérisation du DAT

On s’est assez récemment intéressé à l’oligomérisation potentielle des transporteurs

plasmiques. En 2000, celle du transporteur de la sérotonine (Kilic and Rudnick, 2000) a été

démontrée, suivie de celle du transporteur du GABA (Schmid et al., 2001).

Torres et collaborateurs se sont penchés sur le cas du DAT en choisissant une analyse

mutationnelle, combinée à des approches biochimique, immunologique et fonctionnelle (Torres

et al., 2003). L’expression en système cellulaire de protéines DAT étiquetées a permis, par co-

immunoprécipitation, de montrer l’association physique du DAT avec lui-même. La co-

expression de mutants perte de fonction Y335A ou D79G (ayant perdu leur activité de transport

mais correctement adressés à la membrane) avec un DAT sauvage empêche le

fonctionnement correct de ce dernier. De même, la co-expression de mutants tronqués en N-

ou C- terminal, ayant un adressage membranaire déficient, réduit la fonction du transporteur

sauvage. Ces expériences établissent l’oligomérisation fonctionnelle du DAT : ces deux types

de mutants tronqués, dominants négatifs, diminuent l’activité du DAT sauvage, soit en formant

un complexe oligomérique à la membrane cellulaire, soit en interférant avec les mécanismes

normaux de maturation et de trafic du DAT sauvage (Torres et al., 2003). Cette étude a

également révélé l’importance des motifs d’interaction protéique leucine-zippers, suspectée lors

du clonage moléculaire. La substitution de ce motif contenu dans le TM2 engendre un

transporteur ayant perdu son activité de transport du fait de son incapacité à être adressé à la



membrane. De plus, si l’on supprime le motif leucine-zipper dans les mutants Y335A et D79G,

l’effet de dominance négative est perdu, suggérant la participation de cette séquence à une

interaction monomère-monomère. Le deuxième motif leucine-zipper contenu dans le TM9 ne

semble pas avoir les mêmes propriétés. En conclusion, ces travaux montrent que le DAT forme

un complexe oligomérique au sein de cellules, dont l’assemblage est requis pour l’adressage

correct du complexe à la membrane.

Par une approche de pontage de résidus cystéine, Hastrup et collaborateurs ont montré

que le DAT formait au moins un homodimère (Hastrup et al., 2001), puis un dimère de dimère

(tétramère) au sein de la membrane plasmique, faisant intervenir des acides aminés présents

au niveau des TM4 et TM6 (Hastrup et al., 2003). De façon intéressante, des inhibiteurs du

DAT, benztropine, mazindol et l’analogue de la cocaïne MFZ 2-12, inhibent le pontage,

suggérant qu’un inhibiteur de transport ne serait pas un simple bloqueur mais pourrait de lui-

même engendrer un réarrangement conformationnel du DAT.

Enfin, l’oligomérisation du DAT a également été illustrée par la technique de FRET

(Fluorescence Resonance Energy Transfer Microscopy) au sein de cellules vivantes, entre

deux protéines de fusion exprimant hDAT en phase avec des molécules fluorescentes YFP

(Yellow Fluorescent Protein) et CFP (Cyan Fluorescent Protein; Sorkina et al., 2003). Les

oligomères seraient formés au sein du réticulum endoplasmique et maintenus à la membrane

cellulaire ainsi que lors de leur internalisation éventuelle au sein d’endosomes.

3/ Distribution tissulaire

Le DAT est exclusivement retrouvé dans les neurones synthétisant et libérant de la

dopamine, et non dans les neurones catécholaminergiques utilisant la dopamine comme

précurseur.

a/ Localisation des ARNm

Des travaux d’hybridation in situ ont permis de localiser les transcrits du DAT en majorité

au niveau de la substance noire compacte (SNc ; A9), l’extension postéro-latérale de la

substance noire (A8), l’aire tegmentale ventrale (ATV ; A10), mais également au niveau du

noyau arqué dorsal (A12) et de la substance noire réticulée (SNr ; Lorang et al., 1994; Hoffman

et al., 1998).



b/ Localisation de la protéine

Au niveau protéique, le DAT est exprimé aussi bien dans les terminaisons que dans les

corps cellulaires, dendrites et axones des neurones dopaminergiques issus du mésencéphale

(Ciliax et al., 1995; Ciliax et al., 1999). Ainsi, on le retrouve sur l’ensemble des voies nigro-striée

et méso-cortico-limbique et de façon plus intense, au niveau des régions à terminaisons :

striatum et noyau accumbens. De façon intéressante, beaucoup de dendrites issues de la SNc

et descendant vers la SNr réagissent avec un anticorps anti-DAT, en faveur d’un mécanisme de

recapture de la dopamine par les dendrites de cette région. En revanche, un niveau faible de

DAT a été détecté dans l’hypothalamus (Ciliax et al., 1995). Le système dopaminergique

hypothalamique semble donc indépendant du système mésencéphalique.

c/ Localisation ultrastructurale

Au niveau subcellulaire accessible par microscopie électronique, il a été montré que le

DAT est exprimé intensément au niveau du péricaryon et des dendrites proximales des

neurones dopaminergiques (Nirenberg et al., 1996; Nirenberg et al., 1997), suggérant que ces

régions sont les sites de synthèse, recyclage et/ou du trafic vers ou à partir de la surface

cellulaire.

Dans l’ATV et la SNc, le DAT semble associé à des membranes intracellulaires

d’organelles (tubulo-vésicules) exprimant VMAT2. Ces organelles pourraient constituer des

sites de stockage somato-dendritiques potentiellement capables de libération par le

fonctionnement en mode inverse du DAT (voir paragraphe 4/ c). Le DAT jouerait alors un rôle

dans la régulation du pool de stockage de la dopamine intracellulaire (Nirenberg et al., 1996;

Nirenberg et al., 1997). Des expériences menées in vitro (culture neuronale, expression en

système hétéroloque) ont également montré que le DAT se trouvait dans des pools

intracellulaires d’endosomes (Melikian and Buckley, 1999; Sorkina et al., 2003). Une

localisation membranaire du DAT a été détectée majoritairement au niveau des axones et des

dendrites plus distales, permettant la régulation de la concentration extracellulaire en dopamine.

4/ Mode de fonctionnement/électrophysiologie

a/ Stoechiométrie

Le transport de dopamine est un processus complexe, composé de plusieurs étapes

que sont la liaison du ligand, sa translocation, sa libération à l’intérieur du neurone et la

réorientation du transporteur (Rudnick and Clark, 1993). Afin de transloquer le substrat à

l’intérieur de la cellule contre son gradient de concentration, le transporteur utilise l’énergie



provenant du gradient transmembranaire d’ions Na+ ([Na+]e=120mM, [Na+]i=5mM), maintenu

par la pompe Na/K ATPase. Le DAT co-transporte ainsi la dopamine et les ions sodium et

chlore, avec une stoechiométrie prédite de une molécule de dopamine (chargée positivement

au pH physiologique), deux ions Na+ et un ion Cl- (Gu et al., 1994). Ces données prédisent donc

que chaque molécule de dopamine est accompagnée d’un mouvement de deux charges

positives, à l’origine d’un courant entrant.

b/ Différents états de conductance

En plus du courant associé au transport de substrat, diverses études ont montré que les

transporteurs pouvaient médier des courants ioniques macroscopiques, qui ne sont pas liés de

façon stoechiométrique au mouvement du substrat. Cette découverte suggère que les

transporteurs partageraient des propriétés communes avec les canaux ioniques. Ainsi, quand le

DAT est exprimé dans des ovocytes de Xénope, on peut observer un courant cationique

tonique, dit « courant de fuite », qui n’est pas couplé au transport de substrat mais qui peut être

bloqué par des analogues de la cocaïne et des substrats (Sonders et al., 1997). Ce type de

courant a également été retrouvé pour d’autres transporteurs Na/Cl dépendants (NET et SERT)

exprimés en ovocyte de Xénope et lignées cellulaires (Mager et al., 1994; Galli et al., 1995).

Cependant, ce courant de fuite n’a pas été retrouvé ex vivo dans une culture de neurones

dopaminergiques de rat (Ingram et al., 2002), suggérant que l’existence de ce type de courant

peut varier avec l’environnement cellulaire. Ainsi, la liaison de la protéine neuronale syntaxine

1A à l’extrémité N-terminale du transporteur de la sérotonine inhibe le courant de fuite (Quick,

2003).

D’autre part, des mesures électrophysiologiques réalisées sur des neurones en culture

ont montré que de faibles concentrations de substrat provoquaient des courants entrants, Na+-

dépendants, bloqués par la cocaïne (Ingram et al., 2002). De façon inhabituelle, ces courants

anioniques, généralement inhibiteurs, seraient capables d’exciter le neurone, même quand les

récepteurs dopaminergiques D1 et D2 sont bloqués. Ce même résultat a été retrouvé dans des

cultures neuronales de nématode C. elegans (Carvelli et al., 2004). Le DAT pourrait alors jouer

un rôle dans la modulation de libération de dopamine.

c/ Fonctionnement en mode inverse

Comme d’autres transporteurs de neurotransmetteurs, le DAT présente la capacité de

fonctionner en mode inverse, c'est-à-dire de pomper le neurotransmetteur intra-cytoplasmique

et de l’expulser vers le milieu extracellulaire. Ce mécanisme de libération est indépendant de

l’exocytose. Cet efflux de neurotransmetteur peut être obtenu expérimentalement en changeant



le gradient ionique membranaire : en diminuant les concentrations extracellulaires de sodium et

de chlore (Pifl et al., 1997). Physiologiquement, cette situation est observée dans l’ischémie du

myocarde, conduisant à la libération de noradrénaline par le NET (Schomig et al., 1988). De

même, l’efflux de dopamine via son transporteur peut être induit par l’amphétamine. Ce

mécanisme serait voltage-dépendant et régulé par la concentration intracellulaire de Na+

(Khoshbouei et al., 2003). Il a été montré que l’amphétamine pouvait provoquer une libération

de Ca2+ du réticulum endoplasmique, qui régulerait l’efflux et les courants médiés par le DAT

(Gnegy et al., 2004). De plus, cet efflux induit par l’amphétamine est aboli par l’administration

d’antagonistes de la protéine kinase C, tandis que des agonistes induisent un efflux

dopaminergique en absence d’amphétamine, suggérant l’implication de la protéine kinase C

dans ce processus (Gnegy, 2003).

La pertinence physiologique de ce mode de transport inversé n’est pas encore bien

comprise. Néanmoins, ceci pourrait constituer le mécanisme de libération dendritique de

dopamine par les neurones dopaminergiques de la substance noire compacte (Falkenburger et

al., 2001) et jouerait un rôle fondamental dans les effets pharmacologiques des amphétamines.

5/ Pharmacologie

La mesure de l’affinité du DAT pour ses différents substrats ou inhibiteurs fut d’abord

réalisée sur des préparations synaptosomales de rat. Le clonage du transporteur a ensuite

permis d’élargir les connaissances pharmacologiques grâce à l’expression des différentes

formes de DAT au sein de cultures cellulaires.

a/ Liaison aux catécholamines

Le DAT transporte la dopamine avec une affinité environ 10 fois meilleure que la

noradrénaline et la sérotonine et 60 fois meilleure que l’adrénaline (figure 8).



Figure 8 : Constantes d’inhibition (Ki en nM) de différentes molécules pour le transporteur de la dopamine.

Les valeurs ont été obtenues pour le DAT humain (hDAT) ou de rat (rDAT), exprimé en cellules ou en synaptosomes de rat. D’après : a, Giros et al., 1992; b, Kilty et al., 1991; c, Shimada et al., 1991; d, Horn, 1990.

Paradoxalement, le NET, qui partage 70% d’identité de sa séquence en acides aminés

avec le DAT a une meilleure affinité pour la dopamine que pour son propre substrat et une

meilleure affinité pour la dopamine que le DAT lui-même, bien que sa capacité de transport soit

légèrement moindre que celle du DAT (figure 9; Giros et al., 1994).



DAT NET

Km (μM) Vmax (%) Km (μM) Vmax (%)

DA 2,54 270 0,67 230

NA 20,1 69 2,6 100

Figure 9 : Tableau présentant les affinités (Km en μM) et les capacités de transport (Vmax en % de la Vmax du NET pour la NA) du DAT et du NET pour la dopamine et la noradrénaline, mesurées dans des cellules COS7 transfectées.

DA : dopamine ; DAT : transporteur de la dopamine ; NA : noradrénaline ; NET : transporteur de la noradrénaline. D’après Giros et al., 1994.

b/ Modèles cellulaires versus synaptosomes

La plupart de nos connaissances sur les propriétés pharmacologiques, la régulation et le

trafic des transporteurs plasmiques proviennent d’expériences réalisées par transfection de

cellules non neuronales. Les cellules forment un modèle in vitro facile à obtenir, extrêmement

pratique pour effectuer toutes sortes de tests de pharmacologie et de détection très ciblés

puisque l’on peut choisir les protéines neuronales à exprimer. Au contraire, les synaptosomes

sont des préparations de terminaisons neuronales refermées sur elles-mêmes après

homogénéisation des tissus cérébraux dans des conditions strictes. Ils contiennent toutes les

protéines exprimées à la terminaison, dont les transporteurs plasmiques natifs, constituant un

modèle physiologique « ex vivo ».

Concernant les données pharmacologiques de la figure 8, on peut noter que les

mesures réalisées sur cellules et synaptosomes sont globalement concordantes, mise à part

l’affinité du DAT pour la dopamine, qui est 3 à 10 fois plus faible lorsque celui-ci se trouve

exprimé en cellules eucaryotes (Giros and Caron, 1993). Cette différence significative d’affinité

entre le DAT natif et le DAT recombinant pour son substrat naturel pourrait être la conséquence

d’une différence de processus de maturation traductionnelle (glycosylation par exemple) entre

une cellule fibroblastique et un neurone dopaminergique. Il se peut également qu’il existe une

(ou plusieurs) protéines chaperonnes associée au DAT régulant l’affinité pour son substrat, qui

ne soit pas exprimée par les cellules utilisées pour les transfections.



c/ Le DAT comme cible des psychostimulants

Les transporteurs des monoamines, DAT, NET et SERT, constituent les cibles de

psychotropes comme les psychostimulants (cocaïne, amphétamines, méthylphénidate, ecstasy)

et les antidépresseurs tricycliques.

La cocaïne se lie aux trois transporteurs plasmiques avec le même ordre d’affinité (Ritz

and Kuhar, 1993) mais ses propriétés renforçantes semblent être médiées plus particulièrement

par son inhibition du DAT (Ritz and Kuhar, 1993). Dès lors, un nombre important de composés

chimiques a été synthétisé en vue de développer une pharmacothérapie contre la dépendance

à la cocaïne (Singh, 2000). Ces molécules peuvent être classées en six catégories : tropane,

benztropine, analogues de la pipérazine, méthylphénidate, mazindol et analogues de la

phencyclidine (pour revue, voir Dutta et al., 2003). Parmi les dérivés du tropane, les composés

WIN 35428 (12β-carbométhoxy-3-(4-fluorophényl)-tropane ou CFT) et RTI-55 (22β-

carbométhoxy-3β-[4-iodophényl]-tropane ou CIT) ont souvent été utilisés dans des études

neuropharmacologiques. Ils ne sont pas très sélectifs puisqu’ils se lient également au NET

(Kuhar et al., 1999), contrairement aux différents composés GBR (voir figure 8) qui possèdent

une haute affinité et sélectivité pour le DAT. La benztropine est un inhibiteur du transport de

dopamine, mais aussi un puissant agent anticholinergique utilisé en clinique dans le traitement

de la maladie de Parkinson. Le méthylphénidate est utilisé cliniquement pour traiter les enfants

hyperactifs et la phencyclidine se lie au DAT mais également aux récepteurs-canaux

glutamatergiques de type NMDA.

d/ Le DAT comme cible de toxines

Deux toxines, la 6-OHDA (6-hydroxydopamine) et le MPP+ (1-méthyl-4-

phenylpyridinium), sont transportées de manière spécifique par le DAT et sont largement

utilisées en expérimentation animale pour l’obtention de modèles animaux de la maladie de

Parkinson.

La 6-OHDA ne passe pas la barrière hémato-encéphalique et doit donc être administrée

par voie intracérébrale. Elle conduit à la mort des neurones dopaminergiques, probablement en

augmentant la production de radicaux libres. Par ailleurs, différents travaux suggèrent une

production physiologique de 6-OHDA par la substance noire, ce qui renforce l’intérêt de ce

modèle.

Le MPTP (1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine) est une neurotoxine synthétique

capable d’induire une dégénérescence des neurones dopaminergiques dans plusieurs espèces

animales. Après injection périphérique, le composé traverse la barrière hémato-encéphalique,

est métabolisé par les monoamine-oxydases en MPP+, qui inhibe le complexe mitochondrial I,



aboutissant à la mort des cellules. Il convient de noter que, contrairement à la 6-OHDA, la

production de cette neurotoxine n’est pas endogène même si certaines hypothèses étiologiques

suggèrent l’implication de composés chimiquement ou fonctionnellement proches du MPTP

(isoquinolines, roténone, substances végétales présentes dans les pesticides) dans le

déclenchement de la maladie de Parkinson humaine.

6/ Processus de régulation

Depuis une quinzaine d’années, beaucoup de travaux se sont intéressés à la régulation

des transporteurs plasmiques que l’on avait tendance à considérer dans le passé comme des

constituants relativement stables de la membrane plasmique et qui se sont finalement révélés

extrêmement dynamiques (pour revue, voir Gulley and Zahniser, 2003).

a/ Régulation par glycosylation

Le DAT nouvellement synthétisé dans le réticulum endoplamisque est transporté vers

l’appareil de Golgi où il est glycosylé sur des résidus asparagine de la boucle extracellulaire,

puis inséré dans la membrane plasmique. Ce processus n’est pas essentiel pour l’expression

du DAT, puisque les transporteurs non glycosylés et matures atteignent tous deux la surface

cellulaire, bien que la mutation des sites glycosylés réduise de manière significative l’expression

membranaire du transporteur (Torres et al., 2003; Li et al., 2004). Le mécanisme mis en jeu

reste inconnu : le DAT non glycosylé serait peut être plus accessible à la protéolyse ou alors

moins stable à la surface cellulaire. Du côté fonctionnel, la substitution des trois sites de

glycosylation entraîne une importante baisse de la vitesse maximale de transport (Vmax),

corrélée ou non avec une augmentation de l’affinité, selon les études (Torres et al., 2003; Li et

al., 2004).

b/ Régulation par phosphorylation

D’après la séquence primaire du DAT, on compte plusieurs sites consensus potentiels

de phosphorylation par les protéines kinases. On a supposé que leur activation pouvait altérer

l’affinité du transporteur pour ses substrats/inhibiteurs, ou mener à une diminution de l’activité

du transporteur. Beaucoup d’études ont montré qu’un activateur de protéine kinase C, comme

les esters de phorbol, engendrait une diminution de l’activité du transporteur et ce dans divers

systèmes cellulaires exprimant le DAT : synaptosomes striataux (Vaughan et al., 1997), cellules

COS (Pristupa et al., 1998), cellules PC12 (Melikian and Buckley, 1999), cellules MDCK

(Daniels and Amara, 1999), cellules d’insectes (Pristupa et al., 1998) et ovocytes de Xénope



(Zhu et al., 1997). Par microscopie à fluorescence ou fractionnement subcellulaire de cellules

transfectées avec hDAT, Melikian et Buckley (1999) et Daniels et Amara (1999) ont montré que

cette baisse d’activité était due à une internalisation des transporteurs au sein d’endosomes,

qui pouvaient ensuite être recyclés à la surface ou dégradés, suivant les systèmes utilisés.

L’activation de la protéine kinase C provoque une augmentation de la phosphorylation du DAT

(Vaughan et al., 1997), majoritairement au niveau de son extrémité N-terminale (Foster et al.,

2002). On a donc supposé que la phosphorylation de sites sérine/thréonine du transporteur

était à l’origine du processus d’internalisation. Cependant, la mutation de ces sites (Chang et

al., 2001), de même que la délétion de l’extrémité N-terminale du DAT (Granas et al., 2003)

préviennent la phosphorylation du DAT par la protéine kinase C mais n’empêchent pas son

internalisation. Ces deux mécanismes ne semblent donc pas directement liés et l’on peut

supposer qu’il existe d’autres phosphoprotéines chargées de réguler l’activité du transporteur.

L’inhibition de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K ; Carvelli et al., 2002) et celle de la

MAPK kinase (mitogen-activated protein kinase kinase ; Lin et al., 2003) conduisent également

à une diminution de l’activité de transport, due à une redistribution du DAT de la surface

cellulaire vers le cytosol (voir aussi chapitre C, paragraphe 4/ c).

c/ Régulation par les substrats et les inhibiteurs

• Dopamine

Dans un modèle d’ovocyte de Xénope, il a été démontré qu’une exposition courte mais

répétée de dopamine provoquait une baisse des courants associés au transport (Gulley et al.,

2002). Dans des cellules HEK293, Saunders et collaborateurs ont montré qu’une exposition de

60 min à 10 μM de dopamine engendrait une diminution de la capacité de transport du DAT

(Saunders et al., 2000). En revanche, ce résultat n’a pas été retrouvé avec des cellules MDCK

(Daniels and Amara, 1999). La baisse de transport est là aussi associée à une localisation

cytosolique accrue du transporteur, au détriment de son expression membranaire (Saunders et

al., 2000).

• Amphétamines

La modulation du trafic du DAT n’a pas seulement lieu par des substrats endogènes,

mais aussi par des psychostimulants, suggérant que ce processus serait impliqué dans le

mécanisme d’addiction. Ainsi, dans des synaptosomes de rats, sacrifiés 1h après administration

systémique de metamphétamine, on observe une diminution de la Vmax (Fleckenstein et al.,

1997), sans modification d’affinité. Il en est de même pour des cellules HEK193 exprimant



hDAT et exposées à l’amphétamine (Saunders et al., 2000). Par microscopie confocale, on a pu

suivre le mouvement des transporteurs associés à une protéine fluorescente et conclure que

l’inhibition fonctionnelle était due à une internalisation cellulaire. Par ailleurs, il a été précisé que

l’activité intrinsèque du DAT n’était pas altérée et que le transporteur était pleinement actif juste

avant sa redistribution cellulaire en réponse à l’amphétamine (Kahlig et al., 2004). Enfin, c’est

l’amphétamine intracellulaire et non extracellulaire qui semble responsable de ce processus

(Kahlig et al., 2006). Ajoutons que l’internalisation du DAT induite pas les différents substrats

est atténuée en présence d’inhibiteurs sélectifs de la protéine kinase C (Sandoval et al., 2001;

Gulley et al., 2002) ou de l’activation de la PI3K (Carvelli et al., 2002).

• Cocaïne

Chez l’homme et l’animal, de nombreuses études ont montré que l’administration

répétée de cocaïne engendrait une augmentation du nombre de transporteurs de la dopamine

(voir Zahniser and Doolen, 2001). Sur des préparations de synaptosomes striataux issues de

cerveaux de cocaïnomanes décédés, la capacité de transport de dopamine est multipliée par

deux par rapport aux contrôles (Mash et al., 2002), suggérant que cette augmentation de

densité a également un effet fonctionnel in vivo. De même, sur des cellules HEK293 ou des

synaptosomes de rats exposés à la cocaïne, la Vmax du DAT est accrue de 30 à plus de 50%

(Daws et al., 2002). Une exposition à la cocaïne est également capable de bloquer

l’internalisation du DAT induite par l’amphétamine (Saunders et al., 2000).

d/ Régulation par les récepteurs dopaminergiques

Bien que les résultats de certains travaux soient contradictoires (pour revue, voir Gulley

and Zahniser, 2003), la plupart montre que l’activation des autorécepteurs D2 augmente le

transport de dopamine, favorisant la diminution de concentration de dopamine extracellulaire,

donc de la transmission dopaminergique, en accord avec le rôle inhibiteur de ces

autorécepteurs. Des expériences de transport réalisées chez l’ovocyte de Xénope co-exprimant

le DAT et le récepteur D2, démontrent que l’activation de ces récepteurs accroit la densité des

sites de liaison du DAT (Mayfield and Zahniser, 2001). Cet effet est bloqué par un prétraitement

à la toxine pertussique, qui inhibe l’activité des protéines Gi, suggérant que la fonctionnalité du

récepteur D2 est nécessaire à ce type de régulation. Chez la souris invalidée pour le récepteur

D2, la clairance de dopamine est réduite d’environ 50% (Dickinson et al., 1999). La dopamine

pourrait donc réguler la fonction de son transporteur soit directement en tant que substrat

(favorisant l’internalisation du DAT), soit par l’intermédiaire de ses récepteurs (augmentant la

recapture de la dopamine extracellulaire).



e/ Régulation par interaction directe avec des protéines partenaires

Il a été montré récemment que le DAT interagissait directement avec diverses protéines,

capables de moduler sa fonction. Ce sujet fera l’objet d’un chapitre à part entière (voir chapitre

C, paragraphe 4).

7/ Implication du DAT dans différentes pathologies psychiatriques

Comme mentionné plus haut, il a été démontré que le DAT était impliqué dans divers

troubles mentaux, principalement l’addiction aux drogues, le désordre de l’hyperactivité et du

déficit d’attention, la schizophrénie et dans une moindre mesure, la dépression. Dans les

paragraphes suivants ne seront traitées que les deux premières pathologies.

a/ La dépendance aux drogues : exemple de la cocaïnomanie

Quelque soit leur site d’action primaire, toutes les drogues jouent sur la transmission

dopaminergique en augmentant la libération de dopamine dans le shell du noyau accumbens

(Di Chiara and Imperato, 1988).

• La cocaïne et ses effets physiologiques

La cocaïne est un alcaloïde naturel extrait d'un arbuste d'Amérique du Sud : le cocaïer.

Depuis plus de 3000 ans, les feuilles de coca (0,1% à 1,8% de cocaïne) sont utilisées par les

Indiens des Andes pour leurs vertus thérapeutiques. Mâcher les feuilles de coca procure une

légère euphorie, augmente l'endurance physique et réduit les effets du mal des montagnes et

de la privation d'oxygène.

La cocaïne (chlorhydrate de cocaïne) se présente le plus souvent sous la forme d'une

poudre blanche floconneuse, hydrophile, qui peut être solubilisée dans l'eau et donc injectée,

inhalée (sniffée) ou ingérée. Elle ne peut être fumée, car elle se décompose et devient donc

inactive à une température proche de sa température de vaporisation (198°C). Au contraire, le

« crack », cocaïne mélangée à du bicarbonate de soude ou de l’ammoniaque, présenté sous

forme de petits cailloux, est chauffé pour en inhaler la fumée.

L'usage de cocaïne provoque une euphorie immédiate, un sentiment de puissance

intellectuelle et physique et une indifférence à la douleur, à la fatigue et à la faim (état de

« high »). La prise répétée de cocaïne peut provoquer des troubles psychiques tels que des

psychoses ou des hallucinations, une grande instabilité d'humeur, des délires paranoïdes ou

des attaques de panique. La prise de cocaïne entraîne également une augmentation de



l'activité psychique ainsi que des insomnies, des amnésies et des phases d'excitation. Pendant

la phase de « descente », l'euphorie laisse place à une anxiété et un état dépressif, souvent

comblé par une prise de drogue. Au niveau périphérique, cette drogue se comporte comme un

vasoconstricteur puissant.

Selon le dernier rapport de l’OFDT (Observatoire Français des Drogues et des

Toxicomanies), la cocaïne est la substance illicite la plus consommée en France après le

cannabis et sa consommation est à la hausse sur la dernière décennie.

• Cibles de la cocaïne et effets addictifs

Comme mentionné plus haut, la cocaïne se lie aux trois transporteurs des monoamines

avec une affinité décroissante telle que : SERT> DAT>NET (Ritz and Kuhar, 1989). Néanmoins,

la dopamine serait le neurotransmetteur le plus impliqué dans les propriétés renforçantes de

cette drogue (Ritz and Kuhar, 1993). La liaison de la cocaïne au DAT engendre un changement

de sa conformation, le rendant incapable de transporter la dopamine (Hastrup et al., 2003;

Wang et al., 2003b). Cette inhibition aboutit à une augmentation de la concentration

extracellulaire de dopamine libérée par les varicosités axonales et les dendrites, prolongeant

son interaction avec ses récepteurs pré- et post-synaptiques et donc sa réponse cellulaire et

comportementale. Récemment, il a été montré ex vivo que la cocaïne pouvait également

augmenter la libération de dopamine (Lee et al., 2001b). Ce mécanisme passerait par la

mobilisation de vésicules synaptiques dopaminergiques issues du pool de réserve et liées à

une protéine synaptique, la synapsine (Venton et al., 2006). Néanmoins, la manière dont la

cocaïne interagit avec la synapsine n’est pas encore établie.

De nombreuses équipes ont cherché à déterminer le site de liaison de la cocaïne. Celle-

ci et la dopamine ayant une structure assez différente, il est probable que les résidus

nécessaires à leurs liaisons puissent se chevaucher sans être complètement identiques. Des

analyses menées sur des chimères DAT-NET suggèrent que les sites de liaison résideraient

dans des régions encadrant les TM5-8 et TM1-3 (Giros et al., 1994; Buck and Amara, 1995).

Récemment, le résidu phénylalanine F105 du TM2 a été identifié comme fortement impliqué

dans la liaison à la cocaïne puisque sa substitution en méthionine ou cystéine (F105M et

F105C) décroît fortement la sensibilité à la cocaïne (de 4 à 15 fois), sans pour autant altérer le

transport de dopamine de façon significative (Wu and Gu, 2003). Chen et collaborateurs

(2005a) ont ensuite montré que d’autres mutations de résidus proches de F105C diminuaient

encore plus la sensibilité à la cocaïne et notamment que la triple mutation L104V, F105C,

A109V aboutissait à une affinité pour la cocaïne 69 fois moindre que celle du DAT sauvage de



souris. Cette triple mutation affecte également la liaison du méthylphénidate, confirmant que

son site de liaison au DAT chevauche celui de la cocaïne, mais, de façon remarquable, n’a pas

d’effet sur l’affinité de l’amphétamine, la metamphétamine et la dopamine. La capacité

maximale de transport du DAT muté est plus faible que celle du DAT sauvage, mais les

expériences de biotinylation indiquent que l’expression du transporteur à la surface cellulaire

n’est que marginalement affectée, suggérant une vitesse de renouvellement diminuée du DAT

mutant.

Contrairement aux opiacés, le sevrage à la cocaïne n’induit pas de dépendance

physique, mais conduit à une forte dépendance psychique. Les effets renforçants de cette

drogue proviennent de l’augmentation de la concentration en dopamine au niveau des

structures limbiques, principalement le noyau accumbens. Une consommation chronique de

cocaïne provoque une augmentation du nombre de molécules du DAT, à l’origine d’une

clairance plus rapide de la dopamine synaptique (Staley et al., 1994; Mash et al., 2002). Ceci

pourrait expliquer le phénomène de tolérance, qui se traduit par une réponse comportementale

d’intensité moindre pour une même dose de drogue. Après sevrage, l’expression du DAT

(ARNm et protéine) est diminuée, notamment dans les régions limbiques. Cela pourrait

partiellement expliquer pourquoi, suite à une longue période d’abstinence de plusieurs

semaines à plusieurs mois, une dose challenge de cocaïne serait capable d’induire une

accumulation de dopamine extracellulaire ainsi que des comportements associés de plus forte

amplitude, comparés à l’injection initiale de la drogue. Ce processus de « sensibilisation

comportementale » pourrait contribuer au besoin obsédant de la drogue et au fort taux de

rechute des toxicomanes (Zahniser and Sorkin, 2004).

Ces données montrent que la dopamine et le DAT jouent un rôle essentiel dans la

dépendance à la cocaïne. Néanmoins, les souris invalidées pour le DAT (DAT KO ; Giros et al.,

1996) sont toujours capables de s’auto-administrer de la cocaïne (Rocha et al., 1998). Celle-ci a

encore la capacité d’élever la dopamine extracellulaire au niveau du noyau accumbens mais

pas au niveau du striatum (Carboni et al., 2001). L’ensemble de ces résultats suggère que

d’autres cibles de la cocaïne entrent en jeu dans le processus addictif. Ainsi, la cocaïne pourrait

bloquer le NET, capable de transporter la dopamine au niveau du noyau accumbens,

augmentant par conséquent sa concentration extracellulaire (Yamamoto and Novotney, 1998).

Toutefois, la participation du NET dans le noyau accumbens est assez mineure et son inhibition

chez les souris DAT KO ne modifie pas les taux extracellulaires de dopamine (Budygin et al.,

2002). Par contre, il a été montré que le SERT jouait un rôle fondamental puisque des souris

doublement invalidées pour le DAT et le SERT ne présentent plus de comportement de

préférence de place conditionné à la cocaïne (Sora et al., 2001), contrairement aux souris NET-



SERT double KO (Hall et al., 2002). L’interaction de la cocaïne avec le SERT et potentiellement

le NET, semble donc nécessaire à l’initiation et au maintien des effets renforçants de cette

drogue.

• Lutte contre la cocaïnomanie

Jusqu’à présent, il n’existe pas de traitement effectif de la dépendance à la cocaïne.

Plusieurs stratégies pharmaco-thérapeutiques ont été développées, à savoir la recherche 1/ de

molécules de substitution, n’ayant pas d’effets addictifs, 2/ de molécules « antagonistes » qui

bloqueraient la liaison de la cocaïne aux transporteurs, 3/ de composés agissant à un site

différent de celui de la cocaïne qui empêcheraient les effets fonctionnels de la drogue (voir

(Dickerson and Janda, 2005).

La thérapie de substitution a donné d’excellents résultats dans la dépendance à

l’héroïne, remplacée par la méthadone et des résultats plus mitigés dans la tabacco-

dépendance, la nicotine pure remplaçant le tabac. La plupart des composés testés sont des

dérivés de la cocaïne cités précédemment (voir paragraphe 5/b). Des études d’imagerie

médicale par PET (Positron Emission Tomography) ont montré que l’occupation du DAT par la

cocaïne était importante pour l’induction des effets renforçants. Des doses de 0,1 à 1 mg/kg de

cocaïne occupent, respectivement, entre 53 et 87% des transporteurs chez le singe rhésus,

confirmant le parallélisme entre un taux élevé d’occupation du DAT et l’efficacité de la cocaïne

(Volkow et al., 1996). De la même manière, un fort taux d’occupation du DAT par les inhibiteurs

est nécessaire à leur efficacité. Le RTI-113 est capable de diminuer l’auto-administration de

cocaïne chez les singes lorsqu’il occupe entre 72 et 84% du nombre total de DAT (Wilcox et al.,

2002). Toutefois, l’usage des ligands actuels reste limité puisque beaucoup d’entre eux

provoquent une dépendance.

Une autre approche intéressante consiste à créer des protéines conçues pour lier la

cocaïne afin de bloquer ses effets ou de la dégrader, la rendant moins psychoactive. Ainsi,

l’immunisation de rongeurs avec des anticorps anti-cocaïne a permis l’inhibition efficace de

l’effet du psychostimulant, car les anticorps développés sont capables de lier la drogue dans la

circulation sanguine (Kantak et al., 2000; Carrera et al., 2001). Néanmoins, ils ont une action

uniquement périphérique et la cocaïne non liée par ces anticorps entre dans le cerveau et peut

alors exercer ses effets psychoactifs. Plus récemment, la technique du « phage display » a été

adaptée au traitement contre la cocaïnomanie. Dans cette technique, un bactériophage exprime

des anticorps anti-cocaïne par milliers à sa surface, capables de séquestrer la cocaïne et peut

se multiplier au sein du cerveau. Administré par voie intra-nasale, le virus pénètre dans le



cerveau par les terminaisons nerveuses olfactives, offrant un traitement rapide et restreint au

système nerveux central (Dickerson and Janda, 2005).

Par rapport aux stratégies de développement d’antagonistes, les anticorps bloquants

présentent deux avantages. Premièrement, ils bloquent la cocaïne « à la source », ce qui est

plus facile que de bloquer les effets de la cocaïne, qui agit sur plusieurs transporteurs différents.

Deuxièmement, les anticorps bloquants sont « en veille », ils ne risquent pas d’affecter la

fonction normale de neurotransmission et n’interviennent qu’en présence de cocaïne.

Une dernière approche consiste à injecter des anticorps catalytiques, dégradant

spécifiquement le groupement ester-benzoyl de la cocaïne. Cette technique, qui accélère la

clairance de la cocaïne, a été efficace sur des modèles d’overdose chez les rongeurs mais les

constantes cinétiques de catalyse doivent être améliorées avant de lancer un développement

clinique (Meijler et al., 2004). De plus, on peut s’interroger sur l’efficacité de ce type de

traitement chez l’homme, qui peut être contrecarré par l’augmentation des prises de cocaïne

par le toxicomane.

Ces différentes techniques semblent prometteuses, mais ne prennent pas en compte

l’effet de dépendance psychologique, le besoin que ressentent les toxicomanes de prendre de

la drogue. Un traitement pharmaco-thérapeutique devra donc toujours être associé à un suivi

psychologique, notamment basé sur la désensibilisation des indices comportementaux, comme

c’est le cas actuellement pour d’autres types de dépendance.

b/ Le désordre de l’hyperactivité et du déficit d’attention (ADHD)

• Définition et bases biologiques

Le désordre de l’hyperactivité et du déficit d’attention (ADHD) touche 5-10% des enfants

scolarisés et 3-5% des adultes aux Etats-Unis. Il se caractérise cliniquement chez le jeune

enfant par une impulsivité, des troubles de l’attention et une hyperactivité motrice (voir Madras

et al., 2005). Jusqu'à récemment, on croyait que ces symptômes disparaissaient à

l'adolescence avec les changements hormonaux et développementaux. Or, il est maintenant

reconnu que plusieurs des symptômes persistent chez une majorité d’adultes. En fait,

l'hyperactivité se résorbe à l'adolescence, mais les déficits d'attention peuvent persister dans 30

à 70% des cas. D’autre part, on trouve une forte co-morbidité avec d’autres maladies, telles que

des troubles de l’humeur, les troubles bipolaires et anxieux, le syndrome Gilles de la Tourette

aisi que les troubles addictifs.



Plusieurs études d’imagerie par résonance magnétique (IRM) ont rapporté des

altérations morphologiques et fonctionnelles cérébrales telles qu’une réduction de la taille des

ganglions de la base, du corps calleux, du cortex préfrontal et du cervelet (voir Durston, 2003;

Sowell et al., 2003). Par imagerie fonctionnelle (IRMf), une étude a montré une activation

striatale réduite chez des enfants souffrant d’ADHD lors de tâches cognitives faisant intervenir

une réponse inhibitrice (Vaidya et al., 1998).

Des études de jumeaux et d’adoption ont montré que des facteurs génétiques

intervenaient pour 70% de l’étiologie (Biederman and Faraone, 2002). Certains gènes de la

transmission dopaminergique, sérotoninergique et noradrénergique ont été impliqués dans

l’étiologie de la maladie comme les récepteurs dopaminergiques D4 et D5, sérotoninergiques,

les transporteurs DAT, SERT et NET ainsi que la protéine synaptique SNAP 25 (Yang et al.,

2004; Faraone et al., 2005).

• Rôle du DAT étudié par génétique et neuroimagerie

En 1995, Cook et collaborateurs montrent pour la première fois une association entre

l’ADHD et un polymorphisme allélique du DAT situé dans la partie 3’ non traduite du gène.

Toutefois, ce résultat n’a pas toujours été confirmé par d’autres équipes : des méta-analyses

réalisées récemment ont soit trouvé un effet significatif mais faible (Faraone et al., 2005), soit

aucune association (Purper-Ouakil et al., 2005; Li et al., 2006). Néanmoins, les souris

invalidées pour le DAT (DAT KO, Giros et al., 1996) reproduisent certains symptômes de

l’ADHD (Gainetdinov et al., 2001a ; voir paragraphe 8/c}.

Chez l’homme, et plus particulièrement l’enfant, de nombreuses études de

neuroimagerie ont cherché à déterminer une altération potentielle de la densité de DAT, à l’aide

de différents ligands radioactifs (voir Spencer et al., 2005). Ainsi, des travaux de SPECT (Single

Photon Emission Computed Tomography) réalisés en 1999 avec le ligand altropane indiquaient

que la densité du DAT était augmentée d’environ 70% dans le striatum de patients atteints

d’ADHD (Dougherty et al., 1999). Avec un autre ligand, le TRODAT-1, Dresel et collaborateurs

(2000) ont trouvé une liaison au DAT augmentée de 17%. Une étude plus poussée a distingué

des sous-populations de patients ADHD et démontré que l’augmentation de liaison au DAT ne

concernait que les patients hyperactifs comparés aux patients inattentifs (Krause et al., 2003).

De plus, ce résultat n’était valable que pour les sujets non fumeurs. Une autre étude utilisant

l’altropane a détecté une augmentation de 30% de densité du DAT chez les malades. Cheon et

collaborateurs (2003) ont trouvé un effet de latéralisation, avec une densité de liaison au DAT

accrue de 40% dans le striatum gauche et de 51% dans le striatum droit d’enfants atteints

d’ADHD. Cependant, une autre étude n’a pas trouvé d’altération de liaison au DAT (van Dyck et



al., 2002). Une autre technique plus résolutive utilisée en imagerie est la tomographie par

émission de positrons (PET), mais peu de travaux ont été publiés à l’heure actuelle. Des

premiers résultats confirment une hausse de 30% de liaison dans le striatum de patients

atteints (Spencer et al., 2005) alors qu’une autre étude ne trouve pas de différence significative

(Jucaite et al., 2005).

En résumé, les résultats de ces études d’imagerie penchent en faveur d’une

augmentation de la liaison au DAT chez les patients souffrant d’ADHD. Toutefois, les taux ne

sont pas toujours concordants, suivant les caractéristiques cliniques des échantillons de

patients étudiés (comorbidité, consommation antérieure de cigarettes ou de drogues, ethnie,

âge,..), la spécificité et la lipophilie du ligand utilisé.

• Traitement thérapeutique et mécanismes d’action potentiels

Paradoxalement, le traitement thérapeutique de l’ADHD consiste en l’administration de

faibles doses de psychostimulants : amphétamine et méthylphénidate (Ritalin), ciblant le DAT

et, plus récemment, l’atomoxétine, inhibiteur sélectif du NET. Néanmoins, les mécanismes

d’action thérapeutique de ces drogues ne sont pas encore bien connus. Comme mentionné

précédemment, le méthylphénidate est un inhibiteur du DAT, qui se fixe sur un autre site que la

dopamine et qui empêche l’activité de transport de la dopamine. L’amphétamine est un substrat

du DAT et un inhibiteur compétitif : elle se fixe sur le même site que la dopamine et une fois

entrée dans le neurone, elle est séquestrée dans les vésicules synaptiques par VMAT2,

favorisant la libération de dopamine des vésicules vers le cytoplasme, puis vers le milieu

extérieur par transport inverse du DAT (Sulzer et al., 2005).

L’effet pharmacologique de ces drogues est probablement dû en partie aux densités

relatives du DAT et du NET dans différentes régions du cerveau, ainsi que les affinités pour

chacun des deux transporteurs (Madras et al., 2005). Il a été montré que le méthylphénidate,

l’amphétamine et l’atomoxétine augmentent les concentrations extracellulaires de dopamine et

noradrénaline au niveau du cortex préfrontal. Ces concentrations élevées pourraient

notamment amplifier l’activité des récepteurs dopaminergiques D4 et D5, remédiant à

l’hypofrontalité supposée dans cette maladie. Dans le cortex frontal, la densité du DAT est

faible, tandis que celle du NET est importante et le NET a une meilleure affinité pour la

dopamine que le DAT lui même. L’atomoxétine empêcherait donc sélectivement la capture de

dopamine via le NET.

Au niveau du striatum, l’élévation de la concentration extracellulaire de dopamine

induite par le méthylphénidate a été confirmée par PET (Volkow et al., 2002a; 2002b). Cette

augmentation de dopamine pourrait amplifier l’activation des autorécepteurs, réduisant ainsi la



transmission dopaminergique. Ceci résulterait en une diminution d’activité des récepteurs

postsynaptiques responsables de l’activité locomotrice (Seeman and Madras, 1998; 2002).

Cependant, cette hypothèse n’est pas étayée par des résultats électrophysiologiques montrant

qu’il n’y a pas de doses de méthylphénidate et d’amphétamine activant les autorécepteurs de

façon préférentielle par rapport aux autres récepteurs (Ruskin et al., 2001).

Quelques équipes ont étudié l’action du méthylphénidate par imagerie et ont reporté une

diminution des sites du DAT après traitement (Krause et al., 2003; Vles et al., 2003). On serait

tenté de croire à une normalisation des sites augmentés chez les patients ADHD, cependant,

l’interprétation de la liaison dépend à la fois de la cinétique d’administration du traitement et de

l’imagerie. En effet, dans les travaux de Krause, la dernière dose de méthylphénidate a été

donnée 90 mn avant la prise d’images, il est donc probable qu’une large proportion de la baisse

de liaison soit due à l’occupation des sites du DAT et non à une réelle diminution de densité des

sites.

8/ Les souris invalidées pour le DAT : modèle animal pour la schizophrénie et l’ADHD ?

Dans le but de mieux comprendre le rôle du DAT au sein du système nerveux central,

Giros et collaborateurs (1996) ont généré des souris invalidées pour le DAT ou DAT KO.

a/ Phénotype

• Caractérisation biochimique

Chez ces souris DAT KO, des expériences de voltamétrie cyclique et de microdialyse

ont révélé que la dopamine restait 300 fois plus longtemps à la synapse, aboutissant à une

concentration de dopamine extracellulaire 5 fois plus grande (figure 10 ; Giros et al., 1996).

Ceci démontre bien le rôle capital du DAT dans l’élimination physique de la dopamine

synaptique puisque aucun autre mécanisme n’est capable de compenser l’absence du DAT :

ainsi, la clairance de dopamine n’est pas modifiée par des inhibiteurs des transporteurs de

sérotonine et de noradrénaline ou par l’inhibition sélective des enzymes catalytiques MAO et

COMT (Giros et al., 1996; Jones et al., 1998).



Figure 10 : Représentation schématique des adaptations moléculaires touchant les synapses des souris DAT KO.

Chez les souris DAT KO, l’excès de dopamine extracellulaire tend à être compensé par

une diminution des taux intracellulaires de TH et de dopamine, ainsi que des récepteurs

dopaminergiques D1 et D2 tandis que le récepteur D3 est augmenté. L’expression de la

dynorphine (Dyn), qui est sous contrôle activateur de la dopamine via le récepteur D1,

augmente alors que le niveau d’expression de la préproenképhaline (PPA), sous contrôle

inhibiteur de la dopamine via le récepteur D2 baisse.

Chez ces mutants, la tyrosine hydroxylase striatale est abaissée de 90%, mais son

activité de synthèse est multipliée par 2, néanmoins la dopamine intracellulaire et sa libération

sont réduites de 95% et 75% respectivement. En réponse à la hausse de dopamine

extracellulaire, la densité des récepteurs dopaminergiques D1 et D2 est diminuée d’environ

50% dans le striatum (Giros et al., 1996; Fauchey et al., 2000). En revanche la densité des

récepteurs D3 est augmentée (Fauchey et al., 2000; Weiss et al., soumis). Des travaux

électrophysiologiques et biochimiques ont démontré que le couplage fonctionnel des

autorécepteurs D2/D3 était perdu dans la substance noire et l’aire tegmentale des souris KO

(Jones et al., 1999). Par ailleurs, il a été montré que les transcrits de la préproenképhaline A,



sous le contrôle inhibiteur de la dopamine via le récepteur D2 sont réduits, alors que ceux de la

dynorphine, régulés positivement par la dopamine via le récepteur D1 sont augmentés, ceci

malgré la baisse de densité observée pour ces deux récepteurs (Gainetdinov et al., 1999a). Par

conséquent, l’ensemble de ces données est en faveur d’une hyperdopaminergie, tout au moins

dans le striatum des souris DAT KO.

• Caractérisation comportementale

D’un point du vue physiologique, la délétion du DAT entraîne un changement de

libération des hormones hypophysaires (hormone de croissance et prolactine ; Bosse et al.,

1997) qui pourrait être responsable de la croissance altérée des souris, inférieures de 30% en

taille et en poids comparées aux sauvages, de l’incapacité des femelles homozygotes à allaiter

leurs petits et de la perturbation du comportement maternel (Giros et al., 1996). On note

également un fort taux de mortalité péri-sevrage chez les KO, probablement dû à un défaut de

motilité intestinale.

Au point de vue comportemental, ces souris présentent une importante hyperlocomotion

spontanée accompagnée de stéréotypies marquées, ainsi qu’une hyperlocomotion en réponse

à la nouveauté (Giros et al., 1996; Gainetdinov et al., 1999a; Spielewoy et al., 2000). Aucune

habituation locomotrice n’est observée chez ces souris après exposition journalière au même

environnement (Spielewoy et al., 2000). L’hyperlocomotion peut être réversée par inhibition de

la synthèse de dopamine ou blocage des récepteurs dopaminergiques (halopéridol et

clozapine). Ces mutants sont toujours capables de s’auto-administrer de la cocaïne (Rocha et

al., 1998), qui induit une augmentation de libération de dopamine au niveau du noyau

accumbens mais pas au niveau du striatum (Carboni et al., 2001).

D’un point de vue cognitif, les souris mutantes révèlent des déficits dans un test de

labyrinthe à 8 bras avec augmentation des erreurs de persévération (Gainetdinov et al., 1999b),

mais pas de déficit d’apprentissage de type associatif dans des tests de discrimination olfactive

(Rodriguiz et al., 2004). En revanche, elles présentent un fort déficit d’apprentissage associatif

dans le test du labyrinthe aquatique de Morris et des performances quasi-normales dans la

version spatiale de ce test, avec toutefois un important retard d’apprentissage (Morice et al.,

soumis). D’autre part, les animaux DAT KO présentent une altération de l’inhibition du réflexe

de sursaut (PPI), utilisé comme marqueur d’un déficit d’intégration sensorimotrice (Ralph et al.,

2001), ainsi qu’une diminution de la latéralisation « pattuelle » (Morice et al., 2005), reflétant

probablement des déficits cognitifs. Enfin, ces souris sont plus réactives et montrent plus de

comportements agressifs envers leurs congénères (Rodriguiz et al., 2004).



b/ Un modèle pour la schizophrénie ?

La schizophrénie se manifeste par des symptômes productifs (délires, hallucinations) et

déficitaires (retrait social, anhédonie), ainsi que des déficits cognitifs. L’étiologie de cette

pathologie est complexe, incluant des composantes génétique et environnementale, et peu

connue encore à l’heure actuelle (pour une description plus détaillée de la schizophrénie, voir

Partie II). Plusieurs hypothèses ont été proposées, dont l’hypothèse dopaminergique, selon

laquelle l’hyperactivité du système dopaminergique ou une sensibilité accrue à la dopamine

serait responsable des symptômes des schizophrènes. Une diminution de la transmission

glutamatergique est également suspectée dans cette maladie.

Les souris DAT KO, à l’instar d’autres modèles animaux, reproduisent certains traits de

la schizophrénie, à savoir une hyperactivité, des stéréotypies, un déficit du filtrage sensori-

moteur et des déficits cognitifs, améliorés par des neuroleptiques (Giros et al., 1996;

Gainetdinov et al., 1999a; Ralph et al., 2001 ; Morice et al, soumis). L’hyperactivité des souris

peut être augmentée par l’administration d’antagonistes des récepteurs glutamatergiques

NMDA (Gainetdinov et al., 2001b), reflet d’une hypoglutamatergie probable et inhibée par des

neuroleptiques (Spielewoy et al., 2000). Ces animaux présentent également un défaut de

latéralisation pattuelle (Morice et al., 2005) qui pourrait être mis en relation avec une

augmentation probable de l’ambidextrie chez les schizophrènes, bien que celle-ci soit discutée

(Dragovic and Hammond, 2005). Par imagerie, il a également été montré une perte de

l’asymétrie hémisphérique de la liaison au DAT au niveau du striatum des schizophrènes non

traités (Hsiao et al., 2003). Toutefois, d’autres comportements ne corrèlent pas avec ceux

retrouvés chez les patients schizophrènes. Ainsi, ces souris ne présentent pas de

comportements reproduisant la symptomatologie négative de la schizophrénie comme un

déficit d’interactions sociales (Spielewoy et al., 2000). D’autre part, l’administration de

psychostimulants, qui exacerbe les réactions psychotiques chez les patients, provoque un effet

calmant paradoxal chez les souris DAT KO (Gainetdinov et al., 1999b).

En résumé, les souris DAT KO peuvent représenter un modèle suffisamment pertinent

pour étudier certains aspects de la schizophrénie (Gainetdinov et al., 2001a) même si aucune

étude clinique n’a réussi à montrer une association entre les marqueurs du gène du DAT et la

schizophrénie (Bodeau-Pean et al., 1995; Persico and Macciardi, 1997; Gamma et al., 2005).

c/ Un modèle pour l’ADHD ?

Comme mentionné précédemment, des études de méta-analyse ont conclu à une

association non significative entre un polymorphisme du gène du DAT et l’ADHD (Li et al.,

2006). Cependant, les souris DAT KO montrent plusieurs comportements caractéristiques de



l’ADHD comme l’hyperactivité spontanée et liée à la nouveauté, des déficits cognitifs et une

réponse calmante paradoxale des psychostimulants, amphétamine et méthylphénidate. Ces

souris constitueraient donc un très bon modèle pour reproduire certains symptômes de l’ADHD,

même si l’étiologie, à savoir le dysfonctionnement du DAT, n’est peut être pas la cause primaire

de cette pathologie.

C/ DAT et protéines partenaires

1/ La protéomique : définition et intérêt

Le séquençage systématique des génomes ainsi, que le développement d’outils

analytiques ont permis de faire émerger la « protéomique », domaine qui regroupe plusieurs

technologies ayant pour objectif d’étudier la nature, la fonction et les interactions protéiques à

l’échelle d’une cellule entière, voire d’un organisme entier. Les protéines forment des réseaux

d’interaction dynamiques, au sein desquels elles interagissent et se régulent entre elles. La

protéomique envisage l’étude à grande échelle des interactions protéine-protéine ou de

complexes afin d’établir une carte d’interactions protéiques (« interactome »). En effet, une

seule protéine peut interagir avec différents partenaires sous différentes conditions, ce qui

résulte en diverses réponses biologiques, dépendant du partenaire. Ainsi, la connaissance d’un

interactome est d’un intérêt capital pour la compréhension des mécanismes moléculaires

intervenant dans le fonctionnement cellulaire normal et pathologique.

2/ Principe du double-hybride

En 1989, Fields et Song introduisent une nouvelle technique, nommée double-hybride,

permettant d’étudier les interactions directes entre deux protéines. Cette méthode génétique est

basée sur la structure modulaire des facteurs de transcription eucaryotes. Généralement, ces

facteurs ont deux domaines fonctionnels distincts : le domaine liant l’ADN (DBD : DNA Binding

Domain), qui se lie à des séquences spécifiques d’ADN et le domaine activateur (AD : Activator

Domain), qui active la transcription. Ces deux modules peuvent être séparés et échangés d’un

facteur de transcription à un autre sans altérer leurs fonctions. Le système du double-hybride



en levure repose sur trois composants de base (figure 11) : 1/ un vecteur appât, exprimant

une protéine connue en fusion avec le DBD, comme GAL 4 ou LexA ; 2/ un vecteur proie,

exprimant l’ADNc d’une protéine, souvent issu d’une banque génomique, en phase avec AD ; 3/

des vecteurs rapporteurs permettant l’expression de gènes rapporteurs (gènes dont

l’expression peut être facilement détectable ou mesurable) en aval des séquences liant le DBD.

Ces vecteurs, le plus souvent intégrés au génome de la levure, portent les gènes lacZ pour une

sélection par la couleur et/ou des marqueurs d’auxotrophie, LEU2, HIS3, ou ADE2 (la levure est

alors incapable de métaboliser ces acides aminés essentiels pour sa survie) pour une sélection

par la croissance.

Figure 11 : Le système du double-hybride en levure

D’après Cho et al., 2004.

La protéine appât (X), fusionnée au domaine de liaison à l’ADN (DBD) et la protéine

proie (Y), en fusion avec le domaine activateur de la transcription (AD) sont co-exprimées dans

le noyau d’une cellule de levure contenant des gènes rapporteurs. (A) Lorsqu’il y a interaction

entre les protéines proie et appât, le facteur de transcription est reformé, permettant la

transcription des gènes rapporteurs, ce qui engendre une coloration ou la pousse de la levure

sur milieu sélectif. (B) Si la proie n’interagit pas avec l’appât, il n’y a pas de transcription des

gènes rapporteurs et la levure est incapable de se colorer ou de croître sur milieu sélectif.



Les vecteurs contenant l’appât et la proie peuvent être transformés (introduits) dans des

levures haploïdes de signe sexuel différent, qui vont par la suite être conjuguées, ou bien co-

transformées dans la même cellule de levure. L’activation de la transcription d’un gène

rapporteur n’intervient que lorsqu’il y a interaction directe entre les protéines proie et appât dans

le noyau de la levure.

Deux méthodes existent : la méthode à « puce » (« array ») et la méthode « criblage de

banque » (figure 12, voir Cho et al., 2004). Dans la première, une souche de levure haploïde

exprimant la protéine appât est conjuguée individuellement avec une puce contenant des

cellules de signe sexuel opposé, portant de nombreuses proies différentes. Les interactions

sont analysées par croissance sur milieu sélectif en plaque de 96 puits. Dans la deuxième

méthode, plusieurs souches de protéines proies sont réunies pour créer une banque et

conjuguées avec un jeu de souches appâts. Les colonies positives sur milieu sélectif sont

sélectionnées et les vecteurs proies sont séquencés afin de déterminer la séquence codante de

chaque insert d’ADNc.

Figure 12 : Stratégie de double-hybride à grande échelle.

D’après Cho et al., 2004.



3/ Avantages et limites

Le double-hybride présente l’avantage de pouvoir étudier, relativement facilement et de

façon peu onéreuse, l’interaction de protéines inconnues, à partir d’une banque d’ADNc, qui

peuvent ensuite être facilement extraits et séquencés. L’expérience d’interaction a lieu in vivo,

au sein de levures vivantes, et l’interaction entre des protéines peu abondantes ou ayant un

degré d’interaction faible ou transitoire peut néanmoins être détectée. Cette technique à grande

échelle a permis d’analyser les interactions protéiques au sein de plusieurs organismes comme

Saccharomyces cerevisiae (Uetz et al., 2000; Ito et al., 2001), Caenorhabditis elegans (Walhout

et al., 2000; Boulton et al., 2002), Helicobacter pylori (Rain et al., 2001) et Vaccina virus

(McCraith et al., 2000).

Toutefois, cette technique est également connue pour donner une grande proportion

(environ 50%) de clones faux positifs, dont l’interaction n’est pas retrouvée avec d’autres

techniques ou n’a pas lieu physiologiquement. Ceci est dû aux propriétés intrinsèques de la

technique du double-hybride, qui force les protéines appâts et proies à être localisées ensemble

au sein du noyau de la levure. Une autre contrainte de cette technique est que les protéines de

fusion doivent rester solubles. Les protéines à domaines transmembranaires hydrophobes sont

donc généralement sous-représentées puisqu’elles ont tendance à précipiter. D’autre part, il

peut y avoir un mauvais arrangement protéique, entraînant une instabilité de la protéine de

fusion. Des interactions protéiques peuvent ne pas être détectées lorsqu’elles requièrent des

modifications post-traductionnelles (glycosylations ou phosphorylations). Il arrive également que

des protéines appât soient auto-activatrices, activant directement la transcription du gène

rapporteur, ou bien que certaines protéines se lient de manière non spécifique avec plusieurs

autres.

Il s’avère donc essentiel de confirmer l’interaction trouvée par d’autres techniques (co-

immunoprécipitation, pull-down, immunofluorescence, hybridation in situ,...).

4/ Les partenaires identifiés du DAT

Etant donnée l’implication des transporteurs plasmiques dans la fonction de

neurotransmission, la réponse aux drogues et les maladies psychiatriques, la protéomique a

rapidement été appliquée à l’identification de leurs nombreux partenaires moléculaires. Depuis

six ans, principalement par double-hybride, plusieurs protéines ont été identifiées comme



interagissant directement avec les extrémités cytoplasmiques du DAT et régulant sa fonction

(pour revue, voir Torres, 2006).

a/ Interaction directe avec l’extrémité carboxy-terminale du DAT

• PICK1 (protein interacting with C kinase 1)

En choisissant comme appât la partie C-terminale du DAT humain (Glu578-Val620),

Torres et collaborateurs (2001) ont criblé une banque d’ADNc de cerveau humain et ont obtenu

environ 20 millions de transformants, dont 3 clones positifs codant pour la phase ouverte de

lecture entière de la protéine PICK1. Cette protéine contient un domaine PDZ (Post synaptic

density 95/ Discs large/ Zona occludens-1) dans sa partie amino-terminale, qui est essentiel

pour la liaison, la co-localisation synaptique et l’agrégation des récepteurs glutamatergiques

AMPA (Xia et al., 1999) et de canaux ioniques à la synapse (Kim and Sheng, 2004). La

mutation de ce domaine PDZ abolit l’interaction avec le DAT, révélant que ce domaine est

également nécessaire à l’interaction avec le transporteur. La séquence responsable de

l’interaction au niveau du hDAT a été localisée à son extrémité C-terminale (résidus lysine-

leucine-valine 618 à 620), constituant un site de liaison au domaine PDZ. Transfecté dans des

neurones dopaminergiques, un mutant de ce site est incapable d’avoir une localisation correcte,

suggérant que PICK1 pourrait être important pour l’adressage du DAT au niveau des

terminaisons synaptiques (Torres et al., 2001). D’autres séquences semblent aussi nécessaires

(Bjerggaard et al., 2004). La co-transfection de DAT et de PICK1 dans des cellules HEK-293 a

permis de montrer que les deux protéines co-localisaient en agrégats à la membrane

plasmique. Par des expériences de biotinylation de surface, Torres et collaborateurs (2001) ont

démontré que l’expression du DAT à la membrane était augmentée, ce qui se traduisait par une

plus forte capacité de transport de la dopamine (Vmax multipliée par 2). Etant donné que PICK1

a initialement été identifiée comme une protéine liant la protéine kinase C, il est probable que

l’internalisation du DAT due à cette protéine kinase puisse être régulée par PICK1.

Notons que PICK1 interagit également avec le NET et, au vu de la grande homologie de

séquence avec le DAT, PICK1 a probablement les mêmes fonctions avec cet autre transporteur

(Torres et al., 2001).

• Hic 5

En 2002, une deuxième protéine interagissant avec l’extrémité C-terminale du DAT a été

identifiée (Carneiro et al., 2002). Il s’agit de la protéine Hic 5 qui appartient à la famille des

protéines d’adhésion focales, protéines adaptatrices contenant des domaines LIM (Lin-11, Isl-1,



Mec-3 ; Thomas et al., 1999). L’interaction est médiée par la portion amino-terminale de

l’extrémité C-terminale du DAT (571-580) et la région à domaines multiples LIM de Hic 5.

Exprimée en cellules, Hic 5 réduit l’activité de transport du DAT (30%) en diminuant son

expression à la membrane. Les auteurs ont vérifié que Hic 5 et DAT sont co-localisés dans des

neurones dopaminergiques en culture et ont co-immunoprécipité les deux protéines à partir de

lysats striataux (Carneiro et al., 2002). A ce jour, la signification physiologique de cette

interaction n’est pas encore élucidée, mais il a été montré que Hic 5 interagissait également

avec le NET et, dans une moindre mesure, avec le SERT.

• Alpha-synucléine

Lee et collaborateurs (2001a) ont utilisé la technique du double-hybride pour tester

l’interaction hDAT-alpha-synucléine. Cette protéine, enrichie au niveau des terminaisons, est

retrouvée dans les plaques amyloïdes de la maladie d’Alzheimer et se trouve être le principal

composant des corps de Lewy, corps d’inclusions intraneuronaux caractéristiques de la maladie

de Parkinson. Des formes mutées de l’alpha-synucléine ont également été liées à des cas

familiaux de cette dernière maladie. Cette protéine largement étudiée, qui appartient à la famille

du gène synucléine (comprenant également les formes β et γ), est composée de trois domaines

modulaires : une extrémité N-terminale en hélice alpha, un domaine β-amyloïde codant pour le

composant non-Aβ (NAC) des plaques amyloïdes de la maladie d’Alzheimer et une extrémité C-

terminale acide. Cette structure lui permet d’exister sous une forme native non repliée ou sous

une forme d’hélice alpha en présence de phospholipides, impliquant une régulation dynamique

selon le milieu cellulaire local (Davidson et al., 1998). La fonction de cette protéine est encore

inconnue à ce jour, mais plusieurs études suggèrent qu’elle joue un rôle dans la maturation et la

maintenance des synapses (George, 2002), ainsi que dans l’organisation des composants

membranaires, où elle interviendrait dans les processus de synthèse, maintenance et fusion

des vésicules présynaptiques (Madine et al., 2006).

L’interaction a lieu entre le domaine NAC (résidus 58-107) de l’alpha-synucléine et les

22 derniers acides aminés de l’extrémité C-terminale du DAT (Glu598-Val620 ; Lee et al.,

2001a; Wersinger and Sidhu, 2003). Cette interaction a été confirmée par des expériences de

co-immunoprécipitation (Wersinger and Sidhu, 2003; Wersinger et al., 2003). En revanche, ces

auteurs observent une inhibition du transport de dopamine (35%) associée à une diminution

d’expression à la surface du DAT, après co-transfection du transporteur et de l’alpha-synucléine

dans diverses lignées cellulaires, contrairement à ce qui avait initialement été décrit par Lee et

son équipe (2001). Récemment, Wersinger et Sidhu (2005) ont démontré qu’une dissociation

du réseau de microtubules, au sein de cellules co-transfectées ou de neurones



mésencéphaliques, reversait l’inhibition de transport du DAT induite par l’alpha-synucléine,

entraînant une augmentation de l’activité du transporteur. Toutefois, des souris invalidées pour

les deux formes de synucléine, α- et β-, ont des niveaux normaux de capacité de transport de

dopamine, indiquant que peut être l’isoforme γ serait capable d’interagir avec le DAT et de

compenser la perte de la forme α (Chandra et al., 2004).

Ajoutons qu’il a été montré récemment, par co-immunoprécipitation, que l’alpha-

synucléine était aussi capable d’interagir avec le SERT par son domaine NAC, ce qui conduit,

tout comme l’interaction avec le DAT, à une diminution de l’activité et de l’expression

membranaire du transporteur (Wersinger et al., 2006).

b/ Interaction directe avec l’extrémité amino-terminale du DAT

• RACK1 et syntaxine 1A

Par la technique de double-hybride, Lee et collaborateurs (Lee et al., 2004) ont identifié

une interaction entre l’extrémité N-terminale du hDAT (résidus 1-65) et les protéines RACK1

(Receptor for Activated C Kinases) et syntaxine 1A.

RACK1 a été décrite comme une protéine intervenant dans les signaux médiés par la

protéine kinase C, facilitant l’ancrage de molécules de protéine kinase C activées à la

membrane près de leurs substrats (Ron et al., 1994). Cependant, RACK1 interagit avec de

nombreuses autres protéines (voir Schechtman and Mochly-Rosen, 2001; McCahill et al.,

2002). Toutes ces interactions ne dépendent pas de la stimulation de la protéine kinase C,

suggérant que RACK1 pourrait faciliter la formation de signaux complexes en réponse à des

stimuli distincts.

La syntaxine 1A est un membre de la famille des protéines SNARE (soluble N-

ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor), impliquées dans la fusion des

vésicules synaptiques à la membrane plasmique engendrant la libération du neurotransmetteur.

Il a été montré que la syntaxine 1A inhibait le transport de GABA et de noradrénaline (Horton

and Quick, 2001; Sung et al., 2003; Wang et al., 2003a). Dans les deux cas, l’interaction de la

syntaxine 1A avec le transporteur semble être un régulateur positif de l’expression du

transporteur à la membrane et un régulateur négatif de son activité. Etant donnée la grande

homologie de séquence entre le DAT et le NET, on peut supposer que la syntaxine 1A a des

effets similaires sur la régulation du DAT. La syntaxine 1A interagit également avec le

transporteur de la glycine GLYT-2 et contrôlerait spécifiquement l’arrivée du transporteur à la

surface membranaire (Geerlings et al., 2001). D’autre part, l’immunoprécipitation de lysats de

synaptosomes de cerveau de rat, à l’aide d’un anticorps anti-DAT, résulte en la co-précipitation



de la syntaxine 1A et de RACK1, suggérant que ces trois protéines forment un complexe qui

pourrait médier la phosphorylation du DAT par la protéine kinase C et ainsi réguler son trafic.

c/ Autres interactions

• Protéine kinase C (PKC)

Comme décrit plus haut (voir chapitre 6/ Processus de régulation), de nombreuses

études ont montré que l’activation de la PKC provoquait la redistribution membranaire du DAT

et jouait un rôle dans l’efflux de dopamine induit par l’amphétamine. Johnson et collaborateurs

(2005) ont démontré qu’un complexe DAT-PKC était nécessaire pour maintenir cet efflux.

Certaines isoformes de PKC (PKC-βI et PKC-βII) co-immunoprécipitent avec la partie N-

terminale du DAT à partir de membranes striatales de rat. Toutefois, à l’heure actuelle, on

ignore si cette interaction est directe ou nécessite la présence d’une autre protéine.

• Protéine phosphatase 2A (PP2A)

De même que la PKC, l’incubation de cultures cellulaires avec l’acide okadaique et la

calyculine A, inhibiteurs des protéines phosphatases PP1 et PP2A, provoque la diminution de la

quantité des transporteurs des monoamines, dont le DAT (Huff et al., 1997; Vaughan et al.,

1997). Par immunoprécipitation de synaptosomes de rat, Bauman et collaborateurs (Bauman et

al., 2000) ont montré que hDAT et la sous-unité catalytique de la PP2A formaient un complexe

protéique. En contrôlant l’état de phosphorylation du transporteur, cette phosphatase pourrait

jouer un rôle dans le trafic du DAT, bien que l’on on ne sache pas si cette protéine interagit de

façon directe avec le DAT.

• Autres protéines

Récemment, Maiya et Mayfield (2004) ont développé une stratégie différente du double-

hybride, basée sur l’immunoprécipitation sélective de protéines interagissant avec le DAT, en

utilisant un anticorps dirigé contre la partie N-terminale du transporteur. Les protéines co-

précipitées à partir de striatum de souris sont ensuite identifiées par spectrométrie de masse.

Vingt protéines ont été identifiées, dont 5 validées par des expériences d’immunoprécipitation et

de western-blot (synapsine I, dynamine I, canal potassium Kv2.1, Brca2 et neurocam).



En conclusion, ces différentes études ont permis d’identifier les premières molécules

interagissant avec le DAT (figure 13). A terme, l’objectif de ces études est d’identifier toutes les

protéines interagissant de près ou de loin avec le DAT, susceptibles de réguler sa synthèse,

son assemblage, son adressage, son trafic et ses propriétés fonctionnelles. Ensuite, il faudra

s’attacher à comprendre la régulation spatiale et temporelle de ces interactions et voir si

certains défauts d’interaction peuvent être responsables de dysfonctions du système

dopaminergique retrouvées dans diverses pathologies.

Figure 13 : Schéma des interactions démontrées entre le DAT et différentes protéines.

La syntaxine 1A (Syt) et RACK1 se lient à l’extrémité N-terminale du DAT tandis que l’alpha- synucléine (Syn), PICK1 et Hic 5 lient l’extrémité C-terminale. Les interactions entre DAT et PKC ou PP2A peuvent être directes ou nécessitent d’autres protéines. Vingt autres protéines partenaires du DAT ont été décrites (Maiya and Mayfield, 2004). D’après Torres, 2006.


MATERIELS ET METHODES

Partie 1- Matériels et Méthodes


1/ Double-hybride

• Crible initial Hybrigenics Fabrication de banques de proies d’ADNc

Cette étape a été réalisée par la société Hybrigenics (contrat de collaboration de recherche 01 015A10 INSERM/Hybrigenics). Deux banques d’ADN complémentaires (ADNc) ont été construites à partir d’ARN totaux extraits de cerveaux de rats adultes : une banque d’hippocampe et une banque de cerveau postérieur comprenant les noyaux mono-aminergiques (substance noire, aire tegmentale ventrale, raphé, locus coeruleus). Il s’agit de banques de type « random-primed », dont la synthèse est réalisée à partir d’amorces dégénérées aléatoires. Ces ADNc sont sous-clonés dans un vecteur navette pP6, en fusion avec le domaine d’activation du facteur de transcription de levure LexA. Fabrication du vecteur appât

Cette étape a été réalisée avant mon arrivée au laboratoire. Brièvement, les extrémités N-terminale (1-66) et C-terminale (574-619) de l’ADNc du rDAT ont été amplifiées par PCR à l’aide d’amorces spécifiques contenant les sites de restriction SpeI et PacI. Le fragment SpeI-EcoRI a été sous-cloné dans le vecteur pB6, en fusion avec le domaine de liaison à l’ADN GAL4 et vérifié par séquençage. Crible double-hybride

Le crible a été réalisé par la société Hybrigenics, selon le protocole établi par Rain et collaborateurs (Rain et al., 2001). L’appât et la banque sont transformés dans deux souches haploïdes de signe sexuel opposé qui sont ensuite conjuguées dans des conditions permettant une couverture exhaustive de la banque (5x107 d’interactions testées). Le gène rapporteur utilisé étant HIS3, les diploïdes obtenus sont sélectionnés sur milieu déplété en histidine. L’ADN des clones positifs est isolé des colonies de levure, transformé en bactéries et analysé par restriction enzymatique et séquencé. Les séquences sont alignées pour construire des contigs (clones chevauchant ou identiques) et soumises à une recherche sur des banques de données (BLAST).

• Validation des interactions Construction des vecteurs

Les appâts et les proies clonés en vecteurs pB6 et pP6 ont été sous-clonés en vecteurs pLEX12 et pGAD3S2X, entre les sites d’insertion EcoRI et XhoI. L’ADNc de l’alpha-synucléine de rat (rsyn1) a été obtenu par PCR à partir d’une banque d’ADNc d’hippocampe de rat, à l’aide des amorces suivantes : rSYN1-EcoRI-S : GAATTCGAGCCGTGTGGAGCAAAGATA rSYN1-HdIII-AS : AAGCTTTGCAACGACATTCTTAGGCTT Ce fragment a ensuite été cloné entre les sites EcoRI et HindIII des différents vecteurs pB6, pP6, pLEX12 et pGAD3S2X. Transformation des levures

Les levures utilisées sont de souches L40 et AMR70 (système LEXA) ou CG1945 et YHGX13 (système GAL4) et sont cultivées en milieu YPDA (2% glucose, 1% extrait de levure, 2% polypeptone et 20 mg/mL adénine hémisulfate). Les levures sont rendues compétentes par traitement à l’acétate de lithium (LiAc), puis transformées avec l’ADN plasmidique par incubation avec du polyéthylène glycol (PEG3350) et choc thermique. Après transformation, les levures sont étalées sur milieu sélectif et cultivées à 30°C pendant 2-3 jours.



Conjugaison et tests d’activité Les levures de chaque souche sont conjuguées durant la nuit à 30°C en milieu liquide

YPDA, puis étalées sur milieu sélectif le lendemain et cultivées pendant 1 à 3 jours. Les levures sont testées pour leur activité β-galactosidase (β-gal) : après lyse à l’azote liquide, les levures sont incubées dans un tampon Z (β-mercaptoéthanol 0,3% ; X-Gal 1%) 4h à 30°C, la réaction étant arrêtée par addition de carbonate de sodium 1M. Les colonies exprimant la β-gal donnent une coloration plus ou moins bleue. Parallèlement, les levures sont testées pour leur croissance sur milieu solide dépourvu d’histidine en présence ou non de 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT ; 2 mM). Les couples pLEX Ras/pGAD RBD et pGBKT7-53/pGADT7-T (Clontech) ont été utilisés comme témoins positifs. 2/ Western Blot Extraction des protéines de levure

Les culots de colonies fraîches de levures sont resuspendus dans 300 μl de tampon Laemmli (SDS 2%, DTT 100mM, Tris HCl 60 mM pH 6,8, glycérol 10%) et 400 μl de billes de verre (0,5 mm ; Sigma-Aldrich). Les levures sont vortexées et chauffées à ébullition, puis centrifugées 10 min à vitesse maximale pour conserver le surnageant. Western Blot

Les extraits protéiques (25 μl) sont déposés sur gel NuPAGE 10% Bis-Tris (Invitrogen). Après migration (1h à 200V), les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose (Invitrogen) et colorées au rouge ponceau afin de vérifier le transfert. Après 1h de blocage des sites non spécifiques dans une solution de PBS-tween 0,1%-lait en poudre 5%, la membrane est incubée avec l’anticorps anti-LexA de lapin (Invitrogen, 1/5000) 1h à température ambiante, rincée par du PBS-tween 0,1%-lait 5%, puis incubée 1h à température ambiante avec un anticorps IgG anti-lapin couplé à la péroxydase HRP (Sigma). La révélation s’effectue à l’aide du kit ECL Plus (GE Healthcare). 3/ Culture cellulaire

Des cellules HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) ont été cultivées en flasque T75, dans un milieu DMEM (Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium ; Invitrogen) contenant 10% de FBS (Fetal bovine Serum) préalablement inactivé à la chaleur et 2mM de L-glutamine dans une étuve maintenue à 37°C sous atmosphère 95% O2/ 5% CO2. Transfection cellulaire

Le jour précédant la transfection, les cellules HEK293 sont repiquées dans des boîtes de 10 cm de diamètre. Les cellules sont transfectées à l’aide du Fugene 6 (Roche), avec 18 à 24 μg d’ADN total de plasmide. Le jour suivant, les cellules sont réparties en plaque de 24 puits à raison de 200 000-250 000 cellules par puits. Transport de [3H]-dopamine

Les expériences de capture de [3H]-dopamine sur cellules ont été réalisées comme décrit précédemment (Giros et al., 1992). 48h après transfection, le milieu est aspiré et les puits sont rincés avec 0,4 ml de tampon de transport (Tris Base 5 mM, HEPES 7,5 mM, NaCl 120 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgSO4 1,2 mM, acide ascorbique 1 mM, glucose 5 mM, pH 7,4). Les cellules sont préincubées en triplicats avec des concentrations croissantes de dopamine froide (0,09 à 300 μM) avant addition de 15 nM [3H]-dopamine (50 μl ; 41-52



Ci/mmol ; GE Healthcare) et incubées 10 mn à 37°C dans un volume final de 0,6 ml. Le transport non spécifique de [3H]-dopamine est défini en présence de 10 μM de nomifensine. Les puits sont rincés trois fois avec 0,5 ml de tampon de transport à 4°C, les cellules sont solubilisées avec 0,5 ml de NaOH 0,1M et collectées pour mesurer la radioactivité incorporée à l’aide d’un compteur à scintillation liquide. La détermination de la cosntance de Michaelis (Km) et de la vitesse maximale de transport (Vmax) est réalisée à l’aide du logiciel GraphPad Prism. 4/ Animaux

Des rats Sprague Dawley (Charles River) et des souris C57BL/6 sauvages ou DAT KO (Giros et al., 1996) âgés d’environ 3 mois ont été utilisés pour l’ensemble des expériences décrites ci-dessous. Coupes au cryostat

Les animaux sont sacrifiés par guillotine ou dislocation cervicale, leur cerveau rapidement extrait et congelé dans de l’isopentane à -30°C, puis conservé à -80°C. Pour l’immunofluorescence, les animaux sont perfusés avec du paraformaldéhyde (PAF) 4% et leurs cerveaux cryoprotégés dans du sucrose puis enrobés de gélatine et congelés comme mentionné ci-dessus. Des coupes frontales ou horizontales (10 μm) sont ensuite réalisées à l’aide d’un cryostat Leica CM3050S, montées sur lames SuperFrost Plus et conservées à -80°C. Le jour de l’utilisation, les coupes sont fixées dans du formaldéhyde 3,7% pendant 1h à température ambiante, lavées 2 x 5 mn dans du PBS1X, rinçées rapidement dans de l’eau ultra-filtrée, puis déshydratées dans des bains successifs d’éthanol à 50%, 70% et 100%. 5/ Hybridation in situ Marquage des sondes

Des oligonucléotides antisens complémentaires des gènes d’intérêt (DAT, Sh2bp1, synucléine 1) d’environ 45 paires de bases sont rendues radioactives à leur extrémité 3’ par du [γ-35S]-dATP (1000 Ci/mmol-20uCi ; GE Healthcare) dans les conditions suivantes : 30 ng d’ADN, tampon TdT Proméga (1X), enzyme terminal déoxytransférase (TdT ;10U), [γ-35S]-dATP (1 μl ;10mCi/ml) dans un volume final de 20 μl sont incubés à 37°C pendant 45 mn. La réaction est arrêtée par l’addition de 5 μl d’EDTA à 0,5 M et purification sur colonnes P10 Biogel (résine Biogel P10, Biorad). Du DTT (100mM) est ajouté comme antioxydant. L’activité spécifique finale des oligonucléotides marqués est d’environ 5x106 cpm/μg.

Nom Séquence DAT 5’-GCTGTTGTGAGGTGGCCCAGCTGGCAGCTGTCTCCTTCCACTTTA-3’ Sh2bp1-1 5’-GCCAGCATAGAGTAGGTGTCACTCTGTGTGGCTGGCTGTTTTAAT-3’ Sh2bp1-2 5’-TGACTGCACAGACTCATTGTCCGACTGCTCAGAGCCGGAGCGCCT-3’ Msyn1 5’-GGAACCTACATAGAGGACTCCCTCTTTTGTC-3’ Msyn2 5’-CTGCTGTCACACCAGTCACCACTGCTCCTCC-3’ Msyn3 5’-CATAAGCCTCACTGCCAGGATCCACAGGC-3’



Hybridation in situ 100 μl de milieu d’hybridation (tampon InSitu Hybridization Buffer, GE Healthcare,

contenant du formamide à 40%, DTT (50mM), polyA (0,5 mg/ml)) mélagés à environ 5x106 cpm de sonde sont déposés sur chaque lame et recouverts de Nescofilm. L’hybridation se fait à 50°C pendant 15 à 18h. Les lames sont ensuite lavées 2 x 15 mn dans du SSC1X + DTT 10 mM à 53°C, 2 x 15 mn dans du SSC 0.5X + DTT 10 mM à 53°C, puis rincées à l’eau, déshydratées à l’éthanol 95% et exposées sur un film Biomax (GE Healthcare) pendant 8-15 jours selon l’intensité du marquage radioactif. 6/ Immuno-autoradiographie

Les coupes de cerveau sont fixées 15 mn dans du paraformaldéhyde (PAF) 4%, incubées 1h à température ambiante dans un tampon de blocage (BSA 3%, sérum de chèvre 1%, NaI 0.015%, PBS 1X), puis incubés 1h avec l’anticorps anti-synucléine 1 de lapin (α90 ; Totterdell et al., 2004). Après rinçage au PBS, les coupes sont incubées 2h avec des [125I]-IgG purifiés (10-20 µCi/100 ml, GE Healthcare), puis rincées par du PBS, séchées et exposées sur un film Biomax MR.

Pour les expériences d’hybridation in situ et d’immuno-autoradiographie, la quantification du marquage radioactif est réalisée à l’aide du logiciel d’analyse MCID. Une gamme de standards radioactifs (GE Healthcare) a été exposée sur chaque film afin de s’assurer que les densités des différents marquages se situaient bien dans la partie linéaire de la gamme. Les données obtenues sont ensuite soumises à une analyse de variance (ANOVA, logiciel Statview). 7/ Immuno-fluorescence

Les coupes de cerveau de rat (10 µm) sont fixées pendant 15 mn dans du PAF 4%, incubées 1h dans un tampon de blocage PGT (PBS, gélatine (2g/L), triton 0,25%), puis 1h en présence d’anticorps anti-DAT (anticorps polyclonal de lapin, dirigé contre l’extrémité N-terminale du rDAT) dilué au 1/10000, ou d’anticorps anti-synucléine 1 (anticorps monoclonal de souris, BD Biosciences Pharmingen ; dilution 1/2500). Les lames sont ensuite lavées dans du tampon PGT et incubées 1h avec un anticorps secondaire Alexa A488 Fluor (anti-lapin ; dilution 1/1600 ; Molecular Probes) ou Alexa A555 (anti-souris ; dilution 1/1600 ; Molecular Probes), puis lavées dans du PBS et recouvertes d’une lamelle avec du milieu de montage Fluoromount G (Southern Biotech).

Pour l’immuno-fluorescence sur cellules, le tampon de blocage est composé de : BSA 1%, sérum de chèvre 1%, triton 0,1%, PBS 1X et les rinçages se font dans du PBS 1X.

Les images des coupes sont saisies par la caméra Axiocam du microscope à fluorescence Axioscop 2 Plus (Zeiss), aux objectifs 40X et 63X.


RESULTATS

Partie 1 - Résultats


A/ Etude de partenaires potentiels du DAT

1/ Crible double-hybride

L’appât utilisé pour l’expérience de double-hybride en levure contenait l’extrémité C-

terminale du rDAT (résidus 574-619) fusionnée au facteur de transcription GAL4. Le crible

réalisé par la société Hybrigenics a fourni environ 160 clones positifs. Ces clones ont été

séquencés à partir de leurs extrémités 5’ et 3’, puis alignés en vue de construire des contigs

(alignements de clones chevauchants ou identiques), dont la séquence consensus résultante

a été confrontée à une banque de données. 90 contigs ont été identifiés, chacun comprenant

un à vingt clones différents, c'est-à-dire ayant une extrémité 5’ ou 3’ distincte. Dans un

premier temps, six séquences candidates ont été sélectionnées, du fait de la présence d‘au

moins deux clones individuels différents. Finalement, à la suite d’expériences préliminaires,

seuls deux clones ont été retenus et seront abordés dans ce chapitre : il s’agit des gènes

Sh2bp1 et ACIII (figure 14).

Figure 14 : Clones sélectionnés, issus du crible double-hybride en levure dirigé contre le rDAT.

CaMKII : Calcium Modulated Kinase II ; NET : transporteur de la noradrénaline ; SH2 : Sarc Homology 2; SNAP25 : Synaptosome Associated Protein 25 kDa.

Gène Numéro d’accession

Nombre de clones

Interaction avec NET

Caractéristiques

Mus musculus SH2 domain binding protein 1 (tetratricopeptide repeat containing) (Sh2bp1)

NM_009431

18

oui

Expression ubiquitaire. Contient des domaines « tetratricopeptide repeat » et SH2

Rattus norvegicus type III adenylyl cyclase (ACIII)

M55075

2

oui

Expression ubiquitaire. Stimulée par le Ca2+; inhibée par la CaMKII

Mus musculus SNAP-associated protein (Snapap)

NM_133854

16

oui

Exprimée par les membranes des vésicules synaptiques. S’associe à SNAP25.



Ces séquences ont également été retrouvées dans le crible double-hybride dirigé

contre le rNET, initié au laboratoire.

On peut également noter la présence du gène Snapap, largement représenté dans

les résultats du crible (également dans celui du NET), qui s’associe à la protéine SNAP25,

appartenant elle-même au complexe SNARE, responsable de la fusion des vésicules

synaptiques à la membrane cellulaire. L’interaction DAT-SNAP25 étant en cours d’étude

dans d’autres laboratoires (Marc Caron et Michael Quick, communication personnelle), nous

avons fait le choix de ne pas l’étudier.

2/ Clones sélectionnés

a/ Sh2bp1

La protéine Sh2bp1, initialement nommée p150TSP, a été identifiée en 1996 (Malek

et al., 1996) et comprend 1173 acides aminés. Elle fait partie d’une famille de protéines

adaptatrices contenant des motifs « tetratricopeptide repeat » (TPR), composés d’une

répétition dégénérée de 34 acides aminés arrangés en tandem. Ces motifs forment des

structures en hélices α, avec peu ou pas de feuillets β. Les protéines à domaines TPR sont

impliquées dans un large spectre de fonctions cellulaires, participant notamment au contrôle

du cycle cellulaire, à la transcription, au transport des protéines et au repliement protéique.

Elles sont retrouvées dans différents organismes, incluant les bactéries, cyanobactéries,

levures, insectes, plantes et animaux (Blatch and Lassle, 1999), indiquant un très haut degré

de conservation dans l’évolution.

La protéine Sh2bp1 peut être divisée en deux régions : la partie N-terminale

contenant quinze motifs TPR et la partie C-terminale contenant un domaine SH2 (Src

homology 2). Les domaines SH2 sont des modules conservés d’environ 100 acides aminés,

liant avec une haute affinité les peptides contenant des phosphotyrosines ou des

phosphosérines/thréonine. D’après l’alignement des différents clones ressortis en double-

hybride, Sh2bp1 interagit avec le DAT par cinq domaines TPR situés à son extrémité amino-

terminale. Notons que cette interaction a été retrouvée par Hybrigenics dans deux types de

cribles de stringence différente : un premier crible réalisé avec l’appât DAT fusionné à un

domaine de liaison à l’ADN de type LexA, qui n’avait donné qu’une dizaine de clones au total

et le deuxième crible réalisé avec un domaine Gal4, précédemment décrit, à l’origine de 160

clones. La protéine Sh2bp1 est exprimée dans divers tissus, dont le cerveau, et notamment

retrouvée au niveau ultrastructural dans le noyau (Malek et al., 1996). Chez les eucaryotes



supérieurs, le rôle précis de cette protéine demeure inconnu mais sa séquence et ses

propriétés de liaison suggèrent qu’elle pourrait médier les interactions entre protéines,

notamment celles contenant des domaines TPR et/ ou SH2.

b/ ACIII

L’adénylate cyclase de type III appartient à la grande famille des adénylates cyclases

(AC), comptant neuf isoformes membranaires, constituées de douze domaines

transmembranaires et une isoforme soluble. Ces protéines jouent un rôle primordial dans la

transduction du signal cellulaire puisqu’elles transforment l’ATP (adénosine triphosphate) en

AMPc (adénosine monophosphate), sous la régulation de l’activation d’une protéine G.

L’ACIII, isolée en 1990, est constituée de 1144 acides aminés et est exprimée

majoritairement au niveau de l’épithélium olfactif (Bakalyar and Reed, 1990). D’ailleurs, les

souris invalidées pour l’ACIII (Wong et al., 2000) montrent d’importants déficits au niveau

olfactif, malgré la présence d’autres isoformes d’AC. L’ACIII est également présente dans le

cerveau, particulièrement au niveau de la substance noire, comme le montrent des

expériences de western-blot (Lane-Ladd et al., 1997). De façon intéressante, l’ACIII fait

partie des gènes dont l’expression est fortement diminuée après dégénérescence des

neurones dopaminergiques induite par la métamphétamine (Xie et al., 2002), indiquant que

cette protéine est bien exprimée par les neurones dopaminergiques. D’après le crible

double-hybride, l’extrémité N-terminale intracellulaire de l’ACIII est responsable de

l’interaction avec l’extrémité C-terminale du DAT.

3/ Etude anatomique

Pour que les interactions identifiées en double-hybride entre le DAT et les deux

clones sélectionnés puissent avoir un rôle physiologique potentiel, la première condition est

qu’elles soient co-localisées in vivo. Le crible a été effectué sur une banque de cerveau

postérieur de rat, contenant les corps cellulaires des neurones dopaminergiques, mais il est

important de vérifier si elles sont réellement exprimées par les neurones portant le DAT.

Concernant la protéine ACIII, son expression a été démontrée au niveau de la substance

noire et de l’aire tegmentale ventrale (Lane-Ladd et al., 1997). Ces données n’étant pas

disponibles pour la protéine Sh2bp1, nous avons réalisé une hybridation in situ sur coupes

de cerveau de rat à l’aide d’oligonucléotides radiomarqués, complémentaires de la séquence

de l’ARNm (figure 15). Le témoin positif a été réalisé avec une sonde spécifique du DAT.



Figure 15 : Répartition des ARNm du DAT et de Sh2bp1

Une expérience d’hybridation in situ des transcrits du DAT et de Sh2bp1 a été réalisée à l’aide de sondes oligonucléotidiques marquées au 35S, sur des coupes de cerveau de rat au niveau de la substance noire compacte (SNc) et de l’aire tegmentale ventrale (ATV).

Comme décrit précédemment, le marquage du DAT est fortement présent au niveau

de la substance noire compacte et de l’aire tegmentale ventrale, avec quelques cellules

marquées dans la substance noire réticulée. Le marquage des transcrits de Sh2bp1 apparaît

ubiquitaire, avec une expression plus dense au niveau de l’hippocampe. On peut noter la

présence des ARNm de Sh2bp1 au niveau de la SNc et de l’ATV, démontrant l’expression

de ce gène dans les régions contenant les corps cellulaires dopaminergiques et ainsi la

potentialité d’une interaction physiologique de cette protéine avec le DAT.

4/ Co-expression avec le DAT

Dans le but d’étudier un éventuel rôle fonctionnel de l’interaction DAT-Sh2bp1, nous

avons co-exprimé le transporteur et ce partenaire potentiel en système cellulaire.

a/ Capture de [3H]-dopamine

• Résultats

Afin de savoir si l’interaction DAT-Sh2bp1 provoque un changement fonctionnel de

l’activité de transport et/ou d’affinité du DAT, nous avons effectué des expériences de

capture de [3H]-dopamine par des cellules exprimant de façon transitoire le DAT avec un

plasmide β-galactosidase (contrôle négatif) et par des cellules co-exprimant DAT et le

partenaire d’intérêt, la synucléine 1 ou Sh2bp1 (qsp β-galactosidase). Comme contrôle

positif, nous avons choisi et cloné la synucléine 1, homologue de l’alpha-synucléine humaine

DAT Sh2bp1

SNc ATV

SNcATV



chez le rat. Cette protéine n’est pas apparue dans notre crible, mais a été décrite comme

partenaire direct du DAT humain (Lee et al., 2001a) et engendre une diminution de sa

capacité de transport maximale (Vmax ; Wersinger and Sidhu, 2003).

Les résultats ci-dessous représentent la moyenne de la Vmax du transport par le

DAT co-exprimé avec la synucléine 1 ou Sh2bp1 (5 à 7 expériences indépendantes),

exprimée en % de la Vmax du transport de DAT seul (figure 16). On observe que

l’expression de la synucléine 1 au sein des cellules entraîne une diminution de la capacité de

transport du DAT d’environ 20%, en accord avec la baisse d’activité observée par Wersinger

et Sidhu (-35%, p<0,05 ; Wersinger and Sidhu, 2003). Cependant, cette baisse d’activité

n’est pas significative. L’expression de Sh2bp1 engendre une augmentation de la Vmax du

DAT de l’ordre de 60%, qui n’est pas significative, du fait d’une grande variabilité inter-

expériences.

Figure 16 : Capacité de transport moyenne de [3H]-dopamine par le DAT transfecté dans des cellules HEK 293, co-exprimé avec la synucléine 1 (A ; rsyn1 ; n=7 expériences ; valeur du 100% : 12120+/-4160 fmol/min/mg protéine) ou Sh2bp1 (B ; n=6 expériences ; valeur du 100% : 15624+/-3277 fmol/min/mg protéine).

Concernant l’affinité du DAT pour la dopamine (Km ; figure 17), on observe

également des modifications non significatives, allant dans le même sens que la Vmax

lorsque le DAT est co-exprimé avec la synucléine 1 (-35%) ou Sh2bp1 (+38%). Notons que

ni la co-expression de l’alpha-synucléine (Lee et al., 2001a; Wersinger and Sidhu, 2003), ni

celle d’aucun autre partenaire du DAT rapportée dans la littérature (Torres et al., 2001;

Carneiro et al., 2002) n’affecte le Km du transporteur de manière significative.

A B

0 20 40 60 80

100

120 140 160

0

50

100

150

200

250

DAT

%

Vm

ax

DAT+Sh2bp1 DAT DAT+ rsyn 1

-20%+60%



Figure 17: Constante d’affinité moyenne du DAT pour la [3H]-dopamine co-exprimé avec la synucléine 1 (A ; n=7 expériences ; valeur du 100% : 2,19+/-1 μM) ou Sh2bp1 (B ; n=6 expériences ; valeur du 100% : 2,72+/-0,7 μM).

• Discussion

Nous avons obtenu une grande variabilité entre nos différentes expériences de

transport de [3H]-dopamine, ce qui se traduit par de grands écarts-types à la moyenne,

masquant des différences potentiellement significatives entre les valeurs de Vmax et de Km

testées et les valeurs contrôles.

Ceci peut être dû à plusieurs facteurs expérimentaux, intervenant à différentes étapes

expérimentales :

1/ au niveau du système cellulaire : type de cellules utilisé, nombre de passages et

état de confluence des cellules ;

2/ au niveau de la transfection transitoire : nature, qualité et quantité des plasmides

transfectés, nature et technique de transfection ;

3/ au niveau de la capture : nombre de cellules par puits, protocole de transport

(temps d’incubation,…).

A chaque étape, des précautions ont été prises afin de minimiser les risques de

fluctuation : après essai de différents types cellulaires (COS7, HEK293) et lipofectants

(Lipofectamine®, Fugene 6®), la transfection de cellules HEK293 avec le Fugene 6 a été

sélectionnée. Le nombre de passages, la confluence des cellules ont été contrôlés et les

plasmides utilisés au cours des différentes manipulations provenaient du même stock. La

transfection s’effectuait en flasque avant de répartir les cellules dans chaque puits de façon

0 40 60

120 160

DAT DAT+rsyn1 0

80

120

160 200

DAT+Sh2bp1

% K

m

A B

DAT

40

-35%

+ 38%



homogène. Enfin, le nombre de cellules par puits ainsi que le protocole de transport utilisé

étaient les mêmes d’une expérience à l’autre.

Malgré ces précautions, il peut y avoir une grande hétérogénéité au sein des résultats

des expériences de transport. Un exemple pertinent concerne l’alpha-synucléine qui, suite à

des expériences de capture de [3H]-dopamine, a initialement été décrite comme augmentant

significativement l’activité du DAT (Lee et al., 2001a). Ce résultat a ensuite été infirmé deux

ans plus tard par Wersinger et son équipe, qui ont trouvé une baisse de la Vmax,

reproductible dans différents systèmes cellulaires, avec différents lipofectants et différentes

quantités relatives de plasmides transfectés (Wersinger et al., 2003; Wersinger and Sidhu,

2003). L’origine de ces résultats contradictoires proviendrait du type de transfection utilisé :

transfection en « bain » (« batch »), c’est-à-dire lorsque les cellules sont cultivées et

transfectées en flasque, puis subissent un traitement à la trypsine (détruisant l’adhésion

cellulaire) pour être réparties en puits, versus transfection in situ, lorsque les cellules sont

cultivées en puits et sont transfectées puits par puits (Wersinger et al., 2003). La première

méthode, expérimentée par Lee, conduirait à une augmentation de la Vmax du DAT,

contrairement à la deuxième, employée par Wersinger, qui aboutirait à une baisse de la

Vmax (Wersinger et al., 2003). En fait, il a récemment été montré que ce phénomène mettait

en jeu des éléments du cytosquelette : le traitement de cellules avec des agents

dépolymérisant les microtubules ou affectant leur dynamique engendre une augmentation

systématique de la Vmax du DAT, corrélée avec une hausse du nombre de sites du

transporteur à la surface cellulaire (Wersinger and Sidhu, 2005).

Dans notre protocole, nous avons utilisé une transfection en bain mais le décollement

des cellules a été fait par dissociation mécanique et non chimique par la trypsine. D’autre

part, sur sept expériences réalisées avec la synucléine, trois montraient une augmentation et

quatre une diminution de la Vmax du DAT. De même, sur six expériences réalisées avec

Sh2bp1, quatre montraient une augmentation de la Vmax du DAT et deux une diminution. Il

est donc possible que ce mode de transfection soit responsable de l’hétérogénéité de nos

résultats, mais seulement en partie puisque nous n’avons pas trouvé d’augmentation de la

Vmax pour la totalité de nos expériences avec la synucléine 1, par exemple. Wersinger et

son équipe ont également comparé par western-blot les quantités de protéines exprimées

par les cellules après chaque type de transfection (Wersinger et al., 2003). Il en résulte que

les cellules issues de la transfection en « bain » contiendraient beaucoup moins d’alpha-

synucléine alors que la densité du DAT ne serait pas altérée dans ces mêmes cellules. De

plus, la Vmax du DAT transfecté seul dans des cellules n’est pas significativement différente



entre les deux méthodes de transfection (bain versus puits par puits), suggérant que la

trypsine affecte spécifiquement l’expression de l’alpha- synucléine.

Dans la même logique, soulignons que la co-transfection transitoire reste une étape

difficile à maîtriser, puisque l’on ne peut être sûr de la reproductibilité de la quantité d’ADN

totale et relative (DAT/gène d’intérêt) introduite en fonction du cycle et du métabolisme

cellulaire. Une solution envisageable pour tenter de limiter ces fluctuations serait peut être

d’utiliser des lignées cellulaires exprimant le DAT de façon stable et de ne transfecter

transitoirement que le gêne d’intérêt. Cependant, il est nécessaire de bien sélectionner la

lignée stable puisque dans ce type de transfection, on ne maîtrise pas le nombre de copies

d’ADN intégré au génome et une trop forte expression du DAT pourrait masquer l’effet

fonctionnel de la molécule interactante. Ajoutons que l’endroit dans le génome où s’effectue

cette insertion n’est pas contrôlable, ce qui peut également poser problème. Enfin, tandis

que 30 à 40% des cellules sont transfectées par une technique de transfection transitoire,

toutes les cellules le sont lors de la génération des clones. Ainsi, si l’on transfecte 30% des

cellules exprimant le DAT avec un clone d’intérêt, il y aura une forte dilution de l’effet

fonctionnel, qui pourrait alors ne pas être détectable. La situation est également complexe si

l’on effectue une double transfection stable (DAT + partenaire), car, pour les raisons

énoncées ci-dessus, il sera difficile de trouver le contrôle parfaitement adapté. Enfin, pour

améliorer le taux de transfection, l’utilisation de vecteurs viraux peut être envisagée.

b/ Immuno-fluorescence

Dans le but de détecter d’éventuels changements de localisation du DAT à la

membrane, nous avons effectué des expériences d’immuno-fluorescence, à l’aide d’un

anticorps dirigé contre le DAT, sur les mêmes cultures de cellules ayant servi aux

expériences de capture.

La morphologie des cellules a tout d’abord été observée en contraste de phase afin

de vérifier la bonne intégrité des cellules transfectées (figure 18).



Figure 18 : Observation de la morphologie des cellules transfectées.

(A) Amas de cellules HEK293 observé en contraste de phase. (B) Cellule transfectée par le DAT. (C) Superposition des images A et B. La cellule transfectée par le DAT (B) fait partie de cet amas de cellules vivantes (C). Observation en microscopie à contraste de phase (A, C) et en fluorescence (B), à l’objectif 40X. La barre d’échelle insérée en A correspond à 10 μm.

• Sh2bp1

Lorsque le DAT est co-transfecté avec le plasmide contrôle exprimant la ß-

galactosidase, on obtient un marquage du transporteur à la fois membranaire et

cytoplasmique (figure 19). Dans des cellules co-exprimant le transporteur et Sh2bp1, le

marquage observé apparaît similaire en microscopie à fluorescence. Nous n’avons pas

décelé de différence claire de la localisation subcellulaire du DAT dans les deux conditions.

Figure 19 : Marquage du DAT par immuno-fluorescence dans des cellules HEK293 non transfectées (A), co-transfectées avec le DAT et un plasmide ß-galactosidase (B) et co-transfectées avec le DAT et Sh2bp1 (C).

Observation au microscope à fluorescence, à l’objectif 63X ; la barre d’échelle insérée en A représente une distance de 5 μm.

Notons que le vecteur exprimant Sh2bp1 n’exprime que le fragment cloné en double-

hybride, contenant les domaines TPR et non la protéine entière, qui est peut-être nécessaire

pour exercer son effet. Des mises au point et des observations en microscopie confocale

s’avèrent nécessaires pour tirer une conclusion quant à une potentielle relocalisation du DAT

en présence de Sh2bp1. D’autre part, ne disposant pas d’anticorps dirigé contre Sh2bp1

nous n’étions pas en mesure de vérifier l’expression de cette protéine et étudier sa



localisation au sein de la cellule. Il serait donc utile d’exprimer cette protéine en fusion avec

un épitope, par exemple un motif FLAG, détectable par un anticorps anti-FLAG, comme nous

avons commencé à le faire dans le laboratoire.

• Synucléine 1

Comme pour Sh2bp1, nous n’avons pas été en mesure de détecter une localisation

du DAT particulière lorsqu’il est co-exprimé avec la synucléine 1 (non montré). Disposant

d’un anticorps anti-synucléine 1, nous avons voulu tester sa spécificité sur des coupes de

cerveau de rat et tester la co-localisation de cette protéine avec le DAT. Au niveau du

striatum, le marquage du DAT (figure 20, A) est diffus au niveau des terminaisons

dopaminergiques et des varicosités le long de l’axone. Le marquage de la synucléine 1 (B)

apparaît punctiforme, en accord avec la littérature (Totterdell et al., 2004). La superposition

des deux images (C), montre une absence de co-localisation des deux protéines dans les

mêmes structures. Jusqu’à présent, l’expression de la synucléine 1 par les neurones

dopaminergiques du striatum n’a pas été formellement démontrée (Totterdell and Meredith,

2005).

Figure 20 : Immuno-fluorescence du DAT (A), de la synucléine 1 (B) sur des coupes de striatum de rat. (C)

Superposition des deux images. Observation au microscope à fluorescence à l’objectif 63X.

5/ Interaction en double-hybride

Notre objectif était de valider les données obtenues par le crible double-hybride

réalisé par Hybrigenics avec l’extrémité C-terminale du DAT de rat. Pour cela, nous avons

testé les interactions choisies dans deux systèmes différents. Dans un premier temps, nous

avons utilisé un autre système qu’Hybrigenics (LEXA), qui ne s’est pas révélé concluant,



puis nous avons repris les mêmes plasmides et levures (système GAL4) afin de retrouver les

interactions.

a/ Résultats

Les différentes souches de levures L40 et AMR70 (système LEXA) ou CG1945 et

YHGX13 (système GAL4) ont été rendues compétentes puis transformées séparément avec

les plasmides appropriés (couple pLEX12/pGAD3S2X ou pB6/pP6) et ont été conjuguées

entre elles. Les levures diploïdes obtenues ont alors été testées pour leur expression de

l’enzyme β-galactosidase (β-gal), capable de métaboliser le substrat X-Gal en un composé

de couleur bleue. En parallèle, elles ont été testées pour leur croissance sur milieu dépourvu

d’histidine, en présence ou non de 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT), qui inhibe de façon

compétitive le produit du gène HIS3, de manière à sélectionner des interactions plus

stringentes. Dans les deux cas, s’il y a interaction entre les deux protéines, les résultats de

ces tests sont positifs.

La figure 21 présente une synthèse des résultats obtenus au cours de ces

différentes manipulations.

Dans la première série d’expériences, la conjugaison pLEX DAT–pGAD RBD sert de

témoin négatif puisque le DAT n’interagit pas avec le domaine liant la protéine Ras. La

conjugaison pLEX Ras–pGAD RBD sert au contraire de contrôle positif. Excepté ce contrôle

positif et malgré vérification de la qualité et de la séquence des différents plasmides, aucune

interaction n’a pu être retrouvée dans ce système. Nous avons alors interverti les séquences

d’intérêt et les plasmides, c’est-à-dire exprimé les séquences proies dans les vecteurs appât

et la séquence appât dans le vecteur proie (non montré). Mais là aussi, aucune interaction

n’est ressortie positive, ce qui nous a conduits à revenir au système ayant servi à réaliser le

crible initial.

Dans cette deuxième série de manipulations, nous avons utilisé différents contrôles

négatifs : le plasmide proie pP6 vide, le plasmide pGAD RBD et le plasmide pP6 exprimant

la protéine ribeye, qui a été retrouvée dans le crible double-hybride réalisé par le laboratoire

contre le transporteur vésiculaire des monoamines (VMAT2). Les résultats observés sont

ceux attendus, sauf pour la conjugaison du DAT avec la protéine ribeye qui a souvent donné

des colonies sur milieu dépourvu d’histidine, sans toutefois résister à l’ajout de 3-AT. Le test

β-gal est également resté négatif pour cette conjugaison. Le contrôle positif choisi pour ce

système est la conjugaison pGBKT7-53/pGADT7-T (Clontech). Dans ces expériences,

aucune interaction n’a pu être démontrée entre DAT et ACIII et DAT et synucléine 1. En



revanche, l’interaction directe entre DAT et la protéine Sh2bp1 a été vérifiée de manière

robuste.

Figure 21: Tableau représentant les résultats des interactions étudiées par double-hybride en levure.

Le signe + symbolise une coloration bleue pour le test β-gal et une croissance des colonies sur milieu dépourvu d’histidine +/- 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT). Le signe - signifie une absence de coloration bleue ou de croissance. rsyn1 : synucléine 1 ; RBD : Ras Binding Domain. NT : Non Testé.

b/ Difficultés rencontrées

• Choix des contrôles

- Contrôles négatifs

Nous voulions trouver une protéine n’interagissant pas avec le DAT qui soit exprimée

dans les mêmes conditions qu’une protéine partenaire. Nous avons donc choisi la protéine

ribeye, uniquement retrouvée dans le crible de VMAT2, transporteur assez différent du DAT

par sa séquence. Cependant, dans certaines expériences, une interaction a été retrouvée

entre cette protéine et le DAT. Ainsi, nous pouvons nous poser la question de savoir si cette

Conjugaisons Test ß-gal milieu –HIS milieu-HIS +3AT

pLEX DAT–pGAD RBD _ _ NT

pLEX Ras–pGAD RBD + + NT

pLEX DAT–pGAD rsyn1 _ _ NT

pLEX DAT–pGAD Sh2bp1 _ _ NT

pLEX DAT–pGAD ACIII _ _ NT

pB6 DAT-pP6 vide _ _ _

pB6 DAT- pGAD RBD _ _ _

pB6 DAT-pP6 ribeye _ +/_ _

pGBKT7-53-pGADT7-T + + +

pB6 DAT-pP6 rsyn1 _ _ _

pB6 DAT-pP6 Sh2bp1 + + +

pB6 DAT-pP6 ACIII _ _ _



protéine peut interagir avec le DAT même si elle n’est pas ressortie dans le crible double-

hybride. Pour plus de fiabilité, nous avons donc choisi de nous servir du plasmide exprimant

un domaine liant la protéine Ras (RBD) ainsi qu’un plasmide vide du système GAL4 (pP6).

- Contrôles positifs

Dans le même souci de se trouver dans des conditions expérimentales similaires et

dans le but de valider notre plasmide appât, nous avions initialement choisi la synucléine 1

comme contrôle positif. L’interaction hDAT-alpha-synucléine a en effet été démontrée par

deux groupes différents (Lee et al., 2001a; Wersinger and Sidhu, 2003). Cependant, nous

n’avons pas réussi à établir cette interaction dans les deux systèmes étudiés. Afin de valider

notre protocole, nous avons donc utilisé deux couples de plasmides pLEX Ras/pGAD RBD

et pGBKT7-53/pGADT7-T correspondant aux systèmes LEXA et GAL4, respectivement.

• Croissance des levures

Une des difficultés rencontrées lors de ces expériences était l’hétérogénéité de

croissance observée pour les différentes conjugaisons. Les levures diploïdes ne croissaient

pas toutes avec la même densité et le même aspect. Ainsi, les levures co-exprimant DAT et

Sh2bp1 formaient de grosses colonies rosées, tandis que celles co-exprimant DAT et

synucléine 1 étaient petites et blanches. Il s’avérait donc délicat de comparer la pousse des

levures sur milieu dépourvu d’histidine et la coloration bleue après test β-gal. En vue de

mieux contrôler et de standardiser la taille des colonies, nous avons mesuré et ajusté la

densité optique de chaque colonie de levure transformée avant de procéder à l’étape de

conjugaison. Malgré ce protocole, des difficultés d’interprétation des résultats de croissance

ont persisté.

• Gènes rapporteurs

L’utilisation de deux gènes rapporteurs différents, sous le contrôle de promoteurs

distincts permet d’éliminer beaucoup de clones faux-positifs. Les colonies qui se multiplient

le plus rapidement sur milieu dépourvu d’histidine sont souvent les interactants les plus forts.

Cependant, beaucoup de plasmides rapporteurs HIS3 montrent une expression constitutive

significative. Ceci peut être contrôlé en ajoutant au milieu du 3-AT, un inhibiteur chimique qui

supprime le niveau basal d’expression du gène. L’activité du gène LacZ est mesurée en

utilisant le substrat chromogène X-Gal, aboutissant à un produit bleu. Le test réalisé sur filtre

étant plus sensible que celui réalisé sur agar, nous avons donc choisi le premier. La densité

de la couleur permet d’estimer le niveau d’expression du gène dans une souche de levure



donnée. Dans nos expériences, ces deux tests se sont révélés positifs uniquement pour nos

contrôles positifs Ras/RBD et T7-53/T7-T et l’interaction DAT-Sh2bp1, validant cette dernière

dans ce système.

c/ Discussion

L’interaction DAT-Sh2bp1, clairement démontrée en système pP6/pB6 (GAL4), n’a

cependant pas pu être établie en système pLEX/pGAD (LEXA), quel que soit le vecteur

appât ou proie exprimant la séquence du gène. Bien que la séquence des plasmides

exprimant le gène d’intérêt fusionné avec le domaine activateur de la transcription soit

correcte, nous avons émis l’hypothèse que la protéine de fusion était peut-être mal

exprimée. Nous avons donc vérifié la présence et la taille de cette protéine par des

expériences de western-blot, avec un anticorps anti-LexA visant à détecter la protéine de

fusion sur différents extraits protéiques de levures transformées (figure 22). Dans la majorité

des expériences effectuées, la bande protéique était présente et avait la taille attendue.

Cependant, l’intensité de cette bande, notamment celle de la protéine pLEX DAT était

variable (comparer les puits 2 et 4, figure 22). Ceci pourrait refléter la quantité d’appât DAT,

suggérant qu’une faible expression ou qu’une mauvaise stabilité du transporteur pourrait

expliquer la non-détection des interactions avec les protéines proies. Toutefois, le protocole

d’extraction protéique à partir des levures ne permettait pas un dosage

spectrophotométrique des protéines, rendant la densité des produits révélés par western-blot

non quantitative. On peut également envisager un mauvais repliement de la protéine de

fusion LexA, indétectable en western-blot, qui pourrait être à l’origine de cette absence

d’interaction.

Figure 22 : Détection par western-blot de protéines de fusion pLEX sur différents extraits protéiques de levures transformées.

1 : pLEX A (vecteur vide) ; 2 : pLEX DAT issu d’une première transformation; 3 : pLEX ACIII ; 4 : pLEX DAT issu d’une autre transformation. Les poids moléculaires sont indiqués à droite et exprimés en kDa.



Dans les deux systèmes utilisés, nous n’avons pas retrouvé l’interaction DAT-

synucléine décrite pour les formes humaines par deux équipes (Lee et al., 2001 ; Wersinger

and Sidhu, 2003). Cette interaction existe aussi chez le rongeur (communication personnelle

de C. Wersinger). Emettant l’hypothèse que cette interaction était peut-être trop faible pour

être détectée dans nos expériences, nous avons changé notre protocole de conjugaison et

testé un protocole de co-transformation où une seule souche de levure (L40 ou CG1945) est

transformée simultanément avec les plasmides appât et proie. Ce protocole, décrit comme

plus sensible, évite l’étape de conjugaison mais n’a toutefois pas permis de retrouver

l’interaction DAT-synucléine 1. La cause de cette non-interaction n’a pas été établie et

pourrait impliquer la mauvaise croissance globale des levures transformées par la synucléine

1.

Ces données illustrent la complexité de la technique du double-hybride en levure et

soulignent l’importance d’étudier une interaction protéique par des techniques

complémentaires.

B/ Expression de la synucléine 1 chez les souris DAT KO

Nous appuyant sur les résultats d’interaction publiés dans la littérature entre hDAT et

alpha-synucléine, nous avons décidé d’étudier l’expression de la synucléine 1 au niveau

transcriptionnel et protéique chez les souris invalidées pour le DAT (DAT KO).

1/ Expression des ARNm

Nous avons détecté les transcrits de la synucléine 1 à l’aide de trois sondes

oligonucléotidiques radiomarquées. L’hybridation in situ a été réalisée sur des coupes de

cerveaux de souris sauvages et de souris DAT KO, au niveau des corps cellulaires et des

terminaisons dopaminergiques (figure 23).



Figure 23 : Marquage des ARNm de la synucléine 1 par hybridation in situ au niveau du striatum et de la substance noire (SN) de souris sauvages (WT) et DAT KO.

Chez la souris sauvage, on observe que les transcrits de la synucléine 1 sont

fortement exprimés au niveau du cortex cérébral, de l’hippocampe, de la substance noire

compacte, de l’aire tegmentale ventrale (figure 23), et plus faiblement au niveau du striatum,

comme précédemment décrit dans la littérature (Maroteaux and Scheller, 1991; Abeliovich et

al., 2000). Chez les souris mutantes, la répartition des ARNm est similaire à celle des

sauvages et aucune différence significative de densité du marquage n‘a été décelée au

niveau des régions dopaminergiques (figure 24), ainsi qu’au niveau de l’aire hippocampique

CA3, structure témoin faiblement dopaminergique.



marqueur structure WT DAT KO

ARNm SN 147,1±5 139,9±6

Striatum 57,3±6 60,2±5

CA3 474,9±14 437,1±37

protéine SN 123,0±6 125,8±4

Striatum 69,6±7 63,0±2

Cortex 47,4±2 43,8±2

Figure 24 : Quantification des ARNm (par hybridation in situ) et de la protéine (par immuno-autoradiographie) synucléine 1 chez des souris sauvages (WT) et DAT KO.

Les valeurs représentent la moyenne + SEM des densités (unité arbitraire) de 4-6 animaux par génotype dans trois expériences indépendantes.

2/ Expression de la protéine

La protéine a été détectée par immuno-autoradiographie, à l’aide d’un anticorps anti-

synucléine 1, dirigé contre la protéine de souris (α90 ; Totterdell et al., 2004). La synucléine

1 est largement distribuée au niveau de la substance grise du cerveau, avec une expression

plus marquée au niveau de l’hippocampe (CA3, gyrus dentelé) et de la substance noire

réticulée (figure 25 ; Kingsbury et al., 2004; Totterdell et al., 2004). Aucune différence

significative de densité de la protéine n’a été mise en évidence au niveau des régions

dopaminergiques striatum et substance noire des animaux DAT KO, ainsi que dans le

cortex, région contrôle peu dopaminergique (figure 24).



Figure 25 : Expression de la protéine synucléine 1 au niveau du striatum et de la substance noire (SN) de coupes de cerveau de souris sauvages (WT) et DAT KO. Immuno-autoradiographie réalisée à l’aide de l’anticorps α90 (Totterdell et al., 2004) ; 1/15000).

3/ Discussion

La synucléine 1 est l’homologue murin de l’alpha-synucléine humaine. Cette

abondante protéine a été impliquée dans la maladie de Parkinson, puisque des mutants de

l’alpha-synucléine ont été retrouvés dans des formes autosomales dominantes de la maladie

de Parkinson et que l’alpha-synucléine est un composant majeur des corps de Lewy,

caractéristiques de cette pathologie. L’alpha-synucléine est aussi abondamment présente

dans les plaques amyloïdes de la maladie d’Alzheimer et dans d’autres maladies

neurodégénératives (synucléopathies). Toutefois, son rôle physiologique reste à ce jour mal

défini. Des expériences menées in vitro ont suggéré que l’alpha-synucléine avait un effet

cytoprotecteur contre le stress oxydatif et l’apoptose induits par la dopamine (Wersinger et

al., 2003). Cet effet pourrait être dû, en partie, à l’action inhibitrice de l’alpha-synucléine sur

la recapture de dopamine libérée, via la réduction du nombre de molécules de DAT à la

surface cellulaire.

L’invalidation de cette protéine chez la souris (α-syn KO), réalisée par différentes

équipes, a permis d’apporter de nouvelles informations sur le rôle de l’alpha-synucléine in

vivo. Ainsi, ces souris présentent une réduction du pool de réserve de vésicules synaptiques



dans l’hippocampe, ainsi que des anormalités électrophysiologiques, suggérant que l’alpha-

synucléine pourrait réguler le degré de libération de neurotransmetteur en contrôlant le stock

de vésicules (Cabin et al., 2002). L’analyse de la densité du DAT par immuno-fluorescence

et autoradiographie a montré une densité normale du transporteur au niveau du striatum de

souris α syn KO. De même, aucun changement des paramètres fonctionnels du DAT n’a été

détecté par capture de [3H]-dopamine sur des cultures primaires de neurones

dopaminergiques ni sur synaptosomes striataux issus de souris α syn KO (Vmax et Km

similaires entre les deux génotypes ; Dauer et al., 2002; Schluter et al., 2003). Il a été

suggéré que la ß-synucléine, très souvent co-localisée avec l’isoforme α, pourrait compenser

l’absence de celle-ci (Kahle et al., 2000).

Chez les souris DAT KO, aucune différence de densité des ARNm et de la protéine

synucléine 1 n’a été mise en évidence au niveau des régions dopaminergiques (substance

noire et striatum). L’ensemble des données sur les souris invalidées pour la synucléine 1 et

le DAT suggère que l’interaction DAT-synucléine 1 n’est pas essentielle pour l’expression et

la fonction de chacun des deux partenaires.


CONCLUSION

Partie 1 - Conclusion


A/ Etude de l’interaction DAT-partenaire

Nous avons rencontré des difficultés techniques avec l’approche du double-hybride

en levure que nous n’avons pas toutes résolues : ainsi, je n’ai pas retrouvé l’interaction DAT-

ACIII, proie identifiée lors du crible initial réalisé par la société Hybrigenics et DAT-synucléine

1, interaction publiée dans la littérature. En revanche, l’interaction DAT-Sh2bp1, identifiée

lors du premier crible, a été retrouvée lors de mes expériences de double-hybride. Dans tous

les cas, il me paraît nécessaire de recourir à d’autres méthodes permettant de vérifier une

interaction directe entre deux protéines. Deux techniques sont couramment utilisées : le

« GST pull down » et la co-immunoprécipitation.

Dans la première, l’extrémité C-terminale du DAT est fusionnée (par son extrémité N-

terminale) à une protéine glutathion-S-transferase (GST) et accrochée sur une colonne

d’affinité de billes glutathion agarose, permettant de retenir le complexe DAT-partenaire, à

partir d’homogénats de striata de souris sauvages et DAT KO, ces dernières servant de

témoin négatif. Après élution par compétition avec du glutathion libre, la présence d’une

protéine partenaire est détectée par western-blot. Lorsque l’on ne possède pas d’anticorps

spécifiques des protéines partenaires, on exprime la protéine d’intérêt en fusion avec la GST

et on élue le DAT, que l’on détecte par western-blot. La construction de ces vecteurs est en

cours au laboratoire.

Dans la seconde technique, un anticorps dirigé contre la partie N-terminale du DAT

(disponible au laboratoire) permettra d’immuno-précipiter le complexe DAT-partenaire, dont

la nature sera révélée après élution par western-blot à l’aide d’anticorps spécifique de

chaque protéine. Lorsque l’anticorps n’est pas disponible, il est nécessaire d’étiqueter la

protéine à l’aide d’épitopes myc ou 6-His, et d’utiliser une résine d’affinité de cet épitope,

permettant donc l’élution du DAT.

N’ayant pas retrouvé l’interaction DAT-synucléine dans deux systèmes de levure

différents, nous pouvons émettre des réserves quant à la robustesse de cette interaction

directe. L’interaction DAT-alpha-synucléine n’a été montrée qu’une seule fois par double-

hybride (Lee et al., 2001a), à l’aide d’un kit utilisant le système GAL4 (Clontech). Les auteurs

ont co-transformé les levures, cette méthode étant plus sensible que la conjugaison de

levures de signes sexuels opposés. De plus, ils n’ont utilisé que le test β-gal pour démontrer

leur interaction. Il y avait donc un risque de faux-positif. L’interaction a été vérifiée par co-

immunoprécipitation à partir de cellules transfectées ou d’extraits de striatum (Lee et al.,



1996; Wersinger and Sidhu, 2003), mais, selon les conditions expérimentales, cette

technique peut co-immunoprécipiter des complexes multi-protéiques. Nous pouvons émettre

l’hypothèse que l’interaction DAT-synucléine nécessite la présence d’une protéine

adaptatrice, présente dans les cellules et les extraits striataux, qui rapproche la synucléine

du DAT sans qu’il y ait interaction physique entre les deux protéines.

La fonction endogène de Sh2bp1 n’a pas été démontrée à ce jour, mais il est

possible que cette protéine intervienne dans ce type d’interaction, grâce à ses domaines

TPR et SH2, connus pour médier des interactions entre protéines. Des protéines à domaines

TPR jouent le rôle de co-chaperonnes, liant des protéines chaperonnes telles que hsp70, qui

permettent le repliement, l’assemblage ou le désassemblage de complexes protéiques ou le

transport de protéines vers des organelles (Liu et al., 1999). D’autres sont impliquées dans la

libération de neurotransmetteurs, comme la rapsyne qui contient 8 domaines TPR et joue un

rôle essentiel dans l’agrégation des récepteurs nicotiniques à la jonction neuromusculaire

(Ponting and Phillips, 1996).

L’interaction DAT-Sh2bp1 ayant été confirmée par notre protocole de double hybride,

nous nous sommes aussitôt intéressés à déterminer le domaine d’interaction du DAT avec

ce partenaire. Par des expériences de troncations croissantes de l’extrémité C-terminale du

DAT et des expériences de mutagenèse dirigée réalisées et testées en double-hybride au

laboratoire, Patrick Slama a pu identifier un triple mutant du DAT (YKF577AAS) ayant perdu

sa capacité d’interaction avec Sh2bp1 (Slama et al., en préparation). Plusieurs constructions

portant une seule mutation, visant notamment les résidus conservés entre DAT et NET, ont

été fabriquées et vont être testées en double-hybride.

B/ Etude du rôle fonctionnel de l’interaction DAT-partenaire

J’ai rencontré des problèmes de reproductibilité lors des expériences de capture de

[3H]-dopamine sur cellules HEK293 co-exprimant le DAT et la protéine d’intérêt, qui ne m’ont

pas permis de conclure quant à l’effet des protéines synucléine 1 et Sh2bp1 sur l’activité

fonctionnelle du DAT. Ceci pourrait provenir d’un problème de protocole, concernant le mode

de transfection transitoire utilisé. Il sera donc nécessaire de mettre au point les

manipulations de transport en utilisant la technique de transfection par puits (in situ). Il me

paraît également important d’effectuer ces manipulations sur protéine entière, puisque



jusqu’à présent nous avons travaillé sur la séquence interactante des protéines ACIII et

Sh2bp1 ressortie en double-hybride. Ainsi, il manque plusieurs domaines TPR et le domaine

SH2 de la protéine Sh2bp1, qui jouent très probablement un rôle important dans la régulation

de l’interaction DAT-Sh2bp1. Comme contrôle négatif, nous pourrons utiliser les mutants du

DAT identifiés en double-hybride, tel que le mutant DAT YKF577AAS pour l’interaction DAT-

Sh2bp1. Enfin, en vue de se rapprocher des conditions physiologiques, nous envisageons

d’effectuer ces expériences sur des cultures primaires de neurones mésencéphaliques.

De manière intéressante, Patrick Slama a construit au laboratoire des mutants de

l’extrémité C-terminale du DAT et a démontré que Sh2bp1 interagissait avec la partie

centrale de l’extrémité du transporteur, contenant la séquence FREKLAYAIA (Slama et al.,

en préparation). L’ablation de ce motif abolit l’interaction DAT-Sh2bp1. Récemment, l’équipe

de Melikian (Holton et al., 2005) a montré que cette séquence, spécifique des transporteurs

dépendant de Na/Cl, était nécessaire et suffisante à l’internalisation constitutive des

transporteurs DAT et NET. Le mécanisme et la régulation de ce processus ne sont pas

encore connus, mais pourraient mettre en jeu une ou plusieurs protéines adaptatrices,

comme Sh2bp1. D’après nos résultats préliminaires, la présence de Sh2bp1 a tendance à

augmenter la capacité de transport maximale du DAT. Ceci est souvent corrélé à une

augmentation des molécules du transporteur à la membrane, donc à une internalisation

moins forte. On peut donc émettre l’hypothèse que Sh2bp1, se liant au DAT via la séquence

FREKLAYAIA, empêcherait une endocytose constitutive. Ceci aurait pour conséquence une

plus forte densité de transporteurs membranaires et donc une plus grande activité de

transport.

C/ Etude de l’expression de la synucléine 1 chez les souris DAT KO

Par des expériences d’hybridation in situ des ARNm et d’immuno-autoradiographie

de la protéine synucléine 1, j’ai montré que la délétion constitutive du DAT n’entraînait pas

de modification d’expression et de densité de la synucléine 1 au niveau des régions à corps

cellulaires et terminaisons dopaminergiques. Ces données devront être complétées par des

quantifications de la synucléine 1 par western-blot dans différentes structures cérébrales et

par des expériences d’immuno-fluorescence, permettant de localiser précisément la protéine

au niveau neuronal. Toutefois, il paraît peu probable que l’expression de la synucléine 1 soit



altérée chez les souris DAT KO. Les résultats présentés ici sont en accord avec ceux décrits

dans la littérature concernant les souris dépourvues de synucléine 1, chez lesquelles

l’expression et l’activité du DAT n’est pas modifiée.


PARTIE 2


INTRODUCTION



A/ La schizophrénie

1/ Définition et évolution

• Définition de la maladie

Identifiée en 1904 par Kraeplin puis caractérisée en 1911 par Bleuler, la

schizophrénie est une maladie psychiatrique qui se manifeste par trois catégories de

symptômes cliniques : 1/ des symptômes productifs regroupant pensées délirantes

(convictions erronées), hallucinations (perceptions sensorielles sans objets) et une

désorganisation de la pensée et du discours; 2/ des symptômes déficitaires se traduisant par

un comportement catatonique, une perte de volonté, un émoussement affectif et un retrait

social et 3/ des déficits cognitifs touchant l’attention, la capacité d’abstraction, les fonctions

exécutives et certaines formes de mémoire, notamment la mémoire de travail. L’absence de

marqueurs biologiques implique que le diagnostic de cette pathologie est établi cliniquement,

sur un ensemble de critères basés sur des observations du comportement du sujet et sur le

rapport d'expériences "anormales". Ainsi, les symptômes ne doivent pas être liés à une autre

maladie (dépression ou prise de drogues) et doivent affecter le fonctionnement personnel et

social. Ces symptômes peuvent se succéder dans le temps ou co-exister simultanément.

Cette maladie touche actuellement 1% de la population mondiale, sans préférence

concernant les pays, cultures et sexes, bien que les symptômes apparaissent plus

précocement chez les hommes (18-25 ans) que chez les femmes (25-35 ans).

• Evolution de la maladie

Selon les individus, la progression de la schizophrénie apparaît très variable dans

son évolution et son issue. Le premier épisode de la maladie est souvent précédé d’une

phase prodromale (figure 26), caractérisée, entre autres, par des symptômes productifs

atténués (illusions, superstition, pensées magiques), des troubles de l’humeur (anxiété,

irritabilité), des symptômes cognitifs (difficultés de concentration, distraction) et un retrait

social (Lewis and Lieberman, 2000; Frankle et al., 2003). Cependant, ces comportements

sont aussi fréquemment retrouvés chez des adolescents sains qui ne développeront pas la

maladie ; ces critères ne peuvent donc pas servir de diagnostic. Ensuite, des épisodes

d’exacerbation de la maladie, caractérisés par l’émergence ou l’aggravation de pensées

désorganisées et de symptômes psychotiques, alternent avec des périodes de rémission,



pendant lesquelles les symptômes sont moins apparents. Contrairement aux symptômes

productifs, les symptômes déficitaires tendent à être stables au cours du temps et, si la

schizophrénie est traitée de façon correcte et suffisamment tôt, certains patients peuvent

espérer une réduction, voire une rémission de leurs troubles psychotiques après un premier

épisode. D’autres patients ne répondent pas aussi bien au traitement et, dans ce cas, une

détérioration clinique est généralement observée d’épisode en épisode. La maladie est plus

active pendant la deuxième et troisième décennie de vie et tend à se stabiliser après dans

un état résiduel.

Figure 26 : Evolution clinique et pathophysiologique de la schizophrénie.

Les différentes étapes de la maladie décrivent les phases pré-morbides et morbides. La sévérité des symptômes, représentée en ordonnée, est inversement proportionnelle à l’axe des y. Les mécanismes pathogénique et pathophysiologique hypothétiques sont indiqués en dessous de l’axe des abscisses. D’après Frankle et al., 2003.

2/ Etiologie : deux composantes

La schizophrénie apparaît comme une maladie polygénique, associée à des facteurs

de vulnérabilité environnementaux et développementaux.



a/ Aspects génétiques

La vulnérabilité à la schizophrénie est reliée à des facteurs génétiques (Tsuang,

2000). Des études d’agrégation familiale ont montré que le risque de développer la maladie

passait de 1 à 6-17% chez des apparentés de premier degré (parents, enfants ou fratrie) de

schizophrènes. Parmi les jumeaux, l’incidence de la maladie est de 17% chez les jumeaux

dizygotes (du même ordre que les apparentés de 1er degré) et atteint presque 50% chez les

jumeaux monozygotes (Gottesman, 1994). Enfin, des études d’adoption ont révélé que le

risque de schizophrénie était lié à la présence de la maladie chez les parents biologiques et

non chez les parents adoptifs.

De nombreuses études de liaison ont été entreprises afin d’associer dans des

familles informatives différents marqueurs de régions chromosomiques (satellites ou gènes

candidats) avec la maladie. De fait, diverses régions de chromosomes ont été proposées

comme sites potentiels de vulnérabilité, comme la région 22q11 (pour revue, voir

Karayiorgou and Gogos, 2004). Il est admis que la prédisposition à la schizophrénie soit la

résultante de mutations de plusieurs gènes ayant chacun des effets modestes. Citons les

gènes COMT (catéchol-O-méthyltranférase), dysbindine 1, neuréguline 1, calcineurine,

RGS4 (regulator of G-protein signalling 4) et DISC1 (disrupted in schizophrenia 1) qui

constituent quelques uns des gènes de susceptibilité pour la schizophrénie (pour revue, voir

Harrison and Weinberger, 2005; Norton et al., 2006).

Un autre axe d’étude est la recherche d’endophénotypes, traits infracliniques,

marqueurs de la vulnérabilité génétique à la maladie chez les apparentés non atteints.

Les endophénotypes peuvent être des mesures biochimiques, endocriniennes,

neurophysiologiques, neuroanatomiques, cognitives ou neuropsychologiques. Un

endophénotype doit répondre aux critères suivants : il doit être présent avant

le début de la maladie et doit être héritable. En outre, les sujets atteints et

non atteints d'une même famille doivent partager ces caractéristiques

endophénotypiques plus souvent que des témoins apparentés entre eux, et plus

souvent que des apparentés non atteints ne les partagent avec des témoins. Ainsi, on

retrouve fréquemment chez les schizophrènes et leurs apparentés des déficits neurologiques

(absence d’inhibition du réflexe de sursaut (pre-pulse inhibition ou PPI), défaut d’amplitude

des ondes p50, p300,...) et anomalies anatomiques (augmentation de la taille des ventricules

cérébraux, asymétrie cérébrale,…)

Une piste supplémentaire consiste à analyser les symptômes communs à diverses

maladies psychiatriques (déficits cognitifs, hallucinations,...) afin de tenter d’établir une

origine commune.



En conclusion, on estime que la composante génétique interviendrait de façon

majoritaire dans l’étiologie de la schizophrénie (Cannon et al., 2000).

b/ Aspects environnementaux

Chez les jumeaux monozygotes, possédant un génome identique, le risque d’être

schizophrène est bien inférieur à 100%, ce qui signifie que l’origine de la schizophrénie n’est

pas entièrement génétique et qu’interviennent des facteurs extérieurs et non liés au

patrimoine génétique de l’individu. La plupart surviennent au cours de la grossesse, en

période pré- ou péri-natale, affectant le processus de développement neuronal. Il peut s’agir

d’exposition à des agents infectieux, toxiques, une maladie auto-immune ou bien des

traumatismes ou des situations stressantes (McDonald and Murray, 2000). Par exemple,

l’infection par le virus de la grippe (Influenza) au milieu de la grossesse semble être un

facteur de risque, qui pourrait expliquer l’augmentation du nombre de naissances des

schizophrènes en hiver ou au printemps.

3/ Etiologie : les différentes hypothèses

a/ L’hypothèse dopaminergique

La dopamine est considérée depuis longtemps comme jouant un rôle crucial dans la

schizophrénie. La première hypothèse avancée est que les symptômes productifs résultent

d’une hyperactivité dopaminergique des régions sous-corticales. Cette théorie provient de

l’observation que des agonistes dopaminergiques, directs et indirects, comme l’amphétamine

ou la cocaïne, sont capables de provoquer des réactions psychotiques chez des sujets sains

et d’exacerber, à faibles doses, certains symptômes chez les schizophrènes. D’autre part, il

existe une corrélation positive entre l’effet clinique des antipsychotiques et leur affinité à

bloquer les récepteurs dopaminergiques D2 (Seeman, 1977; Carlsson, 1988).

La plupart des résultats qui étayent cette hypothèse ont été obtenus par des

techniques d’imagerie, SPECT (tomographie d’émission mono-photonique) et TEP

(tomographie par émission de positons), mesurant la liaison d’un traceur radioactif,

spécifique d’un sous-type de récepteur dopaminergique donné (voir Abi-Dargham, 2004).

Plusieurs études ont démontré une augmentation de l’accumulation de DOPA, précurseur de

la dopamine, dans le striatum de patients schizophrènes, qui serait encore plus forte chez

des patients psychotiques (Reith et al., 1994; Lindstrom et al., 1999). Ceci serait compatible



avec une activité de synthèse de dopamine accrue chez ces derniers. De même, une

augmentation de la libération de dopamine après administration aiguë d’amphétamine a été

montrée chez les schizophrènes, comparés aux sujets sains (Abi-Dargham et al., 1998;

Laruelle et al., 1999). Ainsi, chez les patients schizophrènes le déplacement de liaison du

[123-I]-IBZM (spécifique des récepteurs D2) induit par l’amphétamine est 2,5 fois plus élevé

que chez les contrôles. Ce résultat est corrélé avec une probabilité accrue (40%) chez ces

patients de développer des symptômes productifs, contre 0% chez les sujets sains (Laruelle

et al., 1999).

Etant donnée l’implication des récepteurs D2 dans le traitement de la maladie, de

nombreuses études ont déterminé la densité de ces récepteurs. Une augmentation des

récepteurs striataux a été trouvée et reproduite sur des cerveaux post-mortem de

schizophrènes (Zakzanis and Hansen, 1998). Cependant, ces patients ayant été traités par

des antipsychotiques, il ne peut être exclu que la hausse de récepteurs D2 observée ne soit

pas due au traitement lui-même. Afin d’effectuer cette mesure chez des patients non traités,

divers ligands spécifiques du récepteur D2 ont été utilisés en imagerie in vivo. Les études

réalisées avec le [11C]-méthylspipérone ont conclu à une augmentation des sites tandis que

celles menées avec le [11C]-raclopride n’ont pas révélé de variation significative. Cette

différence serait due aux propriétés intrinsèques des ligands (voir Seeman and Kapur, 2000).

Le méthylspipérone ne se lie qu’aux récepteurs D2 monomériques, forme supposée

prépondérante chez les schizophrènes, tandis que le raclopride reconnaît également les

récepteurs oligomériques. Ainsi, chez les patients contrôles, qui possèdent des récepteurs

D2 monomériques et oligomériques, la liaison au [11C]-méthylspipérone serait sous-estimée,

ce qui conduirait à une apparente augmentation des sites chez les schizophrènes. Une solution à ce problème est de mesurer l’occupation basale des récepteurs D2

par SPECT, en comparant la liaison d’un ligand D2 avant et après déplétion de dopamine

par l’α-méthyl-para-tyrosine (Abi-Dargham et al., 2000). Ce composé inhibe la synthèse de

dopamine, déplétant la synapse en dopamine et laissant plus de récepteurs accessibles au

traceur. La différence entre les deux images reflète la proportion de récepteurs occupés à

l’état de base. Il en résulte que les schizophrènes ont un taux d’occupation basal des

récepteurs D2 significativement supérieur à celui des contrôles. D’autre part, on retrouve une

meilleure efficacité d’un traitement aux antipsychotiques chez les schizophrènes ayant un

niveau synaptique de dopamine plus élevé comparés aux schizophrènes ayant un niveau de

dopamine plus bas. Ceci est en faveur de la notion selon laquelle l’hyperstimulation des

récepteurs D2 est en grande partie responsable des psychoses des schizophrènes. Ainsi, il



est peu probable qu’il y ait une augmentation de la densité des recepteurs D2 mais plutot

une plus grande occupation de ces récepteurs par la dopamine chez les schizophrènes.

Quant aux récepteurs D1, une seule équipe a montré une augmentation significative

de leur densité au niveau du cortex préfrontal (Abi-Dargham et al., 2002).

Une hypothèse complémentaire serait qu’une hypodopaminergie préfrontale serait

responsable des déficits de mémoire de travail, associée au cortex préfrontal (Davis et al.,

1991). Cette notion découle de travaux d’imagerie cérébrale décrivant une activité

métabolique réduite au niveau de cette région lors d’une activation cognitive (Andreasen et

al., 1992; Volz et al., 1999). Cependant, ce résultat n’a pas toujours été confirmé et semble

dépendre des tâches cognitives effectuées (pour revue et références, voir Wong and Van

Tol, 2003).

b/ L’hypothèse glutamatergique

La deuxième hypothèse émise quant à la pathophysiologie de la schizophrénie

concerne le glutamate : une transmission glutamatergique réduite serait à l’origine des

symptômes productifs et déficitaires de la maladie (Olney and Farber, 1995; Jentsch and

Roth, 1999). La transmission glutamatergique représente le système excitateur majeur du

cerveau, contrôlant de nombreuses fonctions physiologiques. Ce neurotransmetteur agit sur

trois types de récepteurs ionotropiques (NMDA, AMPA, kainate) et sur des récepteurs

métabotropiques (mGluR). Cette hypothèse est basée sur la capacité d’antagonistes des

récepteurs NMDA (phencyclidine, kétamine) à provoquer, chez des sujets sains, des

symptômes productifs, déficitaires ainsi que des altérations des capacités cognitives (Coyle,

1996). De plus, ces substances exacerbent les symptômes des patients schizophrènes et un

traitement complémentaire avec des agonistes des récepteurs NMDA (glycine, sérine)

améliore les symptômes de la maladie (Tsai et al., 1998; Javitt et al., 2005).

Dès lors, beaucoup d’études ont été entreprises sur des cerveaux post-mortem

puisqu’une difficulté majeure est qu’il n’existe pas à l’heure actuelle de radioligand spécifique

des composants glutamatergiques, limitant ainsi les études in vivo de neuro-imagerie. La

quantité des récepteurs AMPA, NMDA et des transcrits de leurs différentes sous-unités a été

analysée chez des cerveaux de schizophrènes, mais les résultats de différentes équipes ne

sont pas concordants (voir Ohnuma et al., 2005). Ohnuma et collaborateurs proposent que

ce manque de reproductibilité soit dû à des changements fonctionnels de faible amplitude

qui ne pourraient pas être détectés de manière robuste par l’étude d’un seul marqueur. Ce

groupe a quantifié les transcrits des sous-unités mGLuR3 et mGluR5 ainsi que ceux du



transporteur glutamatergique astrocytaire EAAT2 au niveau du cortex préfrontal de sujets

schizophrènes et n’ont noté aucune différence significative de densité comparés aux sujets

témoins. En revanche, les rapports des transcrits de chaque sous-unité par rapport au

récepteur apparaissent significativement différents, suggérant que ce mode de comparaison

pourrait être utile pour détecter des variations minimales.

Récemment, un nouveau concept est né, réunissant les deux hypothèses précitées

en reliant les systèmes dopaminergique et glutamatergique (voir Laruelle et al., 2005). Ainsi,

une injection d’antagoniste NMDA ne modifie pas l’activité dopaminergique de patients

contrôles. En revanche, le blocage des récepteurs NMDA chez des sujets sains ayant reçu

de l’amphétamine provoque un excès de libération de dopamine, dont l’amplitude est

comparable à la réponse des schizophrènes à une injection d’amphétamine seule. Ces

données suggèrent qu’un déficit de la transmission glutamatergique serait impliqué dans les

altérations de la régulation dopaminergique observées chez les schizophrènes.

Réciproquement, la dopamine a des effets modulateurs sur la transmission

glutamatergique. Les afférences corticales glutamatergiques et les projections

dopaminergiques convergent sur les neurones inhibiteurs GABA de type « medium spiny »

du striatum (figure 27). La stimulation des récepteurs D2 inhibe la libération de glutamate et

réduit l’excitabilité des neurones GABA.

Figure 27 : Modulations opposées de la transmission glutamatergique NMDA par les récepteurs dopaminergiques D1 et D2 sur les neurones GABA « medium spiny » du striatum.

D’après Laruelle et al., 2005.



Au contraire, la stimulation des récepteurs D1 favorise la transmission NMDA et

l’excitabilité des neurones GABA (West and Grace, 2002). Ainsi, une stimulation excessive

des récepteurs D2 dans la schizophrénie inhiberait une transmission corticale et limbique via

les récepteurs NMDA déjà déficiente. En bloquant les récepteurs D2, les antipsychotiques

restaureraient la transmission glutamatergique striatale (Laruelle et al., 2005).

c/ La théorie neuro-développementale

Comme mentionné plus haut, plusieurs études suggèrent que le développement

anormal du cerveau pendant la période pré- ou post-natale soit un des facteurs de risque

pour la manifestation de la pathologie chez les jeunes adultes. Plus précisément, l’hypothèse

neuro-développementale propose qu’un évènement adverse in utero altère le

développement normal du cerveau, engendrant une vulnérabilité cérébrale, qui

prédisposerait un individu à risque génétique à développer la maladie au cours de sa vie

(figure 28).

Prédisposition génétique

Anomalies neuro-développementales

Figure 28 : Etapes de l’hypothèse neuro-développementale conduisant à la schizophrénie.

Adapté de Tsuang, 2000.

• Facteurs de risques

Les sujets ayant souffert de complications obstétriques ont deux fois plus de risques

de développer la schizophrénie que des sujets n’ayant pas subi de complications (pour revue

et références, voir Rehn and Rees, 2005). De plus, la précocité de la première manifestation

de la maladie est hautement associée aux complications obstétriques. Une petite

circonférence crânienne à la naissance est associée à une plus grande incidence de

Facteurs environnementaux précoces (complications obstétriques, infection virale,…)

Facteurs environnementaux tardifs (maturation cérébrale, synaptogenèse,..)

Dysfonctions cérébrales et schizophrénie



schizophrénie. Il en est de même pour des infections virales maternelles survenant au cours

des premier et deuxième trimestres de gestation, ainsi qu’une malnutrition maternelle.

• Anomalies morphologiques

Des études d’imagerie ou des analyses de cerveaux post-mortem ont permis de

décrire quelques anomalies morphologiques (pour revue, voir Harrison, 1999). Ainsi, une

dilatation des ventricules latéraux et du troisième ventricule a été observée de manière

robuste chez les schizophrènes (McCarley et al., 1999). Une perte de tissu cérébral au

niveau du cortex et de structures associées a également été trouvée : ceci concernerait

certains cortex associatifs, dont ceux du lobe temporal, le cortex préfrontal dorsal et des

aires limbiques telles que l’hippocampe et le cortex cingulaire antérieur (Goldstein et al.,

1999; McCarley et al., 1999). Au niveau de l’hippocampe et du cortex préfrontal dorsal, ces

diminutions ne proviendraient pas d’une réduction du nombre total de neurones, mais plutôt

d’une réduction de la taille des corps cellulaires ou du nombre de terminaisons, de dendrites

et d’épines dendritiques. Beaucoup de ces anomalies ont été montrées chez des sujets non

traités, lors de leur premier épisode de schizophrénie (apparition des symptômes

précédemment cités), suggérant que ces anomalies pourraient refléter le processus primaire

de la maladie et ne sont pas secondaires à la pathologie ou au traitement. D’autre part, une

étude d’imagerie a montré qu’il n’y avait pas de progression de la baisse de volume de

l’hippocampe chez des schizophrènes au cours d’un suivi de deux ans, suggérant que ces

altérations, analysées lors du premier épisode de la pathologie, sont stables au cours du

temps et pourraient résulter d’un développement anormal pendant la grossesse ou l’enfance

(Wood et al., 2001). En outre, la majorité des études n’a pas décelé d‘astrogliose, signe de

neurodégénerescence, suggérant qu’il n’y aurait pas de processus neurodégénératif en

cause dans la schizophrénie.

d/ Une maladie de la synapse ?

Les anomalies morphologiques, particulièrement au niveau du cortex préfrontal

(réduction du volume de matière grise, augmentation de la densité de cellules sans

changement du nombre total de neurones), contribuent probablement aux déficits cognitifs

caractérisant la schizophrénie. Les données laissent à penser qu’il pourrait y avoir une

diminution du nombre des terminaisons axonales, des dendrites distales et de leur principale

cible synaptique, les épines dendritiques (Selemon and Goldman-Rakic, 1999). Une

diminution de la densité d’épines dendritiques a en effet été trouvée au niveau du cortex

préfrontal de schizophrènes (Glantz and Lewis, 2000) ainsi qu’une baisse de la



synaptophysine, protéine présynaptique (Karson et al., 1999). D’autre part, l’âge de début

typique de la maladie coïncide avec la période de fin de réduction de la densité des

synapses (« synaptic pruning ») et des épines dendritiques au niveau du cortex préfrontal du

primate (Bourgeois et al., 1994). En outre, des gènes codant pour des protéines

responsables du processus de myélinisation ou associées au cytosquelette ont également

été mis en cause dans la schizophrénie (Cotter et al., 1997; Davis et al., 2003). La reeline,

qui régule la migration neuronale pendant la phase embryonnaire et module l’activité des

récepteurs NMDA, est diminuée de 50% dans le cortex des schizophrènes (Guidotti et al.,

2000; Chen et al., 2005b).

Récemment, la technologie des puces à ADN a permis d’étudier les changements

d’expression de gènes à grande échelle, très utile pour l’analyse des maladies complexes

telles que les maladies psychiatriques. Ainsi, Mirnics et collaborateurs (2000) ont trouvé une

diminution reproductible d’expression des transcrits codant pour des protéines régulant la

fonction présynaptique, notamment les mécanismes de libération du neurotransmetteur. Bien

que les gènes les plus affectés varient selon les individus schizophrènes, soulignant

l’hétérogénéité moléculaire de la maladie, cette étude a identifié un gène dont l’expression

était presque systématiquement réduite chez le groupe de patients étudié, par rapport au

groupe contrôle. Cette observation a également été confirmée par hybridation in situ sur

d’autres sujets. Il s’agit du gène RGS4 (regulator of G protein signaling 4) qui a pour fonction

de restreindre la durée de la réponse post-synaptique après libération du neurotransmetteur

et son action sur ses récepteurs métabotropiques, glutamatergiques, sérotoninergique (5-

HT2) et dopaminergique (D2) (Mirnics et al., 2001). De façon intéressante, RGS4 est localisé

sur la région chromosomique 1q21-22, identifiée comme étant un locus significatif de

susceptibilité à la schizophrénie (Brzustowicz et al., 2000). Une diminution d’expression a

également été notée pour les gènes NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor), synapsine II

(SYN2) et ATPase (Mirnics et al., 2000). Physiologiquement, une expression moindre de

gènes présynaptiques provoquerait une diminution de la libération de neurotransmetteur par

les vésicules synaptiques des terminaisons neuronales, qui ne serait pas forcément

significative dans des conditions de faible activité synaptique mais qui pourrait avoir des

conséquences fonctionnelles lorsqu’une activité plus soutenue est requise. Ainsi, ceci

pourrait expliquer que les sujets atteints de schizophrénie montrent une moindre activation

du cortex préfrontal pendant les tâches qui nécessitent une activité soutenue, comme celles

impliquant la mémoire de travail. D’autres travaux sont nécessaires pour valider les résultats

de cette première grande étude. Notons que d’autres expériences utilisant des puces à ADN



ont identifié différents gènes dérégulés, impliqués dans des fonctions autres que synaptiques

(voir Konradi, 2005).

4/ Le traitement de la schizophrénie

Bien que l’étiologie et la pathophysiologie de la schizophrénie ne soient pas encore

élucidées, l’efficacité des traitements pharmacologiques a clairement été démontrée depuis

une cinquantaine d’années. Les différents types de neuroleptiques utilisés ont en commun la

propriété de réduire la transmission dopaminergique en bloquant efficacement le récepteur

dopaminergique D2. Les traitements pharmacologiques actuels montrent cependant une

efficacité parfois limitée et sont souvent associés à des effets secondaires indésirables:

tremblements et dyskinésies (syndromes extra-pyramidaux), dus au blocage du récepteur

D2 au niveau de la voie nigro-striée ; aggravation de symptômes négatifs et troubles

cognitifs dus au blocage de la voie méso-corticale ; stimulation de la production de

prolactine, par blocage des récepteurs du système hypothalamo-hypophysaire. Toutefois,

ces molécules permettent de réduire considérablement les symptômes psychotiques et de

limiter leur récurrence, grâce au blocage du récepteur D2 au niveau de la voie méso-

limbique.

Depuis une quinzaine d’années, une nouvelle classe d’antipsychotiques, dits

« atypiques » est apparue sur le marché. Certaines de ces molécules (clozapine,

rispéridone, olanzapine,…) sont moins spécifiques du récepteur D2 que les neuroleptiques

conventionnels (halopéridol) et ciblent également les récepteurs sérotoninergiques (5HT-1,

5HT-2) ou ont une affinité pour une combinaison de récepteurs multiples et de transporteurs

plasmiques, incluant les récepteurs dopaminergiques, noradrénergiques, muscariniques,

histaminergiques, le DAT, le NET... Ces molécules présentent l’avantage d’engendrer peu

ou pas d’effets extrapyramidaux. Toutefois, certaines d’entre elles présentent le gros

désavantage d’induire des désordres endocriniens, tels que surpoids et diabète.

Ajoutons qu’une thérapie cognitive peut complémenter de façon bénéfique le

traitement pharmacologique des patients schizophrènes (Kane, 1996).

5/ Les modèles animaux pour la schizophrénie

Bien que les modèles animaux puissent seulement approcher la complexité clinique

du phénotype de la schizophrénie, ils représentent un outil essentiel pour comprendre les

mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la pathogenèse et la



pathophysiologie de la maladie. Selon Lipska (2004), plusieurs critères comportementaux

sont requis chez le rongeur pour valider la pertinence d’un modèle animal pour la

schizophrénie, dont :

1/ des changements cellulaires, moléculaires et morphologiques du cerveau

2/ une réponse accrue au stress, aux antagonistes NMDA et aux agonistes

dopaminergiques

3/ un déficit de filtrage sensori-moteur (PPI) et d’inhibition latente

4/ une altération de la mémoire de travail

5/ une vulnérabilité aux drogues addictives

6/ un déficit dans le comportement social

7/ une amélioration des déficits par des neuroleptiques

a/ Modèles pharmacologiques

Plusieurs modèles animaux ont été réalisés afin d’étudier la pertinence des

hypothèses classiques dopaminergique et glutamatergique. Ainsi, les rongeurs traités par les

amphétamines montrent une hyperactivité et des stéréotypies, mimant les symptômes

psychotiques des schizophrènes. Ils montrent également un déficit du PPI et d’inhibition

latente, c’est-à-dire une moindre performance dans une tâche d’apprentissage impliquant un

stimulus non renforçant pré-exposé (Segal et al., 1981; Swerdlow and Geyer, 1998). Ces

comportements peuvent être améliorés par l’administration de neuroleptiques conventionnels

et atypiques. Cependant, ce modèle ne reproduit pas la symptomatologie déficitaire de la

schizophrénie.

Les animaux recevant des antagonistes des récepteurs NMDA (PCP, kétamine, MK-

801, mémantine) montrent une locomotion et des stéréotypies accrues, des déficits

d’interaction sociale ainsi que des déficits de PPI et une altération des fonctions cognitives

(Sams-Dodd, 1998; Krystal et al., 1999), suggérant que ce modèle est plus pertinent que le

précédent. On peut noter que, dans ce modèle, les antipsychotiques atypiques se révèlent

plus efficaces que les neuroleptiques typiques.

b/ Modèles neuro-développementaux

De nombreux modèles animaux ont été développés afin d’étayer l’hypothèse neuro-

développementale (Rehn and Rees, 2005; Robertson et al., 2006). Citons notamment les

modèles de complications obstétriques (privation nutritionnelle ou stress durant la gestation,

hypoxie/ ischémie pendant la mise bas) provoquant des dommages structurels au niveau du

cerveau et des déficits comportementaux, limités cependant aux symptômes productifs;



l’altération de la prolifération cellulaire par méthylation des acides nucléiques, engendrant

des anomalies structurelles et l’insuffisance placentaire chronique, également à l’origine de

défauts structurels et comportementaux.

L’hypothèse de l’infection virale a également été testée: l’inoculation de rattes

gestantes par le cytomégalovirus, l’Herpes simplex ou l’Influenza conduit à un déficit du PPI,

un retrait social et des altérations de la morphologie temporo-limbique. Des études récentes

suggèrent que ces altérations seraient probablement le résultat de la réponse immunitaire

maternelle à l’infection plutôt que dues au virus lui-même. Ainsi, Zuckerman et collaborateurs

(2003) ont démontré que des rattes gestantes, injectées avec un ARN double brin

synthétique mimant l’exposition virale, donnaient naissance à des petits, apparemment

normaux à la naissance et pendant l’adolescence, mais qui développaient des troubles

comportementaux à l’âge adulte. Ces animaux montrent notamment des déficits du PPI, une

sensibilité accrue à l’amphétamine et au MK-801 et une altération de l’inhibition latente

(Zuckerman and Weiner, 2005). Beaucoup de comportements sont améliorés par un

traitement aux antipsychotiques, en accord avec les critères validant un modèle animal pour

la schizophrénie. Il semblerait donc qu’une accumulation de cytokines inflammatoires, à la

suite d’une infection virale au cours du développement du cerveau, augmente le risque de

désordres neuro-développementaux, en altérant la survie et la connectivité des neurones

(Nawa et al., 2000).

Plusieurs équipes ont injecté une toxine anti-mitotique, le méthylazoxyméthanol

(MAM ; Talamini et al., 1998) à des rattes gestantes, entre les jours embryonnaires E09 et

E17 et ont étudié l’anatomie et le comportement de la progéniture. Selon le moment de

l’injection, les animaux présentent des défauts anatomiques et comportementaux plus ou

moins sévères. Chez les rats injectés de E09 à E12, le poids du cerveau est plus faible et le

volume du striatum et des cortex enthorinal et préfrontal sont plus ou moins réduits selon le

jour de l’injection (Jongen-Relo et al., 2004). Toutefois, les rats adultes ne semblent pas

présenter d’hyperactivité et de défaut de PPI ou d’inhibition latente (Jongen-Relo et al.,

2004). Les rats traités à E15 présentent de grosses anomalies anatomiques et un fort déficit

de mémoire spatiale, tandis que ceux injectés à E17, qui ont une migration cellulaire

anormale dans l’hippocampe et une désorganisation laminaire corticale, semblent avoir une

mémoire de travail altérée (Gourevitch et al., 2004). D’autres études s’avèrent nécessaires

pour valider ce modèle.

Citons enfin le modèle de lésion bilatérale de l’hippocampe ventral chez les rats

nouveaux nés (Lipska et al., 1993), qui a fait l’objet de nombreux travaux (voir Lipska, 2004).

Ce modèle est intéressant car l’hippocampe est une structure altérée chez les



schizophrènes, qui projette directement sur le cortex préfrontal, également atteint chez ces

sujets. Les jeunes rats lésés (jour postnatal 35) paraissent moins sociables que leurs

contrôles mais se comportent normalement dans des tests moteurs impliquant un stress et

des agonistes dopaminergiques. A l’adolescence et à l’âge adulte (jour postnatal 56), les

animaux lésés montrent des changements de comportements liés à une transmission

dopaminergique accrue (hyperlocomotion en réponse au stress et aux stimulants,

augmentation des stéréotypies). Ils présentent également une hypersensibilité aux

antagonistes glutamatergiques (MK-801, PCP), des déficits du PPI et d’inhibition latente, un

comportement social altéré et des problèmes de mémoire de travail. Certains de ces

comportements, excepté le retrait social, sont améliorés après traitement aux

neuroleptiques. Ce modèle paraît donc pertinent et répond aux principales exigences d’un

modèle animal pour la schizophrénie. Cependant, la sévérité de l’intervention, détruisant

totalement l’hippocampe ventral, contraste avec les changements neuropathologiques

modestes décrits sur les cerveaux post-mortem de patients schizophrènes. Un modèle

moins lourd d’inactivation transitoire de l’hippocampe ventral par injection de tétrodotoxine,

bloquant les canaux sodiques voltage-dépendants de façon réversible, a alors été développé

(Lipska et al., 2002). Les comportements des rats lésés sont similaires au modèle de lésion

permanente, avec toutefois une amplitude moindre et une absence d’altération du

comportement social.

c/ Modèles génétiques

Les études génétiques d’association et de liaison suggèrent que plusieurs régions

chromosomiques contiennent des gènes de susceptibilité à la schizophrénie, impliqués dans

la neurotransmission, le neuro-développement et la fonction synaptique. Des modèles

animaux invalidés pour différentes protéines impliquées dans ces processus ont donc été

générés (voir Robertson et al., 2006).

Selon l’hypothèse dopaminergique, plusieurs composants de ce système (récepteurs

D1-D5, COMT, MAO ; voir Gainetdinov et al., 2001a) ont ainsi été inactivés de façon

constitutive chez la souris. Par exemple, les souris invalidées pour le DAT (Giros et al., 1996;

voir partie I, Introduction, paragraphe 8) montrent une hyperlocomotion spontanée, des

stéréotypies et des déficits sensori-moteurs et cognitifs améliorés par des neuroleptiques.

Par contre, ces souris ne présentent pas d’altération de leur comportement social (comme le

modèle pharmacologique d’animaux traités à l’amphétamine), ni de réponse accrue aux

psychostimulants. En revanche, les souris exprimant 5 à 10% de la sous-unité NR1 du

récepteur glutamatergique NMDA montrent une hyperlocomotion, des stéréotypies en



réponse à un nouvel environnement ainsi que des déficits sociaux, normalisés par la

clozapine (Mohn et al., 1999). Cependant, le déficit de PPI de ces souris n’est pas amélioré

par cet antipsychotique (Fradley et al., 2005).

La calcineurine est une protéine dépendante du calcium et de la calmoduline,

impliquée dans la croissance neuritique, la plasticité synaptique et les fonctions

d’apprentissage et de mémoire. Une expression diminuée de cette protéine a été notée au

niveau de l’hippocampe de patients schizophrènes, potentiellement à l’origine d’une plasticité

réduite dans cette région (Gerber et al., 2003). Les souris invalidées pour cette protéine

spécifiquement au niveau du cerveau antérieur (Zeng et al., 2001) montrent des déficits de

plasticité synaptique, de certaines formes de mémoire, ainsi qu’une hyperlocomotion, une

altération du PPI, du comportement social et d’inhibition latente (Zeng et al., 2001; Miyakawa

et al., 2003).

La neuréguline 1 est aussi une protéine jouant un rôle dans la plasticité synaptique et

la neurogenèse, ainsi que la migration et la survie neuronales. Un polymorphisme situé dans

la partie non codante du gène a été positivement corrélé à la schizophrénie. Cette mutation

serait probablement impliquée dans la régulation de l’expression de la protéine (voir Tosato

et al., 2005). Les souris ne portant qu’une copie du gène montrent également des

comportements altérés : hyperlocomotion, déficit de PPI, d’inhibition latente,… (Gerlai et al.,

2000; Stefansson et al., 2002; Rimer et al., 2005).

Citons enfin les souris STOP KO (Andrieux et al., 2002), qui feront l’objet d’un

chapitre à part entière (voir chapitre C).

B/ Nicotine et schizophrénie 1/ Le système cholinergique

a/ Voies cholinergiques centrales

Dans le système nerveux central, les neurones cholinergiques sont localisés en amas

dans des noyaux mais aussi de façon diffuse dans certaines structures, en tant

qu’interneurones. Les noyaux cholinergiques sont regroupés dans deux zones cérébrales : le

prosencéphale, contenant la majorité des neurones et le tronc cérébral.



Le prosencéphale contient les structures anatomiques telles que la bande diagonale de

Broca, le noyau préoptique, la substance innominée, le noyau basal de Meynert et les

noyaux du septum. Les neurones issus du septum et de la bande de Broca innervent

principalement l’hippocampe (voie septo-hippocampique), le cortex cingulaire et l’amygdale

(figure 29). Cette voie serait impliquée dans les processus d’apprentissage, de

mémorisation. Les projections issues des autres noyaux sont diffuses dans le cortex. Le

tronc cérébral comprend deux noyaux cholinergiques : le noyau pédonculaire et le noyau

tegmental latéral. Ces neurones innervent, entre autres, les noyaux thalamiques, l’habenula,

les colliculi supérieurs, la substance noire, l’aire tegmentale ventrale et le septum. Par

ailleurs, des interneurones cholinergiques sont notamment présents dans le noyau

accumbens et le striatum, où ils participent au processus de motricité extrapyramidale.

Figure 29 : Schéma illustrant les principaux noyaux cholinergiques et leurs projections dans le cerveau de rat.

b/ Métabolisme de l’acétylcholine

L’acétylcholine (ACh) est synthétisée à partir de la choline et de l’acétyl coenzyme A,

par l’enzyme cytoplasmique choline acétyltransférase (ChAT):

Choline + Acétyl coenzyme A Acétylcholine + Coenzyme A

Les deux précurseurs ne sont pas disponibles en permanence dans le cytoplasme.

La choline provient à la fois de la dégradation d’un lipide circulant, la phosphatidylcholine et

ChAT

Raphe nuclei Locus

coeruleus



de la dégradation de l’acétylcholine et l’acétyl coenzyme A est synthétisé et stocké dans les

mitochondries.

La choline est transportée à l’intérieur du neurone par deux mécanismes spécifiques :

- un mécanisme lent, à faible affinité ;

- un mécanisme actif à haute affinité, co-transportant la choline avec le

sodium extracellulaire, via le transporteur HACU (high affinity choline uptake),

également nommé CHT1 (choline transporter 1).

Après synthèse, l’acétylcholine est transportée activement dans les vésicules

synaptiques par le transporteur vésiculaire VAChT (vesicular acetylcholine transporter). Lors

de l’arrivée d’un potentiel d’action, les vésicules fusionnent à la membrane et leur contenu

est libéré dans l’espace synaptique : l’acétylcholine peut alors agir sur ses récepteurs

spécifiques. Contrairement aux monoamines classiques, mais comme l’histamine,

l’acétylcholine ne possède pas de transporteur plasmique spécifique. L’acétylcholine se lie à

deux types de récepteurs : des récepteurs ionotropiques, appelés également nicotiniques,

liant la nicotine et métabotropiques, dits muscariniques, liant la muscarine. Néanmoins,

environ la moitié de la quantité d’acétylcholine libérée est aussitôt métabolisée en choline et

en acétate dès son entrée dans l’espace synaptique. Cette dégradation est effectuée par

l’enzyme acétylcholine estérase; le temps d’inactivation d’une molécule d’acétylcholine est

estimé à 100 msec.

2/ La transmission cholinergique

L’acétylcholine agit sur deux types de récepteurs : les récepteurs muscariniques,

activés par la muscarine et les récepteurs nicotiniques, stimulés par la nicotine.

a/ Les récepteurs muscariniques

Les récepteurs muscariniques peuvent être classés en deux types : les récepteurs

activateurs (M1, M2, M5) et les récepteurs inhibiteurs (M2 et M4 ; figure 30). Les premiers

sont couplés à des protéines Gq, dont la stimulation entraîne l’activation du métabolisme des

phosphoinositides, via la phospholipase C et une libération de calcium intracellulaire,

aboutissant à une dépolarisation membranaire. Les récepteurs M2 et M4 sont quant à eux

couplés à une protéine Gi et inhibent l’adénylate cyclase, donc la production d’AMPc.



Figure 30 : Représentation schématique des voies de signalisation médiées par les deux types de récepteurs muscariniques.

AC : adénylate cyclase ; Ins(1, 4, 5)P3 : inositol (1,4,5) triphosphate D’après Eglen et al., 2001.

b/ Les récepteurs nicotiniques neuronaux

• Structure et diversité des sous-unités

Les récepteurs nicotiniques (nAChRs) appartiennent à la superfamille des canaux

ioniques activés par des ligands, tout comme les récepteurs ionotropiques du GABA, de la

glycine et de la sérotonine (Karlin and Akabas, 1995). Ils ont une structure pentamérique,

constituée de cinq sous-unités transmembranaires assemblées autour d’un canal ionique

central (figure 31). Les sous-unités du système nerveux central se répartissent en deux

classes : les sous-unités α (α2-α10), se différenciant par la présence de deux résidus

cystéine adjacents, formant le site de liaison au ligand et les sous-unités β (β2-β4).

L’assemblage de sous-unités α et β donne lieu à de multiples combinaisons possibles.



Figure 31 : Représentation schématique d’un récepteur nicotinique ancré dans la membrane plasmique.

D’un point de vue évolutif, l’ensemble de ces sous-unités peut être classé en deux

familles, définies sur la base de séquences protéiques et de la structure des gènes (voir

Arias, 2000). Les récepteurs homopentamériques sont constitués de cinq sous-unités α

appartenant à la famille I (α7-α10). Les hétéropentamères sont formés de deux sous-unités

α de la famille II (α2-α6) et trois sous-unités β de la famille II (β2-β4). L’association des

différentes sous-unités entre elles confère à chaque type de récepteur des propriétés

pharmacologiques et fonctionnelles distinctes (affinité pour les ligands, perméabilité calcique,

vitesse de désensibilisation, durée de re-sensibilisation…).

• Classification et propriétés des récepteurs

Parmi les différentes classifications proposées, on peut retenir celle de Zoli et

collaborateurs (1998), qui différencie quatre types de récepteurs (le sigle * indique une

associations avec d’autres sous-unités) :

Type I (α7*) : caractérisés par leur sensibilité à l’antagoniste α-bungarotoxine et leur faible

affinité pour la nicotine, ces récepteurs sont des homopentamères composés de la sous-

unité α7. Leur vitesse de désensibilisation, donc d’inactivation, est très rapide.

Type II (α4α6β2*) : composés de la sous-unité β2, ils lient l’épibatidine avec une affinité

nanomolaire, meilleure que la nicotine. Cette classe contient essentiellement les récepteurs

α4β2, constituant 90% des récepteurs nicotiniques et également les récepteurs α*α6β2β*.

Type 3 (α3β4*) : ces récepteurs ne contiennent pas la sous-unité β2, lient l’épibatidine avec

une bonne affinité et se désensibilisent assez lentement.

ACh ou nicotine



Type 4 (α2α4β4* ; α3α5β4*): ces récepteurs ne contiennent pas non plus la sous-unité β2,

lient l’épibatidine et la cytisine avec une bonne affinité et ne lient pas la nicotine. Ils montrent

une désensibilisation rapide.

Régulation

Les nAChRs peuvent exister sous différents états conformationnels, régis par des lois

allostériques (Lena and Changeux, 1993). De manière simplifiée, en absence d’agoniste, le

récepteur est dans un état de repos. Lorsqu’un agoniste se lie au nAChR, ce dernier s’ouvre

pendant plusieurs millisecondes, laissant passer un flux de cations. Puis, il se referme de

façon plus ou moins rapide selon le type de récepteur et se retrouve dans un état

désensibilisé, qui évolue vers un état d’inactivation où le récepteur est réfractaire à

l’agoniste. Divers ligands ou processus peuvent modifier la fonctionnalité des nAChRs

(figure 32).

Figure 32 : Représentation des sites allostériques d’un récepteur nicotinique.

D’après Dani, 2001.

De façon non conventionnelle, une exposition prolongée à l’agoniste engendre une

augmentation du nombre de nAChRs (Peng et al., 1994). Dans les cerveaux de fumeurs

post mortem, il a été trouvé un nombre de sites liant la nicotine significativement plus élevé

comparé aux cerveaux de non fumeurs (Breese et al., 1997). Ce processus serait la

conséquence de la désensibilisation rapide et de l’inactivation des récepteurs, provoquant

potentiellement un déficit de transmission cholinergique, pallié par un accroissement du

nombre de récepteurs.

modulateurs et inhibiteurs

non compétitifs

glycosylation toxines α

agonistes et

antagonistes compétitifs

agents non compétitifs

bloquant le canal cytosquelette



Par ailleurs, il a récemment été montré que la consommation journalière de cigarettes

conduisait à une occupation quasi-complète des sites α4β2* (Brody et al., 2006).

Perméabilité calcique

Les nAChRs sont des canaux cationiques, permettant une entrée d’ions Na+ et Ca2+ et

une sortie d’ions K+. Comparés aux autres récepteurs canaux, les récepteurs nicotiniques

présentent la caractéristique d’être particulièrement perméables au calcium (voir Fucile,

2004). Le rapport de perméabilité entre le calcium et le sodium (PCa/PNa) se situe autour de

1,5 pour les hétéropentamères et peut atteindre une valeur dix fois plus élevée pour les

homopentamères α7. Ces derniers sont donc plus perméables au calcium que le récepteur

glutamatergique de type NMDA (PCa/PNa=7). Au potentiel de repos de la cellule, lorsque les

récepteurs NMDA sont bloqués par les ions Mg2+, les nAChRs constituent une voie majeure

d’entrée du calcium.

• Localisations cérébrale et neuronale

Localisation cérébrale

Des expériences d’hybridation in situ chez le rongeur ont permis de montrer une

répartition assez diffuse et variée des ARNm codant pour les différentes sous-unités des

récepteurs nicotiniques (figure 33). Les ARNm des sous-unités α4, α7, β2 sont assez

largement exprimées dans tout le cerveau tandis que ceux de la sous-unité α6 sont

sélectivement concentrés au niveau des corps cellulaires catécholaminergiques :

dopaminergiques (substance noire, aire tegmentale ventrale) et noradrénergiques (locus

coeruleus).



Figure 33 : Distribution différentielle des ARNm de différentes sous-unités des récepteurs nicotiniques dans le cerveau de rat.

ATV: aire tegmentale ventrale ; IPN : noyau interpédonculaire ; NTS : noyau du tractus solitaire ; NSO : noyau supraoptique ; SN : substance noire Tableau adapté de Lena and Changeux, 1998, d’après Le Novere et al., 1996; Lena and Changeux, 1997; Pidoplichko et al., 1997; Winzer-Serhan and Leslie, 1997; Zoli et al., 1998.

D’autre part, des études de radioliaison, utilisant des radioligands plus ou moins

sélectifs des différents récepteurs ont permis de localiser les récepteurs nicotiniques. Ainsi,

par liaison de [3H]-nicotine, [125I]-épibatidine et de [3H]-cytisine sur coupes, il a été montré

que les sous-unités α4 et β2 sont les plus largement exprimées dans le cerveau de rongeur

(Flores et al., 1992; Hill et al., 1993; Zoli et al., 1998). Leur présence a été décrite au niveau

du cortex cérébral (Clarke et al., 1985; Zilles et al., 1989), du striatum, du noyau

accumbens, des noyaux thalamiques, des colliculi supérieurs, de l’habénula médiane, de

α2 α3 α4 α5 α6 α7 β2 β3 β4 Télencéphale bulbe olfactif + ++ + ++ - ++ ++ - + cortex couche I-III - - + + - + ++ - - couche IV - + + + - + ++ - - couche V - - ++ + - ++ ++ - - coucheVI - - ++ ++ - ++ ++ - - hippocampe (+) (+) + + - +++ ++ - - striatum - - + - + + + - - septum - - + - - + + - - hypothalamus - - + - - - + - - NSO - - + - - +++ + - - Diencéphale hypophyse - +++ - + - - + - - habenula - +++ ++ + (+) (+) ++ ++ ++ thalamus - + +++ - + - +++ + + Mésencéphale SN+ATV - (+) ++ ++ +++ (+) ++ +++ +++ IPN ++ - + ++ + (+) ++ + + Rhombencéphale noyaux - - + + - ++ + - - cervelet - + - + - - + + + locus coeruleus - (+) - - +++ - ++ +++ +++ noyaux moteurs - + + + - - ++ - - NTS - ++ (+) + - - ++ - - area postrema - ++ ++ + - - ++ - -



l’aire tegmentale ventrale, de la substance noire pars compacta et du noyau

interpédonculaire (Clarke et al., 1985; Zoli et al., 1998).

Les récepteurs nicotiniques contenant la sous-unité α6, liant l’125I-α-conotoxine MII,

sont exprimés dans la rétine, les noyaux catécholaminergiques (substance noire, aire

tegmentale ventrale, locus coeruleus), le striatum, le noyau interpédonculaire et l’habénula

médiane (Zoli et al., 1998; Champtiaux et al., 2002). Ces régions correspondent aux

neurones exprimant les ARNm de la sous-unité α6 (Le Novere et al., 1996).

Les sites de liaison à l’[125I]-α-bungarotoxine, composés de la sous-unité α7, sont

distribués de manière diffuse dans l’ensemble du cerveau et plus fortement au niveau du

cortex, de l’hippocampe (gyrus denté et région CA1), du striatum et de l’amygdale (Clarke et

al., 1985; Orr-Urtreger et al., 1997).

Localisation neuronale

La fonction des récepteurs nicotiniques la plus fréquemment observée est la

stimulation de la libération de neurotransmetteurs (pour revue, voir Wonnacott, 1997). Pour

cela, ils sont situés stratégiquement au niveau présynaptique : terminal ou pré-terminal

(figure 34). Ces récepteurs présynaptiques terminaux (A) et pré-terminaux (B) permettent de

stimuler la libération de la quasi-totalité des neurotransmetteurs étudiés : une application

exogène d’un agoniste ou d’un antagoniste nicotinique augmente ou diminue,

respectivement, la libération d’acétylcholine elle-même, de dopamine, de noradrénaline, de

sérotonine, de glutamate et de GABA (voir Dani, 2001 et références associées). La

stimulation des récepteurs nicotiniques provoque l’entrée d’un flux d’ions Na+, dépolarisant la

membrane et capable d’activer les canaux calciques voltage-dépendants, engendrant une

libération accrue de neurotransmetteur calcium-dépendante.

Figure 34 : Représentation schématique de la localisation des récepteurs nicotiniques (nAChRs) au niveau terminal du neurone (A) ou préterminal (B). D’après Dani, 2001.

A B



Les récepteurs homomériques α7, particulièrement perméables au calcium, pourraient

aussi provoquer un influx calcique suffisamment important pour conduire à une exocytose

indépendante des canaux voltage-dépendants. Ainsi, dans des tranches et cultures

d’hippocampe de rat, la stimulation des récepteurs présynaptiques de type α7 initie un flux

de calcium qui augmente la libération de glutamate des terminaisons présynaptiques

(Albuquerque et al., 1997). Le calcium intracellulaire joue également le rôle de second

messager, activant plusieurs voies de régulation, notamment des protéines kinases et

phosphatases. Au niveau pré-terminal (B), la stimulation ou l’inhibition des récepteurs

nicotiniques joue sur l’activité des canaux sodium voltage-dépendants, favorisant ou

inhibant, respectivement la régénération d’un potentiel d’action.

Les récepteurs nicotiniques sont également localisés, quoique plus rarement, sur les

soma et dendrites de neurones post-synaptiques (figure 35).

Figure 35 : Représentation schématique de récepteurs nicotiniques postsynaptiques.

D’après Dani, 2001.

Ce type de transmission direct et rapide a notamment été détecté au niveau

d’interneurones GABA pendant le développement du cortex visuel (Roerig et al., 1997).

Cependant, d’une manière générale, la transmission nicotinique rapide ne représente qu’un

très faible pourcentage du signal excitateur qui est très majoritairement glutamatergique.

3/ Relation entre nicotine et schizophrénie

a/ Etudes épidémiologiques

De nombreuses études épidémiologiques ont montré que la consommation de tabac

était beaucoup plus forte chez les populations d’individus atteints de maladies mentales,



particulièrement les schizophrènes, comparées à des populations contrôles (Glassman,

1993). Ainsi, on estime à 70-80% le pourcentage de fumeurs parmi les sujets atteints de

schizophrénie, contre 20-30% dans la population générale (de Leon et al., 2002). De plus,

les fumeurs schizophrènes semblent avoir une plus forte consommation de cigarettes (Ucok

et al., 2004), apprécier les cigarettes plus chargées en nicotine (Olincy et al., 1997) et

extraire plus de nicotine de leurs cigarettes que les fumeurs sains (Strand and Nyback,

2005). Une étude prospective a également montré que la consommation régulière de tabac

chez les adolescents était significativement prédictive de l’apparition ultérieure de

schizophrénie, avec un effet-dose par rapport à la consommation quotidienne de cigarettes

(Weiser et al., 2004). Toutes ces données ont suggéré un éventuel dysfonctionnement de la

transmission nicotinique chez les schizophrènes.

b/ Expression des récepteurs nicotiniques chez les schizophrènes

Des expériences de liaison de l’α-bungarotoxine ou d’immunochimie sur des

cerveaux post-mortem de schizophrènes ont décelé une réduction du nombre de récepteurs

nicotiniques de type α7 au niveau de l’hippocampe (Freedman et al., 1995; Leonard et al.,

1996) et du cortex préfrontal (Guan et al., 1999; Martin-Ruiz et al., 2003). Dans cette

dernière région, aucune différence significative d’ARNm de la sous-unité α7, ou d’immuno-

réactivité des sous-unités α4, α3 ou β2 n’a été observée chez les schizophrènes comparés

aux témoins (Martin-Ruiz et al., 2003). Par contre, la liaison de l’épibatidine semble

augmentée dans le cortex préfrontal des schizophrènes, révélant une augmentation des

récepteurs de type α4β2 (Durany et al., 2000; Martin-Ruiz et al., 2003). D’autres études ont

trouvé une diminution des récepteurs à haute affinité pour la nicotine dans l’hippocampe et le

striatum (Freedman et al., 1995; Durany et al., 2000). Cependant, un autre groupe n’a pas

décelé de changement significatif de liaison de la nicotine au niveau de l’hippocampe, du

thalamus, du cortex et du striatum, mais plutôt un dysfonctionnement dans la régulation des

récepteurs α4β2 des patients schizophrènes en réponse à la nicotine (Breese et al., 2000).

Remarquons que la grande difficulté de ces études provient des critères d’inclusion des

patients, qui ne sont pas toujours identiques entre les différentes études. Il est d’autant plus

difficile d’avoir accés à un grand nombre de sujets schizophrènes à la fois non traités par des

antipsychotiques et non fumeurs.



4/ La nicotine comme forme d’auto-médication

L’ensemble des données épidémiologiques et biochimiques suggèrent que la nicotine

serait utilisée dans un processus d’auto-médication, afin de réduire les déficits cognitifs

associés à la schizophrénie, d’augmenter l’effet thérapeutique et/ou de réduire les effets

secondaires dus au traitement par les antipsychotiques (pour revue, voir Kumari and

Postma, 2005)

a/ Amélioration des symptômes et des effets secondaires

Selon Smith et collaborateurs (2002), la nicotine, via la cigarette, serait capable de

réduire les symptômes déficitaires de la schizophrénie, sans effet sur les symptômes

productifs. Ceci proviendrait de la capacité qu’à la nicotine, comme les autres drogues

d’abus, d’augmenter la libération de dopamine au niveau de la voie méso-limbique (noyau

accumbens et cortex préfrontal), réduisant ainsi l’hypofrontalité avancée dans l’hypothèse

dopaminergique, qui serait responsable des symptômes déficitaires (Weinberger and

Berman, 1988; Dalack et al., 1998).

De façon intéressante, les antipsychotiques atypiques, comme la clozapine, qui ont

une bonne affinité pour divers récepteurs de plusieurs neuromédiateurs, sont plus efficaces

que les neuroleptiques conventionnels pour améliorer cette classe de symptômes. Une

étude a montré que la clozapine, en bloquant les récepteurs sérotoninergiques 5HT-3,

favorisait la libération de plusieurs neurotransmetteurs, dont l’acétylcholine, ce qui stimulerait

l’activité des récepteurs nicotiniques et la libération de dopamine (Imperato et al., 1993; Arnt

and Skarsfeldt, 1998). En outre, les patients schizophrènes passant d’un traitement à

l’halopéridol à un traitement à la clozapine réduisent leur consommation de cigarettes

(McEvoy et al., 1995).

Les antipsychotiques ont une forte capacité de blocage des récepteurs

dopaminergiques D2, conduisant à l’apparition de symptômes moteurs extra-pyramidaux de

type Parkinsonien. L’administration de nicotine sous forme de patchs réduirait les

dyskinésies induites par les neuroleptiques (Yang et al., 2002), en stimulant la libération de

dopamine. De la même manière, la nicotine améliorerait le ralentissement cognitif, les

déficits de mémoire spatiale et d’attention chez les sujets schizophrènes (Levin et al., 1996).

b/ Amélioration des déficits sensoriels

Chez les patients schizophrènes et leurs apparentés non atteints, de nombreuses

études ont mis en évidence des déficits de filtrage sensoriel. L’individu atteint de



schizophrénie intègre malgré lui une multitude d’informations sensorielles extérieures

(visuelles, auditives), lui rendant très difficile de se focaliser sur une tâche précise (une

conversation, par exemple) et le conduisant à une fragmentation cognitive et une pensée

désorganisée (voir Light and Braff, 2003). Notons que ces anomalies de filtrage sensoriel ne

sont pas spécifiques de la schizophrénie et sont retrouvées dans d’autres troubles

psychiatriques, comme les troubles bipolaire et dépressif. Ces altérations de la perception

sensorielle peuvent être appréhendées chez l’homme par deux tests, communément

employés, mesurant le PPI (prepulse inhibition ou inhibition du réflexe de sursaut) et la

suppression de l’onde P50.

• Amélioration du PPI

Chez les mammifères, le réflexe de sursaut se traduit par la contraction réflexe des

muscles faciaux et squelettiques en réponse à un stimulus intense. Si celui-ci est précédé de

30 à 500 msec d’un stimulus de faible intensité (prepulse), la réponse au deuxième stimulus

est significativement diminuée (figure 36). Cette réponse se mesure par électromyographie

du muscle oculaire chez l’homme ou par une réduction du sursaut du corps de l’animal.

Figure 36 : Représentation du paradigme de l’inhibition du réflexe de sursaut (PPI).

D’après Light and Braff, 2003. Les schizophrènes montrent un défaut d’inhibition de leur réflexe de sursaut (Braff et al.,

2001) qui peut être amélioré de façon transitoire par la nicotine (Kumari et al., 2001). Il en est

de même chez les rongeurs (Acri et al., 1991; Curzon et al., 1994), bien que ce résultat

semble dépendre des souches étudiées (Faraday et al., 1999).

pulse réponse normale

prepulse réponse inhibée

stimulus sursaut



• Amélioration du filtrage de l’onde P50

L’onde P50 est une onde de potentiel évoqué, produite environ 50 millisecondes après

un stimulus auditif. La suppression de l’onde P50 correspond à la réduction de l’amplitude

d’une seconde onde suivant un stimulus, quand un stimulus identique est présenté 75 à

2000 msec après le premier (figure 37).

Cette réponse, qui se mesure par électroencéphalographie, est anormale chez 80% des

schizophrènes (Adler et al., 1982; Waldo et al., 1991) et 50% de leurs apparentés de premier

degré (Waldo et al., 1991). Il a été montré que la nicotine, administrée sous forme de

cigarettes ou de gommes, était capable de normaliser transitoirement ce déficit de filtrage

sensoriel chez ces deux populations (Adler et al., 1982; Adler et al., 1992; Adler et al., 1993).

D’autre part, la schizophrénie et ce déficit de filtrage de l’onde P50 ont été liés

génétiquement au locus du gène codant la sous-unité α7 du récepteur nicotinique

(Freedman et al., 1997; Freedman et al., 2001). Cette liaison concernerait un polymorphisme

qui se trouverait dans la région promotrice du gène α7, suggérant un défaut de régulation de

son expression (Leonard et al., 2002).

Figure 37 : Représentation du paradigme de la suppression de l’onde P50.

ST1 : premier stimulus ; ST2: deuxième stimulus. D’après Light and Braff, 2003. De manière intéressante, les souris de la lignée DBA/2Ibg montrent une densité de

liaison de l’α-bungarotoxine moins grande que celles de la lignée C3H (Marks et al., 1989) et

présentent un déficit de filtrage auditif (Stevens et al., 1996). La nicotine normalise ce déficit,

500 ms

Réponse P50 Suppression P50 normale

Stimulus auditif

50 ms 50 ms

Suppression P50 déficiente

filtrage

défaut de filtrage

ST1 ST2



de même qu’un agoniste des récepteurs nicotiniques α7, le GTS-21 (Stevens et al., 1998),

démontrant que ce récepteur joue un rôle important dans ce phénotype.

Ces comportements de filtrage sensoriel font intervenir, sur le plan neurologique,

l’activation de circuits inhibiteurs. Le GABA est vraisemblablement impliqué puisque les

interneurones GABA portent des récepteurs nicotiniques et que la nicotine induit la libération

de GABA chez l’homme et l’animal (Freedman et al., 1993; Alkondon et al., 1997a). Il a été

proposé que la baisse des récepteurs α7 nicotiniques chez les schizophrènes provoquerait

une diminution de l’activation cholinergique d’interneurones GABAergiques, engendrant une

moindre inhibition (Leonard et al., 1998; Martin et al., 2004). La nicotine augmenterait la

libération de glutamate, facilitant la libération de GABA par les interneurones, à l’origine de

l’inhibition des neurones pyramidaux localisés dans l’hippocampe (aires CA3 et CA4). Ceci

expliquerait l’inhibition de la réponse au second stimulus (Alkondon et al., 1997a).

Ajoutons enfin deux tâches de mouvements oculaires, la poursuite lente et la tâche

d’anti-saccade, qui sont testées chez l’homme uniquement. Ces deux comportements sont

altérés chez les schizophrènes (Ettinger et al., 2003) et améliorés après administration de

nicotine (Olincy et al., 2003).

c/ Amélioration des déficits cognitifs

De nombreux travaux réalisés chez l’homme et l’animal ont démontré que la nicotine

et les agonistes nicotiniques étaient capables d’améliorer diverses fonctions cognitives alors

que des antagonistes nicotiniques les altéraient (Levin and Simon, 1998; Levin et al., 2002).

En traitement aigu ou chronique, la nicotine et ses agonistes, comme l’épibatidine, peuvent

augmenter l’attention et la mémoire de travail chez les individus sains. Chez les

schizophrènes, la nicotine améliore l’attention soutenue et réverse les déficits de mémoire de

travail spatiale induits par l’abstinence de cigarettes (George et al., 2002). Sous forme de

patch, la nicotine améliorerait les performances lors d’une tâche d’attention (Depatie et al.,

2002), alors que dans une autre étude, sous forme de spray nasal, elle n’aurait pas d’effet

bénéfique sur cette même tâche (Sherr et al., 2002). Récemment, un agoniste partiel des

récepteurs nicotiniques α7, le DMXB-A, a permis d’améliorer les performances de

schizophrènes dans une batterie de tests neurocognitifs (Martin et al., 2004; Olincy et al.,

2006).



C/ La protéine STOP

1/ Microtubules et protéines associées

a/ Les microtubules

Les cellules eucaryotes contiennent un réseau de fibres cytoplasmiques qui constitue

leur cytosquelette, au contraire des cellules procaryotes, qui en sont dépourvues. Ce

cytosquelette, responsable de la structure et de la motilité cellulaire, est composé de trois

grandes familles de protéines, très conservées dans l’évolution : les microtubules, les

microfilaments d’actine et les filaments intermédiaires.

Les microtubules sont des tubes creux de 25 nm de diamètre de longueur variable,

constitués de 13 protofilaments de tubuline (figure 38). Chaque protofilament est lui-même

constitué de dimères de tubuline : tubulines α et β. Cet assemblage polymérique est, dans la

plupart des cellules, extrêmement labile : les extrémités des microtubules se polymérisent,

utilisant l’énergie provenant de l’hydrolyse du GTP et se dépolymérisent en permanence. Les

deux extrémités des microtubules ont des propriétés différentes : il existe une extrémité

"plus" où les dimères s'ajoutent et une extrémité "moins" qui, au contraire, perd

progressivement ses dimères.

Figure 38 : Représentation schématique d’un microtubule, composé de protofilaments, eux-mêmes formés par l’assemblage de monomères de tubuline α et β.

Les microtubules interviennent dans plusieurs fonctions vitales pour la cellule, telles

que la division cellulaire et le trafic des vésicules. Ils forment le fuseau mitotique qui permet

de ségréguer équitablement les deux jeux de chromosomes dans les cellules filles. Ils



servent également de rails directeurs pour le transport d’organites et sont impliqués dans la

polarisation et la morphogenèse des cellules.

La tubuline est abondamment présente dans le système nerveux central où elle

représente environ un cinquième des protéines cérébrales. Les microtubules sont donc très

nombreux dans les neurones, en particulier dans les dendrites et les axones. Ils permettent

d'acheminer divers composants, comme les vésicules synaptiques et les mitochondries, vers

les extrémités neuronales, servant de véritables rails sur lesquels des moteurs moléculaires

(par exemple la kynésine), liant les composants à transporter, se déplacent.

Les neurones, contrairement aux autres types cellulaires, contiennent une grande

proportion de microtubules stables, résistants aux substances dépolymérisantes et aux

basses températures. La pertinence physiologique de la résistance au froid reste incomprise.

Ces microtubules seraient importants pour la génération et la maintenance de la

morphologie et des fonctions neuronales (Baas and Heidemann, 1986). Ces propriétés de

stabilité leur sont conférées par certaines protéines, appartenant à la famille des protéines

associées aux microtubules, les MAPs (microtubule associated proteins).

b/ Les protéines associées aux microtubules

Par définition, les MAPs sont des protéines associées aux microtubules par des

interactions très fortes puisqu’elles co-immunoprécipitent avec la tubuline. Elles ont un rôle

de médiateur, étant placées entre les microtubules et les composants de la cellule en

interaction avec ces microtubules. Elles influent sur la structure et la dynamique des

microtubules, ainsi que sur les processus de transport axonal et de motilité cellulaire.

On peut distinguer deux sous-ensembles : les MAPs moteurs (dynéine, kynésine) qui

ont une activité enzymatique et participent au transport et à la motilité cellulaire et les MAPs

structurales, qui régulent la dynamique des microtubules, en influant sur la stabilité et

l’organisation des microtubules. Parmi ces dernières, les mieux caractérisées sont MAP2,

tau, anormalement phosphorylée dans la maladie d’Alzheimer, et STOP.

2/ La protéine STOP

La protéine STOP (stable tubule only polypeptide), comme la BPAG1 et la

doublecortine, confère aux microtubules neuronaux la capacité de résister au froid.

Initialement isolée de préparations de cerveaux de rat de microtubules résistants au froid,

cette protéine lie la calmoduline et joue un rôle essentiel dans la stabilisation des



microtubules in vitro (Job et al., 1981; Job et al., 1982). L’inhibition de sa fonction par

addition d’anticorps à des cultures de cellules neuronales abolit la stabilité des microtubules

au froid et aux agents dépolymérisants dans les neurites (Guillaud et al., 1998). De même,

des cellules injectées pendant la phase de différentiation, avec des anticorps dirigés contre

la protéine STOP ou des oligonucléotides antisens, ont une croissance neuritique altérée

(Guillaud et al., 1998).

Le gène codant la protéine STOP, nommé Mtap6 chez la souris (situé sur le

chromosome 1q32) ou Map6 chez l’homme (situé sur le chromosome 11q14), a été cloné il y

a une dizaine d’années (Bosc et al., 1996; Denarier et al., 1998b). Ce gène est composé de

quatre exons, codant différentes isoformes issues de l’épissage du transcrit et de l’utilisation

de promoteurs alternatifs (figure 39, voir Bosc et al., 2003). Selon le type cellulaire, on

trouve ainsi N-STOP (100 kDa) et E-STOP (84 kDa) dans les neurones, F-STOP (42 kDa)

dans les fibroblastes ainsi que A-STOP (60 kDa) et O-STOP (89 kDa) dans les astrocytes et

les oligodendrocytes, respectivement (Bosc et al., 1996; Denarier et al., 1998a; Guillaud et

al., 1998; Galiano et al., 2004). La séquence du gène contient quatre sites consensus de

phosphorylation par la CaM kinase II et deux sites putatifs riches en proline liant les

domaines SH3. N-STOP est la forme majoritairement exprimée dans le cerveau adulte.

Notons que le gène STOP n’est apparemment présent que chez les vertébrés : mammifères,

poissons et oiseaux (Bosc et al., 2003).



Figure 39 : Structure du gène et protéines STOP :

A/ Représentation schématique montrant les domaines structuraux de la protéine N-STOP. B/ Organisation du gène STOP de souris (Mtap6), montrant les différents exons et représentation schématique de 3 variants de STOP. KR : domaine riche en lysine et arginine ; P : domaine riche en proline. Les barres rouges représentent les sites putatifs de phosphorylation par la CaMKII. D’après Bosc et al., 2003.

Au niveau du cerveau de souris, les transcrits sont fortement exprimés dans

l’hippocampe, un peu plus faiblement au niveau du cervelet et des cortex occipital, fronto-

pariétal et cingulaire, avec une moindre expression dans le striatum (Eastwood et al., sous

presse). La protéine, très ubiquitaire, est trouvée un peu plus concentrée au niveau des

bulbes olfactifs, de l’hippocampe et du cervelet (Andrieux et al., 2002). Au sein des

neurones, la protéine STOP est cytoplasmique, abondante au niveau des épines

dendritiques, à proximité des densités postsynaptiques et se trouve également dans les

axones (Andrieux et al., 2002). Récemment, il a été montré que la phosphorylation de STOP

par la CaM kinase II était responsable de la translocation de la protéine des microtubules

vers les compartiments synaptiques où elle pourrait interagir avec l’actine (Baratier et al.,

2006).

Afin de mieux évaluer le rôle de cette protéine in vivo, Andrieux et collaborateurs

(2002) ont créé des souris invalidées pour la protéine STOP (STOP KO).



3/ Les souris STOP KO

Par recombinaison homologue, l’exon 1 du gène Mtap6 a été remplacé par une

cassette contenant le gène codant la néomycine, permettant une sélection positive et le

gène rapporteur LacZ (Andrieux et al., 2002). Le croisement de souris hétérozygotes donne

naissance à des souris STOP KO viables, dans des proportions mendéliennes.

a/ Caractérisation anatomique et physiologique

Les souris STOP KO sont dépourvues de microtubules neuronaux stables à basse

température (figure 40).

Figure 40 : Analyse de la stabilité au froid de microtubules dans des cultures primaires neuronales de souris sauvages (WT) et invalidées pour la protéine STOP (STOP KO).

Les cellules sont exposées à 37°C ou à 0°C pendant 45 mn. Les microtubules sont marqués avec un anticorps anti β-tubuline (vert) et les noyaux avec l’agent Hoescht 33258 (bleu). D’après Andrieux et al., 2002.

De façon surprenante, compte tenu du rôle des microtubules dans la croissance

neuronale, l’anatomie du cerveau des souris mutées, analysée en microscopie, ne présente

pas d’anomalies structurelles ou de dégénérescences neuronales évidentes. L’organisation

des bulbes olfactifs ainsi que la structure en « champs de tonneaux » du cortex

somatosensoriel sont normales. Au niveau de l’hippocampe, l’organisation des fibres

moussues de la zone CA3, la configuration somato-dendritique des cellules pyramidales de

WT STOP KO

37°C

0°C



la région CA1 ainsi que l’arborisation dendritique des cellules de Purkinje cérebelleuses sont

préservées chez les souris STOP KO (Andrieux et al., 2002).

L’examen de synapses hippocampiques par microscopie électronique a montré une

densité deux fois moins élevée de vésicules synaptiques au sein des collatérales de Schaffer

glutamatergiques, très précisément au niveau de la couche stratum radiatum de la région

CA1 (Andrieux et al., 2002). L’analyse de la quantité de différentes protéines synaptiques

dans des synaptosomes n’a pas permis de déceler de différence chez les animaux mutés,

suggérant un import normal des protéines synaptiques vers la zone active de la synapse. En

revanche, par hybridation in situ, une baisse significative des transcrits des gènes

présynaptiques codant pour la synaptophysine, VGLUT1 (transporteur vésiculaire du

glutamate 1), GAP43 (growth associated protein 43), ainsi que du gène postsynaptique de la

spinophiline a été trouvée dans plusieurs régions, dont l’hippocampe (Eastwood et al., sous

presse).

Des études électrophysiologiques au niveau de cette même région ont révélé une

plasticité synaptique à court et long terme altérée chez les animaux STOP KO. Tandis que la

transmission synaptique basale est normale, la potentialisation à long terme (LTP) au niveau

des collatérales de Schaffer et de l’aire CA1 est diminuée d’un facteur trois. La dépression à

long terme (LTD) est également plus faible dans cette région, de même que la

potentialisation post-tétanique (PTP), probablement à cause de la taille réduite du pool

vésiculaire glutamatergique (Andrieux et al., 2002). Dans la région CA3, au niveau des

synapses fibres moussues-cellules pyramidales, la LTP n’est pas modifée, mais un déficit de

plasticité synaptique à court terme a été retrouvé.

b/ Caractérisation biochimique

Les concentrations de dopamine extracellulaire mesurées par microdialyse

quantitative au niveau du striatum et du noyau accumbens sont normales chez les animaux

STOP KO, comparés aux contrôles (Brun et al., 2005). Des expériences d’électrochimie,

mesurant l’efflux dopaminergique après stimulation électrique des fibres dopaminergiques

issues du mésencéphale, ont également été menées chez ces souris. A faible fréquence, il

n’y a pas de différence significative de l’efflux évoqué entre les deux génotypes. En

revanche, pour des fréquences de 15 à 50 Hz, on observe une forte potentialisation de

l’efflux dopaminergique au niveau du noyau accumbens des souris mutées (Brun et al.,

2005). Par contre, au niveau du striatum de ces mêmes animaux, cet efflux a tendance à

être diminué par rapport aux contrôles, bien que non significativement. Les souris STOP KO

présentent donc une réponse normale à une stimulation tonique et une hyper-réactivité au



signal phasique, spécifiquement au niveau du noyau accumbens. D’après l’analyse des

courbes de cinétique de clairance de dopamine, cette réponse excessive serait due à un

excès de libération de dopamine et non à la diminution de recapture du neurotransmetteur

par son transporteur plasmique ou une inhibition déficiente médiée par les auto-récepteurs

D2/D3 (Brun et al., 2005).

c/ Caractérisation comportementale

Les souris STOP KO présentent des troubles multiples et sévères de leur

comportement. Elles alternent entre des crises d’hyperactivité ou au contraire de prostration,

avec apparition d’activité sans but apparent et désorganisation des séquences

comportementales normales (Andrieux et al., 2002). Elles ont une locomotion accrue en

réponse à un nouvel environnement, à un léger stress et également pendant la phase

nocturne du cycle circadien (Brun et al., 2005). Ces animaux montrent des signes d’anxiété

importante dans le test de la boîte claire-obscure puisqu’ils passent significativement plus de

temps dans le compartiment sombre. Ils sont également incapables de réussir les tests de

reconnaissance d’objet, probablement par manque d’intérêt pour leur environnement

physique. En outre, les souris mutantes ont un comportement social fortement altéré :

l’investigation sociale ainsi que le comportement agressif envers des congénères sont

nettement diminués (Andrieux et al., 2002).

D’autre part, les femelles STOP KO sont incapables d’élever leur progéniture : elles

ne manifestent que très peu d’intérêt pour leurs petits et ne sont pas capables de les

ramener au nid pour les allaiter. Plusieurs tests ont montré que ce défaut de soins maternels

était indépendant de l’état hormonal des souris (présence de lait dans les mamelles) ou de

perturbations sensorielles (odorat, vue ; Andrieux et al., 2002).

Les souris STOP KO sont hypersensibles à l’effet stimulant locomoteur de

l’amphétamine (Brun et al., 2005) et, de façon intéressante, plusieurs de leurs

comportements peuvent être améliorés par l’administration de neuroleptiques. Une dose

aiguë de clozapine, inefficace chez les sauvages, est ainsi capable de réverser

l’hyperlocomotion de ces souris (Fradley et al., 2005). Néanmoins, seul un traitement

chronique de quatre mois par des neuroleptiques (chlorpromazine+halopéridol) est capable

d’améliorer le déficit de maternage des femelles mutées (Andrieux et al., 2002). Ce

traitement n’a aucun effet sur la transmission synaptique de base mais améliore la LTP et la

PTP, initialement déficientes chez les mutants. De même, ce traitement réduit partiellement

le déficit en vésicules synaptiques dans la région CA1 de l’hippocampe (A. Andrieux,



communication personnelle). Enfin, les animaux STOP KO présentent un déficit de PPI, qui

n’est pas amélioré par l’injection d’une dose aiguë de clozapine (Fradley et al., 2005).

d/ Un modèle pour la schizophrénie ?

Les souris STOP KO ont été proposées pour étudier l’efficacité des neuroleptiques

dans la schizophrénie et les troubles schizoïdes (Andrieux et al., 2002). En effet, ces souris

présentent divers troubles comportementaux qui sont sensibles à ces molécules. Ces

animaux ne montrent pas de défaut anatomique évident, mais présentent des altérations

synaptiques dans l’hippocampe (pool vésiculaire diminué, défauts de plasticité synaptique),

qui est une structure atteinte chez les schizophrènes. Comme d’autres modèles animaux

proposés pour la schizophrénie, ces souris sont hypersensibles au stress et à l’amphétamine

et manifestent un déficit de PPI ainsi qu’un retrait social. De plus, ce modèle, issu de

l’inactivation d’une protéine associée au cytosquelette, semble présenter des troubles de la

transmission dopaminergique (hyperdopaminergie dans le noyau accumbens), sans

modification de la transmission basale ainsi que des altérations du système glutamatergique

(hypoglutamatergie dans l’hippocampe), comme ce qui est suspecté dans la schizophrénie.

Des changements d’expression de protéines synaptiques ont également été trouvés, en

accord avec ce qui a été décrit chez des patients schizophrènes (Mirnics et al., 2001).

Enfin, le gène STOP humain (Map6), situé sur le chromosome 11q14, se trouve

proche d’une région associée aux désordres mentaux, dont les troubles schizoïdes (St Clair

et al., 1990). De fait, très récemment, une association génétique a été découverte entre un

polymorphisme de ce gène et une population de schizophrènes japonais (Shimizu et al.,

2006). Une hausse significative d’expression d’une des deux isoformes de Map6 a

également été décelée au niveau du cortex préfrontal de cerveaux post-mortem de

schizophrènes (Shimizu et al., 2006).

L’ensemble de ces éléments, décrivant le récent modèle des souris STOP KO,

suggère que ces animaux pourraient reproduire certains traits étiologiques et/ou

symptomatiques de la schizophrénie, constituant potentiellement un modèle pertinent pour

l’étude de cette maladie.


RESULTATS



ARTICLE I : Augmentation de la densité des récepteurs nicotiniques alpha7 chez les souris STOP KO et amélioration par la

choline d’un déficit d’apprentissage de type associatif

Caroline Bouvrais-Veret1+, Stéphanie Weiss1+, Annie Andrieux2, Annie Schweitzer2, J.

Michael McIntosh3, Didier Job2, Bruno Giros1 and Marie-Pascale Martres1# +contribution équivalente

(article soumis pour publication au journal Neuropharmacology)



Contexte de l’étude

Les souris invalidées pour la protéine STOP associée aux microtubules (Andrieux et

al., 2002) montrent une hyper-réactivité dopaminergique au niveau du système limbique,

probablement associée à une hypoglutamatergie dans l’hippocampe. Elles présentent

également de nombreux troubles comportementaux, dont une hypersensibilité à

l’amphétamine, un déficit de filtrage sensori-moteur et un comportement social altéré

(Andrieux et al., 2002; Brun et al., 2005; Fradley et al., 2005). Différents éléments de ce

phénotype sont en partie améliorés par un traitement aigu ou chronique par des

neuroleptiques. Ces traits physiologiques et comportementaux sont généralement associés à

la schizophrénie et suggèrent que ces souris pourraient constituer un modèle pertinent pour

cette pathologie mentale.

De nombreuses études épidémiologiques ont montré une forte prévalence de

fumeurs parmi les individus atteints de schizophrénie : 80 à 90% des schizophrènes fument

contre 25-30% de la population générale (Glassman, 1993; de Leon et al., 1995). Il a été

suggéré que la nicotine, qui agit via ses récepteurs canaux principalement en modulant la

libération de nombreux neurotransmetteurs, constituait une forme d’auto-médication chez les

patients (Kumari and Postma, 2005). Par exemple, la nicotine améliore le déficit de filtrage

sensoriel de l’onde P50 retrouvés chez les schizophrènes, probablement via la stimulation

des récepteurs nicotiniques α7 (Freedman et al., 1997; Adler et al., 1998; Siegel et al., 2005)

Le but de ces travaux a été de caractériser le phénotype nicotinique des souris STOP

KO et d’éventuelles altérations des composants et/ou fonctions de ce système. Pour cela,

nous avons quantifié les densités protéiques de certains composants du système

cholinergique et récepteurs nicotiniques. Puis, nous avons analysé l’activité locomotrice des

souris en réponse à l’injection de nicotine et testé la mémoire associative de nos animaux et

l’effet sur celle-ci d’un agoniste des récepteurs α7.

Principaux résultats

• Les densités de certains récepteurs nicotiniques et composants cholinergiques sont modifiées dans le cerveau des souris STOP KO (figure 1, tableaux 1 et 2) La densité relative de l’acétylcholine estérase (AChE) n’est pas modifiée dans les

régions cérébrales analysées des souris mutées, contrairement celle du transporteur



vésiculaire de l’acétylcholine (VAChT) qui est diminuée de manière significative (-17 à -33%)

dans l’hippocampe (figure 1, tableau 1).

Aucune différence de densité du récepteur de type β2* n’a été décelée dans les

diverses structures cérébrales analysées. Par contre, la densité du récepteur nicotinique de

type α6* est significativement diminuée dans le striatum et le noyau accumbens (20-40%)

des animaux mutés et celle du récepteur nicotinique α7 est significativement augmentée

dans le striatum (25%) et dans les différentes couches de l’hippocampe dorsal (25-70%).

• La nicotine provoque un effet locomoteur biphasique chez les souris STOP KO (figure 2)

Chez les souris sauvages, la nicotine administrée à des doses croissantes a

globalement un effet hypolocomoteur, qui devient significatif à partir de 1 mg/kg (figure 2).

Chez les souris STOP KO, la nicotine provoque un net effet locomoteur biphasique,

constitué d’une composante hyperlocomotrice jusqu’à 1 mg/kg, maximale à 0,5 mg/kg, suivie

d’une composante hypolocomotrice pour les doses supérieures.

La dose inhibitrice de nicotine efficace à 50% (DI50) est identique chez les souris des

deux génotypes. L’activité locomotrice verticale des souris montre un profil similaire à celui

de l’activité horizontale.

• La choline n’a pas d’effet locomoteur global chez les deux génotypes de souris (figure 3)

Afin de tester l’effet de la choline, agoniste sélectif des récepteurs nicotiniques α7,

sur les performances des souris dans la version associative du labyrinthe aquatique de

Morris, nous avons tout d’abord analysé l’effet locomoteur de cet agent.

Chez les souris sauvages, la choline aux trois doses testées n’induit pas d’effet

locomoteur significatif sur l’activité horizontale et verticale des animaux (figure 3). Chez les

souris mutantes, la choline augmente l’activité horizontale de manière dose-dépendante et

significative, jusqu’à 165% à 30 mg/kg. A l’inverse, la choline inhibe l’activité verticale des

souris mutées de façon dose-dépendante, jusqu’à 80% à 30 mg/kg.

• Les souris STOP KO ont des performances déficitaires dans une tâche de mémoire associative, qui sont améliorées par l’administration de choline (figure 4)

Nous avons testé les performances des souris STOP KO dans la version associative

du labyrinthe aquatique de Morris. Les souris STOP KO ont de mauvaises performances



comparées aux souris sauvages : la latence pour trouver la plate-forme et la distance

parcourue pour l’atteindre sont significativement plus grandes (figure 4) et la proportion

d’essais réussis est significativement plus faible.

Nous avons alors testé les effets de la choline sur les capacités mnésiques des

souris dans cette même tâche. Quinze minutes avant chaque essai, les animaux des deux

génotypes ont reçu du sérum physiologique ou la choline à une dose de 0,3 mg/kg. A cette

dose, la choline n’a pas d’effet sur la vitesse de nage des souris des deux génotypes (non

montré). Chez les souris sauvages, le traitement à la choline n’a pas d’effet significatif sur la

latence et la distance parcourue mais augmente significativement la proportion d’essais

réussis. Chez les animaux mutés, la choline diminue la latence et la distance parcourue de

façon significative. De plus, la choline améliore la proportion d’essais réussis, de sorte que

les performances des souris STOP KO traitées à la choline ne sont plus significativement

différentes de celles des souris sauvages.

Conclusions de l’étude L’ensemble des résultats de cette étude montre que l’inactivation constitutive de la

protéine STOP, plutôt ubiquitaire, provoque d’importantes modifications de composants

cholinergiques et de récepteurs nicotiniques, de façon région- et protéine-dépendante. Ces

modifications ont vraisemblablement pour effet d’altérer certaines fonctions nicotiniques. Les

animaux mutants sont hypersensibles à l’effet hyperlocomoteur de la nicotine, en accord

avec leur hypersensibilité à l’amphétamine (Brun et al., 2005). Malgré l’importante

augmentation de récepteurs α7 dans des structures impliquées dans l’apprentissage, les

souris mutantes présentent un défaut important de mémoire associative. Ce déficit est

quasiment restauré par l’administration d’un agoniste des récepteurs nicotiniques α7, la

choline. Ce résultat, associé à la diminution de densité de VAChT, suggère que la

neurotransmission nicotinique est probablement déficiente chez ces animaux mutants.



Sustained increase of alpha7 nicotinic receptors and choline-induced improvement of learning deficit of STOP knock-out mice.

C. Bouvrais-Veret,a+ S. Weiss,a+ A. Andrieux,b A. Schweitzer,b J. M. McIntosh,c D. Job,b B.

Girosa and M.-P. Martresa# +equal contribution

aInserm, U513, Laboratoire de Neurobiologie et Psychiatrie, Créteil, F-94000 France; Univ

Paris 12, Créteil, F-94000 France bInserm, U366, Laboratoire du Cytosquelette, CEA, Grenoble, F-38000 France cDepartment

of Psychiatry, University of Utah, Salt Lake City, UT 84112

Running title: Nicotinic transmission in STOP KO mice

Key words: cytoskeleton, dopamine, locomotion, cued version of the Morris watermaze,

schizophrenia, vesicular acetylcholine transporter/nicotinic receptors

Footnote : For nAChRs, * indicates the association with other subunits

#Corresponding author. Inserm U513, Laboratoire de Neurobiologie et Psychiatrie, Créteil, F-

94010 France. Tel: (33) 139 813 635; fax: (33) 139 813 658; E-mail address: Marie-

[email protected]

Acknowledgements: The authors thank Drs M. Nosten-Bertrand (Inserm U513) and V. Setola (Inserm U616) for helpful discussion and D. Proietto (Inserm U366) for mouse genotyping. This work was supported by Inserm (AA, AS, DJ, BG, MPM) and by NIH MH 53631 and DA12242 (JMM). CBV and SW were the recipients of a fellowship from MILDT and the "Société de Tabacologie", respectively.

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]



ABSTRACT

Mice deficient for the microtubule stabilizing protein STOP (Stable Tubule Only Polypeptide) show synaptic plasticity anomalies and dopamine hyper-reactivity in the limbic system, in spite of the absence of anatomical and neurological defects. These mice exhibit severe behavioural deficits, some being alleviated by long-term antipsychotic treatment. Therefore, this mouse line represents a pertinent model for some aspects of schizophrenic symptomatology.

Numerous data support dysfunction of nicotinic transmission in schizophrenia and epidemiological studies show increased tobacco intake in schizophrenic patients, in whom nicotine has been reported to improve deficits in sensory gating and cognitive dysfunctions. In this study, we examined potential alterations in cholinergic (ACh) and nicotinic components and functions in STOP mutant mice. STOP KO mice displayed no variation of the density of ACh esterase and β2* nicotinic receptors (nAChRs), decreased density of vesicular ACh transporter and α6* nAChRs and highly increased density of α7 nAChRs, in a subtype- and area-dependent manner. STOP KO mice were hypersensitive to the stimulating locomotor effect of nicotine and, interestingly, the impaired performance of mutant mice in learning a place task (cued version of the Morris watermaze) were improved by administration of the α7 nAChR agonist choline.

Altogether, our data suggest that nicotinic neurotransmission can be deficient in STOP KO mice and that mutant mice can represent a meaningful model for the study of some nicotinic adaptations and/or dysfunctions related to schizophrenia. Key words: cytoskeleton, dopamine, locomotion, Morris water-maze, schizophrenia, vesicular acetylcholine transporter/nicotinic receptors



INTRODUCTION

Neuronal microtubules play a key structural role in morphogenesis and protein transports in dendrites and axons. Recently, microtubules and their effectors such as microtubule-associated proteins (MAP 1B, STOP) or sequestering proteins, have been implicated in synaptic plasticity events (Andrieux et al., 2002; Shumyatsky et al., 2005; van Rossum et al., 1999; Zervas et al., 2005). Mice deficient for the protein STOP exhibit characteristics reminiscent of schizophrenia, including impaired behaviours, cognitive deficits and neurotransmission disorders combining potential hypoglutamatergia and hyperdopaminergia, some of which improved by antipsychotic treatment (Andrieux et al., 2002).

Surprisingly, STOP knock-out (KO) mice do not display any obvious disturbance of neuronal cell morphology, but exhibit synaptic abnormalities in the hippocampus. This includes depleted glutamatergic vesicle pools and highly decreased long-term potentiation and depression in the CA1 field. These mice show severe behavioural deficits, such as purposeless and disorganized activity, impaired social interactions and maternal behaviour, deficits in prepulse inhibition (PPI) of the startle reflex, hypersensitivity to mild stress and to the stimulant locomotor effect of amphetamine. STOP KO mice also display a dopamine (DA) hyper-reactivity in the limbic system (Brun et al., 2005). Whereas basal extracellular DA levels are not modified in the striatum and the nucleus accumbens of mutant mice, evoked stimulated DA release is selectively increased in the nucleus accumbens of STOP KO mice, suggesting a hyperDAergia in the meso-limbic system. Importantly, some of these dysfunctions can be alleviated by acute or chronic antipsychotic drug treatment (Andrieux et al., 2002; Brun et al., 2005). Therefore, STOP KO mice may represent a pertinent experimental model for various symptoms present in schizophrenia, in agreement with recent models in which schizophrenia arises from synaptic disorders (Frankle et al., 2003; Mirnics et al., 2001; Owen et al., 2005). Finally, a recent study shows decreased mRNA transcript levels of synaptic protein in the hippocampus of STOP KO mice, such as synaptophysin, GAP-43 and spinophilin (Eastwood et al., 2006).

Numerous data support dysfunction of nicotinic neurotransmission in several psychiatric disorders, including schizophrenia. In particular, post-mortem studies show decreased number of nicotinic receptors in various brain areas of schizophrenic patients (Breese at al., 2000; Freedman et al., 1995, 1997; Leonard et al., 2002; Martin-Ruiz et al., 2003; Milhailescu et al., 2000). Moreover, linkage studies strongly suggest that the P50 auditory sensory deficit in schizophrenia is genetically linked to the locus of the α7 nicotinic receptor gene (Freedman et al., 1997; Leonard et al., 2002). In addition, epidemiological studies show an increased tobacco intake in schizophrenic patients: 80-90% versus 25-30% in the general population (de Leon et al., 1995, 2002; Glassman et al., 1993). It is suggested that nicotine could serve as a self-medication to improve a number of cognitive deficits associated with schizophrenia, to enhance the therapeutic effect of antipsychotics, to alleviate negative symptoms and/or to reduce the side-effects of antipsychotic drugs (Kumari and Postma, 2005). Thus, deficits in sensorimotor gating, often encountered in schizophrenic patients and their first-degree relatives, is alleviated by nicotine, probably via its action through hippocampal α7 nicotinic receptors (Adler et al., 1998; Freedman et al., 1997; Siegel et al., 2005).

Nicotinic neurotransmission facilitates the activity of a wide diversity of transmitter pathways, including the mesocorticolimbic and nigrostriatal DAergic and the glutamatergic transmission (Jones et al., 1999). Nicotine acts via stimulation of its multiple nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) subtypes, widely distributed in the CNS. Beta2 nicotinic



subunits, associated with α4 or α6 subunits, are the most prominent nAChRs located on DAergic neurons (Champtiaux et al., 2003; Zhou et al., 2002) and on many GABA neurons in the areas containing DA cell bodies and terminals (Klink et al., 2001; Picciotto et al., 1998; Zhou et al., 2002). Other nAChRs, mostly α7 nAChRs, are mainly expressed on glutamatergic terminals (Mansvelder et al., 2000; Nomikos et al., 2000).

Thus, STOP KO mice, which represent a pertinent experimental model for some schizophrenic related symptoms, offer us the opportunity to characterize key-components of the cholinergic/nicotinic neurotransmission. We first determined the density of acetylcholine esterase (AChE), of vesicular ACh transporter (VAChT) and of β2*, α6* and α7 nAChRs in various brain areas of wild-type (WT) and STOP KO mice. Then, in order to evaluate the potential consequences of the modified expression of cholinergic/nicotinic markers, we chose to characterize two behaviours that involved nicotinic neurotransmission, namely nicotine-induced locomotor activity and pro-cognitive effect of the α7 nAChR agonist choline.



MATERIALS AND METHODS ANIMALS Homozygous STOP KO mice and their WT littermates were obtained from the intercross (F2) of heterozygous 50:50 BALBc/129 SvPas-F1 mice (Andrieux et al., 2002). The genotype of the mice was determined from tail biopsies as previously described (Andrieux et al., 2002). Animals were housed 4-6 per cage by gender and litter, with sawdust bedding and under standard conditions, i.e. laboratory chow and water available ad libitum, temperature and humidity maintained at 23±2°C and 55±10%, respectively, and a light cycle of a 12 h light:12 h dark (lights on at 7:30 a.m.). Experiments were carried out in accordance with the European Communities Council Directive (86/809/EEC) and approved by the local ethical committee. Mice were allowed to habituate to the animal holding room for at least one week prior to use. All experiments were conducted on naive WT and KO mice (about 60%/40% females/males), 3-4 month old and of the same litters. DRUGS Nicotine bitartrate and choline hydrochloride were purchased from Sigma-Aldrich (St Louis, MO). All drugs were dissolved in physiological serum as free bases and were administered by s.c route under a volume of 100 µl per 20 g weight. [125I]-Epibatidine (74 TBq/mmol) and 3-[125I]-iodotyrosyl-α-bungarotoxin (74 TBq/mmol) were from GE healthcare. [125I]-α-Conotoxin-MII was synthetized as previously described (Whiteaker et al., 2000). Before use, rabbit [125I]-Ig F(ab’)2 fragment antibodies (28-111 TBq/mmol, GE healthcare, Orsay, France) were purified by gel filtration onto a PD10 column (Sephadex G25 M, Pharmacia) in PBS (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 154 mM NaCl) containing 0.1% gelatin. The first 0.25 ml eluate was discarded and the following 3.5 ml eluate was put into 400 ml PBS supplemented with 3% bovine serum albumin (BSA), 1% goat serum, 1 mM NaI and 0.02% sodium azide. This solution was kept at 4°C, for 4-6 weeks. QUANTITATIVE AUTORADIOGRAPHY Mice were killed by cervical dislocation (between 10:00 a.m. and 4:00 p.m.) and their brains rapidly removed and frozen in isopentane at –30°C. Serial 10 µm coronal sections were cut at –20°C, thaw-mounted on Superfrost Plus® slides and then stored at –80°C until use. Immunoautoradiography of acetylcholine esterase (AChE) and vesicular acetylcholine transporter (VAChT) Brain sections were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 min at room temperature (RT), extensively washed with PBS and then incubated for 1 h at RT in PBS containing 3% BSA, 1% goat serum and 1 mM NaI. Sections were incubated for 2 h at RT (or overnight at 4°C) in the presence of AChE antiserum (1:1,000 dilution, polyclonal AChE antibody characterized by (Marsh et al., 1984) or VAChT antiserum (1:8,000 dilution; polyclonal antibody directed against mouse VAChT Ser478-Ser530 peptide). After washes, slides were incubated for 2 h at RT with purified anti-rabbit [125I]-IgG (370-740 MBq/100 ml). Sections were extensively washed with PBS, dried and exposed to Biomax MR films for 1-4 days. Autoradiographic determination of β2*, α6* and α7 nicotinic receptor densities To rule out possible binding of endogenous acetylcholine to nicotinic receptors, sections were pre-incubated in buffer before addition of radioactive ligands.



The labelling of β2* subunits was performed according to(Plenge and Mellerup, 1998). The slides were pre-incubated three times for 5 min at RT in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 containing 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 and 1 mM MgCl2 (Tris-ions buffer). Sections were then incubated for 40 min at RT in the same fresh buffer, in the presence of 0.4 nM [125I]-epibatidine with or without 300 µM nicotine to determine non specific binding. Slides were then washed twice for 5 min in Tris-ions buffer at 4°C, dipped in ice-cold water, dried and exposed to Biomax MR films for 2-3 days. Labelling of α6* subunits was performed according to Whiteaker et al. (2000). Slides were pre-incubated for 15 min at RT in 20 mM HEPES (4-[2-hydroxyethyl]-1-piperazine ethanesulfonic acid) buffer, pH 7.5, containing 144 mM NaCl, 1.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 (standard binding buffer), supplemented with 0.1% BSA and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. They were then incubated in the presence of 0.8 nM [125I]-α-conotoxin-MII for 2 h at RT in standard binding buffer supplemented with 0.1% BSA, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA and 1 mg/100 ml of aprotinin, leupeptin and pepstatin A (protease inhibitors). Non specific binding was determined in the presence of 1 µM epibatidine. Slides were washed for 30 sec at RT and then at 4°C in standard binding buffer plus 0.1 % BSA. Afterwards, sections were washed twice for 5 sec at 4°C in standard binding buffer with 0.01% BSA and, finally, twice for 5 sec at 4°C in 5 mM HEPES buffer pH 7.5. After dipping in ice-cold water and drying, they were exposed to Biomax MR films for 24-72 h. Labelling of α7 nicotinic receptors was performed according to Spurden et al. (1997). The slides were pre-incubated for 30 min at RT in 50 mM Tris–HCl buffer, pH 7.4, containing 0.1% BSA. Sections were next incubated for 2 h at RT in the same buffer in the presence of 0.5 nM [125I]-α-bungarotoxin, with or without 1 mM nicotine to determine non specific binding. Slides were then washed four times for 10 min in ice-cold Tris-HCl buffer, dipped in ice-cold water, dried and exposed to Biomax MR films for 1 week. Quantification of autoradiographic labelling Standard radioactive-microscales (GE healthcare) were exposed on each autoradiographic film to ensure that labelling densities were in the linear range. The autoradiograms were scanned and densitometry was performed with MCIDTM Analysis software. Labelling densities (mean grey values) of four sections per area were averaged for each mouse. BEHAVIOURAL STUDIES Locomotor activity The horizontal (locomotion) and vertical (rearing) activities were individually assessed in transparent activity cages (20x15x25 cm), with automatic monitoring of photocell beam breaks, located at 1.5 cm (horizontal activity) and 6.5 cm (vertical activity) above the floor (Imetronic, Bordeaux, France). For the dose-response analysis of nicotine and choline, locomotor activities of mice were recorded for 60 min immediately after s.c. drug administration, between 9:00 a.m. and 2:00 p.m.. Cued version of the Morris water-maze The water-maze consists of a circular stainless steel pool (150 cm diameter, 29 cm height), filled to a depth of 16 cm with 20-22 °C water made opaque using a white aqueous emulsion (Acusol® OP 301 opacifier, Rohm Ihaas, France). The escape platform (9 cm diameter), made of rough stainless steel, was submerged one cm below the water surface. The pool



was located in a sound-attenuated and brightly illuminated room. A video tracking system, including an overhead camera connected to an image analyzer and a computer (View Point, France), was used to monitor activity. Saline or choline (0.30 mg/kg, free base, s.c.) was injected and mice were tested 15 min later. In the cued version (or place task), mice were trained to find and escape onto a platform, made visible by a small contrasted ball (4.5 cm diameter) fixed 11 cm above the platform. The pool was surrounded by curtains to hide distal cues. Animals were trained with two trials per day for 5 consecutive days. The maximal latency to find the plateform is 90 sec. The first trials were conducted from 10:00 a.m., mice were left undisturbed in their home cage for the 2 hours intertrial and the second trials were from 2:00 p.m. Both the platform location and the animal's starting position were pseudo-randomized for each trial. The mean latency (sec), the mean distance travelled (m), the swimming speed (m/min) and the number of successful trials were calculated for each mouse. STATISTICAL ANALYSIS Data from autoradiographic experiments were subjected to factorial one-way analysis of variance (ANOVA), with genotype as between-group. Significant main effects were further analyzed by comparisons of means using the Fisher’s exact test. Behavioural data were subjected to factorial two-, three- or four-way ANOVA, with genotype, sex, treatment as between-group and time as within-group factors. Significant main effects were further analyzed by post-hoc comparison of means using the Fisher’s test. The numbers of successful trials in the Morris water-maze tests were compared by the Kolmogorov-Smirnov non-parametric test.



RESULTS Quantification of acetylcholine/nicotinic components

Relative densities of cholinergic markers and nicotinic receptors were determined in various brain areas of WT and STOP KO mice. No significant variation of ACh esterase (AChE) density was found in the various areas tested in STOP KO mice, compared to WT mice (Fig. 1, Table 1). The results from immunoautoradiographic labelling of vesicular ACh transporter (VAChT) showed a near significant effect of genotype in the hippocampus and the CA1 and CA3 fields (genotype x area: F(2,24)=2.68, p=0.089). The density of VAChT was significantly decreased by 17% in the entire dorsal hippocampus (F(1,8)=8.92, p=0.0174) and by 33% in the CA1 field (F(1,8)=27.50, p=0.0008) in STOP KO compared to WT mice, whereas it was not modified in the other areas tested (Fig. 1, Table 1).

In all areas tested, [125I]-epibatidine at low concentration is a specific ligand of β2* subunits (Marks et al., 2006). Its autoradiographic labelling is entirely suppressed in mice lacking the β2 subunit gene (Zoli et al., 1998) and recovered by its re-expression in the ventral tegmental area (Maskos et al., 2005). No variation of β2* nAChR subunit density was found between WT and STOP KO mice (Fig. 1, Table 2). Analysis of the relative density of α6* subunits showed a significant effect of genotype (genotype x area: F(5,54)=8.49, p<0.0001). The density of α6* subunits was significantly decreased in the striatum (-19%, F(1,10)=24.56, p=0.001), in the shell (-33%, F(1,10)=48.55, p<0.0001) and in the cone part of the nucleus accumbens (-39%, F(1,10)=65.16, p<0.0001) of STOP KO (Fig. 1, Table 2). Analysis of the α7 nAChR density showed a significant effect of genotype (genotype x area: F(10,80)=2.10, p=0.034). The density of α7 nAChR in STOP KO mice was significantly increased in the dorsolateral striatum (+24%, F(1,7)=7.16, p=0.032), in the dorsal hippocampus (+24%; F(1,9)=5.22, p=0.048), the CA1 (+51%, F(1,8)=13.22, p=0.007) and the CA3 fields (+67%, F(1,9)=7.92, p=0.020) and the lacunosum moleculare layer of hippocampus (+34%, F(1,8)=7.36, p=0.027). Density of α7 nAChRs was nearly significantly increased in the shell of the nucleus accumbens (+16%, F(1,4)=5.89, p=0.072). Effects of nicotine on the locomotor activity

In order to evaluate the potential consequences of the altered VAChT and nAChR densities, we first studied the locomotor effects of nicotine. Since male and female mice of each genotype did not show any significant difference in locomotor activity (not shown), their data were pooled. In both genotypes, acute administration of nicotine at increasing doses elicited a multi-phasic dose-dependent response on the horizontal and vertical locomotor activities (Fig. 2).

In WT mice, nicotine at 0.1 mg/kg induced a nearly significant inhibition of the horizontal activity by 32% over the first 30 min, compared to saline treatment (treatment x time: F(5,100)=2.26, p=0.0540, Fig. 2A, C). The dose of 0.5 mg/kg had no effect compared to saline treatment, but induced a significant 38% increased horizontal locomotion during the first 30 min, compared to 0.1 mg/kg (treatment x time: F(5,60)=2.38, p=0.0494). At doses greater than 0.5 mg/kg, nicotine elicited a dose-dependent hypolocomotor effect (treatment: F(3,32)=10.79, p<0.0001; treatment x time: F(33,352)=3.20, p<0.0001), with an ID50%=1.6 mg/kg and a maximal inhibition (Imax)=100%. The effects of nicotine on vertical locomotor activity were similar to those observed on the horizontal activity in WT mice (Fig. 2D). At dose higher than 0.5 mg/kg, nicotine exerted a pronounced dose-dependent hypolocomotion



(treatment: F(3,30)=6.98, p=0.001; treatment x time: F(33,330)=3.12, p<0.0001; Fig. 2D), with an ID50%=1 mg/kg and a maximal inhibition of 100%. In STOP KO mice, nicotine at 0.1 mg/kg had no effect on the horizontal activity (Fig. 2B, C). The dose of 0.25 mg/kg significantly increased the locomotion by 50% over the time course, compared to saline treatment (treatment x time: F(11,198)=2.21, p=0.0152; not shown and Fig. 2C). Nicotine at 0.5 mg/kg stimulated the horizontal activity of STOP KO mice (Fig. 2B, C) by 130% over the time course, compared to saline (treatment: F(1,18)=6.91, p=0.0170). For doses higher than 0.5 mg/kg, nicotine depressed the locomotor activity in a dose-dependent manner (treatment: F(3,30)=4.91, p=0.007; treatment x time: F(33,330)=1.48, p=0.0476), with an ID50%=1.6 mg/kg and an Imax=100%. The effects of nicotine on vertical locomotor activity were similar to those observed on the horizontal activity in STOP KO mice (Fig. 2D). Nicotine at 0.5 mg/kg significantly increased by 54% the vertical activity of mutant mice over the time course (treatment x time: F(11,132)=2;59, p=0.005). At doses greater than 0.5 mg/kg, nicotine elicited a dose-dependent hypolocomotion (treatment: F(3,25)=8.29, p=0.0005; treatment x time: F(33,275)=3.29, p<0.0001), with an ID50%=1.1 mg/kg and an Imax=100%. This demonstrated that the increased horizontal locomotion induced by nicotine at the doses of 0.25 and 0.5 mg/kg was not due to an inhibition of vertical activity. Effects of choline on the locomotor activity

Choline at the three doses tested had no effect on the horizontal (Fig. 3A, C) or the vertical (Fig. 3D) activity of WT mice. In STOP KO mice, choline significantly increased the horizontal activity in a dose-dependent manner, over the time course (treatment: F(3,26)=5.98, p=0.003; treatment x time: F(33,286)=2.51, p<0.0001; Fig. 3B, C), by 78% at 0.3 mg/kg (treatment: F(1,12), p=0.0651), by 116% at 3.0 mg/kg (treatment: F(1,13)=9.87, p=0.008, treatment x time: F(11,143)=1.798, p=0.0605) and by 166% at 30 mg/kg (treatment: F(1,13)=19.09, p=0.0008, treatment x time: F(11,143)=6.52, p<0.0001). In contrast, choline significantly inhibited the vertical activity of STOP KO mice, in a dose-dependent manner (treatment: F(3,18)=3.71; treatment x time: F(33,198)=2.27, p=0.0003; Fig. 3D), by 69% at 3.0 mg/kg (treatment x time: F(11,110)=2.91, p=0.002) and by 88% at 30 mg/kg (treatment: F(1,10)=6.70, p=0.027; treatment x time: F(11,110)=4.64, p<0.0001). Effect of choline on performance of WT and STOP KO mice in the cued version of the Morris water-maze

Animals of both genotypes received saline or 0.30 mg/kg choline, 15 min before each trial. At these time and dose, choline had no effect on the swimming speed of both WT and STOP KO mice (not shown). WT mice learned correctly the task, since the latency time and the swum distance to find the platform was decreased by 59% (F(1,16)=15.60, p=0.001) and 61% (F(1,16)=14.07, p=0.002) between day 1 and day 5, respectively (Fig. 4). In constrast, STOP KO mice did not learn correctly, as their performance were not significantly improved between day 1 and day 5. The latency time of STOP KO mice was higher than WT mice by 20% for the 5-day session (genotype x time: F(4,68)=2.39, p=0.0595) and by 42% between day 3-5 (genotype: F(1,34)=5.04, p=0.0384). Mutant mice travelled more distance to reach the platform (genotype x time: F(4,68)=2.33, p=0.0643, between day 1-5) and the number of successful trials was significantly lower (Chi2=3.200, p=0.0375, Fig. 4). Choline treatment had no effect on the performance of WT mice, since their latency and distance were not significantly modified by choline during trials. However, the number of



successful trials of WT mice was significantly increased by choline treatment (Chi2=4.350, p=0.025). In contrast, choline treatment improved the performance of STOP KO mice. Choline-treated STOP KO mice learned correctly the task, since their latency time was decreased by 54% (F(1,18)=13.25, p=0.002) and their distance by 62% (F(1,18)=32.24, p<0.0001), between day 1 and day 5. Compared to saline-treatment, choline decreased the latency time of STOP KO mice between day 1-5 (treatment x time: F(4,72)=2.30, p=0.067) and the distance (treatment x time: F(4,72)=3.35, p=0.0143). Moreover, choline treatment significantly increased the number of successful trials of STOP KO mice (Chi2=3.760, p=0.025).

Finally, performance of choline-treated STOP KO mice and saline-treated WT mice were no longer different (genotype x treatment: latency F(4,68)=0.32, distance F(4,68)=0.08, number of successful trials Chi2=0.200).



DISCUSSION

STOP KO mice have been proposed as a model for some symptoms exhibited in schizophrenia (Andrieux et al., 2002; Brun et al., 2005). The pertinence of this experimental mouse line is strengthened by recent studies showing an association between schizophrenia and polymorphism markers of the MAP6 gene, the human homologous of STOP gene (Shimizu et al., 2006). Since dysfunctions of ACh/nicotinic neurotransmission are suspected in schizophrenia and since schizophrenic patients abuse tobacco (probably as a self-medication), we decided to characterize the nicotinic phenotype of STOP KO mice. Our data demonstrate that STOP KO mice displayed important modifications in the cholinergic components, nicotinic receptors and functions. The constitutive inactivation of the ubiquitous protein STOP elicited modified VAChT and nicotinic receptor densities, in an area- and sub-type dependent-manner. Mutant mice were hypersensitive to nicotine-induced locomotor hyperactivity and, interestingly, their impaired performance in the cued version of the Morris watermaze were improved by the α7 receptor agonist, choline.

In STOP KO mice, whereas the density of AChE, the ACh inactivating enzyme, was not modified in any brain areas, the density of VAChT, the vesicular ACh transporter, was selectively decreased in the granular layer of the hippocampal CA1 field, but not modified in the CA3 field and in the median septum containing somas of cholinergic neurons. This suggests that modulation of VAChT expression depends on a specific regional/neuronal environment. Importantly, a two-fold decrease in glutamatergic synaptic vesicles has been found in CA1 field and correlated with altered synaptic transmission in this structure (Andrieux et al., 2002). No synaptic defect has been observed in CA3 field, suggesting area-dependent alterations. The decreased density of VAChT could result from a drop in the amount of cholinergic terminals and/or of vesicular transporters per vesicle and/or a global reduction in vesicle number per terminal. In any event, reduction in VAChT density might result in decreased ACh release. Interestingly, modified VAChT was located in terminals of septo-hippocampal cholinergic neurons thought to be involved in learning and memory (Leanza et al., 1995).

The relative density of β2* nAChRs was not modified in any tested area of STOP null mice. In contrast, α6 nAChR subunit density was highly decreased in the striatum and the shell and cone parts of the nucleus accumbens and α7 nAChR density was highly increased in the dorsolateral striatum and, particularly, in many layers of the dorsal hippocampus, but not in the median septum. Such opposite effects on α6* and α7 nAChR density were also found in DA transporter (DAT) KO mice, another experimental model pertinent for schizophrenia (Gainetdinov et al., 2001; Giros et al., 1996; Weiss et al., in preparation). In these mice, modifications of nAChR density are thought to originate from constitutive hyperdopaminergia.

In order to evaluate the potential consequences of the modified expression of cholinergic/nicotinic markers, we chose to characterize two behaviours that involved nicotinic neurotransmission, namely nicotine-induced locomotor activity and choline-effect on learning performance.

In WT mice, nicotine elicited a multiphasic locomotor effect, since it first depressed locomotor activity at low doses, had no effect at 0.5 mg/kg and, finally, strongly inhibited the locomotor activity for higher doses. In STOP KO mice, nicotine 0.5 mg/kg induced a two-fold increase in locomotor activity. The hypersensitivity of mutant mice to the stimulating locomotor effect of nicotine was in agreement with previous results on amphetamine (Brun et



al., 2005). In rodents, nicotine can increase locomotion in a familiar environment probably via activation of DAergic pathways through distinct nAChRs (Menzaghi et al., 1997; Picciotto et al., 2001). In our case, habituation of STOP KO mice to actimeter cages was not different from their WT counterparts (compare the time course of basal activities after saline administration, Fig. 1 A and B). On the other hand, the hypersensitivity of STOP KO mice to the stimulating locomotor effect of nicotine could be due to an enhanced DA release effect. Recent studies in STOP KO mice showed that the DA efflux evoked by electrical stimulations mimicking physiological stimulation is highly increased in the nucleus accumbens (Brun et al., 2005). Studies on various nAChR subunit KO mice indicate that nicotine exerts its DA releasing effect mainly via β2* nAChRs (Maskos et al., 2005; Picciotto et al., 1998). The relative density of nicotinic β2 subunits was not modified in STOP KO mice but their sensitization state has not been determined. Increased striatal α7 nAChRs, if they were functional, could also participate to the nicotine-induced DA release, taking into account the strategic localization of α7 nAChRs on glutamatergic terminals in DAergic areas (Kaiser and Wonnacott, 2000). Finally, other non-AChRs could mediate the hypersensitivity of STOP KO mice to the stimulant effect of nicotine.

In contrast, STOP KO mice were not hypersensitive to the depressant locomotor effect of nicotine at higher doses, unlike the hyperactive DAT KO mice (Weiss et al., in preparation). As the neuronal substrates responsible for acute nicotine hypolocomotor effects have not been fully elucidated, it is difficult to relate this data to nicotinic or non nicotinic components.

Since the density of α7 nAChRs was highly increased in the hippocampus of STOP KO mice, we first assessed spatial learning of mice in the Morris watermaze. In this version, WT mice did not learn to find the hidden platform up to an 8-day training (not shown). The bad performance of mice can be attributed to the strain (50:50 Balbc/129ScPas), since both parental strains were poor performers (van Dam et al., 2006). Accordingly, we have chosen another easier task, i.e. the cued platform version of the watermaze, in which mice were trained to swim to a platform mounted with a visible cue and placed in a different location on each trial. Such a learning is thought to be mediated by the basal ganglia, in particular the dorsal striatum (Packard and Knowlton, 2002), where α7 nAChR density was also increased in STOP KO mice. In this place task, STOP KO mice show impaired performances compared to WT littermates. Contrary to WT mice whose performance were improved during the successive trials, mutant mice did not learn correctly to find the platform during the 5-day training, as their mean latency and distance travelled were not significantly decreased between day 1 and day 5.

Numerous studies in humans and rodents demonstrate the pro-cognitive effect of nicotine, via α7 nAChR stimulation (Adler et al., 1998; Levin et al., 2002; Siegel et al., 2005; Young et al., 2004). The highly increased α7 nAChR density in the hippocampus and the dorsolateral striatum of STOP KO mice has prompted us to test the cognitive performance of mice in the Morris watermaze and the potential effect of choline, a selective α7 nAChR agonist at low doses (Matsuyama et al., 2003; Papke et al., 1996). In a first set of experiments, we assessed choline effect on the locomotor activities of mice. Whereas choline had no effect on both the horizontal and vertical activities of WT mice, choline increased the horizontal and decreased the vertical activity of STOP KO mice at doses greater than 0.3 mg/kg. These opposite and paradoxical effects were elicited by choline at relatively high doses, for which it can stimulate non-α7 nAChRs and/or can serve as substrate for the synthesis of ACh. Nevertheless, we have chosen the lowest dose of choline



(0.3 mg/kg) to test its potential effect on learning of WT and STOP KO mice. At this dose, choline had no effect on the swimming speed of mice. Choline, administered 15 minutes before trials, had no effect on the mean latency and distance travelled by WT mice, but significantly increased the number of successful trials. In contrast, choline treatment significantly improved performance of STOP KO mice, by decreasing their latency and distance travelled and increasing their number of successful trials. Altogether, the performances of choline-treated STOP KO mice were no longer different from saline-treated WT mice.

A recent report demonstrates that stimulation of both α4β2 and α7 nAChRs, by epibatidine and choline respectively, are essential for full-development of long-term potentiation in the mouse dentate gyrus (Matsuyama and Matsumoto, 2003). Literature data indicate that working memory performance of rats are improved by stimulation or co-stimulation of (α4)β2 and α7 nAChRs in the hippocampus and/or amygdala (Levin et al., 2002a, 2002b). Various studies also indicate participation of cholinergic neurotransmission of the dorsal striatum in learning in which stimulus and response are associated (Packard and Knowlton, 2002). Absence of training acquisition during the 5-day session of STOP KO mice cannot be explained by the increased α7 nAChR density in the dorsolateral striatum. This suggests that up-regulated α7 nAChRs may not be functionnal, undergoing a desensitization state or may be associated with a basal decreased ACh release. This latter hypothesis seems to be more pertinent: first, the α7 nAChR agonist choline at low dose improved the impaired performance of STOP KO mice. Second, in hippocampus, another area implicated in cognitive behaviour, up-regulated α7 nAChRs were associated with decreased density of VAChT, suggesting a reduced ACh release in this particular structure. Nevertheless, we have not measured the activity of VAChT, nor the extracellular ACh level, in both dorsolateral striatum and hippocampus of mutant mice. Another non exclusive hypothesis to explain impaired performance of STOP KO mice would be an imbalance between β2* (not modified) and α7 (increased) nAChR densities in some brain areas, in agreement with previous reports (Levin et al., 2002a). The slight effect of choline on performance of WT mice and its beneficial effect in STOP KO mice can be due to a hypersensitive response of mutant mice to the pro-cognitive effect of choline. It is also reminiscent of studies on cognitive performances in humans. Although the pro-cognitive effect of nicotine is debated in healthy human subjects, there are stronger evidences of nicotinic modulation of cognitive dysfunctions in several neuropsychiatric disorders, including Alzheimer's and Parkinson's diseases, ADHD and schizophrenia (Sacco et al., 2004). Finally, the improvement of performance of STOP KO mice by choline, probably via α7 nAChR stimulation, is reinforced by recent data of our lab showing that impaired performance of DAT KO mice in the cued version of the watermaze was improved by DMXB-A, another α7 nAChR agonist (Moutsimilli et al., in preparation).

In conclusion, our present study shows that the deletion of the widespread regulated-microtubule STOP can induce significant adaptation of the cholinergic/nicotinic neurotransmission. Altogether, our data suggest that nicotinic neurotransmission can probably be deficient in STOP mutant mice and that these mice may provide an useful experimental model to study dysfunctions related to some psychiatric symptoms, particularly schizophrenia. Such a mouse line can also be useful to test the potential benefits of various therapeutic treatments, such as nicotine or nicotinic agonists.



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Table 1: Relative density of cholinergic markers in WT and STOP KO mice

Marker Area WT KO % KO/WT AChE SNC (4) 235±7 (4) 263±14 +12% ns SNR (5) 167±9 (5) 177±10 +6% ns VTA (3) 269±13 (6) 290±11 +8% ns Striatum (6) 335±12 (5) 331±12 -1% ns Acc Shell (4) 352±23 (4) 356±16 +1% ns Acc Core (3) 295±15 (4) 294±22 0% Acc Cone (4) 405±16 (5) 364±18 -10% ns Dorsal Hipp (6) 57±1 (5) 60±3 +5% ns CA1 (5) 90±3 (5) 88±4 -2% ns CA3 (6) 71±4 (6) 73±5 +3% ns VAChT SN ND ND VTA ND ND Striatum (6) 182±10 (6) 181±7 -1% ns Acc Shell (6) 224±18 (6) 233±20 +4% ns Acc Core (6) 156±9 (6) 166±8 +6% ns Acc Cone (6) 259±13 (6) 261±11 +1% ns Dorsal Hipp (5) 39.5±1.6 (5) 32.8±1.6 -17% * CA1 (5) 30.6±1.3 (5) 20.6±1.4 -33% *** CA3 (5) 46.8±2.9 (5) 48.7±5.1 +4% ns Septum (6) 180±13 (6) 154±15 -14% ns

Densities are the means ± SEM of immunolabelling in arbitrary units. The number of mice is indicated in parentheses. ND, not detectable; Acc, nucleus accumbens; AChE, acetylcholine esterase; CA1, CA1 field of hippocampus; CA3, CA3 field of hippocampus; Dorsal Hipp, dorsal hippocampus; SN, substantia nigra; SNC substantia nigra, pars compacta; SNR, substantia nigra, pars reticulata; VAChT, vesicular acetylcholine transporter; VTA, ventral tegmental area; ns: non significant. Fisher's test: *p<0.05; ***p<0.001.



Table 2: Relative density of nicotinic receptors in WT and STOP KO mice

Receptor Area WT KO % KO/WT β2* SN (5) 126±5 (4) 119±11 -6% ns VTA (5) 333±16 (4) 313±13 -6% ns Striatum (6) 242±12 (6) 215±18 -11% ns Acc Shell (6) 193±11 (6) 211±2 +9% ns Acc Core (5) 166±9 (5) 180±11 +8% ns Dorsal Hipp (6) 133±10 (6) 126±6 -5% ns Cing Cx (5) 225±5 (4) 216±10 -4% ns α6* SNC (5) 155±9 (4) 156±9 0% VTA (4) 225±27 (5) 210±21 -7% ns Striatum (6) 179±6 (6) 145±4 -19% *** Acc Shell (6) 225±7 (6) 151±8 -33% *** Acc Core (6) 192±5 (6) 173±10 -10% ns Acc Cone (6) 303±10 (6) 183±11 -40% *** α7 SN (5) 50.0±4.9 (5) 48.0±8.3 -4% ns VTA (6) 143±11 (4) 132±20 -8% ns Str DL (5) 65.0±4.7 (4) 80.4±2.4 +24% * Acc Shell (3) 15.5±0.8 (3) 18.0±0.7 +16% # Acc Core (4) 16.1±1.4 (4) 17.0±2.3 +6% ns Dorsal Hipp (6) 74.2±3.3 (5) 92.2±10.3 +24% * CA1 (6) 44.1±4.2 (4) 66.8±4.2 +51% ** CA3 (6) 58.3±3.6 (5) 97.5±14.8 +67% * L Mol (6) 92.8±7.1 (4) 124.0±10.0 +34% * Septum (4) 34.2±4.0 (3) 43.0±4.2 +26% ns Cing Cx (5) 35.2±2.4 (4) 32.5±2.8 -8% ns

Densities are the means ± SEM of specific radioligand binding in arbitrary units. The number of mice is indicated in parentheses. Acc, nucleus accumbens; CA1, CA1 field of hippocampus; CA3, CA3 field of hippocampus; Cing Cx, cingulate cortex; Dorsal Hipp, dorsal hippocampus; L Mol, lacunosum moleculare layer of hippocampus; SN, substantia nigra; SNC substantia nigra, pars compacta; Str DL, dorsolateral striatum; VTA, ventral tegmental area. ns: non significant. Fisher's test: # p<0.08; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.



LEGENDS TO FIGURES

Fig.1: Autoradiographic representation of acetylcholine esterase (AChE), vesicular acetylcholine transporter (VAChT), β2*, α6* and α7 nicotinic receptors in WT and STOP KO mice. Acb C: nucleus accumbens, core; Acb S: nucleus accumbens, shell; CA1 or CA3: CA1 or CA3 layer; Hip: hippocampus; L Mol: Lacunosum Moleculare layer; Str: striatum. Fig. 2: Effects of nicotine administration on the locomotor activity of WT and STOP KO mice. Time course of the horizontal activity of WT (A) and STOP KO (B) mice after s.c. administration of nicotine (Nic) at increasing doses. Means ± SEM of photocell counts over a 5 min period. Dose-response effects of nicotine administration on the horizontal (C) and vertical (D) locomotor activities of WT and STOP KO mice. Data represent means ± SEM of photocell counts over a 60 min period, expressed as percentages of respective basal activities (65.5±9.0 and 63.3±7.0 counts/60 min for horizontal activity of WT and STOP KO, respectively; 299±60 and 246±55 counts/60 min for vertical activity of WT and STOP KO mice, respectively). Number of mice in parentheses, Sal (15 WT, 13 KO), Nic (7 WT or KO per dose). Fisher's test: ∗ p<0.05, ∗∗ p<0.01, ∗∗∗ p<0.0001 compared to the saline group of the same genotype; # p<0.05, ## p<0.005, ### p<0.0001, comparison between genotypes. Fig. 3: Effects of choline administration on the locomotor activity of WT and STOP KO mice. Time course of the horizontal activity of WT (A) and STOP KO (B) mice after s.c. choline administration at various doses. Means ± SEM of photocell counts over a 5 min period for 7-8 mice per dose. Dose-response effects of choline administration on the horizontal (C) and vertical (D) locomotor activities in WT and STOP KO mice. Data represent means ± SEM of photocell counts over a 60 min period, expressed as percentages of respective basal activity (61.6±6.0 and 35.7±8.0 counts/60 min for horizontal activity of WT and STOP KO, respectively; 101±36 and 151±51 counts/60 min for vertical activity of WT and STOP KO mice, respectively). Fisher’s test: ∗∗ p<0.01, ∗∗∗ p<0.0001 compared to the saline group of the same genotype; # p<0.05, ## p<0.005, ### p<0.0001, comparison between genotypes. Fig. 4: Effect of choline treatment on performance of WT and STOP KO mice in the cued version of watermaze. 15 Min before each trial, mice received s.c. administration of saline (Sal) or choline 0.3 mg/kg (Chol). Performance of mice are expressed as latency (seconds, s) and mean distance travelled (meters, m) to find the platform and proportion of successful trials. Values are means ± SEM for 9 (WT Sal), 10 (KO Sal and KO Chol) and 11 (WT Chol) mice.











ARTICLE II : Altérations préférentielles du système dopaminergique limbique des souris STOP KO

Caroline Bouvrais-Veret, Stéphanie Weiss, Naima Hanoun, Annie Andrieux, Annie

Schweitzer, Didier Job, Michel Hamon, Bruno Giros et Marie-Pascale Martres

Manuscrit en préparation



Contexte de l’étude

Au sein des neurones, les microtubules et les protéines associées jouent un rôle

dans la stabilisation et la plasticité synaptique (van Rossum and Hanisch, 1999). Les souris

invalidées pour la protéine STOP n’ont pas de défaut anatomique évident mais montrent des

anomalies de plasticité synaptique dans l’hippocampe (Andrieux et al., 2002) et une

diminution de l’expression des transcrits de certaines protéines synaptiques (Eastwood, sous

presse). Elles montrent également des déficits comportementaux, comme une activité

désorganisée, des interactions sociales diminuées, un déficit du filtrage sensori-moteur (PPI)

une hypersensibilité au stress et à l’amphétamine (Andrieux et al., 2002; Brun et al., 2005;

Fradley et al., 2005). Récemment, Brun et collaborateurs (2005) ont montré que les souris

mutantes présentaient une altération du système dopaminergique. La transmission de base

est normale mais une stimulation évoquée des fibres dopaminergiques provoque une

augmentation de l’efflux de dopamine, spécifiquement au niveau du noyau accumbens.

Ces données, en accord avec le fait qu’une partie des déficits est améliorée par des

neuroleptiques, suggèrent que ces souris partagent certaines caractéristiques associées à la

schizophrénie d’autant plus que cette maladie psychiatrique semblerait liée à des défauts de

connectivité synaptique (Owen et al., 2005). D’ailleurs, un polymorphisme du gène MAP6,

homologue humain du gène murin STOP, a récemment été associé à une population de

schizophrènes japonais (Shimizu et al., 2006).

Dans cette étude, nous nous proposons d’examiner certains composants clés du

système dopaminergique des souris STOP KO. Nous avons tout d’abord déterminé la

densité de récepteurs D1, D2, D3 ainsi que celles du transporteur DAT et du transporteur

vésiculaire des monoamines VMAT2 dans plusieurs régions cérébrales. Nous avons

également mesuré les taux endogènes de dopamine et l’activité de son enzyme de

synthèse, la tyrosine hydroxylase. Ensuite, nous avons déterminé les paramètres cinétiques

du DAT. Enfin, nous avons examiné la réponse locomotrice de ces animaux à la cocaïne,

ainsi que la sensibilisation comportementale induite par cette drogue.



Principaux résultats

• Les densités relatives de certains marqueurs dopaminergiques sont modifiées dans le cerveau des souris STOP KO (figure 1, tableau 1)

Les densités du DAT et de VMAT2 ne sont pas modifiées dans le cerveau des souris

STOP KO. Aucune différence significative de densité n’a été trouvée pour le récepteur D1.

La densité du récepteur D2 est diminuée de manière significative au niveau des terminaisons

dopaminergiques, striatum et accumbens (-20 à -30%) et celle du récepteur D3 est diminuée

dans l’aire tegmentale ventrale (-40%), alors qu’elle n’est pas modifiée dans la substance

noire.

• Ni le couplage des récepteurs D1 aux protéines G, ni celui des récepteurs D2/D3, mesurés par liaison de [35S]-GTP, ne sont significativement modifiés chez les STOP KO (figure 2, tableau 2)

• Les taux endogènes de dopamine et de ses métabolites sont diminués dans certaines régions cérébrales des souris STOP KO (tableau 3)

Contrairement aux régions à corps cellulaires dopaminergiques (substance noire +

aire tegmentale ventrale), les taux endogènes de dopamine et de ses principaux métabolites,

HVA et DOPAC, sont significativement diminués au niveau des terminaisons

dopaminergiques des souris STOP KO, avec une amplitude au niveau du noyau accumbens

(-50 à -60%) significativement plus importante que dans le striatum. Dans le cortex

préfrontal, seul le niveau du métabolite DOPAC est diminué de manière significative.

• L’activité de la tyrosine hydroxylase (TH) est réduite dans les régions dopaminergiques des souris STOP KO (tableau 4)

L’activité de la TH a été déterminée in vivo, par mesure des taux de L-DOPA

accumulés après inhibition de la dopa-décarboxylase. L’activité de la TH est

significativement diminuée dans les corps cellulaires et les terminaisons dopaminergiques (-

20 à -30%), de façon plus importante dans le noyau accumbens par rapport au striatum.

Aucune différence significative d’activité n’est à noter dans le cortex préfrontal.



• La capacité maximale de transport (Vmax) est diminuée dans le noyau accumbens des souris STOP KO (figure 3)

Les paramètres cinétiques du DAT ont été mesurés par capture de [3H]-dopamine par

des synaptosomes de striatum et de noyau accumbens. Dans le striatum, l’affinité du DAT

pour la dopamine est significativement moins grande chez les souris STOP KO. Dans cette

même région, la capacité maximale de transport (Vmax) du DAT des animaux mutants n’est

pas significativement différente, bien que la vitesse de capture des souris STOP KO soit

systématiquement plus grande que celle des souris sauvages, à toutes les concentrations de

dopamine utilisées. Dans le noyau accumbens, la Vmax des souris STOP KO est

significativement diminuée (-24%). D’autre part, l’affinité du DAT pour la dopamine est

significativement plus faible dans le noyau accumbens que dans le striatum.

• Les souris STOP KO sont hypersensibles à l’effet hyperlocomoteur de la cocaïne (figure 4)

L’activité locomotrice horizontale des souris sauvages augmente de manière

significative en réponse à une dose de 25 mg/kg de cocaïne. En revanche, celle des souris

STOP KO est significativement plus forte dès la dose de 10 mg/kg de cocaïne et augmente

de manière dose-dépendante.

• La constante d’inhibition du DAT pour la cocaïne n’est pas significativement modifiée chez les souris STOP KO (figure 5)

Nous avons mesuré les paramètres d’inhibition du DAT par la cocaïne par des

expériences de capture de [3H]-dopamine dans des synaptosomes de striatum et de noyau

accumbens, issus de souris sauvages et STOP KO. La concentration de cocaïne qui inhibe

de moitié l’effet maximal de la cocaïne (CI 50) n’est pas significativement différente entre les

deux génotypes de souris pour les deux régions analysées. Par contre, pour les deux

génotypes de souris, la CI 50 est significativement plus forte dans le noyau accumbens que

dans le striatum.

• Les souris STOP KO développent une sensibilisation comportementale à une faible dose de cocaïne, contrairement aux souris sauvages (figure 6)

Pendant les cinq jours de la phase d’initiation, les animaux montrent une

sensibilisation comportementale à la cocaïne, qui n‘est significative que pour les souris

sauvages. Après un sevrage de vingt jours, l’hyperactivité locomotrice induite par la cocaïne

n’est pas significativement différente entre les souris sauvages traitées au sérum



physiologique versus cocaïne. Au contraire, l’hyperactivité locomotrice des souris STOP KO

induite par la cocaïne est significativement plus forte pour les animaux traités par la cocaïne

versus sérum physiologique.

Conclusions de l’étude Cette étude révèle des altérations de la densité et/ou de la fonction de certains

composants du système dopaminergique, en accord avec des anomalies déjà observées par

Brun et collaborateurs (2005). L’hyper-réactivité dopaminergique des souris STOP KO dans

le noyau accumbens décrite par cette équipe pourrait être en partie expliquée par la baisse

de la capacité de transport du DAT dans cette région, baisse qui ne devient apparente que

pour les fortes concentrations de dopamine. Par contre, l’hypersensibilité des animaux

mutants à l’effet hyperlocomoteur de la cocaïne, en accord avec leur hypersensibilité à

l’amphétamine (Brun et al., 2005) ne peut être liée à une meilleure affinité du DAT pour cette

drogue. Remarquons enfin que l’inactivation de la protéine ubiquitaire STOP donne lieu à

des altérations sélectives à la fois des composants dopaminergiques et des régions

cérébrales. Ces différents points seront développés dans le chapitre discussion.



Preferential alterations of dopaminergic accumbic system in STOP knock-out mice

Caroline Bouvrais-Veret1, Stéphanie Weiss1, Naima Hanoun2, Annie Andrieux3, Annie

Schweitzer3, Didier Job3, Michel Hamon2, Bruno Giros1 and Marie-Pascale Martres1#

1Inserm, U513, Créteil, F-94000 France ; Univ Paris 12, Créteil, F-94000 France. 2Inserm,

U677, Paris, F-75000 France ; Univ Paris 6, Paris, F-75000 France. 3Inserm, U366, CEA,

Grenoble, F-38000 France.

Running title: Accumbic DA system in STOP null mice

Key words: cytoskeleton, cocaine, dopaminergic transporters and receptors, synaptosomes,

schizophrenia, tyrosine hydroxylase

#Correspondence should be addressed to Marie-Pascale Martres, Inserm U513, Laboratoire

de Neurobiologie et Psychiatrie, 8 rue du Général Sarrail, Créteil, F-94010 France. e-mail :

[email protected]

Acknowledgements: The authors thank Dr M. Nosten-Bertrand (Inserm U513) for helpful discussion and D. Proietto (Inserm U366) for mouse genotyping. This work was supported by grants from Inserm. C. Bouvrais-Veret was the recipient of a grant from the "Mission Interministérielle de Lutte contre la Drogue et la Toxicomanie" (MILDT, France), S. Weiss from the "Société de Tabacologie" (France).



INTRODUCTION

Microtubules are key cytoskeleton components particularly abundant in neurons, where they play a role in morphogenesis and protein transport in dentrites and axons. Previous work has indicated a central role of microtubule associated proteins called STOPs (Stable Tubule Only Polypeptides or MAP 1B) in neuronal stabilization and in synaptic plasticity (Bosc et al., 1996; Guillaud et al., 1998; van Rossum and Hanisch, 1999). Unexpectedly, the recently developed mouse line deficient for the protein STOP do not display any detectable defects in brain anatomy, but exhibit synaptic defects in hippocampus, such as depleted glutamatergic vesicle pool and highly decrease in long-term potentiation and depression (LTP and LDP, respectively; Andrieux et al., 2002). STOP knock-out (KO) mice show severe behavioural disturbances, such as purposeless and disorganized activity, impaired social interactions and maternal behaviour, deficit in prepulse inhibition (PPI) of the startle reflex, hypersensitivity to mild stress and to the stimulant locomotor effect of amphetamine (Andrieux et al., 2002; Brun et al., 2005; Fradley et al., 2005). STOP KO mice also display hyperdopaminergia, preferentially in the limbic dopaminergic (DA) system (Brun et al., 2005). These authors show that, whereas basal extracellular DA level is not modified in the striatum and the nucleus accumbens, evoked stimulated DA release is selectively increased in the nucleus accumbens. Some of the behavioural and synaptic deficits of STOP KO mice can be partly restored by chronic or acute antipsychotic drug treatment (Andrieux et al., 2002; Brun et al., 2005; Fradley et al., 2005). Finally, a recent study shows decreased levels of mRNA transcripts of synaptic proteins in STOP KO mice, such as synaptophysin, GAP-43 and spinophilin (Eastwood et al., 2006). Altogether, the behavioural disturbances, the hyperDAergia in limbic system, the indirect evidence of a decreased glutamatergic neurotransmission and the fact that some of these defects are improved by antipsychotics suggest that STOP KO mice may represent a pertinent experimental model for schizophrenia.

Various evidence suggest that schizophrenia is associated with alterations of neuronal architecture, particularly in the synaptic connectivity (Benitez-King et al., 2004; Frankle et al., 2003; Mirnics et al., 2001; Owen et al., 2005b). Recently, the protein DISC1 (Disrupted-In-Schizophrenia 1) has been demonstrated to bind with microtubules and its truncation in schizophrenic patients contributes to impair intraneuronal transport, neurite cytoarchitecture and/or neuronal migration (Morris et al., 2003; Owen et al., 2005a; Ishizuka et al., 2006). Furthermore, the MAP6 gene, the human homologous of STOP gene, is localized on chromosome 11q14, a region highly associated with schizotypal personality disorders (Lewis et al., 2003). Interestingly, recent study shows association between single nucleotide polymorphism markers of the MAP6 gene (human homologous of STOP gene) and schizophrenia (Shimizu et al., 2006). The authors equally report an up-regulation of isoform 2 of MAP6 transcripts in the prefrontal cortex of schizophrenic patients.

Thus, the STOP KO mice, which represent a pertinent experimental model for some schizophrenic related symptoms, are likely to be informative to precisely characterize key-components of the DAergic neurotransmission. We determined in various brain areas of wild-type (WT) and mutant mice the density of the DA transporter (DAT), the vesicular monoamine transporter (VMAT2) and the D1, D2 and D3 DAergic receptors. We measured the endogenous DA and metabolite levels and the in vivo DA synthesis activity in various brain areas containing DAergic cell bodies and terminals. We performed studies of DA uptake by striatal and accumbic synaptosomes, as well as its inhibition by cocaine. Finally, we assessed the effect of acute cocaine on the locomotor activity of WT and STOP KO mice, as well as the cocaine-induced behavioural sensitization.



MATERIAL AND METHODS Animals Homozygous STOP KO mice and their WT littermates were obtained from the intercross (F2) of heterozygous 50:50 BALBc/129 SvPas-F1 mice. The genotype of the mice was determined from tail biopsies as previously described (Andrieux et al., 2002). Animals were housed 4-6 per cage by gender and litter, with sawdust bedding and under standard conditions, i.e. laboratory chow and water available ad libitum, temperature and humidity maintained at 23±2°C and 55±10%, respectively, and a light cycle of a 12 h light:12 h dark (lights on at 7:30 a.m.). Experiments were carried out in accordance with the European Communities Council Directive (86/809/EEC) and approved by the local ethical committee. Mice were allowed to habituate to the animal holding room for at least one week prior to use. All experiments were conducted on naive WT and KO mice (about 60%/40% females/males), 3-4 month old and of the same litters. Drugs (±)-Butaclamol hydrochloride, 1,3-di-o-tolylguanidine, dopamine hydrochloride, SKF38393 hydrochloride, were purchased from Sigma-Aldrich (Saint Quentin, Fallavier). Quinpirole hydrochloride, sulpiride, SCH23390 were purchased from Tocris Cookson (Bristol, UK). Nomifensine maleate was purchased from RBI (Natick, USA) and cocaine chlorydrate was from Cooper (France). All drugs were dissolved in 0.9% NaCl as free bases and were administered by s.c. or i.p. route under a volume of 100 µl per 20 g weight. [125I]-Iodosulpride (74 TBq/mmol), [35S]-GTP-γ-S (37 TBq/mmol), [3H]-dopamine (1.6 TBq/mmol) and [N-methyl-3H]SCH 23390 (2.2-3.3 TBq/mmol) were from GE Healthcare (Orsay, France). [125I]-R(+)trans-7-hydroxy-2-[N-(3’-iodo-2’-propenyl)amino] tetralin ([125I]-7-OH-PIPAT, 74 TBq/mmol) from Perkin Elmer-NEN (Orsay, France). Before use, rabbit [125I]-Ig F (ab’)2 fragment antibodies (28-111 TBq/mmol, GE Healthcare, Orsay, France) were purified by gel filtration onto a PD10 column (Sephadex G25 M, Pharmacia) in PBS (50mM NaH2PO4/Na2H PO4, 154 mM NaCl) containing 0.1% gelatin. The first 0.25 ml eluate was discarded and the following 3.5 ml eluate was put into 400 ml PBS supplemented with 3% bovine serum albumin (BSA), 1% goat serum, 1 mM NaI and 0.02% sodium azide. This corresponds to a concentration of 10-20 µCi/100 ml, for a freshly synthetized [125I]-IgG batch. This solution was kept at 4°C, for 4-6 weeks. Quantitative autoradiography Slices Mice were killed by cervical dislocation and their brains were then rapidly removed and frozen in isopentane at -30°C. Serial coronal sections (10 µm, 4 sections per slide) were cut at -20°C, thaw-mounted on Superfrost Plus® slides and stored at -80°C until use. To rule out binding of endogenous DA to its receptors, sections were pre-incubated in buffer, before addition of radioactive ligands. Immunoautoradiography of dopamine transporter (DAT) and vesicular monoamine transporter (VMAT2) Brain sections were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 min at room temperature (RT), washed with PBS (50 mM NaH2PO4/Na2H PO4, 154 mM NaCl) and then incubated for 1h at RT in PBS containing 3% BSA, 1% goat serum and 1 mM NaI. Sections were incubated for 2h at RT in the presence of DAT antiserum (1:20,000 dilution, according to Martres et al., 1998) or polyclonal VMAT2 antibody (1:1500 dilution). After extensive washes, slides were incubated overnight at 4°C with purified anti-rabbit [125I]-IgG (10-20 µCi/100ml). Sections were washed with PBS, dried and exposed to Biomax MR films for 1-4 days.



Autoradiographic determination of DAergic D1, D2 and D3 receptor densities Labelling of D1 receptors was performed according to Fernagut et al (2003). The slides were pre-incubated for 20 min at RT in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 containing 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 and 1 mM MgCl2 (Tris-ions buffer). The slides were then incubated for 90 min at RT in a fresh Tris-ions buffer containing 3 nM [3H]-SCH23390, with or without 10 µM butaclamol to determine non-specific binding. After 4 washes for 5 min with ice cold Tris-ions buffer, sections were dipped in ice-cold water and dried. The slides were exposed to BAS-TR Fuji Imaging screen for 72 h and the screens were scanned with a Fuji Bioimaging Analyzer BAS-5000. Labelling of D2 receptors was done as previously described (Martres et al 1985). The slides were pre-incubated three times for 5 min at RT in Tris-ions buffer supplemented with 0.1% bovine serum albumin (BSA) and 0.57 mM ascorbic acid and then incubated for 60 min at RTin the same fresh Tris-ions buffer in the presence of 0.2 nM [125I]-iodosulpride, with or without 10 µM apomorphine to determine non-specific binding. Sections were washed as described for D1 receptor labelling and exposed to Biomax MR film (GE Healthcare) for 24-72 h. Labelling of D3 receptors was performed according to Stanwood et al (2000) and modified as follows: the slides were pre-incubated three times for 5 min at RT in 50 mM HEPES buffer, pH 7.4, supplemented with 1 mM EDTA, 2.8 mM ascorbic acid, 0.1% BSA, 100 µM GTP (to dissociate D2 receptors from G proteins) and 25 µM 1,3-di-o-tolylguanidine (to dissociate ligand from receptors). Then, sections were incubated for 60 min at RT in fresh buffer in the presence of 0.25 nM [125I]-7-OH-PIPAT, with or without 10 µM dopamine to determine non-specific binding. Sections were washed four times for 15 min in ice-cold HEPES buffer, dipped in ice-cold water, dried and exposed to Biomax MR films for 24 h. Quantitative autoradiography of [35S]GTP-γ-S binding Autoradiography of agonist-stimulated [35S]GTP-γ-S binding was performed according to slight modifications of published procedures (He et al., 2000). Briefly, sections were preincubated at RT for 20 min in 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid) supplemented with 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA and 0.2 mM dithiothreitol and then incubated for 15 min in the same buffer with 2 mM guanosine-5'-diphosphate. Thereafter, sections were incubated for 1 h at RT in the same buffer with 0.05 nM [35S]GTP-γ-S with 0.3 mM SKF38393 for D1 receptor stimulation and of 0.3 mM quinpirole for D2/D3 receptor stimulation. Non-specific binding was determined in the presence of 0.2 mM SCH23390 or 1 mM sulpiride, respectively. Sections were then washed twice for 5 min in ice-cold 50 mM HEPES buffer, dipped in ice-cold water, dried and exposed to Biomax MR films for 15-20 h. Quantification Standard radioactive-microscales (Amersham) were exposed on each autoradiographic film to ensure that densities of the labellings were in the linear range. After scanning autoradiograms, densities were analyzed with Multi Gauge software or MCIDTM Analysis software for [3H]- or [35S]- and [125I]-radioligand, respectively. The values, in arbitrary units (mean grey values), of the densities of the labellings of 4 sections per area were averaged to give one value per animal. Determination of endogenous DA levels and in vivo tyrosine hydroxylase activity The levels of endogenous DA, its precursor L-DOPA and its metabolites DOPAC and HVA were determined as already described (Martres et al., 1998). Briefly, brain areas were weighted and homogenized in cold 0.1 M HClO4 supplemented with 0.05% EDTA and 0.05% Na2S2O2 and centrifuged at 450,000 gxmin at 4 °C. 200 µl aliquots were neutralized with 2



M KH2PO4/K2HPO4, pH 7.4 containing 0.01 mg/ml ascorbate oxidase and centrifuged at 300,000 gxmin. Aliquots (10µl) of the clear supernatant were injected into a high-performance liquid chromatography (HPLC) column (Ultrasphere IP, Beckman, Gagny, France; 25x4.6 cm, C18 reversed-phase, particle size 5 µm) protected with a Brownee precolumn (3 cm, 5 µm). The mobile phase for the elution (flow rate of 1 ml/min) consisted of 70 mM KH2PO4, 2.1 mM triethylamine, 0.1 mM EDTA, 1.25 mM octane sulphonate and 16% methanol, adjusted to pH 3.02 with solid citric acid. The electrochemical detection system (ESA 5011, Bedford, USA) comprises an analytical cell with dual coulometric monitoring electrodes (+50 mV and +350 mV). The generated signal was integrated by a computing integrator (Millenium32- Waters, Saint Quentin en Yvelines, France). Quantitative determinations were made using appropriate standards. For the in vivo measurement of tyrosine hydroxylase activity, animals were i.p. injected with 100 mg/kg NSD 1015, 30 min before sacrifice. Endogenous L-DOPA, DA and its metabolites were measured as described. Uptake on synaptosomes 3-4 striata or nucleus accumbens were homogenized in 15-20 volumes (v/w) of 0.32 M sucrose with a glass-Teflon potter. Homogenates were diluted to 40 volumes with 0.32 M sucrose, centrifuged at 10,000 gxmin and the resulting supernatants were centrifuged again at 300,000 gxmin. The pellets were gently resuspended in 50 volumes of 0.32 M sucrose and 25 µl aliquots were incubated in a final volume of 500 µl buffer containing 4 mM Tris-HCl, 6.25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, 1.2 MgSO4, 5.6 mM D-glucose and 0.5 mM ascorbic acid, pH 7.4. For saturation experiments, synaptosomes were incubated in the presence of 10 nM [3H]-dopamine and increasing concentrations of DA. For inhibition cocaine experiments, synaptosomes were incubated in the presence of 10 nM [3H]-dopamine with or without cocaine at increasing concentrations. In all cases, non specific uptake was determined in the presence of 30 µM nomifensine. After 7 min at 37 °C, samples were diluted with 3 ml of cold buffer and rapidly filtered through Whatman GF/B glass-fibers presoaked with 0.05% polyethylenimine. After three washes with 3 ml of cold buffer, filters were dried and the entrapped radioactivity counted by liquid scintillation spectrometry. Proteins were quantified as described by Lowry et al. (1951). Behavioural studies Acute effect of cocaine The horizontal (locomotion) and vertical (rearing) activities were assessed in transparent activity cages (20x15x25 cm), with automatic monitoring of 8 photocell beam breaks, located at 1.5 cm (horizontal activity) and 6.5 cm (vertical activity) above the floor (Imetronic, Bordeaux, France). Mice were allowed to habituate to actimeter cages, 20 min before i.p. administration of saline or cocaine at increasing doses. Their locomotor activity was further recorded for 50 min. Behavioural sensitization to cocaine Mice were allowed to habituate to actimeter cages during 20 min before administration of the drug. Animals of both genotypes received saline or cocaine (10 mg/kg) for 5 consecutive days (initiation phase) and their locomotor activity was recorded for 60 min. 20 Days after the last saline or cocaine administration (day 25), all pre-treated mice received saline and their locomotion was recorded. On day 26 (expression phase), all mice received cocaine (10 mg/kg) and their locomotion was further recorded for 60 min.



Statistical analysis For autoradiographic quantifications, determination of endogenous DA and metabolite levels and tyrosine hydroxylase activity, data were subjected to factorial two-way analysis of variance (ANOVA), with genotype as between-group. Significant main effects were further analyzed by comparison of means using the Fisher’s test. The kinetic parameters from uptake experiments on synaptosomes, i.e. KM, IC50% and VM were calculated by non linear regression using PRISM software. Behavioural data were subjected to factorial two-, three- or four-way ANOVA, with genotype, sex and treatment as between-group and time as within-group factors. Significant main effects were further analyzed by post-hoc comparison of means using the Fisher’s exact test.



RESULTS Relative density of dopaminergic transporters and receptors in various areas of WT and STOP KO mice

The relative density of the DA transporter (DAT), the vesicular monoamine transporter (VMAT2) and of the three main DA receptors D1, D2 and D3 were determined in various brain areas of WT and STOP KO mice (Fig. 1 and Table 1). The density of the DAergic markers varied in a sub-type- and area-dependent manner. The density of DAT and VMAT2 were not modified in the various areas tested in STOP KO mice. The relative density of the DAergic D1 receptors was not altered in any of the areas tested in STOP KO mice, whereas the density of D2 receptors was significantly decreased by 20%-30% in the striatum and the core and the shell parts of the nucleus accumbens. The D2 receptor density was not modified in the DAergic cell bodies, substantia nigra and ventral tegmental area. The density of D3 receptors were significantly decreased by 37% in the ventral tegmental area, while its density was not modified in the substantia nigra and in the DAergic terminal areas, striatum and nucleus accumbens. D1 and D2/D3 receptor-mediated binding of [35S]-GTP-γ-S in various areas of WT and STOP KO mice

The binding of [35S]-GTP-γ-S mediated by the stimulation of D1 receptors with the agonist SKF38393, or by the stimulation of D2/D3 receptors with quinpirole, was quantified in various areas of WT and STOP null mice (Fig. 2 and Table 2). No variation was found in the amplitude of the [35S]-GTP-γ-S binding, when stimulated by D1 or D2/D3 agonist, in any area tested in STOP KO mice, compared to WT mice. Endogenous levels of DA and its metabolites DOPAC and HVA in various areas of WT and STOP KO mice

The levels of endogenous DA and its two main metabolites DOPAC and HVA were compared in DAergic areas of WT and STOP KO mice (Table 3). No variation in DA and metabolite levels was found between mice of the two genotypes, in the substantia nigra and ventral tegmental area, where the DAergic cell bodies are localized. In contrast, the level of endogenous DA was significantly decreased in the striatum (39%, p=0.0063) and in the nucleus accumbens (63%, p=0.0023). The levels of DOPAC and HVA were also decreased to the same extent as DA, so that the ratio between metabolites and DA was not modified in the two DAergic terminals of STOP KO mice. Interestingly, the amplitude of the decrease of DA level was significantly higher in the nucleus accumbens than in the striatum (p=0.0005). In the prefrontal cortex, only the DOPAC level was significantly decreased (26%, p=0.0162), suggesting a decreased intracellular metabolism of endogenous DA. Determination of the in vivo activity of the tyrosine hydroxylase in various areas of WT and STOP KO mice

In order to determine the mechanism responsible for the drop in DA and metabolites concentration, we measured the in vivo synthesis of DA. The in vivo activity of the tyrosine hydroxylase (TH) was determined by the L-DOPA accumulated after inhibition of the DOPA decarboxylase activity (Table 4). In all areas, the respective endogenous levels of L-DOPA were subtracted from L-DOPA accumulated 30 min after NSD 1015 administration. Basal endogenous L-DOPA levels represented 7% of total L-DOPA in the substantia nigra plus the ventral tegmental area, in the striatum and in the nucleus accumbens and 15% in the prefrontal cortex (not shown).

The levels of accumulated L-DOPA were significantly reduced by 20%-30% in the substantia nigra plus the ventral tegmental area, in the striatum and in the nucleus



accumbens of STOP KO mice, suggesting a decreased TH activity in both DAergic cell bodies and terminals. In contrast, no variation was found in the prefrontal cortex. DA uptake on synaptosomes from the striatum and the nucleus accumbens of WT and STOP KO mice

In order to evaluate a potential modulation of the DA transporter (DAT) activity, the kinetic parameters of the [3H]-DA uptake were determined on synaptosomes from the striatum and the nucleus accumbens of mice of both genotypes (Fig. 3). In striatal synaptosomes, the Vmax for STOP KO mice was not significantly different from WT mice (Vmax= 19.4±2.4 and 24.5±2.1 pmol/mg prot/min for WT and KO mice, respectively), contrary to the Km, which was higher for KO mice (Km= 50.4±5.7 and 73.4±2.1 nM for WT and KO mice, respectively for three independent experiments). However, uptake of [3H]-DA, at all concentrations tested in mutant mice, was systematically higher, although not significantly, reaching a near significantly increase (26%, p=0.083) at 100 nM [3H]-DA. In contrast, in accumbic synaptosomes, the maximal uptake rate was significantly decreased in STOP KO mice compared to WT mice, without significant modification of DA affinity, i.e. Vmax= 18.5±1.3 and 14.1±0.6 pmol/mg prot/min, -22%, p=0.0240, and Km=191.3±5.2 and 185.0±2.5 nM, respectively for 6 independent experiments). Finally, the Km for DA was significantly increased by 400% (p<0.0001) in the nucleus accumbens compared to the striatum of WT mice. In our knowledge, the kinetic parameters of the DA uptake by accumbic synaptosomes from mouse had never been determined. Effect of cocaine on the locomotor activity WT and STOP KO mice

In order to determine a potential functional consequence of the decreased accumbic Vmax of [3H]-DA uptake, we assessed the effect of acute cocaine at various doses on the horizontal and vertical locomotor activities (Fig. 4). During the habituation phase, the horizontal locomotor activity of STOP KO mice was higher (26%, p=0.0399) than WT mice, as previously reported for mutant mice in a novel environment (Brun et al., 2005). In contrast, their vertical activity was decreased (40%, p=0.0081), compared to WT mice (not shown). STOP KO mice were hypersensitive to the stimulating effect of cocaine for both their horizontal and vertical activities. Whereas cocaine at the dose of 10 mg/kg had no significant effect on the horizontal activity of WT mice, it strongly increased the locomotion of STOP KO mice (850%, p<0.0001, Fig.4, top and bottom), as recently reported with amphetamine (Brun et al., 2005). The stimulant effect of 10 mg/kg cocaine on the horizontal locomotion of mutant mice was not due to a decreased vertical activity. Indeed, 10 mg/kg cocaine significantly increased (830%, p=0.0029) the vertical activity of STOP KO mice (Fig. 4), while cocaine at this dose significantly decreased the vertical activity of WT mice (99%, p=0.0040). Cocaine inhibition of DA uptake in synaptosomes from the striatum and the nucleus accumbens of WT and STOP KO mice

In order to determine if the hypersentivity of mutant mice towards the hyperlocomotor effect of cocaine was due to modified inhibition of DA uptake, the inhibition parameters of cocaine were measured after [3H]-DA uptake on synaptosomes from the striatum and the nucleus accumbens of WT and STOP mice (Fig. 5). The concentration of cocaine which inhibits by 50% (IC50%) the [3H]-DA uptake was the same, whatever the genotype of mice, in both the striatum and the nucleus accumbens (IC50%=99±27 nM and 102±33 nM in the striatum, 193±24 nM and 205±23 nM in the nucleus accumbens of WT and STOP KO mice, respectively). Finally, the IC50% for cocaine was significantly higher in the nucleus accumbens compared to the striatum of WT mice (95%, p=0.0240).



Behavioural sensitization to cocaine in WT and STOP KO mice

To check the potential dependence of STOP KO mice towards cocaine, we tested the effect of repeated administration of the lowest active dose of cocaine (10 mg/kg, see Fig. 5). During the initiation phase, the 5-day administration of cocaine induced a behavioural sensitization, reaching the same amplitude for mice of both genotypes (Fig. 6). The comparison of cocaine effects between day 1 and day 5 was only significant for WT mice (p=0.0375). After a 20-day withdrawal, the challenge cocaine-induced hyperactivity was similar between saline- and cocaine-pretreated WT mice (compare Sal+Coc and Coc+Coc on Fig.3, bottom). However, in saline-treated WT mice, the challenge cocaine effect was significantly higher than day 1 (compare J1 and Sal+Coc, p=0.0111), suggesting a behavioural (environmental) sensitization. During the expression phase, the challenge cocaine-induced hyperactivity was significantly higher in cocaine-pretreated than in saline-pretreated STOP KO mice, showing a behavioural sensitization STOP KO mice to cocaine (p=0.0417, compare Sal+Coc and Coc+Coc on Fig.3, bottom).



DISCUSSION

The present study demonstrates that the constitutive inactivation of the microtubule effector STOP elicits important modifications in the DAergic components and functions. Paradoxically, the suppression of this relatively ubiquitous protein (Andrieux et al., 2002) did not induce alterations of all DAergic markers, nor in all DAergic areas. Very interestingly, our data show that the meso-limbic neurotransmission is more altered than the nigro-striatal pathway.

In STOP KO mice, the relative density of the DA transporter DAT and of the vesicular monoamine transporter VMAT2 were not altered in the dopaminergic areas tested. On the contrary, the density of D2 and D3 receptors was decreased by 20%-40%. It can be noted that the D3 receptor density was only modified in the ventral tegmental area, containing cell bodies of the meso-limbic DA neurons contrary to the D2 receptor density, which was only modified in the terminals. The decreased density of D2 receptors may correspond to a compensatory mechanism to increased DA release, as previously reported in the constitutively hyperDAergic DAT KO mice (Giros et al., 1996; Jones et al., 1998; Weiss et al., in preparation). Surprisingly, the density of D1 receptors was not modified contrasting with previous results in DAT KO mice, nor the sensitivity state of D1 and D2 receptors, as revealed by their coupling to proteins G. This could mean that in STOP KO mice, alterations of DA receptor levels not only depend on the DAergic area, but also on the neuronal environment. Finally, the unmodified or the decreased density of both autoreceptors D2 and D3 (Sokoloff et al., 1990) in the ventral tegmental area were in disagreement with the previous report of Brun et al. (2005). By amperometric measurements, these authors inbdirectly show an enhanced autoinhibition of evoked DA release in the nucleus accumbens of STOP KO mice. However, we ignore the ratio between D2 and D3 autoreceptors versus postsynaptic receptors in the nucleus accumbens of mutant mice, nor their respective sensitization state and coupling.

A preferential alteration of the meso-limbic DAergic pathway in STOP KO mice was

observed from the alterations of the endogenous DA levels. Indeed, whereas DA and its metabolite levels were not modified in the substantia nigra and the ventral tegmental area containing DAergic cell bodies, they were highly decreased in the DAergic terminal areas, striatum and nucleus accumbens. Furthermore, the amplitude of the drop in endogenous DA level was significantly two-fold higher in the nucleus accumbens than in the striatum. This decreased endogenous DA level in STOP KO mice was reminiscent of that in DAT KO mice (Giros et al., 1996). The selective decrease in DA level was not due to different synthesis activity between DAergic cell bodies and terminals, as indicated by the similar decreased in vivo activity of the tyrosine hydroxylase in the three DAergic areas tested. The decreased endogenous DA level restricted to DA terminals could be due to difference in vesicular uptake and/or intraneuronal catabolism between cell bodies and terminals. Finally, as it was the case for the D2 receptor density, the decrease of TH activity was higher in the nucleus accumbens than in the striatum, although not significantly.

Whereas the relative density of DAT was not modified in any DAergic tissues of STOP KO mice, its activity in synaptosomes was increased by 25%, although non significantly, in the striatum, but significantly decreased by 25% in the nucleus accumbens. Such opposite effects on the DA uptake in the striatum and the nucleus accumbens, not observed at low DA concentrations, were quite in accordance with data from studies of Brun et al. (2005). These authors show that, whereas basal extracellular DA level is not modified in the striatum nor the nucleus accumbens, evoked stimulated DA release (tonic release) is not significantly decreased in the striatum and significantly increased in the nucleus accumbens.



As previously reported for amphetamine (Brun et al., 2005) and nicotine (Bouvrais-Veret et al., in preparation), STOP KO mice displayed hypersensitive response to the stimulating locomotor effect of acute cocaine. Indeed, concerning the mutant mice locomotor activity, the cocaine dose-response curve showed a 10-fold leftward shift, compared to WT mice. In a behavioural sensitization protocol, we showed that this hypersensitivity was maintained 20 days after a semi-chronically treatment, in mutant mice only. This latter data might result from the hypersensitivity of STOP KO mice to the acute effect of cocaine. This hypersensitivity might not be due to modified characteristics of inhibition of DA uptake by cocaine, but rather to a hyper-reactivity of the meso-limbic DAergic system and/or to decreased DA reuptake in the nucleus accumbens. Another, not exclusive, explanation could be that cocaine partly mediates its effects via another monoamine transporter, as the serotonin transporter for which it displays a good affinity (Giros et al., 1992). The serotonin neurotransmission of STOP KO mice is probably altered, in agreement with previous report on dramatic signs of anxiety-like behaviour of mutant mice (Andrieux et al., 2002). The higher sensitivity of STOP KO mice to the stimulant locomotor effect of cocaine, as well to its behavioural sensitization, is reminiscent of studies showing co-morbidity of schizophrenia and psychostimulant abuse (Green, 2005; Swartz et al., 2006).

Altogether our results reinforce the pertinence of STOP KO mice as a study model for

some symptoms of schizophrenia. According to previous results (Brun et al., 2005), these mice displayed hyperDAergy, preferentially in the meso-limbic pathway. These mutants were hyper-reactive to psychostimulant and exhibited some common feature with the constitutively hyperDAergic DAT KO mice, another pertinent model for some symptoms of schizophrenia (Gainetdinov et al., 2001).



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Table 1: Relative density of DAergic transporters and receptors in various areas of WT and STOP KO mice

Marker Area WT KO % KO/WT DAT SNc (6) 353 ± 11 (5) 370 ± 19 +5% ns VTA (5) 355 ± 13 (5) 387 ± 21 +9% ns Str (6) 359 ± 8 (6) 360 ± 12 0% Acc Core (5) 350 ± 11 (6) 362 ± 13 +3% ns Acc Shell (5) 279 ± 9 (6) 291 ± 19 +4% ns VMAT2 SN (6) 514 ± 58 (4) 581 ± 28 +9% ns VTA (4) 265 ± 26 (4) 241 ± 27 -9% ns Str (5) 436± 25 (5) 482 ± 44 +11% ns Acc Core (5) 454 ± 42 (5) 499 ± 37 +10% ns Acc Shell (5) 533 ± 32 (5) 538 ± 25 +1% ns D1 SNr (6) 131 ± 4 (6) 132 ± 7 0% Striatum (5) 494 ± 10 (5) 486 ± 21 -2% ns Acc Core (5) 356 ± 7 (5) 332 ± 16 -7% ns Acc Shell (5) 324 ± 12 (5) 358 ± 14 +11% ns Cing Cx (6) 5.25 ± 0.52 (6) 5.92 ± 0.17 +13% ns D2 SNc (5) 264 ± 33 (5) 231 ± 11 -12% ns VTA (5) 237 ± 18 (4) 211 ± 11 -11% ns Striatum (6) 774 ± 58 (6) 596 ± 50 -23% 0.0431 Acc Core (5) 257 ± 23 (5) 185 ± 14 -28% 0.0298 Acc Shell (5) 240 ± 22 (5) 175 ± 15 -27% 0.0422 D3 SN (6) 25.1 ± 2.4 (5) 21.2 ± 3.3 -16% ns VTA (6) 14.3 ± 0.8 (4) 8.9 ± 1.9 -38% 0.0182 Str DL (5) 12.8 ± 0.7 (6) 12.9 ± 0.3 +1% ns Acc Core (6) 87.0 ± 5.2 (5) 74.0 ± 6.1 -15% ns Acc Shell (7) 111.3 ± 4.8 (6) 99.1 ± 8.1 -11% ns

Relative densities are the means ± SEM of specific autoradiographic labellings in arbitrary mean grey values. The number of mice is indicated in parentheses. Acc, Nucleus Accumbens ; SN, Substantia Nigra ; SNc and SNr, Substantia Nigra, pars compacta and reticulata ; Str, Striatum ; Str DL, Dorso-Lateral part of Striatum ; VTA, Ventral Tegmental Area. ND, not detectable; ns: non significant. Comparison between genotypes by Fisher’s test.



Table 2: D1 and D2/D3 receptor-mediated binding of [35S]-GTP-γ-S in various areas of WT and STOP KO mice

Receptor Area WT KO % KO/WT D1 SNr (4) 245 ±49 (4) 232 ± 54 -5% ns Str (4) 166 ± 38 (5) 256 ± 87 +54% ns Acc Core (4) 286 ±88 (3) 344 ± 5 +20% ns Acc Shell (4) 238 ±92 (3) 216 ± 81 -9% ns Cing Cx (5) 112 ± 30 (5) 124 ± 30 +11% ns D2/D3 SN (5) 328 ± 85 (6) 400 ± 22 +22% ns VTA (5) 416 ±32 (6) 333 ± 42 -20% ns Str (4) 1043 ± 50 (5) 1174 ± 220 +13% ns Acc Core (5) 1016 ± 150 (5) 1006 ± 253 -1% ns Acc Shell (5) 994 ± 141 (5) 977 ± 241 -2% ns Cing Cx (5) 655 ± 121 (6) 609 ± 139 -7% ns

Relative densities are the means ± SEM of specific autoradiographic labellings in arbitrary mean grey values. The number of mice is indicated in brackets. Acc, Nucleus Accumbens ; Cing Cx, Cingulate Cortex; SN, Substantia Nigra, pars compacta and reticulata ; SNr, Substantia Nigra, pars reticulata ; Str, Striatum; VTA, Ventral Tegmental Area. ns; non significant. Comparison between genotypes by Fisher’s test.



Table 3: Endogenous levels of dopamine and its metabolite in various areas of WT and STOP KO mice

Area Mice DA DOPAC HVA

WT (6) 0.77±0.04 (6) 0.41±0.04 (6) 0.47±0.02 SN + VTA KO (5) 0.78±0.13

+2% ns(6) 0.32±0.05

-23% ns(5) 0.38±0.05

-19% ns

WT (5) 11.27±0.97 (5) 1.11±0.16 (5) 1.72±0.12 Str KO (6) 7.95±0.31

-39% 0.0063(6) 0.85±0.04

-23% ns(6) 1.30±0.07 -24% 0.0075

WT (5) 5.45±0.86 (5) 0.88±0.11 (6) 0.87±0.07 Acc KO (6) 2.01±0.24

-63% 0.0023(6) 0.42±0.04 -52% 0.0020

(6) 0.43±0.04 -51% 0.0003

WT (4) 0.21±0.02 (6) 0.11±0.01 (6) 0.43±0.04 PrFr Cx KO (5) 0.26±0.06

+25% ns (5) 0.08±0.004 -26% 0.0162

(3) 0.47±0.02 +8% ns

The levels of endogenous DA and its metabolites HVA and DOPAC of WT and STOP KO mice are expressed as means ± SEM of values in µg/g tissue. The number of mice is indicated in parentheses. Acc, Nucleus Accumbens; PrFr Cx, Pre-Frontal Cortex; SN+VTA, Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area; Str, Striatum. ns: non significant. Values of KO mice were compared with respective WT mouse values by Fisher's test.



Table 4: In vivo activity of tyrosine hydroxylase in various areas of WT and STOP KO mice

L-DOPA (ng/g) Area

WT KO % KO/WT SN+VTA (12) 861±55 (12) 590±38 -31% 0.0009 Str (10) 1405±83 (11) 1145±63 -19% 0.0036 Acc (11) 1188±108 (11) 846±76 -29% 0.0001 PrFr Cx (11) 382±32 (12) 395±58 +3% ns

Mice received 100 mg/kg NSD 1015 30 minutes before sacrifice and dissections. Respective basal endogenous L-DOPA levels were subtracted from L-DOPA accumulated after NSD administration. The levels of L-DOPA are expressed as means ± SEM of values in ng/g tissue. The number of mice is indicated in parentheses. Acc, Nucleus Accumbens; PrFr Cx, Pre-Frontal Cortex; SN+VTA, Substantia Nigra+Ventral Tegmental Area; Str, Striatum. Values in STOP KO mice were compared with the respective WT mice values by Fisher's test.



LEGENDS TO FIGURES Fig. 1 : Autoradiographic representation of plasmic DA (DAT) and vesicular monoamine (VMAT2) transporters and of DAergic D1, D2 and D3 receptors in wild-type (WT) and STOP KO mice. Acb C: nucleus accumbens, core; Acb S: nucleus accumbens, shell; SN: substantia nigra; SNc: substantia nigra, pars compacta; Str: striatum; VTA: ventral tegmental area. Fig. 2 : Autoradiographic representation of D1 and D2/D3 receptor-mediated binding of [35S]-GTP-γ-S in various areas of wild-type (WT) and STOP KO mice. The binding of [35S]-GTP-γ-S was stimulated by the D1 receptor agonist SKF38393 (0.3 mM) or the D2/D3 receptor agonist quinpirole (0.3 mM). Acb C: nucleus accumbens, core; Acb S: nucleus accumbens, shell; Cing cx: cingulate cortex; SN: substantia nigra; Str: striatum; VTA: ventral tegmental area. Fig. 3 : DA uptake in synaptosomes from the striatum and the nucleus accumbens of wild-type (WT) and STOP KO mice. Values represent means ± SEM in pmol/mg prot/min of uptaked [3H]-DA from 3 (striatum) and 6 (nucleus accumbens) independent experiments. Fig. 4 : Effect of acute administration of cocaine on the locomotor activities of wild-type (WT) and STOP KO mice. Top: time course of the horizontal and vertical activities of WT and STOP KO mice after administration of cocaine at increasing doses. Means ± SEM of photocell counts over a 5 min period for 7-15 mice per dose. Bottom: dose-response effects of cocaine administration on the horizontal locomotor activity of WT and STOP KO mice. Data represent means ± SEM of photocell counts over a 50 min period. ∗ p<0.05, ∗∗ p<0.01, ∗∗∗ p<0.0001 compared to the saline group of the same genotype (Fisher’s test). Fig. 5 : Inhibition of DA uptake by cocaine in synaptosomes from the striatum and the nucleus accumbens of wild-type (WT) and STOP KO mice. Uptake of 10 nM [3H]-DA in the presence of cocaine at increasing concentrations. Values represent means ± SEM in % of DA uptake in the absence of cocaine, in 3 independent experiments. Fig. 6 : Behavioural sensitization to cocaine of wild-type (WT) and STOP KO mice. Top: time course of the horizontal locomotor activity of WT and STOP KO mice after administration of saline (Sal) or 10 mg/kg cocaine (Coc), once daily for 5 days. After 20-day cessation treatment, all mice received saline at day 25 (25 Sal) and 10 mg/kg cocaine at day 26 (26 Coc). Bottom: cumulated counts over 60 min period, after cocaine administration, at day 1 (acute administration), day 5 (end of the acquisition period) and at day 26 (expression period) for saline-pretreated (Sal+Coc) or cocaine-pretreated (Coc+Coc) mice. Means ± SEM of data for 9-11 mice per condition. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.0001 by Fisher’s test.















RESULTATS COMPLEMENTAIRES



Taux endogènes de sérotonine (5-HT) et de son métabolite 5-HIAA, mesurés sur cerveaux

de souris sauvages (WT) et STOP KO (KO) (μg/ g tissu).

Régions Génotype 5-HT 5-HIAA

SN+AVT WT

KO

%

(6) 1.232±0.087

(6) 1.311±0.125

+6% NS

(6) 0.819±0.075

(6) 0.877±0.071

+7% NS

Striatum WT

KO

%

(6) 0.451±0.061

(6) 0.279±0.033

-38% 0.0315

(6) 0.297±0.037

(6) 0.200±0.017

-33% 0.0400

Noyau accumbens WT

KO

%

(6) 0.382±0.028

(6) 0.198±0.026

-48% 0.0007

(6) 0.260±0.013

(6) 0.159±0.018

-39% 0.0011

Raphé WT

KO

%

(6) 0.651±0.072

(6) 0.776±0.060

+19% NS

(6) 0.651±0.056

(6) 0.800±0.075

+23% NS

Hippocampe WT

KO

%

(6) 0.327±0.028

(6) 0.169±0.022

-48% 0.0013

(6) 0.249±0.025

(6) 0.159±0.023

-36% 0.0249

Cortex Frontal WT

KO

%

(6) 0.416±0.032

(6) 0.202±0.016

-51% 0.0001

(6) 0.177±0.017

(6) 0.082±0.007

-54% 0.0005

Le nombre d’animaux est indiqué entre parenthèses.

NS : Non significatif (test de Fischer)



Mesure de l’activité in vivo de la tryptophane hydroxylase, dans plusieurs régions cérébrales

de souris sauvages (WT) et STOP KO (KO)

Le nombre d’animaux est indiqué entre parenthèses.

ns : non significatif (test de Fischer)

Régions WT KO % KO/WT

Raphé 397 + 15 (6) 514 + 28 (6) +29% 0,0047

SN+ATV 433 + 14 (12) 525 + 35 (12) +21% ns

Striatum 227 + 13 (12) 170 + 16 (12) -26% 0,010

N. Accumbens 296 + 30 (12) 261 + 22 (12) -22% ns

Hippocampe 223 + 13 (12) 121 + 10 (11) -46% 0,0001

Cx Préfrontal 164 + 9 (12) 108 + 11 (12) -34% 0,0007

5-HTp (ng/g tissu)


DISCUSSION

Partie 2 - Discussion


Notre travail de recherche, centré sur les transmissions nicotinique et

dopaminergique, nous a permis de mieux caractériser les souris invalidées pour la protéine

associée aux microtubules STOP. L’utilisation de diverses techniques biochimiques a mis en

évidence des altérations de la densité et/ou de l’activité de différents marqueurs, des taux

endogènes de dopamine et de métabolites, ainsi que des paramètres cinétiques

caractérisant le transporteur de la dopamine chez ces animaux. Des tests comportementaux,

mesurant l’activité locomotrice en réponse à des psychostimulants et la mémoire associative,

ont également révélé des sensibilités altérées et des déficits cognitifs. Ces résultats nous

amènent à réfléchir sur les effets spécifiques de l’inactivation de la protéine ubiquitaire STOP

et la validité des souris STOP KO comme modèle d’étude pour la schizophrénie.

A/ Altérations biochimiques des souris STOP KO

1/ Marqueurs nicotiniques/cholinergiques et dopaminergiques

Par des techniques de radioliaison sur coupes, nous avons montré une baisse de

densité des nAChRs de type α6* au niveau du striatum et du noyau accumbens des souris

STOP KO, ainsi qu’une augmentation des récepteurs α7 dans le striatum dorso-latéral et

l’hippocampe, structures impliquées dans certaines fonctions cognitives. La liaison à

l’épibatidine, mesurant les sous-unités β2*, probablement associées en majorité à des sous-

unités α4, n’est pas modifiée, de même que la densité de l’enzyme d’inactivation de

l’acétylcholine, AChE. Par contre, la densité du transporteur vésiculaire de l’acétylcholine,

VAChT, est réduite de manière sélective dans le champ CA1 de l’hippocampe, mais pas au

niveau du champ CA3, ni du septum, contenant les corps cellulaires de ces neurones

cholinergiques. Ce dernier résultat peut être rapproché de la baisse des transcrits du

transporteur vésiculaire glutamatergique VGLUT1 récemment décrite dans l’hippocampe

(Eastwood et al, sous presse). Une baisse de densité des vésicules synaptiques

glutamatergiques a également été trouvée dans CA1 et serait à l’origine du déficit de

plasticité synaptique à court terme dépendant de l’élément pré-synaptique (PTP) et plus

indirectement du déficit de LTP, processus postsynaptique, observé chez ces souris

(Andrieux et al., 2002). La baisse de densité de VAChT peut provenir de différentes causes:

une diminution globale du nombre de terminaisons cholinergiques, une réduction du nombre

de vésicules par terminaison et/ou une réduction de la densité de transporteurs par vésicule.



Des études de microscopie électronique seront nécessaires pour valider l’une ou l’autre de

ces hypothèses. Dans tous les cas et si la décroissance de densité de VAChT n’est pas

compensée par une augmentation d’activité, la diminution de ce transporteur vésiculaire

pourrait être responsable d’une baisse de libération d’acétylcholine chez les animaux

mutants.

Les densités des transporteurs plasmique DAT et vésiculaire VMAT2 ne sont pas

modifiées de façon significative dans les différentes régions cérébrales testées. La baisse du

récepteur D2 observée dans diverses régions dopaminergiques pourrait être un effet

compensateur d’une plus grande libération de dopamine à la synapse, comme chez les

souris hyperdopaminergiques DAT KO (Giros et al., 1996; Jones et al., 1998). Cependant, la

densité du récepteur D1 n’est modifiée dans aucune des régions testées et celle du

récepteur D3 n’est diminuée que dans l’aire tegmentale ventrale, région contenant les corps

cellulaires dopaminergiques de la voie méso-cortico-limbique. D’autre part, la fonctionnalité

des récepteurs D1 et D2/D3, reflétée par leur degré de couplage aux protéines G, n’est pas

altérée de manière significative chez les souris STOP KO. Ce résultat, combiné à la baisse

ou l’absence de variation de densité des récepteurs D2 et D3 dans le striatum et le noyau

accumbens, serait en désaccord avec les études d’électrochimie, réalisées par MF Suaud-

Chagny et son équipe, qui suggéraient une auto-inhibition accrue par les auto-récepteurs

D2/D3, suite à une libération évoquée de dopamine dans le noyau accumbens des souris

mutantes (Brun et al., 2005). Toutefois, au niveau des terminaisons dopaminergiques,

notamment du noyau accumbens où le récepteur D3 est préférentiellement exprimé, nous ne

connaissons pas la proportion de récepteurs D2/D3 post-synaptiques versus pré-

synaptiques, de même que le degré de fonctionnalité des récepteurs post-synaptiques

versus pré-synaptiques. Des expériences supplémentaires, mesurant l’activité des auto-

récepteurs par d’autres techniques s’avèrent nécessaires.

2/ Altérations biochimiques

La synthèse de dopamine se fait tout le long du neurone grâce à l’activité de la

tyrosine hydroxylase, qui est l’enzyme limitante hautement régulée de cette voie de

biosynthèse. Par dosage HPLC, nous avons montré que les taux endogènes de dopamine et

de ses métabolites étaient diminués d’environ 20 à 60% au niveau des régions à

terminaisons dopaminergiques (striatum et noyau accumbens) des souris STOP KO. La

libération de dopamine par exocytose ne constituant qu’1% environ de la concentration



endogène, ce résultat n’est pas en désaccord avec une concentration dopaminergique

extracellulaire basale normale (Brun et al., 2005). Aucune variation n’a été décelée au

niveau des régions à corps cellulaires dopaminergiques (aire tegmentale ventrale et

substance noire).

Cette diminution des taux endogènes de dopamine uniquement dans les régions à

terminaisons neuronales pourrait résulter d’un défaut de transport de la tyrosine hydroxylase.

Par conséquent, nous avons analysé l’activité de la tyrosine hydroxylase in vivo, après

inhibition de la DOPA décarboxylase et mesure de l’accumulation de L-DOPA. De manière

intéressante, on ne constate aucune régulation différentielle de la synthèse de dopamine en

fonction des structures cérébrales. L’activité de cette enzyme est diminuée de 20-30%, aussi

bien au niveau des corps cellulaires que des terminaisons neuronales. Ce résultat suggère

que la baisse des taux endogènes de dopamine sélective des terminaisons neuronales n’est

pas due à des variations locales de synthèse. On peut émettre l’hypothèse que dans les

régions des terminaisons, la dopamine est moins protégée de la dégradation intra-cellulaire,

parce que moins internalisée au sein des vésicules synaptiques. Ceci pourrait être la

conséquence d’une diminution du nombre de molécules et/ou de l’activité de VMAT2.

N’ayant pas trouvé de variation significative de la densité de ce transporteur vésiculaire au

niveau des terminaisons neuronales dopaminergiques des souris mutantes, notre hypothèse

pencherait vers une activité de transport décrue et/ou une moindre affinité de VMAT2 pour la

dopamine. Au contraire, dans les corps cellulaires, la dopamine serait moins synthétisée et

mieux stockée. Des expériences de capture de [3H]-dopamine sur des préparations

vésiculaires de souris STOP KO seront nécessaires pour vérifier cette hypothèse.

Concernant le système sérotoninergique (voir résultats complémentaires), les taux

endogènes de sérotonine et des métabolites ne varient pas de façon significative dans les

corps cellulaires (raphé) des souris mutantes, mais diminuent dans presque toutes les

régions de projection étudiées (striatum, accumbens, hippocampe, cortex préfrontal), tout

comme la dopamine. Le tryptophane est hydroxylé par l’enzyme limitante tryptophane

hydroxylase (TpOH), conduisant au 5-hydroxytryptophane (5-HTp), aboutissant à la

sérotonine après décarboxylation. La mesure des taux de 5-HTp chez l’animal vivant, après

inhibition de la décarboxylase, révèle que l’activité de la TpOH est régulée différemment

chez les souris KO, selon les structures cérébrales. Dans le raphé, son activité est

augmentée de façon significative, alors qu’elle est diminuée ou inchangée dans les régions

de terminaisons. Dans ces dernières, la baisse d’activité de la TpOH peut expliquer les

diminutions des taux endogènes de sérotonine. Par contre, au niveau du raphé, on peut



supposer que la sérotonine est un peu plus dégradée, contrairement à ce que nous

suggérons pour la dopamine.

Nous avons réalisé des d’expériences de capture de [3H]-dopamine sur des

préparations de synaptosomes de striatum et de noyau accumbens de souris STOP KO, afin

de déterminer les paramètres d’activité du DAT, dont la densité n’est pas modifiée chez les

mutants. De manière surprenante, et ce pour les deux génotypes de souris, on observe une

différence significative d’affinité du DAT entre striatum et noyau accumbens, l’affinité pour la

dopamine étant significativement plus faible dans cette dernière structure que dans le

striatum. Cette différence pourrait être due à des interactions différentes du DAT avec des

protéines chaperons, selon l’environnement neuronal/régional.

La vitesse maximale de capture (Vmax) du DAT augmente de manière non

significative dans le striatum des souris STOP KO et est significativement diminuée de 25%

pour les fortes concentrations de dopamine au niveau du noyau accumbens des souris

mutantes. Ces différences de capture pourraient résulter en une augmentation significative

de concentration de dopamine extracellulaire dans le noyau accumbens et une diminution

non significative dans le striatum des souris mutantes, dans les deux cas après stimulus.

Ces résultats rappellent ceux précédemment publiés (Brun et al., 2005). La stimulation

électrique à haute fréquence des fibres dopaminergiques conduit à un efflux de dopamine

significativement accru au niveau du noyau accumbens et non significativement diminué

dans le striatum. Nos résultats semblent donc a priori en accord avec ceux de cette équipe,

bien qu’elle ait conclu, de façon indirecte, à une absence de variation significative des

paramètres d’activité du DAT chez les souris mutées (Brun et al., 2005).

Cette discordance s’explique peut-être par la différence des techniques employées

permettant une mesure des paramètres biochimiques du DAT directe dans le cas des

synaptosomes et indirecte dans le cas de l’ampérométrie. D’autre part, Brun et

collaborateurs ont mesuré ces constantes pour des concentrations de dopamine allant

jusqu’à 250 nM alors que nous n’observons de différence de Vmax entre les deux génotypes

que pour des concentrations de dopamine supérieures ou égales à 300 nM. Brun et

collaborateurs concluent que la potentialisation de l’efflux dopaminergique n’est due qu’à une

augmentation de libération de dopamine chez les mutants. Cette plus forte libération peut

avoir plusieurs causes, par exemple un plus grand nombre de vésicules synaptiques, un plus

fort remplissage vésiculaire et/ou un cycle d’exocytose des vésicules plus rapide. Il serait

intéressant de compter en microscopie électronique le nombre de vésicules des

terminaisons dopaminergiques du striatum et du noyau accumbens et de mesurer l’activité

de VMAT2 sur des préparations de vésicules synaptiques, comme cela a déjà été proposé



précédemment. Chez les souris STOP KO, la potentialisation de l’efflux dopaminergique

évoqué à haute fréquence au niveau du noyau accumbens pourrait donc être due à la fois à

une moindre recapture de dopamine par le DAT et à une libération augmentée de dopamine.

B/ Altérations comportementales des souris STOP KO

1/ Sensibilité aux psychostimulants

Du fait des modifications densitométrique et biochimique de certains marqueurs

cholinergiques, nicotiniques et dopaminergiques, nous avons exploré l’activité locomotrice

des souris STOP KO et leur sensibilité aux psychostimulants, nicotine et cocaïne.

Les effets de la nicotine sur l’activité locomotrice des rongeurs sont variables et

dépendent de l’espèce, de l’arrière-fond génétique, du sexe, de l’environnement et de la

dose administrée (Ksir et al., 1987; Menzaghi et al., 1997; Damaj, 2001). Chez la souris, la

nicotine provoque le plus souvent une diminution de l’activité locomotrice, variable selon la

souche génétique. Selon l’environnement, la nicotine engendre généralement une

hyperlocomotion dans un environnement familier et une hypolocomotion dans un

environnement nouveau. Ces modulations de l’activité locomotrice font intervenir différents

sous-types de nAChRs. Dans nos expériences, l’activité locomotrice des souris a été

enregistrée sans période d’habituation, l’environnement est donc considéré comme nouveau.

Chez les souris sauvages, la nicotine provoque globalement un effet hypolocomoteur,

significatif à partir d’une dose de 1 mg/kg, globalement en accord avec les données de la

littérature. En revanche, l’administration systémique de doses croissantes de nicotine

engendre un effet biphasique chez les souris STOP KO, avec une composante

hyperlocomotrice pour des faibles doses de nicotine suivie d’une composante

hypolocomotrice pour de plus fortes doses. L’hypersensibilité des souris mutantes à l’effet

hyperlocomoteur de la nicotine est en accord avec l’hypersensibilité aux effets locomoteurs

de l’amphétamine décrite chez ces souris (Brun et al., 2005), de même qu’aux effets de la

cocaïne. L’augmentation de la locomotion induite par la nicotine a été reliée à la stimulation

des voies dopaminergiques (Clarke et al., 1988). Or, Brun et collaborateurs ont montré une

libération accrue de dopamine dans le noyau accumbens en réponse à une stimulation



électrique mimant un stimulus physiologique. L’hypothèse d’une libération accrue de

dopamine après administration de nicotine, produisant l’effet hyperlocomoteur des souris

STOP KO, semble donc pertinente. Et ceci d’autant plus que la nicotine, comme toutes les

drogues d’abus, provoque une libération de dopamine dans le shell de l’accumbens (Di

Chiara and Imperato, 1988). Des études menées sur tranches de cerveaux ou chez des

souris invalidées pour différentes sous-unités des nAChRs suggèrent que la libération de

dopamine induite par la nicotine impliquerait essentiellement la sous-unité β2 (Picciotto et al.,

1998; Wonnacott et al., 2000; Maskos et al., 2005). Nos résultats de radioliaison n’ont pas

montré d’augmentation significative de cette sous-unité dans les régions dopaminergiques,

toutefois, nous n’avons pas mesuré l’état d’activité de ces récepteurs. Les récepteurs α7

pourraient aussi jouer un rôle indirect dans la libération de dopamine, de par leur localisation

stratégique sur les neurones glutamatergiques projetant dans les régions dopaminergiques

(Kaiser and Wonnacott, 2000). Etant donnée la forte augmentation de leur densité au niveau

striatal, et à la condition d’être fonctionnels, on peut supposer que ces récepteurs pourraient

être impliqués dans l’effet hyperlocomoteur de la nicotine.

Nous avons montré que la choline, agoniste sélectif des récepteurs α7 à faible dose

(Papke et al., 1996; Alkondon et al., 1997b), n’a pas d’effet locomoteur chez les souris

sauvages, mais provoque une forte hyperlocomotion horizontale des souris STOP KO et, à

l’opposé, une forte hypolocomotion verticale. Ce dernier effet de la choline chez les souris

mutantes est difficile à interpréter, d’autant plus que la signification de l’activité verticale est

peu explorée et discutée dans la littérature. Toutefois, l’hypolocomotion verticale n’est

significative que pour de fortes doses de choline, pour lesquelles la spécificité de son action

sur les récepteurs α7 n’est pas démontrée. A ces doses, la choline peut également servir de

substrat dans la synthèse d’acétylcholine et par conséquent agir sur d’autres récepteurs non

α7, nicotiniques et muscariniques. Une participation des récepteurs α7 dans l’effet

hyperlocomoteur de la choline chez les souris mutantes n’est donc pas à exclure, tout

comme d’autres types de nAChRs.

La sensibilité des souris STOP KO à l’effet hypolocomoteur provoqué par la nicotine

à fortes doses est la même que celle des souris sauvages, l’amplitude de l’effet et la dose

efficace inhibitrice (DI50) étant identiques. Des travaux réalisés sur des souris invalidées

pour certaines sous-unités des nAChRs suggèrent que les sous-unités α3 et α4 participent à

l’hypolocomotion induite par la nicotine (Ross et al., 2000; Marubio et al., 2003; Salas et al.,

2004). Cette hypothèse n’a pu être vérifiée, faute de ligands spécifiques pour chacune des

combinaisons de sous-unités nicotiniques.



Plusieurs études indiquent que l’effet stimulant produit par la cocaïne sur la

locomotion est associé à une augmentation de la transmission dopaminergique dans les

régions des terminaisons neuronales dopaminergiques (Johanson and Fischman, 1989).

Comme pour l’amphétamine (Brun et al., 2005), les souris STOP KO sont hypersensibles à

l’effet locomoteur de la cocaïne. Ces animaux montrent une hyperlocomotion dose-

dépendante à partir d’une dose de 10 mg/kg de cocaïne, pour laquelle aucun effet moteur

n’est observé chez les souris sauvages.

Pour tenter de caractériser cette hypersensibilité des souris STOP KO à l’effet

locomoteur de la cocaïne, nous avons mesuré les paramètres d’inhibition du transporteur

DAT par la cocaïne. La concentration de cocaïne nécessaire pour obtenir une inhibition de

50% de la Vmax du DAT (CI50) n’est pas significativement différente entre les deux

génotypes de souris, montrant que l’affinité du transporteur pour la cocaïne n’est pas

modifiée. Par contre, la CI50 est significativement deux fois plus élevée sur la préparation de

synaptosomes du noyau accumbens que sur celle du striatum, quelque soit le génotype des

souris. Nous avons précédemment montré que l’affinité du DAT pour la dopamine est moins

bonne dans le noyau accumbens que dans le striatum. Remarquons que le NET,

transportant la dopamine avec une grande affinité et liant la cocaïne avec une moins bonne

affinité que le DAT, est présent sur des terminaisons noradrénergiques abondantes dans le

noyau accumbens, mais rares dans le striatum. La moins bonne affinité du DAT pour la

dopamine dans le noyau accumbens ne peut pas être expliquée par la présence du NET. En

revanche, la moins bonne affinité du DAT pour la cocaïne pourrait être due à une certaine

participation du NET dans la recapture de la dopamine dans le noyau accumbens et/ou à la

présence de protéines partenaires du DAT, différentes dans les deux régions.

L’hypersensibilité des souris mutantes à la cocaïne ne peut donc pas être expliquée

par un changement des paramètres de son inhibition du DAT. Par contre, une plus grande

libération tonique de dopamine dans le système limbique (Brun et al., 2005), associée à une

recapture déficiente du DAT au niveau du noyau accumbens, suggérée par nos résultats,

pourrait engendrer une concentration de dopamine extracellulaire plus élevée à l’origine de

l’hyperlocomotion. Cette hypothèse pourrait être vérifiée par la mesure comparée chez les

souris sauvages et mutantes des taux de dopamine libérée par la cocaïne (et

l’amphétamine) à différentes doses. D’autres transporteurs plasmiques peuvent être

également mis en jeu, comme le transporteur de la sérotonine, qui a une bonne affinité pour

la cocaïne. La transmission sérotoninergique des souris STOP KO est très

vraisemblablement altérée. En effet, ces souris présentent des signes sévères d’anxiété

(Andrieux et al., 2002), ont des taux endogènes de sérotonine très diminués dans la plupart



des régions de terminaisons sérotoninergiques et une activité de l’enzyme de synthèse

TpOH altérée (voir résultats complémentaires).

L’hypersensibilité des souris mutantes à l’administration aiguë de cocaïne nous a

conduits à tester une éventuelle différence de sensibilisation psychomotrice à cette drogue.

Ce comportement se définit par l’augmentation des effets hyperlocomoteurs en réponse à

l’administration répétée d’un psychostimulant, perdurant après une période de sevrage

(Pierce and Kalivas, 1997). Il est connu que la sensibilisation comportementale induite par

des psychostimulants est associée à une augmentation de libération de dopamine au niveau

du core du noyau accumbens. De nombreuses études ont rapporté que la sensibilisation

comportementale aux psychostimulants est accompagnée de modifications neurobiologiques

au niveau du système limbique, notamment dans le noyau accumbens (Pierce and Kalivas,

1997). Il a été suggéré que les modifications cérébrales induites par la drogue ainsi que

l’induction de la sensibilisation comportementale contribuaient au processus d’addiction. Des

études épidémiologiques ont montré que la cocaïne était une des drogues d’abus

consommées chez les schizophrènes, sans que les causes de cette co-morbidité ne soient

clairement connues (Green, 2005; Swartz et al., 2006). Nous avons choisi de tester ce

comportement de sensibilisation comportementale pour une dose de 10 mg/kg de cocaïne,

bien que les souris sauvages ne répondent pas à cette faible dose, ceci afin de ne pas

masquer un effet potentiel chez les mutants, qui y répondent déjà fortement. Suite à un

protocole d’administration quotidienne pendant cinq jours et une période de sevrage de vingt

jours, l’activité locomotrice des souris STOP KO est significativement plus élevée après

traitement à la cocaïne qu’après administration de sérum physiologique. Cette sensibilisation

comportementale à la drogue n’est pas retrouvée chez les souris sauvages, qui ne

présentent qu’une sensibilisation comportementale à l’environnement, puisqu’après sevrage,

leur activité locomotrice est plus élevée, quelque soit le traitement reçu, cocaïne ou sérum

physiologique. L’absence de la protéine STOP permet donc la sensibilisation psychomotrice

des animaux à une dose relativement faible de cocaïne. Cette réponse comportementale

spécifique des souris STOP KO à l’injection répétée de cocaïne est probablement due en

partie à l’hypersensibilité de ces animaux à l’effet aigu de cette drogue.



2/ Performances mnésiques

L’augmentation très importante de densité de récepteurs α7 dans des régions des

souris STOP KO impliquées dans les processus d’apprentissage nous a incités à tester les

performances mnésiques des souris.

Dans un premier temps, nous avons voulu tester la mémoire spatiale des souris

STOP KO, dans un test de labyrinthe aquatique de Morris. Cependant, les souris sauvages

manifestaient de mauvaises performances, commençant tout juste à acquérir une stratégie

spatiale après huit jours d’entraînement (résultats non montrés). Ce fort déficit

d’apprentissage est très probablement lié à leur fond génétique mixte (50%/50% BALBc/129

SvPas). En effet, il a été montré que les performances des souches parentales sont

mauvaises dans certaines conditions expérimentales de ce test, qui sont celles que nous

avons utilisées dans notre laboratoire (Van Dam et al., 2006).

Nous avons donc testé la version indicée (version associative) du labyrinthe

aquatique de Morris, dans laquelle le rongeur doit apprendre à associer la position de la

plateforme, variable mais matérialisée par une petite balle contrastée. Dans cette

expérience, les souris sauvages montrent une certaine capacité à apprendre. Par contre, les

souris STOP KO présentent un fort déficit de performances. Ce genre d’apprentissage et de

mémoire pourrait faire intervenir le striatum dorsal (Packard and Knowlton, 2002). Bien que

l’hippocampe ait été décrit comme interagissant plus clairement dans la mémoire spatiale, sa

participation dans l’apprentissage associatif n’est pas à exclure. Or, les souris STOP KO

présentent des défauts de plasticité synaptique dans cette région, qui pourraient contribuer à

leurs mauvaises performances. Il n’est pas exclu non plus que ces souris présentent aussi

des déficits de plasticité synaptique dans le striatum.

La transmission cholinergique semble jouer un rôle important dans l’apprentissage et

la mémoire. En effet, des injections intra-striatales d’agonistes et d’antagonistes

cholinergiques augmentent et diminuent respectivement les fonctions mnésiques (Packard et

al., 1996; Hefco et al., 2003). Plusieurs études démontrent l’effet pro-cognitif de la nicotine et

des agonistes nicotiniques chez l’homme et le rongeur (Levin and Simon, 1998; Levin and

Rezvani, 2002). Une co-administration d’antagonistes des récepteurs nicotiniques α4β2

(DHβE) et α7 (MLA) à doses sub-actives dans l’hippocampe ventral potentialise les déficits

de mémoire de travail (Levin et al., 2002). En outre, il apparaît que la co-stimulation de ces

deux types de récepteurs chez la souris, par l’épibatidine (α4β2) et la choline (α7), est

essentielle pour le développement complet de la LTP dans le gyrus dentelé. Ce processus

de LTP est généralement considéré comme substrat de la mémoire (Bliss and Collingridge,



1993; Malenka and Bear, 2004). Or, on observe un accroissement de la densité des

récepteurs nicotiniques α7 dans le striatum dorsal et l’hippocampe des souris mutantes, qui

n’est pas en accord avec les mauvaises performances de ces animaux. On peut donc

supposer que ces récepteurs ne sont pas fonctionnels, soit parce qu’ils sont désensibilisés,

soit parce qu’ils sont sous-stimulés à l’état basal. L’administration d’un agoniste des nAChRs

α7, la choline (à une dose n’engendrant pas d’effet locomoteur significatif), avant chaque

essai du test, permet d’améliorer les performances (latence, distance parcourue et

proportion d’essais réussis) des souris STOP KO, qui ne sont plus significativement

différentes de celles des animaux sauvages. Nos données montrent un effet pro-cognitif d’un

agoniste α7 chez les souris STOP KO, en désaccord avec une éventuelle désensibilisation

des récepteurs α7. L’hypothèse que nous privilégions serait donc que ces récepteurs sont

sous-stimulés à l’état basal, à cause du déficit de libération d’acétylcholine. Nous pouvons

également proposer que le déséquilibre entre la densité des nAChRs β2* (non modifiée) et

α7 (augmentée) soit aussi à l’origine des déficits de mémoire associative (Levin et al., 2002).

Des expériences complémentaires s’avèrent donc nécessaires pour préciser la cause

des déficits de mémoire associative et le mécanisme d’action de la choline. Dans un premier

temps, il serait intéressant de mesurer la concentration extracellulaire d’acétylcholine par

microdialyse ainsi que la fonctionnalité du transporteur vésiculaire VAChT dans le striatum et

l’hippocampe afin d’obtenir des données biochimiques supplémentaires. Au niveau

comportemental, nous pourrions tester les mémoires spatiale et associative dans d’autres

paradigmes (planche à trou de Barnes, test de préférence de place) et tester l’action de

substances pharmacologiques, comme un agoniste des récepteurs β2* (épibatidine) ou un

inhibiteur d’acétylcholinestérase.

Enfin, notons que chez les souris sauvages, l’effet bénéfique de la choline est mineur

puisque ce traitement n’améliore pas la latence et la distance parcourue, mais améliore la

proportion d’essais réussis. Le parallèle peut être fait avec l’action pro-cognitive de la

nicotine chez les humains. En effet, si son action pro-cognitive a clairement été démontrée

chez des patients atteints de schizophrénie, d’ADHD ou de la maladie d’Alzheimer, elle reste

controversée chez les patients sains (Newhouse et al., 2004).



C/ Effets localisés de l’inactivation de STOP

Les mécanismes moléculaires responsables des altérations neurochimiques

observées chez les animaux STOP KO demeurent inconnus à ce jour. Beaucoup de

processus dépendant des microtubules, comme la morphologie et la connectivité cellulaires,

le transport de protéines, des vésicules et des organelles, la fusion des vésicules

synaptiques avec la membrane pourraient être affectés chez ces souris. Contrairement aux

résultats attendus, aucune anomalie morphologique et structurelle du cerveau n’a été

décelée chez les mutants. Malgré une baisse des vésicules glutamatergiques dans le champ

CA1 de l’hippocampe, A. Andrieux et son équipe (2002) n’ont pas trouvé de différence dans

la quantité de protéines synaptiques chez les souris mutantes, suggérant un import normal

des protéines synaptiques vers la zone active de la synapse. Il n’est cependant pas à

exclure que l’import de protéines puisse être différentiellement régulé selon la protéine en

question, le phénotype neuronal et/ou la structure cérébrale.

La protéine STOP est une protéine très ubiquitaire, présente dans les neurones de

toutes les régions cérébrales, avec cependant une expression plus importante dans les

régions à forte plasticité synaptique, hippocampe, bulbes olfactifs et cervelet (Andrieux et al.,

2002). De façon surprenante, son inactivation donne lieu à des modifications biochimiques

spécifiques, qui affectent certaines régions et pas d’autres, qui altèrent différemment divers

systèmes de neurotransmission ou certains composants d’un même système de

neurotransmission et pas les autres. Ainsi, les systèmes glutamatergique et dopaminergique

semblent être touchés de manière opposée (Andrieux et al., 2002; Brun et al., 2005),

l’ensemble des résultats suggérant une diminution de la transmission glutamatergique et une

augmentation de libération de dopamine, indice d’une hyperdopaminergie. La mesure des

taux endogènes et de l’activité des enzymes de synthèse montre par ailleurs une régulation

différente des systèmes dopaminergique et sérotoninergique. Au sein d’un même système,

on observe également des altérations sélectives. Ainsi, la densité du transporteur vésiculaire

VAChT n’est modifiée que dans le champ CA1 de l’hippocampe, celle des récepteurs

nicotiniques β2* n’est pas modifiée, alors que celle des récepteurs α6 et α7 l’est. La densité

des récepteurs dopaminergiques D1 n’est pas modifiée, celle des récepteurs D2 et D3 l’est.

De plus, le système limbique dopaminergique semble être particulièrement touché : une

augmentation significative de l’efflux dopaminergique évoqué a été montrée dans le noyau

accumbens et une tendance non significative à une diminution dans le striatum (Brun et al.,

2005). Certains de nos résultats corroborent ces données : la densité des récepteurs D2



baisse plus fortement (bien que non significativement) dans le noyau accumbens que dans

le striatum, celle des récepteurs D3 n’est modifiée que dans l’ATV, les taux endogènes de

dopamine et l’activité de la tyrosine hydroxylase sont plus fortement diminués dans le noyau

accumbens que dans le striatum. Enfin, nos expériences de capture de dopamine sur

synaptosomes ont montré que la vitesse maximale de recapture de dopamine est

significativement plus faible dans le noyau accumbens des souris STOP KO et qu’elle est

plus élevée dans le striatum, bien que de manière non significative. Ces altérations

sélectives pourraient être dues à un environnement cellulaire différent ou encore à une

expression différentielle de la protéine STOP au cours du développement, qui pourrait

s’exprimer plus ou moins tôt selon les régions cérébrales et les systèmes de

neurotransmission.

Des études complémentaires s’avèrent nécessaires pour comprendre comment la

suppression d’une protéine du cytosquelette, exprimée de façon ubiquitaire, peut conduire à

des altérations spécifiques de certaines régions cérébrales ou voies de neurotransmission.

D/ Validité du modèle d’étude STOP KO pour la schizophrénie

1/ Modélisation animale des maladies psychiatriques

Les premiers modèles animaux de maladie reposaient sur la chirurgie et la

pharmacologie et permettaient d’étudier les conséquences de la perte d’un organe, d’une

structure cérébrale ou de fibres neuronales, ou encore l’effet d’une substance

pharmacologique sur l’animal. Depuis les années 1990, l’avancée des technologies et des

connaissances génomiques a permis l’introduction d’une mutation dans un gène, se

transmettant dans la lignée germinale et donnant naissance à des souris invalidées ou

« knock-out ». Cette technique révolutionnaire, modélisant des maladies et impliquant une

perte de fonction, est très utile pour étudier la fonction d’un gène in vivo mais présente des

limites. L’invalidation du gène d’intérêt est constitutive et totale, ce qui peut affecter le

développement de l’animal ou engendrer des adaptations qui n’existent pas dans la maladie

modélisée. L’évolution de la technique de mutation nulle permet de générer une invalidation

contrôlée dans le temps ou dans l’espace. Il est ainsi possible d’étudier l’effet d’une mutation

à un moment donné du développement ou dans une structure cérébrale précise. Cependant,



il faut garder à l’esprit que ces techniques génétiques, dont la réussite est incertaine,

nécessitent encore à l’heure actuelle un investissement lourd et coûteux.

L’utilisation des modèles animaux pour l’étude de maladies complexes telles que les

maladies psychiatriques, comme la schizophrénie, affectant la perception, la pensée et les

émotions, reste controversée. A priori, il peut paraître insensé de vouloir reproduire les

symptômes majeurs de la schizophrénie, hallucinations, délires et désorganisation de la

pensée -comportements tellement humains- chez l’animal, qu’il soit primate non humain ou

rongeur (Lipska and Weinberger, 2000). Cependant, certains comportements animaux

peuvent être reliés à des symptômes de type schizoïde. De plus, le fort degré d’homologie

entre les génomes humain et murin justifie l’utilisation de la souris dans la modélisation des

maladies humaines. Toutefois, vue la complexité des interactions génétiques et

environnementales suspectées dans l’étiologie de la schizophrénie, il est absolument

nécessaire d’étudier différents modèles animaux. Le but ultime de ces études n’est pas de

créer une souris « schizophrène », mais de se rapprocher au maximum des traits de la

maladie modélisables chez l’animal, en vue de concevoir et de tester l’effet de médicaments

potentiels.

2/ Pertinence du modèle STOP KO : un modèle pour la schizophrénie ?

Récemment, il a été proposé que des affections psychiatriques comme la

schizophrénie et l’autisme pouvaient résulter d’anomalies synaptiques impliquant des

protéines structurales (Harrison and Eastwood, 2001; Jamain et al., 2003). Le produit du

gène DISC1 (Disrupted In Schizophrenia 1), lié à la schizophrénie, est associé aux centres

organisateurs des microtubules et aux protéines associées aux microtubules (Morris et al.,

2003). Par ailleurs, l’inactivation de la protéine stathmine, inhibant la formation des

microtubules chez la souris, est à l’origine de certains troubles comportementaux

(Shumyatsky et al., 2005).

L’ensemble des travaux effectués à l’heure actuelle sur les souris STOP KO suggère

que ces souris partagent certaines caractéristiques avec les modèles animaux utilisés pour

l’étude de la schizophrénie et retrouvées dans cette maladie.

Rappelons premièrement que le gène STOP humain (Map6) est localisé au sein

d’une région chromosomique associée aux troubles schizoïdes (St Clair et al., 1990) et

qu’une association génétique a récemment été découverte entre des polymorphismes de ce



gène et une population de schizophrènes japonais (Shimizu et al., 2006). Cependant,

contrairement à une diminution attendue de l’expression de ce gène, une augmentation des

transcrits d’une des deux isoformes de Map6 a été observée dans le cortex préfrontal d’un

certain nombre de malades de cette même population (Shimizu et al., 2006). Il faut noter

néanmoins que la fonction de cette isoforme de MAP6 est encore inconnue. D’autres études

génétiques et post-mortem sur des populations différentes de patients seront nécessaires

pour valider ces premiers résultats. Chez les animaux STOP KO, la diminution d’expression

des transcrits de différentes protéines synaptiques (synaptophysine, VGLUT1, GAP43,

spinophiline) est similaire à celle observée dans l’hippocampe de patients schizophrènes

(Eastwood, sous presse). Parallèlement, dans cette même région, les souris mutantes

montrent des anomalies biochimiques affectant le système glutamatergique, associées à des

déficits de plasticité synaptique, pouvant découler de la baisse d’expression des ARNm des

protéines synaptiques. Les souris STOP KO semblent donc présenter une hypotransmission

glutamatergique dans l’hippocampe (Andrieux et al., 2002) ainsi qu’une hyper-réactivité

dopaminergique du système limbique (Brun et al., 2005), rejoignant l’hyperdopaminergie

associée à l’hypoglutamatergie soupçonnées chez les schizophrènes. Sur le plan

biochimique, la densité des récepteurs D2 (et D3) diminue dans certaines régions

cérébrales, indice probable d’une hyperdopaminergie constitutive dans ces régions. Ce

résultat est en désaccord avec l’absence de modification de densité des récepteurs D2

retrouvée dans le caudé-putamen de schizophrènes (Farde et al., 1990). Fait étonnant,

aucune différence significative n’a été retrouvée pour la densité et l’état de couplage du

récepteur D1, dans les régions mêmes où la densité des récepteurs D2 diminue. Une seule

étude a décrit une augmentation de ces récepteurs D1 dans le cortex préfrontal de

schizophrènes (Abi-Dargham et al., 2002). Nous ne trouvons pas non plus de variation

significative des récepteurs nicotiniques β2, en désaccord avec les variations régions-

dépendantes observées chez les schizophrènes (Freedman et al., 1995; Durany et al., 2000;

Martin-Ruiz et al., 2003). De plus, les souris invalidées pour la protéine STOP présentent

une forte augmentation du nombre de récepteurs nicotiniques α7 dans l’hippocampe,

contrairement à la diminution de densité décrite chez les malades (Freedman et al., 1995).

Cependant, selon notre hypothèse, ces récepteurs seraient sous-stimulés du fait d’une

libération réduite d’acétylcholine chez les animaux KO. Remarquons qu’il n’est pas

nécessairement judicieux de comparer directement entre eux les différents composants des

neurotransmissions dopaminergique et nicotinique entre souris mutantes et schizophrènes,

mais plutôt de confronter les conséquences résultant de leurs altérations. L’ensemble des

résultats que nous avons obtenus chez les souris STOP KO serait donc en faveur d’une



hyperdopaminergie, tout au moins dans des régions limbiques, et d’une hypocholinergie, tout

au moins dans l’hippocampe, comme cela est décrit dans le système nerveux central des

schizophrènes.

Sur le plan comportemental, rappelons que les souris STOP KO présentent des

troubles du comportement maternel et un fort état d’anxiété, une activité désorganisée et des

déficits du PPI, rappelant la symptomatologie productive de la schizophrénie (Andrieux et al.,

2002). De même, elles sont hypersensibles au stress et à des psychostimulants, tels que

l’amphétamine (Brun et al., 2005), la cocaïne et la nicotine, mimant l’aggravation des

symptômes productifs des schizophrènes en réponse aux agonistes dopaminergiques

indirects et rappelant la co-morbidité psychostimulants-schizophrénie. Ces souris

manifestent un retrait social, en accord avec la symptomatologie déficitaire des

schizophrènes. De façon importante, certains de ces troubles peuvent être restaurés après

administration aiguë ou chronique d’antipsychotiques, démontrant la bonne valeur prédictive

de ce modèle animal (Andrieux et al., 2002). Enfin, au niveau cognitif, nous avons montré

que les animaux mutants avaient une mémoire associative déficiente, qui pourrait être mise

en relation avec les déficits de mémoire de travail des schizophrènes. Des déficits de

plasticité synaptique, notamment de LTP, ont été mis en évidence dans l’hippocampe des

souris STOP KO. Nos travaux démontrent l’effet pro-cognitif de la choline, un agoniste des

nAChRs α7, sur les performances mnésiques des souris mutantes. Ces résultats rappellent

ceux de nombreuses études qui ont démontré l’effet pro-cognitif de la nicotine et du DMXB-

A, un agoniste partiel des récepteurs α7 chez les individus atteints de schizophrénie (Levin

and Rezvani, 2002; Martin et al., 2004; Olincy et al., 2006).

En résumé, l’ensemble de ces études montre que ce modèle de souris STOP KO

présente des similitudes avec des comportements observés chez les patients

schizophrènes. Malgré les discordances relevées, ainsi qu’une étiologie et une

pathophysiologie probablement différentes, définissant les limites de ce modèle animal, il

m’apparaît important de continuer la caractérisation approfondie de ces souris. Ces animaux

peuvent en effet se révéler utiles pour la compréhension de la pathophysiologie de la

schizophrénie ainsi que l’étude des traitements antipsychotiques et pro-cognitifs.


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THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS XIIdoxa.u-pec.fr/theses/th0245450.pdfTHESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS XII Spécialité Neurosciences Présentée par Caroline BOUVRAIS-VERET