et discipline ou spécialité

Jury :

le

Université Toulouse 3 Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier)

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Cécile Gstalder

mercredi 08 juillet 2015

Rôle de la voie sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphatedans l'adaptation à l'hypoxie intratumorale

des adénocarcinomes rénaux à cellules claires

ED BSB : Biotechnologies, Cancérologie

IPBS, CNRS UMR 5089

Pr Alain RAVAUD - RapporteurDr Fabrice SONCIN - Rapporteur

Dr François VALLETTE - Rapporteur

Dr Olivier CUVILLIER - Directeur de ThèseDr Isabelle ADER - Directrice de Thèse

Dr Olivier CUVILLIERDr Isabelle ADER

1!

2!

3!

Table des matières

TABLE DES MATIERES 3

RESUME DES TRAVAUX DE THESE 8

ABSTRACT 9

ABREVIATIONS 10

INTRODUCTION GENERALE 13

CHAPITRE 1: LES ADENOCARCINOMES RENAUX A CELLULES CLAIRES 15

1. Epidémiologie, pronostic et classification des adénocarcinomes rénaux 15

1.1. Epidémiologie, facteurs de risque et diagnostic des adénocarcinomes rénaux 15

1.2. Stade anatomique et pronostic 16

1.3. Classification des adénocarcinomes rénaux 18

1.3.1. Les adénocarcinomes rénaux à cellules claires 18

1.3.2. Les adénocarcinomes rénaux papillaires ou tubulo-papillaires 19

1.3.3. Les adénocarcinomes rénaux à cellules chromophobes 19

1.3.4. Tumeurs rénales rares 20

2. Caractéristiques des adénocarcinomes rénaux à cellules claires 20

2.1. Anomalies génétiques 20

2.1.1. Inactivation du gène suppresseur de tumeur VHL 20

2.1.2. Autres anomalies génétiques 22

2.2. Hypervascularisation 23

2.2.1. L’angiogenèse physiologique 23

2.2.2. L’angiogenèse tumorale 26

3. Prise en charge thérapeutique des adénocarcinomes rénaux à cellules claires 27

3.1. Approche chirurgicale 28

3.1.1. Néphrectomie partielle ou radicale 28

3.1.2. Traitement local ablatif 28

3.1.3. Prise en charge chirurgicale des ccRCC métastatiques 28

3.2. Traitement par chimiothérapie ou radiothérapie 29

3.3. Immunothérapies 29

3.4. Thérapies ciblées 30

3.4.1. Le bevacizumab 30

3.4.2. Les inhibiteurs de récepteurs tyrosine-kinase (TKI) 31

3.4.3. Les inhibiteurs de mTOR 32

4. Stratégies thérapeutiques émergentes 33

4!

4.1. Inhibition des mécanismes de résistance aux anti-angiogéniques 33

4.1.1. Inhibition de l’axe angiopoïétines/Tie-2 34

4.1.2. Inhibition de l’axe HGF/c-Met 34

4.1.3. Inhibition du récepteur ALK-1 35

4.1.4. Inhibition de l’IL-8 35

4.1.5. Inhibition de HDM2 35

4.1.6. Ciblage de l’imitation vasculaire 36

4.2. Identification de nouvelles cibles thérapeutiques 36

4.2.1. HIF-2α 36

4.2.2. La voie SphK1/S1P 37

4.2.3. La voie NF2/Hippo/Yap 37

4.3. Autres stratégies 37

4.3.1. Développement de nouvelles immunothérapies 37

4.3.2. Utilisation néoadjuvante des thérapies ciblées 38

CHAPITRE 2: L’HYPOXIE INTRATUMORALE ET LES FACTEURS HIF 39

1. Homéostasie de l’oxygène et stress hypoxique. 39

2. Les facteurs HIF, acteurs de l’adaptation au stress hypoxique. 40

2.1. HIF-1α 42

2.2. HIF-2α 42

2.3. HIF-3α 43

2.4. HIF-β 43

3. Mécanismes de régulation des facteurs HIF 44

3.1. Mécanismes de régulation dépendants de l’oxygène 44

3.1.1. Régulation de la stabilité des sous-unités HIF-α 44

3.1.2. Régulation de l’activité transcriptionnelle de HIF 46

3.2. Mécanismes de régulation indépendants de l’oxygène 46

3.2.1. Régulation par les protéines HSP90 et RACK1 46

3.2.2. Régulation par modifications post-traductionnelles 47

3.2.3. Régulation par les hormones et les facteurs de croissance 47

3.2.4. Différences de régulation entre HIF-1α et HIF-2α 48

4. Rôle des facteurs HIF en physiologie et physiopathologie 52

4.1. Les facteurs HIF dans le développement et l’embryogenèse 54

4.2. Les facteurs HIF dans le métabolisme glucidique et lipidique 54

4.2.1. Le métabolisme glucidique 54

4.2.2. Le métabolisme lipidique 56

4.3. Les facteurs HIF dans le système cardiovasculaire 57

4.4. Les facteurs HIF dans les cancers 58

5!

4.4.1. Le maintien d’un phénotype dédifférencié 60

4.4.2. La survie et la prolifération cellulaire 61

4.4.3. La reprogrammation métabolique 62

4.4.4. L’induction d’un microenvironnement immunosuppressif 63

4.4.5. L’angiogenèse tumorale 63

4.4.6. L’invasion et la dissémination métastatique 64

5. L’hypoxie et les facteurs HIF comme cibles thérapeutiques en cancérologie 65

5.1. Ciblage de l’hypoxie intratumorale : les prodrogues cytotoxiques 65

5.2. Normalisation du réseau vasculaire tumoral 66

5.2.1. Concept de normalisation vasculaire 66

5.2.2. Données précliniques et cliniques 67

5.3. Stratégies ciblant les facteurs HIF 69

5.3.1. Molécules déjà sur le marché 69

5.3.2. Molécules faisant l’objet d’études cliniques ou précliniques récentes 70

5.4. Discussion 73

CHAPITRE 3: LA VOIE SPHINGOSINE KINASE / SPHINGOSINE 1-PHOSPHATE 74

1. Le métabolisme sphingolipidique 74

1.1. Bases structurales des sphingolipides 74

1.2. Le métabolisme sphingolipidique 74

1.3. Les sphingolipides : lipides bioactifs 77

1.4. Le biostat sphingolipidique 77

2. La voie SphKs/S1P 78

2.1. Les sphingosine kinases 78

2.1.1. Propriétés structurales 79

2.1.2. Propriétés biochimiques 81

2.1.3. Propriétés biologiques 82

2.1.4. Régulation et localisation des SphKs 82

2.2. La S1P, facteur autocrine et paracrine, et ses S1P-récepteurs 84

2.2.1. Le S1P1 85

2.2.2. Le S1P2 86

2.2.3. Le S1P3 87

2.2.4. Le S1P4 87

2.2.5. Le S1P5 88

2.3. La S1P et ses cibles intracellulaires 88

2.3.1. La S1P, inhibiteur des HDAC1/2 89

2.3.2. La S1P, cofacteur de TRAF2 89

2.3.3. La S1P et la prohibitine 2 89

2.3.4. La S1P et la BACE1 90

6!

3. Physiopathologie de la voie SphK1/S1P 90

3.1. La voie SphK1/S1P dans le système immunitaire 90

3.1.1. La sclérose en plaque et le développement du FTY720 92

3.1.2. La polyarthrite rhumatoïde 95

3.1.3. L’asthme 95

3.1.4. Les maladies inflammatoires de l’intestin 95

3.2. La voie SphK1/S1P dans le système cardiovasculaire et le métabolisme 96

3.2.1. La vasculogenèse et l’angiogenèse 96

3.2.2. L’intégrité vasculaire 97

3.2.3. L’infarctus du myocarde 97

3.2.4. L’athérosclérose 97

3.2.5. Le diabète et l’obésité 98

3.3. La voie SphK1/S1P dans les cancers 98

3.3.1. Le biostat sphingolipidique dans la survie et la prolifération tumorale 99

3.3.2. La voie SphK1/S1P dans l’initiation et la progression tumorale 99

3.3.3. La voie SphK1/S1P dans l’angiogenèse et la dissémination métastatique 101

3.3.4. La voie SphK1/S1P dans la résistance thérapeutique 102

3.3.5. Stratégies thérapeutiques ciblant la voie SphK1/S1P 103

PROBLEMATIQUE 107

MATERIELS ET METHODES 113

1. Lignées cellulaires et conditions de culture 115

2. Modèles animaux et conditions expérimentales 115

3. Anticorps 116

4. Réactifs 117

5. Transfection d’ARN interférent 117

6. Western blot 117

7. Test ELISA 118

8. Dosage de l’activité enzymatique de la sphingosine kinase 1 119

9. Test de prolifération cellulaire 121

10. Extraction d’ARN et RT-PCR quantitative 121

11. Coloration à l‘hémalun-éosine 122

12. Immunohistochimie et immunofluorescence 122

12.1. Immunohistochimie 123

12.2. Immunofluorescence 123

13. Analyse de l’hypoxie intratumorale 123

14. Analyse et quantification des immunomarquages 124

7!

15. Numération formule sanguine 124

16. Analyse statistique 124

RESULTATS EXPERIMENTAUX 125

1. La voie SphK1/S1P, un nouveau régulateur clé de HIF-2α dans les ccRCC 127

1.1. Introduction 127

1.2. Article soumis pour publication 129

1.3. Discussion 157

2. Implication des récepteurs à S1P dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α 159

2.1. Rôle des S1P1-3-4-5 dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α 159

2.2. Le S1P1 contrôle l’expression de HIF-1α et HIF-2α 161

2.3. Rôle du S1P1 dans la régulation de l’expression des gènes cibles de HIF (Résultats préliminaires) 166

3. Etude de l’inhibition de la voie SphK1/S1P sur l’adaptation à l’hypoxie intratumorale et sur la

sensibilisation à la chimiothérapie dans un modèle murin de ccRCC 168

3.1. Le FTY720 diminue transitoirement l’expression intratumorale de HIF-1α et HIF-2α ainsi que la

sécrétion tumorale de VEGF 169

3.2. Le FTY720 entraine un remodelage transitoire du réseau vasculaire tumoral associé à une

oxygénation tumorale 172

3.3. Le FTY720 diminue la prolifération et la survie cellulaire tumorale 176

3.4. Le FTY720 chimiosensibilise un modèle murin de ccRCC 179

DISCUSSION 183

1. La SphK1, régulateur clé de l’adaptation cellulaire à l’hypoxie 185

2. Rôle de la S1P et du S1P1 dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α 187

3. Rôle des autres S1PRs dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α 188

4. Le FTY720, inducteur d’une normalisation vasculaire transitoire 188

5. Le FTY720 permet de chimiosensibiliser un modèle murin de ccRCC 190

6. Evaluation de l’effet du FTY720 dans d’autres modèles de ccRCC 192

7. Conclusion générale 192

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 195

TRAVAIL COLLABORATIF 247

8!

Résumé des travaux de thèse

Les adénocarcinomes rénaux à cellules claires (ccRCC), qui représentent 70% des tumeurs

rénales, sont fortement mais irrégulièrement vascularisés, ce qui les rend hypoxiques et donc

résistants aux chimiothérapies. L’hypoxie favorise l’agressivité tumorale via l’activation des

facteurs de transcription HIF-1α et HIF-2α (Hypoxia-Inducible Factors). Pour cette raison, le

ciblage de l’hypoxie intratumorale et des facteurs HIF dans les ccRCC constitue une stratégie

thérapeutique pertinente. !

Dans ce projet, nous montrons pour la première fois que la voie sphingosine kinase

1/sphingosine 1-phosphate (SphK1/S1P) régule HIF-2α in vitro et in vivo. Nos résultats indiquent

que la SphK1 régule le taux intracellulaire et l’activité transcriptionnelle de HIF-2α dans des

lignées de ccRCC représentatives de certains sous-groupes retrouvés en clinique humaine ; et

impliquent la!S1P extracellulaire, via le récepteur S1P1, dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α.

D’autre part, nous avons évalué l’impact de l’inhibition des récepteurs à S1P et de la SphK1 par le

FTY720 dans un modèle de ccRCC in vivo. Nos résultats indiquent que le FTY720 entraine une

diminution transitoire du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α ainsi qu’un remodelage du

réseau vasculaire tumoral. En effet, le FTY720 induit une normalisation vasculaire qui aboutit à

une oxygénation tumorale transitoire. Enfin, nous montrons que ce traitement permet de

sensibiliser un modèle murin de ccRCC à la chimiothérapie.

Ces résultats valident le rôle de la voie SphK1/S1P comme régulateur de l'adaptation à l'hypoxie

dans les ccRCC. Ils constituent une étape indispensable à la transposition en clinique humaine du

concept selon lequel la voie SphK1/S1P peut être ciblée afin de diminuer l’hypoxie intratumorale

et de chimiosensibiliser certains cancers, le FTY720 étant déjà sur le marché.

9!

Abstract

Clear cell renal cell carcinomas (ccRCC) represent 70% of renal tumors. Because of their dense

and irregular vascular network, ccRCC become hypoxic and therefore resistant to

chemotherapies. Hypoxia promotes tumor aggressiveness via the activation of!HIF-1α!and HIF-2α!(Hypoxia-Inducible Factors). For this reason, the control of intratumoral hypoxia and HIF in

ccRCC could be a relevant therapeutic strategy to improve the efficacy of current treatments.

In this study, we show for the first time that the sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate

(SphK1/S1P) pathway regulates HIF-2α in vitro and in vivo. Our results indicate that SphK1

regulates HIF-2α intracellular level and transcriptional activity in ccRCC cell lines that are

representative of some clinical ccRCC subgroups. Our data also involve extracellular S1P, via its

receptor S1P1, in the regulation of HIF-1α!and HIF-2α.!In addition, in a ccRCC mouse model, we

show that FTY720 – an inhibitor of the SphK1/S1P pathway– transiently decreases HIF-1α and

HIF-2α intratumoral level. This is associated with a transient remodeling of the tumor vascular

network indicating that FTY720 induces a vascular normalization that leads to transient tumor

oxygenation. Finally, we show that this treatment sensitizes a ccRCC mouse model to

chemotherapy.

Overall, these results validate the key role of the SphK1/S1P pathway in the adaptation to

hypoxia in ccRCC cell and animal models. Our results provide a mechanistic basis to target the

SphK1/S1P pathway with FTY720 by increasing the efficacy of chemotherapy in ccRCC. They are

a prerequisite for clinical transposition as FTY720 is a drug approved used in human clinic.

10!

Abréviations

αSMA α Smooth Muscle Actin

ABC ATP Binding Cassette

ADN Acide Désoxyribonucléique

ADP Adénosine Diphosphate

AMPc Adénosine Monophosphate cyclique

ARNm Acide Ribonucléique messager

ATP Adénosine Triphosphate

Bcl-2 B cell lymphoma 2

BH3 Bcl-2 Homology Domain 3

bHLH basic Helix Loop Helix

CBP CREB Binding Protein

CerS Ceramide Synthase

ccRCC clear cell Renal Cell Carcinoma

CD Cluster of Differentiation

C-TAD C-terminal Transactivation Domain

DLL4 Delta-Like Ligand 4

DHS Dihydrosphingosine

DMS Dimethylsphingosine

DMSO Dimethylsulfoxide

EDG Endothelial Differentiation Gene

EGF Epidermal Growth Factor

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

EMA European Medicines Agency

eiF eukaryotic initiation Factor

EPAS1 Endothelial PAS domain-containing protein 1

EPO Erythropoïétine

FDA Food and Drug Administration

FGF Fibroblast Growth Factor

FLT3 Fms-Like Tyrosine kinase 3

GLUT Glucose Transporter

GSK3β Glycogen Synthase Kinase 3β

11!

HDAC Histone Deacetylase

HER2 Human Epidermal Growth Factor Receptor 2

HIF Hypoxia-Inducible Factor

HRE Hypoxia Response Element

HRP Horseradish Peroxydase

IL Interleukine

LDL Low Density Lipoprotein

LPS Lipopolysaccharide

MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase

MDR1 Multi-Drug Resistance 1

miR micro Ribonucleic Acid

MMP Matrix Metalloproteinase

mTOR mammalian Target Of Rapamycin

NES Nuclear Export Signal

NLS Nuclear Localization Signal

N-TAD N-terminal Transactivation Domain

ODDD Oxygen-Dependent Degradation Domain

PAI1 Plasminogen Activator Inhibitor 1

PAS Per-ARNT-Sim

PDGF Platelet-Derived Growth Factor

PDGFR Platelet-Derived Growth Factor Receptor

PHD Prolyl Hydroxylase Domain containing protein

PI3K Phosphatidylinositol 3-Kinase

PKC Protein Kinase C

PLC Phospholipase C

PLD Phospholipase D

PP2A Protein Phosphatase 2A

PTEN Phosphatase and Tensin homolog

pVHL protein Von Hippel-Lindau

RCC Renal Cell Carcinoma

RCPG Récepteur Couplé aux Protéines G

ROS Reactive Oxygen Species

S1P Sphingosine 1-Phosphate

S1PR S1P Récepteur

shRNA small hairpin Ribonucleic Acid

12!

siRNA small interfering Ribonucleic Acid

SKi Sphingosine Kinase inhibitor

SphK Sphingosine Kinase

SPL S1P Lyase

Spns2 Spinster homolog 2

SPPase S1P Phosphatase

SPT Serine Palmitoyl Transferase

STAT3 Signal Transducer and Activator of Transcription 3

TGFβ Transforming Growth Factor β

TNFα Tumor Necrosis Factor α

TRAF2 TNF Receptor-Associated Factor 2

TSC Tuberous Sclerosis Complex

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor Receptor

VHL Von Hippel-Lindau

13!

Introduction Générale

14!

15!

Chapitre 1 :

Les adénocarcinomes rénaux à cellules claires

1. Epidémiologie, pronostic et classification des adénocarcinomes rénaux

1.1. Epidémiologie, facteurs de risque et diagnostic des adénocarcinomes rénaux

Les adénocarcinomes rénaux, ou RCC (Renal Cell Carcinoma), représentent 95% des cancers du

rein et se développent généralement à partir des tubules rénaux (Figure 1). Les RCC représentent

3% de l’ensemble des cancers et se placent à la neuvième position en terme de fréquence, avec

près de 340.000 nouveaux cas diagnostiqués en 2012 de part le monde, soit une incidence de

5,8/100.000 qui augmente de 2% par an depuis vingt ans (Bhatt and Finelli 2014, DeSantis et al.

2014, Jonasch et al. 2014). Il s’agit du cancer urologique le plus mortel, avant les cancers de la

vessie et de la prostate (Bhatt and Finelli 2014). En 2012, 11.573 nouveaux cas ont été détectés en

France. L’âge moyen de diagnostic des RCC est de 64 ans, et plus de 80% des patients ont 50 ans

ou plus au moment du diagnostic. Alors que la survie globale à 5 ans est de 72%, 20 à 30% des

patients atteints de RCC sont diagnostiqués au stade métastatique, ce qui réduit

considérablement leur espérance de vie (Bhatt and Finelli 2014, DeSantis et al. 2014). Les RCC sont

deux fois plus fréquents chez l’homme que chez la femme, et leur incidence est la plus élevée

dans les régions développées et industrialisées, telles que les pays d’Amérique du Nord et

d’Europe (DeSantis et al. 2014, Jonasch et al. 2014).

Différents facteurs de risque ont été impliqués dans le développement des RCC, tels que la

maladie de von Hippel-Lindau ; mais aussi le tabagisme, l’hypertension artérielle, l’obésité, ou

encore l’exposition au pétrole et à ses dérivés, à l’amiante et à certains métaux lourds (Bhatt and

Finelli 2014, Jonasch et al. 2014). L’augmentation de l’incidence des RCC est sans doute liée à ces

facteurs de risque, ainsi qu’à l’augmentation de l’utilisation des méthodes de diagnostic.

Très souvent, les RCC sont diagnostiqués de manière fortuite lors d’une imagerie abdominale

puisque les premiers symptômes apparaissent tardivement lors du développement de la maladie.

Parmi ces signes cliniques, les plus fréquents sont une hématurie, une douleur lombaire, la

16!

présence d’une masse abdominale, ou encore de la fièvre (Patard et al. 2003). L’examen

indispensable au diagnostic des RCC est le scanner abdominal ou l’IRM (Imagerie par

Résonnance Magnétique) qui permettent de déterminer s’il est nécessaire d’effectuer une biopsie

ou une néphrectomie. Le diagnostic final sera ensuite basé sur l’examen histologique de ces

dernières (Bhatt and Finelli 2014).

Figure 1. Anatomie du rein et du néphron. La principale fonction du rein est d’assurer l’équilibre hydroélectrolytique de l’organisme, en régulant la pression artérielle et en filtrant le plasma pour former l’urine. Le néphron est l’unité structurelle et fonctionnelle du rein. La filtration du plasma a lieu au niveau du glomérule, ce qui aboutit à la formation de l’urine primitive dont la composition sera modifiée suite à son passage dans le néphron, jusqu’au tube collecteur.

1.2. Stade anatomique et pronostic

La détermination du pronostic des RCC est importante à la fois pour le choix de la stratégie

thérapeutique et pour la prise en charge psychologique du patient. Le pronostic est évalué à

l’aide du système TNM (Tumor Node Metastasis) qui tient compte de la taille de la tumeur

primaire et de son degré d’invasion locale (T), de l’invasion des ganglions lymphatiques

régionaux (N) et de la présence de métastases à distance (M) (Tableau 1). La quantification de ces

trois critères détermine le stade anatomique du cancer qui pourra alors être associé à un pronostic

de survie (Figure 2).

17!

Tableau 1. Classification TNM des adénocarcinomes rénaux. D’après Jonasch et al, 2014.

Tumeur primaire (T) TX Estimation impossible T0 Absence de tumeur T1 Tumeur de moins de 7 cm et limitée au rein T1a Tumeur de moins de 4 cm et limitée au rein T1b Tumeur de 4 à 7 cm et limitée au rein T2 Tumeur de plus de 7 cm et limitée au rein T2a Tumeur de 7 à 10 cm et limitée au rein T2b Tumeur de plus de 10 cm et limitée au rein T3 Tumeur étendue aux veines ou aux tissus péri-néphrétiques

Absence d’envahissement de la glande surrénale et au-delà du fascia de Gerota T3a Tumeur étendue à la veine rénale, à ses branches, ou au sinus rénal T3b Tumeur étendue à la veine cave sous-diaphragmatique T3c Tumeur étendue à la veine cave sus-diaphragmatique T4 Tumeur étendue à la glande surrénale ou au-delà du fascia de Gerota Ganglions lymphatiques régionaux (N)

NX Estimation impossible N0 Absence de métastase ganglionnaire N1 Métastase(s) au niveau d’un ou plusieurs ganglion(s) Métastases à distance (M) M0 Absence de métastase(s) à distance M1 Métastase(s) à distance

Figure 2. Stades anatomiques des adénocarcinomes rénaux et pronostic de survie à 5 ans. T : tumeur primaire; N : ganglion lymphatique régional ; M : métastase à distance. Adapté de Cohen & McGovern, 2005.

18!

Ainsi, les patients atteints d’un RCC de stade I ont un pronostic de survie à 5 ans de 80 à 95% et

ceux atteints d’un RCC de stade II ont un pronostic de survie à 5 ans de 80% (Elmore et al. 2003).

Chez l’ensemble de ces patients, l’invasion de la tumeur jusqu’au bassinet, l’uretère, la vessie ou

l’urètre fait chuter la survie à 5 ans à 43% (Verhoest et al. 2009). Les patients atteints d’un RCC de

stade III ont quant à eux un pronostic de survie à 5 ans de 60%. Enfin, les patients atteints d’un

RCC de stade IV ont un pronostic de survie à 5 ans inférieur à 10%, avec une survie globale

médiane qui est passée de 15 mois à plus de deux ans avec le développement des thérapies

ciblées (Motzer et al. 1996, Motzer et al. 1999, Jonasch et al. 2014). Le pronostic des RCC est

également évalué par le grade de Fuhrman, qui varie entre 1 et 4 et qui tient compte des

caractéristiques histologiques de la tumeur, notamment de la taille et de la forme des noyaux des

cellules tumorales. Enfin, le pronostic de survie des patients atteints d’un RCC métastatique peut

être évalué à l’aide de l’algorithme MSKCC (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) qui tient

compte des cinq caractéristiques défavorables suivantes :

- un indice de Karnofsky inférieur ou égal à 20% (sujet malade et perte totale d’autonomie) ;

- une hypercalcémie ;

- une anémie ;

- un taux de lactate déshydrogénase une fois et demi supérieur à la normale

- une période de moins d’un an entre le diagnostic du RCC et l’administration du premier

traitement systémique.

Ainsi, les patients ne présentant aucune de ces caractéristiques ont une survie médiane de 30

mois, alors que ceux qui en présentent trois ou plus ont une survie médiane de 4,8 mois (Motzer

et al. 1999, Heng et al. 2009, Jonasch et al. 2014).

1.3. Classification des adénocarcinomes rénaux

Parmi les tumeurs rénales malignes de l’adulte, on trouve principalement les adénocarcinomes à

cellules claires (≈70% des cas), les adénocarcinomes papillaires ou tubulo-papillaires (≈15% des

cas) et les adénocarcinomes à cellules chromophobes (≈10% des cas).

1.3.1. Les adénocarcinomes rénaux à cellules claires

Ces cancers représentent 70% de l’ensemble des cancers du rein, et se développent à partir du

tubule proximal. Leur caractérisation histologique met en évidence des cellules tumorales

grandes et claires, dont le cytoplasme est chargé de glycogène et de lipides. Ces cellules seraient

19!

regroupées en amas et entourées par un réseau vasculaire très dense. Les adénocarcinomes

rénaux à cellules claires (ccRCC) sont majoritairement caractérisés par l’inactivation du gène

suppresseur de tumeur VHL (Von Hippel-Lindau), causant la perte de la protéine pVHL (protein

Von Hippel-Lindau), et ont un mauvais pronostic (Bhatt and Finelli 2014, Jonasch et al. 2014). La

partie 2 de ce chapitre est dédié aux ccRCC.

1.3.2. Les adénocarcinomes rénaux papillaires ou tubulo-papillaires

Les adénocarcinomes rénaux papillaires ou tubulo-papillaires (pRCC) se développent à partir du

tubule proximal et se classent en deuxième position des tumeurs rénales les plus fréquentes. Il

existe deux sous-types de pRCC, les pRCC de type 1 dont les cellules sont basophiles, et les pRCC

de type 2 dont les cellules sont éosinophiles (Klatte et al. 2009, Bhatt and Finelli 2014). Des

mutations germinales ou somatiques au niveau du domaine tyrosine kinase de l’oncogène c-Met

prédisposeraient au développement d’un pRCC de type 1, dont le pronostic est plutôt bon

(Schmidt et al. 1997). D’autre part, des mutations du gène codant pour la fumarate hydratase sont

à l’origine d’une maladie génétique nommée « léiomyomatose familiale et cancer du rein » ou

HLRCC (Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Cancer). Les patients atteints de cette pathologie

présentent un risque de développer un pRCC de type 2, dont le pronostic est mauvais (Toro et al.

2003).

1.3.3. Les adénocarcinomes rénaux à cellules chromophobes

Les adénocarcinomes rénaux à cellules chromophobes (chRCC) se développent entre le tubule

contourné distal et le tube collecteur. Ils se caractérisent par des cellules au cytoplasme

transparent et à l’index mitotique faible (Yamazaki et al. 2003). La plupart des cellules des chRCC

présentent des anomalies chromosomiques, ou des pertes chromosomes entiers, dont les

conséquences restent incertaines (Speicher et al. 1994). D’autre part, des mutations au niveau des

gènes codant pour PTEN (Phosphatase and Tensin homolog) et p53 auraient été identifiées dans les

chRCC. Enfin, le syndrome de Birt-Hogg-Dubé, causé par des mutations germinales au niveau du

gène codant pour la folliculine, prédispose à l’apparition d’un chRCC (Schmidt et al. 2005). Ces

tumeurs sont généralement celles qui présentent le moins de risque de développer des

métastases, et ont un bon pronostic (Bhatt and Finelli 2014, Jonasch et al. 2014).

20!

1.3.4. Tumeurs rénales rares

Parmi les tumeurs rénales rares, on trouve les adénocarcinomes des tubes collecteurs, les

adénocarcinomes médullaires et les adénocarcinomes de la sphère urothéliale (calice, bassinet,

uretère, vessie, urètre). Chacun de ces types tumoraux représente moins de 5% des cancers du

rein. Il s’agit de tumeurs qui ressemblent peu aux autres RCC et dont la prise en charge n’est pas

standardisée. Alors que la physiopathologie de ces tumeurs est globalement peu connue, il a

néanmoins été montré que les adénocarcinomes médullaires se développent principalement chez

des patients atteints d’une hémoglobinopathie et qu’ils seraient caractérisés par l’inactivation du

gène suppresseur de tumeur SMARCB1 (SWI/SNF-related Matrix-associated Actin-dependent

Regulator of Chromatin subfamily B member 1) (Liu et al. 2013, Jonasch et al. 2014).

2. Caractéristiques des adénocarcinomes rénaux à cellules claires

2.1. Anomalies génétiques

2.1.1. Inactivation du gène suppresseur de tumeur VHL

L’inactivation somatique biallélique du gène VHL se produit dans la plupart des ccRCC

sporadiques où l’incidence d’une mutation de ce gène peut atteindre 91% selon les études

(Gossage et al. 2015). Ce gène peut également être délété ou méthylé dans les ccRCC (Young et al.

2009). Le gène suppresseur de tumeur VHL a été identifié en 1993 lorsqu’il a été retrouvé muté

chez des familles atteintes de la maladie de von Hippel-Lindau (Latif et al. 1993). Il s’agit d’une

maladie héréditaire rare, autosomale dominante et néoplasique qui se caractérise par l’apparition

de différents types de tumeurs, tels que des hémangioblastomes de la rétine ou du système

nerveux central, des phéochromocytomes, des ccRCC ou des adénocarcinomes pancréatiques,

pouvant être associés à des kystes rénaux ou pancréatiques (v. Hippel 1904, Lindau 1927) (Maher

et al. 2011). La maladie de von Hippel-Lindau est diagnostiquée chez les patients sans antécédents

familiaux qui présentent deux tumeurs parmi celles mentionnées ci-dessus, et chez les patients

avec antécédents familiaux qui présentent une tumeur parmi celles mentionnées ci-dessus

(Gossage et al. 2015). Dans cette pathologie, un allèle du gène VHL est hérité avec une mutation,

et le développement de kystes ou de tumeurs résulte de l’inactivation ou de la perte de l’allèle

21!

wild-type. Le rôle suppresseur de tumeur de VHL a été mis en évidence lorsque des études ont

montré que l’inactivation de ses deux allèles est un événement crucial dans le développement des

tumeurs associées à la maladie de von Hippel-Lindau, mais aussi des ccRCC sporadiques non

héréditaires (Zbar et al. 1987, Tory et al. 1989, Crossey et al. 1994) (Figure 3). Dans le même sens,

une étude a montré que la réintroduction de la protéine pVHL dans la lignée 786-O, une lignée

cellulaire de ccRCC VHL-/-, inhibe la capacité de ces cellules à former des tumeurs chez des souris

nude (Iliopoulos et al. 1995). A ce jour, peu d’études ont évalué le rôle de VHL en tant que

marqueur pronostic des ccRCC et aucun lien n’a été établi entre la présence ou l’absence de

mutation de VHL et l’issue des ccRCC sporadiques (Gossage et al. 2015).

Figure 3. Etapes du développement des ccRCC. Le développement des ccRCC héréditaires liés à la maladie de von Hippel-Lindau (A) est plus rapide et nécessite moins d’étapes que celui des ccRCC sporadiques (B), en raison d’une mutation prédisposant à la maladie. Ainsi, les ccRCC liés à la maladie de Von Hippel-Lindau apparaissent plus tôt et sont souvent multifocaux. Adapté de Cohen & McGovern, 2005.

Dans les années 1990, des études ont montré que les tumeurs associées à l’inactivation de VHL,

dont les ccRCC, étaient hypervascularisées en raison de leur surproduction de VEGF (Vascular

Endothelial Growth Factor), principal facteur pro-angiogénique (Wizigmann-Voos et al. 1995,

Gnarra et al. 1996). Une autre étude a montré que les cellules 786-O (VHL-/-) expriment l’ARNm

du VEGF, de GLUT1 (Glucose Transporter 1) et du PDGFβ (Platelet-Derived Growth Factor β)

quelque soit la concentration en oxygène, alors qu’ils ne sont exprimés qu’à de faibles

concentrations en oxygène (hypoxie) dans les lignées VHL+/+ (Iliopoulos et al. 1996). Cette étude a

22!

ainsi montré qu’en présence d’oxygène, pVHL régule négativement l’expression de protéines

induites en hypoxie, et qu’en absence de pVHL, ces protéines sont surexprimées même en

présence d’oxygène afin de créer un microenvironnement favorable à la croissance tumorale. Par

la suite, une étude a montré que pVHL régule HIF-1α (Hypoxia-Inducible Factor 1α), un facteur de

transcription régulant l’expression de nombreux gènes, tels que le VEGF, GLUT1 et le PDGFβ

(Maxwell et al. 1999). HIF-1α et HIF-2α étant les principaux facteurs d’adaptation à l’hypoxie, ils

sont activés en hypoxie et dégradés par le protéasome en présence d’oxygène suite à leur

interaction avec pVHL (Maxwell et al. 1999, Cockman et al. 2000). Alors que la régulation de HIF-

1α et HIF-2α est la clé du rôle suppresseur de tumeur de pVHL, plusieurs études ont suggéré que

c’est HIF-2α, et non HIF-1α, qui jouerait un rôle crucial dans la progression des ccRCC (Keith et

al. 2012). En effet, une étude effectuée dans un modèle murin établi par xénogreffe hétérotopique

de cellules de ccRCC a montré qu’un variant de HIF-2α ne pouvant pas interagir avec pVHL

empêche ce dernier d’exercer son rôle suppresseur de tumeur, et qu’à l’inverse, l’inhibition de

l’expression de HIF-2α est suffisante pour empêcher la formation de tumeur par des cellules 786-

O (VHL-/-) (Kondo et al. 2003). A l’inverse, des études effectuées dans des modèles murins établis

par xénogreffe de cellules de ccRCC montrent que HIF-1α ne semble pas être indispensable à la

progression tumorale des ccRCC où il fonctionnerait même comme un suppresseur de tumeur

(Raval et al. 2005, Shen et al. 2011). Cependant, à ce jour, seule l’activation constitutive de HIF-1α,

et non de HIF-2α, dans les cellules du tubule proximal de souris – lieu de l’initiation

physiologique des ccRCC – à été décrite comme favorisant le développement d’un ccRCC (Fu et

al. 2011, Fu et al. 2013).

2.1.2. Autres anomalies génétiques

Contrairement à la plupart des autres tumeurs épithéliales, les ccRCC ne présentent que rarement

des mutations au niveau des gènes codant pour p53, B-Raf, pRB (Retinoblastoma-associated protein),

EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) ou HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)

(Gossage et al. 2015). Alors qu’une étude a montré que la seule inactivation de VHL dans le tubule

proximal n’est pas suffisante au développement d’un ccRCC (Rankin et al. 2006) (Figure 3), des

études récentes ont impliqué de nouveaux gènes dans la progression de ces tumeurs. Ainsi, les

gènes BAP1 (BRCA1-associated protein 1), SETD2 (SET domain-containing 2) et PBRM1 (protein

Polybromo 1) sont retrouvés mutés dans respectivement 8 à 11%, 3 à 12% et 41% des ccRCC (Duns

et al. 2010, Varela et al. 2011, Pena-Llopis et al. 2012, Cancer Genome Atlas Research 2013).

D’autres mutations au niveau des gènes KDM5C (lysine-specific demethylase 5C) et KDM6A (lysine-

23!

specific demethylase 6A) ont également été retrouvées respectivement dans 4 à 9% et 1 à 7% des

ccRCC. Ces cinq gènes sont impliqués dans la régulation de l’activation de la chromatine

(Gossage et al. 2015). Dans environ 20% des ccRCC, des mutations ont été décrites au niveau de

gènes codant pour des protéines de la voie mTOR (mammalian Target Of Rapamycin), tels que

MTOR, TSC1 (Tuberous Sclerosis 1), PIK3CA (PI3K catalytic subunit α) et PTEN (Brugarolas 2014).

Alors que des mutations au niveau du gène VHL sont considérées comme étant ubiquitaires dans

les ccRCC, celles au niveau des autres gènes ne sont pas partagées par toutes les tumeurs. De

plus, au sein d’une même tumeur, il existe une hétérogénéité des mutations qui suggère que des

clones tumoraux présentant différentes mutations pourraient répondre différemment aux

thérapies anti-tumorales (Gerlinger et al. 2012).

2.2. Hypervascularisation

L’inactivation de VHL dans les ccRCC et la surproduction de VEGF qui en résulte rendent ces

tumeurs hypervascularisées et favorisent ainsi la progression tumorale (Takahashi et al. 1994).

2.2.1. L’angiogenèse physiologique

Chez l’embryon, la formation de vaisseaux sanguins résulte de la différenciation d’angioblastes,

précurseurs endothéliaux, en cellules endothéliales qui vont s’assembler pour former un réseau

vasculaire, c’est la vasculogenèse (Swift and Weinstein 2009). L’angiogenèse correspond quant à

elle à la formation de nouveaux vaisseaux à partir de ce réseau vasculaire dans le but de

l’expandre. Les vaisseaux ainsi formés seront ensuite remodelés en artères, veines ou capillaires

(Potente et al. 2011). Chez l’adulte, les cellules endothéliales sont généralement quiescentes et ont

une longue durée de vie. Elles sont en effet protégées par des signaux de survie et de

maintenance autocrines et paracrines, comme le VEGF, le FGF (Fibroblast Growth Factor),

l’angiopoïétine-1 et Notch. Les vaisseaux sanguins ayant pour rôle d’approvisionner l’organisme

en oxygène, les cellules endothéliales expriment les facteurs d’adaptation à l’hypoxie HIF-1α et

HIF-2α qui permettent aux vaisseaux de se remodeler afin d’assurer leurs fonctions. Les cellules

endothéliales quiescentes forment une monocouche et sont connectées entre elles par des

molécules d’adhésion telles que la VE-cadhérine (Vascular Endothelial cadherin). Elles sont

recouvertes d’une gaine de péricytes, qui inhibent leur prolifération et libèrent des signaux de

survie tels que le VEGF et l’angiopoïétine-1. Les cellules endothéliales et les péricytes produisent

et partagent une membrane basale commune qui les maintient en place (Eble and Niland 2009,

24!

Carmeliet and Jain 2011a). En présence d’un signal pro-angiogénique, tel que le VEGF,

l’angiopoïétine-2, le FGF ou des cytokines qui peuvent être libérées par des cellules hypoxiques

ou inflammatoires, les vaisseaux sanguins perdent leur quiescence et deviennent activés (Figure

4A). En réponse à l’angiopoïétine-2, les péricytes vont se détacher des cellules endothéliales et se

libérer de la membrane basale par dégradation protéolytique médiée par les MMPs (Matrix

Metalloproteinases) (Augustin et al. 2009, Carmeliet and Jain 2011a). Les cellules endothéliales

desserrent leurs jonctions et le vaisseau se dilate. Sous l’action du VEGF, la perméabilité de la

monocouche formée par les cellules endothéliales va augmenter et la membrane basale va se

dégrader pour faire place à une matrice extracellulaire provisoire et riche en facteurs pro-

angiogéniques. Afin de former un nouveau vaisseau fonctionnel et de prévenir la migration d’un

trop grand nombre de cellules endothéliales en réponse aux signaux pro-angiogéniques, une

seule cellule endothéliale, nommée tip cell, est sélectionnée pour former la pointe du nouveau

vaisseau en formation (Carmeliet and Jain 2011a). Le VEGF stimule la formation de filopodes par

la tip cell, ce qui lui permettra de guider et d’orienter le nouveau vaisseau (De Smet et al. 2009).

Les cellules endothéliales voisines de la tip cell sont nommées stalk cells. Elles établissent des

jonctions adhérentes avec les cellules voisines, produisent une nouvelle membrane basale et

forment la lumière vasculaire (Figure 4B). Elles produisent moins de filopodes mais prolifèrent

plus que la tip cell afin d’allonger le nouveau vaisseau (Potente et al. 2011). L’acquisition des

phénotypes tip cell et stalk cells est transitoire et est régulée par les axes VEGF/VEGFR2 (VEGF

Receptor 2) et DLL4 (Delta Like Ligand 4)/Notch. En effet, en présence de VEGF, l’activation du

VEGFR2 va augmenter l’expression de DDL4 par les cellules endothéliales. La cellule qui exprime

DDL4 le plus fortement et le plus rapidement devient la tip cell, et grâce à DLL4, va activer le

récepteur Notch dans les cellules endothéliales voisines qui deviendront ainsi des stalk cells (Phng

and Gerhardt 2009, Jakobsson et al. 2010). La rencontre entre deux tip cells de deux vaisseaux

naissants aboutit à l’anastomose de ces vaisseaux qui est consolidée par la VE-cadhérine et

favorisée par la présence de macrophages (Fantin et al. 2010) (Figure 4C). Afin d’être fonctionnel,

le nouveau vaisseau formé doit devenir stable et mature. La formation d’une membrane basale

par les TIMPs (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases) et PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor 1), le

recrutement péricytaire par l’axe PDGFβ/PDGFRβ et la formation de jonctions adhérentes entre

les cellules endothéliales contribuent à ce processus (Potente et al. 2011). Le flux sanguin participe

également à la maintenance du nouveau vaisseau qui régressera s’il n’est plus perfusé.

Finalement, l’acheminement d’oxygène et de nutriments aux différents organes inactive les

différents senseurs de l’oxygène et diminue l’expression du VEGF, de façon à ce que les vaisseaux

sanguins acquièrent à nouveau un phénotype quiescent (Potente et al. 2011).

25!

Figure 4. Représentation de l’angiogenèse. ANG : angiopoietin ; DLL4 : delta like ligand 4 ; FGF : fibroblast growth factor ; MEC : extracellular matrix; MMPs : matrix metalloproteinases ; PAI1 : plasminogen activator inhibitor 1 ; PDGF(R)β : platelet-derived growth factor (receptor) β ; TGFβ : transforming growth factor β ; TIMPs : tissue inhibitors of metalloproteinases ; VEGF(R) : vascular endothelial growth factor (receptor) . Adapté de Carmeliet & Jain, 2011.

26!

2.2.2. L’angiogenèse tumorale

Chez l’adulte, les vaisseaux sanguins sont quiescents hormis dans certaines conditions

physiologiques, telles que la cicatrisation, qui vont activer l’angiogenèse de manière transitoire. A

l’inverse, lors de la progression tumorale, un switch angiogénique a lieu, stimulant la formation de

nouveaux vaisseaux pour favoriser l’expansion tumorale. Ce switch perdure dans le temps et est

la conséquence de la rupture de l’équilibre qui existe entre les facteurs anti-angiogéniques et les

facteurs pro-angiogéniques en faveur de ces derniers (Hanahan and Folkman 1996).

En raison de la surproduction de facteurs pro-angiogéniques, le réseau vasculaire tumoral est très

dense, structurellement et fonctionnellement anormal, et son organisation est chaotique, ce qui a

pour conséquence l’acquisition d’un phénotype plus agressif par la tumeur (Carmeliet and Jain

2000). En effet, le réseau vasculaire est dense dans certaines régions de la tumeur, et pauvre à

d’autres endroits. Les vaisseaux sanguins sont irréguliers, tortueux, anormalement larges ou trop

fins avec une lumière vasculaire variable (Eberhard et al. 2000, Potente et al. 2011). Chaque

composant du vaisseau sanguin tumoral est anormal, à commencer par les cellules endothéliales

qui perdent leur apparence pavimenteuse et leur polarité, sont faiblement interconnectées, sont

parfois organisées en multicouche et peuvent se détacher de la membrane basale (Hashizume et

al. 2000, Carmeliet and Jain 2011b, Potente et al. 2011) (Figure 5). Cette dernière a une composition

et une épaisseur irrégulière. Les péricytes y sont souvent mal fixés, sont peu nombreux, et sont

souvent hypocontractiles (Eberhard et al. 2000, Potente et al. 2011). L’ensemble de ces anormalités

structurales rend la perfusion tumorale irrégulière, réduit la délivrance en oxygène et en

nutriments, et altère l’acheminement des cellules du système immunitaire et des agents

thérapeutiques dans la tumeur (Jain 2005). La perméabilité vasculaire et l’augmentation de la

masse tumorale augmentent la pression interstitielle ce qui entrave d’autant plus la distribution

d’oxygène, de nutriments et d’agents thérapeutiques dans la tumeur (Jain 1988). Cette

perméabilité vasculaire facilite également le passage des cellules tumorales dans la circulation

sanguine et donc la dissémination métastatique (Cooke et al. 2012). De plus, la tumeur étant

faiblement approvisionnée par son réseau vasculaire, les cellules tumorales vont continuer à

stimuler l’angiogenèse afin de compenser le mauvais fonctionnement des vaisseaux existants.

Cependant, cet excès de facteurs pro-angiogéniques ne fait qu’amplifier la désorganisation du

réseau vasculaire, aggravant ainsi l’hypoperfusion tumorale. C’est un cercle vicieux qui rend la

tumeur hypoxique et acidifie le milieu extracellulaire. Ceci contribue à la sélection de cellules

tumorales plus agressives, promeut la dissémination métastatique et favorise la résistance aux

thérapies conventionnelles telles que les chimiothérapies et les radiothérapies (Carmeliet and Jain

2011b, Potente et al. 2011). De plus, les ccRCC étant des tumeurs très vascularisées, une étude

27!

effectuée sur des échantillons tumoraux de patients atteints de ccRCC a montré qu’un taux élevé

de VEGF est corrélé avec un grade tumoral plus élevé et qu’une forte densité vasculaire est

corrélée avec une plus courte survie des patients (Iakovlev et al. 2012).

Figure 5. Anormalités structurales et fonctionnelles des vaisseaux sanguins tumoraux. Adapté de Goel et al, 2011.

3. Prise en charge thérapeutique des adénocarcinomes rénaux à cellules claires

Le traitement des ccRCC localisés repose sur la chirurgie. Dans le cas de ccRCC localement

avancés ou métastatiques, une chirurgie complète – incluant la tumeur primaire et les métastases

– est peu fréquemment réalisée, puisque dans la majorité des cas l’approche chirurgicale n’est pas

envisageable. Cependant, la chirurgie constitue à ce jour le seul traitement curatif des ccRCC

localement avancés ou métastatiques. En effet, leur traitement médical ne permet pour l’instant

que de ralentir l’évolution de la maladie.

28!

3.1. Approche chirurgicale

3.1.1. Néphrectomie partielle ou radicale

La néphrectomie partielle ou radicale constitue le traitement de référence des ccRCC localisés.

L’approche chirurgicale est dictée par la taille, la localisation et le stade tumoral, ainsi que par

d’autres caractéristiques anatomiques propres à chaque patient. Alors que la néphrectomie

radicale consiste en l’ablation totale du rein, de la glande surrénale et des ganglions lymphatiques

régionaux, la néphrectomie partielle préserve la fonction rénale. Elle est donc privilégiée lorsque

la tumeur est de petite taille, et lorsque le patient présente des tumeurs sur les deux reins ou une

comorbidité, telle que l’insuffisance rénale, l’hypertension artérielle ou le diabète (Cohen and

McGovern 2005, Campbell et al. 2009, Jonasch et al. 2014). Cependant, des études cliniques ont

montré que le taux de survie est plus élevé et le risque de récidive plus faible chez les patients

ayant subi une néphrectomie radicale par rapport à ceux ayant subi une néphrectomie partielle

(Van Poppel et al. 2007, Van Poppel et al. 2011).

3.1.2. Traitement local ablatif

Ce type d’intervention est réalisé à l’aide d’une aiguille insérée à travers la peau. Les méthodes de

traitements incluent l’ablation par radiofréquence et la cryoablation. Bien que l’ablation par

radiofréquence soit encore en cours d’évaluation, cette méthode semble être bien tolérée et

efficace en terme de contrôle de la croissance tumorale (Siva et al. 2012). A ce jour, aucune étude

clinique n’a comparé les techniques de traitement local ablatif entre elles ni avec la néphrectomie.

Ces méthodes étant très peu invasives, elles pourraient être utilisées pour l’ablation de petites

tumeurs chez des patients ne pouvant pas être opérés (Johnson et al. 2004, Siva et al. 2012, Jonasch

et al. 2014).

3.1.3. Prise en charge chirurgicale des ccRCC métastatiques

Actuellement, 20 à 30% des ccRCC sont diagnostiqués au stade métastatique. Si l’état général des

patients le permet, il est généralement conseillé de réaliser une néphrectomie dite

« cytoréductive », afin de réduire la taille de la tumeur avant de commencer un traitement

médical. Ainsi, deux études cliniques de phase III ont montré une amélioration de la survie des

patients atteints d’un ccRCC métastatique lorsqu’ils subissent une néphrectomie cytoréductive

29!

avant d’être traités par l’interféron α (Flanigan et al. 2001, Mickisch et al. 2001). Une étude clinique

de phase III actuellement en cours évalue l’effet d’une néphrectomie cytoréductive chez des

patients traités au sunitinib (NCT00930033).

3.2. Traitement par chimiothérapie ou radiothérapie

Bien que les chimiothérapies constituent des standards thérapeutiques pour beaucoup de

tumeurs, elles ne font pas partie des stratégies thérapeutiques utilisées pour le traitement des

ccRCC. En effet, ces tumeurs sont historiquement et toujours considérées comme étant résistantes

aux traitements par mono- et polychimiothérapies (Lilleby and Fossa 2005).

La surexpression de la protéine MDR1 (Multidrug Resistance protein 1), ou glycoprotéine P, est l’un

des principaux mécanismes de chimiorésistance des ccRCC (Mickisch et al. 1990). Cette protéine

fait partie de la superfamille des transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) et est capable

d’exporter les agents chimiothérapeutiques hors de la cellule (Juliano and Ling 1976). D’autres

mécanismes ont été impliqués dans la chimiorésistance des ccRCC, comme la surexpression de la

glutathione-S-transférase, de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), ou comme

l’accumulation de HIF-2α (Mickisch et al. 1990, Kausch et al. 2005, Roberts et al. 2009).

Bien que les ccRCC soient considérés comme étant résistants aux chimiothérapies, il existe un

regain d’intérêt pour cette stratégie thérapeutique puisque plusieurs études cliniques et

précliniques évaluent l’efficacité d’agents chimiothérapeutiques en association avec d’autres

thérapies dans le traitement des ccRCC métastatiques (Richey et al. 2011, Buti et al. 2013, Fisher et

al. 2013).

A l’instar des chimiothérapies, les radiothérapies ne constituent pas des standards thérapeutiques

pour le traitement des ccRCC, puisque ces tumeurs sont historiquement considérées comme y

étant résistantes. Actuellement, dans le traitement des ccRCC, l’utilisation des radiothérapies est

donc limitée au traitement palliatif de certaines métastases, ou encore au traitement de certaines

tumeurs récurrentes ou inopérables dans le but de contrôler le volume tumoral (Escudier et al.

2012).

3.3. Immunothérapies

Des agents immunomodulateurs peuvent être utilisés dans le traitement des ccRCC afin

d’augmenter l’antigénicité de ces tumeurs ou de stimuler l’immunosurveillance de l’hôte.

30!

L’utilisation de l’interféron-α a constitué une stratégie thérapeutique classique avant l’arrivée des

thérapies ciblées, puisque des études ont montré qu’environ 14% des patients atteints d’un ccRCC

métastatique répondent à ce traitement lorsqu’il est administré en monothérapie (Cohen and

McGovern 2005). L’interféron-α s’est ensuite avéré moins efficace que les thérapies ciblées en

terme de survie sans progression, et est globalement mal toléré. Actuellement, il n’est utilisé

qu’en association avec le bevacizumab, un anticorps anti-VEGF, chez des patients dont le

pronostic de survie est moyen ou bon (Jonasch et al. 2014, Ljungberg et al. 2015) (Tableau 2).

Un autre agent immunomodulateur, l’IL-2 (Interleukin 2), a longtemps constitué le traitement

standard des ccRCC localement avancés ou métastatiques. L’utilisation de l’IL-2 n’est

actuellement plus recommandée puisque son potentiel curatif est limité à un faible pourcentage

de patients. De plus, à ce jour, il n’existe pas de biomarqueurs permettant de sélectionner les

patients répondeurs à un traitement à l’IL-2 (Yang et al. 2003b, Jonasch et al. 2014).

3.4. Thérapies ciblées

La forte production de VEGF tumoral due à l’inactivation de VHL dans la plupart des ccRCC

sporadiques et héréditaires a conduit au développement de plusieurs molécules anti-

angiogéniques, ciblant le VEGF circulant ou ses récepteurs. Cinq de ces agents ont été approuvés

par la FDA (Food and Drug Administration) pour le traitement des ccRCC métastatiques (Jonasch et

al. 2014) (Tableau 2). De plus, des mutations au niveau des gènes codants pour les protéines de la

voie PI3K/Akt/mTOR se produisent régulièrement dans les ccRCC, suggérant l’importance de

cette voie dans la carcinogenèse rénale et initiant le développement d’inhibiteurs de mTOR, dont

deux ont été approuvés par la FDA pour le traitement des ccRCC métastatiques (Cancer Genome

Atlas Research 2013) (Tableau 2).

3.4.1. Le bevacizumab

Le bevacizumab est un anticorps monoclonal humanisé dirigé contre le VEGF-A, communément

appelé VEGF, dont l’utilisation a été approuvée par l’EMA (European Medicines Agency) en 2005 et

par la FDA en 2009. En premier lieu, une étude clinique de phase II a montré l’efficacité du

bevacizumab dans le traitement des ccRCC métastatiques (Yang et al. 2003a). Par la suite, deux

études cliniques de phase III ont évalué l’efficacité du bevacizumab en combinaison avec

l’interféron-α (Escudier et al. 2007b, Rini et al. 2008). Ces deux études ont montré une

augmentation de la survie sans progression des patients traités avec cette association par rapport

31!

à ceux traités avec l’interféron-α seul, justifiant l’utilisation de cette bithérapie en première

intention pour le traitement des ccRCC métastatiques de bon et moyen pronostic. Aucune étude

clinique de phase III visant à évaluer l‘efficacité du bevacizumab en monothérapie n’a été publiée

ou planifiée à ce jour (Jonasch et al. 2014).

3.4.2. Les inhibiteurs de récepteurs tyrosine-kinase (TKI)

Le sorafenib est inhibiteur des récepteurs VEGFR2, VEGFR3, PDGFRβ, c-Kit et FLT3 (Fms-Like

Tyrosine kinase 3). Son utilisation a été approuvée par l’EMA en 2006 et par la FDA en 2005 pour le

traitement des ccRCC. Une étude clinique de phase III a montré que le sorafenib, en comparaison

avec un placebo, permet d’augmenter la survie sans progression de patients préalablement traités

par une immunothérapie, puisqu’elle passe de 2,8 mois avec le placebo à 5,5 mois avec le

sorafenib (Escudier et al. 2007a).

Le sunitinib est inhibiteur des récepteurs VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, PDGFRβ, c-Kit et FLT3

dont l’utilisation pour le traitement des ccRCC a été approuvée par l’EMA et par la FDA en 2006.

En effet, une étude clinique randomisée a montré que la survie sans progression est de 11 mois

chez les patients traités avec le sunitinib contre 5 mois chez les patients traités avec l’interféron-α

(Motzer et al. 2007).

Le pazopanib est un inhibiteur des récepteurs VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, PDGFRβ et c-Kit

approuvé par l’EMA en 2010 et par la FDA en 2009 pour le traitement des ccRCC. Une étude

clinique randomisée de phase III a évalué l’efficacité du pazopanib en comparaison avec un

placebo chez des patients ayant déjà été traités par une immunothérapie, et a mis en évidence une

survie sans progression de 7,4 mois chez les patients traités avec le pazopanib contre 4,2 mois

chez les patients traités avec le placebo. Chez les patients n’ayant pas été traités par

immunothérapie, la survie sans progression est de 11,1 mois avec le pazopanib et de 2,8 mois

avec le placebo (Sternberg et al. 2010). Récemment, une étude a mis en évidence une survie

globale similaire chez des patients atteints d’un ccRCC traités au pazopanib ou au sunitinib en

première intention (Motzer et al. 2014).

L’axitinib est un inhibiteur spécifique des récepteurs VEGFR1, VEGFR2 et VEGFR3 approuvé par

l’EMA et par la FDA en 2012 pour le traitement des ccRCC réfractaires à d’autres traitements. En

effet, une étude clinique randomisée de phase III a révélé une survie sans progression de 6,7 mois

chez les patients traités par l’axitinib contre 4,7 mois chez les patients traités par le sorafenib (Rini

et al. 2011).

32!

3.4.3. Les inhibiteurs de mTOR

Le temsirolimus a été approuvé par l’EMA et par la FDA en 2007 pour le traitement des ccRCC. Il

est actuellement utilisé en première intention chez des patients atteints d’un ccRCC de mauvais

pronostic. En effet, une étude clinique randomisée de phase III a mis en évidence une survie

globale de 10,9 mois chez les patients traités avec le temsirolimus contre 7,3 mois chez les patients

traités par l’interféron-α et 8,4 mois chez les patients traités par la combinaison de ces deux

molécules. Cette étude a été effectuée chez des patients atteints d’un ccRCC de très mauvais

pronostic, présentant des métastases dans plusieurs organes, et n’ayant pas forcément subi une

néphrectomie cytoréductive (Hudes et al. 2007).

L’everolimus a été approuvé par l’EMA et par la FDA en 2009 pour le traitement des ccRCC

réfractaires au sunitinib et/ou au sorafenib. En effet, une étude clinique randomisée de phase III a

montré l’efficacité de l’everolimus chez des patients n’ayant pas répondu aux anti-angiogéniques.

Dans cette étude, la survie sans progression des patients traités à l’everolimus était de 4 mois

contre 1,9 mois pour les patients ayant reçu un placebo (Motzer et al. 2008). Aucune donnée ne

supportant l’utilisation de l’everolimus en première intention pour le traitement des ccRCC, cette

molécule est actuellement utilisée en deuxième ou en troisième intention.

Tableau 2. Recommandations de l’Association Européenne d’Urologie et de la Société Européenne d’Oncologie Médicale pour le traitement des ccRCC (2014).

Traitement de 1ère intention Traitement de 2ème intention Traitement de 3ème intention Bon pronostic Après échec d’un TKI: Après échec d’un TKI : Sunitinib Axitinib Everolimus Pazopanib Sorafenib Bevacizumab + Interféron-α Everolimus Après échec de l’interféron : Après échec d’un inhibiteur de mTOR : Axitinib Sorafenib Sorafenib Everolimus Pronostic moyen Après échec d’un TKI : Sunitinib Axitinib Everolimus Pazopanib Sorafenib Après échec d’un inhibiteur de mTOR : Everolimus Sorafenib Mauvais pronostic Temsirolimus N’importe quelle thérapie ciblée Sunitinib Pazopanib

Doses : Interféron-α: 9MU trois fois par semaine en sous-cutané ; Bevacizumab : 10mg/kg deux fois par semaine en intraveineux ; Sunitinib : 50mg/j pendant 4 semaines per os ; Temsirolimus : 25mg une fois par semaine en intraveineux ; Pazopanib : 800mg/j per os ; Axitinib 5 à 7mg deux fois par jour per os; Everolimus : 100mg/j per os. mTOR : mammalian target of rapamycin ; TKI : tyrosine kinase inhibitor. D’après Ljungberg 2015 & Motzer 2014.

33!

4. Stratégies thérapeutiques émergentes

Le pronostic de survie des patients atteints d’un ccRCC métastatique s’est nettement amélioré

avec l’émergence des thérapies ciblées. Cependant, ces tumeurs restent généralement incurables,

avec une survie globale médiane d’environ deux ans et 10% de survie à 5 ans (Jonasch et al. 2014).

En effet, environ 20% des patients atteints d’un ccRCC métastatique montrent une résistance

thérapeutique dès le début du traitement, quel qu’il soit, ce qui conduit à une évolution rapide de

la maladie avec un très mauvais pronostic. La grande majorité des patients, quant à elle, présente

tout d’abord une régression tumorale en réponse aux anti-angiogéniques, suivie d’une courte

période de stabilité de la maladie, pour aboutir à une résistance à ces agents et à une progression

de la maladie (Rini and Flaherty 2008, Fisher et al. 2013). Enfin, certains de ces patients conservent

un bon état général après avoir reçu trois à quatre thérapies ciblées et constituent donc de bons

candidats pour tester d’autres stratégies thérapeutiques qui ne sont pas encore disponibles à ce

jour. Alors que la résistance des ccRCC aux chimiothérapies est généralement définitive, des

études cliniques suggèrent que la résistance de ces tumeurs aux thérapies ciblées serait transitoire.

En effet, la résistance à une thérapie ciblée peut être reversée par la réintroduction de ce même

traitement après un intervalle de temps pendant lequel le patient n’a pas bénéficié de cette

thérapie, c’est le concept de « rechallenge ». Ainsi, des études ont montré que le « rechallenge »

du sunitinib présente un bénéfice clinique pour le traitement des ccRCC, et que ce bénéfice serait

encore plus important lorsque l’intervalle de temps entre les deux séries de traitements est long

(Porta et al. 2014). Il reste néanmoins essentiel de comprendre les mécanismes de résistance aux

anti-angiogéniques et de mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques (Philips and

Atkins 2014).

4.1. Inhibition des mécanismes de résistance aux anti-angiogéniques

Une des hypothèses expliquant la résistance des tumeurs aux anti-angiogéniques est l’activation

de voies de signalisation alternatives capables de maintenir l’angiogenèse tumorale. Ce

phénomène, appelé « échappement angiogénique », peut ainsi résulter de la surproduction ou de

la surexpression des angiopoïétines, du facteur HGF (Hepatocyte Growth Factor) et de son

récepteur c-Met, du récepteur ALK1 (Activin receptor-Like Kinase 1), ou encore de l’IL-8 (Interleukin

8). Des inhibiteurs de ces protéines pro-angiogéniques font l’objet d’études précliniques et

cliniques pour le traitement des ccRCC, et leur utilisation en association avec des anti-

34!

angiogéniques déjà sur le marché pourrait aboutir à un bénéfice clinique durable (Philips and

Atkins 2014).

4.1.1. Inhibition de l’axe angiopoïétines/Tie-2

Les angiopoïétines 1 et 2 se lient à leurs récepteurs Tie -1/2 (Tyrosine kinase with Immunoglobulin-

like and EGF-like domains 1/2) afin de promouvoir l’intégrité et la maturation vasculaire mais aussi

l’angiogenèse en réponse à l’hypoxie dans les ccRCC (Yamakawa et al. 2004). Ainsi, une étude

clinique de phase II a montré l’efficacité du trepananib, un inhibiteur de l’axe angiopoïétines/Tie-

2, en association avec le sunitinib dans le traitement des ccRCC métastatiques (Atkins 2012,

Philips and Atkins 2014). Ce résultat encourage donc l’utilisation d’inhibiteurs des angiopoïétines

en association avec des anti-angiogéniques déjà sur le marché (Philips and Atkins 2014).

4.1.2. Inhibition de l’axe HGF/c-Met

Dans des échantillons de ccRCC, l’expression de c-Met a été associée avec le stade anatomique et

constitue un marqueur de mauvais pronostic (Gibney 2011). Ainsi, une étude in vivo a montré que

HGF, le ligand de c-Met, est plus fortement exprimé dans les tumeurs résistantes au sunitinib que

dans les tumeurs qui y sont sensibles, et qu’il induit le développement d’une résistance au

sunitinib en favorisant la maintenance de l’angiogenèse tumorale (Shojaei et al. 2010). De plus,

l’association du sunitinib avec un inhibiteur de c-Met exerce un effet anti-tumoral synergique

dans des tumeurs a priori résistantes au sunitinib (Shojaei et al. 2010).

Le cabozantinib est un inhibiteur des récepteurs à activité kinase c-Met, VEGFR2, c-Kit et FLT3

approuvé par la FDA pour le cancer médullaire de la thyroïde. Une étude a mis en évidence une

activité anti-tumorale encourageante du cabozantinib chez des patients atteints d’un ccRCC et

ayant déjà reçu un ou plusieurs traitement(s) (Choueiri 2012). Ces résultats ont conduit à la mise

en place d’études cliniques randomisées afin d’évaluer le bénéfice du cabozantinib en première

intention en comparaison avec le sunitinib (phase II, NCT01835158) et en deuxième intention en

comparaison avec l’everolimus (phase III, NCT01865747). D’autres inhibiteurs de la voie HGF/c-

Met font également l’objet d’études cliniques (Eder et al. 2009).

35!

4.1.3. Inhibition du récepteur ALK-1

ALK-1, un récepteur au TGFβ, et ses ligands BMP-9 et -10 (Bone Morphogenetic Protein) auraient

un rôle pro-angiogénique distinct de celui du VEGF. Alors que ce dernier est essentiel à

l’angiogenèse « précoce », des données suggèrent que ALK-1 joue un rôle majeur dans le

développement de réseaux vasculaires matures et fonctionnels (Philips and Atkins 2014). Le

dalantercept est une protéine de fusion capable de piéger BMP-9 et -10 et d’inhiber ainsi

l’angiogenèse et la croissance tumorale in vivo (Mitchell et al. 2010). Une étude clinique de phase I

a montré que le dalantercept est relativement bien toléré (NCT00996957), et son efficacité en

association avec l’axitinib est actuellement évaluée chez des patients atteints d’un ccRCC résistant

aux anti-angiogéniques (phase II, NCT01727336).

4.1.4. Inhibition de l’IL-8

L’IL-8 est une chimiokine pro-angiogénique dont la sécrétion tumorale est plus élevée dans les

ccRCC résistants au sunitinib que dans les ccRCC répondeurs, suggérant son implication dans la

résistance à cet anti-angiogénique (Huang et al. 2010a). De plus, la neutralisation de l’IL-8 entraine

une diminution de la croissance tumorale chez des souris porteuses de xénogreffes de ccRCC

résistantes au sunitinib (Huang et al. 2010a). D’autre part, une étude clinique de phase III

évaluant l’efficacité du pazopanib chez des patients atteints d’un ccRCC a montré que des taux

élevés d’IL-8 sont associés à une plus courte survie sans progression. Enfin, une étude préclinique

effectuée, entre autres, dans un modèle de ccRCC, a montré que le microARN miR-200 cible l’IL-8

sécrétée par la tumeur réduisant ainsi l’angiogenèse tumorale (Pecot et al. 2013). L’ensemble de

ces résultats souligne l’intérêt de cibler l’IL-8 afin de retarder ou d’empêcher la résistance aux

anti-angiogéniques chez les patients atteints de ccRCC.

4.1.5. Inhibition de HDM2

L’oncogène HDM2 (Human Double Minute 2) induit la dégradation protéasomale de p53 et a

également été impliqué dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α (Carroll and Ashcroft 2008). Une

étude effectuée dans un modèle murin de ccRCC a montré que dans un premier temps, le

sunitinib augmente l’expression de p53 qui décline par la suite, coïncidant avec le développement

de la résistance à cet agent, elle-même associée à la surexpression de HDM2 et HIF-2α (Panka et

al. 2013). Dans ce modèle, l’administration d’un antagoniste de HDM2 permet de maintenir

36!

l’expression de p53 et de retarder l’échappement angiogénique, ainsi que de prévenir

l’accumulation de HIF-2α. Au vu de ces résultats précliniques, il serait intéressant de savoir si

l’inhibition de HDM2 a des effets similaires chez des patients atteints de ccRCC (Philips and

Atkins 2014).

4.1.6. Ciblage de l’imitation vasculaire

L’imitation vasculaire, ou vascular mimicry, décrit la plasticité fonctionnelle de cellules tumorales

agressives capables d’acquérir une structure tubulaire afin de former un nouveau réseau

vasculaire dépourvu de cellules endothéliales. Ces nouveaux vaisseaux font partie du réseau

vasculaire tumoral ; permettent d’approvisionner la tumeur en oxygène et en nutriments ; et

constituent une échappatoire pour la dissémination métastatique (Maniotis et al. 1999).

L’imitation vasculaire a été observée dans différents cancers, dont les ccRCC où elle représente un

facteur de mauvais pronostic (Zhang et al. 2013b). Elle constitue un mécanisme potentiel de

résistance aux anti-angiogéniques puisque des études ont montré que ces agents n’empêchent pas

l’imitation vasculaire mais peuvent, au contraire, la favoriser (Xu et al. 2012). Son ciblage pourrait

donc constituer une stratégie thérapeutique intéressante.

4.2. Identification de nouvelles cibles thérapeutiques

4.2.1. HIF-2α

Le facteur de transcription HIF-2α jouant un rôle crucial dans le développement des ccRCC, son

inhibition constituerait une stratégie thérapeutique pertinente pour le traitement de ces tumeurs

(Kondo et al. 2003). En effet, le ciblage de HIF-2α pourrait s’avérer plus efficace que l’utilisation

d’anti-angiogéniques puisque ce facteur contrôle l’expression de nombreux gènes impliqués non

seulement dans l’angiogenèse tumorale mais aussi dans la prolifération, la survie, la

dédifférenciation et le métabolisme des cellules tumorales (Keith et al. 2012). Des inhibiteurs

spécifiques de HIF-2α démontrant une activité anti-tumorale sont utilisés in vitro et in vivo mais

ne font pas l’objet d’études cliniques à ce jour, ce qui justifie l’utilisation en clinique de molécules

inhibant indirectement HIF-2α, tels que les inhibiteurs de mTOR (Lee et al. 2009b, Scheuermann et

al. 2013, Philips and Atkins 2014).

37!

4.2.2. La voie SphK1/S1P

La SphK1 (Sphingosine Kinase 1), via son produit la S1P (Sphingosine 1-phosphate), favorise la survie

et la prolifération cellulaire, est surexprimée dans de nombreuses tumeurs, dont les ccRCC, et

contribue à l’échec thérapeutique (Cuvillier et al. 1996, French et al. 2003, Johnson et al. 2005). Des

études ont ainsi montré que la SphK1 est surexprimée dans des ccRCC résistants au sunitinib et

que son inhibition permet de sensibiliser ces tumeurs à cet agent anti-angiogénique (Gao and

Deng 2014, Zhang et al. 2015). De plus, un anticorps anti-S1P fait actuellement l’objet d’une étude

clinique de phase II pour le traitement des ccRCC inopérables ou résistants aux thérapies ciblées

(NCT01762033).

4.2.3. La voie NF2/Hippo/Yap

Une étude préclinique a montré que la voie NF2 (Neurofibromin 2)/Hippo/Yap contribuerait au

développement des ccRCC (Morris and McClatchey 2009). En effet, il a été montré que 33% des

ccRCC VHL+/+ présentent des mutations inactivatrices du gène suppresseur de tumeur NF2, et

des données récentes suggèrent l’inactivation de la voie NF2/Hippo dans certains ccRCC VHL-/-

(Dalgliesh et al. 2010, Philips and Atkins 2014). L’inactivation de NF2 entraine l’activation de

l’oncogène Yap qui promeut la transcription de gènes pro-prolifératif et anti-apoptotiques

(Philips and Atkins 2014). Ainsi, le ciblage de cette voie de signalisation pourrait s’avérer

pertinent pour le traitement des ccRCC.

4.3. Autres stratégies

4.3.1. Développement de nouvelles immunothérapies

Des études récentes ont identifié des « checkpoints immunitaires » capables de protéger les

cellules tumorales de leur destruction par un système immunitaire activé, et parmi eux, le

récepteur PD-1 (Programmed Death-1) (Philips and Atkins 2015). Ce récepteur est exprimé par les

lymphocytes T activés dont il diminue les fonctions effectrices lorsqu’il est en présence de son

ligand PD-L1 (PD-Ligand 1). Or, PD-L1 est exprimé par différentes tumeurs, dont les ccRCC dans

lesquels son expression a été associée avec un mauvais pronostic (Philips and Atkins 2014).

Récemment, des études cliniques ont montré que des anticorps bloquants l’interaction entre PD-

L1 et PD-1 présentent une activité anti-tumorale dans plusieurs types de cancers, dont les ccRCC

38!

(Topalian et al. 2012, Philips and Atkins 2014, Philips and Atkins 2015). Ces anticorps sont bien

tolérés et sont actuellement en développement clinique seuls ou en association avec des anti-

angiogéniques tels que le bevacizumab ou avec d’autres inhibiteurs de checkpoints immunitaires

(NCT02210117) (Philips and Atkins 2014, Philips and Atkins 2015).

En parallèle, de nombreux vaccins anti-tumoraux sont testés cliniquement pour le traitement des

ccRCC (Escudier 2012). C’est notamment le cas du vaccin AGS-003, qui a fait l’objet d’une étude

clinique de phase II chez des patients atteints d’un ccRCC métastatique. Les résultats de cette

étude indiquent que la survie sans progression des patients traités par l’AGS-003 en combinaison

avec le sunitinib est de 11,9 mois contre 8 mois chez les patients traités par le sunitinib seul. Une

étude clinique de phase III actuellement en cours évalue l’efficacité de cette association chez des

patients d’un ccRCC avancé ou métastatique (NCT01582672).

4.3.2. Utilisation néoadjuvante des thérapies ciblées

Alors que la néphrectomie cytoréductive précédent l’administration d’une thérapie ciblée est une

stratégie thérapeutique classique pour le traitement des ccRCC métastatiques, l’utilisation néo-

adjuvante des thérapies ciblées est à ce jour moins fréquente. Cette méthode présente pourtant

l’avantage de réduire le volume tumoral pour rendre la chirurgie plus efficace et plus sûre (van

der Veldt et al. 2008, Cowey et al. 2010, Powles et al. 2011, Fisher et al. 2013). Ainsi, une étude a

montré que l’administration de sunitinib à des patients atteints d’un ccRCC avancé et inopérable,

a permis de rendre opérables 21% d’entre eux (Thomas et al. 2009). Des études cliniques de phase

III sont actuellement en cours afin d’évaluer l’efficacité de cette stratégie thérapeutique

(NCT00930033, NCT01099423).

39!

Chapitre 2 :

L’hypoxie intratumorale et les facteurs HIF

1. Homéostasie de l’oxygène et stress hypoxique.

Au cours de l’évolution, les organismes vivants ont dû s’adapter aux changements de la

composition atmosphérique. En effet, il y a 4 milliards d’années, l’atmosphère terrestre était

composée de 98% de dioxyde de carbone, de 1,9% d’azote et de près de 0% d’oxygène.

Aujourd’hui, sa composition est de 0,03% de dioxyde de carbone, de 79% d’azote et de 21%

d’oxygène. Cette modification progressive, d’une atmosphère quasiment dépourvue d’oxygène à

une atmosphère relativement riche en oxygène, s’est accompagnée d’une augmentation

considérable de la complexité des organismes vivants, pour qui l’oxygène est devenu un élément

clé de la survie cellulaire. L’oxygène permet en effet de répondre aux demandes énergétiques de

la cellule en générant de l’ATP via la phosphorylation oxydative. C’est en raison de ce rôle

essentiel que les concentrations en oxygène sont finement régulées dans l’organisme. Au niveau

des voies aériennes supérieures, qui permettent la captation de l’oxygène, le taux d’oxygène est

de 20%. Il est d’environ 14% dans la circulation artérielle qui permet d’acheminer l’oxygène

jusqu’aux organes et de 0,5 à 10% au niveau de ces derniers (Brahimi-Horn and Pouyssegur 2007)

(Figure 6).

Dans certaines conditions physiopathologiques, ce taux d’oxygène diminue, le tissu en question

se trouve alors en condition d’hypoxie. Il existe différents senseurs capables de détecter une telle

variation du taux d’oxygène et d’induire une réponse physiologique de manière à compenser ce

manque d’oxygène. D’une part, lorsque l’hypoxie est systémique et que le taux d’oxygène du

sang artériel est inférieur à 8,5%, les cellules glomérulaires du corps carotidien vont libérer des

neurotransmetteurs tels que l’acétylcholine et la noradrénaline afin d’augmenter le rythme et le

volume respiratoire ainsi que le rythme cardiaque, de manière à réoxygéner l’organisme (Weir et

al. 2005). D’autre part, lorsque l’hypoxie est locale, les cellules concernées y répondent en activant

des facteurs de transcription, et en particulier les facteurs HIF (Hypoxia-Inducible Factor) qui

constituent les acteurs clés de l’adaptation au stress hypoxique (Semenza 2011).

!!

40!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Figure 6. Différentes concentration en oxygène dans l’organisme humain. !!

2. Les facteurs HIF, acteurs de l’adaptation au stress hypoxique.

Trois facteurs de transcription HIF ont été identifiés à ce jour : HIF-1, HIF-2 et HIF-3 (Figure 7).

Ces facteurs sont des hétérodimères, constitués chacun d’une sous-unité HIF-α, sensible à

l’oxygène et uniquement stabilisée en son absence, et d’une sous-unité HIF-β, exprimée

constitutivement. Ils font partie des facteurs de transcription de type bHLH (basic Helix-Loop-

Helix) à domaine PAS (Per-ARNT-Sim) (Wang et al. 1995, Crews 1998). En effet, chaque sous-unité

est constituée d’un domaine bHLH permettant sa dimérisation avec une autre sous-unité, ainsi

que sa liaison à l’ADN des gènes cibles, au niveau de leurs séquences HRE (Hypoxia Response

Element) 5’-(A/G)CGTG-3’. Le domaine PAS est quant à lui impliqué dans la dimérisation des

sous-unités entre elles ou avec d’autres protéines. Dans leur partie C-terminale, les sous-unités

41!

HIF-α et HIF-β présentent un à deux domaine(s) de transactivation, nommés N-TAD (N-Terminal

TransActivation Domain) et C-TAD (C-Terminal TransActivation Domain), permettant la régulation

de l’activation des gènes cibles de HIF (Ruas et al. 2002, Rankin and Giaccia 2008). Enfin, les sous-

unités HIF-α contiennent un domaine ODDD (Oxygen-Dependent Degradation Domain) nécessaire à

leur dégradation par la voie ubiquitine-protéasome en présence d’oxygène (Huang et al. 1997).

Figure 7. Structure et sites d’hydroxylation des sous-unités HIF. aa : acides aminés ; bHLH : basic helix-loop-helix ; PAS : per-ARNT-sim ; ODDD : oxygen-dependent degradation domain ; N-TAD : N-terminal transactivation domain ; C-TAD : C-terminal transactivation domain. Adapté de Rankin and Giaccia, 2008.

A l’inverse, en conditions d’hypoxie, les sous-unités HIF-α sont stabilisées dans le cytoplasme.

Elles vont ainsi pouvoir s’hétérodimériser avec HIF-β et être transloquées dans le noyau où elles

se lient au niveau des séquences HRE de l’ADN de leurs gènes cibles, dont la transcription pourra

être activée. Ces gènes sont impliqués dans des processus biologiques fondamentaux, tels que la

survie, la prolifération et le métabolisme cellulaire ainsi que l’angiogenèse (Rankin and Giaccia

2008).

42!

2.1. HIF-1α

HIF-1α est le premier membre des facteurs HIF à avoir été caractérisé : il s’agit d’un facteur

nucléaire induit par l’hypoxie capable de se lier à la séquence HRE contenue dans le promoteur

de l’EPO (Erythropoietin) afin d’activer sa transcription (Semenza et al. 1991, Semenza and Wang

1992, Wang and Semenza 1995). HIF-1α présente deux domaines de transactivation N-TAD et C-

TAD. Le domaine N-TAD confère la spécificité de HIF-1 pour ses gènes cibles alors que le

domaine C-TAD est impliqué dans l’activation de la transcription des gènes cibles de part son

interaction avec CBP (CREB Binding Protein) et p300, deux co-activateurs de la transcription

(Lando et al. 2002a, Hu et al. 2007). Le domaine ODDD de HIF-1α contient deux sites

d’hydroxylation sur les résidus proline 402 et 564 impliqués dans la régulation de la stabilité de la

protéine en fonction du taux d’oxygène, et le domaine C-TAD contient un site d’hydroxylation

sur le résidu asparagine 803 impliqué dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de HIF-1.

HIF-1α contient d’autres sites de modifications post-traductionnelles comme des sites de

phosphorylation, d’acétylation et de sumoylation. Etant donné son expression ubiquitaire et les

centaines de gènes cibles qu’il régule, HIF-1α a émergé comme étant un régulateur clé de la

réponse cellulaire à l’hypoxie (Wenger et al. 1996, Semenza 2009).

2.2. HIF-2α

HIF-2α est le deuxième membre des facteurs HIF à avoir été identifié, tout d’abord sous le nom

de EPAS1 (Endothelial PAS domain-containing protein 1) dans les cellules endothéliales (Tian et al.

1997). Il a aussi été appelé HFL (HIF-1α-like factor), HRF (HIF-related factor) ou MOP2 (Member Of

PAS superfamily 2) (Ema et al. 1997, Flamme et al. 1997, Hogenesch et al. 1997). Sa séquence en

acides aminés présente 48% d’homologie avec celle de HIF-1α. De même, ses domaines bHLH,

PAS et ODDD présentent respectivement 85%, 70% et 70% d’homologie avec ceux de HIF-1α.

HIF-2α possède deux domaines de transactivation, N-TAD et C-TAD, qui jouent le même rôle

que ceux de HIF-1α (O'Rourke et al. 1999, Lando et al. 2002a, Hu et al. 2007). Enfin, le domaine

ODDD de HIF-2α contient deux sites d’hydroxylation sur les résidus proline 405 et 531 impliqués

dans la régulation de la stabilité de la protéine en fonction du taux d’oxygène. Le domaine C-

TAD en contient un autre sur le résidu asparagine 847 qui est impliqué dans la régulation de

l’activité transcriptionnelle. A l’inverse de HIF-1α, l’expression de HIF-2α est plus

restreinte puisqu’on le retrouve dans les cellules endothéliales, le parenchyme hépatique, les

43!

pneumocytes de type 2, les cardiomyocytes, ou encore les cellules épithéliales rénales (Tian et al.

1997, Wiesener et al. 2003).

2.3. HIF-3α

HIF-3α est le dernier membre des facteurs HIF à avoir été identifié (Gu et al. 1998). Il présente

respectivement 57% et 53% d’homologie de séquence avec HIF-1α et HIF-2α. Cette protéine ne

possède pas de domaine C-TAD, ce qui a longtemps suggéré que sa fonction était différente de

celle de HIF-1α et HIF-2α (Hara et al. 2001). En effet, HIF-3α présente plusieurs variants

d’épissage et certains d’entre eux ont été décrits in vitro comme n’ayant que peu ou pas d’activité

transcriptionnelle (Pasanen et al. 2010), ou bien comme étant capables de se dimériser avec HIF-

1α et HIF-2α inhibant ainsi leur activité transcriptionnelle (Makino et al. 2001, Maynard et al. 2005,

Maynard et al. 2007). Cependant, plus récemment, une étude fonctionnelle in vivo a révélé que

HIF-3 possède une activité transcriptionnelle et régule l’expression de plusieurs gènes, que la

stabilité de HIF-3α est régulée en fonction du taux d’oxygène, et que ces caractéristiques sont

conservées chez l’homme (Zhang et al. 2014b). Concernant l’expression de HIF-3α, son ARNm a

été détecté dans plusieurs organes comme le thymus, les poumons, le cerveau, le cœur et les reins

(Gu et al. 1998).

2.4. HIF-β

Il existe trois sous-unités HIF-β : ARNT1, ARNT2 et ARNT3 (Aryl hydrocarbon Receptor Nuclear

Translocator 1, 2 et 3), à forte homologie de séquence. Ces sous-unités ne contiennent pas de

domaine ODDD et sont donc constitutivement exprimées dans la cellule, indépendamment du

taux d’oxygène (Kallio et al. 1997). Elles peuvent toutes trois s’hétérodimériser avec les sous-

unités HIF-α, bien qu’ARNT1 soit leur partenaire principal puisque son expression est ubiquitaire

alors qu’ARNT2 n’est retrouvée que dans le cerveau et dans le rein (Hirose et al. 1996).

44!

3. Mécanismes de régulation des facteurs HIF

Dans cette partie, nous nous intéressons à HIF-1 et HIF-2 car peu d’informations sont connues à

propos des mécanismes de régulation de HIF-3.

3.1. Mécanismes de régulation dépendants de l’oxygène

Une étude in vitro a montré que la stabilisation et l’activité transcriptionnelle de HIF-1α sont

induites lorsque le taux d’oxygène est inférieur à 6%, et sont maximales lorsqu’il est de 0,5%

(Jiang et al. 1996). C’est donc le taux d’oxygène qui constitue le régulateur principal des sous-

unités HIF-α.

3.1.1. Régulation de la stabilité des sous-unités HIF-α

En présence d’oxygène, les sous-unités HIF-α sont hydroxylées au niveau de deux résidus proline

de leur domaine ODDD – P402 et P564 pour HIF-1α, P405 et P531 pour HIF-2α – par des PHD

(Prolyl Hydroxylase Domain containing protein). HIF-α est ainsi reconnue par pVHL et adressée au

protéasome pour sa dégradation (Ivan et al. 2001, Jaakkola et al. 2001) (Figure 8).

Les PHD existent sous trois isoformes : PHD1, PHD2 et PHD3 (Bruick and McKnight 2001,

Epstein et al. 2001). Leur activité est dépendante de l’oxygène, de l’α-cétoglutarate, du fer Fe(II) et

de l’ascorbate (Schofield and Zhang 1999, Stolze et al. 2006). Lors de la réaction d’hydroxylation,

le fer Fe(II) permet de cliver l’oxygène moléculaire, dont un atome sera inséré sur le résidu

proline pour former une hydroxyproline, et l’autre sur l’α-cétoglutarate pour libérer une

molécule de CO2 (Stolze et al. 2006). L’ascorbate et le CO2 permettent ensuite de réduire le fer

pour réactiver l’enzyme. Les trois isoformes de PHD sont retrouvées dans l’ensemble de

l’organisme, bien que leur niveau d’expression varie en fonction des tissus et de la localisation

intracellulaire (Metzen et al. 2003a). Les trois PHD sont capables d’hydroxyler les sous-unités

HIF-α (Bruick and McKnight 2001, Jaakkola et al. 2001), mais il a été montré in vitro que la PHD2

joue un rôle essentiel dans la régulation de la HIF-1α alors que la PHD3 est plus importante pour

la régulation de HIF-2α (Appelhoff et al. 2004). Plus tard, des expériences in vivo menées chez la

souris ont montré que seul le KO (Knock-Out) de la PHD2 est létal au stade embryonnaire,

mettant ainsi en évidence l’importance majeure de cette isoforme. Les PHD2 et PHD3 sont elles-

mêmes des gènes cibles de HIF. Leur expression est donc augmentée en hypoxie, ce qui garantit

45!

une dégradation rapide et optimale de HIF-α lorsque la cellule se retrouve en normoxie (Berra et

al. 2001, Epstein et al. 2001, Berra et al. 2003).

L’hydroxylation de HIF-α au niveau des résidus proline de leur domaine ODDD permet leur

reconnaissance par pVHL, un composant d’un complexe E3 ubiquitine ligase. Cette interaction

entre HIF-α et pVHL permet le recrutement des autres composants du complexe E3 ubiquitine

ligase, à savoir les protéines élongine C, élongine B, culline 2 et Rbx1 (Ring-box 1). Cette dernière

permet l’ubiquitinylation de HIF-α qui sera ensuite adressée au protéasome pour y être dégradée

(Iliopoulos et al. 1996, Maxwell et al. 1999, Kamura et al. 2000, Ivan and Kaelin 2001) (Figure 8).

Figure 8. Régulation de HIF-α dépendante de l’oxygène. Cul2 : cullin 2 ; HRE : hypoxia-response element ; Ub : ubiquitin. Adapté de Cohen, 2005.

La mitochondrie constitue également un senseur de l’oxygène impliqué dans la régulation de la

stabilité de HIF-α. En effet, des études ont montré qu’en cas d’hypoxie modérée (1,5% O2), la

mitochondrie stimule la production de ROS (Reactive Oxygen Species) par le complexe III de la

chaine respiratoire. Ces ROS vont inhiber l’activité des PHD et ainsi favoriser la stabilisation de

HIF-α (Klimova and Chandel 2008, Majmundar et al. 2010).

Enfin, notre équipe a montré pour la première fois que la SphK1 (Sphingosine Kinase 1), une lipide-

kinase « oncogénique », régule la stabilisation de HIF-1α en hypoxie dans différentes lignées

tumorales humaines (Ader et al. 2008). Dans ces modèles, l’hypoxie stimule la production de ROS,

46!

ce qui active la voie SphK1/S1P qui empêche la dégradation protéasomale de HIF-1α selon un

mécanisme dépendant de pVHL.

3.1.2. Régulation de l’activité transcriptionnelle de HIF

L’oxygène participe également à la régulation de l’activité transcriptionnelle des facteurs HIF. En

effet, le domaine C-TAD, impliqué dans le recrutement des cofacteurs de transcription

permettant l’expression des gènes cibles de HIF, contient un résidu asparagine – N803 pour HIF-

1α et N847 pour HIF-2α – pouvant être hydroxylé par la protéine FIH (Factor Inhibiting HIF).

L’hydroxylation de ce résidu empêche le recrutement des cofacteurs de transcription CBP et p300,

et inhibe donc l’activité transcriptionnelle de HIF (Lando et al. 2002a, Lando et al. 2002b) (Figure

8). L’activité hydroxylase de FIH est dépendante de l’oxygène, du fer Fe(II) et de l’ α-

cétoglutarate. Son affinité pour l’oxygène étant plus forte que celle des PHD, FIH peut être active

à des concentrations plus faibles en oxygène et peut ainsi inhiber l’activité transcriptionnelle de

HIF lorsque HIF-α a échappé au processus de dégradation dépendant des PHD. Cependant, des

études ont montré que le domaine C-TAD de HIF-2α est plus résistant à l’hydroxylation par FIH

que celui de HIF-1α (Bracken et al. 2006, Yan et al. 2007).

3.2. Mécanismes de régulation indépendants de l’oxygène

Bien que l’oxygène soit le principal régulateur de la stabilité et de l’activité des facteurs HIF, leur

régulation peut aussi se faire par des mécanismes indépendants de l’oxygène. Certains d’entre

eux sont développés ici (Tableau 3, Figure 9).

3.2.1. Régulation par les protéines HSP90 et RACK1

HSP90 (Heat Shock Protein 90) est une protéine chaperonne impliquée dans le repliement adéquat

des protéines et dans leur protection vis-à-vis des chocs thermiques. Une étude in vitro a montré

que l’inhibition de HSP90 entraine l’ubiquitinylation de HIF-1α et sa dégradation par le

protéasome indépendamment de pVHL et du taux d’oxygène. De plus, l’inhibition de HSP90

diminuerait l’activité transcriptionnelle de HIF-1 (Isaacs et al. 2002, Majmundar et al. 2010). Par la

suite, une autre étude a montré que RACK1 (Receptor for Activated C-Kinase 1) peut entrer en

compétition avec HSP90 pour interagir avec HIF-1α au niveau de son domaine PAS. Alors que

47!

HSP90 stabilise HIF-1α, son interaction avec RACK1 aboutit à sa dégradation par le protéasome

(Liu and Semenza 2007, Baldewijns et al. 2010).

3.2.2. Régulation par modifications post-traductionnelles

Plusieurs types de modifications post-traductionnelles peuvent réguler les facteurs HIF. Selon les

études, il a été montré que la sumoylation de HIF-α pouvait aboutir à la fois à sa dégradation

protéasomale mais aussi à l’augmentation de sa stabilité et de son activité transcriptionnelle (Bae

et al. 2004, Carbia-Nagashima et al. 2007, Cheng et al. 2007, van Hagen et al. 2010). De même, une

étude a montré que la S-nitrosylation de HIF-1α stimule le recrutement des cofacteurs CBP et

p300 alors qu’une autre indique le contraire (Yasinska and Sumbayev 2003, Baran et al. 2007, Cho

et al. 2007). Enfin, des études ont montré que la phosphorylation de HIF-α par des protéines de la

voie des MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase), dont ERK1/2 (Extracellular signal-Regulated

Kinases 1/2), augmente l’activité des facteurs HIF, en particulier en favorisant le recrutement de

p300 (Richard et al. 1999, Sang et al. 2003).

3.2.3. Régulation par les hormones et les facteurs de croissance

L’héréguline, une hormone capable de se fixer sur son récepteur HER2 pour induire la

prolifération cellulaire, a été impliquée dans la régulation de HIF-1α. En effet, une étude réalisée

dans un modèle de cancer du sein a montré que cette hormone active la voie PI3K/Akt/mTOR ce

qui induit la traduction de HIF-1α (Laughner et al. 2001). Les mécanismes mis en jeu sont les

suivants : une fois activée, mTOR va phosphoryler les protéines 4E-BP1 (eukaryotic Initiation Factor

(eIF) 4E Binding Protein 1) et p70S6K (p70S6-kinase), toutes deux impliquées dans l’initiation de la

traduction cap-dépendante. Ainsi, la phosphorylation de 4E-BP1 entraine sa dissociation de eIF-

4E qui va se lier au complexe eIF-4F pour initier la traduction. De plus, la phosphorylation de

p70S6K entraine l’activation de la protéine ribosomale S6 et de eIF-4A ainsi que la

phosphorylation de eIF-4B et de eIF-4G qui font également partie du complexe eIF-4F (Hara et al.

1997, Hay and Sonenberg 2004, Sonenberg and Hinnebusch 2009, Blagden and Willis 2011).

L’angiotensine II, une hormone aux propriétés vasoconstrictrices, a également été impliquée dans

la régulation de HIF-1α. En effet, une étude a montré que dans des cellules musculaires lisses

vasculaires, l’angiotensine II induit la transcription de HIF-1α via l’activation de la PKC et

stimule la traduction de HIF-1α selon un mécanisme dépendant des ROS et de la voie de la PI3K

(Page et al. 2002).

48!

Enfin, une étude a montré que le FGF, l’EGF (Epidermal Growth Factor), l’insuline et l’IGF1/2

(Insulin-like Growth Factor) induisent l’expression de HIF-1α dans la lignée HEK293 (Feldser et al.

1999). Une étude réalisée dans un modèle de cancer de la prostate a ensuite montré que l’EGF

régule la transcription de HIF-1α en activant la voie PI3K/Akt (Zhong et al. 2000). Par la suite, il a

été montré que l’EGF et l’insuline peuvent stimuler la production de ROS, ce qui induit

l’activation des protéines Akt et p70S6K pour aboutir à la traduction de HIF-1α dans des lignées

tumorales humaines (Liu et al. 2006, Zhou et al. 2007). Plus récemment, une étude a montré que

l’inhibition du FGFR (FGF Receptor) entraine une diminution du taux intracellulaire de HIF-

1α dans une lignée de glioblastome (Ader et al. 2014).

3.2.4. Différences de régulation entre HIF-1α et HIF-2α

Bien que la majorité des mécanismes de régulation soient communs aux sous-unités HIF-α,

certains d’entre eux sont spécifiques à HIF-1α ou HIF-2α (Keith et al. 2012).

En premier lieu, des études effectuées dans plusieurs lignées cellulaires tumorales ont montré que

HIF-2α est stabilisé en conditions d’hypoxie modérée (2-5% O2) alors que HIF-1α s’accumule

lorsque l’hypoxie est plus sévère (0-2% O2) (Nilsson et al. 2005, Holmquist-Mengelbier et al. 2006).

De plus, en cas d’hypoxie prolongée, l’expression de HIF-2α est élevée et maintenue dans le

temps alors que HIF-1α est d’abord fortement exprimée puis son taux décroît après plusieurs

heures, sans doute suite à la dégradation de son ARNm (Uchida et al. 2004, Holmquist-

Mengelbier et al. 2006). D’autre part, l’hypoxie intermittente induit l’expression de HIF-1α mais

diminue celle de HIF-2α (Peng et al. 2006, Nanduri et al. 2009).

La protéine HAF (Hypoxia-Associated Factor) est une E3 ubiquitine ligase uniquement retrouvée

dans les cellules en prolifération. Il a été montré que cette protéine peut se lier à HIF-1α pour

induire son ubiquitinylation et sa dégradation protéasomale indépendamment de pVHL (Koh et

al. 2008a, Koh and Powis 2009). A l’inverse, HAF peut se lier sur la région C-terminale de HIF-

2α et favoriser ainsi son activité transcriptionnelle (Koh et al. 2011).

Enfin, l’activité des facteurs HIF peut être modulée par les sirtuines, des enzymes sensibles au

statut redox de la cellule. Ainsi, SIRT1 (sirtuin 1) peut déacétyler un résidu lysine du domaine N-

TAD de HIF-2α afin d’augmenter son activité transcriptionnelle (Dioum et al. 2009). A l’inverse, la

déacétylation de ce résidu sur HIF-1α entraine une diminution de son activité transcriptionnelle

(Lim et al. 2010). D’autres études ont montré que SIRT6 constitue un répresseur de l’activité

transcriptionnelle de HIF-1α et que SIRT3 diminue sa stabilité (Zhong et al. 2010, Finley et al.

2011).

49!

Figure 9. Principaux mécanismes de régulation des facteurs HIF. Les facteurs HIF sont activés par trois mécanismes majeurs: la liaison des facteurs de croissance et des hormones à leurs récepteurs (1); l’hypoxie (2); l’activation de voies de signalisation oncogéniques et l’inactivation de gènes suppresseurs de tumeur (3). (1) La liaison d’un facteur de croissance ou d’une hormone à son récepteur aboutit à l’activation de différentes voies de signalisation, telles que la voie PI3K/Akt, induisant ainsi l’accumulation de HIF-1α. (2) L’hypoxie inhibe la dégradation protéasomale de HIF-α, via l’inhibition des PHD ou via la production de ROS, capables notamment d’activer la SphK1. L’hypoxie inhibe également FIH, un régulateur négatif de l’activité transcriptionnelle de HIF. HIF-α s’accumule dans le cytoplasme et s’hétérodimérise avec HIF-β. Le complexe ainsi formé migre dans le noyau et se lie au niveau des séquences HRE de l’ADN des gènes cibles de HIF dont la transcription sera activée. (3) L’inactivation de gènes suppresseurs de tumeur, tels que VHL, p53, PTEN, SDH et FH, de même que l’activation des voies des MAPK, de la PI3K, de NFκB ou de la β-caténine, aboutit à l’accumulation de HIF-α. CBP : CREB binding protein ; EGF : epidermal growth factor ; FIH : factor inhibiting HIF ; FGF : fibroblast growth factor ; FH : fumarate hydratase ; GSK3β: glycogen synthase kinase 3β; IGF : insulin-like growth factor ; HIF : hypoxia-inducible factor ; HRE : hypoxia response element ; MAPK : mitogen-activated protein kinase ; mTOR : mammalian target of rapamycin ; NFκB : nuclear factor κB ; PHD : prolyl hydroxylase domain containing protein ; PI3K : phosphatidylinositol 3-kinase ; PTEN : phosphatase and tensin homolog ; pVHL : protein von Hippel-Lindau ; ROS : reactive oxygen species ; S1P: sphingosine 1-phosphate; SDH : succinate dehydrogenase ; SphK1 : sphingosine kinase 1. Adapté de Baldewijns, 2010.

50!

Tableau 3. Principaux régulateurs des facteurs HIF.

Régulateur Cible(s) Effet(s) biologique(s) sur HIF-α Référence(s) Régulateurs dépendants de l’oxygène pVHL HIF-1α /2α Diminution de la stabilité (Iliopoulos et al. 1996) PHD1/2/3 HIF-1α /2α Diminution de la stabilité (Jaakkola et al. 2001)

(Bruick and McKnight 2001)

FIH HIF-1α /2α Diminution de l’activité transcriptionnelle (Lando et al. 2002a, Lando et al. 2002b)

ROS HIF-1α /2α Augmentation de la stabilité (Klimova and Chandel 2008)

SphK1 HIF-1α Augmentation de la stabilité (Ader et al. 2008) SIAH1/2 RhoB

HIF-1α HIF-1α

Augmentation de la stabilité, entraine la dégradation des PHD1/3 Augmentation de la stabilité

(Simon 2004) (Skuli et al. 2006)

Métabolites α-cétoglutarate HIF-1α /2α Diminution de la stabilité (cofacteur des PHD) (Schofield and Zhang 1999,

Stolze et al. 2006) Ascorbate HIF-1α /2α Diminution de la stabilité (cofacteur des PHD) (Stolze et al. 2006) Fe(II) HIF-1α /2α Diminution de la stabilité (cofacteur des PHD) (Schofield and Zhang 1999,

Stolze et al. 2006) IRP HIF-2α Diminution de la traduction en absence de fer (Zimmer et al. 2008) NO HIF-1α /2α Augmentation ou diminution de la stabilité (Sogawa et al. 1998, Metzen

et al. 2003b) Facteurs de croissance EGF, FGF, IGF1/2 HIF-1α Augmentation de l’expression (Feldser et al. 1999) Héréguline HIF-1α Augmentation de la traduction (Laughner et al. 2001) Voies de signalisation oncogéniques PI3K/Akt/mTOR HIF-1α/2α Augmentation de la traduction (Mottet et al. 2003a) MAPK HIF-1α /2α Augmentation de l’expression (Baldewijns et al. 2010) NF-κB HIF-1α Augmentation de la transcription (Rius et al. 2008) β-caténine HIF-1α Augmentation de l’activité transcriptionnelle (Kaidi et al. 2007) Gènes suppresseurs de tumeur p53 HIF-1α /1β Diminution de l’expression (Blagosklonny et al. 1998,

Majmundar et al. 2010) PTEN HIF-1α /1β Diminution de la transcription (Zhong et al. 2000) TSC1/2 HIF-1α /2α Diminution de l’expression (Liu et al. 2003b,

Baldewijns et al. 2010) SDH/FH mutés HIF-1α Augmentation de la stabilité (King et al. 2006) GSK3β HIF-1α Diminution de la stabilité (Mottet et al. 2003a) Hormones Insuline HIF-1α Augmentation de la traduction (Zhou et al. 2007) Angiotensine II HIF-1α Augmentation de la transcription et de la

traduction (Page et al. 2002)

Cytokines IL-4 HIF-1α /2α Diminution de l’expression (Dehne et al. 2014) Interferon-γ HIF-1α /2α Augmentation de l’expression (Majmundar et al. 2010)

51!

CITED2 : CBP/p300-interacting transactivator 2 ; CHIP : carboxyl terminus of HSP70-interacting protein ; COMMD1 : copper metabolism MURR1 domain-containing protein 1 ; FH : fumarate hydratase ; GSK3β : glycogen synthase kinase 3β ; IRP : iron regulatory protein ; NO : nitric oxide ; PARP1 : poly(ADP-ribose) polymérase 1 ; PTEN : phosphatase and tensin homolog ; RSUME : RWD domain-containing protein SUMO enhancer ; S1P : sphingosine 1-phosphate ; SIAH1/2 : seven in absentia homolog 1/2 ; SDH : succinate déshydrogénase ; SENP1 : SUMO1/sentrin specific peptidase 1 ; TSC1/2 : tuberous sclerosis scomplex 1/2.

!

Régulateur Cible(s) Effet(s)(biologique(s)(sur(HIF4α ! Référence(s)!Protéines chaperonnes et partenaires HSP90 HIF-1α Augmentation de la stabilité (Isaacs et al. 2002) RACK1 HIF-1α Diminution de la stabilité (Liu and Semenza 2007) HSP70/CHIP HIF-1α Diminution de la stabilité (Luo et al. 2010) MicroARNs miR-107 miR-17-92, miR-199a, miR-519c

HIF-1β HIF-1α

Diminution de l’expression Diminution de l’expression

(Taguchi et al. 2008, Rane et al. 2009, Yamakuchi et al. 2010) (Cha et al. 2010)

miR-145 HIF-2α Diminution de l’expression (Zhang et al. 2014a) Sirtuines Sirtuine 1 HIF-1α /2α Diminution de l’activité transcriptionnelle de

HIF-1α et augmentation de celle de HIF-2α (Keith et al. 2012), (Dioum et al. 2009)

Sirtuine 3 Sirtuine 6 Sirtuine 7

HIF-1α HIF-1α HIF-1α /2α

Diminution de la stabilité Diminution de l’activité transcriptionnelle Diminution de l’expression

(Finley et al. 2011) (Zhong et al. 2010) (Hubbi et al. 2013)

Autres HAF HIF-1α/2α Diminution de la stabilité de HIF-1α et

augmentation de l’activité transcriptionnelle de HIF-2α

(Koh et al. 2008a)

RSUME SENP1

HIF-1α HIF-1α

Augmentation de la stabilité, favorise la sumoylation Augmentation de la stabilité, élimine les motifs de sumoylation

(Carbia-Nagashima et al. 2007, Cheng et al. 2007)

CITED2 COMMD1

HIF-1α HIF-1α

Diminution de l’activité transcriptionnelle Diminution de la stabilité et inhibition de la liaison avec HIF-1β

(Bakker et al. 2007, van de Sluis et al. 2009, van de Sluis et al. 2010)

PARP1 HIF-1α /2α Augmentation de l’activité transcriptionnelle de HIF-1α, augmentation de la transcription et de la stabilité de HIF-2α

(Elser et al. 2008) (Gonzalez-Flores et al. 2014)

S1P Hypoxie intermittente

HIF-1α HIF-1α /2α

Augmentation de la stabilité de HIF-1α Augmentation de la stabilité de HIF-1α et diminution de celle de HIF-2α

(Michaud et al. 2009, Kalhori et al. 2013) (Peng et al. 2006, Nanduri et al. 2009)

52!

4. Rôle des facteurs HIF en physiologie et physiopathologie

Les facteurs de transcription HIF-1 et HIF-2 régulent plus de 200 gènes cibles impliqués dans des

processus biologiques fondamentaux tels que la survie, la prolifération et le métabolisme

cellulaire ainsi que l’angiogenèse. Par conséquent, ces facteurs sont impliqués dans de

nombreuses conditions physiologiques et pathologiques. Ils jouent ainsi un rôle crucial dans

l’embryogenèse, sont associés à certaines maladies métaboliques, cardiovasculaires et

inflammatoires, et sont impliqués dans la progression tumorale (Majmundar et al. 2010, Semenza

2012a, Semenza 2014b).

Bien que HIF-1 et HIF-2 aient des gènes cibles en commun, de nombreuses études ont mis en

évidence que chacun de ces facteurs régule également des gènes cibles de manière spécifique (Hu

et al. 2003, Patard et al. 2003, Keith et al. 2012) (Tableau 4). Cette spécificité transcriptionnelle

s’expliquerait par les différences qui existent entre les domaines N-TAD de HIF-1α et HIF-2α et

qui leur confèrerait la capacité d’interagir avec différents cofacteurs afin de réguler

spécifiquement l’expression de certains gènes (Hu et al. 2007).

53!

Tableau 4. Principaux gènes cibles communs et spécifiques aux facteurs HIF-1 et HIF-2.

Gène/ Protéine Fonction Modèle(s) Référence(s) Gènes cibles de HIF-1 et HIF-2 SLC2A1/ GLUT1 Transport du glucose RCC, mCSE (Chen et al. 2001, Hu et

al. 2003) PLIN2/ ADRP Métabolisme lipidique RCC (Hu et al. 2003) CA12/CAXII Régulation du pH RCC (Hu et al. 2003) FLG/Filagrin Structure du cytosquelette RCC (Hu et al. 2003) IL6/IL-6 Immunité et inflammation RCC (Hu et al. 2003) ADM/Adrénomédulline Angiogenèse RCC (Hu et al. 2003) VEGFA/VEGF-A Angiogenèse RCC, cellules

Hep3B (Hu et al. 2003, Raval et al. 2005, Hu et al. 2007)

FLT1/VEGFR1 Angiogenèse hCE (Dutta et al. 2008) SERPINE1/PAI-1 Angiogenèse Cellules HepG2 (Geis et al. 2015) Gènes cibles de HIF-1 VEGFA/VEGF-A Angiogenèse mCSE, mCE (Iyer et al. 1998, Ryan et

al. 1998, Tang et al. 2004) BNIP3/BNIP3 Autophagie et apoptose RCC (Raval et al. 2005) HK1/Hexokinase 1 Glycolyse mCSE (Iyer et al. 1998, Ryan et

al. 1998) HK2/Hexokinase 2 Glycolyse RCC, mCSE (Iyer et al. 1998, Ryan et

al. 1998, Hu et al. 2003) PFK/Phosphofructokinase Glycolyse RCC, mCSE (Iyer et al. 1998, Ryan et

al. 1998, Hu et al. 2003) ALDOA/ALDA Glycolyse RCC, mCSE (Iyer et al. 1998, Ryan et

al. 1998, Hu et al. 2003) PGK1/PGK1 Glycolyse RCC, mCSE (Iyer et al. 1998, Ryan et

al. 1998, Hu et al. 2003) LDHA/LDHA Glycolyse RCC, mCSE (Firth et al. 1995) NOS2/(iNOS) Production de NO Macrophages (Takeda et al. 2010) IGF2/IGF2 Facteur de croissance MEF (Feldser et al. 1999) Gènes cibles de HIF-2 ABL2/ARG Inhibition de la production de NO Macrophages (Takeda et al. 2010) EPO/Erythropoïétine Erythropoïèse Rein, foie (Rankin et al. 2007,

Kapitsinou et al. 2010) POU5F1/OCT4 Identité des cellules souches mCSE (Covello et al. 2006) TGFA/TGFα Facteur de croissance RCC (Gunaratnam et al. 2003,

Raval et al. 2005) CCND1/Cycline D1 Progression du cycle cellulaire RCC (Raval et al. 2005) DLL4/DLL4 Voie de signalisation Notch mCE (Skuli et al. 2009) ANGPT2/angiopoïétine 2 SPHK1/SphK1

Remodellage des vaisseaux sanguins Prolifération et survie cellulaire

mCE Gliome

(Skuli et al. 2009) (Anelli et al. 2008)

ADRP : adipose différenciation-related protein ; ALDA : fructose-bisphosphate aldolase A ; ARG : Abelson-related gene protein ; CA : carbonic anhydrase ; DLL4 : delta-like 4 ; GLUT1 : glucose transporter 1 ; IGF2 : insulin growth factor 2 ; iNOS : inducible nitric oxide synthase ; LDHA : lactate déshydrogénase A ; mEC : mouse endothelial cells; mESC : mouse embryonnic stem cells; MEF : mouse embryonic fibroblasts ; NO : nitric oxide ; NOS : nitric oxide synthases ; PAI-1 : plasminogen activator inhibitor 1 ; PGK1 : phosphoglycerate kinase 1 ; PLIN2 : perilipin 2 ; RCC : rénal cell carcinoma ; TGF : transforming growth factor ; VEGF(R) : vascular endothélial growth factor (receptor).

54!

4.1. Les facteurs HIF dans le développement et l’embryogenèse

Chez les mammifères, l’embryogenèse a généralement lieu en condition d’hypoxie (1 à 5%

d’oxygène) (Dunwoodie 2009). De manière précoce lors du développement, la diffusion passive

de l’oxygène va être limitée, entrainant la mise en place d’un gradient de concentration impliqué

dans le bon développement de l’embryon, en particulier de ses systèmes cardiovasculaire et

respiratoire (Semenza 2012a). L’importance cruciale des facteurs HIF dans l’embryogenèse a été

mise en évidence par l’établissement de modèles animaux KO pour Hif-1α ou Hif-2α.

Les souris Hif-1α-/- présentent un arrêt du développement au jour E8,5 et meurent au jour E10,5

en raison de malformations cardiaques, de défauts vasculaires et d’une altération de

l’érythropoïèse. Ainsi, ces trois composants du système cardiovasculaire sont dépendants de HIF-

1α pour leur bon développement (Iyer et al. 1998). Les souris Hif-1α+/-, quant à elles, se

développent normalement mais ne sont pas capables de s’adapter à une hypoxie chronique (Yu et

al. 1999). Enfin, les KO conditionnels de Hif-1α dans différents types cellulaires montrent que

HIF-1α joue un rôle important dans l’adipogenèse, la chondrogenèse, l’ostéogenèse et dans

l’immunité (Schipani et al. 2001, Yun et al. 2002, Wang et al. 2007, Zinkernagel et al. 2007).

En fonction du fond génétique des souris utilisées, les souris Hif-2α-/- meurent au stade

embryonnaire (≈E12,5) en raison de défauts vasculaires ou d’une forte bradychardie liée à une

trop faible production de catécholamines ; meurent rapidement après leur naissance en raison

d’un défaut de maturation des poumons ; ou bien meurent après plusieurs mois suite à une

défaillance de différents organes causée par une production excessive de ROS (Tian et al. 1998,

Peng et al. 2000, Compernolle et al. 2002, Scortegagna et al. 2003).

Ces travaux montrent que HIF-1α et HIF-2α ont des rôles non redondants et cruciaux dans le

développement du système cardiovasculaire.

Concernant la sous-unité HIF-β, une étude a montré que les souris Hif-1β-/- meurent au stade

E10,5 en raison de défauts vasculaires (Maltepe et al. 1997).

4.2. Les facteurs HIF dans le métabolisme glucidique et lipidique

4.2.1. Le métabolisme glucidique

En conditions d’hypoxie, le manque d’oxygène ne permet pas aux cellules de réaliser la

phosphorylation oxydative, principal mécanisme de production de l’énergie cellulaire. Elles

doivent donc réorienter leur métabolisme vers des mécanismes de production d’ATP ne

55!

nécessitant pas d’oxygène, tel que la glycolyse (Goda and Kanai 2012). HIF-1 est un acteur clé de

cette reprogrammation métabolique puisqu’il contrôle l’expression de GLUT1 (Glucose Transporter

1), un transporteur du glucose, ainsi que celle de nombreuses enzymes de la glycolyse (Chen et al.

2001, Wenger 2002) (Figure 10). La PDK1 (pyruvate deshydrogenase kinase 1), dont l’expression est

régulée positivement par HIF-1, intervient à la fin de la glycolyse en inhibant la conversion du

pyruvate en acétyl-CoA (acetyl-Coenzyme A), ce qui limite la consommation d’oxygène par la

mitochondrie (Kim et al. 2006a, Papandreou et al. 2006). A l’inverse, lorsque HIF-1α est inhibé en

hypoxie, des quantités importantes d’acétyl-CoA sont générées entrainant l’activation du cycle de

Krebs malgré l’absence d’oxygène, ce qui aboutit à la production de ROS (Kim et al. 2006a, Zhang

et al. 2008a). La reprogrammation métabolique en faveur de la glycolyse permet donc aussi de

limiter la production de ROS qui résulte du mauvais fonctionnement de le la chaine de transfert

d’électrons de la mitochondrie en absence d’oxygène. Des études ont montré que HIF-1 régule

également la voie des pentoses-phosphates qui convertit des intermédiaires de la glycolyse en

ribose-5-phosphate, un substrat utilisé pour la synthèse des nucléotides (Tong et al. 2009). Ainsi,

HIF-1 facilite la survie et la croissance cellulaire lors du stress hypoxique en favorisant à la fois la

production d’énergie et la synthèse d’acides nucléiques à partir de la glycolyse (Figure 10).

Bien que l’expression de la plupart des protéines impliquées dans le métabolisme du glucose

soient régulées par HIF-1 (Hu et al. 2003, Raval et al. 2005), HIF-2 joue un rôle important dans le

métabolisme glucidique. En effet, une étude a montré que HIF-1 et HIF-2 régulent tout deux

l’expression de la cytochrome c oxydase afin de maximiser l’efficacité de la chaine de transfert

d’électrons de la mitochondrie (Gordan et al. 2007b). De plus, HIF-2 régulerait spécifiquement

l’expression de la SOD2 (superoxide dismutase 2), une enzyme antioxydante, et supprimerait ainsi

l’accumulation aberrante de ROS dans la cellule (Gordan et al. 2007b). Enfin, la PDK4 serait

régulée spécifiquement par HIF-2, qui limiterait ainsi la production d’acétyl-CoA et le

fonctionnement du cycle de Krebs (Huang et al. 2002).

56!

Figure 10. Rôles des facteurs HIF dans la régulation du métabolisme glucidique et lipidique. ATP : adénosine triphosphate ; CTE : chaine de transfert d’électrons; HMOX1 : heme oxygenase decycling 1 ; LDHA : lactate deshydrogenase A ; PDK : pyruvate deshydrogenase kinase ; PPP : pentose phosphate pathway ; R5P : ribose-5-phosphate ; ROS : reactive oxygen species ; SOD : superoxide dismutase 2. Adapté de Majmundar, 2010.

4.2.2. Le métabolisme lipidique

Les lipides constituent une importante source d’énergie dans la cellule, via la β-oxydation,

principale voie de dégradation des acides gras, et la phosphorylation oxydative. Le stress

hypoxique modifie le métabolisme lipidique en inhibant la dégradation des lipides et en

favorisant leur stockage. En effet, une étude a montré que l’activation constitutive de HIF-2 induit

une diminution de la β-oxydation et une augmentation du stockage des lipides au niveau du foie

(Rankin et al. 2009) (Figure 10).

57!

4.3. Les facteurs HIF dans le système cardiovasculaire

Les facteurs HIF jouent un rôle essentiel dans le développement embryonnaire du système

cardiovasculaire (Hu et al. 2003, Covello and Simon 2004, Manalo et al. 2005), mais sont également

impliqués dans l’homéostasie cardiovasculaire chez l’adulte, en particulier lors de l’angiogenèse.

En effet, en réponse à l’hypoxie, HIF-1 et HIF-2 régulent l’expression de nombreux gènes

impliqués dans le transport de l’oxygène, l’angiogenèse, le remodelage et l’intégrité vasculaire.

HIF-1 et HIF-2 contrôlent ainsi l’expression du VEGF, mais aussi de l’EPO, des angiopoïétines 1 et

2, du PDGFβ, ou encore du PlGF (Hu et al. 2003, Kelly et al. 2003, Rankin et al. 2007, Simon et al.

2008, Schito et al. 2012, Semenza 2014a).

Les cellules endothéliales sont particulièrement impliquées dans le processus de néoangiogenèse,

et sont donc sensibles à l’activation des facteurs HIF. Une étude a ainsi montré que l’induction de

HIF-1α en hypoxie entraine la formation de tubes par des cellules endothéliales in vitro

(Yamakawa et al. 2003). De plus, il a été montré in vivo que la délétion spécifique de HIF-1α dans

les cellules endothéliales entraine des défauts de croissance des vaisseaux sanguins en hypoxie.

De telles cellules endothéliales présentent des défauts de production du VEGF et d’activation du

VEGFR2, ainsi qu’une diminution de leur prolifération et de leur migration en hypoxie (Tang et

al. 2004).

HIF-2α est quant à lui fortement exprimé dans les cellules endothéliales lors de l’embryogenèse

(Ema et al. 1997). Une étude in vivo a montré que des souris délétées pour HIF-2α dans les cellules

endothéliales se développent normalement mais présentent une variété de phénotypes aberrants,

tels qu’une augmentation de la perméabilité vasculaire et une diminution de la lumière et de la

perfusion vasculaire (Skuli et al. 2009, Skuli et al. 2012). HIF-2α jouerait donc un rôle

fondamental dans la formation de vaisseaux sanguins fonctionnels par les cellules endothéliales.

Les facteurs HIF sont également impliqués dans de nombreuses pathologies du système

cardiovasculaire dans lesquelles l’homéostasie de l’oxygène est perturbée. HIF-1α a par exemple

été impliqué dans le processus de néoangiogenèse lors de la reperfusion des zones hypoxiques

qui a lieu suite à un événement ischémique. Ainsi, dans un modèle d’ischémie des membres

inférieurs, les souris Hif-1α+/- présentent une diminution de l’induction de HIF-1α, ce qui a pour

conséquences une diminution de l’activation de facteurs pro-angiogéniques et une diminution de

la reperfusion du membre inférieur par rapport aux souris sauvages. A l’inverse, l’expression

d’une forme constitutivement active de HIF-1α améliore la reperfusion (Bosch-Marce et al. 2007).

La surexpression de HIF-1α favorise ainsi la protection tissulaire suite à une ischémie ou à un

58!

infarctus du myocarde, alors que son inhibition entraine une augmentation de la perte tissulaire

suite aux mêmes événements (Shohet and Garcia 2007). Un rôle pro-angiogénique de HIF-1α a

également été décrit dans la cardiomyopathie hypertrophique, la cicatrisation et la

néovascularisation rétinienne (Semenza 2014b).

De nombreuses études cliniques et pré-cliniques ont ainsi mis en évidence un rôle protecteur des

facteurs HIF dans l’ischémie des membres inférieurs et l’infarctus du myocarde, ainsi que dans la

cicatrisation et le rejet de greffe (Botusan et al. 2008, Cai et al. 2008, Bernhardt et al. 2009, Jiang et al.

2011, Wilkes 2011). A l’inverse, les facteurs HIF contribuent au développement de l’hypertension

artérielle pulmonaire, de la néovascularisation rétinienne et de la cardiomyopathie chez les sujets

obèses (Brusselmans et al. 2003, Yoshida et al. 2010a, Lin et al. 2013). Enfin, leur rôle dans

l’insuffisance cardiaque liée à une augmentation de la pression artérielle est moins clair (Semenza

2014b).

4.4. Les facteurs HIF dans les cancers

Les études immunohistochimiques révèlent que dans la grande majorité des cancers, l’expression

de HIF-1α, de HIF-2α, ou de ces deux sous-unités est plus élevée dans le tissu tumoral que dans

le tissu sain (Zhong et al. 1999, Talks et al. 2000). Une telle augmentation de l’expression des

facteurs HIF est très souvent corrélée à un mauvais pronostic (Keith et al. 2012, Semenza 2014b)

(Tableau 5).

59!

Tableau 5. Corrélation entre l’expression intratumorale de HIF-α et le pronostic de survie des patients. Type de cancer Pronostic Référence(s) Expression de HIF-1α Expression de HIF-2α Cancers du système nerveux central Astrocytome Mauvais Mauvais (Korkolopoulou et al. 2004)

(Scrideli et al. 2007) Glioblastome Non déterminé Mauvais (Scrideli et al. 2007) Gliome Non corrélé Mauvais (Li et al. 2009) Oligodendrogliome Mauvais Non déterminé (Birner et al. 2001) Neuroblastome Bon Mauvais (Noguera et al. 2009) Cancers du système disgestif Carcinome oesophagien Mauvais Non déterminé (Tzao et al. 2008, Ping et al.

2014) Adénocarcinome gastrique Mauvais Mauvais (Mizokami et al. 2006,

Griffiths et al. 2007, Lin et al. 2014b, Tong et al. 2015)

GIST Mauvais Non déterminé (Takahashi et al. 2003) Adénocarcinome colorectal Mauvais Mauvais (Yoshimura et al. 2004,

Rasheed et al. 2009) Hépatocarcinome Non déterminé Mauvais (Bangoura et al. 2007) Adénocarcinome pancréatique

Mauvais Non déterminé (Shibaji et al. 2003)

Cancers du système respiratoire Carcinome des voies aériennes supérieures

Mauvais Mauvais (Koukourakis et al. 2002, Winter et al. 2006)

NSCLC Mauvais Mauvais (Giatromanolaki et al. 2001, Kim et al. 2005, Wu et al. 2011)

Cancers du système hématopoïétique Leucémie myéloïde aigüe Mauvais Non déterminé (Deeb et al. 2011) Leucémie lymphoblastique aigüe

Mauvais Non déterminé (Frolova et al. 2012)

Cancers du système urinaire Carcinome vésical Mauvais Non déterminé (Theodoropoulos et al.

2004) Adénocarcinome rénal Mauvais Mauvais (Klatte et al. 2007, Kroeger

et al. 2014, Minardi et al. 2015)

Bon Non déterminé (Lidgren et al. 2005) Cancers du système reproducteur et associés Adénocarcinome mammaire Mauvais Mauvais* (Helczynska et al. 2008,

Yamamoto et al. 2008, Rundqvist and Johnson 2013, Wang et al. 2014b)

Carcinome ovarien Mauvais Mauvais* (Osada et al. 2007, Daponte et al. 2008)

Carcinome utérin Mauvais Mauvais (Birner et al. 2000, Kawanaka et al. 2008, Huang et al. 2014)

Adénocarcinome prostatique Mauvais Mauvais* (Nanni et al. 2009) Cancers de la peau Mélanome Mauvais Mauvais (Giatromanolaki et al. 2003) GIST : gastrointestinal stromal tumor ; NSCLC : non-small-cell lung carcinoma ; *Corrélation avec l’expression cytoplasmique de HIF-2α.

60!

Divers mécanismes contribuent à l’augmentation de l’activité des facteurs HIF dans les cancers,

parmi lesquels l’adaptation à l’hypoxie intratumorale et les altérations génétiques des cellules

cancéreuses. En effet, la multiplication des cellules tumorales qui prolifèrent plus rapidement que

le réseau vasculaire associé, la limite de diffusion de l’oxygène, et l’irrégularité spatiale et

temporelle du flux sanguin dans la tumeur entrainent la formation de zones d’hypoxie

intratumorale qui permettent la stabilisation des facteurs HIF. L’hypoxie intratumorale, qui

constitue un facteur de mauvais pronostic, est une caractéristique de la majorité des tumeurs

localement avancées qui sont toujours plus hypoxiques que le tissu sain dont elles dérivent

(Vaupel and Mayer 2007). D’autres conditions microenvironnementales, telles que les ROS,

peuvent également induire l’expression de HIF-1α dans les tumeurs (Gao et al. 2007). D’autre

part, l’activité des facteurs HIF dans les cellules tumorales peut être induite par des altérations

génétiques, indépendamment de la concentration en oxygène. Ainsi, l’activation d’oncogènes, tels

que la voie PI3K/Akt/mTOR, ou la perte de fonction de gènes suppresseurs de tumeur, tels que

pVHL, p53 et PTEN, favorise l’expression des facteurs HIF dans les tumeurs (Maxwell et al. 1999,

Ravi et al. 2000, Zhong et al. 2000, Zundel et al. 2000, Laughner et al. 2001).

De nombreuses études ont montré que les gènes cibles de HIF jouent des rôles importants dans

tous les aspects du cancer. Cependant, dans une cellule cancéreuse donnée, seulement certains

gènes cibles sont exprimés et vont déterminer les conséquences de l’activation de HIF. C’est ainsi

que ces facteurs régulent la dédifférenciation, la survie, la prolifération et le métabolisme des

cellules tumorales, l’angiogenèse, l’invasion et la dissémination métastatique, tout en favorisant

l’induction d’un microenvironnement immunosuppressif (Semenza 2014b).

4.4.1. Le maintien d’un phénotype dédifférencié

Des études ont montré que de nombreuses tumeurs contiennent des cellules souches cancéreuses

(CSC) responsables de l’initiation et de la maintenance de la croissance tumorale, ainsi que de la

résistance aux traitements (Lapidot et al. 1994, Singh et al. 2004, Ishikawa et al. 2007, Chen et al.

2012, Skuli et al. 2012). De telles cellules présentent une forte capacité d’auto-renouvellement, de

différenciation et d’ancrage, sont pluripotentes, et peuvent facilement migrer à distance pour

former des métastases (Chen et al. 2012). Il a été proposé qu’un environnement hypoxique serait

nécessaire à la fonction des CSC (Keith and Simon 2007). En effet, des études réalisées dans

plusieurs modèles de cancers ont montré que l’hypoxie favorise l’agressivité tumorale en

induisant la dédifférenciation spontanée des cellules tumorales qui acquièrent ainsi des

propriétés de cellules souches (Axelson et al. 2005, Mazumdar et al. 2009). Par la suite, une équipe

61!

a montré que l’induction de HIF-2α en hypoxie, et non celle de HIF-1α, est cruciale pour assurer

la tumorigénicité de cellules souches de gliomes (Li et al. 2009). L’hypoxie, via l’activation de HIF-

2α en particulier, induit en effet l’expression par les CSC de facteurs normalement exprimés par

les cellules souches embryonnaires, tels que OCT4 (Octamer-binding transcription factor 4) et SOX2

((Sex determining region Y)-box 2), ainsi que l’expression d’autres facteurs de pluripotence tels que

Nanog, KLF4 (Kruppel-Like Factor 4) et c-Myc (Koh et al. 2011, Mathieu et al. 2011, Philip et al.

2013).

4.4.2. La survie et la prolifération cellulaire

Les facteurs HIF influencent la survie et la prolifération des cellules tumorales selon plusieurs

mécanismes. Quatre d’entre eux sont détaillés ci-dessous.

D’une part, dans les cellules tumorales, les facteurs HIF activent la transcription de nombreux

gènes codant pour des facteurs de croissance, tels que le VEGF, l’IGF2 ou encore le TGF-α. Ces

facteurs peuvent se lier à leurs récepteurs de manière autocrine ou paracrine afin de favoriser la

prolifération et la survie cellulaire (Forsythe et al. 1996, Feldser et al. 1999, Semenza 2014b).

D’autre part, à l’inverse des cellules saines, les cellules tumorales se divisent de façon illimitée, en

particulier grâce à la maintenance des télomères. Or, une étude effectuée dans un modèle de

cancer de l’utérus a montré que HIF-1 entraine l’activation de TERT (Telomerase Reverse

Transcriptase), une enzyme capable de rallonger les télomères (Yatabe et al. 2004).

Le facteur de transcription c-Myc est surexprimé dans la majorité des tumeurs humaines. En

formant un hétérodimère avec MAX (Myc-Associated factor X), il favorise la prolifération cellulaire

en régulant la transition G1/S du cycle cellulaire. Des études ont montré que HIF-2α, à l’inverse

de HIF-1α, stabilise l’interaction entre c-Myc et MAX ce qui favorise la liaison de c-Myc à l’ADN

de ses gènes cibles et donc son pouvoir oncogénique (Koshiji et al. 2004, Gordan et al. 2007b,

Gordan et al. 2008).

Le gène suppresseur de tumeur p53, impliqué dans la réparation de l’ADN, l’arrêt du cycle

cellulaire ou encore l’apoptose, est muté ou délété dans la plupart des cancers. Alors que

plusieurs études ont montré que HIF-1α induit la stabilisation de p53 dans des modèles

tumoraux, ainsi qu’en réponse à la radiothérapie, d’autres études ont montré que HIF-2α inhibe

la fonction de p53 dans des modèles d’adénocarcinomes rénaux, favorisant ainsi la survie

cellulaire, la radio- et la chimiorésistance (An et al. 1998, Chen et al. 2003, Bertout et al. 2009,

Roberts et al. 2009).

62!

4.4.3. La reprogrammation métabolique

Il existe des différences majeures entre le métabolisme glucidique des cellules saines et celui des

cellules tumorales. De telles modifications métaboliques ont été identifiées en 1956 par Otto

Warburg, qui a montré que les cellules saines utilisent la glycolyse et la phosphorylation

oxydative pour produire respectivement 10% et 90% de l’ATP dont elles ont besoin, alors que

dans les cellules tumorales, 50% de l’énergie est produite par la glycolyse, et 50% par la

phosphorylation oxydative (Warburg 1956). Une telle reprogrammation métabolique a

logiquement lieu lorsque les cellules tumorales sont en conditions hypoxiques. Or, de manière

intéressante, cette reprogrammation a également lieu lorsque les cellules tumorales sont en

présence de suffisamment d’oxygène pour assurer la fonction mitochondriale. Les cellules

tumorales privilégient ainsi la glycolyse aérobie, c’est l’effet Warburg, puisqu’elle leur confère de

nombreux avantages, en favorisant notamment leur survie et leur migration (Warburg 1956,

Denko 2008).

Le facteur HIF-1 a été impliqué dans la régulation de nombreux gènes responsables de la

reprogrammation métabolique (Figure 10). En effet, HIF-1 favorise la glycolyse en augmentant

l’expression des transporteurs de glucose GLUT1 et GLUT3 et des enzymes de la glycolyse (Iyer

et al. 1998, Chen et al. 2001, Wenger 2002). Des quantités accrues de pyruvate sont ainsi générées.

HIF-1 favorise la conversion du pyruvate en lactate en induisant l’expression de la LDHA (Lactate

Dehydrogenase A), ainsi que l’export de ce dernier vers le milieu extracellulaire en favorisant

l’expression de MCT4 (Monocarboxylate Transporter 4) (Firth et al. 1995, Ullah et al. 2006).

L’excrétion de lactate, tout comme l’expression de CAIX (Carbonic Anhydrase IX), un gène cible de

HIF-1, participe à l’acidification du milieu extracellulaire qui favorise la survie des cellules

tumorales et leur confère des capacités migratoires et invasives (Walenta and Mueller-Klieser

2004, Trastour et al. 2007). D’autre part, HIF-1 diminue la fonction mitochondriale, et donc la

phosphorylation oxydative, en induisant l’expression de la PDK1 qui empêche la conversion du

pyruvate en acétyl-CoA dans la mitochondrie (Kim et al. 2006b, Papandreou et al. 2006). HIF-1

diminue également la biogenèse mitochondriale en induisant l’expression de MXI1 (MAX

Interactor 1) qui inactive c-Myc (Zhang et al. 2007). Une telle réduction de l’activité mitochondriale

entraine une diminution de la production de ROS et favorise la préservation de certains substrats

anaboliques, ce qui est favorable pour la cellule tumorale (Denko 2008).

63!

4.4.4. L’induction d’un microenvironnement immunosuppressif

Les cellules tumorales hypoxiques sont capables d’échapper au système immunitaire de l’hôte et

d’induire un microenvironnement immunosuppressif grâce à plusieurs mécanismes. Quatre

d’entre eux sont détaillés ci-dessous.

En premier lieu, HIF-1α favorise l’expression de CD39 et CD73, deux protéines de surface des

lymphocytes T, qui catalysent la formation d’adénosine. Cette dernière se lie à ses récepteurs A2R

(Adenosine 2 Receptors) ce qui a pour conséquences l’augmentation du taux intracellulaire d’AMPc

et l’inhibition des fonctions cytotoxiques des lymphocytes T effecteurs (Synnestvedt et al. 2002,

Sitkovsky and Ohta 2013). D’autre part, une étude a montré que l’expression de HIF-1α par les

macrophages associés à la tumeur inhibe la fonction des lymphocytes T et favorise la croissance

tumorale (Doedens et al. 2010). De même, les MDSC (Myeloid-Derived Suppressor Cell) recrutées

dans les régions hypoxiques des tumeurs inhiberaient la prolifération des lymphocytes T et leur

production d’interferon-γ selon un mécanisme dépendant de HIF-1α (Corzo et al. 2010). Enfin,

dans les cellules tumorales, HIF-1α induit l’expression de la chimiokine CCL28 (C-C motif ligand

28) qui permet le recrutement les lymphocytes T régulateurs, acteurs de la tolérance immunitaire

(Facciabene et al. 2011).

4.4.5. L’angiogenèse tumorale

Afin de subvenir à leurs besoins en oxygène et en nutriments, et de pouvoir croître au-delà d’une

taille microscopique, les tumeurs doivent établir leur propre réseau vasculaire (Folkman and

Hanahan 1991). La néoangiogenèse est en effet essentielle à la progression tumorale et est induite

par les cellules tumorales lors du switch angiogénique (Folkman and Hanahan 1991). Celui-ci a

lieu lorsque les cellules tumorales produisent plus de facteurs pro-angiogéniques que de facteurs

anti-angiogéniques. Les facteurs HIF sont des acteurs cruciaux de ce switch puisqu’ils induisent

l’expression du VEGF, des angiopoïétines 1 et 2, du PDGFβ, du PGF, du SCF (Stem Cell Factor), du

PAI-1, des MMP 2 et 9, et diminuent celle de la thrombospondine (Carmeliet and Jain 2000,

Hickey and Simon 2006). L’ensemble de ces facteurs exerce leur action pro-angiogénique sur les

cellules endothéliales, les péricytes, et les progéniteurs endothéliaux qui expriment les récepteurs

apparentés : VEGFR2, TIE-2, PDGFRβ, etc. Des études ont ainsi montré que l’inhibition de

l’activité transcriptionnelle de HIF-1 entraine une diminution de la vascularisation et de la

croissance tumorale in vivo (Lee et al. 2009a, Lee et al. 2009b). De même, HIF-2α a été impliqué

64!

dans l’angiogenèse tumorale, en particulier dans les adénocarcinomes rénaux où il jouerait un

rôle plus important que HIF-1α (Raval et al. 2005).

Cependant, l’excès de facteurs pro-angiogéniques produits par les cellules tumorales aboutit à la

formation d’un réseau vasculaire tumoral structurellement et fonctionnellement anormal qui ne

permet pas d’oxygéner les cellules tumorales et qui entretient l’hypoxie intratumorale, et donc

l’activation des facteurs HIF, formant ainsi un cercle vicieux (Jain 2001).

4.4.6. L’invasion et la dissémination métastatique

La transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) est une étape clé dans l’acquisition d’un

phénotype invasif par les cellules tumorales qui pourront ensuite migrer à distance pour former

des métastases. La TEM consiste en la perte de l’adhérence entre les cellules et en une

augmentation de leur capacité de migration (Majmundar et al. 2010). Les facteurs HIF jouent un

rôle important dans ce processus en régulant notamment l’expression de la E-cadhérine, des

MMP, de la lysyl oxydase, de TWIST1 (Twist-related protein 1), de Snail1, de CXCR4 (C-X-C motif

Receptor 4) et de SDF1 (Stromal-Derived Factor 1) (Yang and Wu 2008, Majmundar et al. 2010, Mak

et al. 2010).

La E-cadhérine, qui favorise l’adhésion entre les cellules, limite le pouvoir invasif des cellules

tumorales. Une étude a montré que l’expression de HIF-1α suffit à induire la perte de l’expression

de la E-cadhérine et à augmenter la capacité invasive de cellules d’adénocarcinome rénal (Esteban

et al. 2006). A l’inverse, HIF-1α induit l’expression de la lysyl oxidase (LOX), une enzyme

responsable du remodelage de la matrice extracellulaire dont l’activation augmente le pouvoir

invasif des cellules tumorales et dont l’inhibition serait suffisante pour prévenir l’apparition de

métastases induites par l’hypoxie (Erler et al. 2006, Rodriguez et al. 2008). De plus, l’expression de

LOXL2 et LOXL4 (Lysyl Oxydase homolog 2/4) est aussi induite par HIF-1α. Les protéines LOX,

LOXL2 et LOXL4 participent également à la formation de la niche métastatique, en particulier via

le remodelage de la matrice extracellulaire et l’attraction de cellules dérivées de la moelle osseuse

(Wong et al. 2011, Wong et al. 2012). Des études ont mis en évidence que HIF-1 favorise

l’expression du récepteur CXCR4 et de son ligand SDF-1 dans les cellules endothéliales et dans

plusieurs lignées cellulaires tumorales (Staller et al. 2003, Ceradini et al. 2004, Zagzag et al. 2006).

Or, il a été montré que l’interaction entre CXCR4 et SDF-1 joue un rôle important dans la

migration des cellules tumorales vers leur site de métastase, CXCR4 étant exprimé par les cellules

tumorales et SDF-1 par le site métastatique (Arya et al. 2007).

65!

L’invasion des cellules tumorales dans un vaisseau sanguin, ou intravasation, est facilitée par la

perméabilité vasculaire induite par le VEGF et l’angiopoïétine 2, deux gènes cibles de HIF

(Dvorak et al. 1999, Falcon et al. 2009). Une fois dans la circulation sanguine, les cellules doivent

adhérer à la paroi du vaisseau sanguin. HIF-1 induit l’expression de L1CAM (L1 Cell Adhesion

Molecule) qui est impliquée dans ce processus, dit de margination (Zhang et al. 2012). La protéine

ANGPTL4 (Angiopoiétin-like 4) serait ensuite impliquée dans la diminution des interactions entre

les cellules endothéliales et favoriserait ainsi la migration des cellules tumorales vers le site de

métastase (Zhang et al. 2012). La sécrétion de PDGFβ, gène cible de HIF-1, par les cellules

tumorales faciliterait quant à elle la dissémination métastatique via les vaisseaux lymphatiques

(Schito et al. 2012).

5. L’hypoxie et les facteurs HIF comme cibles thérapeutiques en cancérologie

Largement impliqués dans l’initiation et la progression tumorale, l’hypoxie et les facteurs HIF

favorisent également la résistance aux thérapies anticancéreuses, telles que les chimiothérapies,

les radiothérapies et les thérapies ciblées (Comerford et al. 2002, Brown 2007, Zhao et al. 2010,

Wilson and Hay 2011, Samanta et al. 2014, Zhao et al. 2014). Leur importance thérapeutique en a

donc fait des cibles pertinentes pour le traitement des cancers, et a conduit à la mise au point de

nombreuses stratégies ciblant les cellules hypoxiques et les facteurs HIF.

5.1. Ciblage de l’hypoxie intratumorale : les prodrogues cytotoxiques

Les prodrogues cytotoxiques sont des molécules inactives qui sont réduites par des enzymes

endogènes en métabolite actif et cytotoxique. Afin de cibler uniquement les cellules hypoxiques,

ces prodrogues ont été élaborées de façon à être métabolisées uniquement en absence d’oxygène

(Wilson and Hay 2011).

Parmi elles, la tirapazamine (TPZ) est 50 à 200 fois plus toxique vis-à-vis des cellules hypoxiques

par rapport aux cellules « normoxiques » et présente des propriétés antitumorales (Brown 1993).

En hypoxie, la TPZ est réduite par une réductase endogène pour former le radical TPZ!. S’il se

retrouve en présence d’oxygène, l’électron libre de la TPZ! sera rapidement transféré à une

molécule d’oxygène qui formera ainsi un radical superoxide en régénérant la TPZ initiale (Figure

11). A l’inverse, si elle reste en condition d’hypoxie, la TPZ! va générer un radical libre OH! ou

66!

bien un radical benzotriazinyl (BTZ!). Les radicaux TPZ! et BTZ! seraient responsables de la

toxicité de la TPZ via la formation de cassures double brin au niveau de l’ADN et selon un

mécanisme dépendant de la topoisomérase II (Peters and Brown 2002). Une étude a montré que la

combinaison TPZ/cisplatine améliore la survie de patients atteints d’un cancer du poumon, en

comparaison avec le cisplatine seul (von Pawel et al. 2000). De plus, un essai clinique de phase II a

mis en évidence que la combinaison TPZ/cisplatine/radiothérapie, en comparaison avec la

combinaison 5-fluorouracile/cisplatine/radiothérapie, améliore la survie sans récidive de

patients atteints d’un cancer des voies aériennes et digestives supérieures (Rischin et al. 2005).

Cependant, la TPZ entraine des effets indésirables, tels que la neutropénie, et peut être activée

dans des tissus sains faiblement oxygénés, tels que la moelle osseuse. Enfin, un essai clinique de

phase III a montré que l’association TPZ/cisplatine/radiothérapie, en comparaison avec

l’association cisplatine/radiothérapie, n’apporte pas de bénéfice en terme de survie chez des

patientes atteintes d’un cancer de l’utérus localement avancé (DiSilvestro et al. 2014).

Figure 11. Mécanisme d’activation de la tirapazamine (TPZ).

Il existe d’autres prodrogues cytotoxiques, telles que le PR-104, l’AQ4N et le SN30000 qui font

l’objet d’études précliniques mais qui ne sont pas ou plus testées en clinique à ce jour.

5.2. Normalisation du réseau vasculaire tumoral

!5.2.1. Concept de normalisation vasculaire

L’utilisation clinique du bevacizumab en monothérapie n’a pas montré de bénéfice au niveau de

la survie globale des patients atteints de cancers avancés ou métastatiques. Par contre, des études

cliniques de phase III ont montré que l’association du bevacizumab avec une chimio- ou une

67!

immunothérapie confère un bénéfice de survie à ces patients (Browder et al. 2000, Jain 2001). Ces

données cliniques peuvent sembler paradoxales : pourquoi cet agent anti-angiogénique, qui

détruit le réseau vasculaire tumoral, est uniquement bénéfique via l’amélioration de l’efficacité de

thérapies qui dépendent de ce réseau vasculaire pour atteindre les cellules tumorales et exercer

leurs effets ? Afin de répondre à cette question, Rakesh Jain a proposé le concept de normalisation

vasculaire, selon lequel l’utilisation judicieuse des agent anti-angiogéniques, en terme de dose et

de temps de traitement, peut « normaliser » transitoirement le réseau vasculaire tumoral anormal

au lieu de le détruire, de manière à améliorer la perfusion vasculaire (Jain 2001) (Figure 12). Il en

résulterait une diminution de l’hypoxie intratumorale, qui favorise l’échec thérapeutique, et une

augmentation de l’acheminement des thérapies anti-cancéreuses au niveau de la tumeur. Ainsi,

l’administration de ces thérapies pendant la fenêtre d’oxygénation permettrait d’augmenter leur

efficacité (Jain 2001). De plus, l’élimination des cellules tumorales et stromales par des agents

anti-angiogéniques et cytotoxiques diminuerait la pression interstitielle et la compression des

vaisseaux sanguins tumoraux, améliorant encore la perfusion vasculaire. Enfin, le réseau

vasculaire tumoral normalisé limiterait l’échappement de cellules tumorales depuis la tumeur

primaire, diminuant potentiellement la dissémination métastatique (Jain 2005) (Figure 5).

Ce concept de normalisation vasculaire permet donc d’expliquer comment le bevacizumab

améliore l’efficacité des chimio- et immunothérapies, et propose de nouvelles stratégies pour

améliorer l’efficacité de telles associations (Jain et al. 2006).

5.2.2. Données précliniques et cliniques

De nombreuses études précliniques ont impliqué la normalisation vasculaire dans l’efficacité

thérapeutique induite par les anti-angiogéniques (Yuan et al. 1996, Izumi et al. 2002, Tong et al.

2004, Winkler et al. 2004). Par la suite, des études ont montré qu’outre le VEGF et les autres

facteurs pro-angiogéniques, de nombreuses protéines jouant un rôle dans la progression tumorale

peuvent être ciblées au niveau des cellules endothéliales, périvasculaire ou tumorales pour

induire une normalisation vasculaire transitoire ou prolongée (Jain 2014). C’est notamment le cas

des angiopoïétines et de leur récepteur Tie-2, de l’axe PDGF/PDGFR, de Notch, de l’oncogène B-

Raf, de la voie PI3K/Akt/mTOR, du senseur de l’oxygène PHD2 (Prolyl Hydroxylase Domain

containing protein 2) ou de la S1P (di Tomaso et al. 2009, Huang et al. 2010b, Goel et al. 2011, Bottos

et al. 2012, Jain 2014, Ader et al. 2015). Une étude a montré que la chloroquine, une molécule

utilisée en clinique pour ses propriétés antipaludiques, induit une normalisation vasculaire

dépendante de l’activation de Notch dans les cellules endothéliales, améliorant ainsi la perfusion

vasculaire et réduisant l’apparition de métastases (Maes et al. 2014). D’autre part, deux études in

68!

vivo originales effectuées à l’aide de souris génétiquement modifiées ont montré qu’une activité

réduite de la PHD2 dans les cellules endothéliales n’affecte pas l’angiogenèse physiologique mais

induit une normalisation des vaisseaux tumoraux associée à une oxygénation tumorale, à une

diminution de la dissémination métastatique et à une augmentation de l’efficacité de la

chimiothérapie (Mazzone et al. 2009, Leite de Oliveira et al. 2012). Enfin, une étude de notre

équipe a récemment montré que la neutralisation de la S1P chimiosensibilise un modèle murin de

cancer de la prostate en induisant une normalisation vasculaire et une oxygénation tumorale

transitoire, tout en réduisant la dissémination métastatique (Ader et al. 2015).

Une étude clinique effectuée chez des patients atteints d’un carcinome rectal a montré que

l’administration d’une dose unique de bevacizumab permet de diminuer la densité vasculaire

tumorale ainsi que la pression interstitielle et augmente le recouvrement péricytaire (Willett et al.

2004). Par la suite, une étude clinique de phase II effectuée chez des patients atteints d’un

glioblastome récurrent a montré que le cediranib, un inhibiteur des récepteurs VEGFR1, VEGFR2,

VEGFR3, PDGFRβ et c-Kit, normalise les vaisseaux sanguins tumoraux et présente un bénéfice

clinique en réduisant les œdèmes associés à la tumeur (Batchelor et al. 2007). Cette normalisation

vasculaire a lieu très rapidement après le début du traitement, est réversible mais est maintenue

pendant au moins 28 jours, ce qui suggère que l’administration simultanée du cediranib et d’un

cycle de chimiothérapie peut être bénéfique durant cette période (Batchelor et al. 2007). De plus, la

normalisation vasculaire induite par l’administration d’une dose unique de cediranib corrèle avec

une augmentation de la survie globale et de la survie sans progression des patients (Sorensen et

al. 2009). Plus particulièrement, des études effectuées chez des patients atteints d’un glioblastome

récemment diagnostiqué ont montré que seuls les patients répondant au cediranib par une

augmentation de la perfusion vasculaire et de l’oxygénation tumorale survivent plus longtemps

(Sorensen et al. 2012, Batchelor et al. 2013). Des résultats similaires ont été obtenus avec le

bevacizumab chez des patientes atteintes d’un cancer du sein localement avancé (Jain 2014). Ces

données doivent à présent être confirmées par des études cliniques randomisées. L’augmentation

de la perfusion vasculaire et de l’oxygénation tumorale pourrait alors servir de marqueur

prédictif à l’efficacité des anti-angiogéniques.

69!

Figure 12. Concept de normalisation vasculaire en réponse aux anti-angiogéniques. A) A l’inverse de celui des tissus sains, le réseau vasculaire tumoral est anormal. La normalisation vasculaire est un concept selon lequel les anti-angiogéniques peuvent normaliser la structure et la fonction des vaisseaux sanguins tumoraux. Cependant, leur administration prolongée ou l’utilisation d’une dose trop importante aboutit à la destruction des vaisseaux sanguins et empêche la distribution de l’oxygène, des nutriments et des agents thérapeutiques dans la tumeur. B) Dynamique de la normalisation vasculaire induite par l’inhibition du VEGFR2 dans une tumeur en comparaison d’un tissu sain. C) Des modifications de l’équilibre entre les facteurs pro- et anti-angiogéniques sont à l’origine des changements phénotypiques du réseau vasculaire. Adapté de Jain, 2005.

5.3. Stratégies ciblant les facteurs HIF

Les facteurs HIF étant les acteurs de l’adaptation à l’hypoxie intratumorale, leur ciblage

spécifique pourrait s’avérer bénéfique en clinique. Historiquement, les facteurs de transcription

ont été décrits comme étant difficiles à cibler mais il existe aujourd’hui de nombreux composés

capables d’inhiber l’activité des facteurs HIF, de manière directe ou indirecte (Tableau 6). Parmi

eux, certains sont déjà sur le marché et d’autres font l’objet d’études cliniques ou précliniques.

5.3.1. Molécules déjà sur le marché

Quelques molécules utilisées actuellement en chimiothérapie anticancéreuse inhibent l’activité

des facteurs HIF. C’est le cas du topotecan, un analogue de la camptothécine. Cette molécule

inhibe la topoisomérase I et induit ainsi la formation de cassures double brin au niveau de l’ADN,

inhibant donc sa réplication. Une étude a montré que le topotecan inhibe la traduction de HIF-1α

70!

selon un mécanisme dépendant de la topoisomérase I mais indépendant de la réplication de

l’ADN (Rapisarda et al. 2004a). Il a également été montré in vivo que l’administration quotidienne

de topotecan entraine une diminution de l’expression de HIF-1α, de l’angiogenèse et de la

croissance tumorale (Rapisarda et al. 2004b). De plus, un effet antitumoral synergique a été

observé lors d’un traitement combiné avec le bevacizumab (Rapisarda et al. 2009). La

doxorubicine et la daunorubicine, de la famille des anthracyclines, sont des agents intercalants de

l’ADN utilisés en chimiothérapie. Une étude a montré que ces molécules inhibent l’activité

transcriptionnelle de HIF-1 en bloquant sa liaison à l’ADN de ses gènes cibles, ce qui se traduit

par une diminution de l’angiogenèse tumorale in vivo (Lee et al. 2009a).

D’autre part, plusieurs thérapies ciblées actuellement utilisées en clinique ont des effets anti-

angiogéniques qui semblent largement être dus à leur capacité à inhiber l’activité de HIF-1

(Semenza 2010). Cela semble être le cas de l’imatinib, un inhibiteur de la protéine BCR-ABL

(Breakpoint Cluster Region protein - Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1) dont

l’activation constitutive favorise l’expression de l’ARNm de HIF-1α, augmentant ainsi son

activité transcriptionnelle et donc l’expression du VEGF (Mayerhofer et al. 2002). L’effet anti-

angiogénique du trastuzumab, un anticorps anti-HER2, pourrait également s’expliquer par

l’inhibition de HIF-1α puisqu’une étude a montré que le récepteur HER2 stimule la synthèse de

HIF-1α (Laughner et al. 2001). De plus, des études ont montré que l’erlotinib et le gefitinib, des

inhibiteurs de l’EGFR, ainsi que le cetuximab, un anticorps bloquant l’EGFR, diminuent la

synthèse de HIF-1α et donc l’expression du VEGF (Luwor et al. 2005, Pore et al. 2006). Des études

ont également montré que le bortezomib, un inhibiteur du protéasome notamment utilisé pour le

traitement du myélome multiple, inhibe la voie PI3K/Akt/mTOR et donc la traduction de HIF-

1α, et favorise le recrutement de FIH pour inhiber l’activité transcriptionnelle de HIF-1 (Shin et al.

2008, Befani et al. 2012). Enfin, le temsirolimus et l’everolimus, des inhibiteurs de mTOR, sont

indiqués dans le traitement des adénocarcinomes rénaux avancés où ils inhibent la traduction de

HIF-1α (Majumder et al. 2004, Thomas et al. 2006, Hudes et al. 2007, Motzer et al. 2008).

5.3.2. Molécules faisant l’objet d’études cliniques ou précliniques récentes

L’activation des facteurs HIF constituant un mécanisme de résistance au bevacizumab, une étude

clinique de phase I a été mise au point afin d’étudier le bénéfice de la combinaison du

bevacizumab avec le bortezomib, un inhibiteur de l’activité transcriptionnelle de HIF-1 (Falchook

et al. 2014). Cette étude révèle que la combinaison de ces traitements est bien tolérée et qu’elle

71!

présente une efficacité clinique chez des patients présentant une tumeur localement avancée et

réfractaire aux traitements de première intention (Falchook et al. 2014).

Une étude préclinique récente a montré que l’acriflavine, une molécule capable d’inhiber la

dimérisation de HIF-α avec HIF-β, limite la progression tumorale dans un modèle murin de

cancer colorectal induit par l’inflammation (Shay et al. 2014). En effet, l’acriflavine diminue le

nombre de tumeurs, la taille et le grade tumoral, ainsi que l’infiltration de macrophages et la

vascularisation tumorale. Ainsi l’inhibition de HIF dans les cellules tumorales, immunitaires et

endothéliales permettrait de limiter la croissance tumorale (Shay et al. 2014).

Enfin, une étude préclinique effectuée dans un modèle murin de leucémie myéloïde aigüe

récidivante indique que l’administration d’échinomycine, un inhibiteur de HIF-1, permet de

guérir près de 50% des animaux. Dans ce modèle, l’échinomycine cible spécifiquement les cellules

souches leucémiques, responsables de la récidive, tout en épargnant les cellules souches

hématopoïétiques (Wang et al. 2014d).

Tableau 6. Mécanismes d’action des inhibiteurs de HIF.

Molécule Mécanisme(s) d’action Référence Inhibiteurs de l’expression de l’ARNm de HIF-α EZN-2968 Augmentation de la dégradation de l’ARNm de HIF-1α (Greenberger et al. 2008,

Jeong et al. 2014b) Aminoflavone Inhibition de la transcription de l’ARNm de HIF-1α (Terzuoli et al. 2010) Inhibiteurs de la traduction de HIF-α Topotécan Inhibiteur de la topoisomérase I

Inhibition de la traduction de HIF-1α (Rapisarda et al. 2002, Rapisarda et al. 2004a, Rapisarda et al. 2004b, Rapisarda et al. 2009, Kummar et al. 2011)

EZN-2208 Inhibiteur de la topoisomérase I Inhibition de la traduction de HIF-1α

(Pastorino et al. 2010, Sapra et al. 2011, Jeong et al. 2014a)

NSC-644221 Inhibiteur de la topoisomérase II Inhibition de la traduction de HIF-1α

(Creighton-Gutteridge et al. 2007)

Temsirolimus

Inhibition de mTOR Inhibition de la traduction de HIF-1α

(Wan et al. 2006, Hudes et al. 2007)

Everolimus Inhibition de mTOR Inhibition de la traduction de HIF-1α

(Motzer et al. 2008, Baselga et al. 2012)

Rapamycine Inhibition de mTOR Inhibition de la traduction de HIF-1α

(Majumder et al. 2004)

2-methoxyoestradiol Déstabilisation des microtubules Inhibition de la traduction de HIF-1α

(Mabjeesh et al. 2003)

Digoxine Glycoside cardiotonique Inhibition de la traduction de HIF-1α

(Zhang et al. 2008b, Lin et al. 2014a)

PX-478 Inhibition de la transcription et de la traduction de HIF-1α (Koh et al. 2008b, Zhao et al. 2015)

PX-12 Inhibition de la thiorédoxine 1 Inhibition de la traduction de HIF-1α

(Ramanathan et al. 2012)

72!

Molécule Mécanisme(s) d’action Référence Inhibiteurs de la traduction de HIF-α (suite) Pleurotine Inhibition de la thiorédoxine 1

Inhibition de la traduction de HIF-1α (Welsh et al. 2003)

Glycéolline I, II, III Inhibition de la voie PI3K/Akt/mTOR Inhibition de la traduction de HIF-1α

(Lee et al. 2015a)

Cetuximab Blocage de l’EGFR Inhibition de la traduction de HIF-1α

(Luwor et al. 2005)

Erlotinib, Gefitinib Inhibition de l’EGFR Inhibition de la traduction de HIF-1α

(Pore et al. 2006)

Bortezomib Inhibiteur du protéasome Inhibition de la voie PI3K/Akt/mTOR Inhibition de l’expression de HIF-1α

(Befani et al. 2012)

Inhibition de la stabilisation ou de l’accumulation de HIF-α PX-478 Inhibition de la déubiquitinylation de HIF-1α (Koh et al. 2008b, Zhao et al.

2015) Glycéolline I, II, III Inhibition de la HSP90

Inhibition de la stabilité de HIF-1α (Zhao et al. 2015)

YC-1 Inhibition de l’accumulation de HIF-1α (Chun et al. 2001, Sun et al. 2007, Carroll et al. 2013)

Galdanamycine Inhibition de la HSP90 Ubiquitinylation de HIF-1α

(Hur et al. 2002, Isaacs et al. 2002, Koga et al. 2009)

17-AAG (analogue de la galdanamycine)

Inhibition de la HSP90 Ubiquitinylation de HIF-1α

(Neckers and Neckers 2002, Neckers 2006)

LAQ824 Inhibition des HDAC Augmentation de la dégradation protéasomale de HIF-1α

(Qian et al. 2006)

Ascorbate, N-acétylcystéine

Antioxydants Stimulation de l’activité des PHD Augmentation de la dégradation protéasomale de HIF-1α

(Gao et al. 2007)

LY294002 Inhibition de la PI3K Ubiquitinylation de HIF-1α

(Choy et al. 2010)

Inhibition de la dimérisation de HIF-α Acriflavine Interaction avec le domaine PAS de HIF-α et inhibition

de la dimérisation avec HIF-β (Lee et al. 2009b, Wong et al. 2012, Shay et al. 2014)

Inhibition de la liaison de HIF à l’ADN de ces gènes cibles Doxorubicine, Daunorubicine

Anthracyclines, agents intercalants Inhibition de la liaison de HIF à l’ADN des gènes cibles

(Lee et al. 2009a)

Echinomycine Inhibition de la liaison de HIF à l’ADN des gènes cibles (Kong et al. 2005, Wang et al. 2014d)

Polyamides Inhibition de la liaison à l’ADN des gènes cibles (Olenyuk et al. 2004) Inhibition de l’activité transcriptionnelle de HIF YC-1 Inhibition du recrutement de p300 (Li et al. 2008) Galdanamycine Inhibition de l’activité transcriptionnelle de HIF-1 (Isaacs et al. 2002) (Hur et al.

2002, Mabjeesh et al. 2002, Koga et al. 2009)

Amphotéricine B Antifongique Augmentation du recrutement de FIH

(Yeo et al. 2006)

Bortezomib Inhibiteur du protéasome Augmentation du recrutement de FIH

(Shin et al. 2008, Falchook et al. 2014)

Chetomine Antibactérien Inhibition de l’interaction HIF/p300

(Kung et al. 2004)

EGFR : epidermal growth factor receptor ; FIH : factor inhibiting HIF ; HDAC : histone deacetylase ; HSP90 : heat shock protein 90 ; mTOR : mammalian target of rapamycin ; PAS : per-ARNT-sim ; PHD : prolyl hydroxylase ; PI3K : phosphatidylinositol 3 kinase.

73!

5.4. Discussion

Le ciblage des cellules hypoxiques et l’inhibition des facteurs HIF sont les deux principales

stratégies visant à détruire les cellules tumorales hypoxiques. Chacune de ces stratégies a ses

avantages et ses inconvénients. En effet, les prodrogues cytotoxiques sont très sélectives des

cellules hypoxiques in vitro mais le sont généralement moins chez la souris ou chez l’homme.

Ainsi, l’identification et la caractérisation des réductases endogènes humaines qui activent les

prodrogues permettront sans doute d’améliorer la sélectivité de ces prodrogues vis-à-vis des

cellules tumorales hypoxiques. A l’inverse, les inhibiteurs de HIF ont une activité cytotoxique

plus faible au niveau des cellules tumorales mais sont moins toxiques vis-à-vis des cellules saines.

Pour cette raison, ils sont plus facilement utilisés en association avec les thérapies

conventionnelles que les prodrogues cytotoxiques. Leur utilisation en monothérapie ne semble

cependant pas réalisable à ce jour puisque les cellules hypoxiques constituent une sous-

population minoritaire dans la tumeur, bien que leur importance dans la progression de la

maladie soit critique (Wilson and Hay 2011). En effet, une étude effectuée chez des patients

atteints d’un carcinome des voies aériennes et digestives supérieures indique que l’hypoxie

intratumorale compromet la survie des patients seulement lorsqu’elle est très sévère, puisque la

survie à 5 ans tend vers zéro chez les patients présentant les tumeurs les plus hypoxiques

(Nordsmark et al. 2005). Ainsi, il est nécessaire de développer et d’utiliser des biomarqueurs

prédictifs qui reflètent l‘hypoxie intratumorale ou l’activation des facteurs HIF, afin de

personnaliser au maximum les traitements anticancéreux et d’évaluer leur efficacité dans le

temps (Wilson and Hay 2011).

74!

Chapitre 3 :

La voie Sphingosine kinase / Sphingosine 1-

phosphate

1. Le métabolisme sphingolipidique

1.1. Bases structurales des sphingolipides

Les sphingolipides sont une classe de lipides complexes que l’on retrouve chez l’ensemble des

eucaryotes. Leurs premiers représentants ont été identifiés en 1884 par Thudichum qui choisit

alors le préfixe « sphingo » - en référence au Sphinx de la mythologie grecque – en raison des

propriétés énigmatiques de ces lipides. Les sphingolipides dérivent d’un squelette commun, la

sphinganine ou dihydrosphingosine, constituée d’une chaine de 18 atomes de carbone, porteuse

de deux fonctions alcool en positions C1 et C3, et d’une fonction amine en position C2 (Figure 13).

Figure 13. Structure de la sphinganine, squelette commun des sphingolipides.

1.2. Le métabolisme sphingolipidique

Les sphingolipides sont interconnectés afin de former un réseau métabolique que l’on nomme

métabolisme sphingolipidique (Figure 14). Ce réseau possède un unique point d’entrée et un

unique point de sortie. En effet, la synthèse de novo constitue l’entrée du métabolisme

sphingolipidique. Elle se déroule principalement au niveau de la membrane externe du réticulum

endoplasmique et consiste en la condensation du palmitate et de la sérine sous l’action de la

sérine palmitoyltransférase (SPT). Ceci aboutit à la formation de la 3-céto-dihydrosphingosine

75!

dont dérivent tous les autres sphingolipides. La 3-céto-dihydrosphingosine peut être réduite en

dihydrosphingosine puis N-acylée par une (dihydro) céramide synthase (CerS) afin de former le

dihydrocéramide. Chez les mammifères, il existe 6 CerS ayant des spécificités de substrats vis-à-

vis de la longueur de la chaine carbonnée de l’acide gras N-acylé. La désaturation du

dihydrocéramide aboutit à la formation de céramide (Figure 15), molécule centrale du

métabolisme sphingolipidique puisque pouvant générer plusieurs types de sphingolipides tels

que les sphingomyélines, les glycosphingolipides, le céramide 1-phosphate et la sphingosine

(Spiegel and Merrill 1996, Hannun and Obeid 2008, Gault et al. 2010).

Figure 14. Le métabolisme sphingolipidique. CDase : céramidase; CerS : céramide synthase ; CK : céramide kinase; DAG : diacylglycérol; GCase : glucosylcéramidase : GCS : glucosylcéramide synthase; PC : phosphatidylcholine; SK: sphingosine kinase; SMase : sphingomyélinase; SMS : sphingomyéline synthase; SPPase : sphingosine 1-phosphate phosphatase; SPT: sérine palmitoyltransferase. D’après Hannun and Obeid, 2008.

Les sphingomyélines, sphingolipides complexes les plus abondants, sont formées par les

sphingomyéline synthases qui transfèrent sur le céramide un groupement phosphocholine issu

de la phosphatidylcholine. Les sphingomyélines peuvent être reconverties en céramide par

différentes sphingomyélinases (SMases), caractérisées par leur localisation cellulaire et par le pH

qui leur confère une activité optimale. On distingue ainsi les SMases acides, neutres et alcalines

(Gault et al. 2010). Les glycosphingolipides peuvent être synthétisés à partir du céramide par

deux enzymes différentes : la glucosylcéramide synthase qui permet la formation de

glucosylcéramide et la galactosyltransférase qui permet la formation de galactosylcéramide. A

l’inverse, des β-glucosidases et des galactosidases hydrolysent ces lipides afin de régénérer le

céramide (Hannun and Obeid 2008). Le céramide 1-phosphate est issu de la phosphorylation du

76!

céramide par la céramide kinase. Il peut être déphosphorylé par une phosphatase pour régénérer

le céramide (Hannun and Obeid 2008). La sphingosine (Figure 15) est formée lorsque les

céramidases clivent l’acide gras N-acylé du céramide. La sphingosine peut alors être recyclée en

céramide sous l’action d’une CerS, ou bien être phosphorylée par l’une des deux sphingosine

kinases (SphK1 et SphK2) pour former la sphingosine 1-phosphate (S1P, Figure 15). Cette

dernière peut être déphosphorylée de manière réversible par les S1P-phosphatases pour

régénérer la sphingosine. Alternativement, la S1P-lyase (SPL) peut dégrader irréversiblement la

S1P en hexadécénal et phosphoéthanolamine. Longtemps considérées comme étant dépourvues

d’intérêt biologique, ces deux molécules sont aujourd’hui impliquées dans le développement de

certaines pathologies (Bektas et al. 2010, Nakahara et al. 2012). Il s’agit là de l’unique point de

sortie du métabolisme sphingolipidique (Hannun and Obeid 2008).

Figure 15. Structures du céramide, de la sphingosine et de la sphingosine 1-phosphate.

77!

1.3. Les sphingolipides : lipides bioactifs

Initialement connus exclusivement pour leur rôle structural au niveau des membranes cellulaires,

les sphingolipides constituent désormais une classe de lipides bioactifs, c’est-à-dire capables de

réguler des fonctions biologiques. Ainsi, le céramide, la sphingosine et la S1P sont considérés

depuis le début des années 1990 comme des régulateurs majeurs de processus biologiques

fondamentaux tels que la survie, la différentiation, la prolifération et la migration cellulaire, la

progression du cycle cellulaire, l’angiogenèse et la réponse immunitaire (Hannun and Obeid

2008).

1.4. Le biostat sphingolipidique

Parmi les sphingolipides, le céramide et la sphingosine ont des propriétés pro-apoptotiques, à

l’inverse de la S1P qui a des propriétés pro-prolifératives et qui favorise la survie cellulaire. Dans

la cellule, il existe ainsi un équilibre dynamique entre le céramide, la sphingosine et la S1P. Cet

équilibre a conduit au concept de biostat sphingolipidique selon lequel la balance entre le

céramide et la sphingosine d’une part, et la S1P d’autre part, est crucial pour déterminer le

devenir de la cellule, à savoir sa mort ou sa survie (Figure 16) (Cuvillier et al. 1996). Ce biostat est

principalement sous le contrôle des sphingosine kinases qui phosphorylent la sphingosine pour

former de la S1P, induisant ainsi une signalisation anti-apoptotique et pro-proliférative, et qui

constituent les régulateurs clés du métabolisme sphingolipidique.

Figure 16. Le biostat sphingolipidique. La balance entre la mort et la survie cellulaire est finement régulée dans la cellule, en particulier par les SphKs. SphKs : sphingosine kinases ; SPPase : sphingosine 1-phosphate phosphatase.

78!

2. La voie SphKs/S1P

Des variations au niveau des concentrations de céramide, sphingosine et S1P ayant des

conséquences fonctionnelles au niveau cellulaire, il a été montré que ces molécules sont

impliquées dans des processus physiologiques tels que la migration des cellules immunitaires

mais aussi dans des phénomènes pathologiques tels que les maladies cardiovasculaires,

métaboliques ou inflammatoires, comme le diabète et l’obésité, ainsi que dans les cancers

(Maceyka et al. 2012). Ainsi, la dérégulation du biostat sphingolipidique en faveur de la

production de S1P favorise la progression tumorale ainsi que la résistance aux traitements anti-

tumoraux. La compréhension de ce biostat, de sa régulation et des voies de signalisation induites

par la S1P sont donc essentielles afin d’élucider les mécanismes moléculaires mis en jeu dans de

nombreuses pathologies, en particulier dans les cancers, et dans le but d’améliorer l’arsenal

thérapeutique existant (Cuvillier et al. 2010, Maceyka et al. 2012, Giussani et al. 2014).

2.1. Les sphingosine kinases

Les sphingosine kinases (SphKs) sont des lipide-kinases qui, en présence d’ATP, catalysent la

phosphorylation de la sphingosine en S1P. Ces enzymes ubiquitaires sont très conservées au

cours de l’évolution puisque des séquences putatives ont été mises en évidence dans une

trentaine d’espèces réparties dans quatre règnes du vivant. On les retrouve ainsi chez les

microorganismes unicellulaires, les insectes et les végétaux. Chez les mammifères, l’activité

sphingosine kinase a été mise en évidence pour la première fois dans les années 1970 dans le foie

de rat, le cerveau de bœuf et les plaquettes humaines (Keenan and Maxam 1969, Stoffel et al. 1973,

Louie et al. 1976). Deux enzymes, aux origines géniques différentes, sont responsables de cette

activité, il s’agit de la SphK1 et la SphK2, nommées selon leur ordre de découverte et de

caractérisation. La SphK1 a été purifiée pour la première fois par le groupe de Sarah Spiegel à

partir d’un rein de rat puis chez la souris (Kohama et al. 1998, Olivera and Spiegel 1998). Ce même

groupe a découvert la forme humaine de la SphK1 par homologie de séquence avec celle de la

souris, puis a identifié les formes murine et humaine de la SphK2 (Liu et al. 2000a, Nava et al.

2000). La SphK1 et la SphK2 présentent des différences d’expression lors du développement

embryonnaire de la souris, la SphK2 étant exprimée plus tardivement, ainsi que des différences

de distribution tissulaire et de localisation intracellulaire. Ainsi, la SphK1 a une expression

presque ubiquitaire puisque son ARNm est retrouvé dans le poumon, la rate, le cœur, le thymus,

79!

le cerveau et le rein, alors que l’expression de la SphK2 est principalement restreinte au cœur, au

foie et aux reins (Liu et al. 2000a, Melendez et al. 2000). Ceci suggère que ces deux enzymes

peuvent avoir des fonctions physiologiques différentes.

2.1.1. Propriétés structurales

Il existe trois isoformes de la SphK1, nommés SphK1a, SphK1b et SphK1c, générés par épissage

alternatif. L’isoforme SphK1a, majoritaire chez l’homme, est constituée de 384 acides aminés

(environ 42,5 kDa). De même, il existe deux variants d’épissage de la SphK2, nommés SphK2a et

SphK2b. L’isoforme SphK2b, majoritaire chez l’homme, est constitué de 654 acides aminés

(environ 69,2 kDa). Les termes « SphK1 » et « SphK2 » désignent respectivement l’ensemble de

leurs isoformes (Billich et al. 2003, Taha et al. 2006) (Figure 17).

Figure 17. Variants d’épissage et domaines d’homologie des SphKs. La SphK1 et la SphK2 partagent 47% et 43% d’identité de séquence en acides aminés entre leurs régions N-terminale et C-terminale, respectivement. SK : sphingosine kinase. D’après Pitson, 2011.

Bien que différentes de part leur taille, la SphK1 et la SphK2 présentent un haut degré de

similarité au niveau de leurs séquences peptidiques (Figure 17). En effet, la séquence de la SphK1,

plus petite, s’aligne presque intégralement avec des régions de la séquence de la SphK2. Cette

dernière possède une partie N-terminale plus longue ainsi qu’une insertion polypeptidique riche

en proline dans sa région centrale (Pitson 2011).

Cinq domaines hautement conservés au cours de l’évolution, nommés C1 à C5, sont communs

aux SphKs (Kohama et al. 1998, Pitson 2011). Les domaines C1, C2 et C3 constituent leur domaine

catalytique, le site de liaison à l’ATP se situant sur le domaine C2. A ce niveau, la mutation du

résidu glycine 82 en acide aspartique créé un mutant catalytiquement inactif de la SphK1 (Pitson

et al. 2000b). Le domaine C4 contient le site de liaison à la sphingosine, dans lequel le résidu acide

80!

aspartique 178 chez l’homme et 177 chez la souris, est particulièrement impliqué (Yokota et al.

2004). Les domaines C1, C2, C3 et C5 présentent des homologies de séquences avec la céramide

kinase et les diacylglycérol kinases alors que le domaine C4 est plus spécifique des SphKs

(Sugiura et al. 2002, Taha et al. 2006).

La séquence de la SphK1 contient plusieurs autres sites d’intérêt, parmi lesquels :

- Deux séquences d’export nucléaire (NES) permettant la relocalisation de l’enzyme au

cytoplasme (Inagaki et al. 2003) ;

- Quatre motifs de liaison au calcium et à la calmoduline nécessaires à la translocation de

l’enzyme au niveau de la membrane plasmique (Kohama et al. 1998, Pitson et al. 2000a,

Sutherland et al. 2006);

- Plusieurs sites de modifications post-traductionnelles dont des sites de phosphorylation

par la protéine kinase C (PKC) et un site de phosphorylation par ERK1/2 (Extracellular

signal-Regulated Kinases 1/2) sur le résidu sérine 225, crucial pour l’activation de la SphK1

(Pitson et al. 2000a, Pitson et al. 2003);

- Un motif permettant l’interaction de la SphK1 avec TRAF2 (Tumor necrosis factor Receptor-

Associated Factor 2) (Xia et al. 2002).

De même, la séquence de la SphK2 contient d’autres sites d’intérêt, parmi lesquels :

- Une séquence de localisation nucléaire (NLS) et une séquence NES, (Igarashi et al. 2003b,

Neubauer and Pitson 2013) ;

- Une séquence de neuf acides aminés similaire à celles retrouvées dans la séquence des

protéines pro-apoptotiques « BH3-only » (Bcl2 Homology domain 3). Cette séquence

permettrait l’interaction de la SphK2 avec la protéine anti-apoptotique Bcl-xL (B-Cell

Lymphoma extra large) (Liu et al. 2003a) ;

- Plusieurs sites de modifications post-traductionnelles dont des sites de phosphorylation

par la PKC par ERK1/2 (Hait et al. 2007).

En 2013 a été décrite la structure tridimensionnelle de la SphK1. Cette structure a été obtenue par

cristallisation des résidus 9 à 364 de la SphK1a humaine avec une résolution d’environ 2

angströms. Elle procure de nouvelles informations quant à l’interaction entre la SphK1 et son

substrat, la sphingosine, ainsi que sur la réaction catalysée par cette enzyme et sur son interaction

avec des inhibiteurs spécifiques (Wang et al. 2013, Wang et al. 2014c).

La structure de la SphK1 se révèle être proche de celle de la diacyglycérol kinase. La SphK1

présente une poche hydrophobe, localisée en C-terminal, permettant la liaison avec la

81!

sphingosine. La conformation de cette poche assurerait la spécificité du substrat de l’enzyme. La

chaine carbonée de la sphingosine se placerait dans cette poche hydrophobe alors que les

groupements amine et alcools de sa tête polaire formeraient des liaisons hydrogène avec les

résidus acide aspartique 81, sérine 168 et acide aspartique 178 de la SphK1. Ceci confirme

l’implication du résidu 178, situé dans le domaine C4, dans l’interaction avec la sphingosine

(Yokota et al. 2004).

La co-cristallisation de la SphK1 avec l’ADP montre que le groupement polaire de la sphingosine

serait très proche du groupement phosphate de l’ADP et que le résidu acide aspartique 81

catalyserait le transfert d’un groupement phosphate de l’ATP vers la sphingosine. Ainsi, la

mutation du résidu acide aspartique 81 en alanine créé un mutant dénué d’activité de

phosphorylation (Wang et al. 2013).

2.1.2. Propriétés biochimiques !!

Les substrats pouvant être phosphorylés par la SphK1 sont la D-erythro-sphingosine, ou

sphingosine (Km=15,6µM), et la D-erythro-dihydrosphingosine, ou sphinganine (Km=20µM)

(Pitson et al. 2000a, Billich et al. 2003). La D,L-threo-dihydrosphingosine (DHS, Ki=5,9µM) et la

N,N-diméthylsphingosine (DMS, Ki=7,8µM) sont des inhibiteurs compétitifs de la SphK1 (Pitson

et al. 2000a).

L’activité enzymatique de la SphK1 est optimale à 37°C et pH 7,4. Elle requiert la présence d’ions

Mg2+ et peut être stimulée par l’ajout de Triton-X100. A l’inverse, l’activité de la SphK1 diminue

en présence d’ions Ca2+ et Mn2+ et est inhibée en présence d’ions Fe2+, Zn2+ et Cu2+ ainsi qu’en

présence de NaCl et KCl à des concentrations trop élevées (Liu et al. 2000a, Pitson et al. 2000a).

Les substrats de la SphK2 sont plus nombreux. En effet, la SphK2 peut phosphoryler la D-erythro-

sphingosine (Km=13,8µM), la D-erythro-dihydrosphingosine, la phytosphingosine, la DHS et le

FTY720 (Ki=18,2µM), un analogue de la sphingosine (Liu et al. 2000a, Billich et al. 2003). La DMS

(Ki=12µM) est un inhibiteur non compétitif de la SphK2. Contrairement à la SphK1, l’activité de la

SphK2 peut être stimulée par des concentrations élevées en NaCl et KCl mais sera inhibée en

présence de Triton-X100 et d’albumine sérique bovine (Liu et al. 2000a).

82!

2.1.3. Propriétés biologiques

Les souris knock-out (KO) pour la SphK1 ou pour la SphK2 sont viables et ne présentent pas

d’anomalie phénotypique, alors que les souris KO à la fois pour la SphK1 et pour la SphK2

meurent au stade embryonnaire (E13,5) en raison d’une maturation incomplète de leurs systèmes

cardiovasculaire et nerveux (Allende et al. 2004b, Mizugishi et al. 2005). En particulier, la délétion

spécifique de la SphK1 et de la SphK2 dans les érythrocytes est létale au stade embryonnaire

(E11,5-12,5) (Xiong et al. 2014). Ceci suggère que les SphKs possèdent des fonctions biologiques

partiellement redondantes. Cependant, bien qu’il soit clairement établi que la SphK1 soit une

enzyme pro-proliférative et anti-apoptotique, les rôles de la SphK2 sont plus ambigus. En effet,

des études ont montré que la SphK2 pouvait avoir un rôle pro-prolifératif ou pro-apoptotique

selon le modèle utilisé (Maceyka et al. 2005, Van Brocklyn et al. 2005). De même, la SphK1 et la

SphK2 ont des rôles opposés dans la régulation de la biosynthèse du céramide. En effet, la SphK1

diminuerait les taux de céramide en phosphorylant la sphingosine, alors que la SphK2

favoriserait la conversion de sphingosine en céramide (Maceyka et al. 2005). De tels effets pro-

apoptotiques peuvent s’expliquer par la présence d’un domaine « BH3-only » dans la séquence

peptidique de la SphK2 (Maceyka et al. 2005). De plus, la présence de motifs NES et/ou NLS dans

les séquences peptidiques des SphKs suggère que la production de S1P est compartimentalisée

dans la cellule, ce qui pourrait permettre de comprendre les différentes fonctions biologiques des

SphKs.

2.1.4. Régulation et localisation des SphKs

L’activité catalytique de la SphK1 peut être stimulée par de multiples messagers pro-prolifératifs,

tels que des facteurs de croissance, des cytokines ou des hormones (Taha et al. 2006) (Tableau 7).

Bien que la SphK1 soit principalement cytosolique, des études ont montré que son activation

s’accompagne de sa translocation à la membrane plasmique. Ainsi, la majorité des activateurs de

la SphK1 vont induire sa phosphorylation par ERK1/2 sur le résidu sérine 225, cette

phosphorylation étant nécessaire à la translocation de l’enzyme vers la membrane plasmique et à

l’augmentation considérable de son activité (Johnson et al. 2002, Pitson et al. 2003, Taha et al. 2006).

Cette translocation confère à la SphK1 ses propriétés pro-prolifératives et son rôle pro-tumoral

(Xia et al. 2000, Pitson et al. 2005), et est médiée par l’interaction de la SphK1 phosphorylée avec

une phosphatidylsérine, phospholipide présent au niveau de la membrane plasmique (Stahelin et

al. 2005, Taha et al. 2006). L’acide phosphatidique et la protéine CIB1 (Calcium and Integrin-Binding

protein 1) – qui se lie au site de liaison à la calmoduline de la SphK1 – sont également impliqués

83!

dans la relocalisation de la SphK1 à la membrane plasmique (Delon et al. 2004, Jarman et al. 2010).

La SphK1 peut aussi être relocalisée à l’enveloppe nucléaire où elle joue un rôle dans la

progression du cycle cellulaire, ou bien être excrétée dans le milieu extracellulaire en conditions

physiologiques ou de stress (Olivera et al. 1999, Kleuser et al. 2001, Ancellin et al. 2002, Waters et

al. 2003, Venkataraman et al. 2006, Tani et al. 2007).

La régulation de la SphK1 se fait également de part son interaction avec d’autres protéines. Par

exemple, l’interaction de la SphK1 avec TRAF2 ou eiF1A (eukaryotic Initiation Factor 1A) va

stimuler son activité, alors que son interaction avec la PP2A (Protein Phosphatase 2A) va l’inhiber

(Xia et al. 2002, Barr et al. 2008, Leclercq et al. 2008).

Enfin, des stimuli externes comme l’hypoxie peuvent également activer la SphK1. En effet, des

études ont montré que l’hypoxie augmente l’expression de l’ARNm de la SphK1 dans des

cellules musculaires lisses et dans des cellules endothéliales, et stimule son activité dans des

lignées cellulaires tumorales humaines (Ahmad et al. 2006, Ader et al. 2008, Anelli et al. 2008,

Schwalm et al. 2008).

Bien que les mécanismes impliqués dans la régulation de la SphK2 soient moins clairs, il a été

montré que des facteurs de croissance, des cytokines, ainsi que l’hypoxie sont capables de

stimuler la SphK2 (Hait et al. 2005, Schnitzer et al. 2009). A l’instar de la SphK1, il a été montré que

la phosphorylation de la SphK2 par ERK1/2 conduit à son activation (Hait et al. 2007).

La localisation intracellulaire de la SphK2 peut varier en fonction de la densité et du type

cellulaire. La SphK2 possédant des séquences NLS et NES, elle peut donc se trouver dans le

noyau comme dans le cytoplasme. Localisée dans le noyau, la SphK2 inhibe la synthèse d’ADN,

et localisée au niveau du réticulum endoplasmique ou à la mitochondrie, elle pourrait induire

l’apoptose (Maceyka et al. 2005, Taha et al. 2006, Chipuk et al. 2012). Ainsi, la localisation

intracellulaire des SphKs participe largement à la régulation de leurs fonctions biologiques.

Sachant que de nombreux stimuli conduisent à l’activation des SphKs et donc à l‘accumulation de

S1P, des études se sont attachées à élucider les rôles et les mécanismes d’action de la S1P. Il a ainsi

été montré que la S1P peut agir à la fois de façon extracellulaire et de façon intracellulaire (Spiegel

and Milstien 2003, Strub et al. 2010).

84!

Tableau 7. Principaux activateurs de la SphK1.

Activateur Mécanisme(s) d’action Effet(s) biologique(s) Référence(s) Facteurs de croissance EGF Translocation à la membrane

plasmique Augmentation de la mobilité cellulaire

(Meyer zu Heringdorf et al. 1999)

VEGF Non déterminé Augmentation de la synthèse d’ADN

(Olivera and Spiegel 1993, Shu et al. 2002)

PDGF Translocation à la membrane plasmique

Augmentation de la mobilité cellulaire

(Olivera and Spiegel 1993)

IGF Translocation à la membrane plasmique

Activation de ERK1/2 (El-Shewy et al. 2006, Gomez-Brouchet et al. 2007)

Ligands de RCPG S1P Non déterminé Mobilisation de Ca2+

(Meyer zu Heringdorf et al. 2001)

LPA Translocation à la membrane plasmique

Augmentation de la survie cellulaire

(Young et al. 1999)

Acétylcholine Non déterminé Mobilisation de Ca2+

(Meyer zu Heringdorf et al. 1998)

Cytokines TNF-α Interaction avec TRAF2 Activation de NF-κB (Xia et al. 1998, Xia et al.

2002) TNF-α , IL-1β Non déterminé Production de cytokines (Billich et al. 2005,

Mastrandrea et al. 2005) Hormones Oestradiol Translocation à la membrane

plasmique Prolifération cellulaire (Sukocheva et al. 2003)

Prolactine Non déterminé Expression de la SphK1 (Doll et al. 2007) Dihydrotestostérone Activation de la voie PI3K/Akt Prolifération cellulaire (Martin et al. 2010) Esters de phorbol phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)

Translocation à la membrane plasmique, phosphorylation

Sécrétion de S1P (Mazurek et al. 1994)

Autres Vitamine D3 Transcription de la SphK1 Augmentation de la

survie cellulaire (Kleuser et al. 1998)

LPS Translocation à la membrane plasmique

Activation de ERK1/2 et NF-κB

(Wu et al. 2004)

LDL oxydés Non déterminé Prolifération cellulaire (Auge et al. 1999) Stimuli environnementaux Hypoxie Production de ROS et activation

de la PLD ; Expression de l’ARNm de la SphK1

Stabilisation de HIF-1α, Activation de ERK1/2 et p38 MAPK

(Ahmad et al. 2006, Ader et al. 2008)

Hyperglycémie Activation de la PKC et de ERK1/2

Expression de molécules d’adhérence

(Wang et al. 2005a)

2.2. La S1P, facteur autocrine et paracrine, et ses S1P-récepteurs

En raison de l’activité de la SPL, la concentration de S1P dans les tissus est faible, de l’ordre du

nanomolaire (Schwab et al. 2005). On la retrouve en plus grande concentration, environ 100nM,

dans la lymphe où elle est produite par l’endothélium lymphatique (Pham et al. 2010). Enfin, la

85!

S1P est bien plus concentrée dans le sang, entre 200 et 900nM, où elle est essentiellement produite

par les érythrocytes et les plaquettes, dénuées d’activité SPL et SPPase, et par l’endothélium

vasculaire (English et al. 2000, Pappu et al. 2007, Venkataraman et al. 2008). La S1P plasmatique est

majoritairement liée aux lipoprotéines de haute densité et à l’albumine (Murata et al. 2000, Thuy

et al. 2014). Il existe ainsi un gradient de concentrations de S1P dans l’organisme.

Bien que la SphK1 puisse être sécrétée pour produire de la S1P dans le milieu extracellulaire

(Venkataraman et al. 2006), il a été montré que la S1P est principalement produite en

intracellulaire et qu’elle peut ensuite être exportée dans le milieu extracellulaire par différents

transporteurs lipidiques. Plusieurs membres de la famille des transporteurs ABC (ATP Binding

Cassette), notamment ABCA1, ABCC1, ABCG2, ont été impliqués dans ce processus (Mitra et al.

2006, Sato et al. 2007, Takabe et al. 2010). Plus tard, le transporteur Spns2 (Spinster homolog 2) a été

impliqué dans le transport de la S1P, mais aussi du FTY720 sous sa forme phosphorylée, chez le

poisson zèbre puis chez l’homme (Kawahara et al. 2009, Hisano et al. 2011).

La S1P extracellulaire peut se lier, de manière autocrine ou paracrine, à l’un de ses cinq S1P-

récepteurs (S1PRs). Il s’agit de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) appartenant à la

famille des récepteurs EDG (Endothelial Differentiation Gene), nommés S1P1 (EDG-1), S1P2 (EDG-5),

S1P3 (EDG-3), S1P4 (EDG-6), S1P5 (EDG-8). Les RCPG sont des récepteurs à sept domaines

transmembranaires couplés à une ou plusieurs protéine(s) G hétérotrimérique(s) constituée(s) de

deux sous-unités constantes (Gβ et Gγ) et d’une sous-unité variable (Gα), dont il existe plusieurs

classes parmi lesquelles Gαi, Gαs, Gαq et Gα12/13. La liaison d’un ligand sur le RCPG induit le

transfert d’un groupement GTP sur la sous-unité Gα provoquant la dissociation de

l’hétérotrimère. La Gα-GTP et le dimère Gβ-Gγ peuvent ensuite activer différentes voies de

signalisation. La S1P peut donc agir en se liant à l’un de ses cinq RCPG, dont l’expression

tissulaire et le couplage à différentes protéines G influence l’effet biologique de la S1P. En effet,

selon leur couplage, ces cinq RCPG peuvent agir en synergie ou bien de façon contraire (Chun et

al. 2010, Rosen et al. 2013) (Figure 18).

2.2.1. Le S1P1

Initialement identifié comme le récepteur orphelin EDG-1 dans des cellules endothéliales

humaines (Hla and Maciag 1990), le S1P1 est exprimé de manière ubiquitaire dans l’organisme,

avec un gradient d’expression croissant entre le rein, le système cardiovasculaire, la rate, les

poumons et le cerveau (Brinkmann 2007).

86!

La découverte récente de la structure tridimensionelle du S1P1 permet de visualiser la liaison de

ce récepteur avec son ligand. Bien que la structure du S1P1 présente de nombreux points

communs avec celles d’autres RCPG, la fixation du ligand au niveau de la poche de liaison du

S1P1 est particulière. En effet, l’accès à cette poche étant très limité depuis le milieu

extracellulaire, le ligand s’y fixerait en entrant latéralement dans le domaine transmembranaire

du S1P1 par diffusion depuis la bicouche lipidique de la membrane plasmique (Hanson et al.

2012). Ceci expliquerait pourquoi la S1P, même en excès, sature lentement le S1P1 (Kd=8nM).

Ce récepteur est uniquement couplé à Gαi, ses effets biologiques sont ainsi tous sensibles à la

toxine pertussique (Windh et al. 1999). L’activation du S1P1 peut induire une diminution de la

concentration intracellulaire d’AMPc (Adénosine MonoPhosphate Cyclique), la stimulation des

MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases), l’activation de la voie de la PLC (Phospholipase C), la

stimulation de la voie PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinase)/Akt et ainsi l’activation de eNOS

(endothelial Nitric Oxyde Synthase) ou de Rac (Lee et al. 1996, Okamoto et al. 1998, Zondag et al.

1998, Morales-Ruiz et al. 2001).

Le KO murin du gène codant pour le S1P1 est létal au stade embryonnaire (E12,5-14,5), en raison

d’une maturation incomplète du système cardiovasculaire due au recrutement insuffisant des

cellules musculaires lisses au niveau de la paroi des vaisseaux néo-synthétisés (Allende et al.

2003). Le S1P1 joue ainsi un rôle dans le maintien de l’intégrité vasculaire. Il a également été

impliqué dans la formation de jonctions adhérentes entre les cellules endothéliales (Lee et al.

1999a, Lee et al. 1999b). Ainsi, son inhibition in vivo entraine une augmentation de la perméabilité

vasculaire (Sanna et al. 2006). Le S1P1 est aussi impliqué dans la mise en place du système

nerveux (Mizugishi et al. 2005) et joue un rôle primordial dans la circulation des cellules

immunitaires. En effet, son inhibition provoque une séquestration des lymphocytes T au niveau

du thymus et des lymphocytes B dans les organes lymphoïdes, induisant ainsi une lymphopénie

(Allende et al. 2004a, Matloubian et al. 2004).

2.2.2. Le S1P2

Le S1P2, ou EDG-5, a une expression ubiquitaire et peut lier la S1P (Kd=16-27nM) comme la

dihydroS1P (MacLennan et al. 1994). Il peut être couplé aux protéines Gαi, Gαq et Gα12/13 et ainsi

activer la voie des MAPK, la voie PI3K/Akt, la PLC et la voie Rho/ROCK (Rho-associated protein

kinase) (Gonda et al. 1999, Okamoto et al. 2000, Lepley et al. 2005). L’activation du S1P2,

contrairement à celle du S1P1, conduit généralement à la diminution de la prolifération et de la

migration cellulaire.

87!

Les souris KO pour le gène codant pour le S1P2 sont viables, mais présentent une prédisposition

aux attaques cérébrales, le S1P2 étant impliqué dans l’excitabilité neuronale (MacLennan et al.

2001). De plus, le S1P2 a été impliqué dans le bon fonctionnement des systèmes auditif et

vestibulaire, et dans la capacité de régénération du foie (Kono et al. 2007, Serriere-Lanneau et al.

2007, Ikeda et al. 2009). Enfin, des études ont montré que le S1P2 favorise la perméabilité et

l’inflammation de l’endothélium vasculaire (Skoura et al. 2007, Zhang et al. 2013a).

2.2.3. Le S1P3

Le S1P3, ou EDG-3, est largement exprimé dans l’organisme et son affinité pour la S1P est proche

de celle du S1P2 (Kd=23-26nM) (Yamaguchi et al. 1996). Comme ce dernier, il est couplé aux

protéines Gαi, Gαq et Gα12/13 (Ancellin and Hla 1999, Windh et al. 1999) et peut donc activer les

voies MAPK, PI3K/Akt, la PLC ainsi que Rho de façon à réguler positivement la prolifération et

la migration cellulaire (An et al. 2000, Okamoto et al. 2000).

Les souris KO pour le gène codant pour le S1P3 sont viables et ne présentent pas d’anomalie

phénotypique, sa perte étant sans doute compensée par les autres S1PRs. Cependant, la triple

déplétion des S1P1, S1P2 et S1P3 induit des défauts vasculaires précoces, indiquant une action

combinée de ces trois récepteurs dans la régulation de l’angiogenèse embryonnaire (Kono et al.

2004). De plus, des études ont montré l’implication du S1P3 dans la régulation du rythme

cardiaque, la vasodilatation et la perméabilité vasculaire (Levkau et al. 2004, Nofer et al. 2004,

Sanna et al. 2004). Le S1P3 joue également un rôle dans la migration des lymphocytes B et des

cellules dendritiques (Spiegel and Milstien 2011).

2.2.4. Le S1P4

Le S1P4, ou EDG-6, est exprimé de manière plus restreinte puisqu’on le trouve dans les systèmes

immunitaire, lymphatique et hématopoïétique (Graler et al. 1998). Ce récepteur est couplé aux

protéines Gαi et Gα12/13 et sa liaison avec la S1P (Kd=12-63nM) peut entrainer l’activation de la

PLC, des MAPK et de Rho (Van Brocklyn et al. 2000, Yamazaki et al. 2000). Une étude indique que

l’activation du S1P4 aurait un effet immunosuppresseur puisqu’elle inhiberait la prolifération des

lymphocytes T et leur sécrétion de cytokines effectrices (Wang et al. 2005b). A l’inverse, sa

déplétion altérerait la fonction des cellules dendritiques et réduirait la différenciation des

lymphocytes Th17 pro-inflammatoires (Schulze et al. 2011, Dillmann et al. 2015). Enfin, une étude

récente a montré que la S1P produite par la SphK2 peut se lier au S1P4 afin de prévenir la

88!

translocation nucléaire du S1P2 ce qui favorise ainsi la prolifération cellulaire dans un modèle de

cancer du sein (Ohotski et al. 2014).

2.2.5. Le S1P5

Le S1P5, ou EDG-8, a une expression restreinte au cerveau, à la rate, aux poumons, au placenta et

aux leucocytes du sang périphérique (Glickman et al. 1999, Im et al. 2001). Ce récepteur est couplé

aux protéines Gαi et Gα12/13 et sa liaison avec la S1P (Kd=2nM) peut entrainer l’activation de la

PLC, de la voie PI3K/Akt et de celle des Rho, ainsi que l’inhibition de l’adénylate cyclase, (Im et

al. 2001, Malek et al. 2001, Jaillard et al. 2005, Novgorodov et al. 2007). Les fonctions du S1P5 ont

été principalement étudiées au niveau du système nerveux central, où il favorise la survie des

oligodendrocytes matures et contribue à la formation et à la quiescence de la barrière hémato-

encéphalique (Jaillard et al. 2005). Au niveau du système immunitaire, il joue un rôle dans la

migration des cellules NK (Natural Killer) (Walzer et al. 2007, van Doorn et al. 2012).

Figure 18. Couplage et voies de signalisation induites par les S1PRs. AC : adenylate cyclase ; AMPc : adénosine monophosphate cyclique; DAG : diacyglycerol ; ERK1/2 : extracellular-signal regulated kinases 1/2; IP3 : inositol triphosphate ; NOS : nitric oxide synthase ; PI3K : phosphatidylinositol-3 kinase ; PKC : protein kinase C ; PLC : phospholipase C ; PTEN : phosphatase and tensin homolog ; ROCK : Rho-associated protein kinase

2.3. La S1P et ses cibles intracellulaires

Des études ont suggéré qu’en parallèle de son action extracellulaire sur les S1PRs, la S1P pouvait

agir sur des cibles intracellulaires. En effet, les végétaux, ainsi que des microorganismes comme

S. cerevisiae, répondent à la S1P alors qu’ils n’expriment pas les S1PRs (Birchwood et al. 2001, Ng

et al. 2001). De même, dans des cellules humaines, la S1P peut induire une mobilisation calcique

89!

indépendamment des S1PRs (Meyer zu Heringdorf et al. 2003). Ainsi, depuis plusieurs années,

différents travaux ont permis d’identifier des cibles intracellulaires de la S1P.

2.3.1. La S1P, inhibiteur des HDAC1/2

La SphK2 pouvant être localisée dans le noyau, une étude a montré que cette enzyme est capable

de s’associer avec les histone-deacétylases 1 et 2 (HDAC1/2), en particulier au niveau des

promoteurs des gènes codant pour p21 et c-fos. A ce niveau, la S1P produite se lie aux HDAC1/2

et inhibe leur activité enzymatique, ce qui empêche la liaison de l’histone H3 à l’ADN des gènes

de p21 et c-fos dont la transcription sera ainsi activée (Hait et al. 2009). La protéine c-fos étant un

régulateur transcriptionnel, et p21 un médiateur de la sénescence et de l’arrêt de la croissance

cellulaire, la SphK2 et la S1P jouent un rôle anti-prolifératif de part l’inhibition des HDAC1/2.

2.3.2. La S1P, cofacteur de TRAF2

La protéine TRAF2 est une ubiquitine ligase nécessaire à la polyubiquitinylation de RIP1

(Receptor-Interacting Protein 1) qui permet l’activation du facteur de transcription NF-κB (Nuclear

Factor-κB) en réponse au TNF-α (Tumor Necrosis Factor α). Alors que l’interaction de la SphK1

avec TRAF2 avait déjà été mise en évidence (cf. 2.2.1 et 2.1.4), une étude datant de 2010 a montré

que la S1P est un cofacteur de TRAF2 et qu’elle est indispensable à l’ubiquitinylation de RIP1

(Alvarez et al. 2010).

2.3.3. La S1P et la prohibitine 2

La Prohibitine 2 (PHB2) est une protéine hautement conservée qui régule l’assemblage et la

fonction de la mitochondrie. Une étude a montré que la S1P, produite au niveau de la

mitochondrie par la SphK2, se lie spécifiquement à la PHB2 et joue un rôle important dans la

régulation de la fonction mitochondriale. Ainsi, chez des souris SphK2-/-, la respiration

mitochondriale est réduite en raison d’un mauvais assemblage et d’une dysfonction du complexe

IV de la chaine respiratoire (Strub et al. 2011).

90!

2.3.4. La S1P et la BACE1

Le peptide β-amyloïde (Aβ) est le principal composant des plaques séniles impliquées dans le

développement de la maladie d’Alzheimer. L’enzyme BACE1 (β-site Amyloid precursor protein

(APP) Cleaving Enzyme 1), ou β-sécrétase, permet la formation du peptide Aβ par clivage de la

protéine APP. Une étude a montré que l’inhibition des SphKs, comme la surexpression de la SPL

ou de la S1P phosphatase, diminue l’activité de BACE1 et donc la production de peptide Aβ.

Ainsi, la S1P se lierait spécifiquement à BACE1 pour augmenter son activité protéolytique. De

plus, la diminution de l’expression de la SphK1, et l’augmentation de l’expression de la SPL et de

l’activité de la SphK2 chez des patients souffrant de la maladie d’Alzheimer suggèrent un lien

entre la production de S1P par la SphK2 et la progression de cette pathologie (Takasugi et al. 2011,

Ceccom et al. 2014).

3. Physiopathologie de la voie SphK1/S1P

La voie SphK1/S1P régule des processus biologiques fondamentaux tels que la prolifération, la

survie et la migration cellulaire ainsi que l’angiogenèse. Elle a donc été impliquée dans des

pathologies des systèmes immunitaire, cardiovasculaire ou encore métabolique, mais aussi dans

les cancers (Figure 19). Dans ce contexte, de nombreuses études se sont intéressées à caractériser

le rôle de la voie SphK1/S1P dans ces pathologies, afin de mieux les comprendre et de mieux les

prendre en charge.

3.1. La voie SphK1/S1P dans le système immunitaire

La voie SphK1/S1P a été largement impliquée dans les processus d’inflammation et d’immunité

ainsi que dans les pathologies qui y sont associées. Au cours de l’inflammation, les cellules de

l’immunité innée et adaptative migrent jusqu’au site d’inflammation afin de la neutraliser. La

réponse immunitaire est ensuite inhibée de façon à éviter les dommages tissulaires collatéraux

dus à une réponse immunitaire exacerbée. De nombreuses études ont montré que la voie

SphK1/S1P/S1PRs joue un rôle crucial dans la régulation de la circulation et de la fonction des

cellules immunitaires. En effet, l’axe S1P/S1PRs régule la migration de la majorité des cellules

immunitaires, c’est le cas des lymphocytes B et T, des progéniteurs hématopoïétiques, des

macrophages, des cellules dendritiques, des neutrophiles, des mastocytes ou des cellules NK

91!

(Spiegel and Milstien 2011, Maceyka and Spiegel 2014).

Le rôle de l’axe S1P/S1PRs a été particulièrement décrit dans la régulation de la circulation des

lymphocytes T et B. En effet, des études ont montré que des lymphocytes B et T qui n’expriment

pas le S1P1 perdent leur capacité de migration (Allende et al. 2004a, Matloubian et al. 2004,

Allende et al. 2010). Ainsi, la circulation des lymphocytes implique deux acteurs : le S1P1 et le

gradient de concentration de S1P qui existe entre le sang et les organes lymphoïdes. Dans le

thymus, l’expression de CD69 par les lymphocytes T immatures les empêche d’exprimer le S1P1,

ce qui favorise leur sélection et leur maturation dans cet organe. Après sélection, les lymphocytes

T immatures réexpriment le S1P1 à leur surface, ce qui les rend sensibles au gradient de S1P. Ils

vont donc quitter le thymus pour rejoindre la circulation sanguine où la concentration en S1P est

plus élevée. A ce niveau, le S1P1 est internalisé en réponse aux fortes concentrations de S1P, et

sera réexprimé lorsque les lymphocytes T entrent dans les ganglions lymphatiques non-

inflammatoires. Cependant, en condition d’inflammation, les lymphocytes T seront activés et

vont exprimer CD69 ce qui va entrainer l’internalisation et la dégradation du S1P1. Les

lymphocytes T activés vont donc rester dans les ganglions lymphatiques où la réponse

immunitaire sera intensifiée : après quelques divisions, les lymphocytes T activés deviendront

des lymphocytes T effecteurs qui expriment le S1P1, ce qui leur permettra de rejoindre

rapidement la circulation sanguine pour migrer jusqu’au site d’inflammation (Matloubian et al.

2004, Bankovich et al. 2010, Spiegel and Milstien 2011). De la même manière, le passage des

lymphocytes B immatures de la moelle osseuse vers la circulation sanguine dépend de

l’expression du S1P1 (Allende et al. 2010). Enfin, des études ont impliqué l’axe S1P/S1P1 dans la

migration des cellules dendritiques, l’axe S1P/S1P4 dans la migration des neutrophiles, et l’axe

S1P/S1P5 dans la migration des cellules NK (Jenne et al. 2009, Rathinasamy et al. 2010, Allende et

al. 2011, Spiegel and Milstien 2011).

92!

Figure 19. Implication de la voie SphK1/S1P en physiopathologie. La voie SphK1/S1P est impliquée dans de nombreuses conditions physiopathologiques qui affectent la quasi-totalité des organes du corps humain. La voie SphK1/S1P joue un rôle dans de nombreux cancers qui ne sont pas représentés ici. Adapté de Maceyka 2012.

3.1.1. La sclérose en plaque et le développement du FTY720

La migration des cellules immunitaires est un phénomène qui est aussi impliqué dans la

progression des maladies auto-immunes, telle que la sclérose en plaques. Le FTY720 est un

analogue de la sphingosine capable de séquestrer les lymphocytes T auto-réactifs dans les

ganglions lymphatiques. En raison de son efficacité clinique et de sa bonne tolérance, cette

molécule a été approuvée dans le traitement de la sclérose en plaques.

La sclérose en plaque (SEP) est une maladie auto-immune chronique du système nerveux central

(SNC) caractérisée par la démyélinisation et la perte de neurones ainsi que par la perte

d’oligodendrocytes. Chez le sujet sain, les cellules dendritiques immatures sont impliquées dans

le maintien de la tolérance périphérique, en favorisant la réponse des lymphocytes T régulateurs.

Or, chez les patients atteints de SEP, des cellules dendritiques anormalement activées entrainent

93!

une perte partielle de la tolérance immunitaire. Ceci favorise l’expansion clonale de lymphocytes

T auto-réactifs dans les ganglions lymphatiques. Ces lymphocytes circulent jusque dans le sang,

puis passent la barrière hémato-encéphalique pour envahir le SNC, où ils sont réactivés,

s’expandent et se différencient pour réagir contre des antigènes du soi présentés par les cellules

dendritiques. La présence de lymphocytes T auto-réactifs dans le SNC, ainsi que l’activation

anormale des astrocytes et de la microglie, entraine la production de cytokines inflammatoires, de

ROS et d’anticorps dirigés contre le soi. Ces processus sont impliqués dans la démyélinisation

neuronale et provoquent les dommages au niveau des nerfs et de la barrière hémato-

encéphalique que l’on retrouve chez les patients atteints de SEP (Brinkmann et al. 2010).

Découvert dans les années 1990, le FTY720, ou fingolimod, est un dérivé d’un métabolique

fongique, la myriocine (Brinkmann et al. 2010). Le FTY720 a initialement été utilisé pour ses

propriétés immunosuppressives afin de prévenir les rejets de greffe (Suzuki et al. 1996). Par la

suite, des études ont montré que ce composé exerce son effet immunosuppresseur en inhibant la

migration des lymphocytes T du thymus vers la périphérie, et que cette altération du trafic

lymphocytaire est dû à la liaison de la forme phosphorylée du FTY720 sur le S1P1 (Yagi et al. 2000,

Brinkmann et al. 2002, Mandala et al. 2002, Matloubian et al. 2004). En effet, le FTY720 est une pro-

drogue analogue de la sphingosine (Figure 20) dont la phosphorylation, qui a lieu

préférentiellement par la SphK2, aboutit à la formation du (S)-FTY720-P (Albert et al. 2005). Le

(S)-FTY720-P fonctionne comme un agoniste des récepteurs S1P1, S1P4, S1P5 (EC50=0,3 à 0,6nM) et

S1P3, (EC50=3nM) et n’a pas d’activité sur le S1P2 (Brinkmann et al. 2002, Mandala et al. 2002). Son

mécanisme d’action a été principalement décrit sur le S1P1 où il agit comme un antagoniste

fonctionnel. Ainsi, tel un agoniste, le (S)-FTY720-P se lie au S1P1 pour induire son internalisation.

Cependant, une fois internalisé, le S1P1 sera ubiquitinylé et dégradé par le protéasome ce qui

conduit à une diminution de son expression à la surface de la cellule (Graler and Goetzl 2004, Oo

et al. 2007, Mullershausen et al. 2009, Pitman et al. 2012). C’est ainsi que les lymphocytes T

deviennent insensibles au gradient de S1P et restent séquestrés dans les ganglions lymphatiques

(Figure 20).

94!

Figure 20. Structure et mécanisme d’action du FTY720 au niveau des organes lymphoïdes. A) Structure du FTY720. La SphK2 est capable de phosphoryler le FTY720 sur un groupement alcool afin de former le (S)-FTY720-P. La queue lipophile du FTY720 est nécessaire à l’interaction de sa forme phosphorylée avec la poche de liaison hydrophobe des S1PRs. Le groupement phényl participe également à l’activité du FTY720. B) Le (S)-FTY720-P inhibe la sortie des lymphocytes T des organes lymphoïdes en entrainant l’internalisation puis la dégradation du S1P1. Adapté de Adachi et Chiba 2007.

L’utilisation en clinique du FTY720 est donc liée à sa capacité de rétention des lymphocytes T

centraux mémoire (TCM) dans les ganglions lymphatiques, empêchant ainsi leur migration

jusqu’au SNC, leur expansion clonale et leur différenciation en cellules effectrices. L’efficacité du

FTY720 chez les patients atteints de SEP ne corrèle pas avec leur degré de lymphopénie. En effet,

le FTY720 a également des effets neuroprotecteurs directs dans le SNC où la diminution de

l’expression du S1P1, en particulier au niveau des astrocytes, réduit leur hyperactivation

(Brinkmann et al. 2010, Choi et al. 2011, Spiegel and Milstien 2011). De plus, le FTY720 cible les

lymphocytes TCM mais épargne les lymphocytes T effecteurs périphériques qui protègent

95!

l’organisme contre les infections (Mehling et al. 2008). Des essais cliniques de phase III ont mis en

évidence une réduction significative du taux annuel de récurrence chez les patients atteints de

SEP récurrente-rémittente, en comparaison avec l’interferon-β1a et un placebo. Le fingolimod

(Gilenya®) a donc été approuvé par les agences américaine FDA et européenne EMA pour le

traitement de la SEP récurrente-rémittente. Ses effets secondaires sur le système cardivasculaire,

notamment la bradycardie, font l’objet de surveillance.

3.1.2. La polyarthrite rhumatoïde

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune caractérisée par une inflammation des

articulations. Des taux élevés de S1P ont été retrouvés dans le liquide synovial de patients

souffrant de cette pathologie (Kitano et al. 2006). Des études chez la souris ont montré que le

FTY720 inhibe la progression de la polyarthrite rhumatoïde, tout comme l’inhibition de la SPL

qui perturbe le gradient de S1P, empêchant ainsi la migration des lymphocytes et induisant une

lymphopénie (Schwab et al. 2005, Bagdanoff et al. 2010, Tsunemi et al. 2010). Ainsi, un inhibiteur

de la SPL, le LX2931, est actuellement en phase II d’étude clinique.

3.1.3. L’asthme L’asthme, dont la prévalence est en augmentation constante, est une maladie chronique

inflammatoire des voies aériennes inférieures caractérisée par une inflammation de l’épithélium

bronchique, une bronchoconstriction et une hyperactivité bronchique induisant une

augmentation de la sécrétion de mucus. Des taux élevés de S1P sont retrouvés dans les poumons

de patients atteints d’asthme allergique. Dans des modèles murins d’asthme allergique, la S1P

favoriserait la bronchoconstriction ainsi que l’hyperactivité bronchique et régulerait l’activation

des mastocytes. Une telle inflammation pourrait être atténuée par l’inhalation d’inhibiteurs de

SphKs (Nishiuma et al. 2008, Price et al. 2013, Maceyka and Spiegel 2014).

3.1.4. Les maladies inflammatoires de l’intestin

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) sont des maladies auto-immunes caractérisées par

une inflammation chronique du tractus gastro-intestinal. Les principales MII sont la maladie de

Crohn et la colite ulcéreuse. L’expression de la SphK1, tout comme la production de S1P, serait

augmentée chez les patients atteints de colite ulcéreuse. Dans le même sens, des études in vivo ont

96!

montré que l’inhibition de la SphK1 diminuerait la production de cytokines pro-inflammatoires et

donc la sévérité de la colite, et que le ciblage du S1P1 à l’aide du FTY720 serait efficace dans le

traitement de la colite (Daniel et al. 2007, Snider et al. 2009, Maceyka and Spiegel 2014).

Plusieurs études in vivo ont montré que la voie SphK1/S1P constitue un lien entre l’inflammation

chronique de l’intestin et le développement d’un cancer du côlon induit par l’inflammation, cette

voie étant impliquée à la fois dans le développement du cancer et dans sa progression. En

particulier, une étude a montré que dans un contexte de colite et de cancer associé,

l’augmentation de l’expression de la SphK1 et de la production de S1P entraine une

augmentation de la production d’IL-6 pro-inflammatoire dépendante de NF-κB ainsi qu’une

activation de STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) qui aboutit à l’augmentation

de l’expression du S1P1. Cette même étude a montré que le FTY720 inhibe l’axe SphK1/S1P/S1P1

et supprime la boucle d’amplification induite par l’axe NF-κB/IL-6/STAT3 ainsi que le

développement du cancer. L’utilisation du FTY720 pourrait donc être bénéfique dans le

traitement des cancers liés à l’inflammation (Liang et al. 2013, Maceyka and Spiegel 2014).

3.2. La voie SphK1/S1P dans le système cardiovasculaire et le métabolisme

Les concentrations plasmatiques de S1P sont très élevées, elles varient entre 200 et 900nM. Dans

la circulation sanguine, la S1P peut être liée à l’albumine, qui favorise sa libération des

érythrocytes ainsi que sa solubilité, mais surtout aux lipoprotéines de haute densité (HDL) riches

en apolipoprotéine M (Thuy et al. 2014). Cette forte biodisponibilité confère à la S1P plasmatique

des rôles physiologiques importants au niveau du système cardiovasculaire.

3.2.1. La vasculogenèse et l’angiogenèse

La S1P induit la survie et la migration des cellules endothéliales et régule la contraction et la

relaxation des cellules musculaires lisses au sein des vaisseaux sanguins (Nofer et al. 2004,

Szczepaniak et al. 2010). Il s’agit d’un facteur pro-angiogénique qui stimule la vasculogenèse, en

entrainant la formation par les cellules endothéliales de tubes en Matrigel, ainsi que l’angiogenèse

in vivo (Lee et al. 1999b, Limaye et al. 2005). La S1P peut également interagir avec un autre facteur

pro-angiogénique, le VEGF, afin de stimuler l’angiogenèse. En effet, à l’image du VEGF, la S1P

est capable de transactiver le VEGFR-2, alors que le VEGF peut stimuler l’expression du S1P1

(Tanimoto et al. 2002, Igarashi et al. 2003a).

97!

3.2.2. L’intégrité vasculaire

La S1P joue un rôle important dans le maintien de l’intégrité vasculaire. En effet, l’axe S1P/S1P1 a

été impliqué dans la formation de jonctions adhérentes entre les cellules endothéliales et dans la

diminution de la perméabilité vasculaire, notamment via l’activation de la N-cadhérine et le

recrutement péricytaire autour des cellules endothéliales (Lee et al. 1999a, Liu et al. 2000b,

Rosenfeldt et al. 2001, Paik et al. 2004, Camerer et al. 2009, Wilkerson and Argraves 2014). A

l’inverse, l’activation du S1P2 dans les cellules endothéliales favorise la perméabilité vasculaire

(Sanchez et al. 2007). La balance d’expression entre le S1P1 et le S1P2 au niveau de l’endothélium

déterminerait donc l’effet de la S1P sur la perméabilité vasculaire.

3.2.3. L’infarctus du myocarde

L’infarctus du myocarde correspond à la mort de cardiomyocytes suite à un défaut

d’oxygénation, ou ischémie. Une étude a montré que dans un modèle murin d’ischémie-

reperfusion, la S1P limite l’ampleur de l’infarctus en inhibant l’apoptose des cardiomyocytes. Cet

effet cardioprotecteur impliquerait le S1P3 et le monoxyde d’azote (NO) aux propriétés

vasodilatatrices (Theilmeier et al. 2006). La S1P pourrait également participer à la régénération

tissulaire en recrutant des cellules souches hématopoïétiques au niveau de la zone ischémiée

(Waeber and Walther 2014). Enfin, une étude ex vivo a montré que le FTY720 améliore la

récupération du myocarde après ischémie-reperfusion (Hofmann et al. 2009, Waeber and Walther

2014).

3.2.4. L’athérosclérose

L’athérosclérose est une inflammation chronique caractérisée par une accumulation de lipides et

de cellules immunitaires sous forme de plaques au niveau de l’endothélium vasculaire, ce qui a

pour conséquence la réduction de la lumière artérielle. De plus, la rupture de la plaque

d’athérome constitue un risque de thrombose. Bien que le rôle pro- ou anti-athérogénique de la

S1P ne soit pas clairement élucidé, il a été montré que la S1P régule la migration des monocytes,

la prolifération des cellules musculaires lisses, le tonus vasculaire et la stimulation de la voie NF-

κB impliquée dans la production de cytokines pro-inflammatoires (Daum et al. 2009, Maceyka et

al. 2012). Ainsi, l’activation du S1P3 stimulerait NF-κB, recruterait les monocytes et les

macrophages afin de favoriser l’inflammation et altérerait la fonction des cellules musculaires

98!

lisses (Keul et al. 2011, Maceyka et al. 2012). A l’inverse, la S1P aurait des effets anti-

athérogéniques via le S1P1 qui activerait la eNOS afin d’induire une vasodilatation, et via sa

liaison à l’ApoM, anti-athérogénique (Sato and Okajima 2010, Christoffersen et al. 2011). Dans le

même sens, une étude a montré que le FTY720 inhibe le développement de l’athérosclérose chez

des souris déficientes en LDL-R (Low Density Lipoprotein Receptor) et qui présentent donc un taux

élevé de LDL plasmatique, un transporteur du cholestérol. Le FTY720 exercerait son action en

induisant une lymphopénie et en convertissant les macrophages M1 pro-inflammatoires en

macrophages M2 anti-inflammatoires (Nofer et al. 2007).

3.2.5. Le diabète et l’obésité

Le diabète est une maladie métabolique chronique dans laquelle le métabolisme sphingolipidique

est altéré en faveur du céramide qui favorise la résistance à l’insuline. A l’inverse, l’inhibition de

la synthèse des sphingolipides augmente la sensibilité à l’insuline et prévient le développement

du diabète chez des rongeurs obèses (Summers 2010, Deevska and Nikolova-Karakashian 2011,

Maceyka et al. 2012). La réponse inflammatoire induite par l’obésité exacerbant la résistance à

l’insuline et le développement du diabète, une étude a montré que l’activation du TLR4 (Toll-Like

Receptor 4) stimule la voie NF-κB et ainsi la synthèse de céramide (Holland et al. 2011a). Le

céramide serait donc un médiateur clé de la résistance à l’insuline induite par l’inflammation liée

à l’obésité. De plus, l’adiponectine, une hormone qui favorise la sensibilité à l’insuline, stimule

l’activité des céramidases et donc la production de S1P, induisant ainsi la survie des cellules β des

îlots de Langerhans (Holland et al. 2011b). Toutefois, les mécanismes moléculaires impliqués dans

les propriétés anti-apoptiques et pro-prolifératives de la S1P vis-à-vis de ces cellules

pancréatiques restent à élucider (Maceyka et al. 2012).

En parallèle, une étude récente a impliqué l’axe S1P/S1P1 dans le contrôle hypothalamique de

l’homéostasie énergétique. En effet, l’injection intracérébroventriculaire de S1P diminuerait la

consommation de nourriture et augmenterait la dépense d’énergie chez des rats. De plus,

l’expression du S1P1 serait diminuée dans l’hypothalamus de rats obèses (Silva et al. 2014).

3.3. La voie SphK1/S1P dans les cancers

Les propriétés pro-prolifératives et anti-apoptotiques de la S1P suggèrent l’implication de la voie

SphK1/S1P dans progression tumorale. En effet, une dérégulation du biostat sphingolipidique en

faveur de la S1P est retrouvée dans les cancers. La S1P joue notamment un rôle crucial dans la

99!

survie et la prolifération des cellules tumorales, dans la progression et l’angiogenèse tumorale

ainsi que dans la dissémination métastatique et la résistance aux traitements (Pyne and Pyne

2010, Maceyka et al. 2012).

3.3.1. Le biostat sphingolipidique dans la survie et la prolifération tumorale

Dans les cancers, la surexpression de la SphK1 entraine une dérégulation du biostat

sphingolipidique en faveur de la S1P et au détriment du céramide. Ceci favorise la survie et la

prolifération cellulaire des cellules tumorales, via différents mécanismes. En premier lieu, le

céramide a émergé comme étant un médiateur clé de l’apoptose. En effet, le céramide peut activer

la PP2A qui régule des protéines pro-apoptotiques telles que p53 et anti-apoptotiques telles que

Bcl-2 et Akt. Le céramide peut également activer la PKC-ζ et la cathepsine D qui induit le clivage

de BID et active ainsi la voie intrinsèque de l’apoptose. Au niveau de la membrane externe de la

mitochondrie, le céramide favorise la libération de cytochrome c, ce qui aboutit à l’activation de la

caspase 9 et donc au déclenchement de l’apoptose (Giussani et al. 2014). En second lieu, il a été

montré que le biostat sphingolipidique est impliqué dans le contrôle de l’autophagie, un

processus de recyclage des constituants cellulaires par les cellules eucaryotes, pouvant aboutir à

la survie ou à la mort cellulaire (Li et al. 2014). Des études ont montré que dans des cellules

tumorales, le céramide est capable d’induire la mort cellulaire par autophagie en inhibant la voie

PI3K/Akt, en augmentant l’expression de Beclin1 et en interagissant avec LC3 (Scarlatti et al.

2004, Sentelle et al. 2012, Li et al. 2014). A l’inverse, il a été montré qu’en condition de privation de

nutriments, la S1P induit une autophagie protectrice, aboutissant à la survie de cellules tumorales

mammaires (Lavieu et al. 2006). Enfin, la dérégulation du biostat sphingolipidique en faveur de la

voie SphK1/S1P favorise la croissance et la prolifération cellulaire, d’une part via l’activation des

voies PI3K/Akt et MAPK, et d’autre part en diminuant l’expression de p21 et p27 induites par le

céramide (Morad and Cabot 2013).

!

3.3.2. La voie SphK1/S1P dans l’initiation et la progression tumorale

C’est en 2000 que le caractère « oncogénique » de la SphK1 a été mis en évidence. En effet, une

étude a montré que la surexpression de la SphK1 dans des fibroblastes leur confère des propriétés

transformantes, telles que la capacité à proliférer en absence de sérum, à former des colonies en

agar mou et à former des tumeurs chez des souris immunodéficientes SCID (Severe Combined

ImmunoDeficiency) (Xia et al. 2000). De plus, l’activité de la SphK1 serait nécessaire à la

100!

transformation oncogénique induite par Ras (Xia et al. 2000). Enfin, la localisation de la SphK1 à la

membrane plasmique serait essentielle à cette fonction pro-tumorale (Pitson et al. 2005).

Bien qu’aucune mutation de la SphK1 n’ait été retrouvée dans les cancers, des études ont montré

une augmentation de l’expression de l’ARNm, de la protéine, ou de l’activité de la SphK1 dans de

nombreuses tumeurs humaines en comparaison du tissu sain. C’est le cas dans les cancers du

sein, de l’utérus, de l’ovaire, du poumon, du côlon, du rectum, de la prostate, de l’estomac, du

rein, du foie, des voies aériennes et digestives supérieures, dans les glioblastomes et dans les

lymphomes (French et al. 2003, Johnson et al. 2005, Malavaud et al. 2010, Zhang et al. 2014c). De

plus, cette surexpression de la SphK1 corrèle très souvent avec un grade tumoral élevé, une

résistance aux traitements et une diminution de la survie des patients (Van Brocklyn et al. 2005,

Malavaud et al. 2010, Zhang et al. 2014c).

La SphK2 n’est pas retrouvée surexprimée dans les cancers, et peu d’études y décrivent son

implication. L’une d’entre elles a montré que la déplétion de la SphK2 inhibe la prolifération de

cellules de glioblastome, ceci plus efficacement que le ciblage de la SphK1 (Van Brocklyn et al.

2005). Une autre a montré que l’inhibition de la SphK2 entraine une diminution de la croissance

tumorale dans un modèle murin de myélome multiple (Venkata et al. 2014). Enfin, une troisième

étude montre que la déplétion génétique de la SphK2 inhibe la tumorigenèse dans un modèle de

leucémie lymphoblastique aigüe et que son inhibition pharmacologique augmente la survie de

souris porteuses de tumeurs humaines (Wallington-Beddoe et al. 2014). Ces deux dernières études

mettent en évidence la régulation positive de l’oncogène c-Myc par la SphK2.

Concernant les S1PRs, des études récentes ont montré qu’ils peuvent être mutés ou surexprimés

dans les tumeurs humaines. Ainsi, le S1P2 est retrouvé muté dans des cas de lymphomes, et le

S1P5 serait surexprimé dans certaines leucémies (Kothapalli et al. 2002, Cattoretti et al. 2009). A

l’inverse, une étude a montré que le S1P1 est moins exprimé dans des cas de glioblastome que

dans le tissu sain, et que son expression corrèle avec la survie des patients (Yoshida et al. 2010b).

Par la suite, une étude a montré qu’une forte expression des S1P1 et S1P3 corrèle avec une

diminution de la survie de patientes souffrant de cancer du sein positif pour le récepteur aux

oestrogènes, à l’inverse de l’expression du S1P2 qui corrèle avec une augmentation de leur survie

(Ohotski et al. 2013). La forte expression du S1P4 corrèle quant à elle avec une diminution de la

survie de patientes atteintes d’un cancer du sein triple négatif (Ohotski et al. 2012). Enfin, une

étude effectuée sur 201 échantillons de patients et 183 échantillons contrôles indique que la forme

nucléaire du S1P3 est globalement surexprimée dans les tumeurs en comparaison du tissu sain

101!

(Wang et al. 2014a). Ainsi, en fonction du contexte et de l’expression relative des S1PRs, la S1P

peut exercer divers effets. Généralement, elle stimule la prolifération, la survie et la motilité des

cellules cancéreuses via l’activation des S1P1 et S1P3 et donc des MAPK, d’Akt et de Rac. Ainsi, il a

été montré que l’axe S1P/S1P3 favoriserait l’expansion de cellules souches cancéreuses (Hirata et

al. 2014). De plus, une étude montre que le S1P1 induit l’expression de l’IL-6 et l’activation

persistante de STAT3, qui à son tour va augmenter l’expression du S1P1. Cette boucle de

rétrocontrôle favoriserait la transformation induite par l’inflammation et accélèrerait la

progression tumorale (Lee et al. 2010). A l’inverse, la S1P inhibe la motilité des cellules

cancéreuses en activant la voie S1P2/Rho (Pyne and Pyne 2010, Maceyka et al. 2012).

De nombreuses interactions entre la signalisation induite par la voie SphK1/S1P et celles induites

par des facteurs de croissance ont été impliquées dans les cancers. Les S1PRs peuvent fonctionner

de concert avec des récepteurs aux facteurs de croissance afin de réguler la prolifération

tumorale, la migration et l’angiogenèse. Par exemple, l’EGF stimule l’activité de la SphK1 pour

réguler la migration cellulaire, alors que la S1P peut induire la production d’EGF et la

transactivation de l’EGFR (Meyer zu Heringdorf et al. 1999, Shida et al. 2004, Sukocheva et al.

2006)). De même, la voie de la S1P peut interagir avec celles du FGF, du TGF-β (Transforming

Growth Factor β), du VEGF et du PDGF (Pyne and Pyne 2010).

3.3.3. La voie SphK1/S1P dans l’angiogenèse et la dissémination métastatique

La S1P extracellulaire et les S1PRs jouent un rôle crucial dans le développement et le maintien

l’intégrité du système vasculaire (cf. 2.2. et 3.2.1.). De nombreuses études ont donc caractérisé le

rôle de la voie SphK1/S1P dans la régulation de l’angiogenèse tumorale.

Le S1P1 étant fortement exprimé au niveau des vaisseaux sanguins tumoraux, une étude a montré

que sa déplétion par siRNA inhibe la migration de cellules endothéliales in vitro (Chae et al. 2004).

De plus, l’injection de ce siRNA dans un modèle de tumeur sous-cutanée in vivo déstabilise le

réseau vasculaire tumoral et inhibe l’angiogenèse, ce qui conduit à une diminution de la

croissance tumorale (Chae et al. 2004). A l’inverse, le S1P2 régulerait négativement la migration

cellulaire et l’angiogenèse. En effet, une étude a montré que l’injection de cellules tumorales chez

des souris S1P2-/- entraine une accélération de la croissance tumorale corrélée avec une

augmentation de la densité vasculaire et du recrutement de cellules musculaires lisses et de

péricytes autour des néo-vaisseaux (Du et al. 2010). Le FTY720 étant un antagoniste fonctionnel

du S1P1 qui n’a pas d’effet sur le S1P2, une étude a montré que ce composé inhibe l’angiogenèse

102!

induite par la S1P et le VEGF ainsi que la perméabilité vasculaire induite par ce dernier. Le

FTY720 inhibe ainsi la croissance tumorale et favorise l’apoptose dans un modèle de mélanome in

vivo (LaMontagne et al. 2006).

La mise au point d’un anticorps neutralisant la S1P extracellulaire (Sphingomab®) a permis de

confirmer le rôle crucial de la S1P dans la régulation de l’angiogenèse tumorale. En effet, une

étude a montré que cet anticorps inhibe la migration de cellules endothéliales in vitro ainsi que

leur formation de tubes en Matrigel. Dans différents modèles murins, cette même étude montre

que l’anticorps anti-S1P ralentit la croissance tumorale en inhibant l’angiogenèse induite par le

VEGF, et diminue la sécrétion de VEGF et de cytokines pro-inflammatoires, comme l’IL-6, par les

cellules tumorales (Visentin et al. 2006). En accord avec ces données, une étude récente a montré

que le Sphingomab® diminue le flux sanguin tumoral (Zhang et al. 2015).

Le rôle de la voie SphK1/S1P dans la régulation de la dissémination métastatique est moins clair.

Alors qu’il était généralement admis que la S1P sécrétée par la tumeur est impliquée dans ce

phénomène, une étude a montré que le processus métastatique est régulé par la S1P systémique.

En effet, dans un modèle murin de cancer de la prostate, la déplétion systémique de la SphK1

inhibe la formation de métastases pulmonaires, alors que la déplétion de la SphK1 dans les

cellules tumorales n’a pas cet effet (Ponnusamy et al. 2012).

3.3.4. La voie SphK1/S1P dans la résistance thérapeutique

De nombreuses études ont impliqué la voie SphK1/S1P dans la résistance aux traitements anti-

cancéreux. En effet, afin de résister aux thérapies conventionnelles telles que la chimiothérapie et

la radiothérapie, les cellules tumorales empêchent l’accumulation de céramide, médiateur de

l’action pro-apoptotique de nombreux traitements, et augmentent la production de S1P qui

favorise la survie cellulaire (Giussani et al. 2014). Ainsi, des études ont montré que des lignées

cellulaires tumorales résistantes à la radiothérapie ne montrent pas d’augmentation du taux de

céramide en réponse à ce traitement, à l’inverse de lignées radiosensibles (Chmura et al. 1997,

Michael et al. 1997). De plus, la surexpression de la SphK1 inhibe l’apoptose et favorise la

chimiorésistance dans des modèles de cancers du sein, de la prostate, du pancréas et dans un

modèle de leucémie myéloïde aigüe (Nava et al. 2002, Bonhoure et al. 2006, Pchejetski et al. 2008,

Datta et al. 2014). De la même manière, la surexpression de la SphK1 confère une résistance à

l’imatinib à des cellules de leucémie myéloïde chronique, et son inhibition par le FTY720

sensibilise un modèle murin de cancer de la prostate à la radiothérapie (Baran et al. 2007,

Bonhoure et al. 2008, Pchejetski et al. 2010). Enfin, une étude a montré que l’activation de la SphK1

103!

après déprivation androgénique chronique – qui mime les thérapies anti-androgéniques –

constitue un mécanisme compensatoire qui permet aux cellules tumorales prostatiques de

survivre en absence d’androgènes (Dayon et al. 2009). L’activité de la SphK1 est ainsi corrélée à la

résistance thérapeutique et à l’agressivité tumorale dans de nombreux modèles tumoraux.

Récemment, deux études de notre équipe ont directement impliqué la S1P dans la résistance

thérapeutique à l’aide de l’anticorps anti-S1P. La première a montré que la S1P sécrétée par les

ostéoblastes active le S1P1 à la surface de cellules de métastases osseuses du cancer de la prostate,

afin de les rendre chimio- et radiorésistantes (Brizuela et al. 2014). La seconde étude a montré que

dans un modèle murin de cancer de la prostate, l’anticorps anti-S1P entraine une normalisation

transitoire du réseau vasculaire tumoral, qui favorise l’oxygénation de la tumeur et qui augmente

ainsi l’efficacité de la chimiothérapie (Ader et al. 2015).

3.3.5. Stratégies thérapeutiques ciblant la voie SphK1/S1P

La voie SphK1/S1P étant largement impliquée dans le développement et la progression tumorale

ainsi que dans la dissémination métastatique, elle constitue une cible thérapeutique pertinente en

cancérologie. Par conséquent, de nombreuses molécules dirigées contre les SphKs, la S1P ou les

S1PRs ont été développées dans le but d’améliorer l’efficacité des stratégies anti-tumorales

(Tableau 8).

Historiquement, la DHS et la DMS, des analogues de la sphingosine, ont été utilisés en tant

qu’inhibiteurs des SphKs. Des études ont montré que ces composés inhibent la croissance

tumorale dans de nombreux modèles et peuvent améliorer l’efficacité de radiothérapies et de

chimiothérapies (Cuvillier 2007). Cependant, ces composés manquent de spécificité puisqu’ils

sont capables d’inhiber la PKC et la CerK (Igarashi et al. 1989, Endo et al. 1991, Sugiura et al. 2002).

Par la suite, plusieurs inhibiteurs synthétiques des SphKs ont été identifiés par criblage (French et

al. 2003). Parmi eux, le SKI-II ou SKi, compétitif pour le site de liaison à la sphingosine, inhibe

l’apoptose dans différents modèles de cancer de la prostate et diminue la croissance tumorale in

vivo (Pchejetski et al. 2005, French et al. 2006, Sauer et al. 2009, Wang et al. 2013). Le SK1-I, un

analogue de la sphingosine, a ensuite été le premier inhibiteur considéré comme spécifique de la

SphK1 (Paugh et al. 2008).

Le composé ABC294640 est un inhibiteur compétitif du site de liaison de la sphingosine,

considéré comme spécifique de la SphK2 (French et al. 2010). Il inhibe la prolifération et la

migration in vitro, et diminue la croissance tumorale en induisant l’autophagie dans des modèles

de cancer du sein et du rein in vivo (Beljanski et al. 2010, French et al. 2010).

104!

Des inhibiteurs naturels des SphKs ont été isolés à partir de micro-organismes bactériens ou

fongiques. Il s’agit d’inhibiteurs spécifiques qui ne présentent pas d’activité envers la PI3K et la

PKC (Kono et al. 2000a, Kono et al. 2000b, Kono et al. 2002). Parmi eux, le B-5354c est un inhibiteur

non-compétitif du site de liaison de la sphingosine capable d’induire une chimiosensibilisation in

vitro et in vivo dans un modèle de cancer de la prostate (Pchejetski et al. 2008). Le F-12509A est un

inhibiteur compétitif du site de liaison de la sphingosine qui induit l’apoptose de cellules

leucémiques chimiorésistantes (Bonhoure et al. 2006, Bonhoure et al. 2008).

Deux anticorps anti-S1P, capables de neutraliser la S1P plasmatique et extracellulaire, ont été

produits à ce jour. Il s’agit du Sphingomab®, un anticorps monoclonal murin (cf. 3.3.2.), et de sa

forme humanisée, le Sonepcizumab (Asonep®) actuellement en phase II d’essai clinique pour le

traitement de certains adénocarcinomes rénaux métastatiques.

Il existe de nombreux agonistes et antagonistes des S1PRs dont l’efficacité anti-tumorale n’est pas

avérée, contrairement à celle du FTY720 (cf. 3.1.1. et 3.3.2.). Ce composé induit l’apoptose dans

des cellules de cancer du sein, de la vessie, de la prostate et dans des cellules de mélanome, et

peut inhiber l’angiogenèse et prévenir l’apparition de métastases in vivo (Wang et al. 1999, Azuma

et al. 2002, Azuma et al. 2003a, Azuma et al. 2003b, LaMontagne et al. 2006). En plus de son action

sur les S1PRs, le (S)-FTY720-P inhibe l’autotaxine, ce qui participe à son action anti-angiogénique

(van Meeteren et al. 2008). D’autre part, des études ont montré que le FTY720 inhibe la SphK1, la

SPL, la CerS, la PKC, la phospholipase A2 (PLA2) et active la PP2A (Matsuoka et al. 2003,

Bandhuvula et al. 2005, Payne et al. 2007, Vessey et al. 2007, Sensken and Graler 2010, Pitman et al.

2012).

105!

Tableau 8. Stratégies thérapeutiques ciblant la voie SphK1/S1P.

Molécule Cible(s) Ki /IC50/EC50 Effet(s) biologique(s) Référence(s) Ciblage des SphKs DMS (N,N-diméthylsphingosine), DHS (D,L-thréo-dihydrosphingosine)

SphKs Ki=5-12µM In vitro : IC (SphK1) ou INC (SphK2) du site de liaison de la sphingosine ; inhibition de la PKC et de la CerK ; inhibition de la croissance cellulaire, induction de l’apoptose ; sensibilisation aux radio- et chimio-thérapies In vivo : inhibition de la croissance tumorale Essai clinique de phase I : DHS en combinaison avec le cisplatine pour le traitement de tumeurs solides avancées

(Igarashi et al. 1989, Endo et al. 1991, Sugiura et al. 2002, Dickson et al. 2011)

SK1-I (BML-258 ; (2R,3S,4E)-N-méthyl-5-(4-pentylphényl)-2-aminopent-4ene-1,3-diol)

SphK1 Ki≈10µM In vitro : ICS ; sans effet sur les autres enzymes kinases (PKC, ERK…) ; inhibition de la croissance et de la survie cellulaire In vivo : inhibition de la croissance tumorale et de l’angiogenèse

(Paugh et al. 2008, Kapitonov et al. 2009)

SKi (SKI-II ; 2-(p-hydroxyanilino)-4-(p-chlorophényl)thiazole)

SphKs IC50=0,5µM In vitro : ICS; sans effet sur la PKC, la PI3K et ERK ; inhibition de la dihydrocéramide désaturase ; inhibition de la prolifération cellulaire et induction de l’apoptose ; sensibilisation à la chimiothérapie In vivo : inhibition de la croissance tumorale

(French et al. 2003, Pchejetski et al. 2005, French et al. 2006, Guillermet-Guibert et al. 2009, Wang et al. 2013, Cingolani et al. 2014)

B-5354c SphKs Ki≈3µM In vitro : INCS; sans effet sur la PKC et la PI3K; sensibilisation à la chimiothérapie In vivo : inhibition de la croissance tumorale

(Kono et al. 2000b, Kono et al. 2002, Pchejetski et al. 2008)

F-12509A SphKs Ki≈5µM In vitro : ICS ; sans effet sur la PKC et la PI3K; induction de l’apoptose

(Kono et al. 2000a, Kono et al. 2002, Bonhoure et al. 2006, Bonhoure et al. 2008)

PF-543 SphK1 Ki≈3,6nM In vitro : ICS ; haute spécificité pour la SphK1 ; pas d’effet sur la prolifération et la survie cellulaire

(Schnute et al. 2012, Wang et al. 2014c)

ABC294640 (3-(4-chlorophenyl)-adamantane-1-acide carboxylique (pyridine-4-ylmethyl)amide)

SphK2 Ki≈10µM In vitro : ICS ; inhibition de la prolifération et de la migration cellulaire ; induction de l’autophagie In vivo : inhibition de la croissance tumorale ; induction de l’apoptose et de l’autophagie

(Beljanski et al. 2010, French et al. 2010)

!!!!!!!!!

106!

!!

Molécule

Cible(s)

Ki /IC50/EC50

Effet(s) biologique(s)

Référence(s)

Ciblage de la S1P Sphingomab®, Sonepcizumab (Asonep®, Isonep®)

S1P - In vitro : inhibition de la prolifération et de la migration cellulaire ; induction de l’apoptose ; inhibition de la production de VEGF, IL-6, IL-8 In vivo : inhibition de la croissance tumorale ; inhibition de l’angiogenèse ; diminution de l’hypoxie intratumorale et de la dissémination métastatique Essai clinique de phase I : Isonep® pour le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge Essai clinique de phase II : Asonep® pour le traitement des adénocarcinomes rénaux réfractaires

(Visentin et al. 2006, O'Brien et al. 2009, Ader et al. 2015) NCT00767949 NCT01762033

Ciblage des S1PRs FTY720 (Fingolimod Gilenya®), (S)-FTY720-P

S1P1 S1P3 S1P4 S1P5 SphK1 SphK2

EC50=0,3-0,6nM EC50≈3nM EC50=0,3-0,6nM EC50=0,3-0,6nM Ki=2µM Km=18,2µM

In vitro : phosphorylation par la SphK2 ; agoniste des S1P1, S1P3, S1P4, S1P5 ; antagoniste fonctionnel du S1P1 ; inhibition de l’autotaxine, de la SphK1, de la SPL, de la CerS, de la PKC, de la PLA2 ; activation de la PP2A ; inhibition de la prolifération ; induction de l’apoptose In vivo : inhibition de la croissance tumorale ; inhibition de l’angiogenèse ; inhibition de la dissémination métastatique ; lymphopénie

(Wang et al. 1999, Azuma et al. 2002, Brinkmann et al. 2002, Mandala et al. 2002, Azuma et al. 2003a, Azuma et al. 2003b, Billich et al. 2003, Matsuoka et al. 2003, Bandhuvula et al. 2005, LaMontagne et al. 2006, Payne et al. 2007, Vessey et al. 2007, van Meeteren et al. 2008, Sensken and Graler 2010, Lim et al. 2011, Pitman et al. 2012)

Ciblage des S1PRs W146 S1P1 Ki=77nM In vitro : antagoniste du S1P1 (Gonzalez-Cabrera

et al. 2008) VPC23019 S1P1

S1P3 Ki≈30nM In vitro : antagoniste des S1P1 et S1P3

(Davis et al. 2005)

JTE013 S1P2 IC50=17,6nM In vitro : antagoniste du S1P2 ; inhibition de la prolifération et de la migration cellulaire ;

(Osada et al. 2002, Liu et al. 2014)

ICS : inhibition compétitive du site de liaison à la sphingosine ; INCS : inhibition non-compétitive du site de liaison à la sphingosine.

107!

Problématique

108!

109!

Les adénocarcinomes rénaux à cellules claires (ccRCC), qui représentent 70% de l’ensemble

cancers du rein, ont une incidence en augmentation constante. Alors que la survie globale à 5 ans

des patients atteints d’un ccRCC est de 72%, 20 à 30% d’entre eux sont diagnostiqués au stade

métastatique, ce qui réduit considérablement leur espérance de vie. En effet, la survie globale à 5

ans de ces patients chute à 10% (Bhatt and Finelli 2014, DeSantis et al. 2014, Jonasch et al. 2014).

Les ccRCC étant résistants aux traitements conventionnels, tels que la chimiothérapie, la

radiothérapie et les thérapies ciblées, une meilleure connaissance des voies moléculaires

impliquées dans la carcinogenèse des ccRCC est donc essentielle pour élargir l’arsenal

thérapeutique et améliorer le pronostic de survie de ces patients (Fisher et al. 2013).

L’inactivation somatique biallélique du gène VHL se produit dans la plupart des ccRCC

sporadiques où l’incidence d’une mutation de ce gène peut atteindre 91% selon les études

(Gossage et al. 2015). La conséquence majeure de la perte de la protéine pVHL est la stabilisation

des facteurs de transcription HIF qui, via l’activation de la transcription de leurs gènes cibles,

stimulent l’angiogenèse tumorale, faisant ainsi des ccRCC des tumeurs fortement mais

irrégulièrement vascularisées (Iliopoulos et al. 1996, Maxwell et al. 1999). Cette vascularisation

structurellement et fonctionnellement anormale rend les ccRCC hypoxiques, ce qui favorise

l’agressivité tumorale. En effet, les cellules tumorales s’adaptent et survivent à l’hypoxie

intratumorale en activant les facteurs de transcription HIF-1 et HIF-2 qui régulent l’expression de

nombreux gènes impliqués dans des processus cruciaux de la biologie du cancer tels que la

prolifération cellulaire, la reprogrammation métabolique, l’angiogenèse tumorale ou encore la

dissémination métastatique (Semenza 2012b). Des études ont montré que les facteurs HIF sont

surexprimés dans de nombreuses tumeurs humaines, telles que les glioblastomes, les

adénocarcinomes prostatiques et les ccRCC (Zhong et al. 1999, Rankin and Giaccia 2008). Cette

surexpression étant corrélée à un mauvais pronostic et à l'échec thérapeutique, les facteurs HIF

constituent donc des cibles thérapeutiques pertinentes en cancérologie (Melillo 2007).

De nombreuses études ont confirmé l’importance des facteurs HIF dans la progression des

ccRCC. Parmi elles, plusieurs études suggèrent que c’est HIF-2α, et non HIF-1α, qui jouerait un

rôle crucial dans ces cancers où il serait notamment nécessaire et suffisant pour induire la

croissance tumorale (Kondo et al. 2002, Kondo et al. 2003, Keith et al. 2012). Cependant, à ce jour,

seule l’activation constitutive de HIF-1α, et non de HIF-2α, dans les cellules du tubule proximal

de souris a été décrite comme favorisant le développement d’un ccRCC (Fu et al. 2011, Fu et al.

2013). Ainsi, l’inhibition de HIF-1α et HIF-2α dans les ccRCC représente une stratégie

thérapeutique pertinente.

Longtemps considérés comme simples composants structuraux des membranes cellulaires, les

sphingolipides constituent une classe de lipides bioactifs qui régulent de nombreux processus

110!

biologiques fondamentaux tels que la prolifération, la survie et la migration cellulaire ainsi que

l’angiogenèse, la réponse inflammatoire et la progression tumorale (Maceyka et al. 2012). Parmi

ces sphingolipides, le céramide et la S1P ont largement été impliqués dans la progression

tumorale et la résistance thérapeutique. En effet, le céramide induit des réponses pro-

apoptotiques et anti-prolifératives, à l’inverse de la S1P qui a des propriétés pro-prolifératives et

anti-apoptotiques. Les effets opposés de ces deux sphingolipides ont conduit au concept selon

lequel l’équilibre dynamique entre les taux de céramide et de S1P représente un facteur

déterminant pour le devenir de la cellule (Cuvillier et al. 1996). Un des acteurs majeurs de cet

équilibre est la SphK1 qui phosphoryle la sphingosine, catabolite direct du céramide, pour former

la S1P. Une fois générée, la S1P peut agir soit intracellulairement, soit extracellulairement de

manière autocrine ou paracrine en se liant à l’un de ses cinq récepteurs couplés aux protéines G

(S1P1-5) (Maceyka et al. 2012).

Des études ont montré que la dérégulation de la balance sphingolipidique contrôlée par la SphK1

est importante dans l’acquisition du phénotype malin. La preuve en est que la surexpression de la

SphK1 dans des fibroblastes induit leur transformation et leur capacité à former des tumeurs chez

la souris SCID, et que l’expression de la SphK1 est fréquemment augmentée dans de nombreuses

tumeurs solides (Xia et al. 2000, French et al. 2003, Johnson et al. 2005). De plus, cette surexpression

de la SphK1 est corrélée à une plus forte agressivité tumorale et à une diminution de la survie des

patients (Pyne and Pyne 2010). En particulier, notre équipe a montré que la suractivation de la

SphK1 corrèle avec l’agressivité des adénocarcinomes prostatiques et avec leur récidive après

prostatectomie (Malavaud et al. 2010). D’autre part, de nombreuses études ont montré que la

surexpression de la SphK1 favorise la chimio- et la radiorésistance dans différents modèles de

cancers (Pchejetski et al. 2005, Bonhoure et al. 2006, Pchejetski et al. 2008, Guillermet-Guibert et al.

2009, Datta et al. 2014).

Des travaux de notre équipe ont permis de révéler des interconnexions étroites entre le

métabolisme sphingolipidique et la réponse à l'hypoxie. En effet, notre équipe a été à l’origine de

la première démonstration du rôle de la SphK1 comme régulteur de HIF-1α en hypoxie dans de

nombreux types cellulaires tumoraux, dont les ccRCC (Ader et al. 2008). Ce travail a montré que

l’inhibition de la SphK1 induit la dégradation protéasomale de HIF-1α selon un mécanisme

dépendant de pVHL. Plus récemment, nous avons établi que la neutralisation de la S1P

extracellulaire dans un modèle murin de cancer de la prostate entraine une normalisation

transitoire du réseau vasculaire tumoral, qui favorise l’oxygénation de la tumeur et qui augmente

ainsi l’efficacité de la chimiothérapie (Ader et al. 2015). Enfin, nos résultats préliminaires semblent

indiquer qu’en hypoxie, la SphK1 contrôle le taux intracellulaire de HIF-2α dans des lignées de

111!

glioblastomes et d’adénocarcinomes prostatique et pulmonaire, ainsi que dans les ccRCC

(Gstalder et al. 2015).

Au vu de l’ensemble de ces résultats, et en considérant l’importance des facteurs HIF dans la

progression tumorale des ccRCC, mon projet de thèse s’organise autour de trois objectifs :

1) Caractériser in vitro les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de

HIF-2α via la SphK1 ;

2) Caractériser l’implication des S1PRs dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α ;

3) Evaluer in vivo l’effet de l’inhibition de la voie SphK1/S1P sur l’adaptation à

l’hypoxie intratumorale et sur la sensibilisation à la chimiothérapie dans un modèle

murin de ccRCC.

112!

113!

Matériels et Méthodes

114!

115!

Ce chapitre concerne les parties 2 et 3 du chapitre « Résultats expérimentaux »

1. Lignées cellulaires et conditions de culture

La lignée cellulaire CAKI-1 est issue d’une métastase de peau d’un adénocarcinome rénal à

cellules claires. La lignée cellulaire A498 dérive d’une tumeur primaire d’un adénocarcinome

rénal à cellules claires. La lignée cellulaire PC3 a été établie à partir d’une métastase osseuse d’un

adénocarcinome prostatique de grade 4. La lignée cellulaire U87 est issue d’une lignée

astrocytaire dérivant d’un gliome malin. Les lignées CAKI-1-shCtrl et CAKI-1-shS1P1 ont été

établies par le plateau de vectorologie de Rangueil (CRCT, Toulouse) à l’aide du plasmide

pLKO.1-puro-CMV-tGFP contenant une séquence « Non Target Control » correspondant au

shCtrl, ou la séquence GCTGCTCAAGACCGTAATTAT (Clone ID : TRCN0000011360)

correspondant au shS1P1 (Sigma).

L’ensemble de ces lignées sont cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Life Technologies) contenant

du Glutamax® supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal décomplémenté. De la puromycine

(20µg/mL) est ajoutée au milieu de culture des lignées CAKI-1-shCtrl et CAKI-1-shS1P1.

Toutes les lignées sont maintenues à 37°C, en atmosphère humide contenant 5% de CO2.

Lorsque les expériences sont réalisées en hypoxie, les cellules sont placées dans une enceinte à

hypoxie (InVivo2 400, Ruskinn), dont l’atmosphère contient 0,1% d’oxygène, 95% d’azote et 5% de

CO2.

2. Modèles animaux et conditions expérimentales

Les souris utilisées sont des femelles NMRI nu/nu âgées de 6 semaines. Elles sont identifiées par

tatouage au niveau des pattes et xénogreffées de manière hétérotopique. Dix millions de cellules

d’adénocarcinome rénal à cellules claires CAKI-1 ou un fragment tumoral de 2mm3 est ainsi

implanté en sous-cutané à chaque souris. Le volume tumoral et le poids des animaux sont suivis

de façon hebdomadaire. La longueur (L) et la largeur (l) des tumeurs sont mesurées à l’aide d’un

pied à coulisse et le volume tumoral est déterminé par la formule «L x l2 x 0,52 ». Lorsque le

volume tumoral atteint 100mm3, les souris sont traitées par injection intra-péritonéale de FTY720

2,5mg/kg/j (contrôle : DMSO) et/ou de gemcitabine 2mg/kg (contrôle : PBS) deux fois par

semaine. Un prélèvement sanguin rétro-orbital est effectué la veille du sacrifice. Après anesthésie

116!

à l’isoflurane (IsoVet) et prélèvement du sang total par ponction cardiaque, les animaux sont

sacrifiés par dislocation cervicale.

3. Anticorps

Le tableau 9 ci-dessous recense les anticorps utilisés ainsi que leurs conditions d’utilisation.

Tableau 9. Anticorps et conditions d’utilisation

Cy3 : cyanine 3 ; FITC : fluorescein isothiocyanate ; HRP : horseradish peroxydase ; IHC : immunohistochimie, IF : immunofluorescence, TA : température ambiante, WB : western blot.

Anticorps Fournisseur Conditions d’utilisation Primaires Caspase-3 clivée CD34 Cycline D1 Desmine HIF-1α HIF-2α KI67 Pimonidazole S1P1 S1P2 S1P3 S1P4 S1P5 αSMA

αtubuline

Cell Signaling (#9661) Abcam (ab8158) Cell Signaling (#2926) Abcam (ab8592) BD (610959) Novus (NB100-122) BD (550609) Hypoxyprobe (4.3.11.3) Novus (NBP1-95120) Sigma (HPA014307) Novus (NBP1-95141) Abcam (ab126392) Abcam (ab92994) Dako (M0851) Santa Cruz (sc-32293)

IHC, 1:300 dans SignalStain Antibody Diluent (Cell Signaling #8112L), 16h à 4°C IF, 1:400 dans PBS, 16h à 4°C WB, 1:1000 dans TBST 5% lait, 16h à 4°C IF, 1:50 dans PBS, 1h30 à TA WB, 1:1000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C WB, 1:1000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C IF, 1:50 dans PBS, 16h à 4°C IHC, 1:50 dans TBS, 30minutes à TA WB, 1:10000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C WB, 1:1000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C WB, 1:10000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C WB, 1:1000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C WB, 1:1000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C IF, 1:200 dans MOM Protein Concentrate (MOM Kit, Vector), 1h à TA WB, 1:5000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C

Secondaires AlexaFluor-488 (Souris) Biotine (Rat) Cy3 (Streptavidine et Souris DyLight-488 (Lapin) HRP (FITC) HRP (Lapin) HRP (Lapin et Souris)

Jackson (715-545-150) Jackson (712-065-153) Jackson (016-160-084 et 715-165-150) Jackson (711-485-152) Hypoxyprobe (4.3.11.3) Cell Signaling (#8114S) Bio-Rad (170-6515 et 170-6516)

IF, 1:200 dans PBS, 1h à TA IF, 1:200 dans PBS, 1h à TA IF, 1:200 dans PBS, 1h à TA IF, 1:200 dans PBS, 1h à TA IHC, 1:50 dans TBS, 30 minutes à TA IHC, 30 minutes à TA WB, 1:5000 dans TBST, 1h à TA

Tertiaires Cy3 streptavidine Jackson (715-545-150) IF 1:200

117!

4. Réactifs

Le FTY720 est fourni par Enzo Life Sciences. Il s’agit d’un antagoniste fonctionnel des récepteurs

S1P1, S1P3, S1P4 et S1P5. La solution stock est préparée dans du DMSO puis conservée à -20°C. Le

W146 est fourni par Avanti Polar Lipids. Il s’agit d’un antagoniste du récepteur S1P1. La solution

stock est préparée dans de l’ethanol 100% puis conservée à -20°C. La Gemcitabine (Gemzar®) est

fournie par l’Hôpilal Rangueil (Toulouse). La solution stock est conservée à 4°C puis diluée dans

du PBS avant injection.

5. Transfection d’ARN interférent

Les cellules sont transfectées de façon transitoire avec des siRNA dont les séquences sont

indiquées dans le tableau 10 ci-dessous.

Tableau 10. siRNA et conditions d’utilisation

Les transfections sont réalisées en utilisant la Lipofectamine® 2000 (Invitrogen) selon les

recommandations du fournisseur. Le milieu utilisé pour la transfection est l’Opti-MEM

supplémenté par 5% de glutamine (Life Technologies).

6. Western blot

Après lavage au PBS froid, les cellules sont récupérées par grattage puis centrifugées à 600g

pendant 5 minutes à 4°C avant d’être stockées à -80°C. Les échantillons de tumeurs fraîches sont

récupérés et stockés à -80°C.

Les culots cellulaires sont ensuite lysés, les tumeurs fraiches broyées puis lysées dans les tampons

et les conditions appropriées. Pour l’analyse de l’expression des sous-unités HIF-α et des S1PRs,

les cellules sont lysées dans le tampon suivant : Tris/HCl pH 7,4 50mM, NaCl 120mM, EDTA

1mM, EGTA 6mM, Na4P2O7 15mM, NaF 20mM, NP-40 1%. Ce tampon de lyse est supplémenté en

PMSF 1mM et en cocktail d’inhibiteurs de protéases 1% (Sigma, P3840) extemporanément. Les

siRNA Séquence sens 5’-3’ Fournisseur Conditions d’utilisation siS1P1(a) siS1P1(b) siScramble

CGGUGGUGUUCAUUCUCAU, GCUAUAUCACAAUGCUGAA, GAAGCGCUCUUUACUUGGU GAGUUAGUUCCUGUGAACA Inconnue

Santa Cruz (sc-37086) Sigma Eurogentec

50nM, 72h 40nM, 72h 50nM, 72h

118!

doses de PMSF et de cocktail d’inhibiteurs de protéases sont triplées si l’échantillon est une

tumeur fraîche. Pour l’analyse de l’expression de la cycline D1, les cellules sont lysées dans le

tampon suivant : NaCl 120mM, Tris/HCl pH 7,5 50mM, NP-40 1%, supplémenté en cocktail

d’inhibition de protéases 1%, et en Na3VO4 1mM extemporanément.

La lyse s’effectue dans la glace pendant 20 minutes sous agitation régulière. Dans le cas des

tumeurs fraîches, la lyse s’effectue grâce à cinq cycles de congélation dans l’azote liquide,

décongélation dans de l’eau à température ambiante et agitation. Les lysats sont ensuite

récupérés par centrifugation à 16000g pendant 20 minutes à 4°C. La concentration en protéines

des échantillons est déterminée selon la méthode de Bradford (kit « Bio-Rad Protein Assay », Bio-

Rad). La lecture de l’absorbance à 595nm des échantillons est effectuée en duplicat et les

concentrations en protéines sont déterminées automatiquement par le spectrophotomètre contre

une gamme étalon d’albumine sérique bovine (BSA, Euromedex).

Des échantillons contenant tous la même quantité de protéines sont complétés avec le tampon de

charge approprié. Pour l’analyse de l’expression des facteurs HIF et des S1PRs, les échantillons

sont complétés avec du Laemmli Sample Buffer 2X (Bio-Rad) (1:1, v/v) et du β-mercaptoéthanol

5%. Pour l’analyse de l’expression de la cycline D1, les échantillons sont complétés avec du

tampon de charge Tris/HCl pH 6,8 62,5mM, SDS 2%, glycérol 20%, β-mercaptoéthanol 50mM,

bleu de bromophénol 0,1% (1:5, v/v) et dénaturés à 95°C pendant 5 minutes.

Les protéines sont ensuite séparées sur gel SDS/PAGE à 90V dans un tampon de migration

(Tris/HCl pH 8,5 25mM, glycine 250mM, SDS 0,1%), puis transférées sur des membranes de

nitrocellulose (Amersham) à 250mA pendant 90 minutes dans un tampon de transfert (Tris pH

8,1-8,5 48mM, glycine 39mM, éthanol 20%). Les membranes sont saturées pendant 1 heure en

TBS-Tween 0,1% lait 5% avant d’être incubées avec les anticorps primaires dirigés contre les

protéines d’intérêt (cf. Tableau 9). Après lavages au TBS-Tween 0,1%, les membranes sont

incubées avec les anticorps secondaires couplés à la HRP (HorseRadish Peroxidase). La révélation

est réalisée par chimioluminescence à l’aide du kit Amersham ECL Western Blotting Detection

Reagent (GE Healthcare).

7. Test ELISA

Ce test est réalisé sur des échantillons de plasma murin afin de doser le VEGF humain. Le test est

réalisé selon les recommandations du fournisseur (Invitrogen, #KHG0111). Les échantillons de

plasma murin sont obtenus par centrifugation du sang total des animaux à 1600g pendant 15

minutes à 4°C, puis stockés à -80°C. Tous les échantillons (50µL) sont testés en duplicats. Une fois

les échantillons déposés dans une plaque de 96 puits contenant un anticorps polyclonal anti-

119!

VEGF humain, le VEGF humain de l’échantillon est détecté par l’ajout d’un anticorps monoclonal

anti-VEGF humain biotinylé, puis de streptavidine couplée à la HRP. Après ajout du substrat de

la HRP, la lecture de l’absorbance à 450nm est effectuée à l’aide du spectrophotomètre µQuant®

(Bio-Tek) contre une gamme étalon de VEGF humain standard. L’absorbance mesurée est

proportionnelle à la concentration en VEGF humain présent dans l’échantillon. Une fois les

valeurs d’absorbance corrigées du facteur de dilution, moyennées et imputées de la valeur

d’absorbance du contrôle négatif ou « blanc », on obtient les absorbances « réelles » des

échantillons. Les log10 des concentrations en VEGF humain de chaque échantillon sont alors

obtenus en se référant à la courbe étalon établie à partir des log10 des absorbances « réelles » et

des log10 des concentrations théoriques de la gamme étalon.

8. Dosage de l’activité enzymatique de la sphingosine kinase 1

Le principe du dosage de l’activité enzymatique de la sphingosine kinase 1 repose sur la

quantification de la production de S1P radiomarquée ([γ32P]S1P) produite selon l’équation de

réaction suivante :

sphingosine + ATP + [γ32P] S1P + [γ32P]

La [γ32P]S1P produite est séparée par chromatographie sur couche mince puis révélée par

autoradiographie et quantifiée par un compteur à scintillation (Olivera and Spiegel 1998).

Après lavages au PBS froid, les cellules sont récupérées par grattage. Les cellules sont ensuite

centrifugées à 600g pendant 5 minutes à 4°C. Les culots cellulaires sont lysés dans le tampon

suivant : Tris/HCl pH 7,4 20mM, glycérol 20%, β-mercaptoéthanol 1mM, EDTA 1mM, NaF

15mM, 4-déoxypyrodoxine 0,5mM, β-glycérophosphate 40mM, Na3VO4 1mM. Ce tampon est

supplémenté en PMSF 1mM et en cocktail d’inhibiteurs de protéases 1% extemporanément. La

lyse s’effectue grâce à cinq cycles de congélation dans l’azote liquide, décongélation dans de l’eau

à température ambiante et agitation. Les lysats sont ensuite récupérés par centrifugation à 16000g

pendant 20 minutes à 4°C et les surnageants dosés pour leur concentration en protéines comme

décrit précédemment.

La réaction enzymatique est réalisée en présence de 100µg de protéines dans un volume de

180µL, de 10µl de sphingosine à 50mM (concentration finale : 1mM) et de 10µl d’un mélange

d’ATP 200mM en HEPES, de [γ32P] à 1 µCi (Perkin Elmer) et de MgCl2 400mM. La sphingosine est

€

+SphK1+MgCl2" → " "

120!

préparée de la façon suivante : après prélèvement des 10µL de sphingosine dissoute en éthanol, et

évaporation de l’éthanol sous sorbonne, la sphingosine est reprise en Triton X-100 5% puis

soniquée pendant 5 minutes. Le volume de [γ32P]ATP à prélever dépend de son activité. L’activité

du [γ32P]ATP est déterminée au jour de l’expérience à l’aide de la table de décroissance du 32P

(t1/2(32P)=14,3 jours) fournie par Perkin Elmer. Le volume à est calculé pour obtenir une activité

de 1µCi par condition.

La réaction enzymatique est effectuée à 37°C pendant 30 minutes puis arrêtée par l’ajout de 20µl

d’HCl 1N et de 800µl de CHCl3/CH3OH/HCl (100:200:1). Après centrifugation à 600g pendant 10

minutes, la phase organique inférieure contenant la [γ32P]S1P est récupérée puis lavée par

l’addition de 240µl de CHCl3 et 240µl de KCl 2N. Après une deuxième centrifugation à 600g

pendant 10 minutes, la phase organique inférieure contenant la [γ32P]S1P est récupérée et

évaporée sur la nuit.

Après évaporation, les échantillons sont repris dans 40µl de CHCl3/CH3OH (2:1) et déposés sur

des plaques de silice G60 (VWR). La chromatographie sur couche mince est réalisée en plaçant les

plaques dans une cuve saturée en solution éluante (1-butanol/méthanol/acide acétique/eau

distillée ; 80:20:10:20) pendant 3 heures. Après séchage, les plaques sont autoradiographiées sur la

nuit. L’autoradiographie permet de déterminer la position de la [γ32P]S1P sur la plaque afin de la

récupérer par grattage de la silice. La radioactivité correspondant à chaque échantillon est ensuite

quantifiée par un compteur à scintillation en présence de liquide à scintillation. Un échantillon

dépourvu de [γ32P] est préparé pour servir de blanc, et un aliquot de source de [γ32P]ATP est

compté pour déterminer son activité spécifique comme décrit plus bas.

L’activité enzymatique de la SphK1 correspond à l’activité spécifique de l’enzyme c’est-à-dire à la

quantité de produit formée par unité de temps par milligramme d’enzyme. L’activité

enzymatique de la SphK1 est donc exprimée en picomoles de [γ32P]S1P formées par milligramme

de protéines et par minute de réaction. La quantité de [γ32P]S1P formée correspond à la

radioactivité réelle de l’échantillon (cpm[γ32P]ATP – cpmblanc) normalisée par la quantité de

[γ32P]ATP par rapport à la quantité d’ATP froid (nATP = 200000 pmol).

€

[γ 32P]S1P =cpm

[γ 32P]ATP− cpmblanc

cpm[γ 32P]ATP

/ nATP

121!

L’activité spécifique est ensuite exprimée en picomoles de [γ 32P]S1P générée par milligramme de

protéines (m = 100µg) par minute (t = 30 minutes) grâce à la formule suivante :

9. Test de prolifération cellulaire

Le test utilisé est basé sur la capacité des cellules en prolifération à incorporer la thymidine tritiée

lors de la synthèse de l’ADN. Plus les cellules prolifèrent, plus elles incorporent cet élément

radioactif. La radioactivité est ensuite quantifiée.

Les cellules sont ensemencées à raison de 100.000 cellules par puits dans une plaque 6 puits.

Après 48 heures, la thymidine tritiée (Perkin Elmer) est ajoutée dans le milieu à une concentration

finale de 0,5µCi/ml. L’incubation dure 6 heures à 37 °C. Le milieu est ensuite aspiré et les cellules

rincées au PBS froid. Après deux lavages de 10 minutes par une solution d’acide tricarboxylique

10%, les cellules sont lysées par l’ajout de 1mL d’une solution de NaOH 0,3M 1% SDS. Apres une

incubation de 30 minutes, le lysat est récupéré et placé dans un tube contenant 4ml de liquide à

scintillation, puis la radioactivité est mesurée grâce à un compteur à scintillation.

10. Extraction d’ARN et RT-PCR quantitative

Les ARNs totaux sont extraits à partir de culots cellulaires à l’aide du kit RNeasy (Qiagen) selon

les recommandations du fournisseur. La concentration et la pureté des ARNs sont déterminées

par la mesure de l’absorbance à 260nm et 280nm par un NanoDrop (Thermo). Les cDNA sont

synthétisés par la réaction de transcription inverse à partir d’1µg d’ARN total à l’aide du kit

QuantiTect Primer Assay (Qiagen) selon le protocole du fourniseur. La PCR quantitative est

ensuite réalisée par un thermocycleur ABIPrism 7500 (Applied Biosystems) à l’aide du kit MESA

Green qPCR MasterMix Plus (Eurogentec) selon le protocole du fabricant et à partir des couples

d’amorces spécifiques des gènes ciblés (cf. tableau 11). Les gènes de ménage utilisés sont

ARNPOLII et YWHAZ. La réaction se compose d’une dénaturation initiale de 10 minutes à 95°C,

suivie de 40 cycles de (1) 15 secondes de dénaturation à 95°C, (2) 30 secondes d’hybridation

spécifique à la température adaptée et (3) 30 secondes d’élongation à 72°C. Les résultats sont

analysés par la méthode des ΔCt ou à l’aide de l’algorithme Genorm (Biogazelle).!

€

Activité spécifique =

cpm[γ 32P]ATP

− cpmblanc

cpm[γ 32P]ATP

/ nATP

x1000

m

t

122!

Tableau 11. Séquence des amorces utilisées

Cible Séquence sens 5’—3’ Séquence anti sens 5’—3’ Température d’hybridation

S1P1

S1P2

S1P3

S1P4

S1P5

ARN Pol II YWHAZ

AAATTCCACCGACCCATGTA CACCTGGCGGTACAAAGAAT GCTTCAGGAAATGGAAGCTG CTGCTCTTCACCGCCCTGGC GTGAGGTGGGAGCCATAGAA GCACCACGTCCAATGACAT ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA

AGTTATTGCTCCCGTTGTGG GTCAAGTGGCAGCTGATGAA TCAGGATGCTGTGAAACTGC GAAGCCGTAGACGCGGCTGG TTGGCTGAGTCTCCCAGAGT GTGCGGCTGCTTCCATAA CCGCCAGGACAAACCAGTAT

60°C 60°C 63°C 63°C 60°C 60°C-63°C 60°C-63°C

11. Coloration à l‘hémalun-éosine

Les tumeurs sont récupérées, fixées pendant 16 heures à 4°C dans une solution de PBS-

paraformaldéhyde 4% puis déshydratées et incluses en paraffine à l’aide de l’automate Excelsior

ES Tissue Processor (Thermo Scientific). Des coupes de tumeur de 5µm d’épaisseur sont réalisées

à l’aide d’un microtome et montées sur des lames Superfrost Plus (EMS). Les coupes de tumeur

sont déparaffinées dans de l’Histoclear (National Diagnostics) puis réhydratées dans des bains

successifs d’éthanol et d’eau. Les coupes sont ensuite incubées dans une solution d’hémalun de

Mayer (Sigma) pendant 3 à 4 minutes, dans une solution bleuissante (H2O-NH3) pendant 1

minute et dans une solution d’éosine-orange pendant 2 minutes. Les coupes sont déshydratées

dans de l’éthanol, incubées dans de l’Histoclear avant d’être recouvertes d’une lamelle en

présence de milieu de montage (CoverSafe, American Master Tech Scientific).

12. Immunohistochimie et immunofluorescence

Les tumeurs sont récupérées, fixées pendant 16 heures à 4°C dans une solution de PBS-

paraformaldéhyde 4% puis déshydratées et incluses en paraffine à l’aide de l’automate Excelsior

ES Tissue Processor. Des coupes de tumeur de 5µm d’épaisseur sont réalisées à l’aide d’un

microtome et montées sur des lames Superfrost Plus. Les coupes sont ensuite déparaffinées dans

un four à 60°C pendant 1 heure puis dans de l’Histoclear (2 fois 5 minutes) avant d’être

réhydratées dans des bains successifs d’éthanol et d’eau.

123!

12.1. Immunohistochimie

Les coupes sont incubées dans une solution de peroxyde d’hydrogène 3% pendant 10 minutes

dans le but d’inhiber l’activité des peroxydases endogènes. Afin de démasquer les épitopes, les

coupes sont incubées pendant 15 minutes à 90°C dans un tampon citrate pH 6 10mM

préalablement chauffé à 90°C, puis laissées à refroidir pendant 30 minutes dans cette même

solution. Les coupes sont saturées pendant 1 heure dans un milieu de blocage (Maxblock

blocking medium, Active Motif) avant d’être incubées avec les anticorps primaires dirigés contre

les protéines d’intérêt (cf. Tableau 9). Après lavages au PBS ou TBS, les coupes sont incubées avec

les anticorps secondaires couplés à la HRP (cf. Tableau 9) avant d’être mises présence du substrat

de la HRP (3,3-diaminobenzidine tablets, Sigma) pendant 5 à 10 minutes. Les coupes sont ensuite

contre-colorées à l’aide d’une solution d’hématoxyline de Mayer (Sigma) avant d’être recouvertes

d’une lamelle en présence de milieu de montage (CoverSafe, American Master Tech Scientific).

12.2. Immunofluorescence

Afin de démasquer les épitopes, les coupes sont incubées pendant 15 minutes à 90°C dans un

tampon citrate pH 6 10mM préalablement chauffé à 90°C, puis laissées à refroidir pendant 30

minutes dans cette même solution. Les coupes sont saturées pendant 1 heure dans un milieu de

blocage (Maxblock blocking medium, Active Motif) avant d’être incubées avec les anticorps

primaires dirigés contre les protéines d’intérêt (cf. Tableau 9). Après lavages au PBS, les coupes

sont incubées avec les anticorps secondaires puis tertiaires (cf. Tableau 9). Les coupes sont ensuite

incubées pendant 3 minutes avec du 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 300nM avant d’être

recouvertes d’une lamelle en présence de milieu de montage (Mowiol).

13. Analyse de l’hypoxie intratumorale

L’hypoxie intratumorale est caractérisée après injection de pimonidazole (Hypoxyprobe®) en

intra-péritonéal à la dose de 60mg/kg, 30 minutes à 1h30 avant le sacrifice des animaux. Les

adduits de pimonidazole, représentatifs des zones d’hypoxie, sont détectés par

immunohistochimie (cf. Tableau 9).

124!

14. Analyse et quantification des immunomarquages

!Les lames sont scannées à l’aide du Nanozoomer 2.0-RS (Hamamatsu). Les conditions

d’acquisition sont optimisées en fonction des marquages. Au moins deux champs de 0,75mm2

représentatifs de chaque coupe de tumeur sont utilisés pour l’analyse et la quantification des

immunomarquages.

15. Numération formule sanguine

Un prélèvement sanguin rétro-orbital est effectué après anesthésie des animaux à l’isoflurane. La

numération formule sanguine est ensuite réalisée à l’aide de l’appareil ABX Micros 60

Haematology Analyzer, à partir d’un échantillon de 20 à 30µL de sang.

16. Analyse statistique

Les analyses statistiques des résultats sont réalisées à l’aide du logiciel Prism 5 (GraphPad

Software). Le test utilisé est le test de Student et le degré de significativité est indiqué (ns : non

significatif : p>0,05 ; * : p<0,05 ; ** : p<0,01 ; *** : p<0,001).

125!

Résultats

Expérimentaux

126!

127!

1. La voie SphK1/S1P, un nouveau régulateur clé de HIF-2α dans les ccRCC

1.1. Introduction

La voie SphK1/S1P est impliquée dans de nombreux processus physiologiques et

physiopathologiques tels que le cancer (Xia et al. 2000, Maceyka et al. 2012). Une fois formée, la

S1P peut agir sur ces cibles intracellulaires (Hait et al. 2009, Alvarez et al. 2010), ou bien, après

avoir été sécrétée dans le milieu extracellulaire par des transporteurs membranaires tels que

Spns2 (Kawahara et al. 2009, Nagahashi et al. 2013), elle peut agir de manière autocrine ou

paracrine en se liant à l’un de ses cinq récepteurs couplés aux protéines G, les S1PRs (Takabe et al.

2008). La surexpression de la SphK1 dans de nombreux cancers, à l’image des ccRCC, étant

souvent corrélée à une diminution de la survie des patients (Zhang et al. 2014c), la voie

SphK1/S1P constitue une cible thérapeutique pertinente en cancérologie (Cuvillier 2008). Ainsi,

plusieurs études précliniques ont établi que l’inhibition de la SphK1 permet de diminuer la

croissance tumorale et de sensibiliser des tumeurs à la chimiothérapie ou à la radiothérapie

(Pchejetski et al. 2008, Kapitonov et al. 2009, Pchejetski et al. 2010). Par ailleurs, des études ont

montré que la neutralisation de la S1P extracellulaire par le Sphingomab®, un anticorps

monoclonal anti-S1P, permet de diminuer la croissance tumorale et la dissémination métastatique

dans plusieurs modèles tumoraux (Visentin et al. 2006, Ponnusamy et al. 2012, Ader et al. 2015),

dont un modèle de ccRCC (Zhang et al. 2015).

L’hypoxie est une caractéristique de la plupart des tumeurs solides et constitue un facteur de

mauvais pronostic (Semenza 2012a). Elle favorise l’agressivité tumorale via l’activation des

facteurs de transcription HIF-1 et HIF-2, chacun constitués d’une sous-unité α stabilisée en

hypoxie et d’une sous-unité β exprimée constitutivement. Ces facteurs régulent l’expression de

nombreux gènes qui favorisent notamment l’angiogenèse, la glycolyse, la croissance tumorale, la

dissémination métastatique et la résistance thérapeutique (Semenza 2012a). Alors que HIF-1α est

exprimée de manière ubiquitaire, HIF-2α a une expression plus réduite qui inclut les tissus

fortement vascularisés, tels que les cellules épithéliales rénales (Wiesener et al. 2003). De plus,

HIF-1α et HIF-2α peuvent avoir des fonctions distinctes dans la progression tumorale (Keith et al.

2012), en particulier dans les ccRCC où HIF-2α promeut l’acquisition d’un phénotype tumoral

plus agressif (Gordan et al. 2008).

Notre équipe a montré pour la première fois que la SphK1 constitue un régulateur clé de HIF-1α

en hypoxie dans différentes lignées cellulaires tumorales humaines (Ader et al. 2008). Dans ces

modèles, la SphK1 inhibe la dégradation protéasomale de HIF-1α via la régulation de la voie

128!

Akt/GSK3β. Plus récemment, nous avons montré que la neutralisation de la S1P extracellulaire

par le Sphingomab® dans un modèle murin de cancer de la prostate inhibe HIF-1α, entraine une

normalisation du réseau vasculaire tumoral qui favorise l’oxygénation de la tumeur et augmente

ainsi l’efficacité du docétaxel, la chimiothérapie de référence pour les cancers de la prostate (Ader

et al. 2015). Sachant que nos résultats préliminaires semblent indiquer qu’en hypoxie, la SphK1

contrôle le taux intracellulaire de HIF-2α dans diférentes lignées tumorales, et au vu de

l’importance de HIF-2α dans les ccRCC, nous avons déterminé les mécanismes moléculaires

impliqués dans la régulation de HIF-2α par la SphK1. Ce travail est actuellement soumis pour

publication.

!

129!

1.2. Article soumis pour publication

!

Essential!role!for!SphK1/S1P!signaling!to!regulate!hypoxia8inducible!factor!2!α!expression!and!activity!

in!cancer!

!

Pierre!Bouquerel!1,2,4,*,!Cécile!Gstalder!1,2,4,*,!Jennifer!Laurent!1,2,4,!Leyre!Brizuela>Madrid!1,2,4,!Roger!A.!

Sabbadini!5,!Bernard!Malavaud!1,2,3,4,!Isabelle!Ader!1,2,4,!#!and!Olivier!Cuvillier!1,2,4,!#!

!1!CNRS,!Institut!de!Pharmacologie!et!de!Biologie!Structurale,!Toulouse,!France!2!Université!de!Toulouse,!UPS,!IPBS,!Toulouse,!France!3!Institut!Universitaire!du!Cancer!Toulouse!Oncopôle,!Toulouse,!France!4!Equipe!Labellisée!Ligue!contre!le!Cancer!5!Lpath!Inc.,!San!Diego,!CA,!USA!

*,#!These!authors!have!contributed!equally!to!this!study!

!

Running!title:!S1P!and!hypoxia>inducible!factor!2α!signaling!

!

Keywords:!sphingosine!1>phosphate,!sphingomab,!phospholipase!D,!HIF>2,!clear!cell! renal!carcinoma,!

VHL,!mTOR!!

!

Address!correspondence!to:!

Olivier!Cuvillier,!PhD!

Sphingolipid!and!Cancer!Research!Lab,!Institut!de!Pharmacologie!et!de!Biologie!Structurale,!CNRS!

UMR!5089,!!

205!route!de!Narbonne,!31077!Toulouse,!France!

E>mail:!olivier.cuvillier@ipbs.fr!or!olivier.cuvillier@inserm.fr!

or!

Isabelle!Ader!Perarnau,!PhD!;!STROMALab,!UMR5273!CNRS!UPS!EFS!INSERM!U1031,!Toulouse,!France;!

E>mail:!isabelle.ader>perarnau@inserm.fr!!

!

Conflict!of!interest!statement:!!Authors!would!like!to!disclose!that!Dr.!Roger!A.!Sabbadini!is!a!founder!

of!Lpath,!and!has!stock!in!the!company!and!is!an!inventor.!

!

!

!

130!

ABSTRACT!

!

Here,! we! report! the! first! evidence! that! the! sphingosine! kinase>1/sphingosine! 1>phosphate!

(SphK1/S1P)!signaling!regulates!the!transcription!factor!hypoxia!inducible!HIF>2α!in!diverse!cancer!cell!

lineages!notably!cell!renal!carcinoma!(ccRCC),!where!HIF>2α!has!been!established!as!a!driver!of!a!more!

aggressive!disease.!Under!hypoxic!conditions!or!in!!

ccRCC! lacking! a! functionnal! VHL! gene! and! overexpressing! HIF>2α,! SphK1! activity! controls! HIF>2α!

expression! and! transcriptional! activity! through! a! ROS>dependent! phospholipase! D! (PLD)! driven!

mechanism.!SphK1! silencing!promotes!a!VHL>independent!HIF>2α! loss!of!expression!and!activity! and!

reduces!cell!proliferation!in!ccRCC.!Importantly,!down>regulation!of!SphK1!decreases!the!rate!of!HIF>2α!

protein!synthesis,!and!is!associated!with!impaired!Akt,!mTOR,!p70!S6K!and!4EBP1!phosphorylation!in!

ccRCC.! Taking! advantage! of! a! monoclonal! antibody! neutralizing! extracellular! S1P,! we! show! that!

inhibition! of! S1P! extracellular! signaling! blocks! HIF>2α! accumulation! in! ccRCC! cell! lines,! an! effect!

mimicked!when!the!S1P!transporter!Spns2!is!silenced.!!

These!findings!demonstrate!that!SphK1/S1P!signaling!may!act!as!a!canonical!regulator!of!HIF>2α!

expression!in!ccRCC,!giving!support!to!its!inhibition!as!a!therapeutic!strategy!that!could!contribute!to!

reduce!HIF>2!activity!in!ccRCC.!

!

INTRODUCTION!

!

The!bioactive!sphingolipid!metabolite,!sphingosine!1>phosphate!(S1P),! is!a!critical!regulator!of!

multifarious! physiological! and! pathophysiological! processes! including! cancer! 32,! 43,! 45.! S1P! is! mainly!

formed!by!the!phosphorylation!of!sphingosine,! the!backbone!of!sphingolipids,!by!the!pro>oncogenic!

sphingosine!kinase>1!isoform!62.!S1P!is!a!ligand!for!five!high>affinity!G!protein>coupled!receptors!(S1P1>

5),!with! specific! effects! dictated!by! the! expression!pattern!of! S1P! receptor! subtypes! expressed! in! a!

particular!tissue56.!S1P!is!produced!intracellularly!and!exerts!its!paracrine!or!autocrine!effects!by!being!

secreted! by! specific! transporters! such! as! spinster! 2! (Spns2)! 18,! 29,! 35.! Alternative! GPCR>independent!

signaling!of!S1P!also!exists!59!with!recent!studies!establishing!direct!modulation!of!several!intracellular!

proteins! 3,! 22.! In! cancer,!S1P!metabolism! is!often! found! to!be!dysregulated!directing!attention! to! the!

SphK1/S1P!signaling!pathway!as!a!target!for!anti>cancer!drug!discovery!14,!45,!49.!SphK1!expression!is!up>

regulated! in! a! number! of! solid! tumors,! and! high! SphK1! expression! is! correlated! with! a! significant!

decrease!in!survival!rate!in!patients!with!several!forms!of!cancer!64.!In!some!cases,!as!in!ccRCC,!plasma!

levels!of!S1P!are!substantially!elevated!compared!to!healthy!control! levels!63.!A!number!of!preclinical!

studies!have!established! that!pharmacological! inhibition!of! SphK1! could!be!efficacious! in!decreasing!

tumor! size!or! sensitize! to! therapeutics! 28,! 39,! 41,! 42.! Interestingly,! the!anti>cancer! activity!of! an!anti>S1P!

131!

monoclonal!antibody!(sphingomabTM)! 36,!which!neutralizes!S1P!and! inhibits! its!extracellular!signaling,!

provides! evidence! of! the! importance! of! exogenous! S1P! in!mediating! tumor! growth! and!metastatic!

potential!2,!44,!60,!including!murine!models!of!ccRCC!63.!

Hypoxia! is! a! characteristic! of! solid! tumors! and! the! adaptation! of! cancer! cells! to! hypoxia! is!

instrumental! in! the!development!of! aggressive!phenotype!and!associated!with!a!poor!prognostic! in!

patients!51.!At!the!cellular!level,!the!adaptation!to!hypoxia!is!predominantly!mediated!by!the!hypoxia>

inducible! factors! (HIFs),! consisting!of! an!oxygen>sensitive!α>subunit! and! a! constituvely! expressed!β>

subunit,!that!regulate!the!expression!of!target!genes!promoting!angiogenesis,!glycolysis,!metastasis,!

increased!tumor!growth!and!resistance!to!treatments!51.!HIF>1α!and!HIF>2α!are!the!best!characterized!

HIF>α! subunit! 52.!While!HIF>1α! is! ubiquitously! expressed,!HIF>2α!has! a!more! limited! tissue!expression!

and!is!particularly!detected!in!highly!vascularized!organs!or!hypoxic!tissues!including!kidney!epithelial!

cells!61.!Despite!their!extensive!sequence!similarity!and!co>expression!in!various!cancer!cell!types,!HIF>

1α!and!HIF>2α!play!non>overlapping!roles!in!tumor!progression!30.!The!distinct!roles!of!HIF>1α!and!HIF>

2α! in! promoting! tumor! growth! have! been! mainly! defined! in! von! Hippel>Lindau! (VHL)! disease>

associated!clear!cell!renal!carcinoma!(ccRCC)!26,!which!results!in!a!constitutive!expression!of!either!HIF>

1α!and!HIF>2α!or!HIF>2α!alone,!and!where!the!role!for!HIF>2α!as!a!driver!of!a!more!aggressive!disease!

has!been!firmly!established!21,!46.!

We! previously! identified! SphK1/S1P! signaling! as! a! new! modulator! of! HIF>1α! activity! under! hypoxic!

conditions! owing! to! a! decreased! proteasome! degradation! of! HIF>1α! subunit! mediated! by! the!

Akt/GSK3β!pathway! in!various!cancer!cell!models! 1.!More! recently,!we! reported! in!a!prostate!cancer!

animal! model! that! sphingomab,! a! monoclonal! antibody! neutralizing! extracellular! S1P,! could! reduce!

hypoxia!and!associated!vascular!network!malfunction!by!interfering!with!HIF>1!activity!thus!enhancing!

delivery!and!efficacy!of!docetaxel,!the!standard!chemotherapy!2.!!!

For! the! first! time,! we! report! that! the! SphK1/S1P! signaling! pathway! may! act! as! a! canonical!

regulator! of! HIF>2α! expression! in!multiple! cancer! cell! lineages! (lung,! prostate,! glioma)! as!well! as! in!

ccRCC! cell! lines! (CAKI>1,! A498! and! 786>O)! representing! the! sub>groups! found! in! human! clinic.!

Therefore,! we! suggest! that! targeting! the! SphK1/S1P! signaling! represents! a! strategy! that! could!

potentially! be! exploited! in! therapeutic! approaches! to! decrease! HIF>2! activity! in! cancer! and! more!

particularly! in! ccRCC.! The! humanized! version! of! the! anti>S1P! mAb,! sonepcizumab,! is! currently! in! a!

phase!II!trial!in!RCC!patients!(www.clinicaltrials.gov!Identifier,!NCT00661414).!

!

!

!

!

!

132!

MATERIALS!AND!METHODS!

!

Chemicals!and!reagents!

Culture! medium! and! antibiotics! were! from! Lonza! (Basel,! Switzerland).! Serum! was! from! Perbio!

(Brebières, France).!SKI! II! SphK1! inhibitor! (CAS!Number!312636>16>1)! and!MG132!were!obtained! from!

Merck! Millipore! (Saint>Quentin! en! Yvelines,! France).! The! murine! monoclonal! anti>S1P! antibody,!

sphingomabTM,! was! as! described! previously! 36.! [γ>32P]! ATP! and! [9,10>3H(N)]>palmitic! acid! were! from!

Perkin! (Courtaboeuf,! France).! Silica! gel! 60! high! performance! TLC! plates!were! from! VWR! (Fontenay!

sous!Bois,!France).!All!other!reagents!were!from!Sigma!(Saint>Quentin!Fallavier,!France).!

Cell!lines!!

Human!prostate!PC>3!and! lung!A549!cell! lines!were!obtained! from!DSMZ! (Braunschweig,!Germany).!

Human! U87! glioblastoma! and! clear! cell! renal! carcinoma! (ccRCC)! CAKI>1! cells! were! from! ATCC!

(Molsheim,! France).! ! Human! ccRCC! A498! and! 786>O! were! kindly! supplied! by! Dr! G.! Melillo! (NCI,!

Frederick,! USA).! Cells! were! cultured! in! RPMI! containing! 10%! FBS! at! 37°C! in! 5! %! CO2! humidified!

incubators.!Cell! lines!were!routinely!verified!by!the!following!tests:!morphology!examination,!growth!

analysis! and! mycoplasma! detection! (MycoAlertTM,! Lonza).! All! experiments! were! started! with! low>

passaged!cells!(<15!times).!Hypoxia!(0.1%!O2,!5%!CO2,!94.5%!N2)!was!achieved!using!an!In!Vivo2!hypoxic!

workstation!(Ruskinn,!Bridgend,!UK).!

RNA!interference!experiments!

Transient! interference! was! achieved! by! double>stranded! human! siRNAs! 5’>

GGGCAAGGCCUUGCAGCUCdTdT>3’!(siSphK1)!40;!5’>AAGGAAACCUAGUAACUGAGC>3’!(siPLD1)!and!PLD2!

5’>AAUGGGGCAGGUUACUUUGCU>3‘! (siPLD2)! 37;! and! ! MISSION predesigned siRNAs! from! Sigma! for!

human! Spns2 Spns2 : Spns2 siRNAa : 5’-CGCUCAUGCUCUGCCCUUUdTdT-3’; and Spns2 siRNAb : 5’-

CACUCAUCCUCAUUCUGGUdTdT-3’ 2.!Aleatory!sequence!scrambled!siRNA!(siScr)!was!from!Eurogentec!

(Angers,! France).! Transfections! were! carried! out! using! Lipofectamine! 2000! in! OPTI>MEM! medium!

according!to!the!manufacturer’s!instructions!(Invitrogen,!Villebon>sur>Yvette,!France).!

SphK1!and!Phospholipase!D!enzymatic!assays!

The! protocol! for! the! determination! of! SphK1! enzymatic! activity! has! been! described! in! details!

previously!10.!PLD!activity!was!determined!as!reported!by!9!with!slight!modifications.!Cells!were!treated!

with!the!primary!alcohol,! 1>butanol! (0.3%),! instead!of!ethanol! (1%).!The!TLC!plates!were!developed! in!

this! case! with! the! superior! phase! from! a! mixture! of! ethylacetate/isooctan/acetic! acid/water!

(55/25/10/50).!!

Reporter!Gene!Assay!!!

For! luciferase! assays,! cells! were! plated! in! 24! wells! plates! and! transfected,! using! Lipofectamine!

133!

(Invitrogen),!with!150!ng!of!the!reporter!vector!(pRE>tk>LUC)!containing!three!copies!of!the!HRE!from!

the!erythropoietin!gene!and!50!ng!of!Renilla! luciferase!plasmid!DNA,!as!an! internal!control.!Twenty>

four! hours! after! transfection,! cells! were! incubated! under! normoxic! (20%! O2)! or! hypoxic! conditions!

(0.1%! O2)! for! 16! h.! Cells! were! then! lysed! and! luciferase! activities! were! measured! using! the! Dual!

Luciferase!Assay!Kit! (Promega)! following!manufacturer’s! recommendations.!Results!were!quantified!

with! a!MicroBeta! TRILUX! luminescence! counter! and! normalized! values!were! expressed! as! the! fold!

induction!over!control!cells.!

Western8blot!analysis!and!antibodies!

Rabbit! anti>HIF>2α! (Novus,! Littleton,! CO),! rabbit! anti–GLUT>1! (ThermoScientific,! Villebon>sur>Yvette,!

France),!mouse!cyclin!D1,!rabbit!p70!S6K,!rabbit!anti>phospho>p70!S6K!(Thr389),!rabbit!anti>phospho>

p70!S6K!(Thr421/Ser424),!rabbit!anti>mTOR,!rabbit!anti>phospho>mTOR!(Ser2448),!rabbit!anti>phospho!

4E>BP1! (Ser65),! rabbit! anti>Akt,! rabbit! anti>phopho>Akt! (Ser473)! (Cell! Signaling! Technology,!Danvers,!

MA),! rabbit! anti>Spns2! (Sigma)! were! used! as! primary! antibodies.! Proteins! were! visualized! by! an!

enhanced! chemiluminescence!detection! system! (Perbio)! using! anti>rabbit! or! anti>mouse!horseradish!

peroxidase>conjugated! IgG! (Bio>Rad).! Equal! loading! of! protein! was! confirmed! by! probing! the! blots!

with! anti>α>tubulin! (Santa! Cruz! Biotechnology,! Santa! Cruz,! CA)! antibody.! Densitometry! quantitation!

was!determined!using!Image!J!software!(NIH,!Bethesda,!MD).!

Quantitative!Real!Time!PCR!

Total!RNA!was!isolated!using!the!RNeasy!minikit!(Qiagen,!Courtaboeuf,!France)!and!1!µg!were!reversed!

transcribed!to!cDNA!using!the!SuperScript!Frist!Stand!Synthesis!System!(Invitrogen).!Quantitative!real!

time! PCR! was! performed! using! the! MESA! Blue! PCR! Master! mix! (Eurogentec).! Reactions! were!

performed! using! hSphK1! specific! primers! (forward! primer! 5’>CTGGCAGCTTCCTTGAACCAT>3’;reverse!

primer,! 5’>TGTGCAGAGACAGCAGGTTCA>3’),! hHIF>2>specific! primers! (forward! primer,! 5’>

TCCCACCAGCTTCACTCTCT>3’;reverse! primer,! 5’>TCAGAAAAAGGCCACTGCTT>3’),! and! actin>specific!

primers! (forward! primer,! 5’>ATTGGCAATGAGCGGTTCC>3’;! reverse! primer,! 5’>

GGTAGTTTCGTGGATGCCACA>3’).! For! analysis,! all! genes! were! normalized! to! expression! of! zeta!

polypeptide!(YWHAZ)!gene!as!endogenous!control.!!

Statistical!analysis!

The! statistical! significance! of! differences! between! the! means! of! two! groups! was! evaluated! by!

unpaired!Student’s!t!test.!All!statistical!tests!were!two>sided,!and!the! level!of!significance!was!set!at!

P<0.05.!Calculations!were!done!using!Prism!6!(GraphPad!Software,!San!Diego,!CA).!

!

!

!

!

134!

RESULTS!

!

Sphingosine! kinase81! activity! regulates! HIF82α! expression! under! hypoxia! in! multiple! cancer! cell!

lineages!

To!address!whether!SphK1!has!a! regulatory!role! in!HIF>2α!expression!under!hypoxia,!a!siRNA!

strategy! targeting! SphK1! (siSphK1)!was! used.! As! previously! reported! 1,! SphK1! activity!was!markedly!

decreased! (60>90%! range)! in!all! cancer! cell! lines! (prostate!PC>3,! lung!A549,!glioblastoma!U87,! ccRCC!

CAKI>1!and!A498)!treated!with!siSphK1!compared!to!scrambled!siRNA!(siScr)!(Fig!1A).! In!all!cell! lines,!

hypoxia!was!associated!with!a! remarkable!expression!of! !HIF>2α,!which!was!significantly! reduced!by!

siSphK1!treatment!(Fig!1B8F),!suggesting!that!SphK1!regulates!HIF>2α!in!addition!to!HIF>1α!as!formerly!

published!1,!12,!27.!!Considering! the! critical! role! of! HIF>2α! in! ccRCC! 21,! 26,! the! molecular! mechanisms! of! HIF>2α!

regulation!by!SphK1!were!further! investigated!in!three!ccRCC!cell! lines,!each!representing!one!of!the!

sub>groups! found! in! human! clinic! (expressing! either! HIF>1α! and! HIF>2α! or! HIF>2α! alone).! 786>0! and!

A498!ccRCC!cells!lack!a!functional!VHL!gene!and!express!only!HIF>2α,!whereas!CAKI>1!cells!(pVHL!wild>

type)! can! produce! both! HIF>1α! and! HIF>2α.! Noteworthy,! in! VHL>defective! A498! where! HIF>2α! is!

constitutively! present! under! normoxia! due! to! a! lack! of! degradation,! the! silencing! of! SphK1! also!

inhibited!its!expression!in!normoxic!conditions!(Fig!1F).!

!

Involvement!of!Phospholipase!D!in!regulating!HIF82α!SphK18driven!expression!in!ccRCC!

Because!phospholipase!D!(PLD)!activity!has!been!involved!in!the!control!of!HIF>2α!expression!

in! ccRCC! 57! and! is! an! upstream! regulator! of! SphK1! in! a! different! physiological! context! 9,! we! next!

examined! the! interactions! between! PLD! and! SphK1! signaling! with! regard! to! HIF>2α! expression.! In!

hypoxic!CAKI>1,!A498!cells!(Fig!2A)!and!786>O!cells!(Suppl.!Fig!1A),!an!early!transient! increase! in!PLD!

activity! (peaking! at! 15>30! min)! followed! by! activation! of! SphK1! (peaking! at! 60! min)! was! observed.!

Accordingly,!accumulation!of!HIF>2α!did!not!occur!before!2>3!h!of!hypoxia!in!CAKI>1!cells!(Fig!2A,!inset).!

Confirming!that!SphK1!activation!was!a!consequence!of!PLD!stimulation,!butan>1>ol!(1>ButOH),!a!potent!

inhibitor!of!the!PLD,!markedly!inhibited!SphK1!activity!in!all!ccRCC!cell!lines!(Fig!2B!and!Suppl.!Fig!1B).!

To!rule!out!any!possible!nonspecific!effect!of!the!alcohols!on!SphK1!activity,!cells!were!treated!in!the!

presence! of! t>butanol! (t>ButOH),! a! tertiary! alcohol,! which! is! not! a! substrate! for! PLD! inhibition.! As!

expected,!t>ButOH!did!not!alter!SphK1!activity! in!ccRCC!cell! lines!(Fig!2B!and!Suppl.!Fig!1B).!Unlike!t>

ButOH,!1>ButOH!markedly!inhibited!HIF>2α!expression!in!hypoxic!CAKI>1!cells!(Fig!2C,!left),!as!well!as!in!

normoxic!and!hypoxic!A498!cells!(Fig!2C,!right)!and!in!786>0!cells!(Suppl.!Fig!1C).!To!investigate!which!

PLD! isozyme!could!be! involved! in! the!PLD/SphK1/HIF>2α!signaling!sequence,!siRNAs!directed!to!PLD1!

and!PLD2!isoforms!were!used!37.!A!roughly!50%!PLD!knock>down!in!CAKI>1,!A498!and!in!786>0!cells!was!

135!

achieved! without! additive! effect! when! both! siRNAs! were! combined! (Suppl.! Fig! 2).! Under! hypoxia,!

both!PLD1!and!PLD2!siRNAs!significantly!reduced!>!although!not!to!the!same!extent!>!SphK1!activity!in!

CAKI>1! (Fig! 2D,! left),! A498! (Fig! 2D,! right)! and! 786>0! cells! (Suppl.! Fig! 1D).! Accordingly,! the! down>

regulation!of!SphK1!activity!was!accompanied!by!a!marked!reduction! in!HIF>2α!expression! in!hypoxic!

CAKI>1!cells!(Fig!2E,!left),!as!well!as!in!normoxic!and!hypoxic!A498!cells!(Fig!2E,!right).!Collectively,!this!

data!suggests!that!both!PLD1!and!PLD2! isozymes!are! likely!required!for!regulation!of!HIF>2α!through!

SphK1!signaling!in!ccRCC!cell!lines.!

!

!

Figure!1!8!SphK1!silencing!prevents!HIF82α !accumulation!in!multiple!human!cancer!cell!lines!under!hypoxia!!A,!Prostate!(PC>3),! lung!(A549),!brain!(U87)!and!renal!cancer!(CAKI>1!and!A498)!cells!were!transfected!with!20!nmol/L! of! siSphK1! or! scrambled! (siScr)! for! 72h! and! then! tested! for! SphK1! activity.! Columns,! mean! of! three!independent!experiments;!bars,!SEM.!**,!P<0.01;!***,!P<0.001.!B8F,!PC>3! (B),!A549!(C),!U87!(D),!CAKI>1! (E)!and!A498!(F)!cells!were!untreated!or! treated!with!20!nmol/L!of!siSphK1!or!scrambled!(siScr)! then! incubated!under!normoxia! or! hypoxia! for! an! additional! 6h.! HIF>2α! expression!was! analyzed! by! immunoblotting.! Similar! results!were!obtained!in!at!least!three!independent!experiments,!and!equal!loading!was!monitored!using!antibody!to!α>tubulin.!!

!

!

!

0

50

100

150

Sph

K1

activ

ity(%

of u

ntre

ated

cel

ls)

C.

B.

D.

Bouquerel et al. (Fig 1)

A.

PC-3

siScr siSphK1

A549

***

U87 CAKI-1 A498

E. F.

*** ***

***

**

HIF-2!

Tubulin

PC-3 1 0.2 0.9

HIF-2!

Tubulin

U87 1 0.1 1.1

HIF-2!

Tubulin

A498 1 0.3 1.0

HIF-2!

Tubulin

A549 1 0.2 1.1

hypoxia normoxia

HIF-2!

Tubulin

CAKI-1 1 0.2 0.9

hypoxia normoxia

hypoxia normoxia

hypoxia normoxia hypoxia normoxia

136!

The!PLD/SphK1!signaling!is!activated!under!hypoxia!via!a!ROS8dependent!mechanism!in!ccRCC!

We! previously! reported! that! the! ROS! scavenger,! N>acetylcysteine! (NAC),! could! markedly!

prevent!HIF>1α! accumulation!under! a! SphK1>dependent!manner! in! hypoxic! cancer! cells! 1.! In!order! to!

establish! that! endogenous! ROS! levels! could! affect! the! PLD/SphK1/HIF>2α! signaling! pathway,! ccRCC!

cells!were!treated!with!the!antioxidants!NAC!and!catalase!(CAT).!Both!NAC!and!CAT!markedly!reduced!

the! expression! of!HIF>2α! under! hypoxia! in! CAKI>1! (Fig! 3A),! A498! (Fig! 3C)! and! 786>O! (Suppl.! Fig! 3A)!

cells.! In! line!with!studies!showing!that!ROS!stimulate!PLD!53!and!SphK1!activity! 1,!NAC!and!CAT!could!

abrogate!both!PLD!and!SphK1!activation! in!hypoxic!CAKI>1!(Fig!3B),!A498!(Fig!3D)!and!786>O!(Suppl.!

Fig!3B)!cells.!Taken!together,!these!data!suggest!that!PLD/SphK1!signaling!is!a!downstream!target!of!

ROS!during!hypoxia.!

!

SphK1!silencing!promotes!a!VHL8independent!HIF82α!loss!of!activity!and!reduced!cell!proliferation!in!

ccRCC!!

To!establish!if!SphK1!silencing!was!correlated!with!an!inhibition!of!HIF>2!transcriptional!activity,!

VHL>defective! A498! and! 786>O! cells! ! known! only! to! express! HIF>2α! (vis>à>vis! HIF>1α)! under! either!

normoxic!and!hypoxic!conditions!7,!33!were!used!to!avoid!the!confounding!role!of!HIF>1α!we!previously!

reported!to!be!regulated!by!SphK1!activity!1.!!Accordingly!in!both!VHL>defective!A498!and!786>O!cells,!

SphK1!silencing!was!associated!with!a!decreased!HIF2α!protein!expression!(Fig!4A,!right).!The!role!of!

HIF>2α! transcriptional!activity!was! further! investigated!by!a! transient>transfection!assay!with!an!HRE!

reporter!gene!(pHRE>Luc)!for!HIF>2α.!Accordingly,!HRE>mediated!HIF>2α!!transcription!was!remarkably!

decreased! in!A498!and!786>O!cells! treated!with! siSphK1! (Fig!4A,! left)! in!both!normoxic!and!hypoxic!

conditions.!We! next! analyzed! the! level! of! GLUT>1! and! cyclin!D1,! two!well>established! specific! target!

proteins! of! HIF>2α! in! VHL>defective! ccRCC! 5,! 47.! In! both! normoxic! and! hypoxic! conditions,! SphK1!

silencing!co>occured!with!significantly!reduced!levels!of!glucose!transporter!GLUT>1!(Fig!4B)!and!cyclin!

D1!(Fig!4C)! in!both!cell! lines.!Cyclin!D1! is!an! important!regulator!of!cell!cycle!progression!and! in!vitro!

and! in! vivo! data! have! demonstrated! that! HIF>2α>only>expressing! ccRCC! cells! proliferate! faster! than!

their!HIF>2α!and!HIF>1α!co>expressing!counterparts!8,!20.!Therefore,!we!next!assessed!cell!proliferation!

in! SphK1>silenced! VHL>defective! ccRCC! cells.! [3H]Thymidine! incorporation! assay! clearly! showed! that!

SphK1>silenced!A498!and!786>O!cells!proliferated!much!slower! than! their! siScr>silenced!counterparts!

(Fig! 4D,! left)! and! showed! a! survival! disadvantage! (Fig! 4D,! right)! in! both! normoxic! and! hypoxic!

conditions!in!line!with!the!findings!that!HIF>2α!!likely!contributes!to!tumor!cell!survival!7.!

!

!

!

137!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Figure!2!8!Phospholipase!D!regulates!SphK18dependent!HIF82α!expression!in!CAKI81!and!A498!ccRCC!cells!A,!CAKI>1!(left)!and!A498!(right)!cells!were!incubated!under!hypoxia!for!the!indicated!times!and!then!tested!for!PLD! and! SphK1! enzymatic! activities.! Points,! mean! of! at! least! three! experiments;! bars,! SEM.! **,! P<0.01;! ***,!P<0.001.!Inset,!HIF>2α!expression!in!CAKI>1!cells!exposed!to!hypoxia!for!the!indicated!times.!Similar!results!were!obtained! in! at! least! three! independent! experiments,! and! equal! loading! was! monitored! using! antibody! to! α>tubulin.! B8C,! CAKI>1! (left)! and! A498! (right)! cells! were! untreated! or! treated! with! 1>butanol! (1>ButOH)! or! tert!butanol!(t>ButOH)!as!control!(0.8%).!SphK1!activity!(B)!and!HIF>2α!expression!(C)!were!determined!after!1h!and!6h!of!hypoxia,!respectively.!Similar!results!were!obtained!in!at!least!three!independent!experiments,!and!equal!loading! was! monitored! using! antibody! to! α>tubulin.! Columns,! mean! of! three! independent! experiments;! bars,!SEM. The!two>tailed!P!values!between!the!means!of!hypoxic!cells!are:!ns,!not!significant;!***,!P<0.001. D8E,!CAKI>1!(left)!and!A498!(right)!cells!were!transfected!with!siPLD1!(50!nmol/L),!siPLD2!(50!nmol/L)!or!siPLD1!(50!nmol/L)!and!siPLD2!(50!nmol/L)!or!scrambled!siRNA!(siScr,!50!nmol/L)!for!72h!then!incubated!under!normoxia!or!hypoxia.!SphK1!activity!(D)!and!HIF>2α!expression!(E)! !were!determined!after!1h!and!6h!of!hypoxia,!respectively.!Similar!results! were! obtained! in! at! least! three! independent! experiments,! and! equal! loading! was! monitored! using!antibody! to! α>tubulin.! Columns,! mean! of! three! independent! experiments;! bars,! SEM.! The! two>tailed! P! values!between!the!means!of!normoxic! (A498)!or!hypoxic! (CAKI>1!and!A498)!cells!are:!ns,!not!significant;!**,!P<0.01;!***,!P<0.001.!

0

50

100

150

Sph

K1

activ

ity(%

of u

ntre

ated

cel

ls)

0

50

100

150

Sph

K1

activ

ity(%

of u

ntre

ated

cel

ls)

50

100

150

Sph

K1

activ

ity(%

of u

ntre

ated

cel

ls)

50

100

150

Sph

K1

activ

ity(%

of u

ntre

ated

cel

ls)

A. Bouquerel et al. (Fig 2)

B.

*** ***

ns ns

CAKI-1 A498

!"#

***

CAKI-1 A498

*** ***

*** *** ***

*** ** ns

0

100

200

300

50

100

150

200

PLD

act

ivity

(%

of u

ntre

ated

cel

ls)

SphK

1 activity(%

of untreated cells)

**

**

0

100

200

300

50

100

150

200

PLD

act

ivity

(%

of u

ntre

ated

cel

ls)

SphK

1 activity(%

of untreated cells)

**

*** ***

0 15 30 60 120 min

CAKI-1 A498

0 15 30 60 120 min

SphK1 activity

PLD activityHIF-2!

Tubulin

0 1 2 3 4 5 6 h of hypoxia

E.

1 0.5 0.7 0.4 1 0.9 0.3 0.4 1 0.8 0.2 0.2

HIF-2!

Tubulin

siPLD1 siPLD2

- + - -

- + - -

- + + +

- + + +

- + - -

- + - -

- + + +

- + + +

CAKI-1 A498

hypoxia normoxia hypoxia normoxia

siScr + + - - - - - - + + - - - - - -

C.

1-ButOH - + - - + - - - + - - + t-ButOH

1 0.5 1.1

- + - - + - - - + - - +

1 0.6 1

HIF-2!

Tubulin 1 0.4 1 CAKI-1 A498

hypoxia normoxia hypoxia normoxia

normoxia

hypoxia

normoxia

hypoxia

138!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

!Figure! 3! 8! Reactive! Oxygen! Species! (ROS)! regulate! SphK18dependent! HIF82α! expression! in! CAKI81! and! A498!ccRCC!cells!A,!CAKI>1!cells!were!incubated!under!normoxia!or!hypoxia!for!6h!in!presence!or!not!of!10!mM!N>acetyl>cysteine!(NAC)! or! the! indicated! doses! of! catalase! (CAT).! HIF>2α! expression! was! analyzed! by! immunoblotting.! Similar!results! were! obtained! in! at! least! three! independent! experiments,! and! equal! loading! was! monitored! using!antibody!to!α>tubulin.!B,!PLD!(left)!and!SphK1!(right)!enzymatic!activities!were!tested! in!CAKI>1!cells! incubated!under!normoxia!or!hypoxia!for!15!min!and!60!min,!respectively,!in!presence!or!not!of!10!mM!NAC!or!750!units/ml!CAT.!Columns,!mean!of!at!least!four!independent!experiments;!bars,!SEM.!The!two>tailed!P!values!between!the!means!of!hypoxic!cells!are:!**,!P<0.01;!***,!P<0.001.!C,!A498!cells!were!incubated!under!normoxia!or!hypoxia!for!6h! in!presence!or!not!of! 10!mM!NAC!or!750!units/ml!CAT.!HIF>2α!expression!was!analyzed!by! immunoblotting.!Similar!results!were!obtained!in!at!least!three!independent!experiments,!and!equal!loading!was!monitored!using!antibody! to!α>tubulin.!D,! PLD! (left)! and!SphK1! (right)! enzymatic! activities!were! tested! in!A498!cells! incubated!under!normoxia!or!hypoxia!for!15!min!and!60!min,!respectively,!in!presence!or!not!of!10!mM!NAC!or!750!units/ml!CAT.!Columns,!mean!of!at!least!four!independent!experiments;!bars,!SEM.!The!two>tailed!P!values!between!the!means!of!hypoxic!cells!are:!*,!P<0.05;!**,!P<0.01;!***,!P<0.001.!

0

50

100

150

200

250

PLD

act

ivity

(%

of u

ntre

ated

cel

ls)

A.

Bouquerel et al. (Fig 3)

B.

C.

D.

HIF-2!

Tubulin

- - + NAC (10 mM)

1 0.4 CAKI-1

hypoxia Nx

0.6 0 1 0.4 CAKI-1 HIF-2!

Tubulin

CAT(units/ml) 0 0 250 500 750

hypoxia Nx

HIF-2!

Tubulin

- - + NAC (10 mM)

1 0.6 A498

hypoxia Nx

HIF-2!

Tubulin

- - + CAT (750 units/ml)

1 0.2 A498

hypoxia Nx

A498

normoxia

hypoxia

50

100

150

Sph

K1

activ

ity(%

of u

ntre

ated

cel

ls)

**

*

50

100

150

Sph

K1

activ

ity(%

of u

ntre

ated

cel

ls)

CAKI-1

normoxia

hypoxia ** **

0

50

100

150

200

250

PLD

act

ivity

(%

of u

ntre

ated

cel

ls)

CAKI-1

** ***

A498

***

*

139!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Figure!4!8!SphK1!silencing!leads!to!a!decrease!in!HIF82!transcriptionnal!activity!in.A498!and!7868O!VHL8defective!ccRCC!cells!A498!and!786>O!cells!were!treated!with!20!nmol/l!of!siSphK1!or!scrambled!siRNA!(siScr)!for!72h!then!incubated!for! an! additional! 16! h! under! normoxia! or! hypoxia.! A,! HRE! reporter! gene! assay! (left)! and! protein! HIF>2α!expression!(right)!in!transiently!transfected!A498!(upper)!and!786>O!(lower)!cells.!The!y!axis!shows!normalized!Firefly! luciferase!over!Renilla! luciferase! activity! relative! to! the!wild>type!normoxic! response.!HIF>2α!expression!was!analyzed!by!immunoblotting.!Similar!results!were!obtained!in!at!least!three!independent!experiments,!and!equal! loading! was! monitored! using! antibody! to! α>tubulin.! Columns,! mean! of! at! least! four! independent!experiments;!bars,! SEM.! **,! P<0.01;! ***,! P<0.001.! ! Cell! lysates!were! assayed! for! GLUT>1! (B)! and! cyclin! D1! (C)!expression!by!Western!blot!analysis.!Similar!results!were!obtained!in!three!independent!experiments,!and!equal!loading!was!monitored! using! antibody! to! tubulin.!D,! Cell! proliferation! and! viability!was! respectively! assessed!using! [3H]>thymidine! incorporation! assay! and! MTT! assay.! Columns,! mean! of! at! least! four! independent!experiments;!bars,!SEM.!**,!P<0.01;!***,!P<0.001.!

0

25

50

75

100

125

Cel

l Via

bilit

y (%

of u

ntre

ated

cel

ls)

0

25

50

75

100

125

Cel

l pro

lifer

atio

n(%

of u

ntre

ated

cel

ls)

normoxia

hypoxia

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Rel

ativ

e re

porte

r gen

eac

tivity

786-O *** ***

Bouquerel et al. (Fig 4) A.

0.0

0.5

1.0

1.5

Rel

ativ

e re

porte

r gen

eac

tivity

A498 *** ***

B.

1 0.6 0.9 1 0.2 0.8

GLUT-1

Tubulin 1 0.5 0.9 A498 786-O

hypoxia normoxia hypoxia normoxia

1 0.6 1.1

C.

1 0.4 0.8 1 0.8 1.2

Cyclin D1

Tubulin 1 0.5 1 A498 786-O

hypoxia normoxia hypoxia normoxia

1 0.6 1

D.

A498

siScr

siSphK1

786-O

HIF-2!

Tubulin

0.2 0.9 A498

hypoxia

1

HIF-2!

Tubulin

0.4 0.9 786-O

hypoxia

1

*** ***

** **

A498 786-O

** ** *** ***

140!

SphK1!inhibition!decreases!the!rate!of!HIF82α !protein!synthesis!in!ccRCC!

SphK1! signaling! could! regulate! HIF>2α! expression! and! activity! at! the! levels! of! transcription,!

translation! or! protein! stability.! Silencing! of! SphK1! did! not! alter! the! mRNA! level! of! HIF>2α! in! both!

normoxic!and!hypoxic!conditions!in!both!A498!(Fig!5A)!and!786>O!(Suppl.!Fig!4A)!VHL>defective!ccRCC!

cells.!We!next! used! the!proteasome! inhibitor,!MG132,! to! determine!whether! the! regulatory! process!

mediated!by!SphK1!was!related!to!proteasome>dependent!degradation!of!HIF>2α.!Accordingly,!MG132!

treatment!did!not!reverse!the!HIF>2α!decrease!observed!in!SphK1>silenced!VHL>defective!ccRCC!A>498!

(Fig! 5B)! and! 786>O! cells! (Suppl.! Fig! 4B).! Importantly,! similar! findings!were!observed! in!VHL>positive!

CAKI>1! ccRCC! (Suppl.! Fig! 5A)! and! A549! lung! cancer! (Suppl.! Fig! 5B)! suggesting! that! SphK1! activity!

regulates!HIF>2α!content!regardless!of!the!presence!or!absence!of!VHL.!Next,!we!monitored!the!levels!

of! HIF>2α! after! protein! synthesis! blockade! by! cycloheximide! (CHX).! The! apparent! half>life! of! HIF>2α!

protein! in! presence! of! SKI>II,! a! pharmacological! inhibitor! of! SphK1! 1,! did! not! significantly! change! as!

compared! with! that! of! HIF>2α! in! untreated! A498! (Fig! 5C)! and! 786>O! (Suppl.! Fig! 4C)! cells! when!

assessed!over!a!time!course!in!the!presence!of!CHX.!These!data!indicate!that!the!reduction!of!HIF>2α!

protein!levels!by!SphK1!downregulation!is!likely!due!to!the!reduced!synthesis!of!HIF>2α!rather!than!the!

enhanced!degradation!of!the!protein. To!more!directly!estimate!the!effects!of!SphK1!inhibition!on!the!

rate!of!de;novo!synthesis!of!HIF>2α!protein,!A498!and!786>O!cells!were!pretreated!with!CHX!to!inhibit!

new! protein! synthesis! and! then! incubated! with! fresh! medium.! These! CHX>pretreated! cells! were!

exposed! or! not! to! SKI>II,! for! different! periods! of! time,! and! HIF>2α! protein! levels! were! analyzed! by!

western!blotting.!Significantly!more!HIF>2α!protein!accumulated!in!untreated!A498!(Fig!5D)!and!786>O!

(Suppl.! Fig! 4D)! cells! as! compared! to! SKI>II>treated! cells.! This! result! further! confirmed! that! SphK1!

inhibition!decreases!the!rate!of!HIF>2α!protein!synthesis!in!ccRCC!cells.!!

!

SphK1!silencing!is!associated!with!impaired!mTOR,!p70!S6K!and!4EBP1!phosphorylation!in!ccRCC!!

To! further! investigate!a! translational!pathway! in!HIF>2α!protein! regulation,!we!evaluated! the!

contribution!of!mTOR!pathway,!which!is!often!activated!in!cancer!and!plays!a!key!role!in!the!control!of!

HIF>2α!translation!58.!To!explore!whether!the!loss!of!HIF>2α!induced!by!SphK1!silencing!was!correlated!

with!the!suppression!of!mTOR!signaling!pathway,!we!examined!the!effect!of!siSphK1!on!levels!of!total!

or! phosphorylated! forms! of! mTOR! (p>mTOR)! in! A498! and! 786>O! cells.! Under! both! normoxic! and!

hypoxic!conditions,!the! levels!of!p>mTOR!were!clearly!reduced!while!total!mTOR!was!not!affected! in!

presence!of!siSphK1!(Fig!6A).!The!regulation!of!cap>dependent!translation!initiation!by!mTOR!involves!

direct!phosphorylation!of! its!downstream!substrates!eukaryotic! initiation! factor!4E!binding!protein! 1!

(4E>BP1)! and! ribosomal! protein! kinase! S6! (p70S6K)! 19,! 23.! Activated! p70S6K! phosphorylates! the! 40S!

ribosomal! protein! S6! whereas! phosphorylation! of! 4E>BP1! disrupts! its! inhibitory! interaction! with!

eukaryotic! initiation! factor! 4E! (eIF>4E).! Silencing! of! SphK1! is! associated! with! a! decreased!

141!

phosphorylation!of!p70S6K!(Fig!6B)!and!4E>BP1!(Fig!6C)!in!both!in!A498!and!786>O!cells.!!

By! activating! the! tuberous! sclerosis! complex,! TSC1/TSC2! leading! the!activation!of!mTOR,!Akt!

may! represent!a!mechanistic! link!between!S1P!signaling!and!mTOR!signaling!since!S1P! regulates!Akt!

phosphorylation!as!a!ligand!for!five!high>affinity!G>coupled!receptors!(S1P1>5)!48!in!various!physiological!

conditions!32.!The!silencing!of!SphK1!in!both!in!A498!and!786>O!cells!was!accompanied!by!a!significant!

reduction!in!Akt!phosphorylation!(Fig!6D).!

Collectively,!these!findings!provide!a!mechanistic!explanation!for!the!effect!of!SphK1!silencing,!

through!the!canonical!Akt/mTOR!pathway,!on!HIF>2α!protein!synthesis.!

!

Neutralization!of!exogenous!S1P!decreases!HIF82α!content!in!ccRCC!

Owing!to!the!fact!that!recent!studies!suggest!that!exogenous!S1P!could!regulate!adaptation!to!

hypoxia! through! the! content! of! HIF>1α! in! cancer! 2,! 27! and! non>cancer! cells! 34,! we! examined! the!

contribution! of! extracellular! S1P! in! the! regulation! of! HIF>2α! in! our! ccRCC! cell! models.! We! took!

advantage! of! a! murine! monoclonal! antibody! (mAb),! sphingomab,! that! binds! to! and! neutralizes!

extracellular!S1P!2,!11,!36,!44,!60,!which!is!currently!in!Phase!II!clinical!trial!for!metastatic!renal!cell!carcinoma!

(www.clinicaltrials.gov! Identifier,! NCT00661414)..! As! seen! in! Fig! 7A,! sphingomab! inhibited! HIF>2α!

protein!expression! in!a!concentration>dependent!manner! in!CAKI>1,!A498!and!786>O!ccRCC!cell! lines.!

This!finding!is!consistent!with many reports showing that S1P is produced intracellularly by SphK1 and

exerts its paracrine/autocrine effects by being secreted into the tumor microenvironment 11. Spinster!2!

(Spns2)!is!believed!to!be!the!primary!transporter!in!the!release!of!S1P!29.!Thus!when!CAKI>1!and!A498!

cells!were!treated!with!Spns2>specific!siRNAs,!the!expression!of!Spns2!protein!decreased!to!less!than!

20>30%!of! the! control!with! two!different! siRNAs! (Fig!7B).! In! line!with!our! recent!data! suggesting!an!

autocrine!effect!of!S1P!in!regulating!HIF>1α!in!hypoxic!prostate!cancer!cells!2,!the!silencing!of!Spns2!was!

associated!with!a!significant!inhibitory!effect!on!HIF>2α!accumulation!under!hypoxia!in!both!CAKI>1!and!

A498!ccRCC!cell!lines!(Fig!7B).!

These! data! establish! the! exclusive! contribution! of! exogenous! S1P! mediating! the! effect! of!

SphK1>driven!signaling!to!regulate!HIF>2α!content!in!ccRCC!cell!lines.!

!

!

!

!

!

142!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Figure!5!8!SphK1!signaling!stimulate!translation!of!HIF82α !in.VHL8defective!A498!ccRCC!cells!A,!relative!mRNA!expression!of!HIF>2α!and!SphK1!expression!in!A498!cells!was!measured!after!72h!of!treatment!with! 20! nmol/l! of! siSphK1! or! scrambled! siRNA! (siScr)! followed! by! 6h! under! normoxic! or! hypoxic! condition.!!Columns,!mean!of!at!least!four!independent!experiments;!bars,!SEM.!**,!P<0.01;!***,!P<0.001.!B,!A498!cells!were!untransfected! or! transfected! with! 20! nmol/l! of! siSphK1! or! scrambled! siRNA! (siScr)! for! 72h! before! the!experiments.!Cells!were!then!incubated!for!6h!in!under!normoxic!or!hypoxic!condition!in!presence!or!absence!of!the! proteasome! inhibitor!MG132! (10! µM).! Cell! lysates!were! assayed! for!HIF>2α! expression!by! immunoblotting.!Similar! results! were! obtained! in! three! independent! experiments,! and! equal! loading! was! monitored! using!antibody!to!tubulin.!C,!A498!cells!were!incubated!under!hypoxic!condition!for!4h!and!then!treated!with!50!µg/ml!cycloheximide! in! the!presence!or! absence!of! 5µM!sphingosine!kinase! inhibitor! (SKI>II).!At! the! indicated! times,!total! proteins! were! extracted! and! subjected! to! Western! blot! analysis! to! determine! the! relative! expression!between!HIF>2α!and!tubulin.!Columns,!mean!of! four! independent!experiments;!bars,!SEM.! (D)!A498!cells!were!incubated!under!hypoxic!condition!with!50!µg/ml!cycloheximide!for!2h,!then!medium!was!removed!and!replaced!by!fresh!medium!without!or!with!5µM!sphingosine!kinase!inhibitor!(SKI>II).!At!the!indicated!times,!total!proteins!were! extracted! and! assayed! for! HIF>2α! expression! by! immunoblotting.! Similar! results!were! obtained! in! three!independent!experiments,!and!equal!loading!was!monitored!using!antibody!to!tubulin.!

0.0

0.5

1.0

1.5

Rel

ativ

e m

RN

A

expr

essi

on(%

of u

ntre

ated

cel

ls)

HIF-2! mRNA

SphK1 mRNA

Bouquerel et al. (Fig 5)

A.

C.

30 60

hypoxia normoxia

0 0 15

HIF-2!

Tubulin w/o MG132

hypoxia normoxia

with MG132 HIF-2!

Tubulin *** ***

hypoxia normoxia

B.

HIF-2!

Tubulin

CHX 30 60 min 15

w/o SKI-II with SKI-II

D.

+ + - + +

HIF-2!

Tubulin

CHX + + +

w/o SKI-II with SKI-II

+

60 120 30 240 60 120 30 240 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Rel

ativ

e de

nsity

HIF

-2!

/tubulin

0

Duration (min)

15 30 60

CHX

CHX + SKI-III

hypoxia normoxia

143!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Figure!6!8!SphK1!silencing!disrupts!the!mTor/p70S6K!critical!for!protein!synthesis!in.VHL8defective!A498!and!7868O!ccRCC!cells!A498!and!786>O!cells!were!untransfected!or!transfected!with!20!nmol/l!of!siSphK1!or!scrambled!siRNA!(siScr)!for!72h!before!the!experiments!followed!by!4h!under!normoxic!or!hypoxic!condition.!Cell! lysates!were!assayed!for!Ser2448!phosphorylated!mTOR!(p>mTOR!Ser2448)!and!mTOR!expression!(A);!Thr389!phosphorylated!p70S6K!(p>p70S6KThr389),!Thr421/Ser424!phosphorylated!p70S6K! (p>p70S6K!Thr421/Ser424)!and! !p70S6K!expression! (B);!Ser65! phosphorylated! 4EBP1! (p>4EBP1! Ser65)! and! 4EBP1! expression! (C);! Ser473! phosphorylated! Akt! (P>AKt!Ser473)! and! Akt! expression! (D)! were! analyzed! by! immunoblotting.! Similar! results! were! obtained! in! three!independent!experiments.!!

!

Bouquerel et al. (Fig 6)

A.

1 0.6 1 1 0.3 0.9

p-mTor (Ser2448)

mTor

1 0.8 1.1 A498 786-O

hypoxia normoxia hypoxia normoxia

1 0.5 1.1

B.

1 0.5 1 1 0.4 1

p-p70S6K (Thr389)

p70S6K

1 0.7 1.1

A498 786-O

hypoxia normoxia hypoxia normoxia

1 0.6 1

1 0.6 1.1 1 0.2 1.2 1 0.6 0.9 1 0.5 1

p-p70S6K (Thr421/Ser424)

C.

1 0.6 0.9 1 0.5 1

p-4E-BP1 (Ser65)

4E-BP1

1 0.6 1 A498 786-O

hypoxia normoxia hypoxia normoxia

1 0.7 1

D.

1 0.2 0.8 1 0,5 0.8

p-Akt (Ser473)

Akt

1 0.7 1 A498 786-O

hypoxia normoxia hypoxia normoxia

1 0.2 1.3

144!

Figure! 7! 8!

Exogenous!S1P!regulates!HIF82α!accumulation!in!CAKI81,!A498!and!7868O!ccRCC!cells!A,! CAKI>1,! A498! and! 786>O! cells!were! treated!with! the! indicated! concentrations! of! anti>S1P!mAb! for! 2h,! then!incubated! under! normoxia! or! hypoxia! for! an! additional! 6h! and! HIF>2α! expression! was! analyzed! by!immunoblotting.!B,!relative!mRNA!expression!of!Spns2!expression!in!CAKI>1!and!A498!cells!was!measured!after!72h! of! treatment!with! 90! nmol/l! of! two! different! siSpns2! (siSpns2a! and! siSpns2b)! or! scrambled! siRNA! (siScr)!followed!by!6h!under!normoxic!or!hypoxic!condition.!!Columns,!mean!of!at!least!four!independent!experiments;!bars,! SEM.! *,! P<0.05;! **,! P<0.01.! C,! CAKI>1! and! A498! cells! were! transfected! with! 90! nmol/l! of! two! different!siSpns2!(siSpns2a!and!siSpns2b)!or!scrambled!siRNA!(siScr)!for!72h,!then!incubated!under!normoxia!or!hypoxia!for! an! additional! 6h.! Cell! lysates! were! assayed! for! Spns2! and! HIF>2α! expression! by! immunoblotting.! For! all!experiments,! similar! results!were! obtained! in! at! least! three! independent! experiments,! and! equal! loading!was!monitored!using!antibody!to!tubulin.!

Bouquerel et al. (Fig 7)

A.

B.

0.6 1 0.4 CAKI-1 HIF-2!

Tubulin

Anti-S1P mAb 0 0 25 50 75

hypoxia Nx

100 ("g/ml)

0.1 0.1

0.1 <0.1 1 <0.1 A498 HIF-2!

Tubulin

Anti-S1P mAb 0 25 50 75 100 ("g/ml)

hypoxia

0.6

786-O HIF-2!

Tubulin

Anti-S1P mAb 0 25 50 75 100 ("g/ml)

hypoxia

0.3 0.2 1 0.3 0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

Rel

ativ

e m

RN

Aex

pres

sion

(% o

f unt

reat

ed c

ells

) normoxia

hypoxia

** *

0.0

0.5

1.0

1.5

Rel

ativ

e m

RN

Aex

pres

sion

(% o

f unt

reat

ed c

ells

)

normoxia

hypoxia

* **

A498 CAKI-1

A498 HIF-2!

Tubulin

Spns2

0.2 1

1

1

<0.1 1

hypoxia Nx hypoxia Nx

0.2 1 1

0.3 1 1

0.3 1 1

0.2 1

hypoxia Nx hypoxia Nx

0.2 1 1

0.2 1

CAKI-1

145!

DISCUSSION!

!

HIF>2α! is! frequently!overexpressed! in! solid! tumors! 38,!but! its! role!has!been!mostly! studied! in!

renal!clear!cell!carcinoma!(ccRCC),!the!most!common!form!of!kidney!cancer,!where!it!has!emerged!as!a!

key!driver!in!the!development!and!progression!of!the!disease!24.!A!majority!of!ccRCC!(50>80%)!exhibit!a!

genetic! inactivation! of! von! Hippel>Lindau! (VHL)! gene! resulting! in! the! loss! of! pVHL,! which! normally!

mediates! ubiquitination! of! HIF>2α! and! its! subsequent! degradation!,! leading! to! a! constitutive!

accumulation!of!HIF>α! ! 25.!HIF>2α! is!both!necessary!and!sufficient! to!support! tumor!growth!of!ccRCC!

cell!lines!31!whereas!the!activity!of!HIF>1α!!has!been!shown!to!be!dispensable!as!its!expression!is!often!

silenced! 6,! 54,! 55.! In!particular,! tumor>promoting!genes!encoding!cyclin!D1,!TGFα,!and!VEGF!have!been!

shown! to! be! driven! specifically! by!HIF>2α! 47,! and!HIF>2α! only! expressing! ccRCC! appears! to! exhibit! a!

more!aggressive!clinical!behavior!21!

The! relationship! between! S1P!metabolism! and!HIF! signaling! has! recently! emerged! in! cancer!

cells! with! studies! 1,! 12,! 27! establishing! that! the! SphK1/S1P! signaling! controls! the! regulation! of! ! HIF>1α!

under! hypoxia! 16.! Herein! we! report! for! the! first! time! that! the! SphK1/S1P! signaling! regulates! HIF>2α!

content! and! activity! in! cancer! cells! from! various! tumor! types! (lung,! prostate,! glioma! and! ccRCC)!

suggesting!a!possible!universal!regulatory!role!in!cancer!cells.!Considering!the!critical!role!of!HIF>2α!in!ccRCC! pathogenesis,! we! further! detailed! the! molecular! mechanisms! HIF>2α! regulation! by! the!

SphK1/S1P!signaling!in!various!models!of!ccRCC!representing!the!sub>groups!found!in!human!clinic!26,!

and!by!taking!advantage!of!the!features!of!A498!and!786>O;VHL>defective!cells!that!only!express!HIF>

2α!7,!33,!and!not!HIF>1α,!we!previously!reported!to!be!regulated!by!SphK1!signaling!1.!

As!previously!published!for!HIF>1α!in!a!variety!of!cancer!cell!models!1,!!a!significant!rise!in!SphK1!

activity! (peaking! at! 60! min)! prior! to! HIF>2α! accumulation! (2>3! h)! was! observed! under! hypoxic!

conditions.! The! stimulation! of! SphK1! activity! relied! on! sequential! steps! involving! ROS! production!

followed! by! stimulation! of! phospholipase! D! activity! (PLD)! (peaking! at! 15>30! min).! Specifically,! PLD!

activity! is! known! to! regulate! HIF>2α! accumulation! in! ccRCC! 58! but! a! novel! finding! is! that! SphK1! is! a!

downstream! target!of!PLD!under!hypoxia!as!described!earlier! in!different!physiological! settings! 9,! 17.!

Using! A498! and! 786>O; VHL>defective! cells! that! only! express! HIF>2α,! we! demonstrate! that! SphK1!

activity!controls!not!only!HIF>2α!protein!content!but!also!its!transcriptional!activity!as!down>regulation!

of! specific! HIF>2>regulated! genes! such! as! the! glucose! transporter! GLUT>1! or! the! cell! cycle! regulator!

cylin!D1!was!observed! in!SphK1>silenced!cells.!Accordingly,! the!proliferation!rate!and!the!cell!viability!

were!significantly! inhibited! in!SphK1>silenced!A498!and!786>O!cells!demonstrating!that!SphK1!activity!

promotes! a! survival! advantage! in! accord! with! the! notion! that! HIF>2α! contributes! to! tumor! cell!!!!

survival!7.!

146!

Importantly,!in!contrast!to!our!previous!studies!on!HIF>1α!1,!we!discovered!that!SphK1!signaling!

does!not! regulate!HIF>2α!protein! content! in! ccRCC!and!non>ccRCC!cells!by!a!proteasome>dependent!

mechanism!suggesting!a!general!mode!of!action!regardless!of!the!origin!of!the!cell!lines!used!and!the!

presence!or!not!of!pVHL.!Rather,!SphK1!activity!regulates!the!protein!synthesis!of!HIF>2α!in!ccRCC!cell!

lines!through!the!canonical!mTOR!signaling!pathway,!which!is!often!dysregulated!in!cancer!and!plays!a!

crucial! role! in! the!control!of!HIF>2α! translation! 58.! Importantly,!we!also!show!that! the!protein!kinase!

Akt!represents!a!mechanistic!link!between!SphK1/S1P!signaling!and!mTOR!signaling!as!SphK1!silencing!

abrogates! the! Akt/mTOR! stimulation.! Because! Akt! signaling! can! be! activated! by! all! Gi>coupled! S1P!

receptor!subtypes! 15,! 56!and!because!S1P!has!been!shown!to!be!released!from!hypoxic!cells! 2,! 4,! 50,!we!

explored! the! effects! of! the! neutralization! of! extracellular! S1P! with! anti>S1P! monoclonal! antibody!

sphingomab!49.!Our!findings!firmly!establish!the!contribution!of!extracellular!S1P! in!the!regulation!of!

HIF>2α!!as!the!silencing!of!S1P!exporter!Spns2!as!well!as!the!use!of!sphingomab!markedly!reduced!HIF>

2α!in!all!ccRCC!subtypes.!These!data!are!consistent!with!our!recent!report!that!SphK1!is!upregulated!in!

mice!xenografts!after!resistance!to!VEGFR2!tyrosine!kinase!inhibition!(TKI)!63.!Moreover,!sphingomab!

retarded! the! growth! of! A498! and! 786>O! xenographs,! particularly! after! resistance! to! TKI! was!

established!63!

In!summary,!the!present!report!demonstrates!that!the!SphK1/S1P!signaling!pathway!is!a!potent!

regulator!of!HIF>2! in!human!cancer!notably! in!ccRCC,! the!most!common! form!of!kidney!cancer.!This!

disease!is!aggressive,!notoriously!resistant!to!conventional!chemotherapy,!and!is!almost!invariably!an!

incurable! condition! 13.! SphK1/S1P! inhibition! might! represent! an! alternative! therapeutic! strategy! to!

current!mTOR>!or!VEGF>targeted!agents! as!S1P! is!widely! appreciated!as! a!general! growth>like! factor!

and! a! potent! protector! against! apoptosis! in! addition! to! its! specific! regulatory! role! on! HIF>2.! The!

targeting! S1P! metabolism! is! now! at! hand! by! the! employ! of! antibody! against! S1P! (sphingomabTM),!

which! is! being! investigated! as! a! treatment! for!metastatic! renal! cell! carcinoma! in! patients! that! have!

failed!up! to! three! targeted! therapies! (www.lpath.com).!Anti>s1P! strategies! could!not!only! provide! a!

beneficial!therapeutic!option!in!ccRCC,!but!also!in!other!cancers!as!the!role!of!HIF>2!as!an!oncoprotein!

might!extend!beyond!renal!carcinomas.!

!GRANT!SUPPORT!

!

This!work!was!supported!by!the!Ligue!Nationale!Contre!le!Cancer!(Equipe!Labellisée!LIGUE!2011!to!OC!

and!Allocation!de!thèse!to!PB),!Fondation!de!France!(to!OC),!the!Comité!Local!Haute!Garonne!of!the!

Ligue!Contre!le!Cancer!(to!IA),!Université!Paul!Sabatier!de!Toulouse!(to!IA),!Allocation!de!thèse!from!

the!Fondation!pour!la!Recherche!Médicale!(to!CG),!and!Bourse!Angiogenèse!from!Roche!(to!OC).!

!

147!

REFERENCES!!!1! Ader! I,! Brizuela! L,! Bouquerel! P,! Malavaud! B,! Cuvillier! O.! Sphingosine! kinase! 1:! a! new! modulator! of!

hypoxia!inducible!factor!1alpha!during!hypoxia!in!human!cancer!cells.!Cancer!Res!2008;!68:!8635>8642.!!

2! Ader! I,! Bouquerel! P,! Gstalder! C,! Golzio! M,! Andrieu! G,! Zalvidea! S! et! al.! Neutralizing! S1P! inhibits!intratumoral!hypoxia,! induces!vascular! remodeling!and!sensitizes!to!chemotherapy! in!prostate!cancer.!Oncotarget!2015;!6:!in!press.!

!3! Alvarez! SE,! Harikumar! KB,! Hait! NC,! Allegood! J,! Strub! GM,! Kim! EY! et! al.! Sphingosine>1>phosphate! is! a!

missing!cofactor!for!the!E3!ubiquitin!ligase!TRAF2.!Nature!2010;!465:!1084>1088.!!

4! Anelli!V,!Gault!CR,!Cheng!AB,!Obeid!LM.!Sphingosine!Kinase!1!Is!Up>regulated!during!Hypoxia!in!U87MG!Glioma!Cells:!ROLE!OF!HYPOXIA>INDUCIBLE!FACTORS!1!AND!2.!J!Biol!Chem!2008;!283:!3365>3375.!

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protein! causes! cell! density! dependent! deregulation! of! CyclinD1! expression! through! hypoxia>inducible!factor.!Oncogene!2003;!22:!2728>2738.!

!6! Beroukhim!R,!Brunet!JP,!Di!Napoli!A,!Mertz!KD,!Seeley!A,!Pires!MM!et!al.!Patterns!of!gene!expression!

and!copy>number!alterations!in!von>hippel!lindau!disease>associated!and!sporadic!clear!cell!carcinoma!of!the!kidney.!Cancer!Res!2009;!69:!4674>4681.!

!7! Bertout!JA,!Majmundar!AJ,!Gordan!JD,!Lam!JC,!Ditsworth!D,!Keith!B!et!al.!HIF2alpha!inhibition!promotes!

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!8! Biswas!S,!Troy!H,!Leek!R,!Chung!YL,!Li!JL,!Raval!RR!et!al.!Effects!of!HIF>1alpha!and!HIF2alpha!on!Growth!

and!Metabolism! of! Clear>Cell! Renal! Cell! Carcinoma! 786>0! Xenografts.! Journal! of! oncology! 2010;! 2010:!757908.!

!9! Brizuela! L,! Dayon! A,! Doumerc! N,! Ader! I,! Golzio! M,! Izard! JC! et! al.! The! sphingosine! kinase>1! survival!

pathway! is!a!molecular!target!for!the!tumor>suppressive!tea!and!wine!polyphenols! in!prostate!cancer.!FASEB!J!2010;!24:!3882>3894.!

!10! Brizuela! L,! Cuvillier! O.! Biochemical! methods! for! quantifying! sphingolipids:! ceramide,! sphingosine,!

sphingosine!kinase>1!activity,!and!sphingosine>1>phosphate.!Methods!Mol!Biol!2012;!874:!1>20.!!

11! Brizuela! L,!Martin! C,! Jeannot! P,! Ader! I,! Gstalder! C,! Andrieu!G! et! al.!Osteoblast>derived! sphingosine! 1>phosphate! to! induce! proliferation! and! confer! resistance! to! therapeutics! to! bone! metastasis>derived!prostate!cancer!cells.!Mol!Oncol!2014;!8:!1181>1195.!

!12! Cho!SY,!Lee!HJ,! Jeong!SJ,!Kim!HS,!Chen!CY,!Lee!EO!et!al.! Sphingosine!kinase! 1!pathway! is! involved! in!

melatonin>induced!HIF>1alpha!inactivation!in!hypoxic!PC>3!prostate!cancer!cells.!J!Pineal!Res!2011;!51:!87>93.!

!13! Costa!LJ,!Drabkin!HA.!Renal! cell! carcinoma:!new!developments! in!molecular!biology!and!potential! for!

targeted!therapies.!Oncologist!2007;!12:!1404>1415.!!

14! Cuvillier!O.!Downregulating!sphingosine!kinase>1!for!cancer!therapy.!Expert!Opin!Ther!Targets!2008;!12:!1009>1020.!

!15! Cuvillier!O.![Sphingosine!1>phosphate!receptors:!from!biology!to!physiopathology].!Med!Sci!(Paris)!2012;!

28:!951>957.!!

148!

16! Cuvillier!O,!Ader!I,!Bouquerel!P,!Brizuela!L,!Gstalder!C,!Malavaud!B.!Hypoxia,!therapeutic!resistance,!and!sphingosine!1>phosphate.!Adv!Cancer!Res!2013;!117:!117>141.!

!17! Delon! C,! Manifava! M,! Wood! E,! Thompson! D,! Krugmann! S,! Pyne! S! et! al.! Sphingosine! kinase! 1! is! an!

intracellular!effector!of!phosphatidic!acid.!J!Biol!Chem!2004;!279:!44763>44774.!!

18! Fukuhara!S,!Simmons!S,!Kawamura!S,!Inoue!A,!Orba!Y,!Tokudome!T!et!al.!The!sphingosine>1>phosphate!transporter!Spns2!expressed!on!endothelial!cells!regulates!lymphocyte!trafficking!in!mice.!J!Clin!Invest!2012;!122:!1416>1426.!

!19! Gingras!AC,!Gygi! SP,!Raught!B,!Polakiewicz!RD,!Abraham!RT,!Hoekstra!MF!et! al.!Regulation!of!4E>BP1!

phosphorylation:!a!novel!two>step!mechanism.!Genes!Dev!1999;!13:!1422>1437.!!

20! Gordan! JD,! Bertout! JA,!Hu! CJ,! Diehl! JA,! Simon!MC.!HIF>2alpha! promotes! hypoxic! cell! proliferation! by!enhancing!c>myc!transcriptional!activity.!Cancer!Cell!2007;!11:!335>347.!

!21! Gordan! JD,! Lal! P,! Dondeti! VR,! Letrero! R,! Parekh! KN,! Oquendo! CE! et! al.! HIF>alpha! effects! on! c>Myc!

distinguish!two!subtypes!of!sporadic!VHL>deficient!clear!cell!renal!carcinoma.!Cancer!Cell!2008;!14:!435>446.!

!22! Hait! NC,! Allegood! J,! Maceyka! M,! Strub! GM,! Harikumar! KB,! Singh! SK! et! al.! Regulation! of! histone!

acetylation!in!the!nucleus!by!sphingosine>1>phosphate.!Science!2009;!325:!1254>1257.!!

23! Hara!K,! Yonezawa!K,! Kozlowski!MT,! Sugimoto! T,! Andrabi! K,!Weng!QP! et! al.! Regulation!of! eIF>4E!BP1!phosphorylation!by!mTOR.!J!Biol!Chem!1997;!272:!26457>26463.!

!24! Jonasch!E,!Futreal!PA,!Davis!IJ,!Bailey!ST,!Kim!WY,!Brugarolas!J!et!al.!State!of!the!science:!an!update!on!

renal!cell!carcinoma.!Mol!Cancer!Res!2012;!10:!859>880.!!

25! Kaelin! WG,! Jr.! The! von! Hippel>Lindau! tumor! suppressor! protein! and! clear! cell! renal! carcinoma.! Clin!Cancer!Res!2007;!13:!680s>684s.!

!26! Kaelin!WG,!Jr.!Kidney!cancer:!now!available!in!a!new!flavor.!Cancer!Cell!2008;!14:!423>424.!!

27! Kalhori!V,!Kemppainen!K,!Asghar!MY,!Bergelin!N,!Jaakkola!P,!Tornquist!K.!Sphingosine>1>Phosphate!as!a!Regulator! of! Hypoxia>Induced! Factor>1alpha! in! Thyroid! Follicular! Carcinoma! Cells.! PLoS! One! 2013;! 8:!e66189.!

!28! Kapitonov! D,! Allegood! JC,! Mitchell! C,! Hait! NC,! Almenara! JA,! Adams! JK! et! al.! Targeting! sphingosine!

kinase! 1! inhibits!Akt! signaling,! induces!apoptosis,! and! suppresses!growth!of!human!glioblastoma!cells!and!xenografts.!Cancer!Res!2009;!69:!6915>6923.!

!29! Kawahara!A,!Nishi!T,!Hisano!Y,!Fukui!H,!Yamaguchi!A,!Mochizuki!N.!The!sphingolipid!transporter!spns2!

functions!in!migration!of!zebrafish!myocardial!precursors.!Science!2009;!323:!524>527.!!

30! Keith!B,!Johnson!RS,!Simon!MC.!HIF1alpha!and!HIF2alpha:!sibling!rivalry!in!hypoxic!tumour!growth!and!progression.!Nat!Rev!Cancer!2012;!12:!9>22.!

!31! Kondo!K,!Kim!WY,!Lechpammer!M,!Kaelin!WG,!Jr.!Inhibition!of!HIF2alpha!is!sufficient!to!suppress!pVHL>

defective!tumor!growth.!PLoS!Biol!2003;!1:!E83.!!

32! Maceyka! M,! Harikumar! KB,! Milstien! S,! Spiegel! S.! Sphingosine>1>phosphate! signaling! and! its! role! in!disease.!Trends!Cell!Biol!2012;!22:!50>60.!

!33! Maxwell!PH,!Wiesener!MS,!Chang!GW,!Clifford!SC,!Vaux!EC,!Cockman!ME!et!al.!The!tumour!suppressor!

protein!VHL!targets!hypoxia>inducible!factors!for!oxygen>dependent!proteolysis.!Nature!1999;!399:!271>275.!

149!

!34! Michaud! MD,! Robitaille! GA,! Gratton! JP,! Richard! DE.! Sphingosine>1>phosphate:! a! novel! nonhypoxic!

activator!of!hypoxia>inducible!factor>1!in!vascular!cells.!Arterioscler!Thromb!Vasc!Biol!2009;!29:!902>908.!!

35! Nagahashi!M,!Kim!EY,!Yamada!A,!Ramachandran!S,!Allegood!JC,!Hait!NC!et!al.!Spns2,!a! transporter!of!phosphorylated! sphingoid! bases,! regulates! their! blood! and! lymph! levels,! and! the! lymphatic! network.!FASEB!J!2013;!27:!1001>1011.!

!36! O'Brien! N,! Jones! ST,! Williams! DG,! Cunningham! HB,! Moreno! K,! Visentin! B! et! al.! Production! and!

characterization!of!monoclonal!anti>sphingosine>1>phosphate!antibodies.!J!Lipid!Res!2009;!50:!2245>2257.!!

37! Padron!D,!Tall!RD,!Roth!MG.!Phospholipase!D2!is!required!for!efficient!endocytic!recycling!of!transferrin!receptors.!Mol!Biol!Cell!2006;!17:!598>606.!

!38! Patel!SA,!Simon!MC.!Biology!of!hypoxia>inducible!factor>2alpha!in!development!and!disease.!Cell!Death!

Differ!2008;!15:!628>634.!!

39! Paugh!SW,!Paugh!BS,!Rahmani!M,!Kapitonov!D,!Almenara! JA,!Kordula!T!et!al.!A! selective! sphingosine!kinase!1!inhibitor!integrates!multiple!molecular!therapeutic!targets!in!human!leukemia.!Blood!2008;!112:!1382>1391.!

!40! Pchejetski! D,! Golzio! M,! Bonhoure! E,! Calvet! C,! Doumerc! N,! Garcia! V! et! al.! Sphingosine! kinase>1! as! a!

chemotherapy!sensor! in!prostate!adenocarcinoma!cell!and!mouse!models.!Cancer!Res!2005;!65:!11667>11675.!

!41! Pchejetski!D,!Doumerc!N,!Golzio!M,!Naymark!M,!Teissie!J,!Kohama!T!et!al.!Chemosensitizing!effects!of!

sphingosine!kinase>1!inhibition!in!prostate!cancer!cell!and!animal!models.!Mol!Cancer!Ther!2008;!7:!1836>1845.!

!42! Pchejetski!D,!Boehler!T,!Brizuela!L,!Sauer!L,!Doumerc!N,!Golzio!M!et!al.!FTY720!(Fingolimod)!sensitizes!

prostate! cancer! cells! to! radiotherapy!by! inhibition!of! sphingosine! kinase>1.! Cancer!Res! 2010;! 70:! 8651>8661.!

!43! Pitson!SM.!Regulation!of!sphingosine!kinase!and!sphingolipid!signaling.!Trends!Biochem!Sci!2011;!36:!97>

107.!!

44! Ponnusamy!S,!Selvam!SP,!Mehrotra!S,!Kawamori!T,!Snider!AJ,!Obeid!LM!et!al.!Communication!between!host!organism!and!cancer!cells!is!transduced!by!systemic!sphingosine!kinase!1/sphingosine!1>phosphate!signalling!to!regulate!tumour!metastasis.!EMBO!Mol!Med!2012;!4:!761>775.!

!45! Pyne!S,!Pyne!NJ.!Translational!aspects!of!sphingosine!1>phosphate!biology.!Trends!Mol!Med!2011;!17:!463>

472.!!

46! Rankin! EB,! Rha! J,!Unger! TL,!Wu! CH,! Shutt!HP,! Johnson!RS! et! al.! Hypoxia>inducible! factor>2! regulates!vascular!tumorigenesis!in!mice.!Oncogene!2008;!27:!5354>5358.!

!47! Raval!RR,! Lau!KW,!Tran!MG,!Sowter!HM,!Mandriota!SJ,! Li! JL!et! al.! Contrasting!properties!of!hypoxia>

inducible! factor! 1! (HIF>1)! and!HIF>2! in! von!Hippel>Lindau>associated! renal! cell! carcinoma.!Mol! Cell! Biol!2005;!25:!5675>5686.!

!48! Rosen!H,!Gonzalez>Cabrera!PJ,!Sanna!MG,!Brown!S.!Sphingosine!1>phosphate!receptor!signaling.!Annu!

Rev!Biochem!2009;!78:!743>768.!!

49! Sabbadini!RA.! Sphingosine>1>phosphate! antibodies! as!potential! agents! in! the! treatment!of! cancer! and!age>related!macular!degeneration.!Br!J!Pharmacol!2011;!162:!1225>1238.!

!

150!

50! Schnitzer!SE,!Weigert!A,!Zhou!J,!Brune!B.!Hypoxia!enhances!sphingosine!kinase!2!activity!and!provokes!sphingosine>1>phosphate>mediated!chemoresistance!in!A549!lung!cancer!cells.!Mol!Cancer!Res!2009;!7:!393>401.!

!51! Semenza!GL.!Hypoxia>inducible!factors!in!physiology!and!medicine.!Cell!2012;!148:!399>408.!!

52! Semenza!GL.!Hypoxia>inducible!factors:!mediators!of!cancer!progression!and!targets!for!cancer!therapy.!Trends!Pharmacol!Sci!2012;!33:!207>214.!

!53! Servitja!JM,!Masgrau!R,!Pardo!R,!Sarri!E,!Picatoste!F.!Effects!of!oxidative!stress!on!phospholipid!signaling!

in!rat!cultured!astrocytes!and!brain!slices.!J!Neurochem!2000;!75:!788>794.!!

54! Shen!C,!Beroukhim!R,!Schumacher!SE,!Zhou!J,!Chang!M,!Signoretti!S!et!al.!Genetic!and!functional!studies!implicate!HIF1alpha!as!a!14q!kidney!cancer!suppressor!gene.!Cancer!discovery!2011;!1:!222>235.!

!55! Shinojima! T,!Oya!M,! Takayanagi! A,!Mizuno!R,! Shimizu!N,!Murai!M.! Renal! cancer! cells! lacking! hypoxia!

inducible!factor!(HIF)>1alpha!expression!maintain!vascular!endothelial!growth!factor!expression!through!HIF>2alpha.!Carcinogenesis!2007;!28:!529>536.!

!56! Takabe! K,! Paugh! SW,! Milstien! S,! Spiegel! S.! "Inside>out"! signaling! of! sphingosine>1>phosphate:!

therapeutic!targets.!Pharmacol!Rev!2008;!60:!181>195.!!

57! Toschi!A,!Edelstein!J,!Rockwell!P,!Ohh!M,!Foster!DA.!HIF!alpha!expression!in!VHL>deficient!renal!cancer!cells!is!dependent!on!phospholipase!D.!Oncogene!2008;!27:!2746>2753.!

!58! Toschi!A,!Lee!E,!Gadir!N,!Ohh!M,!Foster!DA.!Differential!dependence!of!hypoxia>inducible!factors!1!alpha!

and!2!alpha!on!mTORC1!and!mTORC2.!J!Biol!Chem!2008;!283:!34495>34499.!!

59! Van!Brocklyn!JR,!Lee!MJ,!Menzeleev!R,!Olivera!A,!Edsall!L,!Cuvillier!O!et!al.!Dual!actions!of!sphingosine>1>phosphate:!extracellular!through!the!Gi>coupled!receptor!Edg>1!and!intracellular!to!regulate!proliferation!and!survival.!J!Cell!Biol!1998;!142:!229>240.!

!60! Visentin! B,! Vekich! JA,! Sibbald! BJ,! Cavalli! AL,! Moreno! KM,! Matteo! RG! et! al.! Validation! of! an! anti>

sphingosine>1>phosphate! antibody! as! a! potential! therapeutic! in! reducing! growth,! invasion,! and!angiogenesis!in!multiple!tumor!lineages.!Cancer!Cell!2006;!9:!225>238.!

!61! Wiesener!MS,! Jurgensen! JS,! Rosenberger! C,! Scholze! CK,! Horstrup! JH,!Warnecke! C! et! al.!Widespread!

hypoxia>inducible!expression!of!HIF>2alpha!in!distinct!cell!populations!of!different!organs.!FASEB!J!2003;!17:!271>273.!

!62! Xia! P,! Gamble! JR,! Wang! L,! Pitson! SM,! Moretti! PA,! Wattenberg! BW! et! al.! An! oncogenic! role! of!

sphingosine!kinase.!Curr!Biol!2000;!10:!1527>1530.!!

63! Zhang!L,!Wang!X,!Bullock!AJ,!Callea!M,!Shah!H,!Song!J!et!al.!Anti>S1P!antibody!as!a!novel! therapeutic!strategy!for!VEGFR!TKI!resistant!renal!cancer.!Clin!Cancer!Res!2015.!

!64! Zhang!Y,!Wang!Y,!Wan!Z,!Liu!S,!Cao!Y,!Zeng!Z.!Sphingosine!kinase!1!and!cancer:!a!systematic!review!and!

meta>analysis.!PLoS!One!2014;!9:!e90362.!!

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151!

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A. Bouquerel et al. (Suppl. Fig 1)

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Bouquerel et al. (Suppl. Fig 2)

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HIF-2!

Tubulin

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Bouquerel et al. (Suppl. Fig 3)

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Bouquerel et al. (Suppl Fig 5)

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Tubulin

A.

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HIF-2!

Tubulin w/o MG132

hypoxia normoxia

with MG132 HIF-2!

Tubulin

B.

A549

157!

1.3. Discussion

HIF-2α est fréquemment surexprimé dans les tumeurs. Son rôle a principalement été étudié dans

les ccRCC où il constitue un facteur clé du développement et de la progression tumorale. En effet,

la plupart des ccRCC présentent une inactivation du gène VHL ce qui entraine l’expression

constitutive des sous-unités HIF-α (Kaelin 2007). De plus, des études ont montré que HIF-2α est

nécessaire et suffisant à la formation de tumeurs par des lignées de ccRCC (Kondo et al. 2003), et

qu’à l’inverse, HIF-1α n’est pas essentiel à ce processus (Shinojima et al. 2007, Shen et al. 2011). En

particulier, l’expression de la cycline D1, du TGFα et du VEGF dans les ccRCC est régulée

spécifiquement par HIF-2 (Raval et al. 2005). Enfin, des données indiquent que les ccRCC

exprimant uniquement HIF-2α semblent être plus agressifs (Gordan et al. 2008).

Différents travaux ont établi que la voie SphK1/S1P contrôle HIF-1α en hypoxie (Ader et al. 2008,

Cho et al. 2011, Cuvillier et al. 2013, Kalhori et al. 2013). Dans cette étude, nous montrons pour la

première fois que la SphK1 régule l’expression de HIF-2α dans plusieurs modèles tumoraux, dont

les ccRCC, suggérant ainsi un rôle canonique de cette enzyme dans la régulation de HIF-2α. Au

vu de l’importance de cette protéine dans les ccRCC, nous avons caractérisé les mécanismes

moléculaires impliqués dans la régulation de HIF-2α par la SphK1 dans plusieurs lignées de

ccRCC représentatives de certains sous-groupes retrouvés en clinique humaine.

En accord avec nos précédents travaux (Ader et al. 2015), une augmentation significative de

l’activité de la SphK1 est observée après 1 heure d’hypoxie. Elle précède ainsi l’accumulation de

HIF-2α qui a lieu après 2 à 3 heures d’hypoxie. Nos résultats indiquent que l’activation de la

SphK1 en hypoxie a lieu selon un mécanisme dépendant des ROS et de la PLD, dont l’activation

est maximale après 15 à 30 minutes d’hypoxie. De manière cohérente avec la littérature (Toschi et

al. 2008a), nous confirmons que la PLD régule l’expression de HIF-2α dans les ccRCC et nous

mettons en évidence le rôle de la PLD dans l’activation de la SphK1 en hypoxie dans ces modèles.

A l’aide des lignées A498 et 786-O déficientes pour pVHL et qui n’expriment pas HIF-1α, nous

montrons que la SphK1 régule non seulement l’expression de HIF-2α mais aussi son activité

transcriptionnelle. En effet, nos résultats indiquent que la déplétion de la SphK1 entraine une

diminution de l’expression de GLUT-1 et de la cycline D1, deux gènes cibles de HIF-2. De plus, la

déplétion de la SphK1 entraine une diminution de la prolifération cellulaire dans les lignées A498

et 786-O, ce qui est en accord avec le fait que HIF-2α favorise la survie des cellules tumorales

(Bertout et al. 2009).

De manière intéressante, et contrairement aux résultats de notre étude sur HIF-1α (Ader et al.

2008), nous montrons que la régulation de HIF-2α par la SphK1 dans les ccRCC a lieu selon un

158!

mécanisme indépendant du protéasome, quelque soit le statut pVHL de ces lignées. En effet, nos

résultats indiquent que la SphK1 régule la synthèse de HIF-2α via la voie mTOR, souvent

dérégulée dans les cancers et impliquée dans la régulation de la traduction de HIF-2α (Toschi et

al. 2008b). De plus, nous montrons que la protéine kinase Akt constitue un lien entre la voie

SphK1/S1P et mTOR puisque la déplétion de la SphK1 inhibe l’activation des protéines Akt et

mTOR. Sachant qu’Akt peut être activée par les S1PRs (Takabe et al. 2008), et que l’hypoxie induit

une surproduction de S1P (Anelli et al. 2008, Schnitzer et al. 2009), nous avons étudié l’effet de la

neutralisation de la S1P extracellulaire sur le taux intracellulaire de HIF-2α. L’utilisation du

Sphingomab®, un anticorps neutralisant la S1P extracellulaire, ainsi que la déplétion du

transporteur Spns2, responsable de l’export de la S1P, établissent l’implication de la S1P

extracellulaire dans la régulation de HIF-2α dans les ccRCC.

En conclusion, notre étude démontre que la voie SphK1/S1P constitue un régulateur clé de HIF-

2α dans différents modèles tumoraux, en particulier dans les ccRCC, tumeurs rénales les plus

fréquentes et dont les formes métastatiques sont agressives, résistantes aux chimiothérapies et

généralement incurables (Jonasch et al. 2014). Une étude ayant montré que la SphK1 est

surexprimée dans des xénogreffes de ccRCC résistantes à l’inhibition du VEGFR2, et que le

Sphingomab® retarde la croissance de ces mêmes tumeurs (Zhang et al. 2015), il apparaît que

l’inhibition de la voie SphK1/S1P représente une stratégie thérapeutique alternative à l’utilisation

des thérapies ciblées dirigées contre mTOR et la voie du VEGF. Le ciblage de la S1P en clinique

est à portée de main, puisque la forme humanisée du Sphingomab® est actuellement évalué dans

une étude clinique de phase II pour le traitement des ccRCC métastatiques inopérables et

résistants aux thérapies ciblées (NCT01762033). Une telle stratégie anti-S1P pourrait procurer un

bénéfice thérapeutique non seulement pour les ccRCC, mais également pour d’autres cancers où

HIF-2α joue un rôle important.

159!

2. Implication des récepteurs à S1P dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α

Les travaux de notre équipe établissent que la SphK1 constitue un régulateur canonique de HIF-

1α et HIF-2α dans différents modèles tumoraux dont les ccRCC, et que cette lipide-kinase exerce

son effet par deux mécanismes distincts. En effet, la SphK1 régule la stabilité de HIF-1α via un

mécanisme dépendant de la voie Akt/GSK3β (Ader et al. 2008), et la synthèse de HIF-2α via un

mécanisme impliquant la voie Akt/mTOR et les protéines p70S6K et 4EBP1 (Gstalder et al. 2015).

Pour aller plus loin, nous avons mis en évidence l’implication de la S1P extracellulaire dans la

régulation de HIF-1α et HIF-2α. En effet, l’inhibition de l’export de la S1P ainsi que la

neutralisation de la S1P extracellulaire entrainent une forte diminution du taux intracellulaire de

HIF-1α et HIF-2α dans différents modèles tumoraux (Ader et al. 2015, Gstalder et al. 2015). Au vu

de ces résultats, et sachant que l’action extracellulaire de la S1P a lieu via son interaction avec l’un

de ses cinq récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs S1PRs (S1P1-5), nous avons voulu

déterminer l’implication de ces S1PRs dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α.

2.1. Rôle des S1P1-3-4-5 dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α

Les effets biologiques de la S1P extracellulaire dépendent des voies de signalisation activées en

aval des S1PRs mais aussi du niveau d’expression de ces récepteurs, qui diffère selon les tissus.

Par conséquent, nous avons déterminé le profil d’expression des S1PRs dans deux lignées de

ccRCC, l’une exprimant pVHL (CAKI-1) et l’autre non (A498), ainsi que dans une lignée

d’adénocarcinome prostatique (PC3) et de glioblastome (U87), afin d’élargir notre étude à

d’autres modèles. Dans ces quatre lignées cellulaires, nous avons évalué l’expression de l’ARNm

et l’expression protéique des S1PRs par qRT-PCR et western blot (Figures 8A et 8B,

respectivement). Nos résultats indiquent que les lignées CAKI-1, A498, PC3 et U87 expriment les

cinq S1PRs en normoxie. Des résultats similaires ont été observés en hypoxie.

160!

Figure 8. Profil d’expression des S1PRs dans les lignées CAKI-1, A498, PC3 et U87. (A) Détermination du profil d’expression de l’ARNm des S1PRs en normoxie par qRT-PCR. Colonnes, moyenne de quatre expériences indépendantes. Barres, SEM. UA : unités arbitraires (B) Détermination du profil d’expression des S1PRs en normoxie par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes.

Afin d’évaluer l’implication des S1PRs dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α dans nos lignées

cellulaires tumorales, nous avons utilisé le FTY720, un antagoniste des récepteurs S1P1-3-4-5, à la

concentration de 10µM, une dose couramment utilisée dans la littérature (Brinkmann et al. 2010).

Nos résultats indiquent qu’après 24 heures de traitement, le FTY720 diminue d’au moins 80%

l’expression protéique de HIF-1α et HIF-2α induite par l’hypoxie dans les lignées CAKI-1 et PC3

(Figure 9A). La lignée A498, quant à elle, n’exprime pas HIF-1α et est qualifiée de pseudo-

hypoxique puisqu’elle est délétée pour pVHL, et exprime ainsi HIF-2α de manière constitutive en

normoxie. Dans cette lignée, le FTY720 inhibe totalement l’expression de HIF-2α en normoxie

(Figure 9A). Ces résultats suggèrent que les récepteurs S1P1, S1P3, S1P4 et S1P5 sont impliqués

dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α dans les lignées A498, CAKI-1 et PC3. Cependant, cette

expérience n’a pas pu être réalisée dans la lignée U87 en raison d’une trop forte sensibilité de ces

cellules au FTY720 à la dose utilisée. Les proprietés pro-apoptotiques du FTY720 ayant été

décrites (Azuma et al. 2003b), l’observation au microscope des cellules U87 révèle en effet que ce

composé induit la mort de la quasi-totalité d’entre elles.

Le mécanisme d’action du FTY720 a principalement été décrit sur le S1P1 où il agit comme un

161!

antagoniste fonctionnel. En effet, une fois phosphorylé, le FTY720 se lie au S1P1 pour induire son

internalisation puis son ubiquitinylation et sa dégradation par le protéasome. Ceci conduit à une

diminution de son expression à la surface de la cellule (Oo et al. 2007). Nous avons donc

déterminé si la diminution de l’expression de HIF-1α et HIF-2α induite par le FTY720 est corrélée

à une diminution de l’expression du S1P1. Nos résultats de western blot montrent en effet

qu’après 6 à 24 heures de traitement, le FTY720 entraine une diminution de l’expression

protéique du S1P1 dans les lignées A498, CAKI-1 et PC3, ce qui suggère que l’inhibition de HIF-

1α et HIF-2α induite par le FTY720 pourrait s’expliquer par la dégradation du S1P1 (Figure 9B).

D’autre part, des études ont montré qu’en plus de ses propriétés antagonistes des S1P1-3-4-5, le

FTY720 est également un inhibiteur de la SphK1 (Pchejetski et al. 2010, Lim et al. 2011). Nos

résultats de tests d’activité kinase indiquent en effet que le FTY720 entraine une diminution

d’environ 35% à 65% de l’activité enzymatique de la SphK1 en normoxie ou en hypoxie selon les

lignées (Figure 9C). Ces données confirment les propriétés inhibitrices du FTY720 vis-à-vis de la

SphK1.

2.2. Le S1P1 contrôle l’expression de HIF-1α et HIF-2α Le FTY720 induisant une diminution de l’expression protéique du S1P1, ainsi que de HIF-1α et

HIF-2α (Figures 9A et 9B), nous avons voulu déterminer l’implication du S1P1 dans la régulation

de ces deux facteurs en évaluant l’effet de la déplétion de ce récepteur, par différentes stratégies

d’interférence à l’ARN, sur l’expression intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α. Dans un premier

temps, nous avons validé l’efficacité et la spécificité de deux siRNA dirigés contre le S1P1 – les

siS1P1(a) et siS1P1(b) – par qRT-PCR. Nos résultats montrent que le siS1P1(a) entraine une

diminution significative de l’expression de l’ARNm du S1P1, de 30% à 60% selon les lignées

cellulaires, et qu’il ne modifie pas l’expression de l’ARNm des autres S1PRs, validant ainsi

l’efficacité et la spécificité de cette séquence (Figure 10). Le siS1P1(b), quant à lui, entraine une

diminution significative de l’expression de l’ARNm du S1P1, de 50% à 70% selon les lignées

cellulaires, mais semble moins spécifique que le siS1P1(a) vis-à-vis des autres S1PRs (Figure 10).

En effet, le siS1P1(b) entraine notamment une diminution respective de 20% et 50% de

l’expression de l’ARNm du S1P2 dans les lignées PC3 et CAKI-1, ainsi qu’une diminution de 60%

de l’expression de l’ARNm du S1P5 dans les lignées A498 et CAKI-1. La déplétion du S1P1

entraine une diminution de 80% à 90% de l’expression de HIF-2α dans la lignée A498 en

normoxie (Figures 11A et 11B), et une diminution d’environ 90% de l’expression de HIF-1α et

HIF-2α dans les lignées CAKI-1 et U87 en hypoxie (Figures 11A et 11B). Dans ces trois lignées

162!

cellulaires, le siS1P1(a) et le siS1P1(b) ont des effets similaires sur l’expression de HIF-1α et HIF-

2α, démontrant que les effets observés sont uniquement dus à la déplétion du S1P1, et non pas à

celle d’un autre S1PR. Dans la lignée PC3, le siS1P1(a) entraine une diminution respective de 50%

et 60% de l’expression de HIF-1α et HIF-2α en hypoxie. Le siS1P1(b) entraine quant à lui une

diminution de 90% de l’expression de ces facteurs (Figures 11A et 11B). Une telle différence entre

les effets de ces deux siRNA pourrait s’expliquer par le fait que le siS1P1(b) entraine une

diminution de l’expression de l’ARNm des S1P2 et S1P3 (Figure 10). Ces récepteurs pourraient en

effet être impliqués dans la régulation des facteurs HIF en hypoxie dans la lignée PC3.

L’implication du S1P1 dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α a été confirmée par l’utilisation

d’un antagoniste spécifique du S1P1, le W146 (Gonzalez-Cabrera et al. 2008) (Figure 11C), ainsi

qu’à l’aide deux lignées stables transduites par des shRNA, les lignées CAKI-1-shCtrl et CAKI-1-

shS1P1. En effet, la lignée CAKI-1-shS1P1, qui exprime dix fois moins l’ARNm du S1P1 que la

lignée CAKI-1-shCtrl (Figure 11D), présente un taux intracellulaire de HIF-1α et de HIF-2α dix

fois inférieur à celui de la lignée CAKI-1-shCtrl (Figure 11E). Dans leur ensemble, ces résultats

montrent que le S1P1 contrôle l’expression intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α en hypoxie dans

des lignées de ccRCC, d’adénocarcinome prostatique et de glioblastome ; ainsi que celle de HIF-

2α en normoxie dans une lignée de ccRCC déficiente pour pVHL.

163!

Figure 9. Effet du FTY720 sur le taux intracellulaire de HIF-1α , de HIF-2α , du S1P1 et sur l’activité de la SphK1. (A) Effet du FTY720 sur le taux intracellulaire de HIF-1α et de HIF-2α. Les cellules A498, CAKI-1 et PC3 sont traitées au FTY720 (10µM) ou au DMSO (contrôle) pendant 24h, les 6 dernières heures de traitement ayant lieu ou non en hypoxie (0,1% O2). L’expression de HIF-1α et de HIF-2α est ensuite évaluée par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes. (B) Effet du FTY720 sur l’expression du S1P1. Les cellules A498, CAKI-1 et PC3 sont traitées au FTY720 (10µM) ou au DMSO (contrôle) pendant 6h ou 24h. L’expression du S1P1 est ensuite évaluée par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes. (C) Effet du FTY720 sur l’activité de la SphK1. Les cellules A498, CAKI-1 et PC3 sont traitées au FTY720 (10µM) ou au DMSO (contrôle) pendant 24h, les 2 dernières heures de traitement ayant lieu ou non en hypoxie (0,1% O2). L’activité enzymatique de la SphK1 est ensuite mesurée. Colonnes, moyenne de six (A498, CAKI-1) ou deux (PC3) expériences indépendantes. Barres, SEM. *, p<0,05. **, p<0,01. ***, p<0,001.

164!

Figure 10. Validation de deux siRNA dirigés contre le S1P1. Les cellules A498, CAKI-1, PC3 et U87 sont transfectées pendant 72h avec un siRNA dirigé contre le récepteur S1P1 (siS1P1(a) à 50nM, siS1P1(b) à 40nM) ou avec un siScramble (50nM, contrôle). L’expression de l’ARNm des S1PRs est ensuite déterminée par qRT-PCR. Colonnes, moyenne de trois expériences indépendantes. Barres, SEM. *, p<0,05. **, p<0,01. ***, p<0,001. UA : unités arbitraires.

165!

Figure 11. Implication du S1P1 dans la régulation du taux intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α . (Légende page suivante)

166!

2.3. Rôle du S1P1 dans la régulation de l’expression des gènes cibles de HIF (Résultats préliminaires)

Par la suite, nous avons voulu déterminer si l’inhibition de HIF-1α et HIF-2α induite par la

déplétion du S1P1 est corrélée à une diminution de l’activité transcriptionnelle de ces facteurs.

Pour cela, nous avons évalué l’expression de la cycline D1, un gène cible de HIF-2 impliqué dans

la progression du cycle cellulaire, ayant ainsi des propriétés pro-prolifératives (Raval et al. 2005).

Nos résultats montrent que la déplétion du S1P1 en hypoxie entraine une diminution de 50% à

80% de l’expression de la cycline D1 en fonction des lignées cellulaires (Figure 12A). De plus, des

tests de prolifération par incorporation de thymidine tritiée indiquent que la déplétion du S1P1 en

hypoxie est également associée à une diminution de la prolifération cellulaire, allant de 30% à

70% selon les lignées (Figure 12B). Ces résultats préliminaires suggèrent d’une part que le S1P1

pourrait être impliqué dans la régulation des gènes cibles de HIF ; et d’autre part que les

propriétés pro-prolifératives du S1P1 pourraient s’expliquer par son rôle dans la régulation de

l’expression de HIF-2α et donc de la cycline D1. Des expériences sont en cours au laboratoire afin

de compléter l’étude de l’implication du S1P1 dans la régulation de l’expression des gènes cibles

de HIF.

Figure 11. Implication du S1P1 dans la régulation du taux intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α . (Page précédente) (A, B) Effet de la déplétion transitoire du S1P1 sur le taux intracellulaire de HIF-1α et de HIF-2α. Les cellules A498, CAKI-1, PC3 et U87 sont transfectées pendant 72h avec le siS1P1(a) (50nM, A) ou le siS1P1(b) (40nM, B), en comparaison avec un siScramble (50nM, contrôle), puis sont incubées en hypoxie (0,1% O2) ou en normoxie (21% O2) pendant 6h. L’expression de HIF-1α et de HIF-2α est ensuite évaluée par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes. (C) Effet du W146 sur le taux intracellulaire de HIF-1α et de HIF-2α. Les cellules A498, CAKI-1, PC3 et U87 sont cultivées en absence de sérum pendant 16h puis sont traitées au W146 (5µM) ou à l’éthanol (contrôle) et incubées en hypoxie (0,1% O2) ou en normoxie (21% O2) pendant 6h. L’expression de HIF-1α et de HIF-2α est ensuite évaluée par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes. (D) Validation des lignées CAKI-1-shCtrl et CAKI-1-shS1P1 par qRT-PCR. Colonnes, moyenne de trois expériences indépendantes. Barres, SEM. ***, p<0,001. UA : unités arbitraires. (E) Effet de la déplétion permanente du S1P1 sur le taux intracellulaire de HIF-1α et de HIF-2α. Les cellules CAKI-1-shCtrl et CAKI-1-shS1P1 sont incubées en hypoxie (0,1% O2) ou en normoxie (21% O2) pendant 6h. L’expression de HIF-1α et de HIF-2α est ensuite évaluée par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes.

167!

Figure 12. Effet de la déplétion du S1P1 sur l’expression de la cycline D1 et sur la prolifération des cellules tumorales in vitro. (A) Effet de la déplétion transitoire du S1P1 sur l’expression intracellulaire de la cycline D1.!Les cellules A498, CAKI-1, PC3 et U87 sont transfectées pendant 72h avec le siS1P1(a) (50nM), en comparaison avec un siScramble (50nM, contrôle), puis sont incubées en hypoxie (0,1% O2) ou en normoxie (21% O2) pendant 18h. L’expression de la cycline D1 est ensuite évaluée par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de deux expériences indépendantes. (B) Effet de la déplétion transitoire du S1P1 sur la prolifération cellulaire. Les cellules A498, CAKI-1, PC3 et U87 sont transfectées pendant 72h avec le siS1P1(a) (50nM), en comparaison avec un siScramble (50nM, contrôle); puis sont placées ou non en hypoxie (0,1% O2) pendant les dernières 24h. La prolifération cellulaire est ensuite évaluée par test d’incorporation de thymidine tritiée. Colonnes, moyenne de trois expériences indépendantes. Barres, SEM. *, p<0,05. **, p<0,01. ***, p<0,001.

168!

3. Etude de l’inhibition de la voie SphK1/S1P sur l’adaptation à l’hypoxie intratumorale et sur la sensibilisation à la chimiothérapie dans un modèle murin de ccRCC

Les ccRCC sont connus pour être résistants à la chimiothérapie. Dans ces tumeurs, comme dans la

majorité des cancers, la surexpression de la SphK1 aboutit à la dérégulation du biostat

sphingolipidique en faveur de la S1P, qui favorise l’angiogenèse et protège les cellules tumorales

de l’apoptose induite par la chimiothérapie (Chae et al. 2004, Maceyka et al. 2012, Giussani et al.

2014). De plus, la surexpression de la SphK1 est généralement corrélée à une diminution de la

survie des patients (Zhang et al. 2014c), faisant de la voie SphK1/S1P une cible thérapeutique

d’intérêt en cancérologie (Cuvillier 2008). L’hypoxie intratumorale constitue également un facteur

de mauvais pronostic (Vaupel and Mayer 2007) et favorise l’agressivité tumorale via l’activation

des facteurs HIF. Ces derniers sont à l’origine de la surproduction de VEGF par les cellules

tumorales, et promeuvent ainsi la formation d’un réseau vasculaire tumoral dense et immature

qui renforce l’hypoxie intratumorale pour former un cercle vicieux et favoriser la résistance

thérapeutique, notamment la chimiorésistance (Jain 2005, Carmeliet and Jain 2011b, Semenza

2012a). Le ciblage de ce réseau vasculaire tumoral anormal induit par les facteurs HIF et le VEGF

constitue ainsi une stratégie thérapeutique pertinente. Alors que l’inhibition directe des facteurs

de transcription HIF est une tâche difficile (Melillo 2006), le ciblage d’une voie en amont de ces

facteurs s’avère plus pragmatique.

Notre équipe ayant démontré que la voie SphK1/S1P constitue un régulateur canonique de HIF-

1α et HIF-2α dans différents modèles tumoraux dont les ccRCC (Ader et al. 2008, Ader et al. 2015,

Gstalder et al. 2015), et au vu de l’importance de ces facteurs dans le développement et la

progression de ces tumeurs (Kondo et al. 2003, Fu et al. 2011), nous avons voulu évaluer in vivo

l’impact de l’inhibition de la voie SphK1/S1P sur l’hypoxie intratumorale, l’angiogenèse et la

chimiosensibilité d’un modèle murin de ccRCC. Pour cela, nous avons utilisé le FTY720,

inhibiteur de la SphK1, antagoniste fonctionnel du S1P1 (Brinkmann et al. 2002, Pchejetski et al.

2010, Tonelli et al. 2010), et dont nous avons démontré les propriétés inhibitrices de HIF-1α et

HIF-2α in vitro. Le FTY720 étant déjà utilisé en clinique humaine, il constitue un outil

thérapeutique de choix pour notre étude. Nous avons ainsi étudié l’effet de l’inhibition de la voie

SphK1/S1P par le FTY720 dans un modèle murin de ccRCC établi par xénogreffe hétérotopique

de cellules CAKI-1 dans des souris nude (Figure 13). Dans ce modèle, les animaux sont traités au

FTY720 à la dose de 2,5mg/kg/j, une dose couramment utilisée dans la littérature, ou au DMSO,

utilisé comme contrôle, pendant 3 à 9 jours. Au jour de l’initiation du traitement (J0), ou après 3,

169!

5, 7 ou 9 jours de traitement au FTY720 ou au DMSO, les souris sont sacrifiées afin de prélever

leurs tumeurs et leur sang total qui nous ont permis, en premier lieu, de caractériser dans le

temps l’effet de l’inhibition de la voie SphK1/S1P sur l’adaptation à l’hypoxie intratumorale, sur

l’angiogenèse ainsi que sur la prolifération et la survie des cellules tumorales.

Figure 13. Protocole in vivo n°1. Dix millions de cellules CAKI-1 ont été implantées en sous-cutané dans le flanc droit de souris nude afin de former des xénogreffes hétérotopiques. Quinze jours après implantation, alors que les tumeurs atteignent un volume de 100mm3 environ, les souris sont traitées chaque jour au FTY720 (2,5mg/kg), ou au DMSO (contrôle) jusqu’à neuf jours. Après 0, 3, 5, 7 ou 9 jours de traitement, les souris sont sacrifiées afin de prélever leurs tumeurs et leur sang total. Chaque groupe est constitué de 8 animaux, à l’exception du groupe J0 qui en contient 4. IF : immunofluorescence, IHC : immunohistochimie ; ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay WB : western blot.

3.1. Le FTY720 diminue transitoirement l’expression intratumorale de HIF-1α et HIF-2α ainsi que la sécrétion tumorale de VEGF

Notre équipe ayant montré que la voie SphK1/S1P régule HIF-1α et HIF-2α, (Ader et al. 2008,

Gstalder et al. 2015), et sachant que le blocage de cette voie par le FTY720 inhibe HIF-1α et HIF-2α

in vitro (cf. partie 2), nous avons dans un premier temps étudié l’effet du FTY720 sur l’expression

intratumorale de HIF-1α et HIF-2α dans notre modèle murin de ccRCC. Pour cela, nous avons

réalisé un western blot sur des lysats de tumeurs fraiches prélevées à J0 ou après 3 à 9 jours de

traitement au FTY720 ou au DMSO (Figures 14A et 14B). Alors que HIF-1α et HIF-2α sont

exprimés par les tumeurs contrôles tout au long du protocole, nos résultats indiquent qu’après 3

jours de traitement, le taux intratumoral de HIF-1α est diminué de 40 à 70% chez les souris

170!

traitées au FTY720 par rapport aux souris contrôles. L’inhibition de l’expression de HIF-1α est

maximale dans les tumeurs traitées 5 à 7 jours au FTY720, puisque le taux intratumoral de HIF-1α

y est diminué jusqu’à 90% par rapport aux tumeurs contrôles. Enfin, après 9 jours de traitement,

le taux intratumoral de HIF-1α chez les souris traitées au FTY720 devient équivalent à celui des

souris contrôles (Figure 14A). Un profil similaire est observé pour l’expression intratumorale de

HIF-2α (Figure 14B). En effet, après 5 jours de traitement, le FTY720 entraine une diminution de

90% du taux intratumoral de HIF-2α par rapport au traitement contrôle. Cette forte inhibition de

HIF-2α se poursuit jusqu’au 7ème jour de traitement où elle est de 70% en moyenne. Enfin, HIF-2α

est réexprimé après 9 jours de traitement au FTY720.

L’ensemble de ces résultats indique que chez les souris contrôles, l’expression intratumorale de

HIF-1α et HIF-2α est dynamique et variable dans le temps ainsi que d’une tumeur à une autre à

un temps donné ; et montre qu’en comparaison du traitement contrôle, le FTY720 entraine une

diminution forte et transitoire de l’expression intratumorale de HIF-1α et HIF-2α entre le 5ème et le

7ème jour de traitement.

Par la suite, nous avons souhaité déterminer si cette inhibition transitoire de l’expression

intratumorale de HIF-1α et HIF-2α est corrélée à une diminution de l’activité transcriptionnelle

de ces facteurs, et donc à une diminution de l’expression de leurs gènes cibles. Nous nous

sommes particulièrement intéressés au VEGF, principal facteur pro-angiogénique, dont la

surproduction par les cellules tumorales entraine une vascularisation forte mais structurellement

et fonctionnellement anormale, ce qui renforce l’hypoxie intratumorale et contribue à l’échec

thérapeutique (Carmeliet and Jain 2000, Jain 2005). Ainsi, afin d’évaluer l’effet du FTY720 sur la

sécrétion tumorale de VEGF, nous avons réalisé un test ELISA sur des échantillons de plasma de

nos animaux. Nos résultats indiquent, qu’en comparaison du traitement contrôle, le FTY720

entraine une diminution significative de 30% de la sécrétion tumorale de VEGF au 5ème jour de

traitement (Figure 14C).

Ces résultats indiquent que la diminution transitoire du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α

induite par le FTY720 in vivo est associée à une diminution de la sécrétion tumorale de VEGF,

dont l’expression est contrôlée par l’activité transcriptionnelle de ces facteurs.

171!

Figure 14. Effet du FTY720 sur le taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α et sur la sécrétion tumorale de VEGF. Analyse de l’expression intratumorale de HIF-1α (A) et HIF-2α (B) par western blot sur 22 tumeurs fraiches prélevées après 0, 3, 5, 7 ou 9 jours de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. (C) Détermination de la sécrétion tumorale de VEGF (pg/mL) par test ELISA après 0, 3, 5, 7 ou 9 jours de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour (noir) ou au DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 2 (jour 0) ou 4 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05.

172!

3.2. Le FTY720 entraine un remodelage transitoire du réseau vasculaire tumoral associé à une oxygénation tumorale

Les facteurs HIF induisant l’expression de nombreux facteurs pro-angiogéniques, dont le VEGF,

nous avons ensuite évalué l’effet du FTY720 sur la densité vasculaire tumorale de notre modèle

murin de ccRCC. Ainsi, à partir des tumeurs prélevées et incluses en paraffine, nous avons réalisé

par immunofluorescence un marquage des cellules endothéliales à l’aide d’un anticorps anti-

CD34. Nos résultats montrent une diminution de la densité vasculaire tumorale chez les animaux

traités au FTY720 en comparaison des animaux contrôles, et ceci dès le 5ème jour de traitement

(Figures 15A et 15B). Ces données confirment les propriétés anti-angiogéniques du FTY720

précédemment mises en évidence dans d’autres modèles (LaMontagne et al. 2006). Au vu de ces

résultats, nous avons voulu déterminer l’impact du FTY720 sur l’oxygénation tumorale. Dans ce

but, nous avons marqué les zones d’hypoxie intratumorale par immunohistochimie à l’aide d’un

anticorps anti-pimonidazole. Le pimonidazole est injecté aux animaux 30 à 90 minutes avant leur

sacrifice. En absence d’oxygène, ce composé est réduit et peut alors former des adduits stables

avec des groupements thiol de molécules endogènes qui pourront ainsi être détectées. Alors que

les tumeurs contrôles présentent de nombreuses zones d’hypoxie (Figure 15C), nos résultats

indiquent que le FTY720 entraine une diminution forte, de plus de 50%, et transitoire de l’hypoxie

intratumorale du 5ème au 7ème jour de traitement (Figures 15C et 15D).

Afin de déterminer comment le FTY720 peut à la fois diminuer la densité vasculaire tumorale et

augmenter l’oxygénation tumorale, nous nous sommes intéressés à la structure et à la

fonctionnalité des vaisseaux sanguins tumoraux. En premier lieu, nos résultats montrent que les

vaisseaux sanguins des tumeurs traitées au FTY720 semblent plus ouverts que ceux des tumeurs

contrôles (Figure 15A). Afin de caractériser la fonctionnalité des vaisseaux sanguins tumoraux,

nous avons étudié leur structure. Pour cela, nous avons évalué l’effet du FTY720 sur le

recouvrement péricytaire. Nous avons donc réalisé, par immunofluorescence, un double

marquage des cellules endothéliales (CD34) et des péricytes (αSMA, Figure 16A ; et desmine,

Figure 16C). Généralement, les vaisseaux sanguins tumoraux sont dépourvus de péricytes, ce qui

les rend immatures et perméables, diminuant ainsi leur fonctionnalité (Eberhard et al. 2000,

Potente et al. 2011). Une telle absence de péricytes au niveau des vaisseaux sanguins est observée

dans les tumeurs contrôles (Figures 16A et 16C). En revanche, nos résultats indiquent que le

FTY720 entraine une augmentation significative et transitoire du recouvrement péricytaire, au

5ème et au 7ème jour de traitement, en comparaison avec le traitement contrôle (Figure 16). Ces

données montrent que le FTY720 permet d’augmenter transitoirement la proportion de vaisseaux

sanguins tumoraux matures, et donc potentiellement fonctionnels.

173!

L’ensemble de nos résultats indique que dans notre modèle murin de ccRCC, le FTY720 entraine

une diminution transitoire du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α, qui corrèle dans le temps

avec une diminution de la sécrétion tumorale de VEGF, facteur pro-angiogénique favorisant la

perméabilité vasculaire. Ceci est associé à un remodelage du réseau vasculaire tumoral qui

consiste en une diminution de la densité vasculaire et en une augmentation de la maturation des

vaisseaux sanguins tumoraux, suggérant que le FTY720 induit une normalisation vasculaire

transitoire qui aboutit à une oxygénation tumorale et qui pourrait sensibiliser ce modèle murin de

ccRCC à la chimiothérapie (Jain 2001, Goel et al. 2011).

174!

Figure 15. Effet du FTY720 sur la densité vasculaire et l’hypoxie intratumorale. (A) Caractérisation de la densité vasculaire par marquage des cellules endothéliales (CD34, rouge) et des noyaux (DAPI, bleu) en immunofluorescence. Les images sont représentatives de coupes tumorales de souris traitées pendant 5 jours au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. Echelle, 200µm. (B) Nombre de vaisseaux sanguins (structures CD34+) par zone de 0,75mm2 après 0, 3, 5, 7 ou 9 jour(s) de traitement au FTY720 2,5mg/kg/j (noir) ou au DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 4 (jour 0) ou 8 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05. **, p<0,01. (C) Détection des zones d’hypoxie intratumorale par marquage immunohistochimique du pimonidazole (brun) et contre-coloration à l’hématoxyline (bleu). Les images sont représentatives de coupes tumorales de souris traitées pendant 5 jours au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. Echelle, 250µm. (D) Intensité relative du pimonidazole par zone de 0,75mm2 après 0, 3, 5, 7 ou 9 jour(s) de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour (noir) ou au DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 4 (jour 0) ou 8 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05.

175!

Figure 16. Effet du FTY720 sur le recouvrement péricytaire. (A, C) Caractérisation de la présence de péricytes au niveau des vaisseaux sanguins par marquage des cellules endothéliales (CD34, rouge), des péricytes à l’aide de deux marqueurs (A, αSMA, vert ; C, desmine, vert) et des noyaux (DAPI, bleu) en immunofluorescence. Les images sont représentatives de coupes tumorales de souris traitées pendant 5 jours (A) ou 7 jours (C) au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. Echelle, 200µm. (B, D) Quantification du recouvrement péricytaire par zone de 0,75mm2 après 0, 3, 5, 7 ou 9 jours de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour (noir) ou au DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 4 (jour 0) ou 8 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05.

176!

3.3. Le FTY720 diminue la prolifération et la survie cellulaire tumorale

Les propriétés pro-prolifératives et anti-apoptotiques de la voie SphK1/S1P/S1P1 ont largement

été décrites, tout comme les propriétés anti-prolifératives et pro-apoptotiques du FTY720 in vitro

et in vivo (Cuvillier et al. 1996, Xia et al. 2000, Azuma et al. 2003b, LaMontagne et al. 2006,

Pchejetski et al. 2010). Ainsi, après avoir évalué l’impact du traitement au FTY720 sur le

compartiment endothélial des tumeurs, nous nous sommes intéressés à son effet direct sur la

prolifération et la survie des cellules tumorales.

Afin d’évaluer la prolifération des cellules tumorales de notre modèle murin de ccRCC, nous

avons déterminé la proportion de cellules positives au Ki67, un marqueur de prolifération, par

immunofluorescence. Nos résultats indiquent que le FTY720 entraine une diminution

significative de la prolifération cellulaire tumorale dès le 3ème jour de traitement pour l’inhiber

jusqu’à près de 50% au 9ème jour de traitement (Figure 17). Ces données mettent en évidence les

propriétés anti-prolifératives du FTY720 dans notre modèle murin de ccRCC.

Afin de compléter cette étude, nous avons caractérisé la mort cellulaire au sein des tumeurs. Pour

cela, nous avons tout d’abord évalué la présence de zones de nécrose dans notre modèle murin de

ccRCC. A ce jour, seules des études réalisées in vitro ont montré que le FTY720 peut induire la

mort cellulaire par nécrose et nécroptose (Zhang et al. 2010, Saddoughi et al. 2013). Afin de

détecter les zones de nécrose tumorale, nous avons réalisé une coloration à l’hémalun-éosine de

nos coupes tumorales de ccRCC. Nos résultats montrent qu’en comparaison du traitement

contrôle, le FTY720 entraine une augmentation significative de la nécrose tumorale au 5ème jour de

traitement (Figures 18A et 18B). Nous avons ensuite évalué la mort cellulaire par apoptose au

sein des tumeurs. Pour cela, nous avons réalisé un marquage immunohistochimique de la

caspase-3 clivée, cette forme activée de la caspase-3 étant impliquée dans le déclenchement de

l’apoptose. Alors que l’induction de l’expression de la caspase-3 clivée par le FTY720 a

uniquement été montrée dans des modèles tumoraux in vitro (Wang et al. 1999, Nagahara et al.

2000, Pchejetski et al. 2010), nos résultats indiquent que le FTY720 induit une augmentation de

l’expression de la caspase-3 clivée dans notre modèle murin de ccRCC au 5ème jour de traitement,

démontrant une augmentation de l’apoptose à ce jour (Figures 18C et 18D).

Ces données indiquent que le FTY720 favorise la mort des cellules tumorales, qui corrèle dans le

temps avec la diminution du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α. Ces deux facteurs régulant

l’expression de protéines impliquées dans l’apoptose et la necroptose, telles que BNIP3

(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) ou TNFα, la diminution de leur taux

intratumoral pourrait être à l’origine de la diminution de la survie cellulaire induite par le

FTY720.

177!

Figure 17. Effet du FTY720 sur la prolifération des cellules tumorales in vivo. (A) Caractérisation de la prolifération tumorale par marquage des cellules positives pour Ki67 (rouge) et des noyaux (DAPI, bleu) en immunofluorescence. Les images sont représentatives de coupes tumorales de souris traitées pendant 5 jours au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. Echelle, 200µm. (B) Pourcentage de cellules positives pour Ki67 par zone de 0,75mm2 après 0, 3, 5, 7 ou 9 jour(s) de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour (noir) ou au DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 4 (jour 0) ou 8 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05. **, p<0,01. ***, p<0,001.

178!

Figure 18 Effet du FTY720 sur la mort cellulaire in vivo. (A) Détection des zones de nécrose tumorale par coloration à l’hémalun-éosine. Les images sont représentatives de coupes tumorales de souris traitées pendant 5 jours au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. Echelle, 250µm. (B) Quantification des zones de nécrose tumorale, déterminée par le rapport des aires de nécrose sur l’aire de la coupe tumorale après 0, 3, 5, 7 ou 9 jour(s) de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour (noir) or DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 4 (jour 0) ou 8 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05. (C) Détection de la mort cellulaire par apoptose par marquage immunohistochimique de la caspase-3 clivée (brun) et contre-coloration à l’hématoxyline (bleu). Les images sont représentatives de coupes tumorales de souris traitées pendant 5 jours au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. Echelle, 200µm. (D) Quantification des cellules positives pour la caspase-3 clivée par zone de 0,75mm2 après 0, 3, 5, 7 ou 9 jours de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour (noir) ou DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 2 (jour 0) ou 4 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05.

179!

3.4. Le FTY720 chimiosensibilise un modèle murin de ccRCC

De nombreuses études précliniques ont montré qu’une utilisation judicieuse des agents anti-

angiogéniques permet de normaliser le réseau vasculaire tumoral et d’oxygéner la tumeur afin

d’améliorer la délivrance des thérapies anti-cancéreuses (Matsuoka et al. 2003, Tong et al. 2004).

Ainsi, nous avons voulu savoir si la normalisation vasculaire et l’oxygénation tumorale induites

par le FTY720 entre le 5ème et le 7ème jour de traitement, permettent de chimiosensibiliser un

modèle murin de ccRCC établi par xénogreffe hétérotopique d’un fragment tumoral, issu de

cellules CAKI-1, dans des souris nude (Figure 19). Dans ce modèle, nous avons combiné le FTY720

à la gemcitabine, une chimiothérapie largement testée lors d’essais cliniques pour le traitement

des ccRCC qui s’y sont finalement avérés résistants (Lilleby and Fossa 2005). Les souris ont été

réparties en cinq groupes, dont un groupe contrôle (groupe 1), un groupe traité au FTY720 dès J0

(groupe 2) et un groupe traité à la gemcitabine dès J0 (groupe 3). Un autre groupe de souris

(groupe 4) a été traité par le FTY720 et la gemcitabine dès J0, et un dernier (groupe 5) a été traité

par le FTY720 à partir de J0 puis par la gemcitabine à partir de J5 (Figure 19). Dans ce dernier

groupe, la gemcitabine a donc été administrée au moment qui correspond au début de la fenêtre

d’oxygénation induite par le FTY720 dans le précédent protocole. L’efficacité de ces traitements a

été évaluée par mesure du volume tumoral ; leur toxicité et leur tolérance par numération

formule sanguine (NFS) à la fin du protocole et par suivi du poids des animaux.

En accord avec la littérature, nos résultats indiquent que notre modèle murin de ccRCC est

insensible à la gemcitabine (Lilleby and Fossa 2005), et que le FTY720 administré seul tend à

diminuer la croissance tumorale (LaMontagne et al. 2006) (Figures 20A et 20B). De manière

intéressante, nos résultats montrent que le FTY720 associé à la gemcitabine permet de ralentir la

croissance tumorale. En effet, à J14, ce sont les souris traitées à la fois au FTY720 et à la

gemcitabine (groupes 4 et 5) qui présentent les tumeurs de plus petites tailles. A J14, le FTY720, la

gemcitabine, la combinaison « FTY720 et gemcitabine » et la combinaison « FTY720 puis

gemcitabine » entrainent respectivement une diminution du volume tumoral de 30%, 21%, 55% et

52% en comparaison du traitement contrôle. Il existe donc un effet additif entre la gemcitabine et

le FTY720, ce dernier permettant donc de sensibiliser notre modèle murin de ccRCC à la

chimiothérapie.

En revanche, il n’existe pas de différence de volume tumoral entre les souris traitées par la

combinaison « FTY720 et gemcitabine » (groupe 4) et les souris traitées par la combinaison

« FTY720 puis gemcitabine » (groupe 5). Ce résultat ne nous permet pas d’expliquer par quel(s)

mécanisme(s) le FTY720 exerce son effet chimiosensibilisant. Cet effet peut être associé à une

180!

normalisation vasculaire et à une oxygénation tumorale mais peut également être dû à un autre

mécanisme.

Figure 19. Protocole in vivo n°2. Des fragments tumoraux de 2mm3 – issus de tumeurs obtenues par implantation sous-cutanée de 10 millions de cellules CAKI-1 - ont été implantés en sous-cutané dans le flanc droit de souris nude afin de former des xénogreffes hétérotopiques. Quinze jours après implantation, alors que les tumeurs atteignent un volume de 100mm3 environ, les souris sont réparties dans cinq groupes composés chacun de cinq à sept souris. Les animaux sont traités au DMSO ou au PBS à partir de J0 (contrôle, groupe 1, n=6) ; au FTY720 2,5mg/kg/j à partir de J0 (groupe 2, n=6) ; à la gemcitabine 2mg/kg deux fois par semaine à partir de J0 (groupe 3, n=5) ; au FTY720 2,5mg/kg/j et à la gemcitabine 2mg/kg deux fois par semaine à partir de J0 (groupe 4, n=7) ; au FTY720 2,5mg/kg/j à partir de J0 et à la gemcitabine 2mg/kg deux fois par semaine à partir de J5 (groupe 5, n=6). A J13, un prélèvement sanguin est effectué afin de réaliser une numération formule sanguine. Les animaux sont sacrifiés à J14. La tolérance des traitements a été évaluée par le suivi du poids des animaux (Figure 20C). Nos

données indiquent que les souris contrôles et les souris traitées par la gemcitabine seule ont un

poids en augmentation légère et constante entre J0 et J14. A l’inverse, les souris traitées par le

FTY720 seul ou par la combinaison « FTY720 puis gemcitabine » présentent une baisse de poids

significative après sept jours de traitement. En effet, à J7, le poids de ces souris est respectivement

diminué de 7% et 5% par rapport au jour de l’initiation du traitement (J0). Les souris semblent

ensuite s’adapter à ces traitements pour mieux les tolérer puisqu’on observe un gain de poids

entre J7 et J14, où les valeurs de poids des animaux tendent vers celles mesurées à J0. L’ensemble

de ces résultats suggère que les différents traitements administrés aux animaux sont finalement

bien tolérés.

L’analyse de la NFS, réalisée sur des échantillons sanguin des animaux à J13, indique que la

combinaison « FTY720 et gemcitabine » entraine une forte lymphopénie. En effet, à J13, les

animaux traités par cette association présentent environ deux fois moins de lymphocytes

circulants que les animaux contrôles (Figure 21A). Cependant, une étude que nous avons réalisée

à l’aide du même modèle murin de ccRCC indique que la lymphopénie induite par le FTY720 est

181!

réversible après l’arrêt du traitement (Figure 21B). Par ailleurs, les résultats de la NFS indiquent

que les différents traitements administrés ne présentent aucune autre toxicité envers les cellules

sanguines (Figure 21A).

L’ensemble de ces données montre que les deux combinaisons « FTY720 et gembitabine » et

« FTY720 puis gemcitabine » ont une efficacité anti-tumorale similaire, mais ne permettent pas

d’expliquer comment le FTY720 exerce son effet chimiosensibilisant. Parmi ces deux stratégies, la

combinaison « FTY720 puis gemcitabine » est la mieux tolérée.

Figure 20. Effet du FTY720 sur la chimiosensibilité d’un modèle murin de ccRCC. (A, B) Evolution de la croissance tumorale depuis le jour de l’implantation jusqu’à J14 (A) et mesure du volume tumoral à J14 (B) des animaux traités au PBS ou au DMSO (groupe 1), au FTY720 (groupe 2), à la gemcitabine (groupe 3), au FTY720 et à la gemcitabine (groupe 4), ou au FTY720 puis à la gemcitabine (groupe 5). Symboles, colonnes, moyenne de cinq à sept souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05. (C) Evolution du poids des animaux depuis le jour de l’implantation jusqu’à J14. Les animaux sont traités au PBS ou au DMSO (groupe 1), au FTY720 (groupe 2), à la gemcitabine (groupe 3), au FTY720 et à la gemcitabine (groupe 4), ou au FTY720 puis à la gemcitabine (groupe 5). Symboles, moyenne de cinq à sept souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05.

182!

Figure 21. Effet des traitements sur la numération formule sanguine. (A) Quantification plasmatique des érythrocytes, de l’hémoglobine, des plaquettes, des leucocytes, des lymphocytes, des monocytes et des granulocytes à J13 chez les animaux traités au PBS ou au DMSO (groupe 1), au FTY720 (groupe 2), à la gemcitabine (groupe 3), au FTY720 et à la gemcitabine (groupe 4), ou au FTY720 puis à la gemcitabine (groupe 5). Colonnes, moyenne de cinq à sept souris par groupe. Barres, SEM. **, p<0,01. Les échantillons sanguins ont été analysés à l’aide de l’appareil ABX Micros 60 Haematology Analyzer. (B) Quantification plasmatique des lymphocytes à J14 et à J28 chez des animaux traités au DMSO ou au FTY720. Colonnes, moyenne de trois souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05. Les échantillons sanguins ont été analysés à l’aide de l’appareil ABX Micros 60 Haematology Analyzer. !!!!!!!!

183!

Discussion

184!

185!

La voie SphK1/S1P joue un rôle majeur dans la progression tumorale. En effet, elle a notamment

été impliquée dans la prolifération et la survie cellulaire, l’angiogenèse et la résistance

thérapeutique (Maceyka et al. 2012). Les facteurs HIF, quant à eux, ont une importance

particulière dans le développement et la progression des ccRCC, où ils favorisent l’agressivité

tumorale et l’échec thérapeutique, notamment via l’induction d’un réseau vasculaire

structurellement et fonctionnellement anormal qui renforce l’hypoxie intratumorale (Semenza

2012b). Des travaux in vitro de notre équipe ont permis de révéler des interconnexions étroites

entre le métabolisme sphingolipidique et la réponse à l'hypoxie. En effet, notre équipe a mis en

évidence pour la première fois que la SphK1 régule le taux intracellulaire de HIF-1α en hypoxie

dans plusieurs lignées cellulaires tumorales humaines, dont une lignée de ccRCC (Ader et al.

2008). Par la suite, notre équipe a montré que la SphK1 contrôle le taux intracellulaire de HIF-2α

en hypoxie dans des! lignées de ccRCC, de glioblastome et d’adénocarcinomes prostatique et

pulmonaire; ainsi qu’en normoxie dans deux lignées de ccRCC déficientes pour pVHL (Gstalder

et al. 2015).

1. La SphK1, régulateur clé de l’adaptation cellulaire à l’hypoxie

Dans un premier temps, nous nous sommes donc intéressés aux mécanismes moléculaires mis en

jeu dans la régulation de HIF-2α par la SphK1 dans les ccRCC. L’étude des mécanismes en amont

de la SphK1 révèle qu’en hypoxie, l’activation de cette enzyme a lieu selon un mécanisme

dépendant des ROS et de la PLD et confirment leur implication dans la régulation des facteurs

HIF (Ader et al. 2008, Toschi et al. 2008a). Par ailleurs, nos résultats indiquent que la SphK1 régule

non seulement le taux intracellulaire de HIF-2α mais également son activité transcriptionnelle et

l’expression de ses gènes cibles, tels que GLUT-1 et la cycline D1. De plus, la déplétion de la

SphK1 se traduit par une diminution de la prolifération cellulaire. La SphK1 confère donc un

avantage prolifératif aux cellules, ce qui est en accord avec le fait que HIF-2α favorise la survie et

la prolifération des cellules tumorales (Gordan et al. 2007a). Cette diminution de la survie et de la

prolifération cellulaire induite par la déplétion de la SphK1 pourrait s’expliquer par un arrêt du

cycle cellulaire médié par la diminution de l’expression de la cycline D1, par une diminution de

l’activité transcriptionnelle de c-Myc (Gordan et al. 2007a), ou encore par une augmentation de

l’induction de l’apoptose étant donné les propriétés anti-apoptotiques de la SphK1 et pro-

apoptotiques de p53 dont l’expression et l’activité peuvent être régulées par HIF-2α (Bertout et al.

2009, Roberts et al. 2009). D’autre part, nos résultats mettent en évidence que la régulation de HIF-

1α et HIF-2α par la SphK1 passe par deux mécanismes distincts. En effet, cette enzyme régule la

186!

stabilité de HIF-1α via un mécanisme dépendant de la voie Akt/GSK3β et de pVHL (Ader et al.

2008), et contrôle la synthèse de HIF-2α via un mécanisme impliquant la voie Akt/mTOR et les

protéines p70S6K et 4EBP1 (Gstalder et al. 2015) (Figure 22). Nos résultats indiquent également

que la SphK1 régule HIF-2α dans des lignées cellulaires de ccRCC indépendamment de leur

statut pVHL. Associés aux précédents résultats de l’équipe (Ader et al. 2008), ces travaux

permettent d’établir que la SphK1 constitue un régulateur clé de l’adaptation cellulaire à

l’hypoxie. Ainsi, la SphK1, qui régule HIF-1α et HIF-2α selon deux mécanismes distincts, devient

une cible thérapeutique de choix pour le contrôle de l’adaptation à l’hypoxie intratumorale. Cette

stratégie pourrait s’avérer pertinente pour le traitement des ccRCC, ciblés indépendamment de

leur statut d’expression de pVHL et de HIF-1α, ainsi que pour le traitement d’autres cancers dans

lesquels les facteurs HIF jouent un rôle important.

Figure 22. Mécanismes de régulation de HIF-1α et HIF-2α par la voie SphK1/S1P. En hypoxie, la SphK1 est activée via un mécanisme dépendant des ROS et de la PLD. La SphK1 régule la stabilité de HIF-1α via un mécanisme dépendant de la voie Akt/GSK3β et de pVHL dans les lignées PC3 et U87 en hypoxie. Elle régule également la synthèse de HIF-2α via un mécanisme impliquant la voie Akt/mTOR et les protéines p70S6K et 4EBP1 en normoxie et en hypoxie dans deux lignées de ccRCC déficientes pour pVHL, les lignées A498 et 786-O. Le S1P1 a quant à lui été impliqué dans la régulation du taux intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α dans la lignée A498 en normoxie et dans les lignées CAKI-1, PC3 et U87 en hypoxie. Les mécanismes mis en jeu dans ce processus restent à élucider.

187!

2. Rôle de la S1P et du S1P1 dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α

La suite de notre étude a permis d’impliquer la S1P extracellulaire dans la régulation de HIF-1α et

HIF-2α. En effet, nos résultats indiquent que l’inhibition de l’export de la S1P ainsi que la

neutralisation de la S1P extracellulaire entrainent une forte diminution du taux intracellulaire de

HIF-1α et HIF-2α dans différents modèles cellulaires (Ader et al. 2015, Gstalder et al. 2015). La S1P

extracellulaire exerçant son action via les récepteurs S1P1-5, nous avons mis en évidence

l’expression de ces cinq récepteurs dans les lignées CAKI-1, A498, PC3 et U87. Nous avons

ensuite montré que le FTY720, un antagoniste des récepteurs S1P1-3-4-5, entraine une forte

diminution du taux intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α dans les lignées CAKI-1, A498 et PC3. Ce

résultat est corrélé à une diminution de l’expression du S1P1, au niveau duquel le mécanisme

d’action du FTY720 a principalement été décrit (Oo et al. 2007). Afin de déterminer si l’inhibition

de HIF-1α et HIF-2α est la conséquence de la diminution de l’expression du S1P1, nous avons

inhibé l’expression de ce récepteur par l’utilisation d’un antagoniste spécifique ou de différentes

stratégies d’interférence à l’ARN. Nos résultats indiquent que l’inhibition du S1P1 entraine une

forte diminution du taux intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α, impliquant ainsi ce récepteur dans

le contrôle des facteurs HIF.

Nos résultats préliminaires suggèrent que le S1P1 régule également l’expression de la cycline D1,

un gène cible de HIF-2, et favorise la prolifération cellulaire dans nos modèles. Les propriétés

pro-prolifératives du S1P1 pourraient ainsi s’expliquer par son rôle dans la régulation de

l’expression de HIF-2α et donc de la cycline D1. L’implication du S1P1 dans la régulation de

l’activité transcriptionnelle des facteurs HIF doit cependant être confirmée par l’étude de l’effet

de la déplétion du S1P1 sur l’expression d’autres gènes cibles de HIF.

Nos travaux ne fournissent pas d’information quant aux voies de signalisation activées en aval du

S1P1 qui seraient impliquées dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α. Sachant que la voie

PI3K/Akt peut être activée en aval du S1P1, ce dernier étant couplé à Gi, et que nous avons

montré que la SphK1 régule la phosphorylation d’Akt, il serait intéressant de déterminer si dans

nos modèles cellulaires, le S1P1 contrôle le taux intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α via la voie

PI3K/Akt. Plus particulièrement, nous pourrions déterminer si le S1P1 régule d’une part la

stabilisation de HIF-1α via la voie PI3K/Akt/GSK3β, qui a déjà été impliquée dans la régulation

de ce facteur (Mottet et al. 2003a, Ader et al. 2008) ; et d’autre part la synthèse de HIF-2α via la

voie Akt/mTOR et les protéines p70S6K et 4E-BP1 (Figure 22). En effet, la S1P a déjà été

impliquée dans la régulation de mTOR, p70S6K et 4E-BP1 (Maeurer et al. 2009). De plus, une

étude a montré que la S1P extracellulaire régule le développement et la fonction des lymphocytes

188!

T régulateurs via le S1P1 et la voie mTOR (Liu et al. 2009). La voie de la PLC et des MAPK

pouvant également être activées en aval du S1P1, il serait intéressant de déterminer si ce récepteur

régule les facteurs HIF via l’activation de ERK. En effet, une étude a montré que le calcium agit en

amont de ERK afin de réguler positivement l’activité transcriptionnelle de HIF-1 (Mottet et al.

2003b).

3. Rôle des autres S1PRs dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α

Dans nos modèles cellulaires, nous avons mis en évidence le rôle du S1P1 dans la régulation de

HIF-1α et HIF-2α. Or nous avons également montré que nos lignées expriment les cinq S1PRs.

Par conséquent, il serait intéressant d’évaluer l’implication des récepteurs S1P2-3-4-5 dans la

régulation de HIF-1α et HIF-2α. L’ensemble de ces récepteurs étant couplés à Gi, leur éventuelle

implication dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α pourrait passer par l’activation des voies

PI3K/Akt/mTOR et MAPK.

Une étude a montré que la S1P, via le S1P3, régule positivement le taux intracellulaire de HIF-1α

dans des cellules de carcinome folliculaire de la thyroïde (Kalhori et al. 2013). Ces expériences

ayant été effectuées en normoxie, il apparaît que la S1P puisse constituer une alternative à

l’hypoxie pour induire l’expression de HIF-1α. L’expression des facteurs HIF en normoxie

constitue en effet un avantage sélectif pour les cellules tumorales (Cao et al. 2013, Lee et al. 2015b).

Ces données renforcent donc la pertinence du ciblage de la voie SphK1/S1P en cancérologie,

puisque cette stratégie thérapeutique permettrait d’inhiber HIF-1α et HIF-2α à la fois en

normoxie et en hypoxie et donc de cibler l’ensemble des cellules tumorales.

4. Le FTY720, inducteur d’une normalisation vasculaire transitoire

L’hypoxie intratumorale favorise l’agressivité tumorale et l’échec thérapeutique. C’est

notamment le cas dans les ccRCC, connus pour être résistants à la chimiothérapie. Dans ces

tumeurs, comme dans la majorité des cancers, la SphK1 est surexprimée par rapport au tissu sain

(French et al. 2003). Ceci aboutit à une production accrue de S1P, qui favorise, entre autres,

l’angiogenèse et la chimiorésistance (Chae et al. 2004, Maceyka et al. 2012, Giussani et al. 2014).

Après avoir montré que la voie SphK1/S1P constitue un régulateur clé de HIF-1α et HIF-2α dans

différents modèles tumoraux dont les ccRCC (Ader et al. 2008, Ader et al. 2015, Gstalder et al.

2015), et au vu de l’importance de ces facteurs dans le développement et la progression de ces

tumeurs (Kondo et al. 2003, Fu et al. 2011), nous avons voulu évaluer in vivo l’impact de

189!

l’inhibition de la voie SphK1/S1P sur l’hypoxie intratumorale, l’angiogenèse et la

chimiosensibilité d’un modèle murin de ccRCC. Nos résultats in vitro indiquant que le FTY720

entraine une forte diminution de l’activité enzymatique de la SphK1, du taux intracellulaire du

S1P1, de HIF-1α et HIF-2α, nous avons choisi d’utiliser ce composé pour inhiber la voie

SphK1/S1P dans notre modèle murin de ccRCC. De plus, le FTY720 étant déjà utilisé en clinique

humaine, il constitue un outil thérapeutique de choix pour notre étude. Par ailleurs, l’hypoxie

intratumorale et l’expression de HIF-1α et HIF-2α étant des phénomènes dynamiques qui

fluctuent dans le temps, nous avons caractérisé l’effet de l’inhibition de la voie SphK1/S1P en

fonction du temps.

De manière cohérente avec les résultats obtenus précédemment dans l’équipe (Ader et al. 2015),

nos résultats indiquent que l’inhibition de la voie SphK1/S1P par le FTY720 induit une

diminution forte et transitoire du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α, qui est associée à une

légère diminution de la sécrétion tumorale de VEGF, un gène cible de HIF. Nous montrons

également que le FTY720 entraine un remodelage vasculaire, qui corrèle dans le temps avec la

diminution du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α et de la sécrétion tumorale de VEGF. En

effet, le FTY720 entraine une diminution de la densité vasculaire, ce qui confirme ses propriétés

anti-angiogéniques déjà décrites dans la littérature (LaMontagne et al. 2006), et induit des

modifications morphologiques au niveau de la structure des vaisseaux sanguins tumoraux. Nous

démontrons ainsi que le FTY720 entraine une augmentation transitoire du recouvrement

péricytaire. Ceci suggère que le FTY720 permet d’augmenter transitoirement la proportion de

vaisseaux sanguins tumoraux matures, et donc potentiellement fonctionnels. Nos résultats

suggèrent donc pour la première fois que le FTY720 induit une normalisation vasculaire

transitoire. En parallèle, nous montrons que le FTY720 favorise transitoirement l’oxygénation

tumorale. Sachant qu’au sein des tumeurs, il existe un cercle vicieux entre l’activation des facteurs

HIF, l’angiogenèse tumorale et l’hypoxie intratumorale, on peut légitimement émettre

l’hypothèse que dans notre modèle, la diminution du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α

induite par le FTY720 est à l’origine d’une normalisation vasculaire qui permet d’oxygéner la

tumeur.

Alors que notre étude décrit un phénomène de normalisation vasculaire induit par le FTY720

dans un modèle murin de ccRCC, il serait intéressant de déterminer par quels mécanismes a lieu

ce processus. Nos résultats indiquent que le FTY720 diminue la densité vasculaire et augmente le

recouvrement péricytaire. Ceci peut s’expliquer de plusieurs manières différentes. Une première

hypothèse serait que le FTY720 élimine en première intention les vaisseaux immatures et donc

190!

dépourvus de péricytes, à l’image des anti-angiogéniques dirigés contre les récepteurs du VEGF

(Potente et al. 2011), pour épargner préférentiellement les vaisseaux sanguins matures. Le FTY720

pourrait également induire le recrutement des péricytes au niveau des vaisseaux sanguins, via

l’axe PDGFβ/PDGFRβ. Une troisième hypothèse serait que le FTY720 empêche le détachement

péricytaire induit par le VEGF au niveau des vaisseaux sanguins en formation. En effet, des

études ont montré que le FTY720 inhibe la perméabilité vasculaire et l’angiogenèse induites par le

VEGF (Sanchez et al. 2003, LaMontagne et al. 2006), et que dans un contexte d’angiogenèse médiée

par le PDGF, le VEGF favorise le retrait des péricytes au niveau des vaisseaux sanguins

émergents, ce qui aboutit à leur déstabilisation (Greenberg et al. 2008).

La S1P, aux propriétés pro-angiogéniques, a été décrite pour son rôle dans le maintien de

l’intégrité vasculaire, via son interaction avec le récepteur S1P1. En effet, des études ont montré

que l’axe S1P/S1P1 favorise la maturation vasculaire ainsi que la formation de jonctions

adhérentes, médiées par la VE-cadhérine, entre les cellules endothéliales (Allende et al. 2003,

Gaengel et al. 2012). Dans le même sens, une étude a montré que la dégradation du S1P1 in vivo

entraine une augmentation de la perméabilité vasculaire (Oo et al. 2011). Nos résultats, qui

indiquent que le FTY720 entraine une normalisation vasculaire, peuvent ainsi paraître

contradictoires avec les données de la littérature. Ils s’expliquent néanmoins par le fait que dans

notre étude, la normalisation vasculaire est observée lorsque le FTY720 est utilisé à faible dose –

2,5mg/kg/j – et pendant un temps court – 5 à 7 jours. Il semblerait en effet qu’au 9ème jour de

traitement, le FTY720 exerce son effet anti-angiogénique sans favoriser le recouvrement

péricytaire. Ainsi, lors d’une utilisation prolongée, le FTY720, à l’image des autres anti-

angiogéniques, ne normalise plus le réseau vasculaire tumoral mais se contente de le détruire,

ceci étant cohérant avec le concept de normalisation vasculaire (Jain 2005), ainsi qu’avec les

données de la littérature établissant le rôle de la S1P dans l’intégrité et la maturation vasculaire.

De plus, de part sa capacité à inhiber la SphK1, le FTY720 entraine une diminution de la

production de S1P. Celle-ci pouvant transactiver le récepteur VEGFR2 (Spiegel and Milstien

2003), il est possible que la normalisation vasculaire induite par le FTY720 dans notre modèle soit

due à l’inhibition de la signalisation induite par le VEGFR2.

5. Le FTY720 permet de chimiosensibiliser un modèle murin de ccRCC

La normalisation vasculaire et l’oxygénation tumorale qui en découle étant connues pour

améliorer la réponse à la chimiothérapie (Jain 2014), nous avons voulu vérifier cette hypothèse

dans notre modèle. Nous avons donc évalué dans quelle mesure la normalisation vasculaire et

l’oxygénation tumorale transitoires induites par le FTY720 permettent de sensibiliser un modèle

191!

murin de ccRCC à la gemcitabine. Nos résultats indiquent que le FTY720 a bien un effet

chimiosensibilisant dans notre modèle, mais ne permettent pas d’expliquer par quel(s)

mécanismes le FTY720 exerce cet effet. Alors que nos données indiquent que le FTY720 induit une

normalisation vasculaire après 5 à 7 jours de traitement, nous pouvons émettre l’hypothèse que le

FTY720 associé à la gemcitabine pourrait induire une normalisation vasculaire après 14 jours de

traitement. Il serait donc intéressant de caractériser l’angiogenèse tumorale après 14 jours de

traitement afin de confirmer ou non cette hypothèse et de déterminer si l’effet chimiosensibilisant

du FTY720 est dû ou non à un phénomène de normalisation vasculaire.

L’effet chimiosensibilisant du FTY720 pourrait également s’expliquer par des mécanismes

distincts de la normalisation vasculaire. Plusieurs études ont déjà montré le rôle de la SphK1 dans

la chimiorésistance de différents modèles de cancer (Bonhoure et al. 2006, Pchejetski et al. 2008,

Datta et al. 2014). Dans notre modèle, une hypothèse expliquant l’effet chimiosensibilisant du

FTY720 serait que ce composé, via l’inhibition de l’expression de HIF-1α, entraine une diminution

de l’expression de la glycoprotéine P, ou MDR-1 (Multidrug resistance protein 1), à la surface des

cellules tumorales, pour les rendre sensibles à la gemcitabine. En effet, une étude a montré que

HIF-1α régule positivement l’expression de la glycoprotéine P, un transporteur de la membrane

plasmique capable d’exporter hors de la cellule des agents chimiothérapeutiques, tels que la

gemcitabine (Chen et al. 2014). De plus, une étude in vitro a montré que le FTY720 diminue

l’expression de la glycoprotéine P permettant ainsi de sensibiliser des cellules de cancer du colon

à la doxorubicine et à l’étoposide (Xing et al. 2014). Afin de compléter notre étude, il donc serait

intéressant de valider in vitro le concept selon lequel le FTY720 permet de sensibiliser les cellules

CAKI-1 à la gemcitabine, afin d’étudier par la suite l’implication de la glycoprotéine P dans cette

chimiosensibilisation. Une autre hypothèse permettant d’expliquer la chimiosensibilisation

induite par le FTY720 dans notre modèle serait que ce traitement, via l’inhibition de l’expression

de HIF-2α, restaure l’expression de p53. En effet, une étude in vitro réalisée dans des cellules de

ccRCC a montré que l’accumulation de HIF-2α entraine une perte d’expression de p53 médiée

par Hdm2 (Roberts et al. 2009). Dans cette même étude, la déplétion de HIF-2α par une stratégie

d’interférence à l’ARN restaure l’expression de p53 et réverse ainsi la résistance de ces cellules de

ccRCC à la doxorubicine et à l’étoposide. Il serait donc intéressant de caractériser l’expression de

p53 et des facteurs HIF dans notre modèle.

Par ailleurs, nous devons garder à l’esprit que le modèle murin de ccRCC nous ayant permis

d’établir que le FTY720 induit une normalisation vasculaire est différent de celui utilisé pour

étudier l’effet chimiosensibilisant du FTY720. En effet, le premier modèle a été établi par injection

d’une suspension cellulaire dans le flanc d’une souris nude (protocole n°1), et le second par

implantation d’un fragment tumoral (protocole n°2), issu lui-même d’une tumeur obtenue par

192!

injection d’une suspension cellulaire. Bien que les animaux des deux protocoles présentent un

volume tumoral moyen d’environ 100mm3 à J0 (Figures 13 et 19), la croissance tumorale s’est

ensuite avérée plus rapide chez les animaux du protocole n°2, implantés par des fragments

tumoraux. Il est donc probable que les tumeurs issues d’une suspension cellulaire et celles issues

d’un fragment tumoral présentent également des réseaux vasculaires différents. Alors qu’une

normalisation vasculaire a été observée après 5 et 7 jours de traitement au FTY720 lors du

protocole n°1, il est possible qu’elle soit décalée dans le temps pour le protocole n°2.

6. Evaluation de l’effet du FTY720 dans d’autres modèles de ccRCC

Une étude réalisée dans un modèle murin de cancer du sein a montré que le FTY720 permet de

prévenir l’apparition de métastases et de prolonger ainsi la survie des animaux (Azuma et al.

2002). Une autre, réalisée dans un modèle murin de cancer de la prostate, a montré que le

FTY720, administré en association avec une radiothérapie, permet de diminuer la dissémination

métastatique (Pchejetski et al. 2010). Un challenge actuel dans la prise en charge des ccRCC étant

la mise au point de stratégies thérapeutiques ciblant les formes métastatiques, la suite de notre

projet de recherche pourrait permettre d’étudier l’impact d’un traitement au FTY720, seul et en

association avec la gemcitabine, dans un modèle murin de métastases spontanées. Pour cela, des

cellules CAKI-1 exprimant la luciférase de manière stable seront injectées en intraveineux chez

des souris nude. L’efficacité des différents traitements pourra ensuite être évaluée par

dénombrement des métastases, par mesure de leur volume, ainsi que par l’impact des traitements

sur la survie des animaux.

Nos travaux pourraient également être complétés par l’étude de l’inhibition de la voie

SphK1/S1P dans un modèle murin de ccRCC établi à partir de cellules A498, une lignée

déficiente pour pVHL et qui n’exprime pas HIF-1α. Ceci nous permettrait notamment d’évaluer

l’impact de l’absence de ces deux protéines sur la réponse au FTY720, et d’étendre notre étude à

un deuxième sous-groupe de ccRCC retrouvé en clinique humaine.

7. Conclusion générale

Ces travaux démontrent pour la première fois le rôle clé de la SphK1 dans la régulation de HIF-

2α dans des lignées de ccRCC, indépendamment de leur statut pVHL. Ils mettent également en

évidence le rôle du récepteur S1P1 dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α dans plusieurs lignées

193!

tumorales humaines. Associés aux précédents résultats de l’équipe, ces résultats in vitro

impliquent la voie SphK1/S1P/S1P1 dans la réponse à l’hypoxie via la régulation de HIF-1α et

HIF-2α dans plusieurs modèles tumoraux, dont les ccRCC. Ils valident ainsi le rôle crucial de

cette voie comme senseur de l’hypoxie intratumorale et régulateur clé de l’adaptation cellulaire à

l’hypoxie.

Par ailleurs, l’étude de l’inhibition de la voie SphK1/S1P par le FTY720 dans un modèle murin de

ccRCC révèle que ce composé entraine une diminution transitoire du taux intratumoral de HIF-

1α et HIF-2α et de la sécrétion tumorale de VEGF, associées à un remodelage du réseau

vasculaire tumoral. Le FTY720 entraine en effet une normalisation vasculaire ainsi qu’une

oxygénation tumorale transitoire, et permet de sensibiliser un modèle murin de ccRCC à la

gemcitabine. Nos travaux précliniques valident ainsi la pertinence de l’utilisation du FTY720 en

association avec la gemcitabine pour le traitement des ccRCC, et constituent une étape

indispensable à la transposition en clinique du concept selon lequel la voie SphK1/S1P peut être

ciblée dans les ccRCC afin d’y augmenter l’efficacité des chimiothérapies, le FTY720 étant bien

toléré et déjà sur le marché.

Finalement, le ciblage de la voie SphK1/S1P est une stratégie qui pourrait notamment constituer

une alternative pertinente pour le traitement des ccRCC résistants à d’autres thérapies ciblées. En

effet, une étude effectuée dans un modèle murin de ccRCC a montré que la neutralisation de la

S1P extracellulaire par le Sphingomab® ralentit considérablement la croissance de tumeurs

résistantes au sunitinib (Zhang et al. 2015). Par ailleurs, le sonepcizumab (Asonep®), la forme

humanisée du Sphingomab®, fait actuellement l’objet d’une étude clinique de phase II dans le

traitement des ccRCC inopérables et réfractaires à plusieurs traitements incluant les stratégies

anti-VEGF/VEGFR, les inhibiteurs de mTOR et l’interleukine 2 (NCT01762033).

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Travail Collaboratif

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www.impactjournals.com/oncotarget/ Oncotarget, Advance Publications 2015

Neutralizing S1P inhibits intratumoral hypoxia, induces vascular remodelling and sensitizes to chemotherapy in prostate cancer

Isabelle Ader1,2,3, Cécile Gstalder1,2,3,*, Pierre Bouquerel1,2,3,*, Muriel Golzio1,2, Guillaume Andrieu1,2,3, Santiago Zalvidea5, Sylvain Richard5, Roger A. Sabbadini6, Bernard Malavaud1,2,3,4, Olivier Cuvillier1,2,3

1CNRS, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France2Université de Toulouse, UPS, IPBS, Toulouse, France3Equipe Labellisée Ligue contre le Cancer4Hôpital Rangueil, Service d’Urologie et de Transplantation Rénale, Toulouse, France5INSERM U1046, Université Montpellier 1, Université Montpellier 2, CHU Arnaud de Villeneuve, Montpellier, France6Lpath Inc., San Diego, CA, USA*These authors have contributed equally to this work

Correspondence to:Olivier Cuvillier, e-mail: olivier.cuvillier@ipbs.fr or olivier.cuvillier@inserm.frKeywords: angiogenesis, hypoxia, sphingolipid, vessel normalization

Received: December 01, 2014 Accepted: January 12, 2015 Published: January 29, 2015

ABSTRACTHypoxia promotes neovascularization, increased tumor growth, and therapeutic

resistance. The transcription factor, hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α), has been reported as the master driver of adaptation to hypoxia. We previously identified the sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate (SphK1/S1P) pathway as a new modulator of HIF-1α under hypoxia. Taking advantage of a monoclonal antibody neutralizing extracellular S1P (sphingomab), we report that inhibition of S1P extracellular signaling blocks HIF-1α accumulation and activity in several cancer cell models exposed to hypoxia. In an orthotopic xenograft model of prostate cancer, we show that sphingomab reduces hypoxia and modifies vessel architecture within 5 days of treatment, leading to increased intratumoral blood perfusion. Supporting the notion that a transient vascular normalization of tumor vessels is the mechanism by which sphingomab exerts its effects, we demonstrate that administration of the antibody for 5 days before chemotherapy is more effective at local tumor control and metastatic dissemination than any other treatment scheduling. These findings validate sphingomab as a potential new normalization agent that could contribute to successful sensitization of hypoxic tumors to chemotherapy.

INTRODUCTION

Sphingosine 1-phosphate (S1P) is a bioactive sphingolipid metabolite regulating pleiotropic activities such as proliferation, survival, migration, inflammation or angiogenesis [1–4]. The S1P content in cells is low and is kept under control through a delicately regulated balance between its synthesis and its degradation. The balance between the intracellular levels of S1P and its metabolic precursors, ceramide and sphingosine, has been suggested to be a switch determining whether a cell proliferates or dies [5]. The predominant regulator of this ceramide/S1P balance is the sphingosine kinase-1 (SphK1)

isoform, which produces S1P from sphingosine [6]. Once generated, S1P is exported by specific transporters such as spinster 2 (Spns2) [7–9], to exert paracrine or autocrine effects as a ligand for five high-affinity G protein-coupled receptors (S1P1–5), with specific effects dictated by the predominance of S1P receptor subtypes expressed [10]. Alternative GPCR-independent signaling of S1P also exist [11] with recent findings demonstrating direct modulation of several intracellular proteins [12, 13].

In cancer, S1P metabolism is often found to be dysregulated directing attention to the SphK1/S1P signaling pathway as a target for anti-cancer drug discovery [14–16]. In a number of solid tumors, high

Oncotarget2www.impactjournals.com/oncotarget

SphK1 expression correlates with a significant decrease in survival rate in patients [17–20]. The S1P produced by SphK1 is widely appreciated as a general growth-like factor and a potent protector against apoptosis induced by cytotoxic agents and other therapies in various cancer cell and animal models [14]. S1P is also thought to be as pro-angiogenic as basic fibroblast growth factor and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in promoting the development of vascular networks in vivo [21–24]. A number of preclinical studies have shown that pharmacological inhibition of SphK1 could be efficacious in decreasing tumor size or sensitize to chemo- or radiotherapy [25–28]. Interestingly, the anti-cancer activity of an anti-S1P monoclonal antibody (sphingomabTM) [29], which neutralizes S1P and inhibits its extracellular signaling, provides evidence of the importance of exogenous S1P in mediating tumor growth and metastatic potential [23, 30, 31].

Hypoxia is a reduction in the normal level of tissue oxygen tension and occurs in many pathological conditions including cancer [32] where it contributes to the development of an aggressive phenotype and a poor prognostic in patients [33]. As a tumor develops, the diffusion distance from the existing vasculature increases resulting in hypoxia, which in turn drives the overexpression of angiogenic factors such as VEGF, leading to the formation of a new vasculature in an attempt to provide adequate supply of oxygen and nutriments [34, 35]. Somewhat paradoxically, such unleashed angiogenesis generates a highly disorganized and immature vascular network with impaired transport characteristics resulting in spatial and temporal inadequacies in delivery of oxygen, thereby exacerbating tumor hypoxia and fuelling a self-reinforcing vicious cycle [36, 37]. As a result of the leakiness of tumor vessels, impaired blood flow and interstitial hypertension interfere with the delivery of therapeutics reducing their efficacy while promoting the escape of cancer cells [37–41]. At the cellular level, the activation of the transcription factor hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) [42], has been identified as a master regulator of the response of cancer cells to hypoxia, triggering the expression of multiple target genes contributing to angiogenesis, treatment failure, invasion/metastasis, altered metabolism and genomic instability [32, 43].

Given its central role in tumor progression and resistance to therapy, targeting hypoxia-induced angiogenesis represent an attractive strategy in cancer centered on two molecular targets, HIF-1 and VEGF [44–46]. As the direct inhibition of a transcription factor is a challenging task [47], targeting upstream signaling pathways leading to HIF-1 activation or downstream effectors regulated by HIF-1 such as VEGF may represent a more practical strategy and a wide range of pharmacological approaches have been proposed including the targeting of the SphK1/S1P signaling [48, 49]. Indeed,

we previously identified SphK1/S1P signaling as a new canonical modulator of HIF-1 activity under hypoxic conditions owing to a decreased proteasome degradation of HIF-1α subunit mediated by the Akt/GSK3β pathway in various cancer cell models [50]. Because Akt signaling can be activated by Gi-coupling of all subtypes of S1P receptors [10] and because S1P has been shown to be released from hypoxic cells [51, 52], we have explored the effects of the neutralization of extracellular S1P with anti-S1P monoclonal antibody sphingomab, currently under clinical development [15]. The goal of this study was to demonstrate preclinical proof of concept in mice bearing orthotopic prostate tumors that sphingomab could reduce intratumoral hypoxia and associated vascular network malfunction by enhancing blood perfusion to significantly improve delivery and efficacy of docetaxel, the standard chemotherapy for prostate cancer.

RESULTS

Extracellular S1P regulates HIF-1α level under hypoxia in several cancer cell lineages

We previously identified SphK1 as a modulator of HIF-1α as a key mediator of the adaptive response to hypoxia in multiple cancer cell models [50]. These studies led us to propose a strategy for controlling tumor hypoxia and its biological consequences [48]. To substantiate that inhibition of the SphK1/S1P pathway could represent a pertinent idea, we evaluated the relevance of inhibiting the extracellular S1P signaling with regard to HIF-1α accumulation under hypoxia in cancer cells. We took advantage of a monoclonal antibody (mAb), sphingomab, that binds to and neutralizes extracellular S1P [23, 29]. As shown in Figure 1A, sphingomab inhibited accumulation of HIF-1α in a concentration-dependent manner in human PC-3 prostate cancer cells. The ability of the anti-S1P mAb to inhibit HIF-1α accumulation was tested in two other models, including the lung adenocarcinoma cell line A549, and the glioblastoma cell line U87. A similar dose- dependent action of the anti-S1P mAb on HIF-1α content was observed in these models (Figure 1A). S1P is mainly produced intracellularly by SphK1 and exerts its paracrine/autocrine effects by being secreted into the tumor microenvironment. Spinster 2 (Spns2) has been recently suggested to be the primary transporter in the release of S1P [7–9, 53, 54]. When PC-3, A549 and U87 cells were treated with Spns2-specific siRNAs, the expression of Spns2 protein decreased to less than 10–20% of the control with two different siRNAs tested (siSpns2a and siSpns2b) (Figure 1B). The transient knockdown of Spns2 using these two different siRNAs was associated with a significant inhibitory effect on HIF-1α accumulation under hypoxia (Figure 1C). Importantly, the decrease of HIF-1α protein content by Spns2 targeting was markedly reversed when cells were exposed to S1P (Figure 1D). These results

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agree with the data in Figure 1A and demonstrate that extracellular S1P released from cancer cells is critical to regulate HIF-1α accumulation under hypoxia, regardless of the experimental conditions (10% FBS in Figure 1A versus serum free conditions in Figure 1D).

Neutralization of extracellular S1P downregulates HIF-1α expression and activity in vivo

To extend our in vitro findings, and because the anti-S1P mAb we used is under clinical development, the antibody’s ability to inhibit HIF-1α accumulation and transcriptional activity in vivo was tested in an orthotopic model of prostate cancer using the PC-3 cell line, because hypoxic response is largely dependent on the vascular microenvironment and very poorly replicated in subcutaneous models [55]. As previously reported [25, 56],

21 days after implantation of human GFP-overexpressing PC-3 in nude mice, the histology of the tumor was consistent with poorly differentiated prostate cancer (data not shown) and animals were treated every other day for up to 9 days with 50 mg/kg sphingomab or the isotype-matched IgG control by i.p. administration. Blood and primary tumors were collected from animals sacrificed at Day 0 or after 3, 5, 7 and 9 days of treatment with anti-S1P or IgG control antibodies. The excised tumors were first evaluated for immunohistochemical analysis of HIF-1α expression. As shown in Figure 2A, anti-HIF-1α-labeled sections showed a marked decrease in staining of tumor cells in mice treated for 5 days with the anti-S1P mAb. A highly significant reduction of the number of HIF-1α-positive cells in tumor sections was observed from 5 to 7 days of treatment (P < 0.0001) but returned to the control value at 9 days suggesting a transient effect of the anti-S1P mAb (Figure 2B). Western blot analysis on tumor

Figure 1: Extracellular S1P regulates HIF-1α level under hypoxia. (A) Human PC-3, A549 and U87 cells were treated with the indicated concentrations of anti-S1P mAb (anti-S1P) for 2 h, then incubated under normoxia (20% O2) or hypoxia (0.1% O2) for an additional 6 h. HIF-1α expression was analyzed by immunoblotting using an anti-HIF-1α antibody. (B) PC-3, A549 and U87 cells were untransfected or transfected with 90 nmol/L of two different siSpns2 (siSpns2a and siSpns2b) or scrambled siRNA (siScr) for 72 h. Cell lysates were assayed for Spns2 expression by Western blot. (C) PC-3, A549 and U87 cells were untransfected or transfected with 90 nmol/L of two different siSpns2 (siSpns2a) and siSpns2b) or scrambled siRNA (siScr) for 72 h, then incubated under normoxia or hypoxia for an additional 6 h. Cell lysates were assayed for HIF-1α expression by Western blot. (D) PC-3, A549 and U87 cells were untransfected or transfected with 90 nmol/L of siSpns2a for 72 h. The cells were then washed and left in DMEM without serum for 12 h before the incubation under normoxia or hypoxia without or with 1 μM S1P for an additional 6 h. Cells were lysed and HIF-1α expression was analyzed by immunoblotting with an anti-HIF-1α antibody. For all experiments, similar results were obtained in at least three independent experiments, and equal loading was monitored using antibody to α-tubulin.

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Figure 2: Effect of S1P neutralization on HIF-1α expression and activity in vivo. Nude mice were injected in prostate with PC-3/GFP cells to form orthotopic xenografts. 21 days after injection, mice were treated every odd day with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. After 3, 5, 7 and 9 days of treatment, mice were sacrificed and the primary tumors and blood were collected. (A) HIF-1α staining of representative regions of tumor sections from animals treated for 5 days with 50 mg/kg anti-S1P antibody or IgG control. Scale bar, 100 μM. (B) Graph represents percentage of HIF-1α positive cells per 0.8 mm2 area after 3, 5, 7 and 9 days of treatment. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM. (C) Analysis of HIF-1α protein expression by Western blotting in tumor lysates harvested from three mice per group after 5 days of treatment with IgG control (lane 1–3) or anti-S1P (lane 4–6). α-tubulin was used as loading control. (D) GLUT-1 staining of representative regions of tumor sections from animals treated for 5 days with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. Scale bar, 250 μM. (E) Graph represents relative GLUT-1 intensity per 1.5 mm2 area after 3, 5, 7 and 9 days of treatment. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM. (F) Plasma hVEGF concentrations in tumor-bearing mice after 3, 5, 7 and 9 days of treatment with 50 mg/kg anti-S1P antibody or IgG control. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM.

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lysates collected at Day 5 confirmed the marked decrease of HIF-1α protein expression when animals were treated with anti-S1P mAb in all samples examined (Figure 2C).

GLUT-1-stained sections revealed that inhibitory effect of the anti-S1P mAb was not restricted to HIF-1α protein accumulation but was also correlated with an inhibition of its transcriptional activity (Figure 2D). The treatment with anti-S1P mAb led to more than 50% inhibition of GLUT-1 expression as early as 5 days of treatment up to 9 days with a maximal effect seen at Day 7 (Figure 2E). In addition, animals treated with the anti-S1P mAb had significantly reduced levels of circulating proangiogenic human VEGF (hVEGF) produced by the PC-3 xenografts (Figure 2F). Collectively these in vivo data demonstrate that S1P neutralization not only downregulates HIF-1α content but also decreases the expression of GLUT-1 and the secretion of VEGF, two main factors depending on HIF-1α transcriptional activity.

Neutralization of S1P is associated with decreased intratumoral hypoxia, vascular remodelling and increased blood flow

We previously observed that neutralization of S1P was associated with a reduction in the release of the potent vascular permeability factor VEGF from tumors, validating the sphingomab as an antiangiogenic agent [23]. We therefore analyzed effects of the antibody on the vasculature of orthotopic PC-3 tumor using immunohistochemical expression of CD34 as biological marker of angiogenesis. In agreement with the in vivo effect formerly reported in a subcutaneous A549 model [23], immunohistochemical analysis indicated a marked decrease in microvessel density in mice treated with the anti-S1P mAb throughout all the experiment time course (Figure 3A and 3B). The remaining vessels seemed to be opened indicating that “immature” vessels were likely preferentially eliminated (Figure 3A). The treatment with the anti-S1P mAb was accompanied by a marked reduction of intratumoral hypoxia as measured by pimonidazole staining, an effect that was significant as early as 5 days of treatment with a persisting effect that peaked at Day 7 (Figure 3C and 3D).

We next determined how hypoxia and neoan-giogenesis were antagonized by the anti-S1P mAb. We first evaluated the architecture and the functional status of tumor vasculature. Because perivascular pericytes play a critical role in vessel maturation and stabilization [37], a double staining for pericytes (α-smooth muscle actin or α-SMA) and endothelial cells (CD34) was performed to quantify the extent of pericyte coverage. A significant increase of the number of α-SMA-positive intratumoral blood vessels was found in tumor-bearing animals treated with anti-S1P mAb, demonstrating the characteristic development of more mature vessels (Figure 4A and 4B).

As noticed for VEGF level and intratumoral hypoxia markers, the effect of sphingomab was evident after 5 days of treatment and maintained overtime (up to 9 days). To examine whether the morphological vessel normalization obtained by neutralizing S1P could translate into a functional vasculature, blood perfusion was assessed by a non-invasive real-time imaging using high frequency ultrasound to allow for longitudinal study on the same animal [57, 58]. At different times after administration of anti-S1P mAb or control IgG, the slope and magnitude of microbubble contrast agent influx was measured to quantify the blood flow in vessels (Figure 4C and 4D). In anti-S1P mAb-treated mice, tumor perfusion significantly augmented as early as 5 days of administration, peaked at Day 7 (over 3-fold increase), then returned to basal level by Day 13 (Figure 4C and 4D). Collectively, these results showing the reduction in tumor hypoxia and enhanced vascular flow when S1P is neutralized support the notion that a transient “vascular normalization” [41] is the mechanism by which anti-S1P mAb exerts its effects, an effect which could enhance the efficacy of cytotoxic agents (see below).

Anti-S1P mAb’s direct effects on tumor cell proliferation and apoptosis

S1P is a well-established proliferative and anti-apoptotic mediator [5, 59], the ability of anti-S1P antibody to alter cell proliferation and death of PC-3 xenograft was also evaluated. The Ki67 proliferation marker was used to estimate the fraction of viable cells undergoing active proliferation within the tumor. Anti-S1P mAb-treated tumors exhibited a notable decrease in cell proliferation rate that was evident after 5 days of administration (Figure 5A and 5B). Tumor cell death was assessed by the activation of the apoptotic executioner caspase-3. In agreement with previous reports showing that S1P inhibits activation of caspase-3 [23, 60], the treatment with anti-S1P mAb was associated with increased apoptosis as reflected by the increased level of cleaved caspase-3 (Figure 5C and 5D). These data suggest that the proliferative and protective antiapoptotic effects of S1P are mitigated when extracellular S1P is neutralized by the anti-S1P antibody.

Anti-S1P mAb-induced vascular normalization sensitizes to chemotherapy in established orthotopic PC-3/GFP tumors in mice

Hypoxia plays a central role in tumor resistance to therapy including chemotherapy [45] and preclinical and clinical data support and offer a rationale of why a therapy aimed at increasing blood flow should result in improved drug delivery [39, 40]. We hypothesized that the vascular normalization period we observed with the anti-S1P

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Figure 3: Effect of S1P neutralization on tumor vasculature and hypoxia in PC-3 tumor-bearing mice. (A) Representative images of blood vessel quantity and morphology in tumors after 5 days of treatment with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. Tissue sections were stained with anti-CD34 (endothelial cell marker) antibody to visualize tumor blood vessel and were counterstained with DAPI. Scale bar, 200 μM. (B) Data are shown as number of CD34+ structures per 1.5 mm2. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM. (C) Hypoxia staining of representative regions of tumor sections from animals treated for 5 days with 50 mg/kg anti-S1P antibody or IgG control. Hypoxia was detected by immunohistochemistry staining of pimonidazole adducts in PC-3 tumor sections. Nuclear counterstain: hematoxylin staining. Scale bar, 250 μM. (D) Graph represents relative HypoxiaProbe intensity after 3, 5, 7 and 9 days of treatment with anti-S1P mAb or IgG control. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM.

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mAb (optimal time of 5 to 9 days) offers an opportunity for enhanced response to docetaxel, the standard of care for the treatment of metastatic prostate cancer [61, 62]. To this end, we relied on an orthotopic model of PC-3 cells overexpressing GFP, growing in their native milieu and leading to a local regional growth and spontaneous distant metastasis dissemination within five weeks that could be monitored by fluorescence imaging [56]. The therapeutic relevance of anti-S1P mAb-induced increase in transient vascular normalization (or oxygenation window) to docetaxel was investigated by varying the sequence of anti-S1P administration and chemotherapy (Figure 6A).

In the first therapeutic approach, tumor-bearing mice were treated with anti-S1P mAb (50 mg/kg every other day) for a 5-day oxygenation window prior to 5 mg/kg docetaxel (Arm 2) or with a classical combination of

anti-S1P mAb and docetaxel administered at the same time (Arm 3). Significantly smaller tumors (mean = 455 mm3) were seen in animals treated with 5 mg/kg docetaxel alone (Arm 5) (Figure 6B and 6C). Interestingly, administration of anti-S1P mAb alone (Arm 4) was not accompanied with a statistical reduction of primary tumor volume (mean = 724 mm3) as compared to IgG-treated control animal (Arm 1, mean = 1010 mm3) and the combination of S1P mAb with docetaxel administered at the same time (Arm 3, mean = 373 mm3) did not significantly sensitize to docetaxel alone (Arm 5) (Figure 6B and 6C). Clearly, the greater effect on primary tumor growth occurred when anti-S1P mAb was administered 5 days before docetaxel treatment (Arm 2, mean = 144 mm3). Supporting the notion that chemotherapy response could be optimum when docetaxel is given when after vascular

Figure 4: Effect of S1P neutralization on vessel functionality. (A) Representative images of immunofluorescence double staining for endothelial cells (CD34) and pericytes (αSMA) in paraffin sections obtained from tumors of animals treated with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. Red, CD34+ staining; green, αSMA+ staining. Counterstaining was done with DAPI. Images were obtained from mice 7 days after beginning of the treatment. Scale bar, 200 μM. (B) Graph represents quantification of vessel coverage per 0.76 mm2 area, calculated as the percentage of αSMA-positive cells compared with the number of CD34-positive cells after 3, 5, 7 and 9 days of treatment with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM. (C) Study of tumor vessel perfusion by contrast-enhanced ultrasound imaging. Examples of raw contrast kinetics acquired after bolus i.v. injection of microbubble contrast agent in animals treated with 50 mg/kg IgG control or anti-S1P mAb for 7 days. (D) Quantification of microbubble velocity within o.t PC-3 tumors, after 3, 5, 7, 9 and 13 days of treatment with anti-S1P mAb or IgG control. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM.

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Figure 5: Effect of S1P neutralization on tumor cell proliferation and apoptosis of established orthotopic PC-3/GFP tumors in mice. (A) Ki67 staining of representative tumor sections after 7 days of treatment with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. Red, Ki-67 positive staining. Counterstaining was done with DAPI. (B) Data are shown as number of Ki67-positive cells per 1.5 mm2 area after 3, 5, 7 and 9 days of treatment with anti-S1P mAb or IgG control. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM. (C) Cleaved caspase-3 (CASP-3) staining of representative tumor sections after 7 days of treatment with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. Red, cleaved caspase-3-positive staining. Counterstaining was done with DAPI. (D) Data are shown as number of cleaved caspase-3-positive cells per 0.76 mm2 area after 3, 5, 7 and 9 days of treatment with anti-S1P mAb or IgG control. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM.

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Figure 6: Docetaxel treatment enhancement by rational scheduling of S1P neutralization on established orthotopic PC-3/GFP tumors in mice. (A) Three weeks after surgical orthotopic implantation of PC-3/GFP cells, mice were randomized into five arms of three to seven animals each. These animals were then subjected to 50 mg/kg IgG control every odd day (arm 1, n = 4); 50 mg/kg anti-S1P mAb every odd day prior to weekly 5mg/kg docetaxel starting at day 26 (arm 2, n = 6); combination of 50 mg/kg anti-S1P mAb every odd day and weekly 5mg/kg docetaxel starting at day 26 (arm 3, n = 5); 50 mg/kg anti-S1P mAb every odd day starting at day 26 (arm 4, n = 7); weekly 5 mg/kg docetaxel starting at day 26 (arm 5, n = 3). At day 42, mice were anesthetized and tumor volume, metastatic dissemination were determined by fluorescence imaging and blood was taken for complete blood count (CBC) and plasma chemistry. (B) Representative fluorescent primary PC-3/GFP tumors from animals treated with IgG control, docetaxel, anti-S1P mAb, anti-S1P mAb prior to docetaxel and combination of docetaxel and anti-S1P mAb, at the time of autopsy. Yellow asterisk indicates bladder. Numbers represent tumor volume as quantified in materials and methods. (C) Quantification of tumor volume of primary tumors. Columns, mean of three to seven mice per group; bars, SEM. (D) Representative fluorescent periaortic lymph nodes from animals treated with IgG control, docetaxel, anti-S1P mAb, anti-S1P mAb prior to docetaxel and combination of docetaxel and anti-S1P mAb, at the time of autopsy. Green arrows indicate prostate. Numbers represent periaortic lymph node volume as quantified in materials and methods. (E) Quantification of periaortic lymph nodes. Columns, mean of three to seven mice per group; bars, SEM.

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normalization is achieved by anti-S1P mAb treatment, we demonstrated in Figure 6 that a significant difference (P = 0.0156) was observed between Arm 2 (anti-S1P mAb prior to docetaxel) and Arm 3 (anti-S1P mAb coincident with docetaxel) (Figure 6B and 6C). In addition to demonstrating an effect of antibody treatment on tumor volume, our fluorescent model allowed us to monitor metastatic dissemination in order to determine effects of the anti-S1P mAb on metastatic potential (Table 1). Although no treatment was able to significantly prevent lymph node tumor involvement (Table 1), we found a marked decreased in the volume of periaortic lymph nodes when anti-S1P mAb was combined to docetaxel (Figure 6D and 6E). As shown in Table 1, the anti-S1P mAb administration given before chemotherapy markedly reduced the total number of metastases (average per animal: 3.8) by comparison with isotype antibody control-treated Arm 1 (average per animal: 7.8). The effect of on primary tumor growth was thus consequently paralleled by a significant limitation of metastasis dissemination when anti-S1P mAb was given for 5 days before initiating chemotherapy.

To rule out that improved therapeutic outcome caused by the sequential dosing (Arm 2) was not a mere reflection of the longer administration of anti-S1P mAb when compared to the classical combination treatment without pre-treatment (Arm 3), a second therapeutic approach was conducted with additional scheduling conditions (Supplementary Figure 1A). Treatments were initiated at Day 21 rather than Day 26 and compared to the sequential normalization treatment (Arm 2). Surprisingly, starting docetaxel treatment earlier did not improve the efficacy with regard to tumor growth (Arm 6 versus Arm 5) (Supplementary Figure 1B). When docetaxel was given as early as 21 days post-implantation in combination with anti-S1P mAb (Arm 8), there was no significant difference in terms of therapeutic efficacy compared to the 26-day conditions (Arm 3), implying that an extra 5-day duration of treatment did not matter (Supplementary Figure 1B). Importantly, the sequential scheduling (Arm 2) was always superior to all the others (Arm 3 or Arm 8) in terms of therapeutic efficacy (Supplementary Figure 1B).

In sum, these data suggest mechanistically that the anti-S1P mAb treatment leads to improved chemotherapy

Table 1: Pattern of metastatic disseminationIgG control Docetaxel anti-S1P anti-S1P &

Docetaxelanti-S1P before

Docetaxel

No. of micewith metastases/total No. of mice

4/4 (100%) 3/3 (100%) 7/7 (100%) 5/5 (100%) 5/6 (83%)

Retroperitoneal lymph nodes

Periaortic lymph nodes 2, 2, 2, 2 2, 2, 1 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2 1, 2, 2, 2, 2 0, 2, 2, 2, 2, 2

Periadrenal 2, 2, 2, 1 2, 2, 2 2, 2, 2, 2, 1, 1, 1 1, 2, 1, 2, 2 0, 1, 1, 2, 1, 1

No. of metastases 15/16(3.8 per animal)

11/12(3.7 per animal)

25/28(3.6 per animal)

17/20(3.4 per animal)

16/24(2.6 per animal)

Solid organs

Lung 1, 1, 1, 1 1, 1, 1 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1 1, 1, 1, 1, 1 0, 1, 1, 1, 1, 1

Liver 1, 1, 1, 1 0, 1, 1 1, 1, 1, 1, 1, 0, 1 1, 1, 1, 0, 1 0, 0, 0, 1, 0, 0

Pancreas 1, 1, 1, 1 1, 1, 1 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1 1, 1, 1, 0, 0 0, 0, 0, 0, 0, 0

Mesentery 1, 1, 1, 1 0, 1, 1 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1 1, 1, 1, 0, 0 0, 0, 0, 1, 0, 0

No. of metastases 16/16(4.0 per animal)

10/12(3.3 per animal)

27/28(3.9 per animal)

15/20(3.0 per animal)

7/24(1.2 per animal)

Total No. of metastases

31(7.8 per animal)

21(7.0 per animal)

52(7.4 per animal)

32(6.4 per animal)

23(3.8 per animal)*

For retroperitoneal lymph nodes, the numbers 0, 1, or 2 represent the quantity of invaded lymph nodes. For solid organs, 0 means no presence of metastasis; 1 means a metastatic organ (regardless of the intensity of metastasis dissemination in this organ). The frequencies of metastases between two groups are not significant.Differences in the number of metastases per mouse: *P = 0.0139 compared with IgG control-treated animals (Wilcoxon - Mann Whitney).

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response when administered for a short period of time before the commencement of chemotherapy, as a consequence of antibody-induced vascular normalization.

In addition to efficacy studies described above, we conducted a toxicology study at the end of the experiment described in Figure 6 designed to evaluate how well the antibody was tolerated in mice. All biochemical and complete blood count (CBC) and serum chemistry markers were within normal range (Supplementary Figures 2 and 3). A statistically significant leukopenia was noted only in mice treated with the combination of anti-S1P mAb and docetaxel, which was mainly the consequence of a significant reduction in total circulating lymphocytes as reported previously [23, 29, 63].

DISCUSSION

Hypoxia is a hallmark of solid tumors driving the production of angiogenic factors to establish a new vascular network [35, 37]. In contrast to healthy tissues, hypoxia-triggered overexpression of VEGF and other pro-angiogenic factors in tumors leads to a structurally and functionally abnormal vasculature, which further aggravates hypoxia setting up a vicious cycle promoting tumorigenesis and metastatic potential [36, 37]. Anatomically, tumor vessels are dilated, tortuous, and saccular with chaotic patterns of interconnection and branching [64]. Unlike a normal vasculature where stable endothelial cells are connected by adherens junctions including vascular endothelial (VE)-cadherin [65], VEGF causes VE-cadherin destabilization hence a loosening of endothelial cell association [66]. Moreover, pericytes, normally positioned around and interacting with endothelial cells to prevent vessel leakage are absent or loosely attached [67, 68]. The mechanisms for abnormal pericyte behavior in tumors are manifold, but include VEGF as a negative regulator [69, 70]. Taken as a whole, the structural weaknesses of tumor vessels, by contributing to a porousness vasculature phenotype, have adverse consequences notably dissemination of tumor cells [71, 72] and impaired drug delivery and efficacy [39, 40]. For these reasons, strategies aimed at restoring tumor vasculature to a more normal state are a matter of the utmost importance as the improvement of vessel structure and function may delay progression and improve delivery and efficacy of chemotherapeutics [41]. Because VEGF is primarily accountable for this haphazard vasculature, it was hypothesized by Rakesh Jain that mopping up excess of VEGF, rather than destroying vessels, would prune away some abnormal vessels and remodel the remaining ones resulting in a more mature vasculature [73, 74]. Over the years, a wide array of preclinical [75–77] and clinical [78–81] studies have provided evidence to support this postulate, showing that judicious treatment with anti-VEGF agents results in transient enhancement of vascular function termed “vascular normalization”

characterized by improved connection between adjacent endothelial cells, increased ratio of pericyte-covered vessels, improved association between endothelial cells and pericytes, and reduced hypoxia [41]. Importantly, the accompanying period of enhanced oxygenation known as the “normalization window”, ranging in general from few days in mice models [41] to several weeks in some patients [81], corresponds to a period of enhanced chemo or radiosensitivity in treated tumors [40, 41, 75, 80]. Lastly, the most compelling support for the benefit of vascular normalization is its benefit on progression-free and overall survival rates in patients [81–84].

We recently identified the SphK1/S1P signaling as a new modulator of HIF-1α accumulation and increased activity under hypoxia, through activation of the Akt/GSK3β pathway [50, 85]. It was recently reported that direct addition of S1P to thyroid cancer cells stimulate Akt signaling under normoxic conditions [86]. Because Akt is activated by Gi-coupling of all subtypes of GPCR S1P receptors [10], and because S1P is secreted by hypoxic cells [51, 52], we analyzed the effects of the neutralization of extracellular S1P with the anti-S1P mAb, sphingomab [15]. Here we report for the first time that sphingomab inhibits HIF-1α accumulation and activity under hypoxia in various cell models (prostate, lung, glioma). This was a consequence of the secretion of S1P by hypoxic cells since knock-down of the S1P transporter Spns2 blocked the activation of HIF-1α, an effect that was reversed by the addition of S1P.

In an orthotopic prostate cancer animal model, we characterized the time course of morphological and functional changes in the vasculature of the tumor as well as intratumoral hypoxia in response to treatment with sphingomab. We demonstrated that S1P neutralization created a less hypoxic environment as shown by the marked decreased in HIF-1α expression and activity (concomitant decrease in GLUT-1 expression), and secretion of VEGF from the tumor. As a result, vascular remodelling occurred as demonstrated by decreased microvessel density and vessel morphological changes namely increased coverage of pericytes. As previously reported for anti-VEGF strategies in other preclinical models [75–77], the anti-S1P mAb was able to normalize intratumoral vasculature after a period (from 5 to 9 days) of treatment. Measurements of tumor blood flow and perfusion assessed by high resolution 3-dimensional power Doppler ultrasound [57, 58] demonstrated a transient improvement in tumor perfusion. Finally and most importantly, we established that the transient vascular normalization window induced by sphingomab created an optimal time frame for the administration of docetaxel-based chemotherapy with enhanced efficacy. Indeed, the therapeutic relevance of sphingomab-induced increases in tumor oxygenation to chemotherapy was investigated by varying the schedules of sphingomab and chemotherapy. Clearly, a greater benefit on both primary tumor and metastasis dissemination took place when sphingomab was administered 5 days prior docetaxel treatment.

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Interestingly S1P has originally been shown to stabilize blood vessels in development and homeostasis through S1P receptor subtype 1 (S1P1) by promoting the formation of VE-cadherin-containing adherens junctions in endothelial cells [21, 87, 88]. Supporting this notion, the loss S1P1 in retinal endothelial cells results in vessels displaying poor blood flow and vascular leakage [89]. In addition, vessel coverage by pericytes is also directed by the activity of S1P1 receptor in endothelial cells [90, 91] by trafficking and activating N-cadherin involved in endothelial cell/pericyte interactions [92]. Our findings that neutralization of exogenous S1P with sphingomab leads to vascular maturation in hypoxic tumors are somehow counterintuitive to the undisputed role of S1P1, one of its main cognate receptor. Surprisingly it has been reported that S1P could increase vascular permeability similar to VEGF, the canonical vascular permeability factor [93]. The mechanism of action would involve the activation of the S1P2 subtype S1P receptor. This observation was extended to in vivo model of vascular permeability in the rat lung, in which the S1P2 antagonist JTE013 significantly inhibited H2O2-induced permeability [93]. In vitro and in vivo models of inflammation-induced vascular permeability confirmed the role of S1P2 [94]. These studies indicate that the relative expression of S1P1 and S1P2 receptors in a specific vascular bed would determine the response to S1P. Noteworthy, in vivo studies have shown that S1P2 expression is markedly enhanced under hypoxic stress in pathological angiogenesis of the mouse retina, establishing its essential role in pathological neovascularization [95]. Further supporting a critical role for S1P2 signaling in mediating vascular permeability, the addition of exogenous S1P to normoxic endothelial cells also induce the activation of HIF-1α and subsequent rise in VEGF release, suggesting a potential amplification of VEGF signaling [96]. Lastly, S1P2-deficient (S1p2-/-) mice implanted with lung or melanoma cells displayed increased number of maturated and functional tumor vessels, showing increased pericyte coverage [97]. In summary, one might speculate that the balance between S1P1 and S1P2 receptors in the endothelium could be modified by hypoxia, with a shift toward higher S1P2 expression hence increasing vascular permeability. Neutralization of S1P produced by hypoxic tumor cells by sphingomab could have a direct impact on vessels by switching off S1P2-mediated vascular leakage, a mechanism reminiscent of the effect of bevacizumab on VEGF. In addition, neutralization of S1P through inhibition of HIF-1α could impact the cancer cell compartment by reducing intratumoral hypoxia and its undesirable consequences (including VEGF overproduction), while sensitizing tumor cells to cytotoxic agents as S1P is a well-establish anti-apoptotic agent [5].

The extent of intratumoral hypoxia seen in the prostate cancer context is comparable to that seen in other cancers [98]. Since the seminal study conducted by Folkman’s group showing that angiogenesis correlates

with metastasis in invasive prostate cancer [99], numerous reports have confirmed an association between prostate cancer aggressiveness and increased microvessel density, greater irregularity of the vessel lumen and smaller vessels [100]. In a prostatectomy cohort of patients (n = 572) with clinically localized prostate cancer with 20 years of follow-up, men with the most irregularly shaped vessels were 17.1 times more likely to develop lethal disease several years after diagnosis [101]. These data clearly suggest that the morphologic characteristics that reflect the pattern and maturity of the growing vascular network could represent valid indicators of neoangiogenesis, cancer aggressiveness, and metastatic potential in prostate. In patients with metastatic castration-resistant prostate cancer, VEGF levels are independent predictors of overall survival [102]. These data supported the hypothesis that VEGF inhibition may enhance current therapies in metastatic prostate cancer. However, the failure of two recently published phase III trials [103, 104] based on combination regimens associating docetaxel with anti-VEGF strategies (bevacizumab or aflibercept) underline our limited understanding of the therapeutic targets being explored and poor preclinical investigation. No preclinical data to lend support to the combination of docetaxel and anti-VEGF approaches have been reported in the literature, and the vast majority of phase II trials have used non-randomized designs [105]. Despite the fact that these large trials have produced disappointing results with docetaxel-based combined anti-VEGF therapies, the notion that reduction of hypoxia and improvement of functional vascularization could sensitize to a therapeutic regimen has been successfully suggested in prostate cancer. Evidence exists that diminution of intratumoral hypoxia [106, 107], reduction of VEGF production [108] and improved functional vascularization [109] during androgen deprivation (ADT) would be accountable for the improved clinical outcome and patient survival observed in phase III clinical trials of short-term neoadjuvant ADT before radiotherapy [110, 111].

In view of these data supporting that only a neoadjuvant approach (ADT) could successfully sensitize to a therapy in prostate cancer, our preclinical findings may have clinical implications. Improvement in blood perfusion leading to better drug delivery or increased tumor oxygenation offers a rationale as to why S1P neutralization might perhaps be started prior to cytotoxic therapy (chemo- or radiotherapy) and continued through this therapy. Non-invasive imaging techniques are currently available in the clinic that could be used to assess tumor vascularity (i.e. DCE MRI) and/or oxygenation such as PET scanning with hypoxia sensitive tracers [79, 81, 82, 84, 109]. Hence, our findings encourage further clinical studies to assess whether optimized scheduling of anti-S1P treatment provide evidence for vessel normalization in cancer patients to identify those who might be benefit from a combination therapy with cytotoxic agents or radiotherapy.

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MATERIALS AND METHODS

Chemicals, reagents and kits

Culture medium and serum were from Invitrogen (Villebon sur Yvette, France). The murine monoclonal anti-S1P antibody, Sphingomab, and its isotype-matched mAb control, LT1017, were generated as described previously [29]. S1P was from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Docetaxel was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). hVEGF plasma levels were quantified using a human VEGF Quantikine ELISA kit (RαD systems, Lille, France) according to manufacturer’s instructions, respectively.

Cell lines

Human prostate cancer PC-3 and lung carcinoma A549 cell lines were obtained from DSMZ (Braunschweig, Germany). Human U87 glioblastoma cells were from ATCC-LGC Standards (Molsheim, France). Cells were cultured in RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum at 37°C in 5% CO2 humidified incubators. Cell lines were routinely verified by the following tests: morphology microscopic examination, growth curve analysis and mycoplasma detection (MycoAlertTM, Lonza, Basel, Switzerland). All experiments were started with low-passaged cells (<15 times). Hypoxia (0.1% O2, 5% CO2, 94.5% N2) was achieved using an In Vivo2 hypoxic workstation (Ruskinn Technologies, Bridgend, UK).

siRNA-mediated knockdown of Spns2

Cancer cells were transfected with 90nM of each specific MISSION predesigned small interfering RNA (siRNA, Sigma-Aldrich) using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. Aleatory sequence scrambled siRNA was from Eurogentec (Angers, France). Details of each specific MISSION predesigned siRNAs are provided below: human Spns2 siRNAa: 5′-CGCUCAUGCUCUGCCCU UUdTdT-3′; and human Spns2 siRNAb: 5′-CACUCAUC CUCAUUCUGGUdTdT-3′.

Western-blot analysis and antibodies

Mouse HIF-1α (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France), rabbit anti-Spns2 (Sigma-Aldrich) were used as primary antibodies. Western blot assays were conducted according to the manufacturer’s instructions. Proteins were visualized by enhanced chemiluminescence detection system (Pierce, Brebières, France) using antirabbit or antimouse horseradish peroxidase–conjugated IgG (Bio-Rad, Hercules, CA). Equal loading was confirmed by probing the blots with the mouse anti-tubulin antibody (Sigma-Aldrich, clone DM1A). Densitometry quantitation was determined using Image J software (NIH, Bethesda, MD).

Animals

Male NMRI/Nu (nu/nu) 6-wk-old mice were obtained from Elevage Janvier (Le Genest Saint Isle, France). Mice were housed in a barrier facility of high-efficiency particulate air-filtered racks. At 7–8 wk of age, the animals were used in accordance with the principles and procedures outlined in Council Directive 86/809/EEC. The Institut Fédératif de Recherche Bio-médicale de Toulouse Animal Care and Use Committee approved all animal studies.

Blood and plasma samples

Blood samples were analysed using the ABX Micros 60 Hematology Analyzer and analytical parameters were determined in plasma by routine laboratory methods using an autoanalyzer (Cobas Mira+), Plateforme phenotypage ANEXPLO (Toulouse, France).

Immunohistochemistry and immunofluorescence

Staining was conducted on paraformaldehyde (PFA)-fixed and paraffin-embedded tissue using 5 μm sections. Intratumoral hypoxia was assessed using a commercially available HypoxyprobeTM-1 kit for the detection of tissue hypoxia (Hypoxyprobe Inc., Burlington, MA). Pimonidazole hydrochloride was given at a dose of 60 mg/kg in 0.9% saline via intraperitoneal injection one hour before euthanasia, and orthotopic tumors were harvested and fixed in 4% PFA. Details regarding antibodies, dilutions, and antigen-retrieval methods used are provided in Supplementary Table S1.

Orthotopic implantation of PC-3/GFP prostate cancer cells, and in vivo fluorescence imaging

Intraprostatic human prostate cancer xenografts were established in nude mice by surgical orthotopic implantation. Mice were anesthetized by isoflurane inhalation and placed in the supine position. A lower midline abdominal incision was made, and a 20 μL tumor cell suspension (1 x 106 cells) was injected into the dorsal lobe of the prostate using a 30-gauge needle and glass syringe. The surgical wound was closed in 2 layers with 4–0 Dexon interrupted sutures. All procedures were performed with a dissecting microscope. Autopsy and in vivo fluorescence imaging were conducted as previously detailed [56].

Tumor vessel perfusion by contrast-enhanced ultrasound imaging

Optical and ultrasound/power Doppler were carried out under anaesthesia (2% isofluorane in oxygen). Microbubble contrast agents were used to enhance in vivo visualization of microvascular perfusion of the tumors.

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This was operated with a Vevo 2100 linear array based high-frequency ultrasound imaging system (VisualSonics, Amsterdam, The Netherlands) and subsequent release of Nonlinear Contrast Imaging Mode. This allowed to assess the tumoral responses to anti-angiogenic drugs, even in absence of change in tumor size. The Micromarker Contrast Agent was delivered as a bolus injection intravenously (tail), and a time versus intensity curve is generated. The perfusion curve kinetics is an exponential limited by a maximum. The initial slope is proportional to the flow velocity and the maximum value of the plateau is proportional to the vascular fractional volume. The product of these two values gives a measure of the true perfusion. The perfusion model is defined as:

f(t) = O + A 1

st!2πe

( ln(t)−m)2

2s2, t > 0

O, A, m and s are fitting parameters; O is the offset, A is an amplitude parameter and m and s are the mean and standard deviation of the normally distributed natural logarithm of t, respectively. Amplitude is expressed relative to echo power, time is expressed in seconds and both are combined to produce quantities relating to blood flow kinetics.

After infusion and steady-state perfusion, a destructive pulse could also be applied and a replenishment curve was generated.

The perfusion model is defined as:

f(t) = O + A2c1 + erf a

ln(t) − ms!2

b d , t > 0

where O, A, m and s are fitting parameters, as defined for equation 1.

Image acquisition and processing and quantification

For bright-field and fluorescence, slides were scanned with Nanozoomer 2.0 RS Hamamatsu (with the fluorescence imaging module for tumor slides stained with anti-CD34, anti-αSMA, anti-cleaved-caspase-3, or anti-Ki67). Absolute numbers of CD34-positive vessels present within 1.5 mm2 of the tumor area and percent of αSMA/CD34-positive staining per 0.76 mm2 area and number of HIF-1α-positive cells per 0.8 mm2 area for each tumor slide were quantified by optical counting. Automatic cell counts of Ki67-positive and cleaved caspase-3-positive cells and automatic GLUT-1 and pimonidazole intensity were determined per 1.5 mm2 of the tumor area with Image J Software (NIH, Bethesda, MD).

Statistical analysis

The statistical significance of differences between the means of two groups was evaluated by unpaired

Student’s t test. The frequencies of metastases between two groups were compared using Fisher’s exact test. Differences in the number of metastases per mouse were examined using a nonparametric Wilcoxon - Mann Whitney test. All statistical tests were two-sided and the level of significance was set at P < 0.05. Calcula-tions were done using Instat (GraphPad Software, San Diego, CA).

AcknowledgmentS

We are grateful to Dr Nathalie Ortega and Dr Leonor Nogueira for their technical help. We thank the Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale histology facilities.

This work was supported by the Institut National du Cancer (Sphingoxia project to OC), the Ligue Nationale Contre le Cancer (Equipe Labellisée LIGUE 2011 to OC), the Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC Grant 1029 to OC), the Equipment ARC Grant (ECL2010R00650 to OC), the Association pour la Recherche sur les Tumeurs de la Prostate (to OC), the Comité Haute-Garonne of the Ligue Contre le Cancer (to IA), Université Paul Sabatier de Toulouse (to IA), the Association Française d’Urologie (to BM). This work was also supported by the National Cancer Institute (5R44CA110298–06 to RAS).

Conflict of interest

Authors would like to disclose that Dr. Roger A. Sabbadini is a founder of Lpath, and has stock in the company and is an inventor.

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AUTEUR : Cécile GSTALDER

TITRE : Rôle de la voie sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate dans l'adaptation à l'hypoxie

intratumorale des adénocarcinomes rénaux à cellules claires

DIRECTEURS DE THÈSE : Dr Isabelle ADER, Dr Olivier CUVILLIER

DATE ET LIEU DE SOUTENANCE : Mercredi 08 Juillet 2015, Toulouse

RÉSUMÉ :

Les adénocarcinomes rénaux à cellules claires (ccRCC), qui représentent 70% des tumeurs rénales, sont fortement mais irrégulièrement vascularisés, ce qui les rend hypoxiques et donc résistants aux chimiothérapies. L’hypoxie favorise l’agressivité tumorale via l’activation des facteurs de transcription HIF-

1α et HIF-2α (Hypoxia-Inducible Factors). Pour cette raison, le ciblage de l’hypoxie intratumorale et des facteurs HIF dans les ccRCC constitue une stratégie thérapeutique pertinente. Dans ce projet, nous montrons pour la première fois que la voie sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate (SphK1/S1P)

régule HIF-2α in vitro et in vivo. Nos résultats indiquent que la SphK1 régule le taux intracellulaire et

l’activité transcriptionnelle de HIF-2α dans des lignées de ccRCC représentatives de certains sous-groupes retrouvés en clinique humaine ; et impliquent la S1P extracellulaire, via le récepteur S1P1, dans la régulation

de HIF-1α et HIF-2α. D’autre part, nous avons évalué l’impact de l’inhibition des récepteurs à S1P et de la SphK1 par le FTY720 dans un modèle de ccRCC in vivo. Nos résultats indiquent que le FTY720 entraine une

diminution transitoire du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α ainsi qu’un remodelage du réseau vasculaire tumoral. En effet, le FTY720 induit une normalisation vasculaire qui aboutit à une oxygénation tumorale transitoire. Enfin, nous montrons que ce traitement permet de sensibiliser un modèle murin de ccRCC à la chimiothérapie.  Ces résultats valident le rôle de la voie SphK1/S1P comme régulateur de l'adaptation à l'hypoxie dans les ccRCC. Ils constituent une étape indispensable à la transposition en clinique humaine du concept selon lequel la voie SphK1/S1P peut être ciblée afin de diminuer l’hypoxie intratumorale et de chimiosensibiliser certains cancers, le FTY720 étant déjà sur le marché. 

MOTS CLÉS : Hypoxie, HIF, Voie sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate, Adénocarcinomes rénaux à cellules claires, Angiogenèse, Chimiorésistance

TITLE : Role of the Sphingosine kinase 1/Sphingosine 1-phosphate pathway in the adaptation to intratumoral hypoxia in clear cell renal cell carcinoma

ABSTRACT:

Clear cell renal cell carcinomas (ccRCC) represent 70% of renal tumors. Because of their dense and irregular vascular network, ccRCC become hypoxic and therefore resistant to chemotherapies. Hypoxia promotes

tumor aggressiveness via the activation of HIF-1α and HIF-2α (Hypoxia-Inducible Factors). For this reason, the control of intratumoral hypoxia and HIF in ccRCC could be a relevant therapeutic strategy to improve the efficacy of current treatments. In this study, we show for the first time that the sphingosine kinase

1/sphingosine 1-phosphate (SphK1/S1P) pathway regulates HIF-2α in vitro and in vivo. Our results indicate

that SphK1 regulates HIF-2α intracellular level and transcriptional activity in ccRCC cell lines that are representative of some clinical ccRCC subgroups. Our data also involve extracellular S1P, via its receptor

S1P1, in the regulation of HIF-1α and HIF-2α. In addition, in a ccRCC mouse model, we show that FTY720 –

an inhibitor of the SphK1/S1P pathway– transiently decreases HIF-1α and HIF-2α intratumoral level. This is associated with a transient remodeling of the tumor vascular network indicating that FTY720 induces a vascular normalization that leads to transient tumor oxygenation. Finally, we show that this treatment sensitizes a ccRCC mouse model to chemotherapy. Overall, these results validate the key role of the SphK1/S1P pathway in the adaptation to hypoxia in ccRCC cell and animal models. Our results provide a mechanistic basis to target the SphK1/S1P pathway with FTY720 by increasing the efficacy of chemotherapy in ccRCC. They are a prerequisite for clinical transposition as FTY720 is a drug approved used in human clinic.

KEY WORDS : Hypoxia, HIF, Sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate pathway, Clear cell renal cell

carcinoma, Angiogenesis, Chemoresistance

DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Cancérologie

LABORATOIRE : Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), CNRS UMR5089, 205 route

de Narbonne, 31077 TOULOUSE CEDEX 04