145
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département de Biologie THESE En vue de l’obtention du diplôme de DOCTORAT en Biologie Présentée par M lle AMEUR Fatma Zohra Intitulé : Impact de l’ingestion subchronique de la tartrazine sur l’activité enzymatique de la Trypsine, de la Chymotrypsine, de l’Amylase et de la Lipase chez la souris Swiss Devant le jury : Président : Mr KHEROUA O. Professeur, Université Oran 1 Examinateur : Mr BABA HAMED B. Professeur, ESSB Oran Examinateur : Mr HAMMOU H. Professeur, Université Oran 1 Examinateur : Mr BOUALGA A. Professeur, Université Oran 1 Rapporteur : Mr SAIDI D. Professeur, Université Oran 1 Co-rapporteur : Mr GONZALEZ A. Professeur, UEX, Espagne Spécialité : Sciences de la Santé et du Développement Soutenue le 08/01/2019

THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

  • Upload
    others

  • View
    7

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie

THESE

En vue de l’obtention du diplôme de DOCTORAT

en Biologie

Présentée par

Mlle AMEUR Fatma Zohra

Intitulé :

Impact de l’ingestion subchronique de la tartrazine sur l’activité

enzymatique de la Trypsine, de la Chymotrypsine, de l’Amylase et de

la Lipase chez la souris Swiss

Devant le jury :

Président : Mr KHEROUA O. Professeur, Université Oran 1

Examinateur : Mr BABA HAMED B. Professeur, ESSB Oran

Examinateur : Mr HAMMOU H.

Professeur, Université Oran 1

Examinateur : Mr BOUALGA A. Professeur, Université Oran 1

Rapporteur : Mr SAIDI D. Professeur, Université Oran 1

Co-rapporteur : Mr GONZALEZ A. Professeur, UEX, Espagne

Spécialité : Sciences de la Santé et du

Développement

Soutenue le 08/01/2019

Page 2: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and
Page 3: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Avant-propos

Les travaux de recherches présentés dans cette thèse ont été réalisés en grande partie

grâce au programme d’une formation résidentielle à l’étranger sous la direction de Mr Saidi

Djamel et la codirection de Mr Antonio Gonzalez. La partie pratique a été réalisée en

collaboration entre le laboratoire de physiologie de la nutrition et de la sécurité alimentaire

(LPNSA) de l’Université Oran1 Ahmed Ben Bella (Algérie), l’Institut des biomarqueurs

moléculaires de pathologie à l’Université d’Estrémadure (Espagne) et l’Institut de recherche

en sciences alimentaires à Madrid (CIAL, Espagne).

Le financement du séjour à l’étranger a été assuré par le Ministère de l’Enseignement

Supérieur et de la Recherche Scientifique (Algérie), tandis que les dépenses liées à l’activité

de recherche ont été à la charge de la Commission d’Estrémadure et du Ministère de

l’Economie et de la Compétitivité d’Espagne.

Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas,

les directeurs des trois laboratoires où se sont déroulés tous nos travaux de recherche. Et, c’est

grâce à cette collaboration qui a été établie que cette thèse, fruit d’un long travail, a pu être

effectuée.

Page 4: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

A ma mère,

celle qui n’a pas vu l’aboutissement de

mon travail. Mais, je sais que tu aurais

été très fière de ta fille !

«Une mère ne meurt jamais, elle cesse

seulement d’être visible »

Page 5: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Remerciements

En tout premier lieu, je remercie le Bon Dieu, Le Tout Puissant, pour la volonté et la

patience qu’il m’a données durant toutes ces longues années afin d’accomplir ce travail.

A l'issue de la rédaction de cette recherche, je suis convaincue que la thèse est loin d'être

un travail solitaire. En effet, ce projet de recherche n’aurait pu aboutir sans la riche

collaboration que j’ai pu avoir avec de nombreuses personnes.

Tout d’abord, je tiens à exprimer mes plus vifs remerciements à Monsieur Saidi Djamel

qui fut pour moi un promoteur attentif et disponible malgré ses nombreuses charges et pour le

suivi régulier et l’aide qu’il a pu m’apporter tout au long de l’élaboration de cette thèse.

Je souhaite remercier Mr Antonio Gonzalez qui m’a accueillie dans son laboratoire en

Espagne, pour son soutien et ses multiples conseils. Je serai toujours reconnaissante pour

l’opportunité qu’il m’a donnée afin d’enrichir mes connaissances tant personnelles que

professionnelles.

J’exprime ensuite toute ma reconnaissance à l'ensemble des membres du jury, qui m'ont

fait l'honneur de bien vouloir étudier et juger mon travail : un grand merci à Monsieur

Kheroua Omar qui a accepté de présider ce jury, à Mr Baba Hamed Bey, à Mr Hammou

Habib et à Mr Boualga Ahmed pour avoir bien voulu juger ce travail.

Un remerciement tout particulier à Madame Mehedi Nabila pour l’intérêt qu’elle a

toujours porté à mon travail, pour ses précieux conseils et sa contribution à la correction de ce

manuscrit.

Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à Madame Cristina Soler Rivas qui m’a donné

la chance de travailler quelque mois à l’Institut de recherche en sciences alimentaires à

Madrid. C’était une superbe expérience et j’en garde de très bons souvenirs. Merci pour tous

les conseils scientifiques (et non scientifiques).

Un grand merci à toute l’équipe du LPNSA, particulièrement à Chahira, Imen, Leila,

Nawel, Souhila, Soumia F, Aicha, Latifa, Wafaa, Hadria, Nesrine, Malika, Amina, Ibtissem,

Dalel, Abir, Soumia B. Merci également à l’équipe de CIAL à Madrid et je précise, Diego,

Fhernanda et Pedro. A Caceres, mes remerciements particuliers vont à Leticia (don’t worry be

happy), Mercedes, Raquel, José, Carlos, Tapia, Rosado, Isaak, Ana, José Javier pour le climat

sympathique dans lequel ils m’ont permis de travailler.

Un remerciement spécial, profond et reconnaissant à mes deux collègues et « soldats »

Matias et Noelia pour les encouragements sans cesse, pour l’aide à la paillasse, pour le sourire

et la sympathie au quotidien.

Page 6: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Je dois aussi remercier le personnel de l’animalerie à l’Université d’Estrémadure avec

qui j’ai fait une formation à l’expérimentation animale et j’en ai beaucoup appris. Merci les

deux Maria R et Maria A et Feliza pour avoir été si gentilles avec moi. Merci Antonio et

Manuel pour les blagues de chaque matin même si je ne comprenais pas trop au début (merci

pour les grenades aussi !).

Mention spéciale au Mr Aladin Mahamedi qui m’a supporté et m’a permis de me lever

motivée, le cœur léger et l’esprit tranquille depuis le début de ma thèse.

J’adresse toute ma gratitude à tous mes ami(e)s qui sont tous aussi géniaux, et

disponibles et d’un grand soutien en toute circonstance plus particulièrement ma proche amie

Nadia. Merci également à Amel, Soumia, Soussou, Fatima, Khadidja, Zahra, Samia, Dahbia,

Salim, Hamza, Noura, Fatima, Younes, Oubadda, Amine, Hasnaa et Ikram.

Je tiens également à dire un énorme merci à Carmen, Ana et Elena (Mujers F et C) qui

me supportent toujours et croient tellement en moi.

Sans les personnes formidables suivantes, la vie dans un pays européen sera tellement

difficile. Merci à chacun de vous pour votre amour et amitié : Elvira, Esteve, Angel, Xavier,

Bego, Borja, Juanlo, José, Hermo, Anto, Fabio, Hausi, Franchisca ,Alejandro (Batman),

Lorenzo, Miguel, Alfonso, Barri, Jerome, Diego, Melqui, Monaim, Rafi, Hasqui.

Un merci particulier à Chele (José Manuel) et ma famille espagnole : Manuela, Juan,

Carlos, Juanito pour l’accueil chaleureux, les repas délicieux et le soutien moral.

Une dédicace spéciale à mes colocataires très gentilles qui m’ont offert l’environnement

idéal pour une thésarde, merci Rocio, Caroline et Magdaline.

Enfin, les mots les plus simples étant les plus forts, j’adresse toute mon affection à ma

famille et en particulier à mon père, mon frère Lahcen et sa femme Asma, mes sœurs Zouzou,

Souad, Affef et Asmaa. Vous avez toujours été à mes cotés pour m’encourager, me soutenir et

si j’en suis là aujourd’hui c’est grâce à vous ! Je tiens également à remercier mes tantes et mes

oncles pour leur amour et leur bienveillance.

A tous ceux qui ont contribué de près ou de très loin à ce travail, cités ici ou pas, vous

avez toute ma reconnaissance !

Page 7: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Résumé

Les colorants alimentaires sont des ingrédients très présents dans la plupart des

aliments manufacturés. Parmi eux, la tartrazine, aussi connue sous le nom de E102, est

largement utilisée dans les industries agroalimentaire, pharmaceutique et cosmétologique,

ainsi que dans certaines préparations culinaires.

S’agissant d’un colorant azoïque synthétique, de plus en plus, il est montré que la

tartrazine est incriminée dans l’apparition de troubles de santé qui touchent plusieurs

fonctions et tout particulièrement le système immunitaire, le système de reproduction, le

système nerveux. La voie par laquelle ce colorant semble affecter la santé se fait

probablement via son métabolite majeur : l’acide sulfanilique.

Le but de notre travail est d’évaluer l’effet de la tartrazine et de son métabolite sur la

fonction exocrine du pancréas à travers une étude in vivo sur des souris Swiss, une étude in

vitro à l’aide d’un modèle de digestion et une étude ex vivo sur des cellules acinaires murines

et sur des cellules AR42J de carcinome pancréatique de rat.

Les résultats obtenus montrent que :

• L’ingestion subchronique de la tartrazine chez les souris Swiss à une dose de 0,05 %

pendant 13 semaines provoque une diminution de l’activité enzymatique de la trypsine

et de la chymotrypsine.

• Aucune modification de l’activité enzymatique de la trypsine ou de la chymotrypsine

n’a été observée lorsqu’on utilise un modèle de digestion.

• La tartrazine ainsi que son métabolite, l’acide sulfanilique, peuvent altérer

significativement l’homéostasie calcique au niveau des cellules acinaires et AR42J.

• L’acide sulfanilique induit un stress oxydatif au niveau des cellules acinaires et des

cellules AR42J pancréatiques en générant des espèces réactives de l’oxygène (ERO).

• L’acide sulfanilique diminue le niveau de défense antioxydante assurée par le système

du glutathion et de la superoxyde dismutase, affecte le potentiel membranaire

mitochondrial et altère la sécrétion de la trypsine par les cellules AR42J.

En conclusion, la tartrazine et son métabolite l’acide sulfanilique semblent affecter

significativement l’activité du pancréas exocrine en favorisant le développement d’effets

délétères au niveau de cet organe. Le dysfonctionnement de cette glande peut évidemment

être à l’origine de troubles digestifs.

Mots clés : tartrazine, acide sulfanilique, pancréas exocrine, enzymes digestives,

calcium, ERO, AR42J.

Page 8: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Abstract

Food dyes are very important ingredients in most manufactured foods. Among them,

tartrazine, also known as E102, is widely used in the food, pharmaceutical and cosmetics

industries, as well as in some culinary preparations.

Being a synthetic azo dye, it is increasingly shown that tartrazine is incriminated in the

development of health disorders that affect several functions and especially the immune

system, the reproductive system, the nervous system. The route by which this dye appears to

affect health is probably via its major metabolite: the sulfanilic acid.

The aim of our work is to evaluate the effect of tratrazine and its metabolite on the

exocrine function of the pancreas through an in vivo study in Swiss mice, in vitro study using

a digestion model and ex vivo one on acinar cells and AR42J cells isolated from rat pancreatic

carcinoma.

The results obtained show that:

• Subchronic ingestion of tartrazine in Swiss mice at a dose of 0,05% causes a decrease

in the enzyme activity of trypsin and chymotrypsin.

• No modification of the enzymatic activity of trypsin or chymotrypsin was observed

using a digestion model.

• Tartrazine and its metabolite sulfanilic acid may alter calcium homeostasis in acinar

cells and AR42J cells.

• Sulfanilic acid induces oxidative stress in acinar cells and pancreatic AR42J cells by

generating reactive oxygen species (ROS).

• Sulfanilic acid decreases the level of antioxidant defense provided by the glutathione

and superoxide disumutase system, affects the mitochondrial membrane potential and

alters the secretion of trypsin by AR42J cells.

In conclusion, tartrazine and its metabolite sulfanilic acid appear to significantly affect

the activity of the exocrine pancreas while promoting the development of deleterious effects

in this organ. The dysfunction of this gland can obviously be at the origin of digestive

disorders.

Key words: tartrazine, sulfanilic acid, exocrine pancreas, digestive enzymes, calcium,

ERO, AR42J.

Page 9: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

ملخص

تعددالملوناتددلغلمليةممنددللكددالملوماتددلغلملوا ددامعلمماددععل ددملكعةددملمبيعوددللملومددنعل لكددالمددنال لتدد لملوناتددلغل

سددتماعلىنددالتوددل ليم ددنل ددململمددنلىلغلمليةممنددلليلملايممنددلليلكست اددعمغللE102ملتددلرتعمن الملوعددعيضل اددللمل ددمل

لملتجونلليلكةلكل ململوهم

للكتزم دال نلملتدلرتعمن ال تسد فلل دملتودا علمبادوعمملغلملمد نللكات لكنانلآنيلمصونلىمل،ل إت ل ةهعلمشدم

ملتملتؤثعلىنالملعا الكالملاظدلم ليالصدللملجهدلنلملوندلىمل،لملجهدلنلملتنل دنمل،لملجهدلنلملعمد مليل دايل نلملتدلرتعمن ال

ؤثعلىنالملم للىاليع قلملوستقنفلملعمنسملل ليل الحوضلملسنفلتنننك

ملهاضلكالمرم تنلل التقننملتأثنعلملتدلرتعمن اليكسدتقن لىنداليظنفدللمل نمع دلخلكدالادة لمرم دللتجع ندللىندالل

ملفئددعمنلملسا سددع للملةاددل للالددالمرم ددللل ددململومت ددعلمل ددتمامعلتودداخرلملهاددمليلمرم ددلل اددع لىنددالاة ددللكددأااخعلكددال

لخللنجعخمن كأااخعلكال عيلنلمل نمع لAR42Jمنمع لخلملفئعمنليلاة لل

تةهعلملنتلمجلملتملتململ ما لىننهل:

د اعل تسد فل دملمتمفدل لل13٪للوداعل05 0ممتةعلملتلرتعمن الكاليعضلملفئعمنلملسا سع للمجعىللكقامر لل•ل

لتشليلاتز ململتع سناليملمنوناتع سنا

لهام لمل ةحظل يلتينعللننشليلمةتز ومللنتع سنال يلكنواتعمسنالمل تمامعلتواخرلم•ل

قال ؤميلملتلرتعمن اليكستقنفلملسنفلتنننكلالالتيننعلتامننلململلسناعل ململمة للملوأااخعلكدالمنمع دلخلملفئدعمنل•ل

AR42Jيلاة لل

حلكضلملسدنفلتنننكل دا نلملداللمب هدلململتأكسدايلىندالكسدتا لملمة دللملودأااخعلكدالمنمع دلخلملفئدعمنليلاة دلل•ل

AR42J

( EROبكسجنالملتفلىننلل)ىاليع قلتالنال تامعلم

حوددضلملسددنفلتنننكل قنددللكددالكسددتا لكنةاكددللملددا لعلملواددلمعللاكسدداعلملتددملتقدداكهللملجناتددلثنانليلمنعيكسددنالل•ل

disumutaseؤثعلىنالغشلءلملونتاكاتار للي ينعلكالا عمنلملتعمسنالكالق للاة للل AR42J

لتنننكل ؤثعمنلمشمللك ندعلىندالتشدليلمل نمع دلخلمب دعمنيل ململمتلعل،ل ايل نلملتلرتعمن اليكستقن لحوضلملسنف

كنلتعز زلتوارلملتأثنعمغلملالرعل مل ةململعاا ل ومال نل مانلانلل ةهلملياعل لل ملماوعمملغلملجهلنلملهاوم

تدامعللمل نمع لخلمة عمن ل،لمةتز ولغلملهاونل،لململلسناع،ملتلرتعمن ا،لحوضلملسنفلتنننك،لل:لالكلمات المفتاحية

ل AR42Jمبكسجنالملتفلىننل،لاة لل

Page 10: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Liste des abréviations

[Ca2+]i : concentration du calcium intracellulaire libre

ADN : Acide Désoxyribonucléique

AESA : Autorité Européenne de Sécurité des Aliments

AS : acide sulfanilique

BALB : dimercaproltributyrate

BAPNA : L.Benzoyl- Arginine p-nitroAniline

BAPTA : acide 1,2-bis(o-aminophénoxy)éthane-.N,N,N',N'-tétraacétique

SAB : Serum AlbumineBovine

BTEE : N-Benzoyl-L-tyrosine éthyl ester

DJA : Dose Journalière Admissible

DMSO : Diméthylsulfoxide

DNS :acide 3,5-dinitrosalicylique

DTNB :acide 5,5′-dithiobis 2-nitrobenzoique

FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations

GSSG/GSH : Glutathionréduit/oxydé

H2O2 : peroxide d'hydrogène

JECFA : Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives

kDa : kilo Dalton

PBS : phosphate buffered saline

Page 11: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Pc : poids corporel

PMSF : fluorure de phénylméthylsulfonyle

SDS : dodécylsulfate de sodium

SOD : superoxydedismutase

SVF : Sérum de Veau Fœtal

TDAH : trouble de déficit de l’attention/ hyperactivité

TMRM : tétraméthylrhodamine ester méthylique

UE : Union Européenne

UI : Unité Internationale

Page 12: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Liste des figures

Figure 1. Anatomie du duodénum et du pancréas (Seeley et al., 2004). ................................... 6

Figure 2. Unité de fonction et rôle du pancréas exocrine (Saladin, 2003) ................................ 6

Figure 3. Représentation schématique de la signalisation calcique (Berridge et al., 2003). ... 11

Figure 4. Digestion des protéines (Gamet, 2006) .................................................................... 13

Figure 5. Représentation tridimensionnelle de la trypsine pancréatique (Demers, 2010)....... 15

Figure 6. Trypsine : Activation et action (Silbernagl and Despopoulos, 2001) ...................... 15

Figure 7. Représentation tridimensionnelle de la chymotrypsine pancréatique (Demers, 2010)

.................................................................................................................................................. 18

Figure 8. Représentation tridimensionnelle de la lipase pancréatique (Chen et al., 2003) ..... 18

Figure 9. Hydrolyse des lipides alimentaires (Marcil et al., 2004). ........................................ 19

Figure 10. Diagramme de la structure de l'α-amylase (Payan, 2004) ..................................... 22

Figure 11. Spécificité régionale du tractus gastro-intestinal humain mimé dans le modèle

digestif in vitro (Guerra et al., 2012) ........................................................................................ 24

Figure 12. Structure chimique de la tartrazine (Mittal et al., 2007) ........................................ 28

Figure 13. Effet de la tartrazine sur l’activité enzymatique de la trypsine. ............................. 55

Figure 14. Effet de la tartrazine sur l’activité enzymatique de la chymotrypsine. .................. 56

Figure 15. Changements de la [Ca2 +]i dans les cellules acinaires en réponse à la CCK-8. .... 59

Figure 16. Les changements de la [Ca2 +]i dans les cellules AR42J en réponse à la CCK-8 et la

thapsigargine. ........................................................................................................................... 60

Figure 17. Effet de la tartrazine sur la [Ca]i+2 dans les cellules acinaires. .............................. 61

Figure 18. Changements de la [Ca2+]i dans les cellules acinaires en réponse à l'acide

sulfanilique. .............................................................................................................................. 62

Figure 19. Changements de la [Ca2 +]i dans les cellules AR42J en réponse à l'acide

sulfanilique. .............................................................................................................................. 64

Figure 20. Effet de l'acide sulfanilique sur la mobilisation du calcium provoquée par la

thapsigargine. ........................................................................................................................... 65

Figure 21. Effet de l'acide sulfanilique sur la génération des ERO dans les cellules acinaires.

.................................................................................................................................................. 66

Figure 22. Effet de l'acide sulfanilique sur la génération des ERO dans les cellules AR42J

chargées avec l’indicateur redox MitoSOXTMRed. .................................................................. 68

Figure 23. Images de fluorescence montrant l'effet de l'acide sulfanilique sur la production

des ERO dans les cellules AR42J chargées avec le MitoSOXTMRed. ..................................... 69

Page 13: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Figure 24. Effet de l'acide sulfanilique sur le glutathion. ........................................................ 70

Figure 25. Effet de l'acide sulfanilique sur l'expression de la superoxyde dismutase (SOD2).

.................................................................................................................................................. 71

Figure 26. Effet de la CCK-8 et de l'acide sulfanilique sur la sécrétion de la trypsine dans les

cellules AR42J. ......................................................................................................................... 73

Figure 27. Effet de l’acide sulfanilique sur le potentiel membranaire mitochondrial (ψm) ... 75

Page 14: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Liste des tableaux

Tableau 1. Fonctions des organes de l’appareil digestif (OpenStaxCollege, 2013) ................. 5

Tableau 2. Caractéristiques des principales hormones intervenant dans la stimulation des

sécrétions pancréatiques (Herdt and Sayegh, 2002; Washabau et al., 2012) . ......................... 10

Tableau 3. Sécrétion exocrine principale de pancréas (Saladin, 2003) ................................... 13

Tableau 4. Liste des principaux colorants alimentaires synthétiques autorisés dans l’Union

Européenne (UE) (Issa, 2009) .................................................................................................. 28

Tableau 5. Liste des produits utilisés : Etude in vivo et in vitro ............................................. 39

Tableau 6. Liste des produits utilisés : Etude ex vivo ............................................................. 44

Tableau 7. Effet de la tartrazine sur le gain du poids corporel et la teneur en protéines totales

chez les souris Swiss témoins et consommant de la tartrazine aux doses de 0,005% et 0,05%

pendant 13 semaines. ................................................................................................................ 54

Tableau 8. Effet de la tartrazine sur la consommation de l’aliment et du liquide chez les

souris Swiss témoins et consommant de la tartrazine aux doses de 0,005% et 0,05% pendant

13 semaines. ............................................................................................................................. 54

Tableau 9. Effet de la tartrazine sur l’activité enzymatique de l’amylase et de la lipase chez

les souris Swiss témoins et consommant de la tartrazine aux doses de 0,005% et 0,05 pendant

13 semaines. ............................................................................................................................. 58

Tableau 10. Effet de la tartrazine aux doses de 7,5mg/kg/jour et 75 mg/kg/jour sur l’activité

des protéases en utilisant un modèle de digestion in vitro. ...................................................... 58

Page 15: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Table des matières

1. Introduction ......................................................................................................................... 1

2. Rappel bibliographique ....................................................................................................... 3

2.1. La digestion : processus et éléments ................................................................................ 3

2.1.1. Pancréas exocrine ...................................................................................................... 4

2.1.1.1. Physiologie et fonctions ......................................................................................... 4

2.1.1.2. Régulation de la sécrétion pancréatique................................................................. 4

2.1.1.3. La signalisation calcique ........................................................................................ 7

2.1.1.4. Physiopathologie du pancréas exocrine ................................................................. 8

2.1.1.5. Enzymes digestives pancréatiques ......................................................................... 9

2.1.1.5.1. Les protéases ....................................................................................................... 9

a. La trypsine ........................................................................................................................ 12

b. La chymotrypsine .............................................................................................................. 14

2.1.1.5.2. La lipase ............................................................................................................ 16

2.1.1.5.3. L’amylase .......................................................................................................... 20

2.1.2. Modèle de digestion ................................................................................................ 21

2.2. Les additifs alimentaires ................................................................................................ 23

2.2.1. Les colorants alimentaires .......................................................................................... 26

2.2.1.1. La tartrazine (E102) ............................................................................................. 27

2.2.1.1.1. Structure et propriétés ...................................................................................... 27

2.2.1.1.2. Métabolisme ...................................................................................................... 27

2.2.1.1.3. Réglementation ................................................................................................. 29

2.2.1.1.4. Estimation de la consommation du E102 .......................................................... 29

2.2.1.1.5. Détermination de la présence de la tartrazine dans les aliments ..................... 30

2.2.1.1.6. Toxicité de la tartrazine .................................................................................... 31

2.2.1.1.6.1. Effet du E102 sur le système nerveux ............................................................ 31

2.2.1.1.6.2. Effet du E102 sur le système immunitaire ...................................................... 32

Page 16: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

2.2.1.1.6.3. Effet du E102 sur le système reproductif ....................................................... 33

2.2.1.1.6.4. Effet du E102 sur les tissus et les paramètres biochimiques ......................... 33

2.2.1.1.6.5. Génotoxicité du E102 ..................................................................................... 34

2.2.1.1.6.6. Cancérogénicité du E102 ............................................................................... 35

2.2.1.1.6.7. Le E102 et le stress oxydatif .......................................................................... 35

2.2.1.1.6.8. Effet du E102 sur le système digestif ............................................................. 35

3. Matériel et méthodes ............................................................................................................ 37

3.1. Effet de la tartrazine sur les activités enzymatiques digestives in vivo et in vitro ........ 37

3.1.1. Produits et réactifs ................................................................................................... 37

3.1.2. Etude in vivo ........................................................................................................... 37

3.1.2.1. Modèle animal et conditions d’élevage ............................................................... 37

3.1.2.2. Protocole expérimental ........................................................................................ 37

3.1.2.3. Obtention des échantillons ................................................................................... 38

3.1.2.4. Dosage des protéines totales selon la méthode de Lowry et al. (1951) ............... 38

3.1.2.5. Détermination de l’activité enzymatique de la trypsine et la chymotrypsine ...... 38

3.1.2.6. Détermination de l’activité enzymatique de la lipase .......................................... 41

3.1.2.7. Détermination de l’activité enzymatique de l’amylase ........................................ 41

3.1.3. Etude in vitro ........................................................................................................... 42

3.1.3.1. Protocole expérimental ........................................................................................ 42

3.2. Effet de la tartrazine et de son métabolite sur le pancréas exocrine : Etude ex vivo ..... 42

3.2.1. Produits et réactifs ................................................................................................... 42

3.2.2. Protocole expérimental ........................................................................................... 43

3.2.2.1. Mesure microfluorimétrique du calcium libre intracellulaire par l’imagerie en

temps réel « Real time imaging » ..................................................................................... 43

3.2.2.2. Détermination des changements de [Ca+2] libre sur les cellules AR42J ............ 45

3.2.2.3. Détermination de l’oxydation .............................................................................. 47

3.2.2.3.1. Détermination de la libération des ERO par spectrofluorimétrie .................... 47

Page 17: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

3.2.2.3.2. Visualisation des ERO par microscopie à fluorescence ................................... 48

3.2.2.3.3. Détermination des taux de Glutathion .............................................................. 48

3.2.2.3.4. Étude de la superoxyde dismutase mitochondriale par Western blot ............... 50

3.2.2.4. Effet de l'acide sulfanilique sur la trypsine .......................................................... 51

3.2.2.5. Détermination du potentiel membranaire mitochondrial .................................... 51

3.3. Etude statistique ............................................................................................................. 52

4. Résultats ............................................................................................................................... 53

4.1. Effet de la tartrazine sur le gain de poids corporel et la teneur en protéines ................. 53

4.2. Effet de la tartrazine sur la consommation de l’aliment et de l’eau .............................. 53

4.3. Impact de la tartrazine sur l’activité enzymatique in vivo ............................................. 53

4.4. Impact de la tartrazine sur l’activité enzymatique in vitro ............................................ 57

4.5. Effet de la tartrazine et de l’acide sulfanilique sur la libération du calcium (étude ex

vivo) ...................................................................................................................................... 57

4.6. Effet de l’acide sulfanilique sur le statut redox (étude ex vivo) ..................................... 63

4.7. Effet de l’acide sulfanilique sur la trypsine (étude ex vivo) .......................................... 72

4.8. Effet de l’acide sulfanilique sur le potentiel membranaire mitochondrial (étude ex vivo)

.............................................................................................................................................. 72

5. Discussion ............................................................................................................................ 76

6. Conclusion ............................................................................................................................ 85

7. Références bibliographiques ................................................................................................ 88

Page 18: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

INTRODUCTION

1

1. Introduction

Les colorants alimentaires sont des additifs largement utilisés au quotidien pour

ajouter une couleur souhaitée à des aliments ou redonner la couleur perdue au cours de la

fabrication de certains produits. L'avantage primordial de la couleur est sa contribution à

l'aspect attrayant de la nourriture. L'apparence de la nourriture peut être le facteur crucial qui

peut déterminer son acceptation ou son rejet.

La tartrazine (connue sous le nom de E102 ou FD & C Yellow5) est actuellement un

des colorants les plus utilisés pour les usages cités. C’est un colorant azoïque synthétique de

couleur jaune citron dérivé du goudron de houille soluble dans l'eau (Amin et al., 2010). Une

dose journalière admissible (DJA) de 0-7,5 mg / kg de poids corporel a été fixée par le Comité

mixte FAO / OMS d'experts des additifs alimentaires (JECFA, 1964) puis a été révisée à 0-10

mg / kg pc en 2016 (JECFA, 2016).

Cependant, et de plus en plus, de nombreuses études indiquent que ce colorant possède

une activité toxique. Une forte corrélation à été établie entre sa consommation et l’apparition

de l’hyperactivité chez les enfants (McCann et al., 2007). D’autre part, de nombreuses études

ont montré des effets immunotoxiques (Moutinho et al., 2007; Guendouz et al., 2013) et

génotoxiques de ce colorant alimentaire (Sasaki et al., 2002; Hassan, 2010; Khayyat et al.,

2017). De plus, des effets notables de la tartrazine sur le système reproducteur et le statut

redox ont été signalés (Mehedi et al., 2009; Cemek et al., 2014; El Golli, 2016; Boussada et

al., 2017; Bhatt et al., 2018).

Après son ingestion orale, la tartrazine peut être réduite en amines aromatiques libres.

L'acide sulfanilique (AS) en est le principal métabolite. Cet élément résulte de la réduction de

la liaison azotée N = N produite principalement par la flore gastro-intestinale (GI) (Elhkim et

al., 2007; Moutinho et al., 2007).

Fait intéressant, Wang et al. (2012) ont découvert que la tartrazine était capable

d'interagir avec les résidus His57 et Lys224 de la trypsine, entraînant l’inhibition de son

activité enzymatique. D’autre part, il a été montré que les sous-produits d'un tel métabolisme

deviennent parfois plus toxiques que la substance initiale (Onyema et al., 2006).

Page 19: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

INTRODUCTION

2

Même si de nombreuses études ont été menées pour étudier les effets toxiques de la

tartrazine sur la santé, peu d'entre elles ont ciblé le système digestif. C’est pourquoi, le but

principal de notre travail a été d’étudier l'effet de la tartrazine et de son métabolite, l’acide

sulfanilique, sur l’activité du pancréas exocrine sachant que cette glande joue un rôle

primordial dans le processus de la digestion via la sécrétion des enzymes digestives,

principalement la trypsine, la chymotrypsine, la lipase et l’amylase.

Pour atteindre cet objectif, une étude in vivo sur des souris Swiss a été menée. Dans

cette partie, les activités enzymatiques de la trypsine, de la chymotrypsine, de la lipase et de

l’amylase ont été mesurées après une ingestion subchronique de la tartrazine aux doses de

0,005 % et 0,05 %.

Dans un deuxième temps, un modèle de digestion in vitro a été utilisé pour mettre en

évidence la relation entre la toxicité probable de la tartrazine et la nature des aliments ingérés.

Enfin, une approche ex vivo menée sur des cellules acinaires isolées du pancréas de

souris Swiss ainsi que sur des cellules AR42J a été réalisée afin d’évaluer les effets du

colorant et de son métabolite principal, l’acide sulfanilique, sur l’activité du pancréas mais

aussi pour identifier les voies de signalisation intracellulaires qui peuvent être affectées par

ces deux composants. C’est pourquoi on a évalué l’effet de la tartrazine et de l’acide

sulfanilique sur la signalisation calcique, le statut redox ainsi que sur l’activité trypsique.

Page 20: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

3

2. Rappel bibliographique

2.1. La digestion : processus et éléments

La plupart des composants des aliments ne peut pas être absorbée directement par

l’organisme. C’est seulement après dégradation en petites molécules que l’organisme peut

extraire les nutriments essentiels. La digestion se réfère à la rupture mécanique et

enzymatique des aliments et à la résorption des produits résultants (Koolman and Roehm,

2005).

Les aliments, au cours de leur passage dans le tube digestif, sont exposés à des

phénomènes mécaniques et enzymatiques. La mastication en bouche, les mouvements

péristaltiques de l’estomac et de l’intestin conduisent à la déstructuration des aliments en

réduisant leur taille. Simultanément, les enzymes du tractus digestif, de la bouche à l’intestin,

modifient chimiquement l’aliment et le transforment en nutriments (Ménard and Dupont,

2014).

Bien qu’elle puisse sembler simple à première vue, la digestion des aliments est un

processus assez complexe et admirable qui nécessite une coopération et une coordination

précise entre les différents organes composant l’appareil digestif (tableau 1).

Le tractus gastro-intestinal (TGI) est un ensemble très complexe composé de plusieurs

organes qui travaillent d’une manière ajustée avec précision chez un individu sain. Outre les

glandes salivaires, les dents, l'estomac, l’intestin grêle, le gros intestin et le foie, le pancréas

joue un rôle très important dans le processus de la digestion (Mößeler and Kamphues, 2017).

Le pancréas est une glande mixte. Elle assure une fonction endocrine en sécrétant

plusieurs hormones tels que le glucagon, l’insuline, la somatostatine et le polypeptide

pancréatique (PP) tandis que le rôle exocrine implique les cellules acinaires qui sécrètent le

suc pancréatique riche en enzymes digestives, en eau et en électrolytes (OpenStaxCollege,

2013).

Page 21: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

4

2.1.1. Pancréas exocrine

2.1.1.1. Physiologie et fonctions

Le pancréas se compose d'une tête reliée au duodénum (figure 1), d’un corps et d’une

queue qui s'étend jusqu'à la rate (Saladin, 2003; Seeley et al., 2004). La partie exocrine du

pancréas a pour fonction de sécréter du suc pancréatique dans le duodénum. Le transport de

ce suc est assuré par deux canaux : le canal pancréatique principal (canal de Wirsung) et le

canal pancréatique accessoire (canal de Santorini) (Tortora and Derrickson, 2009). Il est

formé de deux principaux types cellulaires : les cellules acineuses et les cellules ductales, et

adopte une structure en grappe de raisin (Vaysse, 2005). Les acini pancréatiques synthétisent

et sécrètent des enzymes comme la lipase, la trypsine et l’amylase qui hydrolysent

respectivement les lipides, les protéines et les glucides (figure 2). Les cellules du canal

pancréatique sécrètent des bicarbonates qui maintiennent un pH optimal pour les processus de

digestion et d’absorption (Pibot et al., 2010).

La cellule acineuse présente une forme plus ou moins pyramidale avec son apex dirigé

vers la lumière acinaire. Cette cellule est riche en organites. On retrouve en son sein un

réticulum endoplasmique majoritairement au niveau basal de la cellule avec des ribosomes, un

appareil de Golgi au niveau moyen de la cellule et à l’apex, des grains de zymogène (Barone,

1997; Venel, 2009).

2.1.1.2. Régulation de la sécrétion pancréatique

La sécrétion d'enzymes pancréatiques comporte trois phases : céphalique, gastrique et

intestinale. Les deux premières sont assurées par la stimulation nerveuse neuro-vagale alors

que la troisième, et probablement la plus importante, est régulée par la libération des

hormones cholécystokinine (CCK) et sécrétine de la paroi duodénale (White et al., 1963;

Anagnostides et al., 1984).

La CCK stimule la libération de la bile de la vésicule biliaire et la sécrétion du suc

pancréatique riche en enzymes digestives. Le principal stimulus pour la libération de CCK est

la présence d'acides gras et d'autres lipides dans le duodénum (Seeley et al., 2004).

Le chyme acide stimule également le duodénum pour sécréter la sécrétine qui stimule

Page 22: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

5

Tableau 1. Fonctions des organes de l’appareil digestif (OpenStaxCollege, 2013)

Organe Fonction majeure

Bouche

Ingestion et mastication des aliments

Initiation de la digestion des glucides et des lipides

Déplacement de la nourriture vers le pharynx

Pharynx Déglutition de l’aliment de la cavité orale vers l’œsophage

Œsophage Propulsion de l’aliment vers l’estomac

Estomac

Formation du chyme alimentaire en mélangeant l’aliment au suc gastrique

Initiation de la digestion chimique des protéines suite à l’action de la

pepsine et de l'acide chlorhydrique (HCl)

Déversement du chyme dans le duodénum

Absorption de quelques substances (l'eau, l'alcool, l'aspirine),

Possession des propriétés antimicrobiennes

Intestin grêle

Mélange du chyme avec les sucs digestifs

Poursuite de la digestion de l’aliment

Absorption des nutriments

Organes

accessoires

Foie : produit des sels biliaires qui émulsifient les lipides afin de faciliter

leur digestion et absorption

Vésicule biliaire : stocke et libère la bile

Pancréas : produit des enzymes digestives et bicarbonates

Gros intestin

Absorption des sels, d’eau et des vitamines

Propulsion des excréments vers le rectum en vue de leur élimination

Page 23: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

6

Figure 1. Anatomie du duodénum et du pancréas (Seeley et al., 2004).

(a) La tête du pancréas se trouve dans la courbure duodénale, le canal pancréatique se vide

dans le duodénum. (b) Histologie du pancréas montrant à la fois les acini et le système des

canaux pancréatiques

Figure 2. Unité de fonction et rôle du pancréas exocrine (Saladin, 2003)

(a) Un acinus. (b) L'activation des enzymes pancréatiques dans le duodénum. Le pancréas

sécrète le trypsinogène. Ce dernier est converti par l'entérokinase en trypsine. La trypsine non

seulement digère les protéines alimentaires mais active également deux autres zymogènes

pancréatiques, le chymotrypsinogène et la procarboxypeptidase.

(b) (a)

Page 24: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

7

les voies biliaires hépatiques et les canaux pancréatiques pour sécréter du bicarbonate. Une

autre hormone, la gastrine sécrétée par l'estomac et le duodénum stimule la sécrétion

d'enzymes pancréatiques mais pas aussi fortement que la CCK (Saladin, 2003) (tableau 2).

A l’instar de la stimulation, l’inhibition est contrôlée par deux types de facteurs : les

facteurs nerveux et les facteurs hormonaux. C’est le système nerveux sympathique qui

provoque la diminution de la sécrétion, pour la partie neurologique (Light et al., 1993). Pour

la partie hormonale, il existe un rétrocontrôle au niveau du duodénum sur les sécrétions de

sécrétine et de la CCK. De plus, la somatostatine joue également un rôle inhibiteur de la

sécrétion pancréatique et de l’acide chlorhydrique. Une fois le chyme dans le duodénum, la

somatostatine est libérée. Elle a une action sur les cellules sécrétrices et empêche la libération

des hormones gastro-intestinales (Venel, 2009).

2.1.1.3. La signalisation calcique

L’ion calcium (Ca2+) est un second messager intracellulaire universel. Il est impliqué

dans de nombreuses fonctions cellulaires telles que la contraction musculaire, la libération de

neurotransmetteur, la sécrétion d’enzyme, l’expression génique, ou encore la mort cellulaire

(Berridge et al., 2003; Petersen, 2005) (figure 3). Les études de la signalisation du Ca2+

cellulaire ont été considérablement facilitées par la disponibilité des indicateurs fluorescents

du Ca2+(Lock et al., 2015).

La cellule acineuse du pancréas exocrine est un excellent modèle pour l’étude de la

signalisation calcique, et des messagers impliqués. Ces signaux calciques sont rendus

possibles par des gradients importants de concentration entre le cytoplasme, les différents

compartiments cellulaires, et le milieu extracellulaire (Berridge et al., 2003; Petersen and

Tepikin, 2008).

Le Ca2+ peut être retrouvé dans de nombreux organites intracellulaires fonctionnant

comme des réserves calciques, tels que les mitochondries, le noyau ou encore l'appareil de

Golgi. Néanmoins, le réticulum endoplasmique (RE) constitue la plus importante réserve

calcique intracellulaire composant ainsi, l'une des deux sources principales de Ca2+ de la

cellule, avec le milieu extracellulaire (Missiaen et al., 2004; Cabanas, 2016). La concentration

de cet ion est très faible dans le cytosol (~100 nM) par rapport au milieu extracellulaire

Page 25: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

8

(~1mM) et est maintenue stable grâce à différentes protéines impliquant des transports actifs

et passifs (García et al., 2006; Clapham, 2007).

Dans les cellules exocrines du pancréas, le rôle du calcium, principalement largué du

réticulum endoplasmique (RE) en réponse à l’activation des récepteurs à l’inositol

triphosphate (IP3), est crucial dans la régulation de l’exocytose et peut impliquer un grand

nombre de canaux calciques (Wäsle and Edwardson, 2002; Papin, 2009). Le déclenchement

des ces signaux calciques complexes dépend du neurotransmetteur acétylcholine (ACh) et

l’hormone CCK qui stimulent à leur tour la sécrétion d’enzymes digestives à partir des

granules de zymogène au niveau de la membrane apicale (Palade, 1975; Maruyama and

Petersen, 1994).

2.1.1.4. Physiopathologie du pancréas exocrine

La limitation physiologique de la digestion de la nourriture peut se situer soit au

niveau de la synthèse et de la sécrétion d'enzymes, au niveau du transport des nutriments ou

encore au niveau de la capacité de synthèse des protéines musculaires (Lemieux, 1998). Ainsi,

les conditions qui conduisent à une maldigestion peuvent être soit organiques (altération de la

sécrétion des enzymes pancréatiques), fonctionnelles (altération de la coordination entre les

enzymes et les aliments), ou une combinaison des deux conditions (Vujasinovic et al., 2017).

Parmi les pathologies qui affectent le pancréas, l'insuffisance pancréatique exocrine

(IPE) est définie comme une activité enzymatique pancréatique insuffisante, due à une

production insuffisante d'enzymes, à une activation enzymatique insuffisante ou à une

dégradation précoce de l'enzyme ce qui entraîne une mauvaise digestion des aliments (Löhr et

al., 2013; Vujasinovic et al., 2017). En outre, la pancréatite correspond à une inflammation du

pancréas. Elle peut être chronique ou aigüe. Dans le cas de la pancréatite aigüe, il s'agit de

l'autodigestion du pancréas, utilisant ses propres enzymes pour sa destruction. Le mécanisme

par lequel les enzymes pancréatiques s'attaquent à leur parenchyme d'origine reste peu connu

(Annicotte, 2004).

Le développement de pancréatites aigües ou chroniques peut être provoqué par

différents mécanismes mais elles aboutissent toutes à un disfonctionnement du pancréas et

entrainent par conséquent une maldigestion des aliments.

Page 26: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

9

2.1.1.5. Enzymes digestives pancréatiques

Les enzymes sont des catalyseurs très spécifiques de réactions biologiques. Cette

propriété est liée à la présence, dans leur structure, d’un site actif qui en forme une cavité au

sein de laquelle se déroule la réaction enzymatique proprement dite. De manière générale, le

site actif est d’une taille restreinte par rapport à la taille globale de l’enzyme. Il constitue donc

le site de reconnaissance spécifique de l’enzyme (Cingöz, 2009). Ces catalyseurs biologiques

sont synthétisés dans les cellules par la machinerie normale de la synthèse des protéines. La

structure d'une enzyme donnée est codée par des gènes de structure, dont la séquence d'ADN

est transcrite en un ARN messager, et l'ARNm est traduit par les ribosomes à partir de ses

codons pour former la séquence des acides aminés de la protéine souhaitée en présence des

facteurs associés (Aehle, 2007).

Suite à l’ingestion des aliments, la glande pancréatique sécrète plus de 2 L de suc par

jour, un liquide clair et incolore formé d’eau, de quelques sels, de bicarbonates de calcium et

également de proenzymes et d’enzymes digestives (Vaysse, 2005; Pezzilli, 2009; Kim et al.,

2010). La sécrétion de protéines par le pancréas est la plus importante par gramme de tissu de

tout l’organisme et plus de 85% de teneur en protéines est composée d'enzymes. Ces dernières

sont capables de digérer les lipides, protéines et glucides (Pezzilli, 2009) (tableau 3).

Le suc pancréatique est sécrété principalement en réponse à l’ingestion d’aliments.

Mais toutefois, il existe une sécrétion basale continue lors du jeûne, mais en faible quantité

(par rapport à la sécrétion suite à une stimulation, seulement 2% du bicarbonate et 10% des

enzymes) (Antomarchi, 2009).

Chez l’homme, les enzymes digestives sont aussi dégradées par les protéases pendant

la digestion une fois qu’elles ont digéré leurs substrats. Dans les conditions normales, les

niveaux des enzymes pancréatiques dans la partie distale de l’intestin et dans les fèces sont

extrêmement faibles (Najjar, 2010).

2.1.1.5.1. Les protéases

La digestion des protéines débute dans l’estomac sous l’action de la pepsine. Elle se

poursuit dans le duodénum grâce aux enzymes protéolytiques pancréatiques (Despopoulos

and Silbernagl, 2003) (figure 4). Les protéases représentent 70% des enzymes sécrétées. Elles

Page 27: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

10

Tableau 2. Caractéristiques des principales hormones intervenant dans la stimulation des

sécrétions pancréatiques (Herdt and Sayegh, 2002; Washabau et al., 2012) .

Hormone Production Principaux

stimuli Cellules cibles

Principaux effets

sur le pancréas

exocrine

Sécrétine Duodénum pH duodénal

bas

Cellules

canalaires

Stimule la sécrétion

de bicarbonates

CCK duodénum,

jéjunum et iléon

Acides aminés,

lipides présents

dans le

duodénum

Cellules

acineuses

Stimule la sécrétion

d’enzymes

pancréatique, stimule

la synthèse

enzymatique

Gastrine antre gastrique

Stimulation

vagale,

présence d’acide

aminés et de

calcium

dans la lumière

gastrique

cellules

acineuses

stimule la sécrétion

d’enzymes

pancréatiques

Page 28: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

11

Figure 3. Représentation schématique de la signalisation calcique (Berridge et al., 2003).

(A) : Entrée du calcium ou production de seconds messages qui provoquent la libération du

calcium contenu dans les stocks intracellulaires ; (B) : Processus physiologiques induits par le

calcium ; (C) retour à l’état de repos grâce à l’action combinée de pompes et d’échangeurs.

Page 29: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

12

sont synthétisées sous une forme inactive par les cellules acineuses, où elles sont stockées

dans les grains de zymogène. Leur activation n’a lieu qu’au moment où elles sont libérées

dans la lumière duodénale (Antomarchi, 2009).

Les protéases, en tant que molécules protéiques, ne peuvent accomplir leur action que

si leur structure est préservée. Pour cela, certaines conditions physico-chimiques doivent être

respectées pour que les protéases soient actives. Il est bien connu que chaque enzyme a un

optimum d’activité dans certaines conditions de pH et de température (Nioi, 2013). Selon leur

mécanisme d’action qui est lui-même fonction de la nature du ou des acides aminés du site

actif de l’enzyme, on distingue les endopeptidases (trypsine, chymotrypsine et élastase) et les

exopeptidases (carboxypeptidases A et B) (Aluko et al., 2005; Lecleire, 2008). Dans le

contexte de notre travail, nous nous sommes intéressés à la trypsine et la chymotrypsine.

a. La trypsine

La trypsine (EC 3.4.21.4) (figure 5) possède quatre ponts disulfures et a une masse

moléculaire de 23,8 kDa pour 221 acides aminés (Cunningham, 1954). Le pH optimal pour

cette enzyme se situe autour de 7,8 (Beck, 1973). C’est une enzyme extrêmement spécifique

hydrolysant la liaison peptidique côté C-terminal après les acides aminés, lysine et arginine

(Cingöz, 2009).

Dans le pancréas, les vésicules stockent la trypsine en tant que trypsinogène pour

éviter l’autodigestion de l’organe. Les cellules acineuses pancréatiques sécrètent également

une protéine appelée inhibiteur de la trypsine qui se combine avec n'importe quelle trypsine

formée accidentellement dans le pancréas ou dans le suc pancréatique et bloque son activité

enzymatique (Kishimura and Hayashi, 2002; Tortora and Derrickson, 2009). Le pancréas

humain sécrète trois isoformes de trypsinogène. Sur la base de leur mobilité

électrophorétique, ils sont communément appelés trypsinogène cationique, trypsinogène

anionique et mésotrypsinogène. Les deux principales isoformes, cationique et anionique,

constituent la majeure partie du trypsinogène sécrété, alors que les niveaux de

mésotrypsinogène sont rapportés entre 3 et 10% de la teneur totale en trypsinogène dans le

suc pancréatique (Szmola et al., 2003).

La sécrétion sous forme de proenzyme est donc un mécanisme de régulation qui

consiste en un blocage de l’accès du substrat au site actif par une partie de la chaîne

Page 30: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

13

Tableau 3. Sécrétion exocrine principale de pancréas (Saladin, 2003)

Sécrétion Fonction

Des ions bicarbonates Neutralisation de l’acidité gastrique

Zymogènes Convertis en enzymes

Trypsinogène Converti en trypsine qui digère les protéines

Chymotrypsinogène Converti en chymotrypsine qui digère les protéines

Procarboxypeptidase Converti en carboxypeptidase hydrolyse l'acide aminé terminal de

l'extrémité carboxyle (-COOH) de petits peptides

Enzymes

Amylase pancréatique Digestion de l’amidon

Lipase pancréatique Digestion des lipides

Ribonucléase Digestion de l’ARN

Désoxyribonucléase Digestion de l’ADN

Figure 4. Digestion des protéines (Gamet, 2006)

Page 31: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

14

peptidique du proenzyme. Ce n’est que lors du clivage de cette région que, par un changement

de conformation, la cavité du site se retrouve libre.

Une fois libérée dans le duodénum, l’entérokinase qui est une enzyme attachée à la

bordure en brosse de l'intestin grêle, active le trypsinogène. La trypsine active alors à son tour

plus de trypsinogène, ainsi que le chymotrypsinogène et la procarboxypeptidase (Seeley et al.,

2004; Buscail and Carrière, 2010). Donc cette enzyme joue un rôle-clé dans les processus de

la digestion dans la mesure où c’est elle qui va être responsable de l’activation en cascade de

toutes les autres enzymes (figure 6).

La détermination de la présence de trypsine dans le sérum est utilisée pour établir le

diagnostic de pancréatite aiguë car les sites de production de la trypsine sont presque

exclusivement pancréatiques. En présence de pancréatite, cette concentration s’accroît de

façon remarquable (Vaysse, 2005).

b. La chymotrypsine

La chymotrypsine (EC 3.4.21.1) (figure 7) est synthétisée en même temps que la

trypsine au niveau du pancréas sous forme d’un zymogène comme le reste des protéases. Son

précurseur, le chymotrypsinogène est transformé en chymotrypsine sous l’action de la

trypsine au niveau du duodénum (Silbernagl and Despopoulos, 2001; Kim et al., 2010).

La chymotrypsine a une seule chaîne polypeptidique de 324 résidus d'acides aminés.

Elle possède une masse moléculaire de 25,7 kDa et un point isoélectrique de 9,1 (Uhlig, 1998;

Boeris et al., 2009). Son pH optimal est 8,2 (Sharma and Hopkins, 1979). Cette enzyme

hydrolyse pour sa part les liens peptidiques sur les résidus hydrophobes encombrants

(phénylalanine, tryptophane, tyrosine) (Hedstrom, 2002; Vaysse, 2005). Chez l’humain,

quatre isoformes de chymotrypsinogène sont présentes : chymotrypsinogène B1 (CTRB1),

chymotrypsinogène B2 (CTRB2), chymotrypsinogène C (CTRC), et le précurseur de

l'enzyme-1 chymotrypsin-like (CTRL1) (Sahin-Tóth and Szabó, 2011). Lors de son largage

dans la lumière intestinale, la trypsine va cliver la chymotrypsinogène entre l'Arg15 et l'Ile 16,

et ainsi activer l'enzyme (Mátrai et al., 2004; Whitcomb and Lowe, 2007).

Page 32: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

15

Figure 5. Représentation tridimensionnelle de la trypsine pancréatique (Demers, 2010)

Figure 6. Trypsine : Activation et action (Silbernagl and Despopoulos, 2001)

Page 33: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

16

2.1.1.5.2. La lipase

La lipase également nommée triacylglycerolacyl hydrolase ou lipase pancréatique

colipase dépendante (EC 3.1.1.3) est capable d’hydrolyser les triglycérides à longues chaînes

d’acides gras en glycérol et en acides gras correspondants (Fickers et al., 2008).

Cette enzyme est constituée d’une chaine glycoprotéique composée de 449 acides

aminés et est divisée en deux unités de pliage : un grand amino-terminal domaine contenant 1-

336 résidus et un petit carboxy-terminal domaine aux résidus 337-449. Le site actif est une

triade comprenant His-263, Asp-176 et Ser-152 dans le plus grand domaine amino-terminal

(figure 8) (Zhang et al., 2014). La lipase pancréatique possède une activité optimale entre pH

6,5 et 7,5. Elle est particulièrement adaptée au contenu de l’intestin grêle, où le pH varie entre

5 et 7 au cours d’un repas (Lengsfeld et al., 2005).

Environ 10 à 30% de l'apport en graisses alimentaires sont hydrolysés dans l'estomac,

tandis que les 70-90% restants sont dégradés dans le duodénum et la partie supérieure du

jéjunum (Silbernagl and Despopoulos, 2001). Quand le chyme entre dans le duodénum, sa

graisse se présente en grands globules exposés à la lipase, mais seulement à leur surface. La

digestion de la graisse serait plutôt lente et inefficace si elle restait de cette façon (Saladin,

2003). Pour permettre une action enzymatique optimale, il faut qu'il y ait une émulsification

préalable des lipides car les gouttelettes graisseuses relativement petites dans une émulsion

offrent aux lipases une surface d'action importante (Tortora and Derrickson, 2009).

Cette émulsification est assurée d’une part par la motricité de l’estomac et d’une autre

part sous l’action de la lécithine et des sels biliaires. En effet, sans l’interface eau / lipide de

l’émulsion formée avec les sels biliaires, la lipolyse des triglycérides serait 2 à 4 fois moins

efficace (Borgström, 1975; Fickers et al., 2008). Les sels biliaires sont des détergents

stéroïdiens biosynthétisés à partir du cholestérol dans le foie et stockés dans la vésicule

biliaire. La bile est sécrétée par le canal biliaire dans l'intestin sous l'influence d'une gamme

d’hormones gastro-intestinales. Chez l’être humain, la production de la bile est environ 0,4 à

0,8 L par jour (Maldonado-Valderrama et al., 2011).

Cependant, les lipides sont les stimulants les plus puissants de la sécrétion d'enzymes

pancréatiques et l'administration chronique d'un régime à haute teneur en matière grasse est en

Page 34: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

17

permanence associée à une production d'enzymes plus élevée par rapport aux régimes riches

en hydrates de carbone ou en protéines (Keller and Layer, 2005).

La sécrétion exocrine pancréatique contient d’autres enzymes lipolytiques possédant

diverses spécificités et une moindre contribution à la lipolyse globale. La carboxylester

hydrolase (ou cholestérol estérase, ou lipase dépendante des sels biliaires) est une enzyme peu

spécifique qui hydrolyse très faiblement les triglycérides et dont le rôle physiologique

principal semble être la lipolyse des esters de cholestérol et de vitamines liposolubles. La

phospholipase A2 pancréatique hydrolyse préférentiellement la phosphatidylcholine (figure 9)

(Buscail and Carrière, 2010).

En plus, deux protéines apparentées à la lipase pancréatique (PLRP1 et PLRP2 :

pancreatic lipase-relatedprotein) ont été identifiées dans le suc pancréatique humain (Giller et

al., 1992; De Caro et al., 1998; De Caro et al., 2004). Alors que la PLRP1 ne présente aucune

activité enzymatique, la PLRP2 a une activité hydrolytique contre les triglycérides et les

phospholipides (Roussel et al., 1998; Wong and Schotz, 2002; Eydoux et al., 2007).

Contrairement à la plupart des enzymes pancréatiques, la lipase pancréatique n’est pas

produite sous la forme d’une proenzyme et elle est potentiellement fonctionnelle dès sa

synthèse, mais elle est néanmoins inefficace sans la présence de son coenzyme : la colipase,

qui permet à la lipase de traverser la couche de substances biliaires recouvrant les gouttelettes

lipidiques sans être inactivée notant que la colipase résulte de l'action de la trypsine sur une

pro-colipase provenant du suc pancréatique (Silbernagl and Despopoulos, 2001; Antomarchi,

2009). Ce système lipase pancréatique-colipase est extrêmement efficace; La quantité de

lipase dans 100 ml de contenu duodénal est capable de digérer la prise quotidienne complète

de graisse en environ 1 minute (Brogström and Hildebrand, 1975).

Bien qu'aucun ion ne semble nécessaire en tant que cofacteur-lipase absolu, les ions

calcium ont été impliqués dans le mécanisme d'action de la lipase pancréatique pendant une

longue période (Benzonana, 1968; Lairon et al., 1980; Alvarez and Stella, 1989; Wickham et

al., 2002; Golding and Wooster, 2010). Selon Borgström and Brockman (1984), le calcium est

un effecteur de la lipase pancréatique et contribue de manière significative à l'augmentation

de son activité catalytique.

Page 35: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

18

Figure 7. Représentation tridimensionnelle de la chymotrypsine pancréatique (Demers,

2010)

Figure 8. Représentation tridimensionnelle de la lipase pancréatique (Chen et al., 2003)

Page 36: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

19

Figure 9. Hydrolyse des lipides alimentaires (Marcil et al., 2004).

Les enzymes lipolytiques de provenance pancréatique sont essentiels à l’hydrolyse des

lipides. La lipase pancréatique s’attaque aux liens en position sn-1 et sn-3 du triacylglycérol

pour libérer deux acides gras et un monoacylglycérol ayant un acide gras en position sn-2. La

phospholipase détache l’acide gras de la position sn-2 du phospholipide pour produire un

acide gras et un lysophospholipide. La cholestérol estérase dégrade l’ester de cholestérol en

acide gras et en cholestérol libre.

Page 37: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

20

En effet, plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer le rôle du calcium

pouvant augmenter la lipolyse de plus de 87 % (Scow, 1988). Les ions calcium peuvent

moduler la vitesse de la lipase ou la phase de latence jusqu'à ce que l'activité enzymatique

maximale soit atteinte. Le calcium peut diminuer les répulsions électrostatiques se produisant

à l'interface émulsion-eau, mais un excès de calcium peut induire une coalescence des

particules émulsifiées. En fait, le rôle des ions calcium n'est toujours pas clair et, par

conséquent, la dépendance en calcium de la réaction lipolytique a été déterminée en présence

de différents substrats émulsifiés (Armand et al., 1992).

Bien que la lipase gastrique participe dans la digestion des graisses, la lipase

pancréatique reste le principal enzyme responsable de la digestion des lipides alimentaires.

Ceci explique l’association de son déficience avec plusieurs maladies (Buscail and Carrière,

2010). En effet, la réduction ou l'absence de la sécrétion de la lipase pancréatique, soit en

raison d'une carence en lipase ou dans des maladies telles que la fibrose kystique, la

pancréatite chronique, les tumeurs pancréatiques, ou après une chirurgie du pancréas, entraîne

une stéatorrhée et une malabsorption des lipides, qui sont préjudiciables et se produisent

généralement des années avant la malabsorption cliniquement pertinente des hydrates de

carbone ou des protéines devient évidente (Layer and Keller, 1999; Layer and Keller, 2005).

2.1.1.5.3. L’amylase

L'amylase également connue sous plusieurs autres appellations, dont saccharidase et

diastase est une enzyme qui catalyse l’hydrolyse de l’amidon en oligosaccharide plus courts,

une étape importante vers la transformation de l’amidon en unités simples qui peuvent être

assimilées par l’organisme (Iulek et al., 2000; Payan, 2004). L'histoire des amylases a

commencé en 1811 lorsque la première enzyme dégradant l'amidon a été découverte par

Kirchhoff (Gupta et al., 2003).

Plusieurs types d'amylases existent : alpha (3.2.1.1), bêta (3.2.1.2) et gamma (3.2.1.3)

(Yamamoto, 1995). La bêta-amylase et la gamma-amylase (glucoamylase) sont généralement

d'origine végétale ou microbienne quoique la glucoamylase a été retrouvée chez certains

mammifères ou espèces aquatiques (Shetty, 2006).

L'amylase pancréatique humaine est une alpha-amylase (EC 3.2.1.1) (figure 10). Son

poids moléculaire est de 55000 daltons et ayant un point isoélectrique à 7,0 (Lévy, 2006).

Page 38: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

21

Cette enzyme est secrétée sous forme active puisqu’elle n’attaque pas le pancréas comme le

font les protéases pancréatiques (OpenStaxCollege, 2013). Son pH optimal varie selon les

auteurs entre neutre et alcalin (pH=8) alors que la présence de calcium est nécessaire à

l’activité de l’amylase (Bonnin, 2002; Despopoulos and Silbernagl, 2003; Taghipoor, 2012).

De plus, la présence de 1'ion chlorure ou d'autres anions contribue également à activer

cette enzyme, mais l'ion chlorure le fait d'une manière plus importante (Buisson et al., 1987).

L’hydrolyse par L’α-amylase aboutit principalement à la formation de maltose, de

maltotriose, de dextrine ainsi que des oligosaccharides variés (Kim et al., 2010).

Des enzymes, telles que la maltase, l’isomaltase, la 1-6-glucosidase, présentes à la

surface des villosités intestinales, complètent l’action de l’α-amylase, et permettent la

libération de glucose absorbable par les entérocytes (Tortora and Derrickson, 2009; Venel,

2009).

A l’état normal, l’amylase pancréatique représente 30 à 50 % de l’amylase sanguine

(Pieper-Bigelow et al., 1990). Ceci est bien sûr radicalement différent en cas de pancréatite

aiguë (Lévy, 2006). En effet, une élévation de l’amylase sérique est couramment rencontrée

dans un grand nombre de pathologies et des valeurs normales n’excluent pas une pancréatite

(Pibot et al., 2010). De plus, la digestion des glucides devient très difficile lors de déficit en

amylase et sa carence entraine des anomalies d’activités des enzymes intestinales

(Henroteaux, 1996).

2.1.2. Modèle de digestion

Pour étudier la digestion, les études expérimentales chez l’animal ou les essais

cliniques chez l’homme demeurent la meilleure approche. Cependant, les études cliniques de

digestion chez l’homme sont éthiquement et techniquement difficiles à mettre en place. Ces

études, également très couteuses, sont impossibles à réaliser en grand nombre (Ménard and

Dupont, 2014). En conséquence, des méthodes alternatives in vitro qui déterminent des

paramètres tels que la bioaccessibilité des nutriments et des éléments non nutritifs ou la

digestibilité des macronutriments (par exemple les lipides, les protéines et les hydrates de

carbone) sont utilisées pour le criblage et la construction de nouvelles hypothèses (Minekus et

al., 2014).

Page 39: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

22

Figure 10. Diagramme de la structure de l'α-amylase (Payan, 2004)

Le domaine A est représenté en rouge, le domaine B en jaune et le domaine C en violet. L'ion

calcium (sphère bleue) et l'ion chlorure (sphère jaune) sont également montré à proximité

immédiate du centre catalytique. Un dérivé de l'acarbose ligand (représentation boule-et-bâton

en vert) est lié au site actif fendu. Ligands de monosaccharide et de disaccharide (dans la

représentation de boule-et-bâton) sont montrés liés aux sites de liaison de surface.

Page 40: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

23

Les modèles de digestion in vitro devraient considérer trois principales étapes : la

digestion dans la bouche, celle dans l'estomac et la dernière au niveau du duodénum. Ces trois

phases peuvent être considérées séparément ou en combinaison en fonction de l'objectif de

l'étude (figure 11) (Wickham et al., 2009). En effet, les modèles in vitro de l'intestin grêle sont

utilisés pour la mise en évidence de la digestibilité des nutriments alors que le modèle du

côlon élucide le rôle du microbiote dans le métabolisme de tous les composants non

digestibles d’un aliment (Aura, 2005).

A l’heure actuelle, la digestion gastro-intestinale simulée est largement employée dans

beaucoup de domaines des sciences alimentaires et nutritionnelles sachant que les modèles de

digestion in vitro sont rapides, simples et relativement peu coûteux pour une évaluation plus

précise des risques sans l'utilisation d'animaux (Brandon et al., 2006).

D’un autre coté, bien que ces modèles soient très sophistiqués, ils ne reflètent pas

complètement les conditions digestives de l’homme. La grande complexité des matrices

alimentaires et les mécanismes intervenant dans le processus de digestion, encore

incomplètement définis, impliquent que, quel que soit le modèle de digestion, la

caractérisation du devenir des protéines alimentaires est une tâche très difficile (Picariello et

al., 2013).

En outre, la comparaison entre les systèmes in vitro est compliquée et il est difficile de

déterminer lequel des modèles actuels fournit les valeurs les plus précises en termes de la

situation humaine (Guerra et al., 2012) sachant que ces modèles diffèrent les uns des autres en

ce qui concerne le nombre et le type d'étapes incluses dans la digestion, la composition des

fluides digestifs ainsi que les contraintes mécaniques et les écoulements de fluides utilisés

dans chaque étape (Hur et al., 2011).

2.2. Les additifs alimentaires

À partir du moment où la disponibilité alimentaire est la règle, le choix de l’aliment se

fait non seulement sur la base de ses propriétés nutritionnelles mais aussi sur celle de ses

propriétés sensorielles. À l’aliment, on attribue une fonction « plaisir » liée, entre autre, à la

satisfaction des sens olfactifs : il doit être beau à la vue, bon au goût, avoir une odeur et une

Page 41: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

24

Figure 11. Spécificité régionale du tractus gastro-intestinal humain mimé dans le modèle

digestif in vitro (Guerra et al., 2012)

Bouche :

Mastication et mélange de

l’aliment avec la salive.

• pH 5-7

• Temps de transit : 10 s à 2

minutes

• Enzymes salivaires (amylase,

lipase linguale)

Colon

• Fermentation microbienne

des aliments non digérés,

réabsorption d'eau

• pH 5-7

• Temps de transit : 12 à 24

heures.

•Microbiote

Estomac :

• Digestion mécanique et

enzymatique du bol

alimentaire.

• pH 1-5

• Temps de transit : 15 min à

3 heures

• HCl, pepsine, lipase

gastrique

Intestin :

Digestion et absorption des

nutriments.

• pH 6-7,5

• Temps de transit : 2 à 5 heures

• Suc pancréatique, bile,

NaHCO3

Page 42: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

25

palatabilité caractéristiques et estimées du consommateur, et même être agréable à l’oreille

(Hyardin et al., 2007).

C’est dans ce contexte que les additifs alimentaires sont communément utilisés dans le

souci d’améliorer l’apparence, le goût, l’odeur, la couleur, la texture, la valeur nutritive et

pour la conservation dans le but de rendre les aliments plus attirants et plus appétissants

(Shawish et al., 2013). Plus précisément, d’après le comité FAO–OMS, un additif alimentaire

est défini comme « une substance dotée ou non d’une valeur nutritionnelle, ajoutée

intentionnellement à un aliment dans un but technologique, sanitaire, organoleptique ou

nutritionnel. Son emploi doit améliorer les qualités du produit fini sans présenter de danger

pour la santé, aux doses utilisées » (Dutau et al., 1996; Bourrier, 2006).

Les additifs sont listés en 24 catégories : colorants (cochenille, érythrosine, riz rouge,

annatto, tartrazine), conservateurs (lysosyme, sulfites, benzoates, nitrites), antioxygènes,

émulsifiants, sels de fonte, épaississants, gélifiants (carraghénanes, gommes adragantes),

stabilisants, exhausteurs de goût (diacétyl), acidifiants, correcteur d’acidité, antiagglomérants,

amidon modifié, édulcorants, poudre à lever, antimoussants, agents d’enrobage, agents

detraitement de la farine, affermissants, humectants, séquestrants, enzymes, agents de charge,

gaz propulseur et d’emballage (Sauvage, 2010).

Sur le marché européen, il y a une liste dont la lettre E est toujours suivie de 3 chiffres

pour permettre d’identifier les différentes catégories des additifs alimentaires. Cette liste

comprend : les colorants de E100 à E180, les agents conservateurs de E200 à E290, les agents

anti-oxygène de E300 à E321, Les agents de texture : émulsifiants, stabilisants, épaississants

et gélifiants de E322 à E495, les acides alcalis de E500 à E578, les révélateurs de goût de

E620 à E637 et divers de E900 à E927 (Vimont, 2008).

L’emploi des additifs alimentaires est rigoureusement réglementé et répond à une

évaluation scientifique approfondie en termes de sécurité sous le contrôle de l’Autorité

Européenne de Sécurité des Aliments (AESA) (Gallen and Pla, 2013). En Australie et en

Nouvelle‐Zélande, le processus d’approbation des additifs est rigoureux et fondé sur deux

principes : l’additif doit remplir une fonction technologique et, utilisé à la dose proposée, il ne

doit poser aucun risque pour la santé des consommateurs. La présence des additifs autorisés

doit être déclarée sur l’étiquette des aliments (Hayder et al., 2011). Parmi les additifs

Page 43: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

26

alimentaires, les colorants sont ceux qui sont les plus utilisés et souvent par intérêt

économique.

2.2.1. Les colorants alimentaires

Depuis le début de l’humanité, les colorants ont été appliqués dans pratiquement

toutes les sphères de notre vie quotidienne pour la peinture et la teinture du papier, de la peau

et des vêtements, etc. Jusqu’à la moitié du 19ème siècle, les colorants appliqués étaient

d’origine naturelle qui sont obtenus à partir de produits d’origine animale ou végétale

(Hammami, 2008). Les premiers colorants connus sont ceux utilisés à Lascaux (France) ou à

Altamira (Espagne), datant du Magdalénien. Ces colorants sont des pigments minéraux :

oxydes de fer pour les jaunes, les ocres et les rouges, oxydes de manganèse pour les bruns.

Dès 1500 avant notre ère, les Egyptiens réalisent des teintures avec le safran (jaune), le pastel

(bleu) et la garance (rouge) (Chaguer, 2007).

Les colorants alimentaires étaient d’origine naturelle (carotte, betterave, peau de raisin

noir, safran, etc.) (Gallen and Pla, 2013). Ces colorants sont souvent ajoutés aux denrées

alimentaires et des boissons afin de fournir, d'intensifier ou de restaurer leur couleur pour

créer l'apparence de couleur désirée (Schenone et al., 2013). La couleur est un des facteurs les

plus influents dans l’acceptation de la nourriture et du comportement alimentaire et a été

utilisée pour affecter de façon spectaculaire la perception par les gens d'une variété de

différents aliments et boissons (Radder and Le Roux, 2005; Zampini et al., 2007).

Ce n'est qu'en 1856 que William Henry Perkin, en essayant de synthétiser de la

quinine artificielle à partir d’allyltoluidine pour soigner la malaria, a découvert la première

matière colorante synthétique. Il l’appela "mauve", c’est l’aniline qui est un colorant basique.

L'industrie des colorants synthétiques était alors née (Barka, 2008). La production annuelle

mondiale des colorants est estimée à 800.000 tonnes par an et environ 50% sont des colorants

azoïques (Szyguła et al., 2008; Greluk and Hubicki, 2011). En Europe, les principaux

colorants synthétiques utilisés sont présentés dans le tableau 4.

Les colorants synthétiques sont largement utilisés car ils présentent de nombreux

avantages par rapport aux colorants naturels tels que la grande stabilité à la lumière, l'oxygène

et le pH, uniformité de la couleur, l'homogénéité, la faible contamination microbienne et les

coûts de production relativement bas (Schenone et al., 2013). En outre, les colorants azoïques

Page 44: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

27

constituent le plus grand groupe de colorants certifiés. Plus de 15 colorants azoïques sont

autorisés dans tous les aliments, à l'exception des viandes crues ou transformées, des fruits,

des légumes, du pain blanc, thé, café et lait (Ward, 1997). La tartrazine (E102) est le colorant

le plus fréquemment étudiée en termes de troubles de santé.

2.2.1.1. La tartrazine (E102)

2.2.1.1.1. Structure et propriétés

La Tartrazine aussi connu sous le nom de FD & C Yellow No. 5 est un colorant

synthétique azoïque de couleur jaune (Gao et al., 2011). C'est le sel trisodique d'hydroxy-5-

(sulfo-4-phényl)-1-(sulfo-4-phénylazo)-4-H-pyrazole carboxylate-3.Sa formule brute est :

C16H9N4Na3O9S2 (EFSA, 2009) et sa formule développée est représentée dans la figure 12.

C’est un dérivé de goudron de houille qui est utilisé pour colorer les aliments, les cosmétiques

et autres produits.

On le trouve dans certains jus de fruits, liqueurs, boissons gazeuses colorées,

poudings instantanés, mélanges à gâteaux, poudres pour pudding, soupes, sauces, crèmes

glacées, bonbons, chewing-gums, confitures, moutardes, yaourts et de nombreux plats

cuisinés (Mittal et al., 2007). Ce colorant est également utilisé dans des produits

pharmaceutiques et cosmétiques comme les savons, les shampoings, les produits capillaires,

les vitamines, les antiacides et les médicaments en capsules (Kobylewski and Jacobson, 2010;

Ghonimi and Elbaz, 2015).

La tartrazine est souvent utilisée dans les préparations culinaires en Algérie comme un

remplaçant du safran (Mehedi et al., 2009) et en Espagne, elle est utilisée pour colorer les

plats traditionnels tel que la paella.

2.2.1.1.2. Métabolisme

La tartrazine (E102) est soluble dans l’eau mais très peu métabolisée et absorbée par

voie orale. Les études publiées dans la littérature montrent que moins de 2% de la tartrazine

ingérée est effectivement absorbée (Murdoch et al., 1987; Soares et al., 2015). L'acide

sulfanilique est le principal métabolite résultant de la réduction de la tartrazine au niveau du

lien azoïque N=N.

Page 45: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

28

Tableau 4. Liste des principaux colorants alimentaires synthétiques autorisés dans l’Union

Européenne (UE) (Issa, 2009)

Nom commercial Dénomination usuelle

E102 Tartrazine

E104 Jaune de quénoline

E110 Jaune orangé S

E122 L'azorubine ou carmoisine

E123 Amarante

E124 Rouge cochenille A

E127 Erythrosine

E128 Rouge 2G

E129 Rouge Allura AC

E131 Bleu Patenté V

E132 Indigotine ou carmin d'indigo

E133 Bleu Brillant FCF

E141 a. Complexes cuivriques des chlorophylles

b. Complexes cuivriques des chlorophyllines

E142 Vert S

E151 Noir Brillant BN ou Noir PN

E154 Brun FK

E155 Brun HT

Figure 12. Structure chimique de la tartrazine (Mittal et al., 2007)

Page 46: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

29

Cependant, lorsque le E102 marqué avec le C14 du groupe phénylazo était administré

par voie intrapéritonéale chez le rat et le lapin, aucun acide sulfanilique radioactif n'a été

récupéré dans l'urine (Jones et al., 1964)

Dans la même étude, quand la tartrazine a été administrée par voie orale à des rats, des

lapins et des humains, l'acide sulfanilique a été récupéré dans l'urine. Ces résultats indiquent

que la réduction du E102 se produit via la flore gastro-intestinale. Par ailleurs, cette réduction

peut avoir lieu au niveau hépatique par voie enzymatique mais les enzymes hépatiques

jouerait seulement un rôle mineur dans ce métabolisme (Chung et al., 1992; de Aragão

Umbuzeiro et al., 2005). Selon l'Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (AESA)

(EFSA, 2009), les métabolites de la tartrazine peuvent être absorbés dans une plus grande

mesure que la tartrazine elle-même.

2.2.1.1.3. Réglementation

Ce colorant azoïque autorisé en tant qu'additif alimentaire dans l’UE est

précédemment évalué par le Comité mixte FAO / OMS d'experts des additifs alimentaires

(JECFA) en 1964 et du Comité scientifique Alimentaire (SCF) en 1975 et en 1984 et

également réévalué par EFSA en 2009. Ces comités ont établi une dose journalière acceptable

(DJA) de 0-7,5 mg/kg poids corporel (pc) / jour (JECFA, 1964; EFSA, 2009). En 2016, cette

dose est révisée par le JECFA qui a établi une nouvelle DJA de 0-10 mg / kg pc (JECFA,

2016).

L’utilisation de la tartrazine est également autorisée dans plusieurs pays autre que

l’UE. En Australie, selon TherapeuticGoods Administration (TGA), la tartrazine ne semble

pas représenter un risque pour le consommateur d'un point de vue toxicologique. En

Nouvelle-Zélande, l’utilisation de la tartrazine par voie orale est également permise et la

teneur en tartrazine dans les produits est soigneusement étiquetés conformément à la TGA

(2014).

2.2.1.1.4. Estimation de la consommation du E102

L’estimation de la consommation de la tartrazine varie considérablement d’un pays à

l’autre. En Australie, la consommation de la tartrazine chez les enfants âgés de 2 à 16 ans,

même avec la consommation quotidienne la plus élevée, se situe entre 0,21 et 0,38 mg / kg de

Page 47: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

30

poids corporel ce qui correspond entre 3 à 5% de la DJA (TGA, 2014). En France, la

consommation de la tartrazine chez les enfants représente 37,2 % de la DJA (Elhkim et al.,

2007). En Corée, l’estimation de l’apport quotidienne du E102 était plus élevée chez les

enfants que chez les adultes mais ne dépasse pas 2,5 % de la DJA (Ha et al., 2013).

Une étude menée en Indonésie a révélé que la valeur moyenne de la tartrazine

consommée était de 231,24 μg / kg de poids corporel (3,08% de DJA) et que les enfants

représentent la population la plus exposée en raison de leur consommation alimentaire élevée

et de leur faible poids corporel (Anisyah et al., 2011). En plus, une étude britannique estime

que l'apport en tartrazine représente 52% de la DJA chez les jeunes enfants dans les pays de

l’UE (EC, 2001) alors qu’elle représente 0,4 % chez les enfants âgés de 3 à 14 ans selon une

autre étude faite au Brésil (Toledo et al., 1992)

Par contre, en Inde, la dose consommée de la tartrazine dépasse la DJA de 152% chez

les enfants de 1 à 10 ans (Tripathi et al., 2010). Une autre étude réalisée dans la ville de

Hyderabad, au sud de l'Inde a montré que la consommation de ce colorant a dépassé les

limites de la DJA de 104% (Rao et al., 2004). Ce dépassement est aussi trouvé au Kuwait

chez les enfants de 7 ans (Husain et al., 2006; Sawaya et al., 2008).

2.2.1.1.5. Détermination de la présence de la tartrazine dans les aliments

Le niveau d'exposition à la tartrazine et l’excès de la DJA dépendent non seulement de

la fréquence de la consommation des aliments contenant ce colorant, mais aussi de sa quantité

dans ces aliments dont l’excès est généralement lié à un manque de contrôle aux niveaux des

industries alimentaires. Dans l’Union Européenne(UE), la quantité maximale autorisée de

tartrazine dans les aliments est de 500 mg/kg (Scotter and Castle, 2004). L’étude de Amin et

al. (2014) a montré que la teneur en tartrazine était supérieure à la dose maximale permise de

300 mg /kg dans 10 échantillons de yaourts en Côte d’Ivoire. De plus, l'autorité indienne de la

sécurité alimentaire PFA (The Food Safety and Standards Authority of India) autorise

l'utilisation de huit colorants synthétiques dont la tartrazine dans des denrées alimentaires à

une dose de 100 mg/kg ou litre (PFA, 2004). Cependant, cette dose a été dépassée dans 53 %

des aliments comme cela a été montré par Dixit et al. (2011).

Page 48: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

31

Aux États-Unis, ce contrôle semble être plus stricte, Bastaki et al. (2017) a conclu que

l'utilisation des colorants alimentaires telle qu'elle est actuellement pratiquée est sans risque et

n’entraîne pas une exposition excessive à la population.

Diverses techniques ont été utilisées pour déterminer la dose de la tartrazine dans les

aliments telles que la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) (Alves

et al., 2008), la spectrophotométrie (Badawy et al., 2011), l’électrophorèse capillaire (Süslü et

al., 2007), le dosage par voltamétrie (Ghoreishi et al., 2012), ELISA (Li et al., 2013) ou

encore en utilisant des capteurs potentiométriques (Shawish et al., 2013).

Dans ce sens, l’étude de (Dixit et al., 2011) révèle que la tartrazine est parmi les

colorants les plus utilisés en Inde et qu’elle est présente dans 570 échantillons, principalement

les confitures, les boissons et les bonbons. En Indonésie, les cinq aliments qui contiennent une

dose élevée de la tartrazine sont les nouilles instantanées, les boissons en poudre, gazeuses et

non gazeuses et les biscuits (Anisyah et al., 2011). De plus, selon une étude de (Sawaya et al.,

2008), la dose de la tartrazine dans certains aliments (chips, chocolat, bonbons, boissons,

jelly , chewing-gums) au Kuwait dépassent les doses autorisées en Australie, aux Etats-Unis

et même en Inde.

Vu le nombre croissant des études qui suggèrent le potentiel toxicologique de la

tartrazine, un contrôle strict de sa dose dans les aliments en forte consommation est une tâche

indispensable.

2.2.1.1.6. Toxicité de la tartrazine

2.2.1.1.6.1. Effet du E102 sur le système nerveux

La tartrazine est le colorant le plus fréquemment étudiée en termes d'intolérance

alimentaire, des changements de comportement et de l’hyperactivité chez les enfants (Ward,

1997). Les scientifiques ont découvert que la tartrazine augmentait l'excrétion urinaire de zinc

chez les enfants hyperactifs sachant que cet ion joue un rôle primordial dans le métabolisme

des neurotransmetteurs comme la dopamine ce qui suggère un lien entre la consommation de

la tartrazine et le trouble de déficit de l’attention/ hyperactivité (TDAH) (Ward et al., 1990;

Stevens et al., 2013).

Page 49: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

32

D’un autre coté, les résultats d'une étude réalisée dans le Royaume-Uni par des

chercheurs du l'Université de Southampton a révélé un lien entre la consommation de

colorants alimentaires synthétiques dont la tartrazine et/ou conservateurs et l’augmentation

des symptômes du TDAH chez les enfants de 3 ans et de 8/9 ans dans la population générale

(McCann et al., 2007). Il est aussi possible que ces colorants alimentaires synthétiques

puissent interagir avec des facteurs génétiques et agissent pour déclencher le désordre

(Kleinman et al., 2011). Suite à cette étude, la Food Standards Agency (FSA) a suggéré que

les parents d'enfants présentant des signes d'hyperactivité pourraient choisir d'éviter de donner

les colorants utilisés dans l'étude dont la tartrazine à leurs enfants (FSA, 2007) . Selon Kamel

and El-lethey (2011), la tartrazine peut induire des effets néfastes liés à l’anxiété et la

dépression chez le rat. En outre, plusieurs études ont trouvé que la tartrazine peut produire des

effets nocifs sur le système nerveux et les paramètres comportementaux (Tanaka, 2006;

Tanaka et al., 2008; Park et al., 2009).

Dans une étude menée par Goldenring et al. (1982), l'acide sulfanilique, le métabolite

majeur de la tartrazine a été administré à des rats post-nataux via une injection

intrapéritonéale pour examiner son impact sur le comportement. Les chercheurs ont observé

une hyperactivité et une altération des performances chez les rats ayant reçu l’acide

sulfanilique.

2.2.1.1.6.2. Effet du E102 sur le système immunitaire

La tartrazine est responsable de réactions allergiques comme l'urticaire, l'asthme, le

purpura et l'eczéma chez les individus allergiques à l'aspirine, le mécanisme immunologique

reste mal connu (Moutinho et al., 2007).

Dans son rapport, le comité de EFSA (2009), a déclaré que les données provenant

d'études animales et humaines n'ont pas démontré de manière convaincante que la tartrazine

est capable d'induire une réponse immunitaire (hypersensibilité) et les réactions indésirables

rapportés chez l'homme après une exposition à la tartrazine semblent être des réactions

d'intolérance. Toutefois, compte tenu des informations disponibles, le comité conclut que la

tartrazine peut induire des réactions d'intolérance chez une minorité de la population, même

au delà de la DJA.

Page 50: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

33

D’autre part, l’ingestion du E102 provoque une augmentation du nombre de

lymphocytes gastriques chez des rats (Moutinho et al., 2007) ainsi qu'un effet immuno

dépresseur sur la réponse immunitaire humorale chez des souris mâles (Guendouz et al.,

2013). Il a également été démontré que ce colorant pourrait avoir des effets délétères sur la

prolifération des lymphocytes, induisant la mort cellulaire et agissant sur l'ADN des

lymphocytes tout en causant une déficience de la réponse immunitaire (El Golli, 2016).

2.2.1.1.6.3. Effet du E102 sur le système reproductif

Les études qui ont visé l’effet de la tartrazine sur le système reproducteur présentent

aussi une contradiction. Les recherches de Tanaka (2006)et Tanaka et al. (2008) ne montrent

pas un effet adverse de la tartrazine sur la reproduction. A l’inverse, Mehedi et al. (2009), ont

montré que l'administration de la tartrazine diminue le nombre et la motilité des

spermatozoïdes et induit des anomalies du sperme et des dommages au niveau de la structure

du testicule. Cet effet a été confirmé par (Boussada et al., 2017) qui ont montré une

diminution du taux de la testostérone induite par la tartrazine ainsi qu’une réduction de la

densité des spermatozoïdes tout en provoquant des lésions testiculaires ce qui peut contribuer

à l’altération de la fertilité chez le rat.

La tartrazine semble être capable d’initier la mobilisation du zinc des testicules, un

élément essentiel pour la croissance et le fonctionnement normal des spermes

(spermatogenèse). En plus les animaux traités à la tartrazine montrent une architecture

défectueuse des tubes séminifères ce qui prouve l’impact négatif de ce colorant sur la fonction

reproductrice mâle (Visweswaran and Krishnamoorthy, 2012).

Une étude in vitro sur des cellules humaines issues du cancer du sein a montré que le

E102 peut agir comme un xénoestrogène en interagissant avec les récepteurs de l’œstrogène

ce qui favorise une perturbation endocrinienne (Axon et al., 2012).

2.2.1.1.6.4. Effet du E102 sur les tissus et les paramètres biochimiques

En ce qui concerne les paramètres biochimiques, plusieurs études ont mentionné

l’implication de la tartrazine dans l’altération de ces paramètres au niveau de plusieurs

organes. Amin et al. (2010) ont rapporté que le E102 provoque une augmentation significative

de l’activité de l’alanine-aminotransférase (ALT), l’aspartate-aminotransférase (AST) et de la

Page 51: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

34

phosphatase alcaline (ALP), ainsi que les taux de l'urée, de la créatinine totale et de la sérum

albumine chez des rats ayant reçu de la tartrazine aux doses 10 et 500 mg/kg/jour. De même,

El Golli (2016) a montré une augmentation significative des transaminases dans le plasma des

rats traités à la tartrazine à la dose de 300 mg/kg/jour. Dans une autre étude, et suite à

l’ingestion du E102 pendant 25 jours par des souris Swiss, les taux sériques de triglycérides,

de créatinine et de bilirubine étaient significativement augmentés, tandis que le taux de

cholestérol était diminué (Arefin et al., 2017). Cette altération des paramètres biochimiques

est aussi observée par Sharma et al. (2009), Himri et al. (2011), El-Wahab and Moram (2013),

Mehedi et al. (2013), Saxena and Sharma (2014) et Tawfek et al. (2015).

En effet, la tartrazine affecte les différents paramètres biochimiques, en particulier

ceux liés aux organes vitaux spécialement le foie et les reins ainsi que la modification du

profil lipidique. D’un autre coté, le changement du poids absolu et relatif des organes est un

signe de toxicité. La tartrazine est capable d'augmenter le poids du cœur et des rein des souris,

diminue le poids moyen du foie (Arefin et al., 2017), du thymus et de la rate (Guendouz et al.,

2013). En outre, l’administration du E102 provoque des lésions histologiques sévères au

niveau de plusieurs tissus comme le foie, les reins , les testicules, le cerveau, le thymus, la

rate, le jéjunum et l’estomac (Moutinho et al., 2007; Gao et al., 2011; Himri et al., 2011;

Guendouz et al., 2013; Ghonimi and Elbaz, 2015).

2.2.1.1.6.5. Génotoxicité du E102

Le débat sur l'effet génotoxique de la tartrazine est controversé. En utilisant le tests des

comètes (Comet assay), une technique capable de détecter une grande variété de dommages à

l'ADN et des lésions telles que la rupture de l'ADN simple brin, double brin ainsi que des

dommages au niveaux des bases nucléotidiques (Tice et al., 2000), Sasaki et al. (2002) ont

montré que le E102 consommé à des doses égales à la DJA induit des altérations d’ADN au

niveau du colon tandis que Hassan (2010) a observé le même effet au niveau du foie et les

reins chez les rats. En revanche, selon Poul et al. (2009), la tartrazine n’a pas provoqué des

effets génotoxiques lorsque elle a été administrée deux fois, à 24 heures d’intervalle, par

gavage oral aux souris. Ce colorant azoïque a également un potentiel toxique sur les

leucocytes en liant directement à l’ADN (Mpountoukas et al., 2010; Soares et al., 2015;

Khayyat et al., 2017).

Page 52: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

35

2.2.1.1.6.6. Cancérogénicité du E102

Plusieurs chercheurs se sont intéressés à l’étude du pouvoir cancérigène de la

tartrazine mais à l’heure actuelle aucune étude n’a montré un tel effet.Soares et al. (2015) ont

trouvé que le E102 provoque des dommages au niveau de l’ADN et que certains d’entre eux

étaient irréparables. Ceci suggère que l’utilisation de la tartrazine pendant une longue période

pourrait avoir un effet cancérigène puisque l’accumulation des erreurs successives d’ADN

peut affecter les gènes liés au contrôle du cycle cellulaire. Selon Raposa et al. (2016), le E102

peut contribuer de manière dose-dépendante à l'activation des voies inflammatoires ce qui

favorise le développement des cancers.

2.2.1.1.6.7. Le E102 et le stress oxydatif

Le stress oxydatif, parfois appelé stress oxydant, se définit comme étant un

déséquilibre de la balance oxydants-antioxydants en faveur des oxydants (Atamer et al.,

2008). Il se développe lorsque les radicaux libres, des molécules oxydantes, sont produits plus

rapidement qu'ils ne peuvent être neutralisés par l'organisme (Rioux, 2009). A l’état

physiologique, le métabolisme de l’oxygène dans les cellules entraine la production d’espèces

réactives de l’oxygène (ERO). Ces derniers participent dans plusieurs fonctions biologiques

(Nordberg and Arnér, 2001). Toutefois, en concentrations élevées, ils deviennent hautement

cytotoxiques en engendrant de sérieuses altérations aux cellules pouvant mener à la mort

cellulaire (Zou et al., 2008).

Plusieurs études ont corrélé la consommation de la tartrazine avec l’induction du stress

oxydatif. Les résultats de l’étude de El Golli (2016) a révélé un important déséquilibre entre

les marqueurs pro- et antioxydants au niveau du sang, reins, foie et la rate chez les rats ayant

reçus de la tartrazine pendant un mois. La tartrazine peut surproduire les ERO et augmenter le

stress oxydatif dans le foie et les reins (Amin et al., 2010; Himri et al., 2011) au niveau de

l’appareil reproducteur mâle (Visweswaran and Krishnamoorthy, 2012; Boussada et al., 2017)

ainsi que le cerveau (Gao et al., 2011).

2.2.1.1.6.8. Effet du E102 sur le système digestif

Même si de nombreuses études ont été menées pour étudier les effets toxiques de la

tartrazine sur la santé, peu d'entre elles ciblent le système digestif. Selon ces études, la

Page 53: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

36

tartrazine peut induire des dommages de l'ADN dans l'estomac et le côlon ainsi que des

modifications dégénératives de la muqueuse gastrique (Sasaki et al., 2002; Ghonimi and

Elbaz, 2015). En Outre, une étude in vitro a révélé que la tartrazine interagit avec des acides

aminés composant la trypsine -une enzyme cruciale dans la digestion- ce qui provoque

l’inhibition de son activité enzymatique (Wang et al., 2012).

Page 54: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

37

3. Matériel et méthodes

3.1. Effet de la tartrazine sur les activités enzymatiques digestives in vivo et in

vitro

3.1.1. Produits et réactifs

Les produits utilisés dans cette partie sont répertoriés dans le tableau 5. Ce tableau

spécifie également la provenance de chacun des produits. En ce qui concerne les appareils de

laboratoire et les logiciels, leur provenance est spécifiée directement dans le texte de

description des méthodes.

3.1.2. Etude in vivo

L’objectif de cette partie est de mesurer l’activité enzymatique des protéases (trypsine

et chymotrypsine), l’amylase et la lipase chez les souris Swiss après une ingestion

subchronique de la tartrazine pour évaluer la toxicité de ce colorant.

3.1.2.1. Modèle animal et conditions d’élevage

Nos expériences sont menées sur des souris Swiss. Ces animaux constitués de deux

sexes ont été acquis auprès de l’Institut Pasteur d’Alger (IPA). Les souris sont mises en

reproduction et élevées dans l’animalerie du Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et de

la Sécurité Alimentaire (LPNSA) dans des conditions environnementales contrôlées. La

température est ajustée autour de 20°C. Les souris sont nourries avec une nourriture standard,

correspondant à un aliment pour rongeurs commercialisé par l’ONAB.

3.1.2.2. Protocole expérimental

L’étude porte sur 60 souris de souche Swiss (30 mâles et 30 femelles), âgées de 4

semaines ayant un poids de 14,71±0,11g. Les souris ont été réparties en trois groupes

expérimentaux, comprenant chacun 10 mâles et 10 femelles. Le premier groupe est celui des

témoins. Ses sujets reçoivent de l’eau du robinet sans colorant. Les deux autres groupes ont

reçu de la tartrazine diluée dans l'eau respectivement à 0,005% (faible dose) et à 0,05% (forte

dose).

Page 55: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

38

Les animaux sont placés à raison de dix sujets par cage avec libre accès à l’eau de

boisson (avec ou sans tartrazine) et à la nourriture pendant 13 semaines. Une mesure

quotidienne de la consommation d’aliment (g) et de l’absorption de la solution de tartrazine a

été effectuée en plus d’une pesée hebdomadaire du poids corporel des souris de chaque

groupe et ce afin de suivre leur évolution pondérale.

3.1.2.3. Obtention des échantillons

Au bout des 13 semaines d’expérience, les souris ont été sacrifiées par dislocation

cervicale. Le pancréas de chaque animal a été rapidement excisé, pesé, homogénéisé à l’aide

d’un Potter (avec un piston en téflon) dans une solution de Ringer (contenant en mmol/l :

Na+ : 140, K+ : 5.2, Ca++ :1.2, Cl- :120,HCO-3 : 25,HPO4

- :0.4) et conservé à -20 ºC sous forme

d’aliquotes jusqu'à utilisation. Le pancréas est homogénéisé dans un rapport de 25 mg par ml.

Toutes les opérations sont effectuées à 0°C pour bloquer les activités enzymatiques.

3.1.2.4. Dosage des protéines totales selon la méthode de Lowry et al. (1951)

Cette méthode est basée à la fois sur la réaction de Biuret, dans laquelle les liaisons

peptidiques des protéines réagissent avec le cuivre dans des conditions alcalines pour produire

Cu + et sur la réaction de Folin-Ciocalteu dont le réactif Folin à base de phosphomolybdate et

de phosphotungstate est réduit en bleu hétéropolymolybdène par le complexe cuivre-protéine.

Cette couleur bleue dépend de la teneur en tyrosines et en tryptophanes (Lowry et al., 1951).

Le dosage des protéines totales se fait sur les homogénats des pancréas des souris

témoins et des souris traitées. La lecture se fait au spectrophotomètre (Tecan Group Ltd,

Suisse) par mesure de l’absorbance à la longueur d’onde λ=750 nm. La concentration en

protéines est mesurée par comparaison à une courbe étalon établie avec la sérum albumine

bovine (SAB).

3.1.2.5. Détermination de l’activité enzymatique de la trypsine et la chymotrypsine

La trypsine et la chymotrypsine sont des endopepetidases sécrétées par le pancréas

sous forme de zymogènes et elles sont actives en pH alcalin. Tandis que la trypsine hydrolyse

les liens peptidiques au niveau de la lysine et de l'arginine, la chymotrypsine clive

Page 56: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

39

Tableau 5. Liste des produits utilisés : Etude in vivo et in vitro

Produits Fabricant

Tartrazine

SAB

Chem (Inde)

Sigma-Aldrich (Espagne)

BAPNA Sigma-Aldrich (France)

BTEE Sigma-Aldrich (France)

Amidon soluble

BALB

Scharlau (Espagne)

Sigma-Aldrich (Espagne)

Pancréatine

Lécithine

Sels biliaires

Sigma-Aldrich (Espagne)

Sigma-Aldrich (Espagne)

Sigma-Aldrich (Espagne)

Page 57: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

40

sélectivement les liaisons peptidiques formées par les résidus aromatiques (tyrosine,

phénylalanine et tryptophane) (Hedstrom, 2002). L’activité de la trypsine est mesurée par

l’hydrolyse du substrat L.Benzoyl- Arginine p-nitroAniline (BAPNA) 1 mM dans un tampon

Tris (50 mM trizma, 20 mM CaCl2, pH 8.2) (Faulk et al., 2007). L’hydrolyse du BAPNA

libère la para-nitroaniline jaune. Ce produit de la réaction a un maximum d’absorption pour

=410 nm. Brièvement, 20 µl de chaque échantillon d'homogénat pancréatique sont mis dans

un puits d'une microplaque à 96 puits. Ensuite, 100 µl du tampon Tris contenant la BAPNA

ont été ajoutés rapidement à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux. La plaque est

incubé durant 30 minutes à 37 ºC. La production de p-nitroaniline est mesurée à 410 nm en

utilisant un lecteur de plaques (Tecan Group Ltd, Suisse).

L’activité de la trypsine est présentée en unités sachant que 1 unité correspond à la

production de 1 µmol de p-nitroaniline par minute. Pour cela une courbe étalon établie avec la

p-nitroaniline a été utilisée. Pour le dosage de la chymotrypsine, un volume de 1,5 ml de

tampon Tris (80 mM, pH 7,8) contenant 100 mM de CaCl2 est mélangé avec 1,4 ml de

solution BTEE (1,07 mM). Par la suite, 50 µl d'homogénat pancréatique de chaque

échantillon sont ajoutés au réactif réactionnel (Rick, 1976). L’absorbance du mélange a été

déterminée à 256 nm pendant 20 minutes d’incubation à 37 ºC en utilisant un

spectrophotomètre (Evolution 600 Thermoscientific, UK).

L’activité de la chymotrypsine est calculée selon l’équation suivante :

U=106[(∆𝐴256)×(∆t)-1]×(ɛl)-1(Vt×Vs) où :

• U est la quantité d'enzyme qui catalyse l’hydrolyse de 1 µmole de BTEE par minute

• ∆𝐴256 représente l’augmentation de l’absorbance par minute obtenue à partir du taux

linéaire maximum et dépendant de ∆t qui représente le changement dans le temps

• ɛ est le coefficient d'extinction molaire de la BTEE à 256 nm (= à 964 (L/(mol × cm)

• l est le chemin optique de la cuve (=1 cm)

• Vt est le volume total utilisé

• Vs est le volume de l’échantillon

• 106 est un facteur de correction.

Page 58: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

41

3.1.2.6. Détermination de l’activité enzymatique de la lipase

L'activité lipasique a été déterminée selon la méthode BALB-DTNB (Furukawa et al.,

1982). L’homogénat pancréatique (50 µl) a été mélangé avec 1 ml d’acide 5,5′-dithiobis 2-

nitrobenzoique (DTNB) 0,3 mM et 20 µl de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF). Le

mélange a été incubé à 37 °C pendant 5 minutes. Ensuite, 100 µl d'une solution de BALB (20

mM dimercaproltributyrate et 20 mM de dodécylsulfate de sodium SDS dans l'éthanol) sont

ajoutés et incubés à 37 °C pendant 30 minutes. La réaction est arrêtée en ajoutant 2 ml

d'acétone.

Concomitamment, un échantillon zéro de chaque essai a été préparé comme décrit ci-

dessus mais sans addition de substrat. Les valeurs de l'absorbance à 412 nm ont été

enregistrées à l’aide d’un spectrophotomètre (Evolution 600 Thermoscientific, UK). Une

unité BALB de lipase est définie comme l'activité enzymatique donnant une différence

d'absorbance de 0,001 à 412 nm lorsque 50 µL d'échantillon sont dosés selon les conditions

précédentes. L'activité enzymatique a été exprimée en unités internationales (IUB) comme

décrit par Furukawa et al. (1982).

3.1.2.7. Détermination de l’activité enzymatique de l’amylase

L'activité amylasique est déterminée en se basant sur la libération de maltose à partir

d'amidon soluble selon la méthode de Silva et al. (2001) légèrement modifiée. L'homogénat

de pancréas a été décongelé à température ambiante juste avant la détermination de l'activité

enzymatique. Brièvement, 25 µl d'homogénat pancréatique sont mélangés avec 25 µl de

substrat (1% d'amidon soluble dans un tampon de sodium 20 mM pH = 6,9 contenant 0,6 mM

de NaCl).

Le test est suivi par l'addition de 200 µl de l'acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS). La

solution a été incubée à 100 °C pendant 10 minutes. Après refroidissement, 1 ml d'eau

distillée est ajouté. L’absorbance est lue à 550 nm. Une unité d'enzyme correspond à la

quantité d'enzyme qui produit 1 µmol d'équivalent de maltose par minute. Pour cela une

courbe étalon avec des quantités de maltose connues est établie.

Pour tous les dosages, un blanc approprié est utilisé et toutes les activités

enzymatiques sont exprimées en unité par g de pancréas par min.

Page 59: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

42

3.1.3. Etude in vitro

Dans cette partie, l’activité enzymatique de la trypsine et la chymotrypsine a été

mesurée après l’utilisation d’un model de digestion qui imite l’appareil digestif pour mettre en

évidence la relation entre la toxicité probable de la tartrazine et la nature des aliments ingérés.

3.1.3.1. Protocole expérimental

Du riz, du beurre et du lait dégraissé ont été acquis auprès d’un supermarché local. Ces

aliments ont été digérés in vitro sans tartrazine (contrôle), et avec 7,5 mg ou 75 mg de

tartrazine selon la méthode de (Martin et al., 2010). Brièvement, les échantillons alimentaires

(500 mg) avec / sans tartrazine ont été mélangés dans un mortier pendant 2 min à 5 ml de

salive humaine obtenue de chez un volontaire, et à 5 ml d'eau du robinet, simulant le

processus de mastication.

Ensuite, la digestion au niveau de l'estomac a été simulée en ajoutant de l'eau acidifiée

(pH = 2) contenant 0,275 g de pepsine. La solution a été transférée ensuite dans un récipient

thermostaté à 37 ° C (Titrino plus Metrohm 877, Suisse).

Après une heure, la digestion intestinale a été simulée par addition de 5 mM CaCl2,

150 mM de NaCl et 6 ml d'une solution pancréatique (pancréatine (20 mg, 4 × USP), extrait

de bile (633 mg) et phosphatidylcholine (228 mg) dans un tampon de trizma-maléate 50 mM

pH 7,5). Le pH a été ajusté et maintenu à 7,5 avec du 0,5 M NaOH. Au bout de deux heures,

des aliquotes de la suspension de digestion ont été recueillis et stockés à -20 ° C jusqu'à

utilisation.

Les activités enzymatiques de la trypsine et de la chymotrypsine ont été déterminées

en utilisant les méthodes décrites ci-dessus pour les homogénats pancréatiques. Les digestions

ont été réalisées en double.

3.2. Effet de la tartrazine et de son métabolite sur le pancréas exocrine : Etude ex vivo

3.2.1. Produits et réactifs

Les produits et réactifs ainsi que la lignée cellulaire utilisés sont indiqués dans le tableau 6.

Page 60: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

43

3.2.2. Protocole expérimental

Des cellules acinaires isolées à partir du pancréas des souris Swiss et des cellules

AR42J commercialisées ont été utilisées dans cette partie.

3.2.2.1. Mesure microfluorimétrique du calcium libre intracellulaire par

l’imagerie en temps réel « Real time imaging »

L’objectif de cette partie est d’évaluer l’effet de la tartrazine et de l’acide sulfanilique

(AS) sur l’homéostasie calcique sachant que cet ion représente un second messager universel

impliqué dans de nombreuses fonctions cellulaires (Berridge et al., 2003; Petersen, 2005).

Pour cela, une technique de Real imaging a été utilisée.

Les animaux utilisés (souris Swiss agées de 6 semaines) ont été fournis par

l’animalerie de l'Université d'Estrémadure (Cáceres, Espagne). Ils sont manipulés

humainement et sacrifiés conformément au comité de bioéthique institutionnel.

Les cellules acinaires ont été isolées à partir du pancréas selon la méthode de

(Williams, 2010). Brièvement le pancréas est prélevé, lavé avec une solution Na-HEPES

d’isolement, une solution physiologique contenant en mM : 130 NaCl, 4,7 KCl, 1,3 CaCl2, 1

MgCl2, 1,2 KH2PO4, 10 glucose, 10 HEPES, 0,2% (p / v) de SAB et 0,01 % de inhibiteur de

la trypsine (pH = 7,4 ajusté avec 1M de NaOH).

Ensuite, 0,5 ml de solution de collagénase (100 unités dans 0,5 ml de Na-Hepes) est injecté

dans le pancréas pour la dissocier et une incubation de 10 minutes à 37 ºC dans un bain marie

avec agitation a été effectuée. A la fin de l’incubation, le tissu pancréatique est délicatement

coupé en petits morceaux avec un ciseau et le mélange est centrifugé 30xg pendant 5 minutes

à 4 ºC. Le surnageant qui contient la collagénase est éliminé et le tissu pancréatique est

mélangé avec le Na-HEPES d’isolement et pipeté plusieurs fois jusqu'à l’obtention d’un

liquide turbide de préférence ne contenant pas de grands morceaux. En cas ou ces derniers

persistent, la suspension cellulaire est filtrée sur un tamis.

La suspension est centrifugée une autre fois et le culot est mis en suspension dans le

Na-HEPES d’isolement. Des cellules acinaires isolées ainsi que des acini sont obtenus. Elles

sont incubées avec une sonde fluorescente possédant une affinité pour le calcium : (Fura-2)

Page 61: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

44

Tableau 6. Liste des produits utilisés : Etude ex vivo

Produits Fabricant

AR42J

BAPNA

BAPTA

SAB

CCK-8

Tampon de lyse cellulaire

Dexaméthasone

Entérokinase

EGTA

FCCP

TMRM

Acidesulfanilique

Trypsine

Thapsigargine

Inhibiteur de protéase

Fura-2

MitoSOXTMRed

CM-H2DCFDA

Trypsine-EDTA

RPMI

FBS

Pénicilline/Streptomycine

L-Glutamine

Tampon Tris/glycine/SDS (10x)

Tampon Tris/glycine (10x)

Anticorps anti-alfa actine

Anticorps anti SOD2

Tampon de lyse cellulaire

Réactif de BRADFORD

STAB-UEX (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Life Technologies (Invitrogen, Espagne)

Life Technologies (Invitrogen, Espagne)

Life Technologies (Invitrogen, Espagne)

Life Technologies (Invitrogen, Espagne)

HyClone (Fisher Scientific Inc., Espagne)

HyClone (Fisher Scientific Inc., Espagne)

BioWhittaker (Lonza, Basel, Suisse)

BioWhittaker (Lonza, Basel, Suisse)

Bio-Rad (Espagne)

Bio-Rad (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Santa Cruz Biotechnology (Espagne)

Sigma Chemicals Co. (Espagne)

Bio-Rad (Espagne)

Page 62: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

45

sous sa forme ester acétoxyméthylique (Fura-2 AM) à une concentration de 4 µM pendant 40

minutes à 37 ºC et à l’abri de la lumière.

La sonde diffuse à travers la membrane cellulaire et elle est clivée par les estérases

intracellulaires pour générer ensuite la sonde fluorescente. Ensuite, pour éliminer les sondes

restantes à l’extérieur des cellules, une centrifugation pendant 5 minutes à 30 xg a été

effectuée. Le culot est mis en suspension dans un tampon Na-HEPES fraiche dont la

composition en mM est la suivante 140 NaCl, 4,7 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 Hepes, 10

glucose, pH à 7,3, ajusté avec une solution de NaOH (1M).

100 µl de la suspension cellulaire sont déposés sur une lamelle introduite dans une

chambre de perfusion conçue à cet effet. Les variations de la concentration de calcium

intracellulaire ([Ca2+]i) induits par les différentes doses de la tartrazine (0,1mM, 1mM, 5mM,

10 mM) ou de l’acide sulfanilique (AS) (1 µM, 10 µM, 100 µM, 1 mM ) ou encore par la

CCK (control positif) sont mesurés par la technique de Real imaging. Cette technique permet

de quantifier la fluorescence en utilisant un microscope inverse de fluorescence (modèle

Diaphot 200 de NIKON) muni d’un système d’acquisition et d’analyse des images

(Hamamatsu Photonics).

Le Fura-2/AM est excité à deux longueurs d’onde suivantes : 340 nm et 380 nm avec

la lumière ultraviolette d’un monochromateur (Polychrome IV, Photonics) et émets la

fluorescence à 505 nm. Les résultats sont exprimés par le rapport des valeurs de la

fluorescence émise aux deux longueurs d’onde d’excitation.

3.2.2.2. Détermination des changements de [Ca+2] libre sur les cellules AR42J

Les cellules AR42J dérivent initialement d'une tumeur transplantable d'un pancréas de

rat. Elles sont utilisées comme un modèle in vitro pour l’étude du pancréas exocrine grâce à

leurs caractéristiques comme la signalisation calcique et la sécrétion des enzymes digestives

(Christophe, 1994). Dans cette partie du travail, les cellules AR42J ont été cultivées selon la

technique de Gonzalez et al. (2011).

Les cellules ont été maintenues dans un milieu RPMI 1640 supplémenté de 10% de

sérum de veau fœtal (SVF), 2 mM de la L-Glutamine et une association d’anticorps (0,1

Page 63: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

46

mg/ml de streptomycine et 100 UI de pénicilline). Elles sont placées dans un incubateur

thermostaté à 37°C ayant une atmosphère humidifié et contenant 5% de CO2.

Entre chaque renouvellement du milieu de culture ou avant d’être décollées de leur

support, les cellules sont rincées avec le tampon phosphate salin (PBS de l'anglais phosphate

buffered saline) contenant 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HP04, 2 mM KH2P04; le

pH est ajusté à 7,4 avec du NaOH 1 M. Lorsque les cellules sont confluentes à 75 à 80 %,

elles sont ensemencées. Afin de faciliter le décollement des cellules de leur support (boites de

pétri), les cellules sont mises en contact pendant deux minutes avec une solution de trypsine-

EDTA. Puis, une centrifugation de 30xg pendant 5 minutes a été effectuée.

Le culot de cellules est repris dans le milieu de culture RPMI 1640 afin de prélever les

cellules en suspension et de nouvelles boites sont préparées. Quarante-huit heures avant

l'utilisation, les cellules sont incubées dans un milieu de culture additionné de 100 nM de

dexaméthasone pour maintenir un phénotype acinaire.

Ensuite, pour Déterminer les changements de [Ca+2] libre, les cellules AR42J ont été

détachées, remises en suspension dans la solution Na-HEPES d’isolement et chargées pendant

40 minutes à température ambiante (23 à 25 ºC ) avec la même sonde fluorescente le Fura-

2/AM utilisé dans la technique de l’imagerie en temps réel.

Les changements des signaux de fluorescence ont été surveillés en plaçant une

aliquote de 2 ml de cellules AR42J dans une cuvette de quartz dans un spectrofluorimètre

(RF-5001-PC; Shimadzu,Kyoto, Japon) relié à un bain marie pour maintenir les cellules à

37°C. Un barreau magnétique a permis d’effectuer une agitation tout au long de

l’enregistrement. Tous les stimuli (control négatif, control positif et les différentes

concentrations d’AS) ont été ajoutés directement aux cellules dans la cuve pour achever la

concentration requise. Les changements de la concentration du calcium intracellulaire

([Ca]i+2) ont été exprimés en ∆Ratio, calculé comme la différence entre les pics du rapport

F340/F380. Les expériences sont réalisées en employant différents lots de cellules.

Page 64: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

47

3.2.2.3. Détermination de l’oxydation

3.2.2.3.1. Détermination de la libération des ERO par spectrofluorimétrie

Dans cette partie les deux types cellulaires ont été utilisés : les cellules acinaires et les

AR42J. Le statut redox des cellules a été déterminé en utilisant deux indicateurs du stress

oxydatif : CM-H2DCFDA et MitoSOXTMRed. La fluorescence a été mesurée selon la

technique de Gonzalez and Salido (2016).

Pour les cellules acinaires isolées à partir du pancréas des souris Swiss, les expériences

ont été réalisées en utilisant les deux indicateurs. Le Diacétate de 5-(et-6) -chlorométhyl-2’,

7’dichlorodihydrofluorescéine (CM-H2DCFDA), un dérivé de H2DCFDA. Ce dernier pénètre

dans la cellule ou il sera transformé par des estérases cellulaires en 2’, 7’-

dichlorodihydrofluorescéine (H2DCF). Les ERO intracellulaires peuvent alors oxyder le

H2DCF (non fluorescent) et le convertir en DCF, qui émet une fluorescence (Ubezio and

Civoli, 1994). Les cellules acinaires sont alors incubées avec le CM-H2DCFDA (10 μM)

pendant 40 min à température ambiante (23-25 ºC).

D’un autre coté, les cellules AR42J détachées et mises en suspension dans le Na-

HEPES ainsi que le reste des cellules acinaires sont incubées avec le MitoSOXTMRed (2,5 μM

) pendant 15 minutes à 37ºC. Cet indicateur est un dérivé cationique du dihydroéthidium,

conçu pour la détection hautement sélective du superoxyde dans les mitochondries des

cellules vivantes. Après le chargement de la sonde, les cellules ont été centrifugées (30 xg),

remises en suspension dans du tampon Na-HEPES frais et utilisées immédiatement.

100 µl de la suspension des cellules acinaires ou AR42J préalablement incubées avec

CM-H2DCFDA ou MitoSOXTMRed sont mises sur un puits d’une plaque ELISA. Ensuite les

différentes concentrations de AS sont ajoutées selon un ordre décroissant (1 mM, 100 µM, 10

µM, 1 µM). Des cellules non traitées avec AS ont été utilisées comme témoin négatif alors

que le contrôle positif s’agit des cellules incubées avec le CCK-8 (1nM) ou le H2O2 sans

cellules à une concentration de 10 µM.

La fluorescence cellulaire pour le CM-H2DCFDA a été déterminée à 530 nm / 590 nm

(excitation/émission). Par ailleurs, l'oxydation de MitoSOXTMRed liée à l'état redox des

cellules était déterminée en mesurant la fluorescence cellulaire à 510 nm / 580 nm (excitation

Page 65: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

48

/émission) en utilisant un spectrofluorimètre ELISA (TecanInfinite M200,Grödig, Autriche)

(Santofimia-Castaño et al., 2015).

En parallèle, le même protocole a été utilisé en absence de calcium extracellulaire et

en présence de l’acide 1,2-bis (o-aminophénoxy) éthane-.N,N,N',N'-tétraacétique (BAPTA)

qui est un chélateur de calcium intracellulaire. Dans ces expériences nous avons utilisé un

tampon Na-HEPES dépourvu de calcium dont la composition est identique à celle du tampon

riche en calcium sauf que le CaCl2 est remplacé par EGTA à 0,5mM.

Les données montrant l'augmentation moyenne de la fluorescence sont exprimées en

pourcentage ± ES. (n) par rapport aux cellules témoins (non stimulées), où n est le nombre

d'expériences indépendantes.

3.2.2.3.2. Visualisation des ERO par microscopie à fluorescence

Afin d'obtenir des images de fluorescence des cellules traitées par le MitoSOXTMRed,

des lamelles contenant des cellules AR42J ont été montées sur une chambre de perfusion

expérimentale et ont été continuellement perfusées avec un tampon HEPES frais. Les stimuli

sont préparés dans ce même tampon et ajoutés directement aux cellules dans la chambre de

perfusion. Les cellules ont été excitées avec la lumière d'une lampe à arc au xénon passée à

travers un monochromateur à grande vitesse (Polychrome IV, Photonics, Hamamatsu, Japon)

à 510 nm. L'émission de la fluorescence (580 nm) a été détectée à l'aide d'une Caméra CMOS

numérique ORCA-flash 4.0 V2 (Hamamatsu Photonics-France, Barcelone, Espagne) et

enregistrée à l'aide du logiciel HCImage (Hamamatsu Corp., Sewickley, PA, États-Unis).

3.2.2.3.3. Détermination des taux de Glutathion

Le glutathion (GSH) est un antioxydant important produit par la plupart des

organismes vivants. Il contrôle le niveau du stress oxydant en agissant à la fois comme

piégeur des ERO et comme cofacteur nécessaire pour l’activité des enzymes antioxydantes

(Nassour, 2015). Lors de l'oxydation, le GSH est transformé en disulfure de glutathion

(GSSG). Les concentrations de GSH et de GSSG sont des indicateurs de la fonctionnalité

cellulaire et du stress oxydatif (Monostori et al., 2009).

Page 66: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

49

Les taux réduits (GSH) et oxydés (GSSG) de glutathion au niveau des cellules AR42J

ont été déterminés en utilisant la méthode de Hissin and Hilf (1976). Après l'application des

stimuli, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, détachées et remises en suspension

avec 1 ml de tampon Tris-HCl 25 mM (pH = 7,6) contenant 1% (p/v) de Triton X-100 et

transférées dans des eppendorfs. Les échantillons étaient placés sur de la glace, soniqués

pendant 10 min et maintenus à -20 ºC pendant 5 min.

Par la suite, les échantillons ont été centrifugés (9 000 ×g, à 4 ºC pendant 30 min), et

les surnageants ont été collectés et placés dans des flacons indépendants. La concentration

totale des protéines dans chaque échantillon a été déterminée selon la méthode de Bradford

(1976), en utilisant la courbe de la SAB. Ensuite, les protéines du surnageant ont été

précipitées par addition de 20% d'acide trichloracétique froid. Les flacons ont ensuite été

centrifugés (10 000 ×g pendant 10 min à 4 ° C) et conservé à -80 °C jusqu’à l’utilisation.

Au moment d’utilisation, les échantillons (50 μL) ont été incubés avec 1 mg / ml du

réactif fluorescent orthophtalaldéhyde (OPT) dans un tampon basique (pH 8,0) contenant du

Na-phosphate (0,1 M) et EDTA (5 mM). Avant la détermination du GSSG, le N-

éthylmaléimide (40 mM) et la NaOH (1 M, volume pour atteindre pH 12) ont été ajoutés. Le

mélange réactionnel était incubé pendant 45 min à 20 °C.

Ensuite, 200 μL du mélange réactionnel ont été transférés dans les puits dans une

plaque noire à 96 puits. La présence de GSH ou GSSG est déterminé en mesurant la

fluorescence à 350 nm / 420 nm (excitation / émission) en utilisant un spectrofluorimètre. Des

Courbes standard de GSH (3,20-320 μmol / ml) et GSSG (2,5-80 μmol / ml) ont été utilisés

pour la quantification. Pour la normalisation, la teneur en protéines de chaque échantillon a

été utilisée. Les dosages ont été effectués en triplicats. Un milieu réactionnel sans extrait

cellulaire a été utilisé comme un témoin (blanc).

Les valeurs de GSH et GSSG (μmol / mg de protéines) ont été déterminées et le

rapport GSH / GSSG a été calculé. Les données sont présentées comme l'augmentation

moyenne du ratio GSH / GSSG exprimé en pourcentage ± ES (n) par rapport aux cellules

témoins (non stimulées), où n est le nombre d'expériences indépendantes.

Page 67: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

50

3.2.2.3.4. Étude de la superoxyde dismutase mitochondriale par Western blot

Le Western Blot (aussi appelé immunotransfert) est une technique employée pour

analyser des protéines individuelles dans un mélange protéique (par ex. un lysat de cellules).

La technique repose sur trois éléments : la séparation des protéines, leurs transfert et la

révélation en utilisant des anticorps (Mahmood and Yang, 2012).

Dans le cadre du Western blot, le mélange protéique est soumis à une électrophorèse

sur gel dans une matrice porteuse afin de trier les protéines par taille, charge, ou toute autre

différence au sein des bandes individuelles de protéines. Les bandes de protéines séparées

sont ensuite transférées vers une membrane porteuse. Les protéines de cet immunotransfert

peuvent ensuite être utilisées pour être liées à l'anticorps en vue de leurs détermination (C.,

2012).

Le stress oxydatif induit souvent la production des ERO. Parmi ces derniers le radical

superoxyde O2- et le peroxyde d’hydrogène H2O2. La réduction de O2

- en H2O2 se fait par les

superoxydes dismutases (SOD) (Nojima et al., 2015) qui sont des métallo-enzymes se

retrouvant dans l’ensemble du monde du vivant, mis à part dans quelques microorganismes

(Alscher et al., 2002).

Il existe chez l’homme deux SOD qui se distinguent par leur localisation

intracellulaire ainsi que par le cofacteur métallique qu’elles utilisent : la Cu/Zn-SOD (SOD1),

présente dans le cytosol est associée aux ions cuivre et zinc et la MnSOD (SOD2) présente

dans les mitochondries est associée au manganèse (Nassour, 2015). Dans le contexte de

l’étude, l’effet de AS sur le SOD2 mitochondrial a été étudié.

Les cellules AR42J ont été incubées avec les différentes concentrations d’AS pendant

une heure. Par la suite, elles ont été détachées, centrifugées à 1400 xg, lavées avec le PBS et

soniquées dans un tampon de lyse cellulaire contenant 1% d’inhibiteur de protéase et 0,25 %

d’orthovanadate de sodium.

Les protéines des échantillons ont été quantifiées par la méthode de Bradford (1976).

Les protéines dénaturées par la température (70 °C pendant 10 minutes) (20 μg) sont séparées

par SDS-PAGE (10%) et transférées sur des membranes à difluorure de polyvinylidène

Page 68: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

51

(PVDF), et une immunodétection est effectuée en utilisant des anticorps anti-superoxydes

dismutases (SOD2) et anti-Actine.

Les résultats sont exprimés en pourcentage d'expression protéique ± ES (n) comparé à

celui détecté dans les cellules témoins (non stimulées), où n est le nombre d'expériences

indépendantes. Les expériences ont été réalisées en utilisant différents lots de cellules.

3.2.2.4. Effet de l'acide sulfanilique sur la trypsine

Selon les résultats de l’étude in vivo sur les souris Swiss, la tartrazine semble diminuer

l’activité enzymatique de la trypsine et la chymotrypsine. L’objectif ici est de déterminer la

voie par laquelle le E102 peut exercer son effet nocif. La sécrétion de la trypsine a été

mesurée selon une méthode colorimétrique (Tapia et al., 1997).

Des cellules AR42J ont été ensemencées sur une plaque de 24 puits à une densité de

40.000 cellules par puits et sont laissées à croître pendant 72 heures, incubées 48 heures en

présence de dexaméthasone et ensuite elles sont incubées pendant 45 min à 37 ºC avec les

différents stimuli testés en présence de différentes concentrations de CCK.

A la fin de l’incubation, 150 µl de surnageant de chaque puits sont incubés avec 50µl

d’une solution d’entérokinase (4U/ml) et BAPNA (1mg/ml). Le mélange est incubé à 37 ºC

pendant 10 minutes.

La libération de 4-nitroaniline à partir de la BAPNA, liée à la sécrétion de

trypsinogène transformé en trypsine par l’entérokinase, a été surveillée en mesurant

l'absorbance à 405 nm en utilisant un spectrofluorimètre (TecanInfinite M200, Grödig,

Austria). Chaque détermination était effectuée en double. Pour mesurer l’activité de la

trypsine, une gamme étalon avec des concentrations connues de la trypsine est utilisée. Les

résultats sont exprimés en unités de trypsine (UT) sécrétées par les cellules ± ES (n), où n est

le nombre de préparations indépendantes.

3.2.2.5. Détermination du potentiel membranaire mitochondrial

Pour faciliter le transport des métabolites au sein de la membrane interne, la

mitochondrie utilise un gradient électrochimique. Ce gradient appelé potentiel membranaire

Page 69: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

MATERIEL ET METHODES

52

mitochondrial (∆ψm) est basé sur un gradient de proton, qui va charger négativement la

matrice mitochondriale et positivement la chambre externe (Lamy, 2009). Il a été suggéré que

le stress oxydatif induit une diminution du ψm (Satoh et al., 1997). C’est pour ceci que ce

potentiel a été mesuré au niveau des cellules AR42J pour évaluer le lien entre le métabolite de

la tartrazine, le stress oxydatif et ce ψm.

A cette fin, le colorant fluorescent tétraméthylrhodamine ester méthylique (TMRM) a

été utilisé selon la technique de González et al. (2003). Les cellules ARJ42 ont été incubées

pendant 30 minutes en présence du TMRM 50 nm à 37 ºC. Ensuite, les cellules ont été

centrifugées (30 ×g), remises en suspension dans le tampon HEPES frais et utilisées

immédiatement. Sur une plaque ELISA, les cellules ont été incubées pendant 15 min en

présence d’AS (1 mM, 100 μM, 10 μM ou 1 μM).

En tant que contrôle positif, différents lots de cellules étaient incubé en présence du

carbonilcyanure p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP) : un agent découplant

mitochondrial. Ce dernier va considérablement dépolariser le ψm. Cette dépolarisation est

reflétée par une diminution de l’intensité de la fluorescence lié au TMRM par rapport à

l'intensité de fluorescence de base (Joshi and Bakowska, 2011).

Les changements de ψm ont été déterminés en mesurant la fluorescence à 543 nm /

605 nm (excitation / émission) en utilisant le même spectrofluorimètre. Les résultats sont

exprimés en pourcentage ± ES (n) par rapport aux cellules témoins (non stimulées)

représentant l’augmentation de la fluorescence où n est le nombre d'expériences

indépendantes.

3.3. Etude statistique

L'analyse statistique des données a été faite à l'aide du logiciel GraphPad Prism

version 5.01 pour Windows (Logiciel GraphPad, San Diego, CA, USA). Les données sont

présentées en moyenne ± ES. Une analyse statistique de variance à sens unique (ANOVA)

suivie d'un test de Tuckey pour l’étude in vivo et in vitro et le test t de student pour l’étude ex

vivo ont été appliquées. Les différences ont été considérées comme statistiquement

significatives à p< 0,05.

Page 70: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

53

4. Résultats

4.1. Effet de la tartrazine sur le gain de poids corporel et la teneur en protéines

Le tableau 7 représente l’effet de la tartrazine sur le gain du poids corporel et la teneur

en protéines totales chez les souris femelles et mâles consommant ce colorant à des doses de

0,005 et 0,05 % en comparaison avec les témoins durant les 13 semaines d’expérimentation.

Aucun effet indésirable sur le gain du poids corporel n'a été observé, bien que ce gain

soit légèrement diminué chez les deux groupes ayant reçu la tartrazine par rapport au groupe

témoin. Néanmoins, les différences ne sont pas statistiquement significatives. Pour la teneur

en protéines totales, aucune différence significative n’est constatée chez les groupes traités

comparés aux témoins.

4.2. Effet de la tartrazine sur la consommation de l’aliment et de l’eau

Le tableau 8 représente le volume de la solution de la tartrazine et la quantité de

l’aliment consommés par les trois groupes expérimentaux durant les 13 semaines

d’expérience. La consommation de l’aliment et du liquide n'était pas significativement

différente chez tous les groupes traités par rapport aux témoins.

4.3. Impact de la tartrazine sur l’activité enzymatique in vivo

L’activité enzymatique de la trypsine est significativement diminuée chez les femelles

et chez les mâles traitées à la dose de 0,05% par rapport aux témoins (p<0,01) dont les valeurs

sont de 1337,12±25,21 vs 1470,08±33,71 U/g de pancréas pour les femelles et 1339,70±31,06

vs 1469,65±16,85 U/g de pancréas pour les mâles soit une diminution respective de 9,05% et

8,85 % (Figure 13).

De même une baisse significative de l'activité de la chymotrypsine est notée chez les

souris à 0,05% de tartrazine (figure 14), dont les valeurs sont de 1000,75 ± 43,35 vs 1312 ±

58,55 U/g de pancréas chez les femelles et 1099,99 ± 18,61 vs 1405±63.54 U/g de pancréas

chez les mâles. Ce qui représente une diminution de 23,77% et 21,74% respectivement.

Cependant, par rapport aux témoins, aucune différence significative de l’activité trypsique ou

chymotrypsique n’est observée chez les souris ayant consommé une faible dose de tartrazine

Page 71: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

54

Tableau 7. Effet de la tartrazine sur le gain du poids corporel et la teneur en protéines

totales chez les souris Swiss témoins et consommant de la tartrazine aux doses de 0,005%

et 0,05% pendant 13 semaines.

Dose de

Tartrazine (%)

Poids initial

(g)

Poids final

(g)

Gain du poids

(g)

Teneur en protéines

(mg/g Pancréas)

Femelles 0 14,58±0,29 40,51±0,82 25,92±0,96 217,21±6,84

0,005 14,79±0,39 38,63±0,64 23,83±0,79 203,87±6,33

0,05 14,90±0,37 38,40±0,56 23,50±0,43 203,49±9,30

Mâles 0 14,18±0,23 43,27±0,64 29,08±0,79 235,67±7,25

0,005 14,96±0,27 42,32±0,53 27,36±0,53 228,74±10,80

0,05 14,85±0,43 41,22±0,66 26,36±0,62 217,77±13,99

Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) (n=10)

Tableau 8. Effet de la tartrazine sur la consommation de l’aliment et du liquide chez les

souris Swiss témoins et consommant de la tartrazine aux doses de 0,005% et 0,05%

pendant 13 semaines.

Dose de Tartrazine

(%)

Aliment

(g/souris/jour)

Liquide

(ml/souris/jour)

Tartrazine

(g//souris/jour)

Femelles 0 7,59±0,15 4,69±0,10 0

0,005 7,68±0,25 4,95±0,07 8,06±0,16

0,05 7,71±0,23 5,00±0,08 80,11±0,90

Mâles 0 7,66±0,30 4,94±0,14 0

0,005 7,72±0,15 5,02±0,07 8,07±0,07

0,05 7,75±0,28 5,04±0,08 80,78±0,48

Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) (n=10)

Page 72: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

55

Figure 13. Effet de la tartrazine sur l’activité enzymatique de la trypsine.

On note une diminution significative de l’activité trypsique pancréatique chez les souris Swiss

consommant 0,05 % de la tartrazine (forte dose) pendant 13 semaines par rapport aux souris

témoins. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES).

** : significativement différent par rapport aux témoins (p<0,01)

Page 73: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

56

Figure 14. Effet de la tartrazine sur l’activité enzymatique de la chymotrypsine.

On note une diminution significative de l’activité chymotrypsique pancréatique chez les

souris Swiss consommant 0,05 % de la tartrazine (forte dose) pendant 13 semaines par rapport

aux souris témoins. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards

(X±ES).

** : significativement différent par rapport aux témoins (p<0,01).

Page 74: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

57

(0,005%) aussi bien chez les mâles que chez les femelles. D’un autre coté, il semble que la

tartrazine n’a pas un effet adverse sur l’activité de l’amylase et de la lipase in vivo (tableau 9).

4.4. Impact de la tartrazine sur l’activité enzymatique in vitro

Les résultats de l’effet de la tartrazine sur l’activité de la trypsine et la chymotrypsine

in vitro en utilisant un modèle de digestion sont exprimés dans le tableau 10. Aucune

modification de ces activités n’a été observée.

4.5. Effet de la tartrazine et de l’acide sulfanilique sur la libération du calcium

(étude ex vivo)

En premier lieu, nous avons effectué plusieurs contrôles pour vérifier la mobilisation

du Ca2 + en réponse aux composés connus pour le mobiliser dans les deux types cellulaires

utilisés. A cet effet, différents lots de cellules ont été stimulées avec 1 nM de la CCK-8 ou 1

µM de la thapsigargine (Tps) (figures 15 et 16).

La CCK-8 est un sécrétagogue pancréatique bien connu qui médie ses effets à travers

la mobilisation du Ca2 +(Castillo-Vaquero et al., 2010). Après l'ajout de la CCK-8 aux cellules

acinaires ou AR42J, une augmentation transitoire de [Ca+2]i a été détectée, qui plus tard, est

revenue vers une valeur stable au-dessus du niveau de base (pré-stimulation) (figure 16A).

La Tps est un inhibiteur puissant des Ca2+ATPases du réticulum sarco-endoplasmique

(SERCA). L’inhibition de cette pompe, responsable de la réentrée du calcium dans le RE,

induit une forte augmentation de [Ca2+]i (Thastrup et al., 1990; Peters and Raghavan, 2011).

Ceci est montré dans la figure 16B au niveau des cellules AR42J.

En ce qui concerne les cellules acinaires isolées des souris Swiss, l’augmentation de

[Ca+2]i a été observée suite à la stimulation avec de la tartrazine aux quatre concentrations

utilisées (0,1 mM ; 1 mM ; 5 mM et 10 mM) et aussi la stimulation de ces cellules avec

l’acide sulfanilique (AS) aux concentrations suivantes : 1 µM, 10 µM, 100 µM et 1 mM induit

la même augmentation (figure 17 et 18).

Page 75: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

58

Tableau 9. Effet de la tartrazine sur l’activité enzymatique de l’amylase et de la lipase

chez les souris Swiss témoins et consommant de la tartrazine aux doses de 0,005% et 0,05

pendant 13 semaines.

Dose de tartrazine (%) Activité d’Amylase

U/g pancréas

Activité de Lipase U/g

pancréas

Femelles 0 2392,83±50,21 3385,58±103,96

0,005 2363,60±75,81 3335,42±74,30

0,05 2355,77±25,71 3213,02±81,54

Mâles 0 2458,03±71,05 3413,23±138,22

0,005 2440,30±81,36 3343,41±117,09

0,05 2436,91±48,22 3243,66±55,92

Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) (n=10)

Tableau 10. Effet de la tartrazine aux doses de 7,5mg/kg/jour et 75 mg/kg/jour sur

l’activité des protéases en utilisant un modèle de digestion in vitro.

Dose de tartrazine (mg) Riz Lait Beurre

Activité de la trypsine

(U/ml)

0 0,23±0,00 0,19±0,00 0,23±0,01

7,5 0,23±0,00 0,20±0,00 0,22±0,01

75 0,24±0,01 0,20±0,01 0,23±0,02

Activité de la chymotrypsine

(U/ml)

0 0,24±0,00 0,31±0,02 0,37±0,01

7,5 0,22±0,00 0,31±0,01 0,37±0,01

75 0,21±0,02 0,29±0,01 0,37±0,01

Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) (n=6)

Page 76: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

59

Figure 15. Changements de la [Ca2 +]i dans les cellules acinaires en réponse à la CCK-8.

Page 77: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

60

Figure 16. Les changements de la [Ca2 +]i dans les cellules AR42J en réponse à la CCK-8

et la thapsigargine.

(A) les changements de la fluorescence au cours du temps, liés à la [Ca2 +]i dans des cellules

AR42J chargées en fura-2, stimulées avec 1 nM de CCK-8. (B) les changements de la

fluorescence au cours du temps, liés à la [Ca2 +]i dans des cellules AR42J chargées en fura-2,

stimulées avec 1 μM de thapsigargine (Tps).

Les barres horizontales continues indiquent le moment où la concentration désirée du stimulus

a été appliquée aux cellules. Les expériences ont été réalisées en présence du Ca2 + dans le

milieu extracellulaire. Les enregistrements sont représentatifs de quatre à cinq essais

indépendants.

Page 78: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

61

Figure 17. Effet de la tartrazine sur la [Ca]i+2 dans les cellules acinaires.

Les enregistrements représentent les changements de la fluorescence, liés à [Ca2 +]i dans les

cellules acinaires chargées en fura-2 stimulées avec 0,1 mM (A), 1 mM (B), 5 mM (C) ou 10

mM (D) de tartrazine.

Les barres horizontales continues indiquent le moment où la concentration désirée du stimulus

a été appliquée aux cellules. Les expériences ont été réalisées en présence du Ca2 +dans le

milieu extracellulaire.

Les enregistrements sont représentatifs de quatre à six essais indépendants.

Page 79: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

62

Figure 18. Changements de la [Ca2+]i dans les cellules acinaires en réponse à l'acide

sulfanilique.

Les enregistrements représentent les changements de la fluorescence, liés à la [Ca2 +]i dans les

cellules acinaires chargées en fura-2 stimulées avec 1 µM (A), 10 µM (B), 100 µM (C) ou 1

mM (D) d'acide sulfanilique.

Les barres horizontales continues indiquent le moment où la concentration désirée du stimulus

a été appliquée aux cellules. Les expériences ont été réalisées en présence du Ca2 +dans le

milieu extracellulaire.

Les enregistrements sont représentatifs de sept à neuf essais indépendants.

Page 80: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

63

En outre, les cellules AR42J sont incubées avec différentes concentrations de l’AS (1

μM, 10 μM, 100 μM ou 1 mM) en présence de Ca2+extracellulaire. Ce métabolite de la

tartrazine a conduit à une augmentation progressive de [Ca+2]i (figure 19).

Le niveau de la fluorescence atteint dans les cellules acinaires semble être lié à la dose

de l’acide sulfanilique ajouté mais ce n’est pas le cas en utilisant la tartrazine alors qu’au

niveau des cellules AR42J, ce niveau de fluorescence était similaire en présence de différentes

concentrations d’AS. On suggère donc que l'effet de ce dernier sur la [Ca+2]i n'était pas

toujours dose-dépendant et ça peut différer selon le type cellulaire utilisé.

Dans d'autres expériences, les cellules ont été stimulées avec du Tps (1 μM) après une

incubation préliminaire des cellules avec 1 mM de l’AS. Dans ces conditions, une

augmentation transitoire de [Ca+2]i a été observée mais elle était plus faible par rapport à la

réponse observée lorsque la Tps a été ajoutée seule aux cellules (figure 20). Ces résultats

suggèrent que l’AS provoque une mobilisation du calcium à partir des mêmes réserves

sensibles aux Tps.

4.6. Effet de l’acide sulfanilique sur le statut redox (étude ex vivo)

Nous nous sommes intéressés à étudier la production des espèces réactives de

l’oxygène (ERO) au niveau des cellules acinaires et des cellules AR42J préalablement

incubées avec les différentes concentrations de l’AS (1 mM, 100 μM, 10 μM ou 1 μM) et

chargées en CM-H2DCFDA ou MitoSOXTMRed. Une augmentation de la fluorescence

dérivée des deux sondes a été observée au niveau des deux types cellulaires par rapport aux

cellules non stimulées, reflétant une augmentation de la production des ERO au niveau

cytosolique et mitochondriale (figure 21 et 22).

Pour les cellules acinaires en utilisant le CM-H2DCFDA, les valeurs exprimées en

pourcentage de fluorescence pour les quatre concentrations de l’AS sont respectivement de

123,5±4,47 %; 114,8±2,65 % ; 109,7±2,37% et 111,5±2,35 % vs 100±0,66% (p<0,001) alors

que les valeurs pour la sonde MitoSOXTMRed sont respectivement de 125,01±4,33 %;

118,83±4,11 %; 110,55±2,49 % et 108,65±2,81% vs 100±0,61 % (p<0,001). Pour les cellules

AR42J, nous avons notamment noté une augmentation de la fluorescence en utilisant

l’indicateur MitoSOXTMRed avec les quatre concentrations de l’AS 1 mM, 100 μM, 10 μM et

Page 81: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

64

Figure 19. Changements de la [Ca2 +]i dans les cellules AR42J en réponse à l'acide

sulfanilique.

Les enregistrements représentent les changements de la fluorescence liés à la [Ca2 +]i dans les

cellules AR42J chargées en fura-2 stimulées avec 1 µM (A), 10 µM (B), 100 µM (C) ou 1

mM (D) d'acide sulfanilique.

Les barres horizontales continues indiquent le moment où la concentration désirée du stimulus

a été appliquée aux cellules. Les expériences ont été réalisées en présence du Ca2 +dans le

milieu extracellulaire.

Les enregistrements sont représentatifs de quatre à cinq essais indépendants.

Page 82: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

65

Figure 20. Effet de l'acide sulfanilique sur la mobilisation du calcium provoquée par la

thapsigargine.

Observation des modifications de la [Ca2 +]i dans les cellules AR42J chargées en fura-2 et

stimulées d’abord avec de l'acide sulfanilique 1 mM ensuite avec 1 μM de thapsigargine

(Tps). Les barres horizontales continues indiquent l’instant où la concentration désirée du

stimulus a été appliquée aux cellules. Les expériences ont été réalisées en présence du Ca2 +

dans le milieu extracellulaire.

Les enregistrements sont représentatifs de quatre essais indépendants.

Page 83: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

66

Figure 21. Effet de l'acide sulfanilique sur la génération des ERO dans les cellules

acinaires.

Les cellules acinaires sont exposées aux différents stimulants pendant 1 h. Ensuite, l'effet de

l'acide sulfanilique sur l'oxydation du CM-H2DCFDA(A) et du MitoSOXTMRed (B) a été

étudié. Les résultats expriment l'état oxydatif des cellules traitées par rapport aux cellules non

stimulées. Ils présentent l'augmentation moyenne de la fluorescence exprimée en pourcentage

± ES par rapport aux cellules témoins (non stimulées).

(***, P <0,001 vs cellules non traitées ; n = 6 à 7 essais indépendants).

Page 84: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

67

1 μM par rapport aux cellules témoins non stimulées dont les valeurs sont 117,40±3,62 %;

114,70±3,11 %; 112,52±1,96 % ; 111,15±2,03 % vs 100±1,00 %. Le niveau d'oxydation

obtenu avec 1 mM d'acide sulfanilique était légèrement supérieur à celui observé avec les

autres concentrations bien qu’il soit non statistiquement significatif.

En absence du Ca2+extracellulaire (cellules AR42J incubées en présence de BAPTA en

milieu contenant 0,5 mM EGTA), la production des ERO provoquée par l’AS n’est pas

différente de celle observée en présence du Ca2+. Donc il semble que le stress oxydatif induit

par l’AS n’est pas Ca2+ dépendant (figure 22B). Les valeurs sont de 120,89±4,28 %;

115,70±4,69 % ; 111,14±3,52 % et 108,66±3,84 % vs 100±1,04 % en réponse à la stimulation

avec 1mM, 100 μM, 10 μM et 1 μM d’acide sulfanilique respectivement par rapport aux

cellules non stimulées.

Pour visualiser la production des ERO au niveau des cellules AR42J, des images de

fluorescence ont été prises après une incubation avec 1mM de l’AS. En présence de ce

dernier, une augmentation de la fluorescence a été détectée en corrélation avec une

augmentation de la production des ERO (figure 23).

Une protection contre ces ERO est assurée par une variété de systèmes antioxydants

tels que le glutathion et la SOD. Pour cela, une évaluation de leurs niveaux dans les cellules

AR42J traitées par l’AS a été faite.

Les résultats obtenus montrent que l’AS induit une diminution dose-dépendante du

rapport GSH/GSSG comparé aux cellules témoins (figure 24). Les valeurs obtenues en

utilisant les quatre concentrations de l’AS (1 mM, 100 μM, 10 μM , 1 μM) sont

respectivement de 42,86±7,81 % vs 100±4,78 % (p<0,01) et 56,38±4,19 %; 76,43±5,1 %;

70,88±7,93 % vs 100±4,78 % (p<0,05).

De même, l’étude par Western Blot révèle que le métabolite de la tartrazine induit une

diminution de l’expression de la SOD2 au niveau des cellules AR42J (figure 25). Les valeurs

exprimées en pourcentage de phosphorylation sont de 35,29±11,60% ; 44,73±12,99 % ;

77,88±8,06 % vs 100±0,99 % suite à la stimulation avec les concentrations suivantes de

l’AS : 1 mM, 100 μM, 10 μM respectivement (p<0,001), (p<0,01) et (p<0,05).

Page 85: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

68

Figure 22. Effet de l'acide sulfanilique sur la génération des ERO dans les cellules AR42J

chargées avec l’indicateur redox MitoSOXTMRed.

Les cellules AR42J sont incubées pendant 1 h sans stimulant (contrôle) ou avec différentes

concentrations de l'acide sulfanilique, en présence (A) ou en absence (B) du Ca2 + dans le

milieu extracellulaire. Ensuite, l'effet de l'acide sulfanilique sur l'oxydation de

MitoSOXTMRed a été étudié.

Les résultats expriment l'état oxydatif des cellules traitées par rapport aux cellules non

stimulées. Ils présentent l'augmentation moyenne de la fluorescence exprimée en pourcentage

± ES par rapport aux cellules témoins (non stimulées) (*, P <0,05 ; **, P <0,01 ; ***, P

<0,001 vs cellules non traitées ; †P <0,05 vs CCK-8 en présence du Ca2 + extracellulaire ; n =

6 à 7 essais indépendants).

Page 86: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

69

Figure 23. Images de fluorescence montrant l'effet de l'acide sulfanilique sur la production

des ERO dans les cellules AR42J chargées avec le MitoSOXTMRed.

(A) Image des cellules par microscopie à lumière transmise. (B) Image des cellules par

microscopie à fluorescence avant stimulation avec de l'acide sulfanilique (1 mM). (C) Image

des cellules par microscopie à fluorescence prises après incubation pendant 1 h en présence de

1mM de l’acide sulfanilique. Une augmentation de la fluorescence a été détectée.

Page 87: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

70

Figure 24. Effet de l'acide sulfanilique sur le glutathion.

Les histogrammes montrent l'augmentation moyenne du ratio GSH / GSSG au niveau des

cellules AR42J incubées avec l’acide sulfanilique (1 mM, 100 μM, 10 μM ou 1 μM).

Les résultats sont exprimés en pourcentage ± ES par rapport aux cellules témoins (non

stimulées). Trois préparations cellulaires différentes ont été utilisées (n.s, cellules non

stimulées ; *, P <0,05 ; **, P <0,01).

Page 88: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

71

Figure 25. Effet de l'acide sulfanilique sur l'expression de la superoxyde dismutase

(SOD2).

(A) Les bandes de Western Blot représentent les niveaux d’expression de l’enzyme

mitochondriale antioxidante SOD2 au niveau des cellules AR42J traitées avec l’acide

sulfanilique (1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM). Pour assurer le chargement égal des protéines,

un témoin de charge (α-actine) a été utilisé dans les conditions testées. (B) Le graphe montre

la quantification de la phosphorylation des protéines.

Les valeurs représentent des moyennes ± ES (n=4) exprimées en % de phosphorylation

par rapport aux cellules témoins (non stimulées) (*, p<0,05 ; **, p<0,01 ; ***, P <0,001 par

rapport aux cellules non stimulées).

Page 89: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

72

4.7. Effet de l’acide sulfanilique sur la trypsine (étude ex vivo)

Les cellules AR42J libèrent les enzymes digestives suite à une stimulation par la CCK

(Logsdon, 1986) et leur sécrétion est altérée en cas du stress oxydatif (Gonzalez et al., 2012)

Ainsi, nous nous sommes intéressés à vérifier si l’acide sulfanilique, métabolite de la

tartrazine, exerce un effet sur la sécrétion de la trypsine.

La stimulation des cellules AR42J avec la CCK induit une libération de la trypsine

dépendante de la concentration de cette hormone en atteignant un pic à 10-10M soit 2,60±0,29

unité de trypsine (figure 26A). L’acide sulfanilique (1 mM ou 100 μM) a provoqué une

augmentation de la sécrétion de la trypsine comparée aux cellules témoins non stimulées mais

l’effet dose-dépendant de la CCK-8 sur cette sécrétion était altéré (figure 26B). Les valeurs

sont respectivement de 1,77±0,23 et 2,00±0,36 vs 1,17±0,20 unité de trypsine (p<0,05).

Ensuite, nous avons cherché si l’effet de l’AS sur la sécrétion trypsique est dû ou non

à la production des ERO. Pour cela, les cellules AR42J sont préincubées pendant 5 minutes en

présence de 100 µM de mélatonine. Ce composé a des effets antioxydants dans le pancréas

exocrine (Santofimia-Castaño et al., 2015). En présence de la mélatonine, les cellules sont

stimulées par l’AS en combinaison avec la CCK-8.

Dans ces conditions expérimentales, l’effet de l’AS sur la sécrétion de la trypsine

induite par la CCK-8 a été réduit. En utilisant la concentration 10-10 M de CCK, Les valeurs

comparées avec celles des cellules traitées avec 1mM d’AS sont de 1,70±0,19 vs 2,24±0,21

unité de trypsine (p<0,05).

Nos résultats suggèrent que l'effet de l’AS sur la sécrétion enzymatique induite par la

CCK-8 pourrait être dû à la génération des ERO.

4.8. Effet de l’acide sulfanilique sur le potentiel membranaire mitochondrial

(étude ex vivo)

Outre leur rôle essentiel dans la production d'ATP, les mitochondries agissent

également comme des tampons locaux de calcium pour réguler étroitement la concentration

du Ca 2+ intracellulaire. Pour ce faire, les mitochondries utilisent le potentiel électrochimique

Page 90: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

73

Figure 26. Effet de la CCK-8 et de l'acide sulfanilique sur la sécrétion de la trypsine dans

les cellules AR42J.

(A) Augmentation dose-dépendante de la sécrétion de la trypsine induite par la CCK-8 dans

les cellules AR42J. (B) Effet de l'acide sulfanilique 1 mM (■), acide sulfanilique 100 μM (●)

et de la combinaison de 100 μM de mélatonine plus 1 mM d'acide sulfanilique (□) sur la

sécrétion de la trypsine par la CCK-8 dans les cellules AR42J. Les expériences ont été

réalisées en présence du Ca2 + dans le milieu extracellulaire.

Les données expriment les moyennes ± ES (*, p<0,05 ; **, p<0,01 par rapport aux cellules

non stimulées, n = 4 à 5 essais indépendants).

Page 91: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

74

à travers leurs membranes internes (ΔΨm) pour séquestrer le Ca2+(Au - McKenzie et al.,

2017).Une augmentation de la concentration du calcium mitochondriale devrait conduire à

une dépolarisation du Ψm et reflète des changements dans l’état redox mitochondrial

(González et al., 2003) sachant que les mitochondries représentent la source majeure des ERO

(Circu and Aw, 2010).

C’est pourquoi nous nous sommes intéressés à évaluer l’effet de l’AS sur le potentiel

membranaire mitochondrial pour visualiser la relation entre la [Ca2+]i, le Ψm et la production

des ERO.

Quand les cellules AR42J ont été incubées pendant 15 min en présence de l’AS (1

mM, 100 μM, 10 μM ou 1 μM) nous avons observé une diminution statistiquement

significative de la fluorescence en TMRM dans les cellules traitées avec 1mM d’AS. Cela

reflète une dépolarisation du ψm, en raison de la diffusion du colorant au cytosol (González et

al., 2003). Les valeurs exprimées en pourcentage de fluorescences ont de 92,11±2,27 % vs

100±2,37 % (p<0,05).

Cependant, aucun changement détectable de ψm n'a été noté avec les autres

concentrations. En présence de FCCP (0,5 μM) considéré comme un contrôle positif, une

diminution statistiquement significative de ψm a été détectée dont les valeurs sont de

89,35±3,59 % vs 100±2,37 % (p<0,05) (figure 27).

Page 92: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

RESULTATS

75

Figure 27. Effet de l’acide sulfanilique sur le potentiel membranaire mitochondrial (ψm)

Le graphe indique les changements dans le ψm des cellules AR42J chargées avec le TMRM

et incubées en présence d'acide sulfanilique (1 mM, 100 μm, 10 μm ou 1 μm) par rapport aux

cellules non stimulées (n.s.).

Les résultats sont exprimés en moyenne de pourcentage ± ES par rapport aux cellules témoins

(*, p <0,05 vs cellules non stimulées, n = 4 essais indépendants).

Page 93: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

DISCUSSION

76

5. Discussion

Les habitudes alimentaires ont évolué tout au long des siècles. Aujourd'hui, les

colorants alimentaires tels que la tartrazine prennent une grande part dans notre alimentation.

En fait, ces colorants sont souvent ajoutés aux denrées alimentaires et aux boissons afin de

fournir, d’intensifier ou de restaurer leurs couleurs pour créer une apparence attrayante

(Schenone et al., 2013). Actuellement, les débats sur la sécurité alimentaire, principalement

l’implication de la tartrazine dans plusieurs pathologies, sont devenus de plus en plus

nombreux.

Ce colorant, répertorié sous le code E102 en Europe, est un colorant azoïque

synthétique utilisé dans plusieurs secteurs. Dans les pays en développement, les gens

l’utilisent principalement comme substitut du safran (Mehedi et al., 2009). Il est également

utilisé dans certains produits cosmétiques et pharmaceutiques (Amine et al 2010). La dose

journalière admissible (DJA) de ce colorant est de 0-10 mg/kg/jour (JECFA, 2016).

Cependant, cette DJA peut largement être dépassée en raison de certaines habitudes

alimentaires.

Plusieurs études ont montré que la tartrazine a des effets immunotoxiques (Moutinho

et al., 2007; Guendouz et al., 2013), génotoxiques (Sasaki et al., 2002; Khayyat et al., 2017)

ainsi que des altérations au niveau du système reproducteur (Mehedi et al., 2009; Axon et al.,

2012). En outre, il a été montré que la tartrazine altère différents paramètres biochimiques, en

particulier ceux liés aux organes vitaux comme le foie et les reins (Sharma et al., 2009; Amin

et al., 2010; Tawfek et al., 2015). Concernant le système digestif, les études existantes

révèlent que la tartrazine peut induire des dommages de l’ADN dans l'estomac et le côlon

ainsi que des modifications dégénératives de la muqueuse gastrique (Sasaki et al., 2002;

Ghonimi and Elbaz, 2015). Selon Wang et al. (2012), il semble que la tartrazine inhibe

l’activité enzymatique de la trypsine et affecte la digestion.

Du fait que le système digestif est la première surface exposée aux xénobiotiques tels

que la tartrazine, il était d’intérêt d’étudier l’impact de ce colorant sur la physiologie du

pancréas exocrine qui occupe une place importante dans le système digestif, principalement

via la sécrétion des enzymes digestives pancréatiques dans le duodénum.

Page 94: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

DISCUSSION

77

Dans la première partie de ce travail, on s’est intéressé à évaluer l’effet de la tartrazine

(E102) sur l’activité des enzymes digestives pancréatiques. L'analyse de l'activité des

enzymes digestives a été largement utilisée comme indicateur de l'état et de la fonction du

système digestif (Xu et al., 2003; Jiang et al., 2008; Wang et al., 2012; Arhakis et al., 2013).

Dans notre protocole, les souris Swiss ont reçu deux doses de tartrazine : la première est de

0,005%, équivalente à 8 mg/kg/ jour environ, c’est à dire une dose proche de la DJA établie

par le Comité Conjoint d'Experts sur les Additifs alimentaires (JECFA, 2016) qui est de 10

mg/kg/jour. La deuxième est de 0,05 % du fait qu’il a été constaté que la consommation de ce

colorant alimentaire chez les enfants peut dépasser la DJA (Sawaya et al., 2008; Tripathi et

al., 2010).

En terme de poids corporel, nos résultats ont montré qu’à faible dose, la

consommation de tartrazine n’influe pas significativement sur ce paramètre ; ce qui est en

accord avec l'étude de (Himri et al., 2011). Le même constat est établi lorsque le colorant est

ingéré à dose élevée, concordant avec les données de Tanaka (2006), qui a utilisé une dose de

0,05% (environ 83 mg/kg/jour). Cependant, les études menées au niveau de notre laboratoire

par Mehedi et al. (2009) puis par Guendouz et al. (2013) ont montré une perte de poids

corporel significative chez des souris traitées à la tartrazine. Ces résultats pourraient être liées

aux doses élevées utilisées qui étaient de 0,1 ; 0,45 ; 1 et 2%. La perte de poids corporel est

l'un des indicateurs de toxicité et est généralement liée à la perte d'appétit et à la diminution

de la consommation alimentaire (Ezeuko et al., 2007).

Les résultats de ce travail ont montré aussi que les activités de l'amylase et de la lipase

chez les souris femelles et mâles qui consommaient de la tartrazine aux doses de 0,005% et

0,05% étaient comparables à celles des témoins. En revanche, à forte dose (0,05%), la

tartrazine induit une diminution significative des activités de la trypsine et de la

chymotrypsine, alors qu'aucun changement détectable n'a été noté chez les animaux ayant

consommé le colorant à faible dose (0,005%).

Ces résultats indiquent donc clairement qu’il semble exister un effet notoire de la

tartrazine sur les protéases mais pas sur les enzymes non protéolytiques. Ils indiquent

également que le colorant utilisé à la DJA ne semble pas avoir d’effet sur l’activité des

enzymes pancréatiques étudiées.

Page 95: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

DISCUSSION

78

Dans notre travail, l'absence de changements significatifs dans le poids corporel des

souris ayant consommé de la tartrazine à 0,05 % pourrait s'expliquer par le fait qu'une

sécrétion présumée de protéases pancréatiques pourrait être partiellement compensée par les

mécanismes gastriques et de l'intestin grêle, de sorte que la malabsorption des protéines

survient généralement plus tard et elle est moins importante que la malabsorption des lipides

(Keller and Layer, 2014).

L'étude de Buddington and Diamond (1989) a montré que le processus de production

d'enzymes est contrôlé par des mécanismes génétiques et n’est pas induit par le régime

alimentaire. Cependant, selon Vaysse (2005), la sécrétion pancréatique s'adapte aux

changements dans la composition de l'alimentation (glucides, protéines et lipides). Il a été

montré qu’un régime riche en lipides stimule plus la sécrétion pancréatique qu’un régime

protéique (Keller and Layer, 2005; Bartel et al., 2015). Indépendamment de ces observations,

dans notre étude, tous les groupes ont été nourris avec un régime ayant la même composition.

Ce qui laisse penser que la diminution des activités des protéases que nous avons observée

n’est pas en lien avec la composition du régime alimentaire consommé par les animaux.

Dans le pancréas, les protéines sont synthétisées et transférées dans le réticulum

endoplasmique rugueux des cellules acineuses. Elles sont ensuite transportées dans l'appareil

de Golgi où elles subissent des modifications post-traductionnelles et sont triées. Les

zymogènes pancréatiques peuvent être exportés sous l'influence d'agents stimulants (voie

régulée), ou peuvent être libérés en permanence (voie constitutive) (Vaysse, 2005).

En ce qui concerne la tartrazine, ce colorant est transformé en acide sulfanilique (AS)

après avoir été métabolisée par la microflore gastro-intestinale (Moutinho et al., 2007;

Demirkol et al., 2012). Plusieurs études ont révélé que le groupe sulfonique interagit avec les

résidus d'acides aminés chargés positivement des protéines, principalement par des forces

électrostatiques, ce qui peut modifier la structure de la protéine (Aehle, 2007; Ang and

Elimelech, 2007; Nilsson et al., 2009; Wang et al., 2012; Al-Shabib et al., 2018).

Du fait que les études sur la physiologie digestive aussi bien chez l’homme que chez

l’animal sont éthiquement et techniquement difficiles, il était important pour les scientifiques

de pouvoir développer et appliquer des modèles de digestion in vitro qui miment et reflètent

les conditions et les processus physiologiques qui se produisent in vivo. Actuellement, ces

Page 96: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

DISCUSSION

79

modèles de digestion sont largement utilisés pour étudier les changements structurels, la

biodisponibilité ainsi que la digestibilité des aliments (Hur et al., 2011).

Pour ce qui est de l’étude in vitro dans notre travail à l’aide d’un modèle de digestion,

aucun changement d’activité enzymatique de la trypsine ou de la chymotrypsine n'a été noté,

avec les deux doses de la tartrazine (7,5 et 75 mg) utilisées. Selon Hur et al. (2011), les

résultats des modèles de digestion in vitro sont souvent différents de ceux obtenus avec des

modèles in vivo en raison des difficultés à simuler avec précision les événements

physicochimiques et physiologiques très complexes qui se produisent dans les voies

digestives animales et humaines. En effet, les modèles de digestion gastro-intestinale

présentent des avantages et des inconvénients. Ménard and Dupont (2014) ont conclu que le

recours à des modèles in vivo, animaux ou humains, demeure la meilleure approche pour

étudier la digestion. De plus, la réponse individuelle varie non seulement en fonction de la

dose, de l'âge, du sexe, de l'état nutritionnel et des facteurs génétiques, mais aussi en fonction

de l'exposition à long terme à de faibles doses (Sasaki et al., 2002).

Par conséquent, l'impact négatif de la tartrazine sur les enzymes in vitro pourrait

s'expliquer par la complexité du système digestif animal et par la durée de l'exposition (13

semaines) in vivo. Un autre facteur important pourrait être l'absence de la microflore gastro-

intestinale dans ce modèle de digestion in vitro qui, par conséquent, se traduit par l’absence de

toute production d'amines aromatiques.

Il est admis que l'ingestion de certains contaminants est susceptible d'affecter l'activité

des enzymes qui peuvent conduire ensuite à l’apparition de certaines pathologies dans le corps

humain (Wang et al., 2012). En ce qui concerne le système digestif, Sasaki et al. (2002) ont

montré que la tartrazine (à la dose de 10 mg/ kg / jour) provoque des lésions de l'ADN au

niveau des organes gastro-intestinaux. L'étude de Himri et al. (2011) suggère une réponse

inflammatoire due à l'absorption de l'acide sulfanilique caractérisée par l’augmentation du

nombre de leucocytes.

Dans une étude menée par Goldenring et al. (1982), l'acide sulfanilique, métabolite

majeur de la tartrazine, issu du métabolisme de la flore intestinale a été administré à des rats

postnataux via une injection intrapéritonéale pour examiner son impact sur le comportement.

Page 97: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

DISCUSSION

80

Ces chercheurs ont observé une hyperactivité et une altération des performances chez les

animaux traités à l’acide sulfanilique.

Sur la base des travaux précédemment cités et de nos études réalisées in vivo et in

vitro, il apparait bien que l’action de la tartrazine sur les protéases pancréatiques s’effectue à

travers son métabolite majeur. Ce qui conforte l’hypothèse de Onyema et al. (2006), selon

lesquels les métabolites des xénobiotiques deviennent parfois plus toxiques que les substances

initiales dont elles sont issues.

Sachant que les trois grandes phases de la sécrétion des protéines par le pancréas

exocrine sont: la synthèse des enzymes digestives, leur transport intracellulaire et la sécrétion

de zymogènes induite par le sécrétagogue (Otsuki and Williams, 1982), on peut donc suggérer

que le E102 et/ou l’acide sulfanilique (AS) pourraient exercer leurs effets toxiques au cours

de l’une de ces phases. Partant donc des ces données, et dans le but d’établir les mécanismes

mis en jeu dans l’altération du système digestif, il était intéressant d’essayer d’identifier les

voies de signalisation intracellulaires qui pouvaient être affectées par ces deux composants.

Pour cela, nous avons procédé à une étude ex vivo sur des cellules acinaires isolées du

pancréas des souris Swiss et sur des cellules AR42J issus d’un carcinome pancréatique du rat.

On sait que la fonction du pancréas exocrine est contrôlée principalement par les

signaux du calcium (Petersen, 2014). Mais il est connu également qu’une augmentation

prolongée des niveaux du Ca2+ peut nuire à la physiologie du pancréas par l’induction de

lésions pancréatiques à l’origine de plusieurs pathologies (Petersen, 2008; Petersen, 2009;

Gerasimenko et al., 2017).

Nos résultats ont montré que la tartrazine ainsi que l’AS provoquent une augmentation

généralement dose-dépendante de la concentration du Ca2+libre intracellulaire. Ceci suggère

que le E102 et son métabolite pourraient potentiellement endommager la glande (Petersen,

2008).

Compte tenu du rôle primordial du Ca2+ dans différents processus physiologiques, la

dérégulation du signal calcique peut être une caractéristique de certains états pathologiques

(Missiaen et al., 2000; Roderick and Cook, 2008; Parkash and Asotra, 2010). En effet, le

calcium a un rôle accélérateur dans la conversion du trypsinogène en trypsine alors qu'un taux

Page 98: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

DISCUSSION

81

élevé de calcium dans le suc pancréatique pourrait être à l'origine de la formation de calculs

responsables de l'obstruction des voies pancréatiques. Tout ceci pourrait être à l'origine de

l'autodigestion du pancréas (Sara, 2016). De plus, cette élévation anormale provoque une

activation prématurée des enzymes intracellulaires, un dysfonctionnement mitochondrial, une

altération de l’autophagie, vacuolisation et nécrose. Ces anomalies contribuent au

développement de la pancréatite aigüe (Wen et al., 2016).

D’autre part, le stress oxydatif qui correspond à un déséquilibre entre la génération des

espèces réactives de l’oxygène (ERO) et les défenses antioxydantes de la cellule, en faveur

des premières, peut contribuer à une multitude de maladies dans lesquelles une surproduction

des ERO engendre un dysfonctionnement cellulaire (Haleng et al., 2007; Migdal and Serres,

2011).

En effet, plusieurs études ont corrélé l’action de la tartrazine avec l’induction du stress

oxydatif. En particulier, il a été montré que ce colorant alimentaire peut altérer le statut redox

en produisant des ERO et en diminuant l’activité des enzymes antioxydantes au niveau du

système reproducteur (Visweswaran and Krishnamoorthy, 2012; Boussada et al., 2017), des

reins et du foie (Amin et al., 2010; El Golli, 2016) et du cerveau (Gao et al., 2011; Cemek et

al., 2014). De même, la production excessive des ERO a été signalée comme étant un

contributeur majeur des pathologies affectant le pancréas exocrine (Bhardwaj and Yadav,

2013).

Dans notre travail, nous avons montré que l’acide sulfanilique induit la production des

ERO dans les cellules acinaires et dans les mitochondries des cellules AR42J. En fait, il est

bien connu que les mitochondries représentent la principale source des ERO dans la cellule et

que leur production joue un rôle fondamental dans les pathologies pancréatiques (Granados et

al., 2004; Gerasimenko and Gerasimenko, 2012).

Nos résultats sont en accord avec ceux deMorales et al. (2004) et Bansal et al. (2005)

qui montrent que les métabolites de la tartrazine peuvent générer des ERO favorisant ainsi la

peroxydation lipidique et inhibant les enzymes antioxydantes, accélérant ainsi le stress

oxydatif et endommageant la plupart des composants cellulaires.

La relation entre la génération des ERO et l’excès en Ca2 + est très étroite et il est

Page 99: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

DISCUSSION

82

difficile d’évaluer lequel conduit à l’autre sachant que des niveaux élevés de [Ca2+]i

conduisent à la production des ERO et un excès de cette dernière induit une surproduction en

Ca2 +(Gonzalez et al., 2012).

Fait intéressant, nos résultats indiquent que l'effet de l'acide sulfanilique sur la

production des ERO ne semblait pas dépendre de la mobilisation du Ca2+. Ceci nous laisse

supposer que le dérivé de la tartrazine pourrait altérer la physiologie mitochondriale,

conduisant à la production des ERO qui, à leur tour, pourrait entraîner une augmentation de

[Ca2+]i.

D’autre part, il a été montré que la génération des ERO dans un organisme est corrélée

à la diminution des niveaux d'enzymes antioxydantes favorisant ainsi le stress oxydatif (El-

Tohamy, 2012). C’est pourquoi, on s’est intéressé à évaluer l’effet de AS sur le système du

glutathion (GSH) et sur les taux de la superoxydase dismutase (SOD2).

Nos résultats montrent que l’incubation des cellules AR42J avec l’acide sulfanilique

provoque une diminution dose-dépendante du ratio glutathion réduit/glutathion oxydé

(GSH/GSSH) ainsi qu’une diminution d’expression de la SOD2.

En fait, le système de glutathion est impliqué dans la désintoxication des ERO

produites par les xénobiotiques. Une diminution de la teneur de GSH ainsi qu’une

augmentation permanente du ratio [GSSG/GSH] constitue un stress oxydant et est considéré

comme un signe pathologique commun lors des troubles affectant les tissus et les organes de

l’organisme (Dugo et al., 2011). A son tour, la SOD2 mitochondriale protège les cellules

contre les effets délétères des ERO. Par conséquent, sa déficience est responsable de plusieurs

pathologies (Nojima et al., 2015). En effet, la suppression du gène responsable de la

production de la superoxyde dismutase chez des souris a été associé à un décès prématuré dû

à un manque de défense contre les radicaux libres (Baba and McGrath, 2008).

La SOD2 est une métalloprotéine qui représente une des premières lignes de défense

contre le stress oxydant. Elle assure l’élimination de l’anion superoxyde O2-par une réaction

de dismutation, en le transformant en peroxyde d’hydrogène H2O2 et en oxygène (Haleng et

al., 2007). Cependant, cette enzyme peut être inhibée par un taux élevée des H2O2 (Grzelak et

al., 2000).

Page 100: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

DISCUSSION

83

Les résultats de l’étude du GSH et de la SOD2 confirment les observations

précédentes lors de la détermination des ERO et indiquent que le métabolite de la tartrazine

affecte le système de défense antioxydant, favorisant ainsi un état de stress oxydatif et altère

probablement la mitochondrie.

Pour vérifier une probable altération de cet organite, nous avons déterminé le potentiel

membranaire mitochondriale (ψm). Ce dernier est nécessaire pour maintenir la fonction

physiologique de la chaine respiratoire pour générer de l’ATP (Joshi and Bakowska, 2011). Il

a été montré qu’une diminution de ψm est liée à une augmentation du niveau des ERO (Satoh

et al., 1997). De plus, les changements dans l'état redox mitochondrial et du ψm peuvent

conduire à des dommages cellulaires (Kuznetsov et al., 2011). D’ailleurs, le

dysfonctionnement mitochondrial et le stress oxydatif sont impliqués dans la

physiopathologie de nombreuses maladies (Joshi and Bakowska, 2011). Dans ce sens, une

diminution du ψm entraine un dysfonctionnement de la mitochondrie qui va activer la voie

apoptotique intrinsèque (Lamy, 2009).

Nous avons observé une diminution du ψm dans les cellules AR42J incubées avec la

concentration la plus élevée d'acide sulfanilique, soit 1 mM. Notre résultat concorde avec les

données précédemment citées confortant alors l’existence d’une relation entre l'atteinte

mitochondriale et le stress oxydatif. De plus, Siraki et al. (2002) ont constaté que l'incubation

des hépatocytes avec des amines aromatiques entraînent une diminution du potentiel de la

membrane mitochondriale avant que la cytotoxicité ne se produise .

En effet, nos résultats suggèrent que l'acide sulfanilique induit la production des ERO

dans les mitochondries et altère les défenses antioxydantes des cellules favorisant les

conditions du stress oxydatif qui pourrait endommager la fonction cellulaire.

En ce qui concerne la fonction cellulaire, nous avons observé une altération de la

sécrétion de la trypsine dans les cellules AR42J stimulées par la cholécystokinine (CCK) en

présence d’acide sulfanilique. Ceci confirme les résultats obtenus in vivo en utilisant la

tartrazine. Selon Sherwood et al. (2007), un désordre dans la sécrétion du trypsinogène est une

étape précoce dans le développement de la pancréatite aigüe.

Nous avons également montré que l’effet toxique du métabolite de la tartrazine sur la

Page 101: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

DISCUSSION

84

trypsine a été diminué en présence de la mélatonine. Cette dernière est considérée comme un

puissant antioxydant qui peut protéger les cellules en piégeant les ERO, elle présente aussi des

effets anti-inflammatoires (Korkmaz et al., 2009).

En fait, il a été précédemment montré que l’utilisation des antioxydants protège

potentiellement le pancréas contre les dommages induits par les ERO (Sevillano et al., 2003).

De même, concernant l’effet antioxydatif, Santofimia-Castaño et al. (2013) et Santofimia-

Castaño et al. (2014) ont montré que l'indoleamine possède des effets protecteurs sur les

cellules acineuses pancréatiques.

Tous les composants cellulaires, y compris les lipides, les protéines, les acides

nucléiques et les sucres sont des cibles potentielles du stress oxydatif (Visweswaran and

Krishnamoorthy, 2012). Les enzymes digestives alors ne font pas exception. Nos observations

suggèrent donc que l'effet de l'acide sulfanilique sur la sécrétion de la trypsine pourrait être dû

à la génération des ERO.

Page 102: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

CONCLUSION

85

6. Conclusion

La coloration est un facteur important, parfois même décisif, dans le choix d'un

aliment. Ainsi, les colorants alimentaires sont d’avantage utilisés par intérêt économique que

par nécessité technique ou technologique. La tartrazine (E102) étudiée dans le cadre de ce

travail, est un colorant largement utilisé dans l’industrie alimentaire et notamment dans la

cuisine algérienne.

L’évaluation de la toxicité de la tartrazine a fait l’objet de nombreuses études menées

aussi bien sur l’animal que chez l’homme, en plus de travaux réalisés in vitro. Cependant,

l'impact de l’ingestion de la tartrazine sur les activités biologiques et les processus

physiologiques telle que la digestion n'est pas clairement établi, et les conclusions peuvent

différer d'une étude à l'autre.

Ce travail a donc eu pour objectif l’évaluation de la toxicité de la tartrazine sur un

aspect particulier de la fonction digestive à savoir l’activité enzymatique de la trypsine, de la

chymotrypsine, de l’amylase et de la lipase.

Nous avons dans un premier temps vérifié si l’ingestion de la tartrazine à la DJA est

vraiment sans effets néfastes. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à

étudier l’effet du métabolite majeur de la tartrazine qui est l’acide sulfanilique sur les

fonctions du pancréas exocrine compte tenu du rôle majeur de cette glande dans le processus

de la digestion. Il s’agissait, en fait, d’essayer de d’étudier la voie par laquelle ce colorant peut

affecter le bon fonctionnement de la digestion.

Nos résultats ont montré dans cette étude que la consommation par les souris Swiss de

la tartrazine à la dose de 0,05% durant 13 semaines diminue significativement l’activité de la

trypsine et de la chymotrypsine. Contrairement à cela, les résultats de l’étude in vitro en

utilisant un modèle de digestion ont montré que la tartrazine n’as pas d’effet sur l’activité de

ces deux enzymes protéolytiques. Ce résultat suggère en fait que ce colorant exerce son

pouvoir toxique via son métabolite. Une absorption intestinale adéquate des nutriments est

tributaire d’une production conséquente en enzymes pancréatiques pour permettre une activité

enzymatique optimal dans la lumière du duodénum.

Page 103: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

CONCLUSION

86

Les données de l’étude ex vivo sur les cellules acinaires et sur les cellules AR42J

indiquent que la tartrazine affecte la signalisation calcique. En fait, une augmentation de la

concentration du calcium intracellulaire est un signal précoce important par lequel les

sécrétagogues physiologiques provoquent la libération des enzymes digestives par les cellules

acineuses pancréatiques. Une altération de la sécrétion conduit à l’activation intracellulaire

des enzymes digestives qui à son tour pourrait initier l’autodigestion de la glande et les tissus

environnants en favorisant les maladies inflammatoires (Fernández-Sánchez et al., 2009;

Tapia et al., 2010).

Nos résultats montrent que l’acide sulfanilique (AS), le métabolite majeur de la

tartrazine, altère la physiologie de la mitochondrie et affecte son potentiel membranaire. Ce

composant semble notamment être très nocif pour les cellules car il induit un stress oxydatif

dose-dépendant dans les deux modèles cellulaires utilisés (cellules acinaires et cellules

AR42J) tout en surproduisant les espèces réactives de l’oxygène (ERO) et en diminuant le

niveau de défense antioxydante assurée par le système du glutathion et de la superoxyde

dismutase dans les cellules AR42J. De plus, l’acide sulfanilique provoque une altération de la

sécrétion de la trypsine qui semble être due à un excès des ERO mis en évidence par

l’utilisation d’un antioxydant (la mélatonine) qui diminue l’effet toxique de l’AS.

Les protéines ont de nombreuses fonctions dans le corps. Elles peuvent être utilisées

comme source d’énergie, entrer dans la structure des différentes parties du corps, constituer

des hormones, des enzymes etc. Ainsi, toute carence dans la digestion de ces protéines peut

affecter le bon fonctionnement de l'organisme. Nos résultats ont clairement montré que

l’ingestion subchronique de la tartrazine diminue significativement l’activité protéolytique des

enzymes pancréatique ce qui confirme que ce colorant est réellement nocif pour la bonne

santé.

Bien que les résultats de ce travail montrent que la dose de 0,005 %, une dose très

proche de la DJA, n’as pas un effet adverse sur les enzymes pancréatiques étudiées, il est

néanmoins important qu’une enquête nutritionnelle soit menée auprès de la population

algérienne pour évaluer la consommation quotidienne de la tartrazine. Une priorité doit être

plus particulièrement accordée aux enfants, catégorie très vulnérable, en raison d’une part de

leur poids corporel relativement diminué et d’autre part, en rapport à leur consommation

Page 104: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

CONCLUSION

87

élevée en additifs alimentaires (Anisyah et al., 2011). Ainsi, l’altération du processus de

croissance peut être plus sévère chez les enfants.

En conclusion, la présente étude montre clairement que la tartrazine ainsi que son

métabolite, l’acide sulfanilique, peut significativement affecter la fonction du pancréas

exocrine et rendre cet organe susceptible à des pathologies ce qui altère les processus de la

digestion.

En perspectives, en vue de protéger la population des effets nocifs de ce colorant

alimentaire synthétique, la curcumine (grâce à son pouvoir antioxydant puissant) est utilisée

comme un additif alimentaire prometteur pour réduire le stress oxydatif causé par la tartrazine

(El-Desoky et al., 2017) donc une étude comparative en utilisant les deux colorants semble

être de grand intérêt .

Les résultats obtenus ouvrent sur d’autres perspectives notamment d’évaluer l’effet de

la tartrazine et de son métabolite sur d’autres enzymes digestives tels que la pepsine gastrique,

l’élastase, les nucléases, les carboxypeptidases…etc. D’autre part, on peut également

envisager l’étude de l’effet de la tartrazine et de son métabolite, l’acide sulfanilique, sur

l’absorption intestinale in vivo sur des souris Swiss et ex vivo en utilisant les cellules Caco-2

pour bien comprendre l’effet de ce colorant alimentaire sur la fonction digestive.

Page 105: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

88

7. Références bibliographiques

Aehle, W. (2007). Enzymes in industry: production and applications. The Netherlands, John

Wiley & Sons: 12.

Al-Shabib, N. A., Khan, J. M., Alsenaidy, M. A., Alsenaidy, A. M., Khan, M. S., Husain, F.

M., Khan, M. R., Naseem, M., Sen, P. and Alam, P. (2018). "Unveiling the stimulatory effects

of tartrazine on human and bovine serum albumin fibrillogenesis: Spectroscopic and

microscopic study." Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy

191: 116-124.

Alscher, R. G., Erturk, N. and Heath, L. S. (2002). "Role of superoxide dismutases (SODs) in

controlling oxidative stress in plants." Journal of Experimental Botany 53(372): 1331-1341.

Aluko, R. E., McIntosh, T. and Katepa‐Mupondwa, F. (2005). "Comparative study of the

polypeptide profiles and functional properties of Sinapis alba and Brassica juncea seed meals

and protein concentrates." Journal of the Science of Food and Agriculture 85(11): 1931-1937.

Alvarez, F. J. and Stella, V. J. (1989). "The role of calcium ions and bile salts on the

pancreatic lipase-catalyzed hydrolysis of triglyceride emulsions stabilized with lecithin."

Pharmaceutical Research 6(6): 449-457.

Alves, S. P., Brum, D. M., de Andrade, E. C. B. and Netto, A. D. P. (2008). "Determination of

synthetic dyes in selected foodstuffs by high performance liquid chromatography with UV-

DAD detection." Food Chemistry 107(1): 489-496.

Amin, C. N. C., Bony, N. F., Gbassi, G. K. and Aké, M. (2014). "Research and determination

of tartrazine in artisanal yoghurts commercialized in Abidjan (Côte d'Ivoire)." International

Journal of Nutrition and Food Sciences 3(2): 119-122.

Amin, K., Hameid II, H. A. and Elsttar, A. A. (2010). "Effect of food azo dyes tartrazine and

carmoisine on biochemical parameters related to renal, hepatic function and oxidative stress

biomarkers in young male rats." Food and Chemical Toxicology 48(10): 2994-2999.

Page 106: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

89

Anagnostides, A., Chadwick, V., Selden, A. and Maton, P. (1984). "Sham feeding and

pancreatic secretion." Gastroenterology 87(1): 109-114.

Ang, W. S. and Elimelech, M. (2007). "Protein (BSA) fouling of reverse osmosis membranes:

implications for wastewater reclamation." Journal of Membrane Science 296(1): 83-92.

Anisyah, A., Andarwulan, N. and Hariyadi, P. (2011). "Tartrazine exposure assessment by

using food frequency method in North Jakarta, Indonesia." Food and Nutrition 2: 458-463.

Annicotte, J.-S. (2004). Etude des fonctions pancréatiques du récepteur nucléaire orphelin

Liver Receptor Homolog-1 (LRH-1) et du facteur de transcription E2F1. Institut de Génétique

et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. Strasbourg, Université Strasbourg I- Louis Pasteur.

Antomarchi, C. (2009). Etude bibliographique des lésions pancréatiques chez les carnivores

domestiques: fréquence et nature de ces lésions dans un échantillon de 57 chiens et chats

présentés pour un examen nécropsique à l'ENVL Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon. Lyon,

Université Claude-Bernard - Lyon I.

Arefin, S., Hossain, M. S., Akter Neshe, S., Rashid, M. M. O., Amin, M. T. and Hussain, M.

S. (2017). "Tartrazine induced changes in physiological and biochemical parameters in Swiss

albino mice, Mus musculus." Marmara Pharmaceutical Journal 21(3): 564-569.

Arhakis, A., Karagiannis, V. and Kalfas, S. (2013). "Salivary alpha-amylase activity and

salivary flow rate in young adults." The Open Dentistry Journal 7: 7-15.

Armand, M., Borel, P., Ythier, P., Dutot, G., Melin, C., Senft, M., Lafont, H. and Lairon, D.

(1992). "Effects of droplet size, triacylglycerol composition, and calcium on the hydrolysis of

complex emulsions by pancreatic lipase: an in vitro study." The Journal of Nutritional

Biochemistry 3(7): 333-341.

Atamer, A., Bilici, A., Yenice, N., Selek, S., Ilhan, N. and Atamer, Y. (2008). "The

importance of paraoxonase 1 activity, nitric oxide and lipid peroxidation in hepatosteatosis."

Journal of International Medical Research 36(4): 771-776.

Page 107: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

90

Au - McKenzie, M., Au - Lim, S. C. and Au - Duchen, M. R. (2017). "Simultaneous

Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells

by Fluorescent Microscopy." JoVE(119): e55166.

Aura, A.-M. (2005). In vitro digestion models for dietary phenolic compounds. Department of

Chemical Technology. Finland, VTT Technical Research Centre of Finland.

Axon, A., May, F. E., Gaughan, L. E., Williams, F. M., Blain, P. G. and Wright, M. C.

(2012). "Tartrazine and sunset yellow are xenoestrogens in a new screening assay to identify

modulators of human oestrogen receptor transcriptional activity." Toxicology 298: 40-51.

Baba, L. and McGrath, J. M. (2008). "Oxygen free radicals: effects in the newborn period."

Advances in Neonatal Care 8(5): 256-264.

Badawy, A. M., Mostafa, N., Abd El-Aziz, B., El-Aleem, A. and Lamie, N. (2011). "Stability

indicating spectrophotometric methods for determination of rosuvastatin in the presence of its

acid degradation products by derivative spectrophotometric techniques." J. Adv. Pharm. Res

2(1): 44-55.

Bansal, A., Bansal, M., Soni, G. and Bhatnagar, D. (2005). "Modulation of N-

nitrosodiethylamine (NDEA) induced oxidative stress by vitamin E in rat erythrocytes."

Human & Experimental Toxicology 24(6): 297-302.

Barka, N. (2008). L’élimination des colorants de synthèse par adsorption sur un phosphate

naturel et par dégradation photocatalytique sur TiO2 supporté. Physico-chimie des Matériaux

à Caractères Appliqués. Agadir, Université de Ibn Zohr.

Barone, R. (1997). Pancreas. Anatomie comparée des mammifères domestiques. Tome 3.

Splanchnologie I. Appareil digestif. Appareil respiratoire. Paris, VIGOT: 560-576.

Bartel, M. J., Asbun, H., Stauffer, J. and Raimondo, M. (2015). "Pancreatic exocrine

insufficiency in pancreatic cancer: a review of the literature." Digestive and Liver Disease

47(12): 1013-1020.

Page 108: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

91

Bastaki, M., Farrell, T., Bhusari, S., Bi, X. and Scrafford, C. (2017). "Estimated daily intake

and safety of FD&C food-colour additives in the US population." Food Additives &

Contaminants: Part A 34(6): 891-904.

Beck, I. (1973). "The role of pancreatic enzymes in digestion." The American Journal of

Clinical Nutrition 26(3): 311-325.

Benzonana, G. (1968). "Sur le role des ions calcium durant l'hydrolyse des triglycerides

insolubles par la lipase pancreatique en presence de sels biliares." Biochimica et Biophysica

Acta (BBA)-Enzymology 151(1): 137-146.

Berridge, M. J., Bootman, M. D. and Roderick, H. L. (2003). "Calcium signalling: dynamics,

homeostasis and remodelling." Nature Reviews Molecular cell biology 4(7): 517-529.

Bhardwaj, P. and Yadav, R. (2013). "Chronic pancreatitis: role of oxidative stress and

antioxidants." Free Radical Research 47(11): 941-949.

Bhatt, D., Vyas, K., Singh, S., John, P. and Soni, I. (2018). "Tartrazine induced

neurobiochemical alterations in rat brain sub-regions." Food and Chemical Toxicology 113:

322-327.

Boeris, V., Romanini, D., Farruggia, B. and Picó, G. (2009). "Purification of chymotrypsin

from bovine pancreas using precipitation with a strong anionic polyelectrolyte." Process

Biochemistry 44(5): 588-592.

Bonnin, P. (2002). Les affections du pancréas exocrine chez le chat. Ecole Nationale

Veterinaire d’Alfort. Créteil-Paris, La faculté de médecine de Créteil.

Borgström, B. (1975). "On the interactions between pancreatic lipase and colipase and the

substrate, and the importance of bile salts." Journal of Lipid Research 16(6): 411-417.

Borgström, B. and Brockman, H. L. (1984). Pancreatic lipase. Lipases. New York, Elsevier

Science Limited: 84-150.

Page 109: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

92

Bourrier, T. (2006). "Intolérances et allergies aux colorants et additifs." Revue Française

d'Allergologie et d'Immunologie Clinique 46(2): 68-79.

Boussada, M., Lamine, J., Bini, I., Abidi, N., Lasrem, M., El-Fazaa, S. and El-Golli, N.

(2017). "Assessment of a sub-chronic consumption of tartrazine (E102) on sperm and

oxidative stress features in Wistar rat." International Food Research Journal 24(4): 1473-

1481.

Bradford, M. M. (1976). "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding." Analytical Biochemistry

72(1): 248-254.

Brandon, E. F., Oomen, A. G., Rompelberg, C. J., Versantvoort, C. H., van Engelen, J. G. and

Sips, A. J. (2006). "Consumer product in vitro digestion model: bioaccessibility of

contaminants and its application in risk assessment." Regulatory Toxicology and

Pharmacology 44(2): 161-171.

Brogström, B. and Hildebrand, H. (1975). "Lipase and co-lipase activities of human small

intestinal contents after a liquid test meal." Scandinavian Journal of Gastroenterology 10(6):

585-591.

Buddington, R. K. and Diamond, J. M. (1989). "Ontogenetic development of intestinal

nutrient transporters." Annual Review of Physiology 51(1): 601-617.

Buisson, G., Duee, E., Haser, R. and Payan, F. (1987). "Three dimensional structure of

porcine pancreatic alpha-amylase at 2.9 A resolution. Role of calcium in structure and

activity." The EMBO Journal 6(13): 3909-3916.

Buscail, L. and Carrière, F. (2010). "Physiopathologie de l'insuffisance pancréatique exocrine

et ses implications thérapeutiques." Hépato-Gastro & Oncologie Digestive 17(2): 135-144.

C., J. E. (2012). "The Basics of Western Blotting." The Anatomical Record 295(3): 369-371.

Page 110: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

93

Cabanas, H. (2016). Rôle de la signalisation calcique dans la leucémie myéloïde chronique.

École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé Poitiers, Université de Poitiers.

Castillo-Vaquero, D., Salido, G. M. and Gonzalez, A. (2010). "Melatonin induces calcium

release from CCK-8 and thapsigargin sensitive cytosolic stores in pancreatic AR42J cells."

Journal of Pineal Research 49(3): 256-263.

Cemek, M., Büyükokuroğlu, M. E., Sertkaya, F., Alpdağtaş, S., Hazini, A., Önül, A. and

Göneş, S. (2014). "Effects of food color additives on antioxidant functions and bioelement

contents of liver, kidney and brain tissues in rats." Journal of Food and Nutrition Research

2(10): 686-691.

Chaguer, M. (2007). Analyse, synthèse et étude solvatochromique de composés tinctoriaux.

Département de Chimie. Constantine, Université Mentouri de Constantine.

Chen, J., Anderson, J. B., DeWeese-Scott, C., Fedorova, N. D., Geer, L. Y., He, S., Hurwitz,

D. I., Jackson, J. D., Jacobs, A. R. and Lanczycki, C. J. (2003). "MMDB: Entrez's 3D-

structure database." Nucleic Acids Research 31(1): 474-477.

Christophe, J. (1994). "Pancreatic tumoral cell line AR42J: an amphicrine model." American

Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology 266(6): 963-971.

Chung, K.-T., Stevens, S. E. and Cerniglia, C. E. (1992). "The Reduction of Azo Dyes by the

Intestinal Microflora." Critical Reviews in Microbiology 18(3): 175-190.

Cingöz, A. (2009). Analyse d'une protéine ciblée par immunoaffinité et digestion sur micro-

réacteur enzymatique couplés en ligne à une analyse par chromatographie liquide et

spectrométrie de masse: synthèse, caractérisation et miniaturisation des outils bioanalytiques.

Chimie. Paris, Université Pierre et Marie Curie (Paris VI).

Circu, M. L. and Aw, T. Y. (2010). "Reactive oxygen species, cellular redox systems, and

apoptosis." Free Radical Biology and Medicine 48(6): 749-762.

Page 111: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

94

Clapham, D. E. (2007). "Calcium signaling." Cell 131(6): 1047-1058.

Cunningham, L. W. (1954). "Molecular-kinetic properties of crystalline diisopropyl

phosphoryl trypsin." Journal of Biological Chemistry 211(1): 13-19.

de Aragão Umbuzeiro, G., Freeman, H., Warren, S. H., Kummrow, F. and Claxton, L. D.

(2005). "Mutagenicity evaluation of the commercial product CI Disperse Blue 291 using

different protocols of the Salmonella assay." Food and Chemical Toxicology 43(1): 49-56.

De Caro, J., Carrière, F., Barboni, P., Giller, T., Verger, R. and De Caro, A. (1998).

"Pancreatic lipase-related protein 1 (PLRP1) is present in the pancreatic juice of several

species." Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology

1387(1): 331-341.

De Caro, J., Sias, B., Grandval, P., Ferrato, F., Halimi, H., Carrière, F. and De Caro, A.

(2004). "Characterization of pancreatic lipase-related protein 2 isolated from human

pancreatic juice." Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics 1701(1):

89-99.

Demers, D. (2010). Optimisation de méthodes chromogéniques pour l'évaluation d'enzymes

pancréatiques en milieu pharmaceutique. Chimie. Montréal, Université du Québec à

Montréal.

Demirkol, O., Zhang, X. and Ercal, N. (2012). "Oxidative effects of Tartrazine (CAS No.

1934-21-0) and New Coccin (CAS No. 2611-82-7) azo dyes on CHO cells." Journal of

Consumer Protection and Food Safety 7(3): 229-236.

Despopoulos, A. and Silbernagl, S. (2003). Nutrition and digestion. Color Atlas of

Physiology. New York, Thieme: 226-265.

Dixit, S., Purshottam, S., Khanna, S. and Das, M. (2011). "Usage pattern of synthetic food

colours in different states of India and exposure assessment through commodities

Page 112: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

95

preferentially consumed by children." Food Additives & Contaminants: Part A 28(8): 996-

1005.

Dugo, L., Negis, Y. and Azzi, A. (2011). Antioxidants. Encyclopedia of Life Sciences (eLS).

United Kingdom, Wiley.

Dutau, G., Rancé, F., Fejji, S., Juchet, A., Brémont, F. and Nouilhan, P. (1996). "Intolérance

aux additifs alimentaires chez l'enfant: mythe ou réalité?" Revue Française d'Allergologie et

d'Immunologie Clinique 36(2): 129-142.

EC (2001). Report from the Commission on Dietary Food Additive Intake in the European

Union. Commission of the European Communities. Brussels, COM: 23.

EFSA (2009). Scientific Opinion on the reevaluation Tartrazine (E 102) on request from the

European Commission. Panel on Food Additives and Nutrient Sources added to Food (ANS).

Italy: 8.

El-Desoky, G., Abdel-Ghaffar, A., Al-Othman, Z., Habila, M., Al-Sheikh, Y., Ghneim, H.,

Giesy, J. and Aboul-Soud, M. (2017). "Curcumin protects against tartrazine-mediated

oxidative stress and hepatotoxicity in male rats." European Review for Medical and

Pharmacological Sciences 21: 635-645.

El-Tohamy, M. M. (2012). "The mechanisms by which oxidative stress and free radical

damage produces male infertility." Life Sci J 9(1): 674-688.

El-Wahab, H. M. F. A. and Moram, G. S. E.-D. (2013). "Toxic effects of some synthetic food

colorants and/or flavor additives on male rats." Toxicology and Industrial Health 29(2): 224-

232.

El Golli, N. (2016). "Toxicity Induced after Subchronic Administration of the Synthetic Food

Dye Tartrazine in Adult Rats, Role of Oxidative Stress." Recent Advances in Biology and

Medicine 2: 20-28.

Page 113: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

96

Elhkim, M. O., Héraud, F., Bemrah, N., Gauchard, F., Lorino, T., Lambré, C., Frémy, J. M.

and Poul, J.-M. (2007). "New considerations regarding the risk assessment on Tartrazine: an

update toxicological assessment, intolerance reactions and maximum theoretical daily intake

in France." Regulatory Toxicology and Pharmacology 47(3): 308-316.

Eydoux, C., De Caro, J., Ferrato, F., Boullanger, P., Lafont, D., Laugier, R., Carrière, F. and

De Caro, A. (2007). "Further biochemical characterization of human pancreatic lipase-related

protein 2 expressed in yeast cells." Journal of Lipid Research 48(7): 1539-1549.

Ezeuko , V. C., Nwokocha Chukwuemeka, R., Mounmbegna Philippe, E. and Nriagu

Chinonso, C. (2007). "Effects of Zingiber officinale on liver function of mercuric chloride-

induced hepatotoxicity in adult Wistar rats." Electron J Biomed 3: 40-45.

Faulk, C., Benninghoff, A. D. and Holt, G. (2007). "Ontogeny of the gastrointestinal tract and

selected digestive enzymes in cobia Rachycentron canadum (L.)." Journal of Fish Biology

70(2): 567-583.

Fernández-Sánchez, M., del Castillo-Vaquero, A., Salido, G. M. and González, A. (2009).

"Ethanol exerts dual effects on calcium homeostasis in CCK-8-stimulated mouse pancreatic

acinar cells." BMC Cell Biology 10(77): 1-11.

Fickers, P., Destain, J. and Thonart, P. (2008). "Les lipases sont des hydrolases atypiques:

principales caractéristiques et applications." Biotechnology, Agronomy, Society and

Environment 12(2): 119-130.

FSA (2007). Guidelines on approaches to the replacement of Tartrazine, Allura Red, Ponceau

4R, Quinoline Yellow, Sunset Yellow and Carmoisine in food and beverages. Food Standards

Agency in Scotland. Scotland: 4.

Furukawa, I., Kurooka, S., Arisue, K., Kohda, K. and Hayashi, C. (1982). "Assays of serum

lipase by the" BALB-DTNB method" mechanized for use with discrete and continuous-flow

analyzers." Clinical Chemistry 28(1): 110-113.

Page 114: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

97

Gallen, C. and Pla, J. (2013). "Allergie et intolérance aux additifs alimentaires." Revue

Francaise d'Allergologie 53: 9-18.

Gamet, Y. (2006). "Physiologie du pancréas." Pratique Médicale & Chirurgicale de l'Animal

de Compagnie 41(4): 165-169.

Gao, Y., Li, C., Yin, H., An, X. and Jin, H. (2011). "Effect of food azo dye tartrazine on

learning and memory functions in mice and rats, and the possible mechanisms involved."

Journal of Food Science 76(6): 125-129.

García, A. G., García-De-Diego, A. M., Gandía, L., Borges, R. and García-Sancho, J. (2006).

"Calcium signaling and exocytosis in adrenal chromaffin cells." Physiological Reviews 86(4):

1093-1131.

Gerasimenko, J., Peng, S., Tsugorka, T. and Gerasimenko, O. (2017). "Ca2+ signalling

underlying pancreatitis." Cell Calcium 70: 95-101.

Gerasimenko, O. V. and Gerasimenko, J. V. (2012). "Mitochondrial function and malfunction

in the pathophysiology of pancreatitis." Pflügers Archiv-European Journal of Physiology

464(1): 89-99.

Ghonimi, W. A. and Elbaz, A. (2015). "Histological Changes of Selected Westar Rat Tissues

Following the Ingestion of Tartrazine With Special Emphasis on the Protective Effect of

Royal Jelly and Cod Liveroil." Journal of Cytology & Histology 6(4): 1-6.

Ghoreishi, S. M., Behpour, M. and Golestaneh, M. (2012). "Simultaneous determination of

sunset yellow and tartrazine in soft drinks using gold nanoparticles carbon paste electrode."

Food Chemistry 132(1): 637-641.

Giller, T., Buchwald, P., Blum-Kaelin, D. and Hunziker, W. (1992). "Two novel human

pancreatic lipase related proteins, hPLRP1 and hPLRP2. Differences in colipase dependence

and in lipase activity." Journal of Biological Chemistry 267(23): 16509-16516.

Page 115: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

98

Goldenring, J., Batter, D. and Shaywitz, B. (1982). "Sulfanilic acid: behavioral change related

to azo food dyes in developing rats." Neurobehavioral Toxicology and Teratology 4(1): 43-

49.

Golding, M. and Wooster, T. J. (2010). "The influence of emulsion structure and stability on

lipid digestion." Current Opinion in Colloid & Interface Science 15(1): 90-101.

González, A., Granados, M. a. P., Salido, G. M. and Pariente, J. A. (2003). "Changes in

mitochondrial activity evoked by cholecystokinin in isolated mouse pancreatic acinar cells."

Cellular Signalling 15(11): 1039-1048.

Gonzalez, A. and Salido, G. M. (2016). "Determination of reactive oxygen species production

in pancreatic acinar cells." Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base.

Gonzalez, A., Santofimia-Castaño, P., Rivera-Barreno, R. and Salido, G. M. (2012).

"Cinnamtannin B-1, a natural antioxidant that reduces the effects of H 2 O 2 on CCK-8-

evoked responses in mouse pancreatic acinar cells." Journal of Physiology and Biochemistry

68(2): 181-191.

Gonzalez, A., Santofimia-Castaño, P. and Salido, G. M. (2011). "Culture of pancreatic AR42J

cell for use as a model for acinar cell function." Pancreapedia: The Exocrine Pancreas

Knowledge Base.

Granados, M. a. P., Salido, G. M., Pariente, J. A. and González, A. (2004). "Generation of

ROS in response to CCK-8 stimulation in mouse pancreatic acinar cells." Mitochondrion 3(5):

285-296.

Greluk, M. and Hubicki, Z. (2011). "Efficient removal of Acid Orange 7 dye from water using

the strongly basic anion exchange resin Amberlite IRA-958." Desalination 278(1-3): 219-226.

Grzelak, A., Soszyński, M. and Bartosz, G. (2000). "Inactivation of antioxidant enzymes by

peroxynitrite." Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation 60(4): 253-258.

Page 116: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

99

Guendouz, M., Mehedi, N., Zaoui, C., Saidi, D. and Khéroua, O. (2013). "Immune response

after tartrazine subchronic ingestion in Swiss albino mice." International Journal of Pharmacy

and Pharmaceutical Sciences 5(2): 584-592.

Guerra, A., Etienne-Mesmin, L., Livrelli, V., Denis, S., Blanquet-Diot, S. and Alric, M.

(2012). "Relevance and challenges in modeling human gastric and small intestinal digestion."

Trends in Biotechnology 30(11): 591-600.

Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswami, V. K. and Chauhan, B. (2003). "Microbial α-

amylases: a biotechnological perspective." Process Biochemistry 38(11): 1599-1616.

Ha, M.-S., Ha, S.-D., Choi, S.-H. and Bae, D.-H. (2013). "Exposure assessment of synthetic

colours approved in Korea." Food Additives & Contaminants: Part A 30(4): 643-653.

Haleng, J., Pincemail, J., Defraigne, J.-O., Charlier, C. and Chapelle, J.-P. (2007). "Le stress

oxydant." Revue Medicale de Liege 62(10): 628-638.

Hammami, S. (2008). Étude de dégradation des colorants de textile par les procédés

d'oxydation avancée. Application à la dépollution des rejets industriels. Faculté des Sciences

de Tunis. Tunis, Université Tunis El Manar.

Hassan, G. (2010). "Effects of some synthetic coloring additives on DNA damage and

chromosomal aberrations of rats." Arab J Biotech 13(1): 13-24.

Hayder, H., Mueller, U. and Bartholomaeus, A. (2011). "Examen des Réactions D’intolérance

aux Aliments et aux Additifs Alimentaires." International Food Risk Analysis Journal 1(2):

25-36.

Hedstrom, L. (2002). "Serine protease mechanism and specificity." Chemical Reviews

102(12): 4501-4524.

Henroteaux, M. (1996). "L’atrophie pancréatique juvénile canine." Point Vét. Nspécial

«Affections Héréditaires et Congénitales des Carnivores Domestiques 28: 535-537.

Page 117: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

100

Herdt, T. and Sayegh, A. (2002). "Regulation of gastrointestinal function." Textbook of

veterinary physiology. Philadelphia, PA: WB Saunders: 222-229.

Himri, I., Bellahcen, S., Souna, F., Belmekki, F., Aziz, M., Bnouham, M., Zoheir, J., Berkia,

Z., Mekhfi, H. and Saalaoui, E. (2011). "A 90-day oral toxicity study of tartrazine, a synthetic

food dye, in wistar rats." International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(3):

159-169.

Hissin, P. J. and Hilf, R. (1976). "A fluorometric method for determination of oxidized and

reduced glutathione in tissues." Analytical Biochemistry 74(1): 214-226.

Hur, S. J., Lim, B. O., Decker, E. A. and McClements, D. J. (2011). "In vitro human digestion

models for food applications." Food Chemistry 125(1): 1-12.

Husain, A., Sawaya, W., Al-Omair, A., Al-Zenki, S., Al-Amiri, H., Ahmed, N. and Al-Sinan,

M. (2006). "Estimates of dietary exposure of children to artificial food colours in Kuwait."

Food Additives & Contaminants 23(3): 245-251.

Hyardin, A., Cuny, A. and Méjean, L. (2007). "La fonctionnalité alimentaire: illusion

aujourd’hui, réalité demain." Cahiers de Nutrition et de Diététique 42(3): 146-152.

Issa, N. (2009). Étude de l'oxydation de différents composés phénoliques par la laccase de

Myceliophtora thermophila: application à la fonctionnalisation du chitosane. Ecole Doctorale

Ressources Procédés Produits Environnement. Vandoeuvre-les-Nancy, INPL.

Iulek, J., Franco, O. L., Silva, M., Slivinski, C. T., Bloch, C., Rigden, D. J. and de Sá, M. F.

G. (2000). "Purification, biochemical characterisation and partial primary structure of a new

α-amylase inhibitor from Secale cereale (rye)." The International Journal of Biochemistry &

Cell Biology 32(11): 1195-1204.

JECFA (1964). Specifications for the identity and purity of food additives and their

toxicological evaluation: food colours and some antimicrobials and antioxidants, eighth report

Page 118: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

101

of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives 8-17 December. Geneva, World

Health Organization.

JECFA (2016). Compendium of food additive specifications: eighty-second report of the Joint

FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Rome, FAO JECFA Monographs.

Jiang, Z., Zhou, Y., Lu, F., Han, Z. and Wang, T. (2008). "Effects of different levels of

supplementary alpha-amylase on digestive enzyme activities and pancreatic amylase mRNA

expression of young broilers." Asian Australasian Journal of Animal Sciences 21(1): 97-102.

Jones, R., Ryan, A. and Wright, S. (1964). "The metabolism and excretion of tartrazine in the

rat, rabbit and man." Food and Cosmetics Toxicology 2: 447-452.

Joshi, D. C. and Bakowska, J. C. (2011). "Determination of Mitochondrial Membrane

Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons." Journal of Visualized

Experiments : JoVE(51): 2704.

Kamel, M. M. and El-lethey, H. S. (2011). "The potential health hazard of tartrazine and

levels of hyperactivity, anxiety-like symptoms, depression and anti-social behaviour in rats."

Journal of American Science 7(6): 1211-1218.

Keller, J. and Layer, P. (2005). "Human pancreatic exocrine response to nutrients in health

and disease." Gut 54(6): 1-28.

Keller, J. and Layer, P. (2014). "The pathophysiology of malabsorption." Visceral Medicine

30(3): 150-154.

Khayyat, L., Essawy, A., Sorour, J. and Soffar, A. (2017). "Tartrazine induces structural and

functional aberrations and genotoxic effects in vivo." PeerJ 5: 30-41.

Kim, E., Susan, M., Scott, B. and Heddwen, L. B. (2010). Gastrointestinal Physiology.

Ganong’s review of medical physiology. United States, McGraw-Hill: 429-486.

Page 119: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

102

Kishimura, H. and Hayashi, K. (2002). "Isolation and characteristics of trypsin from pyloric

ceca of the starfish Asterina pectinifera." Comparative Biochemistry and Physiology Part B:

Biochemistry and Molecular Biology 132(2): 485-490.

Kleinman, R. E., Brown, R. T., Cutter, G. R., DuPaul, G. J. and Clydesdale, F. M. (2011). "A

research model for investigating the effects of artificial food colorings on children with

ADHD." Pediatrics 127(6): 1575-1584.

Kobylewski, S. and Jacobson, M. F. (2010). Food dyes: A rainbow of risks. USA, Center for

Science in the Public Interest: 33.

Koolman, J. and Roehm, K.-H. (2005). Digestion: overview. Color Atlas of Biochemistry.

New York, Thieme Stuttgart: 266.

Korkmaz, A., Reiter, R. J., Topal, T., Manchester, L. C., Oter, S. and Tan, D.-X. (2009).

"Melatonin: an established antioxidant worthy of use in clinical trials." Molecular Medicine

15(1-2): 43-50.

Kuznetsov, A. V., Margreiter, R., Amberger, A., Saks, V. and Grimm, M. (2011). "Changes

in mitochondrial redox state, membrane potential and calcium precede mitochondrial

dysfunction in doxorubicin-induced cell death." Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-

Molecular Cell Research 1813(6): 1144-1152.

Lairon, D., Nalbone, G., Lafont, H., Leonardi, J., Vigne, J.-L., Chabert, C., Hauton, J. C. and

Verger, R. (1980). "Effects of bile lipids on the adsorption and activity of pancreatic lipase on

triacylglycerol emulsions." Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid

Metabolism 618(1): 119-128.

Lamy, V. (2009). Étude des propriétés anti-cancéreuses des Lupulones, micro constituants

spécifiques du houblon: Aspects cellulaires et physiologiques. Ecole Doctorale des Science de

la Vie et de la Santé. Strasbourg, Université de Strasbourg.

Page 120: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

103

Layer, P. and Keller, J. (1999). "Pancreatic enzymes: secretion and luminal nutrient digestion

in health and disease." Journal of Clinical Gastroenterology 28(1): 3-10.

Layer, P. and Keller, J. (2005). "Gastric lipase and pancreatic exocrine insufficiency."

Clinical Gastroenterology and Hepatology 3(1): 25-27.

Lecleire, S. (2008). "Digestion et absorption des nutriments." Cahiers de Nutrition et de

Diététique 43(1): 45-50.

Lemieux, H. (1998). Les limites physiologiques de la croissance et de l'efficacité de

conversion des aliments chez la morue franche (gadus morhua). Biologie. Trois-rivières,

Université du Québec à Trois-rivières.

Lengsfeld, H., Beaumier-Gallon, G., Chahinian, H., De Caro, A., Verger, R., Laugier, R. and

Carrière, F. (2005). Physiology of Gastrointestinal Lipolysis and Therapeutical Use of Lipases

and Digestive Lipase Inhibitors. Lipases and Phospholipases in Drug Development, Wiley-

VCH Verlag GmbH & Co. KGaA: 195-229.

Lévy, P. (2006). "Conduite à tenir devant une élévation des enzymes pancréatiques de

découverte fortuite." Gastroentérologie Clinique et Biologique 30(3): 421-426.

Li, Z., Song, S., Xu, L., Kuang, H., Guo, S. and Xu, C. (2013). "Development of an

ultrasensitive immunoassay for detecting tartrazine." Sensors 13(7): 8155-8169.

Light, G., Hudson, L. and Hamiltom, W. (1993). "Atlas of feline anatomy for veterinarians."

Philadelphia: WB Saunders: 135-143.

Lock, J. T., Parker, I. and Smith, I. F. (2015). "A comparison of fluorescent Ca 2+ indicators

for imaging local Ca 2+ signals in cultured cells." Cell Calcium 58(6): 638-648.

Logsdon, C. D. (1986). "Glucocorticoids increase cholecystokinin receptors and amylase

secretion in pancreatic acinar AR42J cells." Journal of Biological Chemistry 261(5): 2096-

2101.

Page 121: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

104

Löhr, J.-M., Oliver, M. R. and Frulloni, L. (2013). "Synopsis of recent guidelines on

pancreatic exocrine insufficiency." United European Gastroenterology Journal 1(2): 79-83.

Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J. (1951). "Protein measurement

with the Folin phenol reagent." Journal of Biological Chemistry 193(1): 265-275.

Mahmood, T. and Yang, P.-C. (2012). "Western blot: technique, theory, and trouble

shooting." North American Journal of Medical Sciences 4(9): 429-434.

Maldonado-Valderrama, J., Wilde, P., Macierzanka, A. and Mackie, A. (2011). "The role of

bile salts in digestion." Advances in Colloid and Interface Science 165(1): 36-46.

Marcil, V., Peretti, N., Delvin, E. and Levy, E. (2004). "Les processus digestifs et absorptifs

des lipides alimentaires." Gastroentérologie Clinique et Biologique 28(12): 1257-1266.

Martin, D., Nieto‐Fuentes, J. A., Señoráns, F. J., Reglero, G. and Soler‐Rivas, C. (2010).

"Intestinal digestion of fish oils and ω‐3 concentrates under in vitro conditions." European

Journal of Lipid Science and Technology 112(12): 1315-1322.

Maruyama, Y. and Petersen, O. (1994). "Delay in granular fusion evoked by repetitive

cytosolic Ca2+ spikes in mouse pancreatic acinar cells." Cell Calcium 16(5): 419-430.

Mátrai, J., Verheyden, G., Krüger, P. and Engelborghs, Y. (2004). "Simulation of the

activation of α-chymotrypsin: Analysis of the pathway and role of the propeptide." Protein

Science : A Publication of the Protein Society 13(12): 3139-3150.

McCann, D., Barrett, A., Cooper, A., Crumpler, D., Dalen, L., Grimshaw, K., Kitchin, E.,

Lok, K., Porteous, L. and Prince, E. (2007). "Food additives and hyperactive behaviour in 3-

year-old and 8/9-year-old children in the community: a randomized, double-blinded, placebo-

controlled trial." The lancet 370: 1560-1567.

Page 122: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

105

Mehedi, N., Ainad-Tabet, S., Mokrane, N., Addou, S., Zaoui, C., Kheroua, O. and Saidi, D.

(2009). "Reproductive toxicology of tartrazine (FD and C Yellow No. 5) in Swiss albino

mice." American Journal of Pharmacology and Toxicology 4(4): 130-135.

Mehedi, N., Mokrane, N., Alami, O., Ainad-Tabet, S., Zaoui, C., Kheroua, O. and Saidi, D.

(2013). "A thirteen week ad libitum administration toxicity study of tartrazine in Swiss mice."

African Journal of Biotechnology 12(28): 4519-4529.

Ménard, O. and Dupont, D. (2014). "Atouts et limites des modèles de digestion gastro-

intestinale: de l'in vitro à l'in vivo." Innovations Agronomiques 36: 27-41.

Migdal, C. and Serres, M. (2011). "Espèces réactives de l’oxygène et stress oxydant." M/S

Revues 27: 405-412.

Minekus, M., Alminger, M., Alvito, P., Ballance, S., Bohn, T., Bourlieu, C., Carriere, F.,

Boutrou, R., Corredig, M., Dupont, D., Dufour, C., Egger, L., Golding, M., Karakaya, S.,

Kirkhus, B., Le Feunteun, S., Lesmes, U., Macierzanka, A., Mackie, A., Marze, S.,

McClements, D. J., Menard, O., Recio, I., Santos, C. N., Singh, R. P., Vegarud, G. E.,

Wickham, M. S. J., Weitschies, W. and Brodkorb, A. (2014). "A standardised static in vitro

digestion method suitable for food - an international consensus." Food & Function 5(6): 1113-

1124.

Missiaen, L., Robberecht, W., Van Den Bosch, L., Callewaert, G., Parys, J., Wuytack, F.,

Raeymaekers, L., Nilius, B., Eggermont, J. and De Smedt, H. (2000). "Abnormal intracellular

Ca2+ homeostasis and disease." Cell Calcium 28(1): 1-21.

Missiaen, L., Van Acker, K., Van Baelen, K., Raeymaekers, L., Wuytack, F., Parys, J., De

Smedt, H., Vanoevelen, J., Dode, L. and Rizzuto, R. (2004). "Calcium release from the Golgi

apparatus and the endoplasmic reticulum in HeLa cells stably expressing targeted aequorin to

these compartments." Cell Calcium 36(6): 479-487.

Page 123: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

106

Mittal, A., Kurup, L. and Mittal, J. (2007). "Freundlich and Langmuir adsorption isotherms

and kinetics for the removal of Tartrazine from aqueous solutions using hen feathers." Journal

of Hazardous Materials 146(1-2): 243-248.

Monostori, P., Wittmann, G., Karg, E. and Túri, S. (2009). "Determination of glutathione and

glutathione disulfide in biological samples: An in-depth review." Journal of Chromatography

B 877(28): 3331-3346.

Morales, A. E., Perez-Jimenez, A., Hidalgo, M. C., Abellán, E. and Cardenete, G. (2004).

"Oxidative stress and antioxidant defenses after prolonged starvation in Dentex dentex liver."

Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology 139(1-3):

153-161.

Mößeler, A. and Kamphues, J. (2017). "Black‐Box Gastrointestinal Tract—Needs and

Prospects of Gaining Insights of Fate of Fat, Protein, and Starch in Case of Exocrine

Pancreatic Insufficiency by Using Fistulated Pigs." Nutrients 9(2): 1-13.

Moutinho, I., Bertges, L. and Assis, R. (2007). "Prolonged use of the food dye tartrazine

(FD&C yellow n° 5) and its effects on the gastric mucosa of Wistar rats." Brazilian Journal of

Biology 67(1): 141-145.

Mpountoukas, P., Pantazaki, A., Kostareli, E., Christodoulou, P., Kareli, D., Poliliou, S.,

Mourelatos, C., Lambropoulou, V. and Lialiaris, T. (2010). "Cytogenetic evaluation and DNA

interaction studies of the food colorants amaranth, erythrosine and tartrazine." Food and

Chemical Toxicology 48(10): 2934-2944.

Murdoch, R. D., Pollock, I. and Naeem, S. (1987). "Tartrazine induced histamine release in

vivo in normal subjects." Journal of the Royal College of Physicians of London 21(4): 257-

261.

Najjar, A. (2010). Etude quantitative de la sécrétion de lipase, de la lipolyse et du stockage de

lipides chez Yarrowia lipolytica lors de sa croissance en présence d'huile d'olive. Ecole

Page 124: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

107

Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé. Marseille, Université de la Méditerranée

(Aix-Marseille II).

Nassour, J. (2015). Rôle du stress oxydant et des cassures de l’ADN dans l’émergence

néoplasique post-sénescence. Ecole Doctorale Biologie - Santé. Lille, Université du Droit et

de la Santé-Lille II.

Nilsson, M. T., Krajewski, W. W., Yellagunda, S., Prabhumurthy, S., Chamarahally, G. N.,

Siddamadappa, C., Srinivasa, B. R., Yahiaoui, S., Larhed, M. and Karlén, A. (2009).

"Structural basis for the inhibition of Mycobacterium tuberculosis glutamine synthetase by

novel ATP-competitive inhibitors." Journal of Molecular Biology 393(2): 504-513.

Nioi, C. (2013). Extraction et protéolyse de napines de tourteau de colza: influence de l'état

structural de la protéine sur la cinétique de protéolyse, la composition et les fonctionnalités

des hydrolysats. Ecole doctorale Ressources Procédés Produits Environnement (RP2E).

Nancy, Université de Lorraine.

Nojima, Y., Ito, K., Ono, H., Nakazato, T., Bono, H., Yokoyama, T., Sato, R., Suetsugu, Y.,

Nakamura, Y. and Yamamoto, K. (2015). "Superoxide dismutases, SOD1 and SOD2, play a

distinct role in the fat body during pupation in silkworm Bombyx mori." PloS one 10(2): 1-

20.

Nordberg, J. and Arnér, E. S. J. (2001). "Reactive oxygen species, antioxidants, and the

mammalian thioredoxin system1 1This review is based on the licentiate thesis “Thioredoxin

reductase—interactions with the redox active compounds 1-chloro-2,4-dinitrobenzene and

lipoic acid” by Jonas Nordberg, 2001, Karolinska Institute, Stockholm, ISBN 91-631-1064-

4." Free Radical Biology and Medicine 31(11): 1287-1312.

Onyema, O. O., Farombi, E. O., Emerole, G. O., Ukoha, A. I. and Onyeze, G. O. (2006).

"Effect of vitamin E on monosodium glutamate induced hepatotoxicity and oxidative stress in

rats." Indian Journal of Biochemistry and Biophysics 43: 20-24.

Page 125: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

108

OpenStaxCollege (2013). Digestive System Processes and Regulation. Anatomy &

Physiology. Houston, Texas, OpenStax College: 1021-1069.

Otsuki, M. and Williams, J. A. (1982). "Effect of diabetes mellitus on the regulation of

enzyme secretion by isolated rat pancreatic acini." Journal of Clinical Investigation 70(1):

148-156.

Palade, G. (1975). "Intracellular aspects of the process of protein synthesis." Science

189(4200): 347-358.

Papin, J. (2009). Bases moléculaires des défauts sécrétoires des cellules ß pancréatiques lors

de la glucotoxicité. École Doctorale « Sciences de la Vie et de la Santé ». Bordeaux,

Université Bordeaux 1.

Park, M., Park, H. R., Kim, S. J., Kim, M.-S., Kong, K. H., Kim, H. S., Gong, E. J., Kim, M.

E., Kim, H. S. and Lee, B. M. (2009). "Risk assessment for the combinational effects of food

color additives: neural progenitor cells and hippocampal neurogenesis." Journal of

Toxicology and Environmental Health, Part A 72(21-22): 1412-1423.

Parkash, J. and Asotra, K. (2010). "Calcium wave signaling in cancer cells." Life Sciences

87(19-22): 587-595.

Payan, F. (2004). "Structural basis for the inhibition of mammalian and insect α-amylases by

plant protein inhibitors." Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics

1696(2): 171-180.

Peters, L. R. and Raghavan, M. (2011). "ER calcium depletion impacts chaperone secretion,

innate immunity and phagocytic uptake of cells." Journal of Immunology (Baltimore, Md. :

1950) 187(2): 919-931.

Petersen, O. H. (2005). "Ca 2+ signalling and Ca 2+-activated ion channels in exocrine acinar

cells." Cell Calcium 38(3): 171-200.

Page 126: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

109

Petersen, O. H. (2008). "Ca2+‐induced pancreatic cell death: Roles of the endoplasmic

reticulum, zymogen granules, lysosomes and endosomes." Journal of Gastroenterology and

Hepatology 23(1): 31-36.

Petersen, O. H. (2009). "Ca2+ signaling in pancreatic acinar cells: physiology and

pathophysiology." Brazilian Journal of Medical and Biological Research 42(1): 9-16.

Petersen, O. H. (2014). "Calcium signalling and secretory epithelia." Cell Calcium 55(6): 282-

289.

Petersen, O. H. and Tepikin, A. V. (2008). "Polarized Calcium Signaling in Exocrine Gland

Cells." Annual Review of Physiology 70(1): 273-299.

Pezzilli, R. (2009). "Chronic pancreatitis: maldigestion, intestinal ecology and intestinal

inflammation." World Journal of Gastroenterology: WJG 15(14): 1673-1676.

PFA (2004). The Prevention of Food Adulteration Act and Rules. India, Ministry of Health

and Family Welfare.

Pibot, P., Biourge, V., Elliott, D. and Simpson, K. W. (2010). Rôle de la nutrition dans la

pathogénie et la gestion des affections du pancréas exocrine. Encyclopédie de la nutrition

clinique canine. France, Royal Canin: 162-191.

Picariello, G., Mamone, G., Nitride, C., Addeo, F. and Ferranti, P. (2013). "Protein

digestomics: Integrated platforms to study food-protein digestion and derived functional and

active peptides." TrAC Trends in Analytical Chemistry 52: 120-134.

Pieper-Bigelow, C., Strocchi, A. and Levitt, M. D. (1990). "Where does serum amylase come

from and where does it go?" Gastroenterol Clin North Am 19(4): 793-810.

Poul, M., Jarry, G., Elhkim, M. O. and Poul, J.-M. (2009). "Lack of genotoxic effect of food

dyes amaranth, sunset yellow and tartrazine and their metabolites in the gut micronucleus

assay in mice." Food and Chemical Toxicology 47(2): 443-448.

Page 127: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

110

Radder, L. and Le Roux, R. (2005). "Factors affecting food choice in relation to venison: A

South African example." Meat Science 71(3): 583-589.

Rao, P., Bhat, R., Sudershan, R., Krishna, T. and Naidu, N. (2004). "Exposure assessment to

synthetic food colours of a selected population in Hyderabad, India." Food Additives &

Contaminants 21(5): 415-421.

Raposa, B., Pónusz, R., Gerencsér, G., Budán, F., Gyöngyi, Z., Tibold, A., Hegyi, D., Kiss, I.,

Koller, Á. and Varjas, T. (2016). "Food additives: Sodium benzoate, potassium sorbate,

azorubine, and tartrazine modify the expression of NFκB, GADD45α, and MAPK8 genes."

Physiology International (Acta Physiologica Hungarica) 103(3): 334-343.

Rick, W. (1976). Chymotrypsin Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). B. HU. New

York and London, Verlag Chemie. 2: 1006-1012.

Rioux, C. (2009). Stress oxydatif et prévention des maladies chroniques La supplementation

s‟ impose t-elle. Faculté de Médecine. Québec, Université Laval.

Roderick, H. L. and Cook, S. J. (2008). "Ca 2+ signalling checkpoints in cancer: remodelling

Ca 2+ for cancer cell proliferation and survival." Nature Reviews Cancer 8(5): 361-375.

Roussel, A., Yang, Y., Ferrato, F., Verger, R., Cambillau, C. and Lowe, M. (1998). "Structure

and activity of rat pancreatic lipase-related protein 2." Journal of Biological Chemistry

273(48): 32121-32128.

Sahin-Tóth, M. and Szabó, A. (2011). "Expression, purification and activity measurements of

pancreatic proteases." Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base.

Saladin, K. S. (2003). The Digestive System. Anatomy & Physiology: The Unity of Form and

Function, The McGraw−Hill Companies: 940-982.

Santofimia-Castaño, P., Garcia-Sanchez, L., Ruy, D. C., Sanchez-Correa, B., Fernandez-

Bermejo, M., Tarazona, R., Salido, G. M. and Gonzalez, A. (2015). "Melatonin induces

Page 128: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

111

calcium mobilization and influences cell proliferation independently of MT1/MT2 receptor

activation in rat pancreatic stellate cells." Cell Biology and Toxicology 31(2): 95-110.

Santofimia-Castaño, P., Ruy, D. C., Fernandez-Bermejo, M., Salido, G. M. and Gonzalez, A.

(2014). "Pharmacological dose of melatonin reduces cytosolic calcium load in response to

cholecystokinin in mouse pancreatic acinar cells." Molecular and Cellular Biochemistry

397(1-2): 75-86.

Santofimia-Castaño, P., Ruy, D. C., Salido, G. M. and González, A. (2013). "Melatonin

modulates Ca 2+ mobilization and amylase release in response to cholecystokinin octapeptide

in mouse pancreatic acinar cells." Journal of Physiology and Biochemistry 69(4): 897-908.

Sara, B. (2016). Pancréatite et grocesse. Faculté de medecine et de pharmacie Fes, Universite

Sidi Mohammed Ben Abdellah.

Sasaki, Y. F., Kawaguchi, S., Kamaya, A., Ohshita, M., Kabasawa, K., Iwama, K., Taniguchi,

K. and Tsuda, S. (2002). "The comet assay with 8 mouse organs: results with 39 currently

used food additives." Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis

519(1): 103-119.

Satoh, T., Enokido, Y., Aoshima, H., Uchiyama, Y. and Hatanaka, H. (1997). "Changes in

mitochondrial membrane potential during oxidative stress‐induced apoptosis in PC12 cells."

Journal of Neuroscience Research 50(3): 413-420.

Sauvage, C. (2010). "Controverse l’hypersensibilité aux additifs alimentaires est une réalité

clinique: pour." Revue Francaise d'Allergologie 50(3): 288-291.

Sawaya, W., Husain, A., Al-Otaibi, J., Al-Foudari, M. and Hajji, A. (2008). "Colour additive

levels in foodstuffs commonly consumed by children in Kuwait." Food Control 19(1): 98-105.

Saxena, B. and Sharma, S. (2014). "Serological changes induced by blend of sunset yellow,

Metanil yellow and tartrazine in swiss albino rat, Rattus norvegicus." Toxicology

International 21(1): 65-68.

Page 129: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

112

Schenone, A. V., Culzoni, M. J., Marsili, N. R. and Goicoechea, H. C. (2013). "Determination

of tartrazine in beverage samples by stopped-flow analysis and three-way multivariate

calibration of non-linear kinetic-spectrophotometric data." Food Chemistry 138(2-3): 1928-

1935.

Scotter, M. and Castle, L. (2004). "Chemical interactions between additives in foodstuffs: a

review." Food Additives & Contaminants 21(2): 93-124.

Scow, R. O. (1988). "Effect of sodium taurodeoxycholate, CaCl2 and albumin on the action

of pancreatic lipase on droplets of trioleoylglycerol and the release of lipolytic products into

aqueous media." Biochimie 70(9): 1251-1261.

Seeley, R. R., Trent D, S. and Philip, T. (2004). Digestive System. Anatomy and Physiology.

New York, The McGraw−Hill Companies: 860-901.

Sevillano, S., De la Mano, A., De Dios, I., Ramudo, L. and Manso, M. (2003). "Major

pathological mechanisms of acute pancreatitis are prevented by N-acetylcysteine." Digestion

68(1): 34-40.

Sharma, G., Gautam, D. and Goyal, R. (2009). "Tartrazine induced haematological and

serological changes in female Swiss albino mice, Mus musculus." Pharmacologyonline 3:

774-788.

Sharma, S. K. and Hopkins, T. R. (1979). "Activation of bovine chymotrypsinogen A. 3.

Isolation and characterization of. mu.-and. omega.-chymotrypsin." Biochemistry 18(6): 1008-

1013.

Shawish, H. M. A., Ghalwa, N. A., Saadeh, S. M. and El Harazeen, H. (2013). "Development

of novel potentiometric sensors for determination of tartrazine dye concentration in foodstuff

products." Food Chemistry 138(1): 126-132.

Sherwood, M. W., Prior, I. A., Voronina, S. G., Barrow, S. L., Woodsmith, J. D.,

Gerasimenko, O. V., Petersen, O. H. and Tepikin, A. V. (2007). "Activation of trypsinogen in

Page 130: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

113

large endocytic vacuoles of pancreatic acinar cells." Proceedings of the National Academy of

Sciences 104(13): 5674-5679.

Shetty, K. (2006). Food Biotechnology. New York, CRC Taylor & Francis: 1982.

Silbernagl, S. and Despopoulos, A. (2001). Digestion. Atlas de poche de physiologie,

Medecine Science Flammarion: 226-264.

Silva, C., Terra, W., de Sá, M. G., Samuels, R., Isejima, E., Bifano, T. and Almeida, J. (2001).

"Induction of digestive α-amylases in larvae of Zabrotes subfasciatus (Coleoptera: Bruchidae)

in response to ingestion of common bean α-amylase inhibitor 1." Journal of Insect Physiology

47(11): 1283-1290.

Siraki, A. G., Chan, T. S., Galati, G., Teng, S. and O'Brien, P. J. (2002). "N-oxidation of

aromatic amines by intracellular oxidases." Drug Metabolism Reviews 34(3): 549-564.

Soares, B. M., ARAÚJO, T. M. T., RAMOS, J. A. B., Pinto, L. C., Khayat, B. M., Bahia, M.

D. O., Montenegro, R. C., BURBANO, R. M. R. and Khayat, A. S. (2015). "Effects on DNA

repair in human lymphocytes exposed to the food dye tartrazine yellow." Anticancer Research

35(3): 1465-1474.

Stevens, L. J., Kuczek, T., Burgess, J. R., Stochelski, M. A., Arnold, L. E. and Galland, L.

(2013). "Mechanisms of behavioral, atopic, and other reactions to artificial food colors in

children." Nutrition Reviews 71(5): 268-281.

Süslü, İ., Celebier, M. and Altınöz, S. (2007). "Determination of rosuvastatin in

pharmaceutical formulations by capillary zone electrophoresis." Chromatographia 66(1): 65-

72.

Szmola, R., Kukor, Z. and Sahin-Tóth, M. (2003). "Human mesotrypsin is a unique digestive

protease specialized for the degradation of trypsin inhibitors." Journal of Biological

Chemistry 278(49): 48580-48589.

Page 131: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

114

Szyguła, A., Guibal, E., Ruiz, M. and Sastre, A. M. (2008). "The removal of sulphonated azo-

dyes by coagulation with chitosan." Colloids and Surfaces A: Physicochemical and

Engineering Aspects 330(2-3): 219-226.

Taghipoor, M. (2012). Modélisation du transport, de la dégradation et de l’absorption des

aliments dans l’intestin grêle. Unité de Recherche Avicole (INRA-UR 0083). Tours,

Université François Rabelais - Tours.

Tanaka, T. (2006). "Reproductive and neurobehavioural toxicity study of tartrazine

administered to mice in the diet." Food and Chemical Toxicology 44(2): 179-187.

Tanaka, T., Takahashi, O., Oishi, S. and Ogata, A. (2008). "Effects of tartrazine on

exploratory behavior in a three-generation toxicity study in mice." Reproductive Toxicology

26(2): 156-163.

Tapia, J., González, A., Salido, G. and García, L. (1997). "Trypsinogen secretion from the

isolated guinea-pig pancreas in response to secretagogues." Biogenic Amines 13(5): 477-490.

Tapia, J. A., Salido, G. M. and González, A. (2010). "Ethanol consumption as inductor of

pancreatitis." World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics 1(1): 3-8.

Tawfek, N., Amin, H., Abdalla, A. and Fargali, S. (2015). "Adverse effects of some food

additives in adult male albino rats." Current Science International 4(4): 525-537.

TGA (2014). Toxicity of tartrazine Scientific review report. Australia, Therapeutic Goods

Administration (Health Safety Regulation): 10.

Thastrup, O., Cullen, P. J., Drøbak, B., Hanley, M. R. and Dawson, A. P. (1990).

"Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition

of the endoplasmic reticulum Ca2 (+)-ATPase." Proceedings of the National Academy of

Sciences 87(7): 2466-2470.

Page 132: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

115

Tice, R. R., Agurell, E., Anderson, D., Burlinson, B., Hartmann, A., Kobayashi, H., Miyamae,

Y., Rojas, E., Ryu, J. C. and Sasaki, Y. (2000). "Single cell gel/comet assay: guidelines for in

vitro and in vivo genetic toxicology testing." Environmental and Molecular Mutagenesis

35(3): 206-221.

Toledo, M. C. F., Guerchon, M. S. and Ragazzi, S. (1992). "Potential weekly intake of

artificial food colours by 3–14‐year‐old children in Brazil." Food Additives & Contaminants

9(4): 291-301.

Tortora, G. J. and Derrickson, B. (2009). The Digestive System. Principles of Anatomy and

Physiology. United State of America, John Wiley & Sons: 921-968.

Tripathi, M., Dixit, S., Khanna, S. K. and Das, M. (2010). "Intake pattern of synthetic colours

by different age and socio-economic consumer groups of Lucknow, India." International

Journal of Food, Nutrition and Public Health 3(1): 1-19.

Ubezio, P. and Civoli, F. (1994). "Flow cytometric detection of hydrogen peroxide production

induced by doxorubicin in cancer cells." Free Radical Biology and Medicine 16(4): 509-516.

Uhlig, H. (1998). Industrial enzymes and their applications. New York, John Wiley & Sons:

454.

Vaysse, N. (2005). "Physiologie du pancréas exocrine." EMC-Hepato-Gastroenterologie 2(2):

59-74.

Venel, L. (2009). Les affections pancréatiques chez le chat. Ecole Nationale Vétérinaire de

Lyon. Lyon, Université Claude-Bernard - Lyon I.

Vimont, H. B. d. (2008). Additifs alimentaires: Ce que cachent les étiquettes. Paris, Guy

Trédaniel: 30-100.

Visweswaran, B. and Krishnamoorthy, G. (2012). "Oxidative stress by tartrazine in the testis

of Wistar rats." Journal of Pharmacy and Biological Sciences 2(3): 44-49.

Page 133: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

116

Vujasinovic, M., Valente, R., Del Chiaro, M., Permert, J. and Löhr, J. (2017). "Pancreatic

Exocrine Insufficiency in Pancreatic Cancer." Nutrients 9(3): 1-10.

Wang, J., Liu, R. and Qin, P. (2012). "Toxic interaction between acid yellow 23 and trypsin:

spectroscopic methods coupled with molecular docking." Journal of Biochemical and

Molecular Toxicology 26(9): 360-367.

Ward, N. I. (1997). "Assessment of chemical factors in relation to child hyperactivity."

Journal of Nutritional & Environmental Medicine 7(4): 333-342.

Ward, N. I., Soulsbury, K. A., Zettel, V. H., Colquhoun, I. D., Bunday, S. and Barnes, B.

(1990). "The Influence of the Chemical Additive Tartrazine on the Zinc Status of Hyperactive

Children—a Double-blind Placebo-controlled Study." Journal of Nutritional Medicine 1(1):

51-57.

Washabau, r., Xenoulis, p., Steiner, j., Schaer, m., Wiberg, m., Axiak, s. and Hahn, k. (2012).

Pancreas. Canine and Feline Gastroenterology, Elsevier Saunders: 799-848.

Wäsle, B. and Edwardson, J. M. (2002). "The regulation of exocytosis in the pancreatic acinar

cell." Cellular Signalling 14(3): 191-197.

Wen, L., Mukherjee, R., Huang, W. and Sutton, R. (2016). "Calcium signaling, mitochondria

and acute pancreatitis: avenues for therapy." Pancreapedia: The Exocrine Pancreas

Knowledge Base.

Whitcomb, D. C. and Lowe, M. E. (2007). "Human pancreatic digestive enzymes." Digestive

Diseases and Sciences 52(1): 1-17.

White, T., McAlexander, R. and Magee, D. (1963). "The effect of gastric distension on

duodenal aspirates in man." Gastroenterology 44(1): 48-51.

Page 134: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

117

Wickham, M., Faulks, R. and Mills, C. (2009). "In vitro digestion methods for assessing the

effect of food structure on allergen breakdown." Molecular Nutrition & Food Research 53(8):

952-958.

Wickham, M., Wilde, P. and Fillery-Travis, A. (2002). "A physicochemical investigation of

two phosphatidylcholine/bile salt interfaces: implications for lipase activation." Biochimica et

Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1580(2): 110-122.

Williams, J. A. (2010). "Isolation of rodent pancreatic acinar cells and acini by collagenase

digestion." Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base.

Wong, H. and Schotz, M. C. (2002). "The lipase gene family." Journal of Lipid Research

43(7): 993-999.

Xu, Z., Hu, C., Xia, M., Zhan, X. and Wang, M. (2003). "Effects of dietary

fructooligosaccharide on digestive enzyme activities, intestinal microflora and morphology of

male broilers." Poultry Science 82(6): 1030-1036.

Yamamoto, T. (1995). Enzyme chemistry and molecular biology of amylases and related

enzymes. United State of America, CRC Press: 206.

Zampini, M., Sanabria, D., Phillips, N. and Spence, C. (2007). "The multisensory perception

of flavor: Assessing the influence of color cues on flavor discrimination responses." Food

Quality and Preference 18(7): 975-984.

Zhang, J., Xiao, L., Yang, Y., Wang, Z. and Li, G. (2014). "Lignin binding to pancreatic

lipase and its influence on enzymatic activity." Food Chemistry 149: 99-106.

Zou, Y., Qian, Z.-J., Li, Y., Kim, M.-M., Lee, S.-H. and Kim, S.-K. (2008). "Antioxidant

effects of phlorotannins isolated from Ishige okamurae in free radical mediated oxidative

systems." Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(16): 7001-7009.

Page 135: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Contents lists available at ScienceDirect

Food and Chemical Toxicology

journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodchemtox

Sulfanilic acid increases intracellular free-calcium concentration, inducesreactive oxygen species production and impairs trypsin secretion inpancreatic AR42J cells

Fatma Zohra Ameura,b, Nabila Mehedib, Omar Kherouab, Djamel Saïdib, Gines M. Salidoa,Antonio Gonzaleza,∗

a Institute of Molecular Pathology Biomarkers, University of Extremadura, Caceres, Spainb Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et de Sécurité Alimentaire - Université d'Oran1, Ahmed BenBella, Algeria

A R T I C L E I N F O

Keywords:AR42J cellsCalciumPancreasROSSulfanilic acidTrypsin secretion

A B S T R A C T

We studied the effects of the tartrazine-metabolite sulfanilic acid on the physiology of pancreatic AR42J cells.Sulfanilic acid (1 μM-1 mM) induced a slow and progressive increase in intracellular free-calcium concentrationthat reached a plateau. The effect of sulfanilic acid was not concentration-dependent. Stimulation of cells withthapsigargin (1 μM) after treatment with sulfanilic acid (1mM) induced a smaller Ca2+ response compared withthat obtained with thapsigargin alone. Sulfanilic acid induced a concentration-dependent production of reactiveoxygen species; however, this effect was not Ca2+-dependent. Depolarization of mitochondrial membrane po-tential was observed at the concentration of 1mM sulfanilic acid. In the presence of the compound a decrease inthe GSH/GSSG ratio was observed. A decrease in the expression of superoxide dismutase 2 was noted. Finally,stimulation of cells with CCK-8 led to a concentration-dependent increase of trypsin secretion that was impairedby pretreatment of cells with sulfanilic acid. Preincubation of cells with the antioxidant melatonin (100 μM)reduced the effect of sulfanilic acid on trypsin secretion. We conclude that sulfanilic acid might induce oxidativestress, which could alter Ca2+ signaling and enzyme secretion in pancreatic AR42J cells. This creates a situationpotentially leading to damage of the exocrine pancreas.

1. Introduction

The compound E102 or FD&C Yellow #5, known as tartrazine(PubChem CID: 164825), is a synthetic lemon yellow azo dye used as afood coloring mainly in developing countries as a substitute for saffron(Mehedi et al., 2009). It is also used in some of non-food products suchas soaps and cosmetics; also some medical preparations contain tar-trazine such as vitamin complexes, antiacids, medicinal capsules andcertain prescription drugs (Amin et al., 2010). An acceptable daily in-take (ADI) of 0–7.5mg/kg b.w. was established by Joint FAO/WHOExpert Committee on Food Additives (Wilson and Terry, 1964) andrevised to be 0–10mg/kg b.w. in 2016 (WHO, 2016) while a standardnorm of 300mg per kg of tartrazine in dairy products is permitted.However, the ADI of this compound may be exceeded in part due to

food habits (Amin et al., 2010).The debate about tartrazine is controversial but most of the studies

show a relation between its consumption and health disorders. After theoral ingestion of tartrazine, it can be reduced to free aromatic amines.Sulfanilic acid is the mainly metabolite that results from this reductionat the N=N azo link, which occurs mainly via the gastrointestinal (GI)flora (Elhkim et al., 2007; Moutinho et al., 2007) and possibly bymammalian azo reductase in the intestinal wall or in the liver (deAragão Umbuzeiro et al., 2005). According to Onyema et al. (2006), thebyproducts of such metabolism sometimes become more toxic than theinitial substance. Its consumption can lead to activation of the in-flammatory cascade, impairment of intestinal permeability allowinglarge antigenic molecules to be absorbed, and could lead to cross-re-activities, autoimmunity, and even neurobehavioral disorders (Vojdani

https://doi.org/10.1016/j.fct.2018.07.001Received 22 March 2018; Received in revised form 9 June 2018; Accepted 1 July 2018

∗ Corresponding author. Institute of Molecular Pathology Biomarkers, University of Extremadura, Avenida Universidad s/n, E-10003, Caceres, Spain.E-mail address: [email protected] (A. Gonzalez).

Abbreviations: BAPNA, Nα-Benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride; Dimethyl BAPTA/AM, 1,2-bis(2-amino-5-methylphenoxy) ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl) ester; CCK-8, cholecystokinin octapeptide; [Ca2+]i, intracellular free Ca2+ concentration; CM-H2DCFDA, 5-(and-6)-chloromethyl-2′,7′-dichlorodihydrofluoresceindiacetate, acetyl ester; EGTA, ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'N´-tetraacetic acid; ER, endoplasmic reticulum; GSSG, oxidized glutathione; GSH, reduced glutathione; FCCP,carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone; Fura-2/AM, fura-2 acetoxymethyl ester; H2O2, hydrogen peroxide; ROS, reactive oxygen species; SA, sulfanilic acid; SERCA,sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase; SOD2, superoxide dismutase 2; TMRM, tetramethylrhodamine methyl ester; Tps, thapsigargin

Food and Chemical Toxicology 120 (2018) 71–80

Available online 03 July 20180278-6915/ © 2018 Elsevier Ltd. All rights reserved.

T

Page 136: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

and Vojdani, 2015). A possible link exists between consumption of ar-tificial food coloring, including tartrazine and/or preservatives, andincreased symptoms of attention-deficit hyperactivity disorder amongchildren (McCann et al., 2007). Additional research supports neurotoxicand reproductive effects (Axon et al., 2012; Kamel and El-Lethey, 2011;Park et al., 2009; Tanaka, 2006; Tanaka et al., 2008).

Even though many studies have been carried out to investigate thetoxic effects of tartrazine and its derivatives on health, few ones targetthe digestive system. According to existing studies, tartrazine may in-duce DNA damage in the stomach and colon as well as degenerativechanges in stomach mucosa (Sasaki et al., 2002). However, studies onthe effects of this food-dye and of its derivative sulfanilic acid on theexocrine pancreas are currently lacking. In the present study, we aimedto investigate the effects of the tartrazine derivative compound sulfa-nilic acid on rat pancreatic AR42J cells. Here we show that sulfanilic

acid exerts deleterious actions on cellular physiology, which might bebased on the induction of oxidative stress and the impairment of en-zyme secretion.

2. Material and methods

2.1. Chemicals

Pancreatic AR42J cells were obtained from the Service of AppliedTechniques to Bioscience from the University of Extremadura (STAB-UEx, Badajoz, Spain). Nα-Benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydro-chloride (BAPNA), 1,2-bis(2-amino-5-methylphenoxy) ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl) ester (dimethylBAPTA/AM), bovine serum albumin, (Tyr[SO3H]27) cholecystokininfragment 26–33 amide (CCK-8), cell lysis reagent for cell lysis andprotein solubilization, reduced glutathione, dexamethasone, en-terokinase, ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'N´-tetraaceticacid (EGTA), carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone(FCCP), N-ethylmaleimide, tetramethylrhodamine methyl ester(TMRM), sulfanilic acid, oxidized glutathione, o-Phthalaldehyde, pro-tease inhibitor cocktail (Complete, EDTA-free), Tween®-20, thapsi-gargin and trypsin were obtained from Sigma Chemicals Co. (Madrid,Spain). Fura-2 acetoxylmethyl ester (fura-2/AM), MitoSOX™ Red, andtrypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (trypsin-EDTA) were pur-chased from Life Technologies (Invitrogen, Barcelona, Spain). RPMI1640 medium and fetal bovine serum (FBS) were purchased fromHyClone (Fisher Scientific Inc., Madrid, Spain). Penicillin/streptomycinand L-glutamine were obtained from BioWhittaker (Lonza, Basel,Switzerland). Bradford reagent, Tris/glycine/SDS buffer (10× ) andTris/glycine buffer (10× ) were from Bio-Rad (Madrid, Spain).SignalFire™ ECL Reagent was obtained from Cell Signaling Technology(C-Viral, Madrid, Spain). Anti-alpha-actin antibody was purchased fromSigma Chemicals Co. (Madrid, Spain). Antibody against superoxidedismutase 2 was purchased from Santa Cruz Biotechnology (QuimigenS.L., Madrid, Spain). Goat anti-mouse IgG HRP-conjugate was pur-chased Thermo Fisher Sci. (Fisher Scientific Inc., Madrid, Spain). Allother reagents were of analytical grade.

2.2. Preparation of cell cultures

AR42J cells (passages 8–18) were cultured following previouslydescribed methods (Gonzalez et al., 2011). Briefly, cells were culturedin a RPMI 1640 medium supplemented with 2mM L-glutamine, 10%FBS and an association of antibiotics (0.1 mg/mL streptomycin, 100 IUpenicillin). Cells were maintained in a cell incubator at 37 °C under ahumidified condition of 95% air and 5% CO2. Cells were seeded in cellculture plates (10 cm diameter) at a density of approximately 106 cells/mL or on glass coverslips (≈30000 cells) placed in independent dishes(35mm diameter), and were allowed to grow until confluence wasreached. Forty-eight hours prior to use, cells were incubated in culturemedium supplemented with 100 nM dexamethasone and then the cellswere used for the experiments. In order to increase the number of cellsavailable for the experiments, and to keep a cell population to be usedin other studies, the cells were detached by incubation with Hanks'Balanced Salt Solution containing Trypsin-EDTA and reseeded.

2.3. Determination of changes in intracellular free-calcium concentration

The fluorescent ratiometric Ca2+ indicator fura-2 was employed tomonitor the changes in [Ca2+]c (Santofimia-Castaño et al., 2014a).Fura-2-derived fluorescence closely report changes in [Ca2+]c(Grynkiewicz et al., 1985).

For this purpose, cells were detached and resuspended in aNa–HEPES buffer 1 containing: 130mM NaCl, 4.7mM KCl, 1.3 mMCaCl2, 1 mM MgCl2, 1.2mM KH2PO4, 10mM glucose, 10 mM HEPES,0.2% (w/v) bovine serum albumin and 0.01 trypsin inhibitor (pH=7.4

Fig. 1. Changes in [Ca2+]c in AR42J cells in response to CCK-8 andthapsigargin. (A) Time-courses of changes in fluorescence, related to [Ca2+]c,in fura-2-loaded AR42J cells stimulated with 1 nM CCK-8. (B) The trace shows arepresentative time-course of changes in fluorescence in fura-2-loaded AR42Jcells stimulated with 1 μM thapsigargin (Tps). The horizontal continuous barsindicate the time during which the desired concentration of stimulus was ap-plied to the cells. The experiments were performed in the presence of Ca2+ inthe extracellular medium. Traces are representative of four to five such in-dependent experiments.

F.Z. Ameur et al. Food and Chemical Toxicology 120 (2018) 71–80

72

Page 137: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

adjusted with NaOH). Thereafter, cells were incubated in the presenceof fura-2/AM (4 μM) at room temperature (23–25 °C) for 40min. Oncefinished the incubation with the dye the cell suspension was centrifuged(30× g), the supernatant was discarded and the pellet was resuspendedwith a Na-HEPES buffer 2 containing: 140mM NaCl, 4.7mM KCl, 1 mM

CaCl2, 1.1 mMMgCl2, 10mM Hepes, 10mM glucose (pH adjusted to 7.4with NaOH).

Changes in fluorescence signals were monitored by placing 2mLaliquots of dye-loaded cells into a quartz cuvette in a fluorescencespectrofluorimeter (RF-5001-PC; Shimadzu, Kyoto, Japan). Cells werestirred continuously and maintained at 37 °C. Fluorescence light at 340and 380 nm were employed to alternatively excite the cells, andfluorescence emission was measured at 505 nm. All stimuli were dis-solved in the extracellular Na-HEPES buffer 2, and were added directlyto the cells to yield the final concentration required. Results are ex-pressed as the ratio of fluorescence emitted at both excitation wave-lengths, previously normalized to the basal (resting) fluorescence (n)(where n is the number of independent experiments). The experimentswere carried out employing different batches of cells.

2.4. Determination of reactive oxygen species production

Determination of reactive oxygen species (ROS) generation wasperformed using protocols routinely applied in our lab. Cells were de-tached, resuspended in Na-HEPES buffer 1 and incubated in the pre-sence of MitoSOX™ Red (2.5 μM) for 15min. at 37 °C as previously de-scribed (Santofimia-Castaño et al., 2015). Following loading of cellswith the dye, cells were centrifuged (30× g), resuspended in Na-HEPESbuffer 2 and used immediately. Oxidation of the dye, related to theredox state of cells, was determined by measuring cellular fluorescenceat 510 nm/580 nm (excitation/emission) using an ELISA spectro-fluorimeter (Tecan Infinite M200, Grödig, Austria).

In experiments in which Ca2+-free conditions were used, cells wereloaded with BAPTA by incubating the cells in the presence of 10 μM

Fig. 2. Changes in [Ca2+]c in AR42J cells in response to sulfanilic acid. The traces represent the changes in fluorescence, related to [Ca2+]c, in fura-2-loadedAR42J cells stimulated with 1 μM (A), 10 μM (B), 100 μM (C) or 1mM (D) sulfanilic acid. The horizontal continuous bars indicate the time during which the desiredconcentration of sulfanilic acid was applied to the cells. The experiments were performed in the presence of Ca2+ in the extracellular medium. Traces are re-presentative of six to eight such independent experiments.

Fig. 3. Effect of sulfanilic acind on thapsigargin-evoked calcium mobili-zation. Time-course of changes in [Ca2+]c in fura-2-loaded AR42J cells sti-mulated with 1mM sulfanilic acid and further application of 1 μM thapsigargin(Tps). The horizontal continuous bars indicate the time during which the de-sired concentration of stimulus was applied to the cells. The experiments wereperformed in the presence of Ca2+ in the extracellular medium. Traces arerepresentative of four such independent experiments.

F.Z. Ameur et al. Food and Chemical Toxicology 120 (2018) 71–80

73

Page 138: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

BAPTA/AM during 40min at room temperature. Additionally, Ca2+

was omitted from the extracellular solution and 0.5mM EGTA wasadded. Results are shown as the mean increase of fluorescence ex-pressed in percentage ± SEM (n) with respect to control (non-stimu-lated) cells, where n is the number of independent experiments.

In order to obtain fluorescence images of MitoSOX RedTM-loadedcells, individual coverslips with dye-loaded cells were mounted on anexperimental perfusion chamber, and placed on the stage of an epi-fluorescence inverted microscope (Nikon Diaphot T200, Melville, NY,USA). The cells were continuously superfused with a control Na-HEPESbuffer containing (in mM): 140 NaCl, 4.7 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10Hepes, 10 glucose (pH adjusted to 7.4). Cells were excited with light

from a xenon arc lamp passed through a high-speed monochromator(Polychrome IV, Photonics, Hamamatsu, Japan) at 510 nm.Fluorescence emission (580 nm) was detected using an ORCA Flash 4.0V2 digital CMOS camera (Hamamatsu Photonics-France, Barcelona,Spain) and recorded using HCImage software (Hamamatsu Corp.,Sewickley, PA, USA). Stimuli were dissolved in the extracellular Na-HEPES buffer, and applied directly to the cells in the perfusionchamber. Three different culture preparations were employed in thestudies.

2.5. Determination of mitochondrial membrane potential

Changes in mitochondrial membrane potential (ψm) were recordedusing the dye TMRM as described previously. AR42J cells were in-cubated during 30min in the presence of 50 nm TMRM at 37 °C. Adecrease in TMRM fluorescence reflects depolarization of ψm, becauseof diffusion of the dye to the cytosol (González et al., 2003). No TMRMwas added to the medium after the initial loading period. Followingloading of cells with the dye, cells were centrifuged (30× g), re-suspended in Na-HEPES buffer 2 and used immediately. Changes in ψmwere determined by measuring cellular fluorescence at 543 nm/605 nm(excitation/emission) using an ELISA spectrofluorimeter (Tecan InfiniteM200, Grödig, Austria). Results are given as the mean increase offluorescence expressed in percentage ± SEM (n) with respect to con-trol (non-stimulated) cells, where n is the number of independent ex-periments.

2.6. Determination of glutathione

Reduced (GSH) and oxidized (GSSG) levels of glutathione weredetermined using the method of Hissin and Hilf (1976). After applica-tion of stimuli, cells were washed twice with PBS, detached and re-suspended with 1mL of 25mM Tris-HCl buffer (pH=7.6) containing1% (w/v) Triton X-100 and transferred to Eppendorf vials. The sampleswere placed on ice, sonicated for 10min and kept at −20 °C during5min. Subsequently, the samples were centrifuged (9000× g, at 4 °Cfor 30min), and the supernatants were collected and placed in in-dependent vials. The total protein concentration in each sample wasdetermined following Bradford's method (1976), using bovine serumalbumin as standard. Next, proteins in the supernatant were pre-cipitated by addition of 20% cold trichloroacetic acid. The vials werethen centrifuged (10,000× g for 10min at 4 °C) and kept at −80 °C forlater determination of GSH and GSSG. On the moment of use, samples(50 μL) were incubated with 1mg/mL of the fluorescent reagent ortho-phthalaldehyde (OPT) in a basic (pH 8.0) buffer containing Na-phos-phate (0.1M) and EDTA (5mM). Previous to the determination ofGSSG, N-ethylmaleimide (40mM) and NaOH (1M; volume to reach pH12) were added. The reaction mixture was incubated during 45min at20 °C. Afterwards, 200 μL of the reaction mixture were transferred tothe wells in a black 96 well plate. The presence of GSH or GSSG wasdetermined by measuring fluorescence at 350 nm/420 nm (excitation/emission) using a spectrofluorimeter (Tecan Infinite M200, Grödig,Austria). Standard curves of GSH (3.20–320 μmol/mL) and GSSG(2.5–80 μmol/mL) were used for quantification. For normalization, theprotein content of each sample was used. The assays were performed intriplicate. A reaction medium without cell extract was employed ascontrol (blank) sample.

GSH and GSSG values (μmol/mg of proteins) were determined andthe ratio GSH/GSSG was calculated. Data are shown as the mean in-crease in GSH/GSSG ratio expressed in percentage ± SEM (n) withrespect to control (non-stimulated) cells, where n is the number of in-dependent experiments.

2.7. Western blotting studies

Cells were incubated with stimuli. Thereafter, cells were detached,

Fig. 4. Effect of sulfanilic acid on reactive oxygen species generation inAR42J cells loaded with the redox-sensitive dye MitoSOXTM Red. AR42Jcells were incubated during 1 h with no stimulus (control) or with differentconcentrations of sulfanilic acid, in the presence (A) or in the absence (B) ofCa2+ in the extracellular medium. Then the effect of sulfanilic acid onMitoSOX™ Red oxidation was studied. Results report the oxidative state oftreated cells compared with that of control (non-stimulated) cells, and arepresented as the mean increase of fluorescence expressed in percentage ± SEMwith respect to control (non-stimulated) cells (*, P < 0.05; **, P < 0.01 vsnon-treated cells; ***, P < 0.001 vs non-treated cells; †, P < 0.05 vs CCK-8 inthe presence of extracellular Ca2+; n= six to seven independent experiments).

F.Z. Ameur et al. Food and Chemical Toxicology 120 (2018) 71–80

74

Page 139: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

centrifuged, washed with a standard phosphate-buffered saline (PBS:137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4; pH ad-justed to 7.4) and sonicated in lysis buffer. For quantification of theprotein content of samples Bradford's method was employed (Bradford,1976). Protein lysates (20 μg/lane) were fractionated by SDS-PAGEusing 10% polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose mem-branes. The membranes were incubated with the specific primary andthe corresponding IgG-HRP conjugated secondary antibody. Results areexpressed as percentage of protein expression ± SEM (n) comparedwith that detected in control (non-stimulated) cells, where n is thenumber of independent experiments. The experiments were carried outemploying different batches of cells, harvested on different days.

2.8. Determination of trypsin secretion

Trypsin secretion was monitored employing previously describedmethods (Tapia et al., 1997) with some modifications. AR42J cells wereseeded onto 24 well plates at a density of 40.000 cells per well and wereallowed to grow for 72 h. Once the cells had been differentiated byincubation in the presence of dexamethasone the cells were incubatedduring 45min at 37 °C with the different stimuli assayed. For the de-tection of trypsin secretion to the supernatant in each well the followingprocedure was used: 150 μL of the supernatant were incubated with50 μL of a solution containing enterokinase from porcine intestine (4units/mL) and BAPNA (1mg/mL). The mixture was then incubated at37 °C during 10min. In the presence of enterokinase the inactiveproenzyme trypsinogen, that will have been secreted by AR42J cells, isconverted to the active enzyme trypsin, and also autocatalytically bythe action of trypsin formed. BAPNA is used as a chromogenic substrate,which will liberate 4-nitroaniline in the presence of trypsin. The releaseof 4-nitroaniline, related to trypsin secretion, was monitored by mea-suring absorbance at 405 nm employing the ELISA spectrofluorimetermentioned above. Each determination (secretion point) was performedin duplicate. The increases in optical density were linearly related withunits of trypsin. Trypsin secretion was calculated employing a calibra-tion curve with known trypsin concentrations. Results are expressed asunits of trypsin (UT) secreted by the cells ± SEM (n), were n is thenumber of independent preparations.

2.9. Statistical analysis

Statistical analysis was performed by one-way analysis of variance(ANOVA) followed by Tukey post hoc test, and only p values < 0.05

Fig. 5. Fluorescence images showing the effect of sulfanilic acid on reactive oxygen species generation in AR42J cells loaded with the redox-sensitive dyeMitoSOXTM Red. Coverslips with dye-loaded cells were mounted on an experimental perfusion chamber and placed on the stage of an epifluorescence invertedmicroscope, as described in Material and methods section. (A) Transmitted light image of cells. (B) Fluorescence image of cells before treatment with sulfanilic acid(1mM). (C) Fluorescence image of the cells taken after incubation during 1 h in the presence of 1mM sulfanilic acid. An increase in fluorescence was detected. Theimages are representative of three independent preparations.

Fig. 6. Effect of sulfanilic acid on mitochondrial membrane potential.AR42J cells were loaded with the mitochondria-specific voltage-sensitive dyeTMRM. The cells were then incubated during 15 min. in the presence of sul-fanilic acid (1 mM, 100 μM, 10 μM or 1 μM). As a control, different batches ofcells were incubated in the presence of the mitochondrial uncoupler FCCP(0.5 μM). Results show the changes in ψm of treated cells compared with non-stimulated (n.e.) cells, and are presented as the mean increase of fluorescenceexpressed in percentage ± SEM with respect to non-stimulated cells (*,P < 0.05 vs non-stimulated cells; n= four independent experiments).

Fig. 7. Effect of sulfanilic acid on glutathione. AR42J were incubated duringone hour in the presence of sulfanilic acid (1 mM, 100 μM, 10 μM or 1 μM), andthe effect on glutathione was analyzed. The bars show the mean increase inGSH/GSSG ratio expressed in percentage ± SEM with respect to control (non-stimulated) cells. Three different cellular preparations were used (n.e., non-stimulated cells; *, P < 0.05; **, P < 0.01).

F.Z. Ameur et al. Food and Chemical Toxicology 120 (2018) 71–80

75

Page 140: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

were considered statistically significant. For individual comparisonsand statistics between individual treatments, we employed Student's t-test, and only p values < 0.05 were considered statistically significant.

3. Results

3.1. Effect of sulfanilic acid on intracellular free-calcium concentration

First, we performed several controls to check Ca2+ mobilization inresponse to compounds known to mobilize Ca2+ in this cell type. Forthis purpose, different batches of cells were stimulated with 1 nM CCK-8or 1 μM thapsigargin (Fig. 1A and B). CCK-8 is a well-known pancreaticsecretagogue that mediates its effects through Ca2+ mobilization (DelCastillo-Vaquero et al., 2010). Following addition of CCK-8 to the cellsa transient increase in [Ca2+]c was detected, which later returned to-wards a stable value over the basal (prestimulation) level, as it has beenpreviously shown. Thapsigargin, in turn, is a potent selective sarcoen-doplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) inhibitor, and increases[Ca2+]c due to depletion of functional Ca2+ stores (Nielsen et al.,1995). When thapsigargin was added to the cells, a transient increase in

[Ca2+]c was noted that then decreased towards a stable level over thebasal.

Next, we incubated AR42J cells with different concentrations ofsulfanilic acid (1 μM, 10 μM, 100 μM or 1mM) in the presence of ex-tracellular Ca2+. The compound led to a progressive increase in[Ca2+]c that reached a plateau over the resting (prestimulation) level.Because the level of fluorescence achieved was similar in the presenceof the different concentrations of sulfanilic acid tested, we can assumethat the effect of the compound on [Ca2+]c was not concentration de-pendent (Fig. 2).

In other set of experiments, cells were stimulated with Tps (1 μM)following prior incubation of cells with 1mM SA. Under these condi-tions, sulfanilic acid induced a progressive increase in [Ca2+]c thattowards a plateau over the prestimulation level. Addition of Tps to thecells in the presence of SA further induced a transient increase in[Ca2+]c, which was smaller compared with the response observed whenTps was added to the cells alone (Fig. 3). These results suggest thatsulfanilic acid evokes mobilization of [Ca2+]c from Tps-sensitive stores.

3.2. Effect of sulfanilic acid on reactive oxygen species production

It has been shown that the synthetic dye tartrazine induces oxida-tive damage and hepatotoxicity (El-Desoky et al., 2017). It is also wellknown that mitochondria serve as the major intracellular source of ROS(Granados et al., 2004). We were interested in checking whether tar-trazine derivative compound sulfanilic acid induced any effect on ROSproduction in our cellular model. For this purpose, different batches ofAR42J cells were loaded with MitoSOX™ Red, a mitochondrial ROSindicator. When the cells were incubated during one hour in the pre-sence of sulfanilic acid (1mM, 100 μM, 10 μM or 1 μM) we observed anincrease in the dye-derived fluorescence, compared with non-stimu-lated cells, reflecting an increase in ROS production. The level of oxi-dation achieved with 1mM sulfanilic acid was slightly higher than thatobserved with the other concentrations of the compound used, althoughthe differences were not statistically significant. In another set of ex-periments cells were incubated in the presence of 1 nM CCK-8, whichalso induced an increase in fluorescence (Fig. 4A).

In order to check whether ROS generation in response to sulfanilicacid was dependent on Ca2+, we performed a series of experiments inwhich AR42J cells were previously loaded with the intracellular Ca2+

chelator dimethyl BAPTA, and challenged with sulfanilic acid in theabsence of extracellular Ca2+ (medium containing 0.5mM EGTA).Under these conditions ROS production evoked by sulfanilic acid didnot differ from that observed in the presence of Ca2+. However, ROSproduction in response to 1 nM CCK-8 was diminished compared withthe response noted in the presence of Ca2+ (Fig. 4B). These resultssuggest that sulfanilic acid-induced ROS production may not be Ca2+-dependent.

In separate sets of experiments individual coverslips with MitoSOXRedTM-loaded cells were mounted on an experimental perfusionchamber, and placed on the stage of an epifluorescence inverted mi-croscope, as described in Materials and methods section. For thesedeterminations we chose the concentration of 1mM sulfanilic acid,because it was the concentration that had evoked the highest ROSgeneration. The cells were incubated with the compound during onehour and fluorescence images of the cells were obtained. In the pre-sence of 1mM sulfanilic acid an increase in fluorescence was detected,which is consistent with an increase in ROS production (Fig. 5).

3.3. Effect of sulfanilic acid of mitochondrial membrane potential

It has been suggested that oxidative stress induces a decrease of ψm(Satoh et al., 1997). In order to analyze whether sulfanilic acid induceschanges in ψm, we performed a series of experiments in which AR42Jcells were loaded with the mitochondria-specific voltage-sensitive dye

Fig. 8. Effect of sulfanilic acid on the expression of superoxide dismutase.(A) Representative blot showing the effect of sulfanilic acid (SA; 1 mM, 100 μM,10 μM or 1 μM) on the level of the mitochondrial antioxidant enzyme SOD2,evaluated with a specific antibody, in AR42J cells. To ensure equal loading ofproteins, the levels of α-actin were employed as controls under the testedconditions. Cells were incubated during 1 h in the absence (n.e.) or in thepresence of the desired concentration of sulfanilic acid. (B) The graph shows thequantification of protein phosphorylation. The experiments shown are re-presentative of three others. Values are the mean ± S.E.M. of normalizedvalues expressed as % of phosphorylation in control (non-stimulated) cells (*,P < 0.05; **, P < 0.01 vs non-stimulated cells).

F.Z. Ameur et al. Food and Chemical Toxicology 120 (2018) 71–80

76

Page 141: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

TMRM. The cells were then incubated during 15min. in the presence ofsulfanilic acid (1mM, 100 μM, 10 μM or 1 μM). We observed a statis-tically significant decrease in ψm in cells treated with 1mM sulfanilicacid. However, no detectable changes in ψm were noted when the cellswere incubated with the other concentrations of sulfanilic acid. As acontrol, different batches of cells were incubated in the presence of themitochondrial uncoupler FCCP (Gonzalez et al., 2003). In the presenceof FCCP (0.5 μM) a statistically significant decrease in ψm was detected(Fig. 6).

3.4. Effect of sulfanilic acid on glutathione levels

The glutathione system includes reduced (GSH) and oxidized(GSSG) forms of glutathione. Glutathione is a critical antioxidant de-fense against oxidative stress (Garcia-Gimenez et al., 2017). Becausesulfanilic acid induced ROS production, we were interested in testingthe effect of the compound on the glutathione system. For this purpose,different batches of cells were incubated during one hour in the pre-sence of different concentrations of sulfanilic acid (1mM, 100 μM,10 μM or 1 μM), and the effect on the levels of GSH and GSSG wasstudied. Sulfanilic acid induced a concentration-dependent decrease inGSH/GSSG ratio, compared with that noted in non-treated (control)cells (Fig. 7). These results show that sulfanilic acid induces changes inthe oxidative state of AR42J cells.

3.5. Effect of sulfanilic acid on superoxide dismutase 2 expression

Superoxide dismutase (SOD) metabolizes superoxide radicals tomolecular oxygen and hydrogen peroxide (Nojima et al., 2015). Mi-tochondrial SOD2 plays a critical role in protecting cells from oxidativestress and cytotoxicity (Fukui and Zhu, 2010). Because we had observedthat sulfanilic acid induces generation of ROS in the mitochondria itwas of interest to analyze the effect of the compound on the expressionof this enzyme.

For this purpose, AR42J cells were incubated for one hour in thepresence of 1mM, 100 μM, 10 μM or 1 μM of sulfanilic acid. Incubationof cells in the presence of compound resulted in a concentration-de-pendent decrease in the expression of SOD2 (Fig. 8).

3.6. Effect of sulfanilic acid on trypsin secretion

AR42J release digestive enzymes following stimulation with cho-lecystokinin (Logsdon, 1986), and secretion is impaired under oxidativestress conditions (Gonzalez et al., 2012). Thus, we were interested inanalyzing whether sulfanilic acid exerts any effect on enzyme secretion,in a search for deleterious actions of the compound on the secretoryprocesses. In this work we analyzed the secretion of the protease en-zyme trypsin in response to CCK-8 and we also tested the two higherconcentrations of sulfanilic acid, alone or in combination with CCK-8.

Fig. 9. Effect of CCK-8 and sulfanilic acid on trypsin secretion in AR42J cells. (A) Concentration-dependent increase in trypsin secretion evoked by CCK-8 inAR42J cells. (B) Effect of sulfanilic acid 1mM (■), sulfanilic acid 100 μM (●) and of the combination of 100 μM melatonin plus 1mM sulfanilic acid (□) on CCK-8-evoked trypsin secretion in AR42J cells. The experiments were performed in the presence of Ca2+ in the extracellular medium. Data show the units of trypsin secretedto the extracellular medium expressed as the mean ± SEM (*, P < 0.05; **, P < 0.01 vs non-stimulated cells; n= four to five independent experiments).

F.Z. Ameur et al. Food and Chemical Toxicology 120 (2018) 71–80

77

Page 142: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Stimulation of pancreatic AR42J cells with CCK-8 (45min incuba-tion) induced a concentration-dependent release of trypsin, reaching amaximum at 10−10 M (Fig. 9A). Incubation of cells for 45min withsulfanilic acid alone (1mM or 100 μM) evoked an increase in trypsinsecretion, compared with non-stimulated (control) cells (Fig. 9B; fullsquares and full circles for 1mM and 100 μM sulfanilic acid respec-tively). When AR42J cells were incubated with CCK-8 in the presence ofsulfanilic acid (1mM or 100 μM) the concentration-dependent effect ofCCK-8 on trypsin secretion was impaired (Fig. 9B).

Because we had observed that sulfanilic acid induced ROS genera-tion, we tested whether the effect of the compound on trypsin secretionwas due to the production of ROS. In this set of experiments AR42J cellswere preincubated for 5min in the presence of 100 μM melatonin, acompound with known antioxidant effects in the exocrine pancreas(Santofimia-Castaño et al., 2015). In the presence of melatonin cellswere then challenged with 1mM sulfanilic acid in combination withCCK-8. Under these experimental conditions the effect of sulfanilic acidon CCK-induced trypsin secretion was reduced (Fig. 9B, open squares).In addition, trypsin secretion was lower in the presence of melatonin,compared with the effect of CCK-8 alone. Our results suggest that theeffect of sulfanilic acid on enzyme secretion evoked by CCK-8 might bedue to ROS generation.

4. Discussion

Colour is one of the most influential factors in the acceptance offood and in eating behavior, and it has been shown to dramaticallyaffect people's perception of a variety of different foods and drinks(Radder and Le Roux, 2005; Zampini et al., 2007). The annual world-wide production of dyes is approximately 800.000 tones and about 50%of these are azo dyes (Szygula et al., 2008). Food dyes are often addedto foodstuffs and drinks in order to supply, intensify or restore theircolour to create the desired coloured appearance (Schenone et al.,2013). However, its consumption may lead to health damage.

Tartrazine is a food-dye worldwide employed. Once in the body it istransformed into its derivative sulfanilic acid. Different studies havereported immunotoxic (Moutinho et al., 2007; Guendouz et al., 2013)and genotoxic effects of this food dye (Khayyat et al., 2017; Sasakiet al., 2002), as well as alterations of the reproductive system (Axonet al., 2012; Mehedi et al., 2009). Furthermore, tartrazine and its me-tabolite sulfanilic acid adversely affect and alter different biochemicalparameters, especially those related to vital organs like liver and kidney(Amin et al., 2010; Sharma et al., 2009; Tawfek et al., 2015). Being thedigestive system a major site of contact of dyes present in food, it was ofinterest to study its action on the physiology of the exocrine pancreas.

The exocrine pancreas is a gland whose secretion participates in thedigestion of food in the intestine. The function of the gland is majorlycontrolled by Ca2+ signals (Petersen, 2014). Moreover, sustained in-creases in the levels of Ca2+ may impair pancreatic physiology andhave been related with diseases affecting the gland (Gerasimenko et al.,2018; Petersen, 2009). In the present work we have shown that sulfa-nilic acid evoked a concentration-dependent increase in [Ca2+]c thatreached an elevated value over the basal. Because sustained elevationsof [Ca2+]c have been related with damage to the pancreas (Petersen,2008), the tartrazine-derivative might potentially damage the gland.

It is well-established that oxidative stress is a factor that contributesto a range of diseases in which an inadequate cytoprotective responseconverts ROS into contributors of cellular dysfunction. The availableresearch points towards oxidative stress as a major cause of the perni-cious actions of tartrazine and its derivatives (Axon et al., 2012; Bhattet al., 2018; Cemek et al., 2014; Visweswaran and Krishnamoorthy,2012). Excessive ROS production has been signaled as a major con-tributor to the diseases affecting the exocrine pancreas (Bhardwaj andYadav, 2013). Here we have shown that sulfanilic acid induces ROSgeneration in the mitochondria. It is well known that mitochondriarepresent the major source of ROS within the cell (Granados et al.,

2004). Moreover, mitochondrial production of ROS plays a funda-mental role in pancreatic pathology (Gerasimenko and Gerasimenko,2012). Interestingly, the effect of sulfanilic acid on ROS productionseemed not to depend on Ca2+ mobilization. This lets us hypothesizethat the tartrazine-derivative might impair mitochondrial physiology,leading to ROS generation which, in turn, might lead to an increase in[Ca2+]c.

Glutathione is a critical antioxidant defense against oxidative stress.The glutathione system is responsible for the detoxification of ROSproduced by xenobiotics. Therefore, depletion of GSH leads to exacer-bation of damage by oxidative stress. A common pathological hallmarkin disorders affecting different tissues and organs in the body is theincrease in oxidative stress and the failure of antioxidant systems, suchas the decrease in the GSH content (Garcia-Gimenez et al., 2017). Herewe show that incubation of cells with sulfanilic acid decreased theavailability of reduced glutathione. Our observations support thecreation of a potential oxidative stress condition in the presence ofsulfanilic acid.

One way that aerobic biological systems counteract the generationof ROS is with SOD proteins, which metabolize superoxide radicals tomolecular oxygen and hydrogen peroxide or scavenge oxygen radicalsproduced by the extensive oxidation-reduction and electron-transportreactions that occur in mitochondria. Mitochondrial SOD is biologicallysignificant to aerobic cells. Its role in protecting the cells against thedeleterious effects of ROS is of major relevance. Therefore, impairmentof this enzyme is of relevance under oxidative stress conditions (Nojimaet al., 2015). Here we show that the expression of SOD2 decreased afterincubation of cells with sulfanilic acid. Our observations support aprobable impairment of mitochondria in the presence of sulfanilic acid.

Mitochondria fulfill a number of essential cellular functions. Theirprimary role is generation of ATP through oxidative phosphorylation.However, as mentioned above, mitochondria are also the major sourceof ROS production. It has been shown that a decrease of ψm is linkedwith an increase in the level of ROS (Satoh et al., 1997). Moreover,changes in mitochondrial redox state and ψm can lead to cell damage(Kuznetsov et al., 2011). We observed a decrease in ψm in cells in-cubated with the highest concentration of sulfanilic acid tested. Ourobservations are in agreement with previously reported data that sup-port a relationship of mitochondrial impairment with oxidative stress.Altogether, our results suggest that sulfanilic acid induces ROS pro-duction in the mitochondria and impairs the antioxidant defenses of thecell. This leads to oxidative stress conditions that might compromisecell function.

We further observed an impairment of trypsin secretion evoked byCCK-8 in the presence of sulfanilic acid. Former studies have proposedthat aberrant secretion of trypsinogen is an important early step in thedevelopment of acute pancreatitis (Sherwood et al., 2007). Our resultssupport a potential harmful action of sulfanilic acid on pancreaticfunction due to its effect on CCK-8-induced enzyme secretion. We havealso shown that the effect of the tartrazine-derivative was decreased bypretreatment with the antioxidant melatonin. In fact, it has been pre-viously shown that treatment with antioxidants potentially protects thepancreas against ROS-induced damage (Sevillano et al., 2003). In thisline, previous studies in our lab showed protective actions of the in-doleamine on pancreatic acinar cells (Santofimia-Castaño et al., 2013,2014b). Our observations thus suggest that the effect of sulfanilic acidon trypsin secretion might be due to the generation of ROS, and supportthe above mentioned effects of the compound on the cellular anti-oxidant system.

5. Conclusion

Our results show that sulfanilic acid exerts deleterious actions onpancreatic AR42J cells, which involve ROS generation in the mi-tochondria and a consequent impairment of antioxidant defenses.Generation of ROS can lead to the release of stored Ca2+ in the ER and

F.Z. Ameur et al. Food and Chemical Toxicology 120 (2018) 71–80

78

Page 143: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

its accumulation in the cytosol. Moreover, treatment of cells with sul-fanilic acid evoked an impairment of trypsin secretion. Altogether, theactions of sulfanilic acid on cell physiology might create a situationpotentially prone to the development of illness in the exocrine pancreas.

Conflicts of interest

The authors declare that there is no conflict of interest.

Acknowledgments

Funding for this study was partly provided by Junta deExtremadura-FEDER (IB16006) and Ministerio de Economía yCompetitividad (BFU 2016–79259-R; UNEX13-1E-1608). The fundingsource(s) had no role in study design, in the collection, analysis andinterpretation of data, in the writing of the report, nor in the decision tosubmit the paper for publication. The authors would like to thank Mrs.Mercedes Gomez and Ana María Moreno for their valuable technicalassistance.

Transparency document

Transparency document related to this article can be found online athttp://dx.doi.org/10.1016/j.fct.2018.07.001.

References

Amin, K., Hameid II, H.A., Elsttar, A.A., 2010. Effect of food azo dyes tartrazine andcarmoisine on biochemical parameters related to renal, hepatic function and oxida-tive stress biomarkers in young male rats. Food Chem. Toxicol. 48, 2994–2999.

Axon, A., May, F.E., Gaughan, L.E., Williams, F.M., Blain, P.G., Wright, M.C., 2012.Tartrazine and sunset yellow are xenoestrogens in a new screening assay to identifymodulators of human oestrogen receptor transcriptional activity. Toxicology 298,40–51.

Bhardwaj, P., Yadav, R.K., 2013. Chronic pancreatitis: role of oxidative stress and anti-oxidants. Free Radic. Res. 47, 941–949.

Bhatt, D., Vyas, K., Singh, S., John, P.J., Soni, I., 2018. Tartrazine induced neurobio-chemical alterations in rat brain sub-regions. Food Chem. Toxicol. 113, 322–327.

Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantization of microgramquantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem. 72,248–254.

Cemek, M., Büyükokuroğlu, M.E., Sertkaya, F., Alpdağtaş, S., Hazini, A., Önül, A., Göneş,S., 2014. Effects of food color additives on antioxidant functions and bioelementcontents of liver, kidney and brain tissues in rats. J. Food Nutr. Res. 2, 686–691.

De Aragão Umbuzeiro, G., Freeman, H., Warren, S.H., Kummrow, F., Claxton, L.D., 2005.Mutagenicity evaluation of the commercial product CI Disperse Blue 291 using dif-ferent protocols of the Salmonella assay. Food Chem. Toxicol. 43, 49–56.

Del Castillo-Vaquero, A., Salido, G.M., Gonzalez, A., 2010. Melatonin induces calciumrelease from CCK-8- and thapsigargin-sensitive cytosolic stores in pancreatic AR42Jcells. J. Pineal Res. 49, 256–263.

El-Desoky, G.E., Abdel-Ghaffar, A., Al-Othman, Z.A., Habila, M.A., Al-Sheikh, Y.A.,Ghneim, H.K., Giesy, J.P., Aboul-Soud, M.A., 2017. Curcumin protects against tar-trazine-mediated oxidative stress and hepatotoxicity in male rats. Eur. Rev. Med.Pharmacol. Sci. 21, 635–645.

Elhkim, M.O., Héraud, F., Bemrah, N., Gauchard, F., Lorino, T., Lambré, C., Frémy, J.M.,Poul, J.M., 2007. New considerations regarding the risk assessment on Tartrazine: anupdate toxicological assessment, intolerance reactions and maximum theoreticaldaily intake in France. Regul. Toxicol. Pharmacol. 47, 308–316.

Fukui, M., Zhu, B.T., 2012. Mitochondrial superoxide dismutase SOD2, but not cytosolicSOD1, plays a critical role in protection against glutamate-induced oxidative stressand cell death in HT22 neuronal cells. Free Radic. Biol. Med. 48, 821–830.

García-Giménez, J.L., Romá-Mateo, C., Pérez-Machado, G., Peiró-Chova, L., Pallardó,F.V., 2017. Role of glutathione in the regulation of epigenetic mechanisms in disease.Free Radic. Biol. Med. 112, 36–48.

Gerasimenko, O.V., Gerasimenko, J.V., 2012. Mitochondrial function and malfunction inthe pathophysiology of pancreatitis. Pflügers Archiv 464, 89–99.

Gerasimenko, J.V., Peng, S., Tsugorka, T., Gerasimenko, O.V., 2018. Ca2+ signallingunderlying pancreatitis. Cell Calcium 70, 95–101.

Gonzalez, A., Granados, M.P., Salido, G.M., Pariente, J.A., 2003. Changes in mitochon-drial activity evoked by cholecystokinin in isolated mouse pancreatic acinar cells.Cell. Signal. 15, 1039–1048.

Gonzalez, A., Santofimia-Castaño, P., Rivera-Barreno, R., Salido, G.M., 2012.Cinnamtannin B-1, a natural antioxidant that reduces the effects of H2O2 on CCK-8-evoked responses in mouse pancreatic acinar cells. J. Physiol. Biochem. 68, 181–191.

Gonzalez, A., Santofimia-Castaño, P., Salido, G.M., 2011. Culture of Pancreatic AR42J

Cell for Use as a Model for Acinar Cell Function. Pancreapedia: Exocrine PancreasKnowledge Base. http://dx.doi.org/10.3998/panc.2011.26.

Granados, M.P., Salido, G.M., Pariente, J.A., Gonzalez, A., 2004. Generation of ROS inresponse to CCK-8 stimulation in mouse pancreatic acinar cells. Mitochondrion 3,285–296.

Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R.Y., 1985. A new generation of Ca2+ indicators withgreatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440–3450.

Guendouz, M., Mehedi, N., Zaoui, C., Saidi, D., Khéroua, O., 2013. Immune response aftertartrazine subchronic ingestion in Swiss albino mice. Int. J. Pharm. Pharmaceut. Sci.5, 584–592.

Hissin, P.J., Hilf, R., 1976. A fluorometric method for determination of oxidized andreduced glutathione in tissues. Anal. Biochem. 74, 214–226.

Kamel, M.M., El-Lethey, H.S., 2011. The potential health hazard of tartrazine and levels ofhyperactivity, anxiety-like symptoms, depression and anti-social behaviour in rats. J.Am. Sci. 7, 1211–1218.

Khayyat, L., Essawy, A., Sorour, J., Soffar, A., 2017. Tartrazine induces structural andfunctional aberrations and genotoxic effects in vivo. Peer J. 5, e3041.

Kuznetsov, A.V., Margreiter, R., Amberger, A., Saks, V., Grimm, M., 2011. Changes inmitochondrial redox state, membrane potential and calcium precede mitochondrialdysfunction in doxorubicin-induced cell death. Biochim. Biophys. Acta 1813,1144–1152.

Logsdon, C.D., 1986. Glucocorticoids increase cholecystokinin receptors and amylasesecretion in pancreatic acinar AR42J cells. J. Biol. Chem. 261, 2096–2101.

McCann, D., Barrett, A., Cooper, A., Crumpler, D., Dalen, L., Grimshaw, K., Kitchin, E.,Lok, K., Porteous, L., Prince, E., 2007. Food additives and hyperactive behaviour in 3-year-old and 8/9-year-old children in the community: a randomised, double-blinded,placebo-controlled trial. Lancet 370, 1560–1567.

Mehedi, N., Ainad-Tabet, S., Mokrane, N., Addou, S., Zaoui, C., Kheroua, O., Saidi, D.,2009. Reproductive toxicology of tartrazine (FD and C Yellow No. 5) in Swiss albinomice. Am. J. Pharmacol. Toxicol. 4, 130–135.

Moutinho, I., Bertges, L., Assis, R., 2007. Prolonged use of the food dye tartrazine (FD&Cyellow n° 5) and its effects on the gastric mucosa of Wistar rats. Braz. J. Biol. 67,141–145.

Nielsen, S.F., Thastrup, O., Pedersen, R., Olsen, C.E., Christensen, S.B., 1995. Structure-activity relationships of analogues of thapsigargin modified at O-11 and O-12. J. Med.Chem. 38, 272–276.

Nojima, Y., Ito, K., Ono, H., Nakazato, T., Bono, H., Yokoyama, T., Sato, R., Suetsugu, Y.,Nakamura, Y., Yamamoto, K., Satoh, J., Tabunoki, H., Fugo, H., 2015. Superoxidedismutases, SOD1 and SOD2, play a distinct role in the fat body during pupation insilkworm Bombyx mori. PLoS One 10, e0116007.

Onyema, O.O., Farombi, E.O., Emerole, G.O., Ukoha, A.I., Onyeze, G.O., 2006. Effect ofvitamin E on monosodium glutamate induced hepatotoxicity and oxidative stress inrats. Indian J. Biochem. Biophys. 43, 20–24.

Park, M., Park, H.R., Kim, S.J., Kim, M.S., Kong, K.H., Kim, H.S., Gong, E.J., Kim, M.E.,Kim, H.S., Lee, B.M., 2009. Risk assessment for the combinational effects of foodcolor additives: neural progenitor cells and hippocampal neurogenesis. J. Toxicol.Environ. Health 72, 1412–1423.

Petersen, O.H., 2008. Ca2+-induced pancreatic cell death: roles of the endoplasmic re-ticulum, zymogen granules, lysosomes and endosomes. J. Gastroenterol. Hepatol. 23,31–36.

Petersen, O.H., 2009. Ca2+ signaling in pancreatic acinar cells: physiology and patho-physiology. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, 9–16.

Petersen, O.H., 2014. Calcium signalling and secretory epithelia. Cell Calcium 55,282–289.

Radder, L., Le Roux, R., 2005. Factors affecting food choice in relation to venison: a SouthAfrican example. Meat Sci. 71, 583–589.

Santofimia-Castaño, P., Garcia-Sanchez, L., Ruy, D.C., Fernandez-Bermejo, M., Salido,G.M., Gonzalez, A., 2014a. The seleno-organic compound ebselen impairs mi-tochondrial physiology and induces cell death in AR42J cells. Toxicol. Lett. 229,465–473.

Santofimia-Castaño, P., Ruy, D.C., Fernandez-Bermejo, M., Salido, G.M., Gonzalez, A.,2014b. Pharmacological dose of melatonin reduces cytosolic calcium load in responseto cholecystokinin in mouse pancreatic acinar cells. Mol. Cell. Biochem. 397, 75–86.

Santofimia-Castaño, P., Ruy, D.C., Garcia-Sanchez, L., Jimenez-Blasco, D., Fernandez-Bermejo, M., Bolaños, J.P., Salido, G.M., Gonzalez, A., 2015. Melatonin induces theexpression of Nrf2-regulated antioxidant enzymes via PKC and Ca2+ influx activationin mouse pancreatic acinar cells. Free Radic. Biol. Med. 87, 226–236.

Santofimia-Castaño, P., Ruy, D.C., Salido, G.M., González, A., 2013. Melatonin modulatesCa2+mobilization and amylase release in response to cholecystokinin octapeptide inmouse pancreatic acinar cells. J. Physiol. Biochem. 69, 897–908.

Sasaki, Y.F., Kawaguchi, S., Kamaya, A., Ohshita, M., Kabasawa, K., Iwama, K., Taniguchi,K., Tsuda, S., 2002. The comet assay with 8 mouse organs: results with 39 currentlyused food additives. Mutat. Res. 519, 103–119.

Satoh, T., Enokido, Y., Aoshima, H., Uchiyama, Y., Hatanaka, H., 1997. Changes in mi-tochondrial membrane potential during oxidative stress-induced apoptosis in PC12cells. J. Neurosci. Res. 50, 413–420.

Schenone, A.V., Culzoni, M.J., Marsili, N.R., Goicoechea, H.C., 2013. Determination oftartrazine in beverage samples by stopped-flow analysis and three-way multivariatecalibration of non-linear kinetic-spectrophotometric data. Food Chem. 138,1928–1935.

Sevillano, S., De la Mano, A.M., De Dios, I., Ramudo, L., Manso, M.A., 2003. Major pa-thological mechanisms of acute pancreatitis are prevented by N-acetylcysteine.Digestion 68, 34–40.

F.Z. Ameur et al. Food and Chemical Toxicology 120 (2018) 71–80

79

Page 144: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Sharma, G., Gautam, D., Goyal, R., 2009. Tartrazine induced haematological and ser-ological changes in female Swiss albino mice, Mus musculus. Pharmacol. online 3,774–788.

Sherwood, M.W., Prior, I.A., Voronina, S.G., Barrow, S.L., Woodsmith, J.D., Gerasimenko,O.V., Petersen, O.H., Tepikin, A.V., 2007. Activation of trypsinogen in large endocyticvacuoles of pancreatic acinar cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5674–5679.

Szyguła, A., Guibal, E., Ruiz, M., Sastre, A.M., 2008. The removal of sulphonated azo-dyesby coagulation with chitosan. Colloids Surf., A 330, 219–226.

Tawfek, N., Amin, H., Abdalla, A., Fargali, S., 2015. Adverse effects of some food ad-ditives in adult male albino rats. Curr. Sci.Int. 4, 525–537.

Tapia, J.A., Gonzalez, A., Salido, G.M., Garcia, L.J., 1997. Trypsinogen secretion from theisolated Guinea-pig pancreas in response to secretagogues. Biog. Amines 13,477–490.

Tanaka, T., 2006. Reproductive and neurobehavioural toxicity study of tartrazine ad-ministered to mice in the diet. Food Chem. Toxicol. 44, 179–187.

Tanaka, T., Takahashi, O., Oishi, S., Ogata, A., 2008. Effects of tartrazine on exploratorybehavior in a three-generation toxicity study in mice. Reprod. Toxicol. 26, 156–163.

Visweswaran, B., Krishnamoorthy, G., 2012. Oxidative stress by tartrazine in the testis ofWistar rats. J. Pharm. Biol. Sci. 2, 44–49.

Vojdani, A., Vojdani, C., 2015. Immune reactivity to food coloring. Alternative Ther.Health Med. 21, 52–62.

Wilson, R.H., Terry, J.L., 1964. Specifications for the identity and purity of food additivesand their toxicological evaluation: food colours and some antimicrobials and anti-oxidants. In: eighth Report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on FoodAdditives 8-17 December. World Health Organization, Geneva, pp. 1–25 WorldHealth Organ Tech. Rep. Ser. 309.

World Health Organization, 2016. Joint FAO/WHO Expert committee on food additivesMeeting. Compendium of food additive specifications. Eighty-second report of theJoint FAO/WHO Expert committee on food additives. FAO JECFA Monographs,Rome, pp. 1–162 World Health Organ. Tech. Rep. Ser. 19.

Zampini, M., Sanabria, D., Phillips, N., Spence, C., 2007. The multisensory perception offlavor: assessing the influence of color cues on flavor discrimination responses. FoodQual. Prefer. 18, 975–984.

F.Z. Ameur et al. Food and Chemical Toxicology 120 (2018) 71–80

80

Page 145: THESE - univ-oran1.dz · Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas, ... development of health disorders that affect several functions and

Résumé

Le but de notre travail est d’évaluer l’effet de la tartrazine et de son

métabolite sur la fonction exocrine du pancréas à travers une étude in

vivo sur des souris Swiss, une étude in vitro à l’aide d’un modèle de

digestion et une étude ex vivo sur des cellules acinaires murines et sur des

cellules AR42J de carcinome pancréatique de rat. Les résultats obtenus

montrent que :- L’ingestion subchronique de la tartrazine chez les souris

Swiss à une dose de 0,05 % pendant 13 semaines provoque une diminution

de l’activité enzymatique de la trypsine et de la chymotrypsine. - Aucune

modification de l’activité enzymatique de la trypsine ou de la chymotrypsine

n’a été observée lorsqu’on utilise un modèle de digestion. - La tartrazine

ainsi que son métabolite, l’acide sulfanilique, peuvent altérer

significativement l’homéostasie calcique au niveau des cellules acinaires et

AR42J. - L’acide sulfanilique induit un stress oxydatif au niveau des cellules

acinaires et des cellules AR42J pancréatiques en générant des espèces

réactives de l’oxygène (ERO). - L’acide sulfanilique diminue le niveau de

défense antioxydante assurée par le système du glutathion et de la

superoxyde dismutase, affecte le potentiel membranaire mitochondrial et

altère la sécrétion de la trypsine par les cellules AR42J. En conclusion, la

tartrazine et son métabolite l’acide sulfanilique semblent affecter

significativement l’activité du pancréas exocrine en favorisant le

développement d’effets délétères au niveau de cet organe. Le

dysfonctionnement de cette glande peut évidemment être à l’origine de

troubles digestifs.

Mots clés :

Tartrazine; Acide sulfanilique; Pancréas exocrine; Calcium; ERO; AR42J;

Trypsine; Chymotrypsine; Amylase; Lipase.