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VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2012 - Thèse n°

COMPARAISON DE DIFFERENTES COLORATIONS POUR LA

MISE EN EVIDENCE DES PROTOZOAIRES DANS LA

COPROSCOPIE DES RUMINANTS

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I

(Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 21 décembre 2012

pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

CHANUDET Jeanne Née le 10 mars 1987

à Mâcon (71)

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LISTE DES MEMBRES DU CORPS ENSEIGNANT

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REMERCIEMENTS

Au président de ma thèse, Monsieur le Professeur Jean-Alain CHAYVIALLE,

Professeur à l’Université Claude Bernard de Lyon,

Pour m’avoir fait l’honneur de présider mon jury de thèse, pour sa disponibilité,

Hommages respectueux.

A Monsieur le Professeur Lionel ZENNER,

Professeur à VetAgro Sup, Campus vétérinaire de Lyon,

Pour avoir dirigé ce travail, pour ses conseils avisés,

Sincères remerciements.

A Madame le Docteur Marie-Anne ARCANGIOLI,

Maître de conférences à VetAgro Sup, Campus vétérinaire de Lyon,

Pour son aide et pour avoir eu la gentillesse de juger cette thèse et d’être mon deuxième

assesseur,

Sincère reconnaissance.

A Madame Marie-Thérèse POIREL,

Technicienne au service de parasitologie de VetAgro Sup, Campus vétérinaire de Lyon,

Pour sa patience, sa disponibilité et ses précieux conseils,

Sincère gratitude.

Au personnel des LVD et LDA contactés,

Pour leurs réponses et l’intérêt qu’ils ont portés à cette étude.

Aux éleveurs et vétérinaires,

Pour leur aide indispensable à la réalisation de ce travail.

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A mes parents,

Pour tout l’amour et le soutien que vous m’apportez chaque jour,

Pour la confiance que vous m’avez toujours accordée et la liberté dans laquelle j’ai grandi,

Je suis fière d’être votre fille.

A mon frère Pierre,

La vie nous a malheureusement séparés trop tôt, mais je sais que tu resteras toujours à mes

côtés et dans mes pensées,

Ma réussite est aussi la tienne.

A mes grands-parents,

Ce que je suis aujourd’hui, je vous le dois, merci.

A toute la famille Chanudet,

Pour ces rendez-vous café au Tari le dimanche matin, et tous vos sourires.

A ma tante Odile,

Pour ton soutien pendant toutes ces années.

A ma cousine Marie,

Grâce à toi, j’ai pu découvrir l’Espagne où tu es comme un poisson dans l’eau.

A toute la famille Chamonard,

Pour tous ces souvenirs de vacances ensemble.

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TABLE DES MATIERES

Table des illustrations ...................................................................................................................................................... 13

Table des figures .......................................................................................................................................................... 13

Table des tableaux ....................................................................................................................................................... 14

Introduction générale ....................................................................................................................................................... 17

Partie I : Partie bibliographique .................................................................................................................................... 19

Introduction .................................................................................................................................................................... 20

I. Les protozoaires et les différents tests diagnostiques en coproscopie ............................................... 21

A. Les principaux protozoaires détectables en coproscopie .................................................................. 21

1. Cryptosporidium parvum ....................................................................................................................... 21

a) Taxonomie.............................................................................................................................................. 21

b) Cycle ........................................................................................................................................................ 21

c) Morphologie .......................................................................................................................................... 22

d) Pathogénie et signes cliniques.......................................................................................................... 23

2. Eimeria spp. ................................................................................................................................................ 23

a) Taxonomie.............................................................................................................................................. 24

b) Cycle ........................................................................................................................................................ 24

c) Morphologie .......................................................................................................................................... 25

d) Pathogénie et signes cliniques.......................................................................................................... 26

3. Giardia intestinalis ................................................................................................................................... 27

a) Taxonomie.............................................................................................................................................. 27

b) Cycle ........................................................................................................................................................ 27

c) Morphologie .......................................................................................................................................... 28

d) Pathogénie et signes cliniques.......................................................................................................... 29

4. Autres protozoaires .................................................................................................................................. 30

B. Les différents tests diagnostiques réalisables sur un échantillon de selles .................................. 32

1. Techniques microscopiques ................................................................................................................... 32

a) Examen direct des selles .................................................................................................................... 32

b) Examen des selles après coloration ................................................................................................ 32

2. Techniques immunologiques................................................................................................................. 33

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a) Immunofluorescence directe ............................................................................................................ 33

b) ELISA ...................................................................................................................................................... 34

c) Immunochromatographie .................................................................................................................. 34

3. Technique de biologie moléculaire : PCR ........................................................................................ 36

II. Préparation de l’échantillon à l’examen microscopique ........................................................................ 37

A. Les modalités de prélèvement et conservation de l’échantillon...................................................... 37

1. Techniques de prélèvements ................................................................................................................. 37

2. Conservation des échantillons .............................................................................................................. 38

B. Matériel nécessaire à la réalisation d’un examen microscopique des selles ............................... 39

C. Méthodes de concentration des parasites ............................................................................................... 40

1. Méthodes physiques ................................................................................................................................. 40

a) Concentration par flottation .............................................................................................................. 40

b) Concentration par sédimentation ..................................................................................................... 42

2. Méthodes diphasiques ............................................................................................................................. 42

D. Réalisation et fixation du frottis ................................................................................................................ 45

1. Etalement des selles ................................................................................................................................. 45

2. Fixation des frottis .................................................................................................................................... 46

E. Lutage ................................................................................................................................................................ 48

F. Montage ............................................................................................................................................................ 49

III. Les différentes méthodes de coloration pour la détection des protozoaires ................................ 50

A. Forme végétative............................................................................................................................................ 50

1. Colorations entre lames et lamelles ..................................................................................................... 50

a) Méthode de Bailenger et Faraggi .................................................................................................... 51

b) MIF ou méthode de Sapero, Lawless et Strome ......................................................................... 51

2. Fixation –coloration d’un frottis humide ........................................................................................... 52

a) Technique en trois temps ................................................................................................................... 52

Méthodes à l’hématoxyline ................................................................................... 52 i).

Trichrome (Gomori-Wheatley).............................................................................. 54 ii).

b) Techniques en un temps ..................................................................................................................... 54

3. Coloration d’un frottis sec ...................................................................................................................... 55

a) Méthode de Brooke et Goldman ..................................................................................................... 55

b) Giemsa ..................................................................................................................................................... 56

B. Forme kystique ............................................................................................................................................... 57

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1. Colorations entre lames et lamelles ..................................................................................................... 57

a) Méthode de Bailenger et Faraggi .................................................................................................... 57

b) MIF ........................................................................................................................................................... 57

c) Colorations iodées ............................................................................................................................... 58

d) Coloration au saccharose ................................................................................................................... 59

e) Méthode de Heine ................................................................................................................................ 60

f) Coloration négative à la nigrosine .................................................................................................. 61

2. Fixation –coloration d’un frottis humide ........................................................................................... 61

a) Techniques en trois temps ................................................................................................................. 61

Méthodes à l’hématoxyline ................................................................................... 61 i).

Trichrome (Gomori-Wheatley).............................................................................. 62 ii).

b) Technique en 1 temps ......................................................................................................................... 62

3. Coloration d’un frottis sec ...................................................................................................................... 62

a) Giemsa ..................................................................................................................................................... 63

b) Les méthodes de Ziehl-Neelsen....................................................................................................... 63

Méthode de Ziehl-Neelsen modifiée par Henriksen .............................................. 63 i).

Autres modifications de la méthode de Ziehl-Neelsen .......................................... 65 ii).

c) Méthode de Brooke et Goldman ..................................................................................................... 65

d) Méthode à fluorescence ..................................................................................................................... 66

Auramine-fuchsine carbolique .............................................................................. 66 i).

Auramine-phénol ................................................................................................... 67 ii).

Mépacrine .............................................................................................................. 67 iii).

Conclusion ...................................................................................................................................................................... 69

Partie II : Bilan sur les méthodes de diagnostic des protozoaires digestifs en France et étude

expérimentale comparative de techniques de coloration rapides pour la mise en évidence des

protozoaires intestinaux .................................................................................................................................................. 71

I. Introduction .......................................................................................................................................................... 72

II. Matériels et méthodes ....................................................................................................................................... 73

A. Recueil de données et d’échantillons ...................................................................................................... 73

1. Modalités de contact ................................................................................................................................ 73

2. Zone et période d’étude .......................................................................................................................... 73

3. Collectes et modalités de prélèvement des échantillons ............................................................... 74

B. Préparation du questionnaire et des échantillons ................................................................................. 75

1. Réalisation du questionnaire ................................................................................................................. 75

10

2. Préparation des échantillons en vue de la coloration ..................................................................... 75

3. Dilution des échantillons ........................................................................................................................ 76

C. Modalités de coloration et de lecture des prélèvements .................................................................... 78

1. Coloration des prélèvements ................................................................................................................. 78

a) La coloration par une solution de saccharose.............................................................................. 78

b) La méthode de Heine ou coloration à la fuchsine ...................................................................... 79

c) La méthode de Ziehl-Neelsen modifiée ........................................................................................ 79

d) La coloration au lugol ......................................................................................................................... 79

2. Lecture des lames...................................................................................................................................... 80

D. Etude statistique ............................................................................................................................................. 82

III. Résultats ........................................................................................................................................................... 83

A. Enquête sur les méthodes de détection des protozoaires en coproscopie en France ................ 83

1. Les colorations en routine lors d’analyse coproscopique de jeunes bovins dans les

laboratoires départementaux ........................................................................................................................... 84

2. Les colorations lors de demande de recherche de Cryptosporidium ........................................ 84

3. Les colorations lors de demande de recherche de Giardia .......................................................... 86

4. Critères de choix des colorants par les laboratoires ....................................................................... 88

B. Comparaison de quatre techniques de coloration en coproscopie .................................................. 89

1. Comparaison de la sensibilité des colorants vis-à-vis de trois genres courants de

protozoaires .......................................................................................................................................................... 89

a) Comparaison pour le genre Cryptosporidium ............................................................................. 89

b) Comparaison pour le genre Giardia ............................................................................................... 94

c) Comparaison pour le genre Eimeria .............................................................................................. 97

2. Comparaison de la spécificité des colorants ..................................................................................... 99

a) Genre Cryptosporidium ...................................................................................................................... 99

b) Genre Giardia .................................................................................................................................... 101

c) Genre Eimeria .................................................................................................................................... 104

3. Comparaison de la mise en pratique des différentes techniques de coloration de formes

parasitaires de protozoaires .......................................................................................................................... 109

a) Temps de préparation ...................................................................................................................... 109

b) Coût des différentes techniques de coloration ......................................................................... 109

c) Facilité de lecture des différentes techniques ........................................................................... 110

11

4. Comparaison de différentes durées des étapes de la coloration de Ziehl-Neelsen modifiée

111

IV. Discussion ..................................................................................................................................................... 113

A. Enquête sur les méthodes de détections des protozoaires digestifs en France ........................ 113

B. Méthodologie ............................................................................................................................................... 116

C. Comparaison des 3 méthodes de coloration ....................................................................................... 118

1. Pour la recherche de C. parvum ........................................................................................................ 118

2. Pour la recherche de G. intestinalis .................................................................................................. 120

3. Pour la recherche d’Eimeria ............................................................................................................... 121

Conclusion générale ...................................................................................................................................................... 125

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................................................... 129

ANNEXES ....................................................................................................................................................................... 145

Annexe 1 : Les sites de prédilections, les périodes prépatentes des espèces d’Eimeria chez les

bovins ............................................................................................................................................. 146

Annexe 2 : Les sites de prédilections et les périodes prépatentes des espèces d’Eimeria chez les

ovins ............................................................................................................................................... 147

Annexe 3 : Les sites de prédilections et les périodes prépatentes des espèces d’Eimeria chez les

caprins ............................................................................................................................................ 148

Annexe 4 : Schéma et description de la morphologie des oocystes sporulés des espèces d’Eimeria

présentes chez les bovins ................................................................................................................ 149

Annexe 5 : Schéma et description de la morphologie des oocystes sporulés des espèces d’Eimeria

présentes chez les ovins .................................................................................................................. 151

Annexe 6 : Schéma et description de la morphologie des oocystes sporulés des espèces d’Eimeria

présentes chez les caprins ............................................................................................................... 153

Annexe 7 : Protocole de coloration par la méthode de Bailenger et Faraggi ................................. 155

Annexe 8 : Protocole de coloration par la méthode M.I.F. ............................................................ 156

Annexe 9 : Protocole de coloration de la technique d’Heindenhain .............................................. 157

Annexe 10 : Protocole de la méthode de coloration de Trichrome de gomori-Weathley .............. 158

Annexe 11 : Protocole de la méthode de coloration au noir chlorazol de Kohn ............................ 159

Annexe 11 : Protocole de coloration par la méthode de Brooke et Goldman ................................ 160

Annexe 12 : Protocole de la méthode de coloration de Giemsa ..................................................... 161

Annexe 13 : Protocole de coloration au lugol ................................................................................ 162

Annexe 14 : Protocole de coloration au saccharose ....................................................................... 163

Annexe 15 : Protocole de coloration pour la méthode de Heine .................................................... 163

Annexe 16 : Protocole de la coloration négative à la nigrosine ..................................................... 164

12

Annexe 17 : Protocole de la technique de coloration de Ziehl-Neelsen modifiée par Henriksen et

Pohlenz ........................................................................................................................................... 165

Annexe 18 : Protocole de la technique de Ziehl-Neelsen modifiée par Angus .............................. 166

Annexe 19 : Protocole de coloration de diméthylsulphoxyde-Ziehl-Neelsen ................................ 167

Annexe 20 : Protocole de coloration à l’auramine-fuchsine carbolique ........................................ 168

Annexe 21 : Protocole de coloration à l’auramine-phénol ............................................................. 169

Annexe 22 : Protocole de coloration à la mépacrine ...................................................................... 170

Annexe 23 : Questionnaire envoyé aux laboratoires ...................................................................... 171

Annexe 24 : Protocole de la technique de coloration de Ziehl-Neelsen modifiée choisie pour l’étude

expérimentale ................................................................................................................................. 172

13

TABLE DES ILLUSTRATIONS

TABLE DES FIGURES

Figure 1 : Cycle parasitaire de Cryptosporidium parvum [Fayer et al. (1990)] ............................................ 22

Figure 2 : Cycle parasitaire du genre Eimeria.......................................................................................................... 25

Figure 3 : Paramètres clés de diagnostic morphologique d’un oocyste de coccidie [Dorchies et al.

(2012)] .................................................................................................................................................................................. 26

Figure 4 : Cycle de Giardia intestinalis [à l'aide du site centers for Disease control and Prevention] ... 28

Figure 5 : Schémas d’un trophozoïte et d’un kyste de Giardia [Magne et al. (1996)] ................................ 29

Figure 6 : Schéma d’une tigette [Depierreux et al. (2001)] ................................................................................. 35

Figure 7 : Schéma des étapes de la méthode de flottation [Beugnet (2000)] ................................................. 41

Figure 8 : Tubes après centrifugation lors d’une méthode diphasique [OMS, 1997] .................................. 43

Figure 9 : Les trois étapes de réalisation d’un frottis ............................................................................................. 45

Figure 10 : Répartition des laboratoires départementaux ayant répondu ........................................................ 83

Figure 11 : Part des laboratoires utilisant chaque colorant en routine ............................................................. 84

Figure 12 : Pourcentage d’utilisation des colorants lors de recherche de C. parvum .................................. 85

Figure 13 : Tarifs de recherche de C. parvum pour des méthodes de colorations et pour des méthodes

immunologiques ................................................................................................................................................................ 86

Figure 14 : Pourcentage d’utilisation des colorants lors de recherche spécifique de Giardia ................... 87

Figure 15 : Tarifs de recherche de kystes de giardia pour des méthodes de colorations et pour des

méthodes immunologiques ............................................................................................................................................ 87

Figure 16 : Critères de choix des laboratoires de leur méthode de coloration ............................................... 88

Figure 17 : Nombre d’échantillons, dans chaque catégorie de semi-quantification de C. parvum, pour

les 4 méthodes de coloration ......................................................................................................................................... 91

Figure 18 : Nombre d’échantillons, dans chaque catégorie de semi-quantification de kystes de giardia,

pour les 4 méthodes diagnostiques étudiées ............................................................................................................. 96

Figure 19 : Nombre d’échantillons dans chaque catégorie de quantité d’Eimeria pour les 4 méthodes

diagnostiques étudiées ..................................................................................................................................................... 98

Figure 20 : Oocystes de C. parvum par la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée (objectif x40) ............... 99

Figure 21: Oocystes de C. parvum par dans une solution de saccharose (objectif x40) ......................... 100

Figure 22: Oocystes de C. parvum sur une lame colorée par du lugol (objectif x40) .............................. 100

Figure 23 : Oocystes de C. parvum dans une solution de fuchsine (objectif x40) .................................... 101

Figure 24 : Kystes de giardia sur une lame non colorée (à gauche) et dans une solution de saccharose

(objectif x40) ................................................................................................................................................................... 102

Figure 25 : Kystes de giardia colorés par du lugol (objectif x40) .................................................................. 103

Figure 26 : Kystes de giardia et artefact colorés par la méthode de Heine (objectif x40) ...................... 103

Figure 27 : Oocystes d’Eimeria photographiés sur des lames non colorées (objectif x40) ................... 105

Figure 28 : Oocystes d’Eimeria dans une solution de saccharose (objectif x40) ..................................... 106

Figure 29 : Oocystes d’Eimeria colorés par le lugol (objectif x40) .............................................................. 107

Figure 30 : Oocystes d’Eimeria colorés par la fuchsine (objectif x40) ....................................................... 108

14

TABLE DES TABLEAUX

Tableau I : Résultats du nombre d’oocystes de Cryptosporidium parvum à l’aide des 4 colorations .... 90

Tableau II : Résultats du nombre d’oocystes de Cryptosporidium parvum à l’aide des 4 colorations sur

des dilutions ........................................................................................................................................................................ 93

Tableau III: Résultats du nombre de kystes de Giardia à l’aide des 4 colorations ....................................... 95

Tableau IV: Résultats du nombre d’oocystes d’Eimeria à l’aide des 4 colorations ..................................... 97

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TABLE DES ABREVIATIONS

ADN Acide désoxyribonucléique

ARN Acide ribonucléique

CR Corps résiduel

C. parvum Cryptosporidium parvum

E. Eimeria

G. intestinalis Giardia intestinalis

LDA Laboratoire départemental d’analyse

LVD Laboratoire vétérinaire départemental

MIF Merthiolate Iode Formol

PCR Réaction de polymérase en chaîne

Z-N Ziehl-Neelsen

16

17

INTRODUCTION GENERALE

En médecine vétérinaire, comme en médecine humaine, les protozoaires digestifs sont

fréquemment rencontrés. Ils ont une grande importance d’un point de vue économique et

sanitaire, par les signes cliniques provoqués mais aussi par leur aspect zoonotique important

pour certains.

Le diagnostic de protozoose digestive se fait souvent par coproscopie. C’est un acte

non invasif et le prélèvement est facile à réaliser. De nombreux laboratoires sont qualifiés

pour l’analyse des selles, des vétérinaires équipés peuvent également réaliser cette analyse

directement au cabinet.

La coproscopie peut aussi être utilisée pour la réalisation de diagnostic d’élevage dans

le but d’avoir un bilan de l’infestation des protozoaires ainsi que des trématodes et des

nématodes.

Pour que cet examen puisse être réalisé en clientèle, il faut que la technique utilisée

soit rapide, demande peu de matériel, que les solutions nécessaires soient facile d’accès et non

toxiques mais aussi que la réalisation et la lecture soit aisée.

Pour la détection des protozoaires digestifs, la principale difficulté est la petite taille

des éléments parasitaires. Ils sont donc parfois difficiles à visualiser et peuvent être facilement

confondus avec des débris, des spores végétales ou des levures. Il peut donc être utile et

parfois indispensable d’utiliser un colorant pour mettre en évidence ces éléments parasitaires

dans les selles.

Dans un premier temps, les différentes étapes de la coproscopie, de la réalisation du

prélèvement jusqu’à l’observation microscopique, vont être développées. Les éléments

parasitaires de protozoaires et les différentes techniques permettant leur mise en évidence

vont être cités et les méthodes de coloration permettant la mise en évidence de ces éléments

parasitaires vont être décrites.

Dans un second temps, une enquête sur les méthodes de diagnostic des protozoaires en

laboratoires vétérinaires départementaux français ayant été réalisée pour ce travail sera

18

étudiée permettant ainsi d’avoir un point de vue sur les différentes méthodes utilisées

actuellement. Puis, trois méthodes de colorations rapides testées sur trois genres de

protozoaires majeurs chez les ruminants vont être comparées sur différents points de la

sensibilité à leur mise en pratique.

19

PARTIE I : PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE

20

INTRODUCTION

Le diagnostic de suspicion des infections par les protozoaires digestifs se fait de façon

clinique mais il est nécessaire de faire une analyse en laboratoire pour avoir le diagnostic de

certitude. L’analyse de la présence des protozoaires dans les selles est la recherche la plus

courante. Pour que le diagnostic soit correct, il faut que toutes les étapes de ces analyses se

déroulent convenablement, du prélèvement au choix de la technique utilisée et sa réalisation.

Aujourd’hui de nombreuses méthodes de diagnostic des protozoaires dans les selles sont

développées. Dans cette partie bibliographique, il va tout d’abord être question des

protozoaires les plus couramment rencontrés en coproscopie chez les jeunes ruminants ainsi

que des différents types de techniques développées pour la recherche de ces protozoaires. Par

la suite, les modes de prélèvement et les étapes de préparation de l’échantillon de selles en

vue d’une coproscopie vont être détaillés. En dernier lieu, les nombreuses techniques de

coloration de matière fécale pour la recherche des formes végétatives et kystiques des

protozoaires vont être exposées.

21

I. LES PROTOZOAIRES ET LES DIFFERENTS TESTS DIAGNOSTIQUES

EN COPROSCOPIE

A. LES PRINCIPAUX PROTOZOAIRES DETECTABLES EN COPROSCOPIE

Parmi les nombreux parasites détectés lors d’une coproscopie chez les ruminants, nous

allons nous intéresser plus spécialement aux protozoaires. Différents protozoaires sont

retrouvés dans les fèces, sous une forme kystique ou végétative.

1. Cryptosporidium parvum

Cryptosporidium parvum est un parasite rencontré fréquemment chez l’homme et

l’animal. Il est reconnu depuis plus de 20 ans comme un agent majeur de diarrhée néonatale

chez les ruminants et donc associé à des pertes économiques importantes [Naciri et al.

(2000)]. Il a été identifié pour la première fois par Tyzzer en 1907 [O’Hara et Chen (2011)].

a) Taxonomie

Ce parasite appartient au groupe des Sporozoaires, au phylum des Apicomplexa, il fait

partie de la classe des Coccidea et de l’ordre Eimeriida.

Le genre Cryptosporidium compte une vingtaine d’espèces, 3 sont présentes chez les

ruminants : C. andersoni, C. bovis et C. parvum, cette dernière est l’espèce majeure [Bowman

(2003), Fayer et al. (2005), Lindsat et al. (2000)]. C. parvum n’est pas spécifique d’une espèce

(elle touche un grand nombre d’espèces animales ainsi que l’Homme) et sa répartition est

mondiale.

b) Cycle

C. parvum est un parasite monoxène et son cycle est très rapide, la période prépatente est

de 4 jours.

Après l’ingestion d’oocystes par un hôte, les 4 sporozoïtes contenus dans l’oocyste sont

libérés au niveau de la bordure en brosse et vont s’attacher aux cellules épithéliales

22

intestinales. Le sporozoïte passe alors en position intracellulaire et devient un trophozoïte. Un

trophozoïte va donner plusieurs mérontes. Il existe 2 types de mérontes, les mérontes de type I

qui vont infecter d’autres cellules épithéliales (auto-infection), et les mérontes de type II qui

vont donner des macrogamontes et des microgamontes. La fusion d’un microgamonte avec un

macrogamonte donne un zygote qui devient un oocyste. Les oocystes sont alors émis dans la

lumière intestinale. Deux types d’oocystes sont émis dans la lumière, des oocystes à paroi fine

dont l’excystation se fait dans le tube digestif de l’animal (ce qui participe à un phénomène

d’auto-infection) et des oocystes à paroi épaisse qui sont une structure de résistance dans le

milieu extérieur [O’Handley et Olson (2006)].

Figure 1 : Cycle parasitaire de Cryptosporidium parvum [Fayer et al. (1990)]

c) Morphologie

Les oocystes de C. parvum sont difficiles à voir dans les fèces du fait de leur petite

taille et de leur absence de couleur.

Ils sont de forme ovoïde à sphéroïde. Ils mesurent environ 5 µm de longueur pour 4,5

µm de largeur. La paroi des oocystes est épaisse ce qui lui procure une grande résistance dans

le milieu extérieur. Les 4 sporozoïtes, en demi-lune, situés dans les oocystes sont

difficilement discernables en microscopie optique, ils donnent au contenu des oocystes un

aspect granuleux [Beugnet et al. (2004)].

23

d) Pathogénie et signes cliniques

Chez les ruminants, la présence de ces parasites au niveau de la bordure en brosse

provoque des modifications morphologiques qui induisent une malabsorption et une mauvaise

digestion des aliments. Le mécanisme n’est pas très bien connu, mais la pénétration du lactose

non digéré dans le gros intestin favoriserait la croissance bactérienne et la formation d’acides

gras libres volatiles. Cette accumulation de nutriments hypertrophiques non absorbés dans la

lumière du gros intestin provoquerait la diarrhée.

La diarrhée est également due à un phénomène d’hypersécrétion dans la lumière

intestinale.

Les ruminants atteints de cryptosporidiose clinique, sont âgés de 5 jours à 3 semaines.

Les premiers signes sont souvent une anorexie et une apathie, la diarrhée survient

généralement le lendemain. Les animaux présentent alors une diarrhée aigüe aqueuse plutôt

jaunâtre qui entraine un état de déshydratation plus ou moins sévère. En moyenne la durée de

la diarrhée est de 6 à 10 jours. Certains auteurs signalent que les cryptosporidies seules

n’engendrent pas de diarrhée, celle-ci ne survient seulement que lorsque d’autres agents

pathogènes sont associés à C. parvum [Naciri et al. (1999)].

Chez certains animaux, l’infection par C. parvum provoquerait uniquement un

amaigrissement [O’Handley et Olson (2006)].

Chez les chevreaux, la cryptosporidiose engendre une très forte morbidité et la

mortalité est plus élevée que chez les veaux et les agneaux.

2. Eimeria spp.

Les parasites du genre Eimeria sont responsables de la coccidiose. C’est une maladie

parasitaire très fréquente chez de nombreuses espèces animales et sa répartition est mondiale.

Son influence économique est très importante du fait de sa prévalence et de sa

morbidité. Une enquête réalisée en 2006, montre que sur 10 élevages étudiés dans l’Allier,

tous présentent au moins 4 veaux excréteurs [Richard et al. (2006)]. En Vendée, une autre

étude a été réalisée sur des élevages laitiers, 14 élevages sur 15 présentent des veaux

excréteurs [Denis et al. (2008)]. L’importance économique de cette maladie est due aux pertes

24

occasionnées lors de coccidiose clinique chez les jeunes ruminants, mais également lors de

coccidiose sub-clinique engendrant des retards de croissance [Chartier (2002)].

a) Taxonomie

Le genre Eimeria fait partie du phylum des Apicomplexa, et de l’ordre des Eimeriida

tout comme le genre Cryptosporidium.

Chez les bovins, il existe au moins 13 espèces d’Eimeria, 11 sont retrouvées chez les

ovins et 9 chez les caprins [Taylor et al. (2007)]. Chaque espèce d’Eimeria présente une

spécificité d’hôte très stricte.

Toutes ces espèces ne sont pas pathogènes. Les espèces E. zuernii, E. bovis sont les

plus pathogènes chez les bovins [Navetat et al. (1996)], E. alabamensis l’est également. De

nombreuses espèces de coccidies ne le sont pas comme E. auburnensis, E. brasiliensis, E.

bukidnonensis, E. canadensis, E. cylindrica, E. ellipsoidalis, E. pellita, E. subspherica et E.

wyomingensis.

Chez les ovins, les espèces E. crandallis et E. ovinoidalis sont hautement pathogènes

alors que les autres ne provoquent aucun signe clinique chez les agneaux.

Chez les caprins parmi les 9 espèces de coccidies, 4 sont pathogènes : E. caprina, E.

ninakohlyakimovae, E. christenseni et E. hirci.

b) Cycle

Le cycle est identique pour toutes les coccidies, seul le site de prédilection des

parasites change selon les espèces d’Eimeria.

Suite à l’ingestion d’oocystes sporulés, les sporozoïtes sont libérés au niveau du

jéjunum sous l’action de la bile et de la trypsine. Ils vont alors pénétrer dans les cellules

épithéliales dans des sites de prédilection au niveau de l’intestin ; ces sites sont différents

selon l’espèce d’Eimeria (voir annexes 1, 2 et 3). C’est à ce niveau que se déroule la

mérogonie (ou schizogonie), les mérozoïtes (ou schizozoïtes) alors formés font éclater les

cellules dans lesquelles ils se trouvent et infectent d’autres cellules voisines. Ces mérozoïtes

vont alors subir la gamogonie ce qui aboutit à la formation des gamètes, puis la fusion de

25

ceux-ci donne un zygote et par la suite un oocyste non sporulé. L’oocyste est éliminé dans la

lumière du tube digestif donc dans les selles suite à l’éclatement de la cellule dans laquelle il

est situé

La durée des cycles est différente selon l’espèce d’Eimeria, les périodes prépatentes

varient de 10 à 30 jours, (voir annexes 1, 2 et 3).

Dans certaines conditions d’humidité et de température, les oocystes sporulent, c’est la

sporogonie, les oocystes contiennent alors 4 sporocystes contenant chacun 2 sporozoïtes.

Figure 2 : Cycle parasitaire du genre Eimeria

c) Morphologie

La morphologie des oocystes varie selon les espèces ce qui permet leur différenciation.

Les oocystes coccidiens sont subsphériques. Leur taille est en général supérieure à 10 µm de

longueur pour 10 µm de largeur [Beugnet et al. (2004)], elle n’excède pas 50 µm de longueur

et 40 µm de largeur [Taylor et al. (2007)]. Ils sont entourés par une paroi relativement épaisse.

26

Figure 3 : Paramètres clés de diagnostic morphologique d’un oocyste de coccidie [Dorchies

et al. (2012)]

Les oocystes sporulés sont composés de 8 sporozoïtes. Etant donné l’absence de

pouvoir pathogène de nombreuses espèces de coccidies, il est utile de déterminer l’espèce

présente, pour cela il existe des clés de diagnostic morphologique (voir annexe 4, 5 et 6).

L’identification est possible grâce à la taille, la couleur, la forme, la présence ou non de

micropyle ou de calotte micropylaire, ainsi que la forme des sporocystes dans les oocystes

sporulés [Daugcshies et Ditmtmar (2007)].

d) Pathogénie et signes cliniques

La destruction des cellules épithéliales par les coccidies engendre souvent de la

diarrhée chez les animaux atteints.

En cas de faible infestation, seule une forme subclinique est présente, les animaux

présentent alors un retard de croissance. Les formes chroniques peuvent provoquer de

l’anorexie et prédisposent aux infections secondaires. L’infection par les coccidies produit

une réponse immunitaire cellulaire et humorale protectrice.

Lors de plus forte infestation, les animaux ont une diarrhée profuse hémorragique avec

des épreintes. Ils présentent également une perte d’appétit, ils deviennent plus faibles et se

déshydratent. Il existe une forme nerveuse relativement fréquente chez les veaux à

l’engraissement et plus rare chez les petits ruminants. Les animaux présentent des

27

trémulations musculaires, de l’incoordination, des convulsions et des pertes d’équilibres

[Adjou et al. (2006)].

Les signes cliniques engendrés par les différentes espèces de coccidies sont légèrement

différents. Lors d’une infection par E. zuernii, les veaux présentent une diarrhée hémorragique

noirâtre avec du mucus, des épreintes, de l’anémie, ainsi que des troubles nerveux. Pour E.

bovis, la diarrhée est plus claire et n’est pas hémorragique [Institut de l’élevage (2000)].

Les animaux atteints de coccidiose sont les jeunes ruminants, âgés de 3 à 8 semaines

environ.

3. Giardia intestinalis

Ce parasite a été observé pour la première fois en 1681 par Antony Van Leeuwenhoek

dans ses propres selles diarrhéiques [Burke (1977)]. Il a été reconnu comme cause de diarrhée

chez l’homme depuis 1892. Tout comme C. parvum, il est de plus en plus étudié depuis les

années 80 en raison de son potentiel zoonotique. En effet, il provoque de la diarrhée chez des

personnes immunodéficientes atteintes par le virus de l’immunodéficience humaine.

a) Taxonomie

Le genre Giardia fait partie des Flagellés, il appartient au phylum des

Sarcomastigophora, au subphylum Mastigophora, à la classe des Zoomastigophora et à l’ordre

des Diplomonadida [Magne et al. (1996)]. L’espèce principale de ce genre est Giardia

intestinalis, elle est également appelée G. lamblia et G. duodenalis.

Ce parasite est retrouvé chez de nombreuses espèces de mammifères dans le monde

[Taylor et Webster (1998)].

b) Cycle

Suite à l’ingestion d’un kyste, des trophozoïtes sont libérés dans le tube digestif de

l’animal hôte. Ces trophozoïtes subissent alors une multiplication asexuée par division binaire

et colonisent alors l’intestin grêle. Les trophozoïtes adhèrent à l’épithélium grâce à un disque

28

ventral. Chez les ruminants, on retrouve les trophozoïtes sur toute la longueur de l’intestin

mais ils sont plus nombreux au niveau du jéjunum.

Puis les trophozoïtes s’enkystent et sont éliminés avec les fèces [O’Handley et Olson

(2006)].

La période prépatente est en moyenne de 14 jours [Jokipii et Jokipii (1977)].

Figure 4 : Cycle de Giardia intestinalis [à l'aide du site centers for Disease control and

Prevention]

c) Morphologie

Le trophozoïte est piriforme. De face, il mesure 10 à 20 µm de long sur 6 à 10 µm de

large, on peut distinguer 2 noyaux à l’intérieur. De profil, il présente une dépression au niveau

de la face ventrale : c’est un disque d’adhésion, il se prolonge par une extrémité effilée et

quatre paires de flagelles (2 paires en position antérolatérale, une en position ventrale et une

paire postérieure). La face dorsale est convexe.

Les kystes sont ovoïdes ou elliptiques, ils mesurent 10 à 13 µm de long sur 8 à 9 µm

de large. Ils possèdent 2 à 4 noyaux et contiennent des flagelles groupés en un faisceau

réfringent dans l’axe longitudinal [Magne et al. (1996)].

29

Figure 5 : Schémas d’un trophozoïte et d’un kyste de Giardia [Magne et al. (1996)]

d) Pathogénie et signes cliniques

La pathogénie de G. intestinalis est discutée, certains chercheurs comme Björkman et

Huentink ont montré que ce n’était pas une cause de diarrhée chez les ruminants [Björkman et

al. (2003), Huentink et al. (2001)]. En effet, dans une étude effectuée en Vendée, sur les 20

élevages caprins étudiés, des kystes de giardia ont été retrouvés dans toutes les fermes, il a

aussi été montré qu’il n’y avait pas de relation entre la quantité de kystes excrétés et une

diarrhée survenue chez les chevreaux en post-sevrage [Castro-Hermida et al. (2005)].

Des articles ont décrit qu’il existait un lien entre l’infection par des giardias et un

affaiblissement voir l’apparition d’une légère diarrhée [Olson et al. (1997)]. Pour finir

certaines études ont mis en évidence un lien direct entre l’excrétion de Giardia dans les selles

et la présence de diarrhée chez des veaux de moins de 3 mois [Xiao et al. (1993), O’Handley

et al. (1999), St Jean et al. (1987)].

La plupart du temps l’affection est asymptomatique. Cependant, lorsqu’elle est

symptomatique, elle est plutôt chronique et provoque de la diarrhée, une perte de poids ainsi

qu’un affaiblissement [Taylor et Webster (1998)].

Lors de giardiose la diarrhée est muqueuse et fluide, l’appétit et la prise de boisson

sont conservés [Pitel et al. (2005)].

La giardiose est considérée par certains comme n’étant pas une cause majeure de

diarrhée chez les ruminants et ayant un impact économique faible [O’Handley et Olson

(2006)].

30

4. Autres protozoaires

Il existe d’autres protozoaires chez les ruminants, ceux-ci sont retrouvés de façon

moins fréquente que les trois premiers genres étudiés.

Le parasite Blastocystis hominis est responsable de diarrhée chez l’homme [Zierdt

(1991), Taylor et Webster (1998)], il est également retrouvé chez les ruminants. Sa taxonomie

est controversée, il a parfois été placé parmi les protozoaires, notamment par les travaux de

Zierdt en 1967. Grâce aux avancées en biologie moléculaire, de plus récentes études ont

rapproché le genre Blastocystis des Straménopiles [cités par Tan (2004)].

Buxtonella sulcata est un protozoaire appartenant au phylum ciliophora [Taylor et al.

(2007)]. Ce parasite est un pathogène incertain, il pourrait être la cause de colites ulcératives

et de diarrhées chez les bovins.

Il possède une forme végétative, celle-ci est ciliée, et se multiplie dans le colon. Elle

présente 2 noyaux : un macronucleus réniforme et un micronucleus. Des vacuoles digestives

sont également visibles. Sa taille est d’environ 60 à 138 µm de longueur pour 46 à 100 µm de

large. Cette forme végétative possède un grand nombre de cils courts sur tout son pourtour.

Comme pour le genre Giardia, la reproduction se fait par fission binaire.

Dans les matières fécales, la forme retrouvée est la forme kystique. Les kystes sont de

forme ovale à ronde et mesurent de 55 à 130 µm, mais la taille des kystes diminue dans les

jours suivant l’excrétion. Ils sont de couleur jaunâtre et présentent une double membrane. On

retrouve les deux noyaux présents dans la forme végétative mais le micronucleus est difficile

à observer vu sa localisation dans la concavité du macronucleus [Dorchies et al. (2012)].

31

A retenir :

Les genres de protozoaires les plus fréquents chez les jeunes ruminants sont

Cryptosporidium, Giardia et Eimeria.

Les genres Giardia et Cryptosporidium ont une grande importance par leur potentiel

zoonotique, ainsi que par leurs graves conséquences sur les jeunes animaux ce qui provoque

de grandes pertes économiques. La pathogénie du genre Giardia reste cependant discutée.

Ces protozoaires digestifs sont présents chez de très jeunes ruminants, à partir de 7 jours pour

C. parvum, tandis qu’on ne retrouve le genre Eimeria qu’à partir de 3 semaines.

Pour le genre Eimeria, seul quelques espèces sont pathogènes, il est donc important de faire

un diagnostic d’espèce lors de la présence de coccidies dans les matières fécales.

Ces différents protozoaires pathogènes chez les jeunes ruminants doivent être

diagnostiqués afin d’administrer un traitement adapté aux animaux et de mettre en place des

mesures sanitaires pour éliminer ou limiter ce problème dans l’élevage.

32

B. LES DIFFERENTS TESTS DIAGNOSTIQUES REALISABLES SUR UN ECHANTILLON

DE SELLES

Avant tout examen sur les selles, un examen macroscopique doit être réalisé. La

couleur, la consistance, la présence ou non de mucus ou de vers de grande taille sont notées.

1. Techniques microscopiques

Lors d’un examen coproscopique, il est important de faire systématiquement un

examen direct des fèces puis un examen après concentration et/ou coloration.

a) Examen direct des selles

L’examen direct des selles est la méthode la plus simple et rapide. Elle permet

d’étudier les caractères de mobilité des formes végétatives de protozoaires lorsque les fèces

sont fraiches (moins de 3 heures environ).

Une petite quantité de selles est mélangée à du sérum physiologique sur une lame et

recouverte d’une lamelle. Toute la lamelle est parcourue à faible grossissement. Si un élément

est observé, un plus fort grossissement est alors utilisé pour l’identifier. Par la suite, les zones

les plus minces du frottis sont également observées au plus fort grossissement (objectif x 40).

Cette méthode a de nombreux avantages, elle est très rapide et demande un minimum

d’équipement. Une petite quantité de selles est suffisante, mais l’examen est par conséquent

moins représentatif. La lecture peut parfois être difficile étant donné la présence de débris

fécaux sur la lame [Hendrix (1998)].

b) Examen des selles après coloration

L’examen microscopique des selles nécessite parfois une coloration surtout lors de

recherche de protozoaires dont la petite taille ne facilite pas leur observation. Les colorations

peuvent être réalisées après concentration ou non. Différentes colorations permettent la mise

en évidence des protozoaires digestifs dans leurs formes végétatives ou kystiques. Les

colorations seront détaillées par la suite.

33

2. Techniques immunologiques

Les techniques immunologiques se sont vite développées car celles-ci sont rapides et

faciles à réaliser en laboratoire et en clientèle (immunochromatographie). Contrairement aux

colorations, les résultats ne sont pas dépendants de l’opérateur [Diaz-Lee et al. (2011)].

a) Immunofluorescence directe

L’immunofluorescence directe est une technique de coloration utilisant des anticorps

monoclonaux, dirigés contre le parasite, auxquels est lié un colorant fluorescent.

Il existe des kits commercialisés pour la détection de Cryptosporidium et/ou de

Giardia [Tangtrongsup et Scorza (2010), Scorza et Tangtrongsup (2010)]. Une étape de

sédimentation ou de flottation est recommandée avant l’utilisation de ces kits pour concentrer

les parasites [Kehl et al. (1995)].

Cette technique est très spécifique et permet l’obtention de résultats clairs et non

ambigus contrairement à certaines colorations classiques [Baron et al. (1989), Alles et al.

(1995)]. En 1996, une étude réalisée sur la détection de Cryptosporidium dans des fèces de

bovins et de porcs, a montré que l’immunofluorescence est plus sensible qu’une méthode de

coloration Ziehl-Neelsen modifiée [Quílez et al. (1996)].

L’immunofluorescence est très facile à lire mais nécessite un microscope à

fluorescence. Elle n’est donc pas réalisable dans tous les laboratoires ni dans une clinique

vétérinaire, mais elle est rapide et peu onéreuse. Dans une étude, il a été montré qu’elle

prenait moins de temps aux techniciens qu’une coloration de Ziehl-Neelsen modifiée par

Kinyoun ou qu’un test ELISA. De plus, le coût du test est inférieur à celui des deux tests

ELISA étudiés mais supérieur à une coloration [Kehl et al. (1995)]. Une autre étude montre,

au contraire, que cette technique est longue lorsque la concentration de parasite est faible, et

qu’il semble judicieux de la coupler avec de la cytométrie de flux permettant d’analyser un

grand nombre d’échantillons en peu de temps [Dixon et al. (1997)].

34

b) ELISA

Différents kits ELISA pour le diagnostic de C. parvum et G. intestinalis sont

commercialisés.

Certains tests ELISA pour la détection de Giardia détectent directement les antigènes

de la paroi des éléments parasitaires de Giardia et d’autres, comme Prospect® Giardia

Microplate Assay, permettent la détection d’une protéine, la protéine GSA 65. Cette protéine

est produite par le parasite lors de sa multiplication et elle est émise dans les selles

indépendamment de l’émission de kystes ou de trophozoïtes [Papini et Cardini (2006)].

Ce test a été évalué comme étant moins cher que la recherche directe des parasites

dans les selles et que l’immunofluorescence [Aldeen et al. (1995)]. Ces tests ELISA sont

rapides, sensibles et spécifiques et peuvent donc être très utiles pour confirmer le diagnostic

de giardiose, [Adiss et al. (1991)].

Pour les tests permettant la détection de Cryptosporidium parvum, ce sont directement

les antigènes de surface des oocystes qui sont recherchés. Des anticorps monoclonaux dirigés

contre ces antigènes sont présents au fond des puits, une dilution de selles est placée dans ces

puits. Après incubation et rinçage, des anticorps de détection sont ajoutés, puis un conjugué et

pour finir un substrat (avec un temps de lavage entre chaque étape) [Depierreux et al. (2001)].

Le résultat peut alors être lu.

Les tests ELISA permettent la confirmation d’une suspicion de giardiose ou de

cryptosporidiose même lorsque les parasites sont peu nombreux. Ils peuvent être réalisés par

un technicien non spécialisé en parasitologie [Gaafar (2011)].

c) Immunochromatographie

Divers tests rapides existent, Certains ne recherchent qu’un seul élément parasitaire C.

parvum ou G. intestinalis. D’autres tests recherchent de façon combinée Cryptosporidium et

Giardia ou C. parvum avec les virus rotavirus et coronavirus ainsi que la bactérie Escherichia

coli K99. Il n’existe pas de test immunochromatographique permettant la détection des

coccidies.

35

Ces tests utilisent des anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines spécifiques

de la membrane ou de la paroi des oocystes, des kystes et des trophozoïtes. Pour générer un

signal visuel, dans certains tests, des microbilles de latex colorées sont liées aux anticorps

monoclonaux [Papini et Cardini (2006)].

La plupart du temps ces tests sont sous forme de tigettes ou de plaquettes. Les tigettes

sont à tremper dans l’échantillon de selles puis à mettre dans une solution tampon pour faire

migrer les antigènes. Lors de tests sous forme de plaquettes [thermo scientific], il faut alors

effectuer une dilution des selles dans une solution, puis mettre quelques gouttes du mélange

dans les différents puits présents et ajouter une solution tampon [Depierreux et al. (2001)]. La

lecture se fait facilement par l’apparition ou non d’un trait coloré dans une zone précise.

Figure 6 : Schéma d’une tigette [Depierreux et al. (2001)]

Les différents tests rapides d’immunochromatographie présentent des sensibilités et

des spécificités supérieures à 94% [Garcia et Shimizu (1997)]. Par exemple pour le FASTest

Crypto-Giardia Strip du laboratoire allemand Megacor, la Sensibilité est de 96,7% pour C.

parvum et 97,2% pour G. duodenalis et la spécificité de 99,9% pour les deux parasites,

[Megacor]. Pour le kit détectant les antigènes de Cryptosporidium du laboratoire Kitvia, les

études montrent une sensibilité de 98% et une spécificité de 99% [KITVIA].

Cette technique est très rapide et ne nécessite pas un technicien spécialisé pour sa

réalisation. Aucun matériel supplémentaire n’est nécessaire pour ces tests et la quantité de

selles nécessaire est très faible [Gaafar (2011)].

36

3. Technique de biologie moléculaire : PCR

La méthode de PCR (réaction de polymérisation en chaine) amplifie l’ADN ou l’ARN

de certains protozoaires ce qui permet leur détection. Il existe des kits de PCR commercialisés

pour la détection de Cryptosporidium parvum ou Giardia intestinalis. Dans certains kits de

détection de C. parvum, l’ARN amplifié n’est pas présent chez tous les génotypes de C.

parvum (infectant les humains, les bovins…), ce qui peut limiter la détection de ce

protozoaire [Higgins et al. (2001)].

Cette technique de biologie moléculaire à une sensibilité équivalente aux méthodes

immunologiques pour la détection de C. parvum, ces procédés ne sont donc pas un apport

supplémentaire pour des examens coprologiques de routine [Bialek et al. (2002)]. La

détection d’acides nucléiques libres ou d’oocystes non viables dans les fèces, la contamination

des selles au moment du prélèvement ou dans le laboratoire peuvent aboutir à des faux

positifs [Fayer et al. (2000)].

En raison du coût de l’analyse, du temps de manipulation ainsi que de la technicité

nécessaire, les PCR sont essentiellement réalisées pour la recherche [Paul et al. (2009)]. Elles

sont utilisées pour l’analyse de selles humaines et animales mais également pour la recherche

des protozoaires dans l’eau (Giardia, Cryptosporidium ou Eimeria). Elles permettent aussi la

réalisation d’analyses génétiques des diverses espèces et génotypes de ces protozoaires [De

Waal (2012), Kawahara et al. (2010), Bertrand et al. (2004)].

A retenir :

De nombreuses techniques sont disponibles pour la détection des protozoaires digetifs, les

techniques de PCR, d’ELISA et d’immunofluorescence nécessitent d’être effectuées en

laboratoire. Les techniques d’examen microscopique et d’immunochromatographie peuvent

être facilement réalisées en laboratoire et dans les cabinets et cliniques vétérinaires.

Les différentes techniques permettant le diagnostic des protozoaires à partir des selles

nécessitent une bonne collecte et une préparation de l’échantillon. Pour l’examen

microscopique des matières fécales, il y a plusieurs étapes de préparation de l’échantillon en

vue d’analyse.

37

II. PREPARATION DE L’ECHANTILLON A L’EXAMEN MICROSCOPIQUE

A. LES MODALITES DE PRELEVEMENT ET CONSERVATION DE L’ECHANTILLON

1. Techniques de prélèvements

Le prélèvement de selles est facile à réaliser, mais il est nécessaire de suivre certaines

règles pour avoir un échantillon de bonne qualité.

Il est important de prendre des fèces fraîches pour avoir des éléments parasitaires qui

n’ont pas évolué et pour pouvoir observer des formes végétatives de Giardia. Pour cela, il est

possible de stimuler la défécation chez le veau (à l’aide d’un thermomètre par exemple) ou

d’utiliser une curette pour les chevreaux [Polack et al. (1983)]. Il faut éviter de prendre des

fèces sur le sol car celles-ci peuvent être contaminées par des nématodes libres ou des larves

de diptères [Hendrix (1998)].

Si l’on désire faire un bilan parasitaire sur l’élevage, il est possible de faire un mélange

de 7 à 10 prélèvements individuels pour diminuer le coût de l’analyse pour l’éleveur [Chartier

(2002)].

Il est recommandé de prendre 10 à 20 g de selles par échantillon. Pour certaines

recherches de parasites, dont l’excrétion est intermittente comme pour la recherche de

cryptosporidies, il est conseillé de faire plusieurs prélèvements sur quelques jours.

Les selles doivent être conditionnées dans un pot à prélèvement transparent avec un

couvercle, fermé hermétiquement, qui doit être correctement identifié. La date du

prélèvement, l’identification de l’animal, le nom de l’élevage et d’autres informations comme

l’âge de l’animal et les symptômes de celui-ci doivent être mentionnées sur le pot ou sur un

document d’accompagnement.

38

2. Conservation des échantillons

Il est important de faire parvenir les échantillons au laboratoire le plus rapidement

possible. L’analyse de fèces fraiches (moins de trois heures) permet l’observation des formes

végétatives de protozoaires qui sont détruites dans le milieu extérieur. Elles sont alors très

mobiles et facilement observables.

Mais ils peuvent également être conservés de différentes façons lorsqu’il est

impossible de faire parvenir l’échantillon très rapidement. Les échantillons, une fois prélevés

et conditionnés dans des flacons hermétiques, peuvent se conserver plusieurs mois au

réfrigérateur à une température de 4°C.

Les prélèvements peuvent également être conservés à température ambiante dans du

bichromate de potassium à 2,5% (il faut alors mettre 2 volumes de solution pour 1 volume de

fèces). Les échantillons se conservent alors à température ambiante pendant 120 jours

[Boufassa-Ouzrout et al. (1986)].

L’eau formolée permet la conservation des œufs d’helminthes et des kystes de

protozoaires dans les selles mais les kystes de protozoaires perdent leur réfringence et les

noyaux se colorent plus difficilement. On utilise de l’eau formolée à 5% pour des selles

fermes et à 10% pour des selles plus pâteuses [Golvan et Ambroise-Thomas (1984)]. Si l’on

utilise une plus grande quantité de formol cela entraine la destruction des kystes de giardia.

Une fois l’échantillon correctement prélevé et conservé au laboratoire, les

manipulations pour le préparer à l’examen microscopique peuvent être réalisées.

39

B. MATERIEL NECESSAIRE A LA REALISATION D’UN EXAMEN MICROSCOPIQUE

DES SELLES

L’examen microscopique des selles nécessite peu de matériel.

Pour cet examen, il est nécessaire de disposer, au minimum, d’un microscope optique

avec des objectifs allant de x4 à x100 à immersion (le plus souvent avec des objectifs x4, x10,

x40 et x100 à immersion) [Beugnet et al. (2004)]. Un éclairage classique est suffisant, mais

parfois le contraste de phase permet d’avoir une vision différente.

En ce qui concerne la verrerie, des lames porte-objet et des lamelles sont nécessaires.

Pour des méthodes de concentration il est nécessaire d’avoir un tamis ou une passoire à thé,

des verres à pied, des pipettes pasteur, des agitateurs et des tubes [Rousset (1993)].

Pour accélérer certaines méthodes de concentration dans des liquides de flottation, une

centrifugeuse peut être utilisée. Il faut donc avoir des tubes de centrifugation correspondants.

Pour les techniques de coloration du matériel supplémentaire sera nécessaire pour la

réalisation des colorations (colorants, bécher ou flacons fermés parfois opaques). Certaines

colorations nécessitent un microscope à fluorescence avec un filtre défini.

40

C. METHODES DE CONCENTRATION DES PARASITES

Pour augmenter la sensibilité des tests, il est utile de concentrer les parasites d’un

grand échantillon dans un petit volume. Différentes méthodes permettent la concentration des

protozoaires. La concentration permet également de limiter les débris fécaux sur le frottis.

1. Méthodes physiques

Deux types de méthodes physiques augmentent la quantité de parasites dans le frottis,

la méthode par flottation (ou flotaison) et la méthode par sédimentation. Les méthodes

physiques sont basées sur les différences de poids existant entre les parasites (œufs, kystes,

larves) et les débris.

a) Concentration par flottation

La méthode de concentration par flottation repose sur la différence de densité entre les

œufs et le liquide. La densité des œufs est de 1,1 à 1,2. Pour condenser les œufs à la surface

du liquide celui-ci doit avoir une densité supérieure à celle des œufs [Hendrix (1998)].

Différents liquides de flottation sont utilisables, leurs densités sont différentes et varient de

1,18 à 1,44.

La procédure des techniques de flottation consiste à mélanger une petite quantité de

fèces dans le liquide de flottation choisi, d’homogénéiser la solution, puis de filtrer le mélange

dans un tamis (par exemple une petite passoire à thé). Un tube est rempli du mélange jusqu’à

ras bord et une lamelle est placée sur le tube. Au bout d’une dizaine de minutes environ, les

œufs sont remontés sur la lamelle. Une centrifugation est possible pour accélérer cette étape

[Beugnet (2000), Beugnet et al. (2004)].

41

Figure 7 : Schéma des étapes de la méthode de flottation [Beugnet (2000)]

Le liquide le plus employé et recommandé pour la concentration des oocystes de

Cryptosporidium est une solution de saccharose ou solution de Sheather. Cette technique est

également appelée technique d’Anderson [Boufassa-Ouzrout et al. (1986), Mc Nabb et al.

(1985)]. Cette solution permet de réunir la majorité des oocystes à la surface du liquide et

permet une bonne purification du surnageant en éliminant les levures et les oocystes

dégénérés et non viables [Kar et al. (2011)]. Cette technique permet la concentration et la

coloration des oocystes, mais le prélèvement ne peut être conservé longtemps car celle-ci

déforme les oocystes rapidement (une heure environ) [Broussard (2003)]. Une centrifugation

peut être utile pour cette technique pour diminuer le temps de flottation car cette solution est

relativement épaisse.

Les liquides de flottation couramment utilisés en coproscopie sont : le sulfate de

magnésium dont la densité est de 1,28 et le sulfate de zinc (d=1,18 à 1,39). Ces liquides sont

très souvent employés car ils nécessitent peu de matériel.

Le sulfate de zinc est d’une efficacité presque équivalente au saccharose pour

l’ensemble des œufs et kystes, mais il est considéré comme idéal pour la concentration des

42

kystes de giardia selon certains auteurs [Broussard (2003), Hendrix (1998)], car il est le plus

efficace pour leur concentration et ne provoque pas de déformation de ceux-ci.

Une solution à base de NaCl (d=1,21) peut permettre de concentrer les parasites à la

surface. Une étude a montré que cette solution est une des plus efficaces pour concentrer les

oocystes de Cryptosporidium parvum lorsqu’ils sont présents en faible quantité [Kuczynska et

Shelton (1999)]. Cependant, ce liquide est très corrosif pour le matériel du laboratoire et

déforme les œufs d’helminthes, il forme également des cristaux sur la lame (Hendrix, 1998).

Le iodo-mercurate de potassium (d=1,44) est un liquide de flottation qui était utilisé de

façon courante en coproscopie, mais ce liquide est très polluant et corrosif. Il nécessite donc

des mesures de protection et de récupération [Beugnet (2000), Golvan et Ambroise-Thomas

(1984)].

b) Concentration par sédimentation

Contrairement aux méthodes de flottation, la sédimentation utilise des liquides dont la

densité est inférieure à celle des éléments parasitaires mais supérieure à celle des débris.

Les méthodes de sédimentation sont moins réalisées en routine que les méthodes de

flottation, car celles-ci demandent plus de temps et de nombreuses manipulations [Kuczynska

et Shelton (1999)].

Les techniques de sédimentation ne donnent pas un résultat aussi clair que la

flottation, il y a souvent plus de débris. Ces techniques ne sont pas efficaces pour la mise en

évidence des protozoaires digestifs sous leurs formes végétatives comme kystiques [Golvan et

Ambroise-Thomas (1984)].

2. Méthodes diphasiques

Le principe de la méthode diphasique est de mettre l’échantillon de selles en présence

de deux phases non miscibles, une phase aqueuse et une phase organique (éther). Toutes les

méthodes diphasiques dérivent de celle décrite par Telemann en 1908. La concentration des

éléments parasitaires dans le culot est due à l’action dissolvante de l’éther et la mise en jeu

43

des deux phases non miscibles qui réalisent pour les éléments fécaux un coefficient de partage

dont la valeur n’est pas fixe et dépend de sa balance hydrophile/lipophile [Anonyme].

Pour réaliser cette technique, les selles sont mélangées avec une solution déterminée

puis le mélange est agité avec de l’éther, le tout est centrifugé pour recueillir les œufs et les

kystes. On obtient quatre couches, au sommet l’éther puis les débris ensuite le formol et pour

finir le culot contenant les éléments parasitaires.

Figure 8 : Tubes après centrifugation lors d’une méthode diphasique [OMS, 1997]

Il existe plusieurs méthodes diphasiques, la méthode de Telemann-Rivas est souvent

utilisée comme méthode de routine en laboratoire, elle est simple et peu onéreuse mais n’est

pas toujours suffisante pour concentrer les œufs [Golvan et Ambroise-Thomas (1984)]. Elle

est, par exemple, moins performante que la flottation au saccharose pour la concentration des

cryptosporidies [Boufassa-Ouzrout et al. (1986)].

La méthode de Ritchie, ou Ritchie simplifiée permet de mettre en évidence les œufs

d’helminthes et les kystes de protozoaires, mais le culot est souvent très abondant. Cette

technique suivie d’une coloration de Kinyoun modifiée à froid est aussi efficace pour la

détection de Cryptosporidies que la flottation et la coloration à l’aide de la solution de

Sheather [Mc Nabb et al. (1985)].

La méthode de Blagg, Schloegel, Mansoer et Khalaf permet la concentration des

éléments parasitaires contenus dans des prélèvements fixés par le mercurothiolate-iode-formol

44

(MIF), les kystes de protozoaires sont alors colorés par le MIF [Rousset (1993), Golvan et

Ambroise-Thomas (1984)].

A retenir :

Les techniques de concentration les plus utilisées sont les techniques de flottation. Elles

permettent un résultat clair avec peu de manipulation. Les liquides de flottation les plus

courants sont le sulfate de zinc, le sulfate de magnésium, le saccharose ou le chlorure de

sodium. Une centrifugation peut être utilisée pour accélérer la technique.

45

D. REALISATION ET FIXATION DU FROTTIS

1. Etalement des selles

Certaines colorations se font dans les tubes de sédimentation ou de flottation, d’autres

se font de façon directe ou sur la lame. Pour toutes les colorations, il est nécessaire de réaliser

un étalement à une étape du processus.

Le frottis consiste à réaliser un étalement de fèces le plus fin possible afin de pouvoir

identifier les éléments parasitaires au microscope. Il est donc nécessaire d’avoir une texture de

selles assez liquide pour le réaliser.

Si les selles sont liquides, une goutte de matière fécale est placée sur une lame porte-

objet et l’étalement est réalisé directement.

Si les selles sont plus solides, il est nécessaire de les liquéfier avec une solution. Pour

réaliser un frottis simple on y ajoute alors une goutte de NaCl isotonique tiédie dans lequel on

mélange des fèces [Golvan et Ambroise-Thomas (1984)].

Si l’on souhaite faire une coloration directe (comme pour la méthode de Heine) on

ajoute alors une très petite quantité de selles dans une goutte de fuchsine sur une lame [Adam

et al. (1971)]. Ensuite, l’étalement du mélange se fait en le recouvrant d’une lamelle ou à

l’aide d’une lame pour étirer le prélèvement [Rousset (1993)].

Figure 9 : Les trois étapes de réalisation d’un frottis

A : Dépôt d’une goutte de matière fécale ; B : Apposition d’une lame à 45° ; C : Mouvement

de translation lent et uniforme

46

Pour réaliser un frottis, il faut apposer la lame au contact de la goutte de matière

fécale, préalablement posée sur une lame, avec un angle de 45°, puis attendre que cette goutte

diffuse le long de la lame. Une fois que la goutte est répartie sur le bord de la lame, on réalise

un mouvement de translation lent et uniforme, de la même façon que pour la réalisation d’un

frottis sanguin (voir figure 9).

Le frottis doit être fin et l’on doit pouvoir lire les caractères d’un journal au travers de

celui-ci.

Si les oocystes ont été concentrés par une méthode de flottation, il n’est pas nécessaire

d’effectuer un frottis puisque les oocystes seront venus se coller à la lamelle au sommet du

tube de centrifugation.

2. Fixation des frottis

Selon la coloration envisagée par la suite, le frottis doit être fixé ou non. Il existe

différentes techniques de fixation, certaines colorations permettent également la fixation.

Pour les techniques de coloration acido-résistantes, le frottis est séché à l’air, puis la

lame est plongée dans du méthanol pur pendant 5 minutes environ pour la fixation [Bessieres

et al. (1995)].

Pour les colorations permanentes qui se déroulent en plusieurs étapes ou les

colorations sur frottis fixé et sec, le frottis est directement plongé dans le fixateur sans être

séché.

Plusieurs fixateurs peuvent être utilisés comme le fixateur de Bouin, la solution de

Schaudinn acétique ou la fixation PVA (PolyVinyl Alcool). Le choix du fixateur est

indépendant de la méthode, la solution de Schaudinn acétique est généralement préférée

[Bailenger (1982)].

Pour la fixation PVA, cela se passe en même temps que le frottis, une petite quantité

de fèces est mélangée à une goutte de la solution de fixation PVA, puis le mélange est étalé, il

est alors séché et laissé une nuit à 37°C [Adam et al. (1971)].

47

Une fois le frottis réalisé et fixé, il peut être coloré, la conservation de la préparation

après coloration peut être de courte durée, cela est principalement dû à la déshydratation de la

préparation. Le lutage et le montage peuvent prolonger la durée de conservation pour

permettre une lecture différée.

48

E. LUTAGE

Pour augmenter la conservation d’une préparation microscopique (avec ou sans

coloration) pendant quelques jours, il peut être utile d’effectuer un lutage.

Le lutage permet d’empêcher l’évaporation de l’eau contenue dans la préparation en

limitant les échanges entre la préparation et le milieu extérieur.

Plusieurs techniques existent, certaines ont une efficacité limitée comme le lutage à la

vaseline qui ne conserve la préparation que quelques heures.

Le lutage au lut de Rondeau de Noyer est une technique ayant une bonne efficacité, les

lames peuvent se conserver plusieurs mois. Mais elle nécessite l’utilisation d’un fer à luter et

la technique est relativement longue.

Le lutage au vernis à ongles est la technique la plus utilisée du fait de sa simplicité.

Une fois la lamelle posée sur la lame, le pourtour de la lamelle est séché à l’aide d’un papier

absorbant, puis du vernis est déposé sur les bords de la lamelle. Cette technique a une bonne

efficacité mais les formes végétatives et kystiques se conservent mal [GOLVAN et Ambroise-

Thomas (1984)].

49

F. MONTAGE

Pour certaines techniques microscopiques de coloration, il est parfois nécessaire de

réaliser un montage après la fixation et la coloration des frottis.

Les méthodes de montage utilisées en coprologie sont les mêmes que celles utilisées

pour les pièces histologiques. Il faut veiller à ce que le frottis ne sèche pas avant le montage.

Il existe deux grandes techniques de montage, la plus ancienne est le montage au

baume du Canada.

Pour cette technique, le frottis humide est déshydraté par de l’alcool éthylique à titre

croissant : 60°, 70°, 80°, 95° puis avec de l’alcool absolu. Pour finir il est déshydraté par le

xylène ou le toluène. Le frottis est laissé une à deux minutes dans chaque solution. Sur le

frottis encore imprégné de toluène, une lamelle avec une petite goutte de baume du Canada

sirupeux est déposée [Achir et Hamrioui (2001), Bailenger (1982)].

Une résine de synthèse peut également être utilisée pour effectuer un montage comme

l’Eukitt®. Cette résine permet de fixer une lamelle sur le frottis et de pouvoir le conserver

pendant plusieurs années.

Les étapes de la réalisation d’un examen microscopique de fèces ont donc été

expliquées. Une fois les fèces conservées ou le frottis réalisé, une coloration peut être

effectuée. Ensuite la lame peut éventuellement être lutée ou montée. Selon l’élément

parasitaire cherché, différents colorants peuvent être choisis.

50

III. LES DIFFERENTES METHODES DE COLORATION POUR LA

DETECTION DES PROTOZOAIRES

Les protozoaires sont de petites tailles, des colorations permettent donc de faciliter leur

recherche dans les selles. Les formes végétatives ou kystiques ne sont pas colorées par les

mêmes méthodes.

A. FORME VEGETATIVE

La forme végétative des protozoaires intestinaux est la forme flagellée, encore appelée

trophozoïte. En ce qui concerne les protozoaires étudiés, seule la forme végétative de Giardia

intestinalis est retrouvée dans les excréments des ruminants. Les trophozoïtes sont présents

dans les glaires muqueuses et les selles liquides.

Cette forme est fragile dans le milieu extérieur, elle n’est donc visualisable que sur des

fèces fraiches. Différentes méthodes permettent de mettre en évidence les formes végétatives

grâce à des colorants. Il y a des méthodes dont le colorant s’applique directement entre lames

et lamelles, d’autres se font sur un frottis humide après fixation de celui-ci et pour finir,

certaines s’effectuent sur un frottis préalablement séché.

1. Colorations entre lames et lamelles

Les colorations réalisables directement entre lames et lamelles comportent des

techniques simples et rapides, il est donc très utile de les mettre systématiquement en œuvre

lorsque l’examen direct n’a pas permis l’identification des trophozoïtes.

Ces méthodes sont à effectuer sur des selles contenant des trophozoïtes vivants.

Pour toutes ces méthodes, la technique est identique. Sur une lame, une goutte de

préparation fécale est mélangée à une petite goutte de réactif. Le tout est recouvert d’une

lamelle puis observé au microscope.

51

a) Méthode de Bailenger et Faraggi

Cette technique, décrite en 1972, permet de colorer toutes les formes parasitaires de

protozoaires.

Le réactif utilisé est une solution composée d’un mélange de violet cristal, de fuchsine

basique et de phénol (voir protocole en annexe 7). Cette solution se conserve correctement

mais elle doit être placée dans un flacon opaque fermé hermétiquement [Bailenger (1982)].

Une petite goutte du réactif est suffisante, cela permet à la coloration d’être

progressive et de ne pas altérer les parasites, de plus une petite quantité de liquide permet de

ne pas diluer la préparation fécale.

Si le frottis est lutté (avec du vernis à ongles ou de la colle cellulosique),

l’identification des trophozoïtes reste possible plusieurs jours après la coloration.

Après coloration, le cytoplasme et les cristalloïdes apparaissent de couleur rouge rosé,

les structures nucléaires et les rudiments flagellaires sont colorés en noir.

Cette méthode colore correctement les formes végétatives et les détails cytologiques

sont très bons. De plus cette coloration est rapide et nécessite peu de manipulations.

Cette coloration peut également se réaliser en tube, la solution est mise dans un tube à

hémolyse, puis une petite quantité de matière fécale y est ajoutée. Après une trentaine de

minutes, la couche supérieure du sédiment peut être prélevée pour effectuer un frottis et

observée au microscope [Rousset (1993)].

b) MIF ou méthode de Sapero, Lawless et Strome

La méthode de Sapero, Lawless et Strome a été décrite en 1951. Le sigle MIF

correspond à Merthiolate Iode Formol, ce sont les principaux constituants des réactifs [Levine

(1973), Adam et al. (1971)].

Le colorant est composé par un mélange de lugol, de teinture de merthiolate et de

formol (voir protocole en annexe 8). Les proportions peuvent être modifiées car le lugol

s’altère avec le temps, il peut alors être nécessaire d’augmenter la proportion de lugol pour

compenser sa détérioration. Le mélange ainsi formé ne se conserve pas plus de 8 heures.

La coloration se fait en deux phases. Tout d’abord l’iode colore immédiatement les

trophozoïtes qui apparaissent alors vert-jaune à jaune-brun. Au bout de quelques heures, les

membranes nucléaires sont colorées en rouge foncé et le cytoplasme en rouge. La chromatine

52

n’est pas colorée mais est visible grâce à sa réfringence [Bailenger (1982), Golvan et

Ambroise-Thomas (1984)].

Le frottis, une fois coloré, peut se conserver pendant quelques heures, mais au-delà les

parasites sont détruits.

Cette coloration peut s’effectuer entre lames et lamelles ou sur tube. La coloration

dans un tube à hémolyse permet de conserver les fèces si le tube est fermé hermétiquement

[Adam et al. (1971)].

Cette méthode est simple et peu cher, elle est également rapide et permet la

conservation des fèces (pour la coloration en tube).

2. Fixation –coloration d’un frottis humide

La fixation doit être effectuée le plus tôt possible après la défécation pour éviter la

dégénérescence des trophozoïtes. Le frottis doit rester humide tout au long des manipulations,

il faut donc que celles-ci s’enchainent rapidement.

a) Technique en trois temps

Il y a un temps de fixation, un temps de coloration et pour finir un temps de

différenciation. Un frottis fécal est réalisé, puis fixé selon une des techniques décrites

précédemment dans le paragraphe « Réalisation et fixation d’un frottis ». Après la phase de

coloration, les frottis sont montés en suivant la technique expliquée dans le paragraphe

« montage au baume ». Les techniques en trois temps sont réparties en deux catégories selon

la nature du colorant.

Méthodes à l’hématoxyline i).

De nombreuses méthodes utilisant l’hématoxyline comme colorant ont été mises au

point. L’hématoxyline seule n’a pas un grand pouvoir colorant, il est donc nécessaire

d’utiliser un mordant [Levine (1973)]. Les méthodes utilisant l’hématoxyline comprennent

53

souvent trois étapes, la première étape est le mordançage, puis il y a une étape de coloration et

pour finir une étape de différenciation.

La méthode de coloration la plus utilisée et souvent jugée comme une des meilleurs est

la méthode de Heindenhain ou méthode à l’hématoxyline ferrique [Shetty et Prabhu (1988)].

Cette technique utilise l’affinité des constituants nucléaires pour le fer, puis

l’hématoxyline apportée se combine avec le fer déjà fixé. Cela permet de faire ressortir les

structures nucléaires en noir sur un fond gris clair. Toutes les étapes de cette coloration sont

effectuées dans une étuve à 37°C.

Le mordant utilisé est une solution d’alun de fer à 3%, cette solution se conserve mal à

température ambiante, mais elle se conserve très bien au réfrigérateur (voir protocole en

annexe 9).

La solution de coloration se fait par une dilution au dixième d’une solution mère. La

solution mère est constituée d’une dissolution d’hématoxyline cristallisée dans de l’alcool à

90°. Une fois préparée, cette solution se conserve bien.

Pour finir, le différenciateur utilisé est la solution de mordançage diluée. C’est le

temps le plus difficile de la coloration, il est donc nécessaire de suivre cette étape au

microscope, lorsque les structures nucléaires apparaissent nettes, le frottis peut être lavé pour

enlever l’alun de fer [Bailenger (1982), Adam et al. (1971)].

Les éléments parasitaires sont mis en évidence par leur couleur gris foncé voire noire

sur un fond gris clair.

Après montage, le frottis peut être conservé. Cette méthode est la technique qui a

permis la description des protozoaires, mais elle est très difficile à exécuter. Elle est longue et

assez délicate, elle ne peut donc pas être utilisée en routine [Golvan et Ambroise-Thomas

(1984), Rousset (993)].

Les autres techniques utilisant l’hématoxyline sont légèrement différentes, elles

utilisent d’autres solutions de mordançage ou de différenciation. La méthode de Thompkins et

Miller utilise une solution d’acide phosphotungstique à 2% comme différenciateur.

La méthode de Mallory utilise le lugol comme solution de mordançage. Puis le frottis

est coloré par une solution d’hématoxyline phosphotungstique, il n’y alors pas d’étape de

différenciation. Les noyaux apparaissent violet foncé et le cytoplasme des cellules est violet

clair [Bailenger (1982)].

54

Trichrome (Gomori-Wheatley) ii).

La coloration trichrome de Gomori a été appliquée par Weathley aux frottis fécaux en

1951.

Cette technique s’effectue en deux temps.

Dans un premier temps le frottis est plongé dans une solution colorante pendant une

dizaine de minutes. La solution colorante : le trichrome de Gomori, est un mélange de

chromotrope 2R, de vert lumière SF, d’acide phosphotungstique et d’acide acétique

cristallisable (voir protocole en annexe 10).

Après ce premier temps de coloration, il y a un temps de rinçage ou de différenciation.

Le rinçage est effectué avec une solution d’alcool acétique et d’acide acétique pendant

quelques secondes [Bailenger (1982), Golvan et Ambroise-Thomas (1984)]. D’autres

protocoles utilisent de l’eau distillée pour le rinçage [Adam et al. (1971)].

Après coloration, la chromatine apparait de couleur rouge et le cytoplasme apparait

vert teinté de pourpre, ces éléments sont donc mis en évidence par rapport au fond coloré en

vert.

.

Il y a une grande irrégularité des résultats due à la difficulté d’obtenir des produits

chimiques de qualité. Cependant, lorsque la coloration est réussie, les résultats des colorations

sont de très bonne qualité. Cette technique est rapide et peut donner de très bons résultats. Elle

est relativement simple à mettre en place et les réactifs utilisés se conservent facilement.

Cette coloration est souvent préférée à d’autre coloration comme l’hématoxyline

ferrique pour la coloration des flagellés. Elle est recommandée pour la recherche des formes

végétatives comme kystiques [Garcia et al. (1979)].

b) Techniques en un temps

Pour les techniques en un temps, la fixation et la coloration se font simultanément. Les

manipulations sont donc simplifiées et plus rapides. Cependant, les résultats sont de moins

bonne qualité que ceux fournis par les techniques en trois temps.

Il existe plusieurs méthodes dont la fixation et la coloration se font simultanément

comme la méthode de Lawless ou celle de Noble. La plus utilisée est la méthode de Kohn.

55

Gleason et Healy ont décrit en 1965 la coloration de Kohn modifiée pour la détection

des protozoaires, c’est la méthode de coloration au noir chlorazol de Kohn.

Le réactif utilisé est un mélange de noir chlorazol, d’alcool éthylique, d’alcool

méthylique, d’acide acétique, de phénol et d’une solution aqueuse d’acide phosphotungstique

(voir protocole en annexe 11). La maturation du réactif doit s’effectuer à la lumière pendant

plusieurs semaines avant la première utilisation [Bailenger (1982)].

Les trophozoïtes apparaissent globalement gris. Les structures cellulaires sont colorées

en vert foncé à noir, le cytoplasme apparait incolore. Cela permet donc de mettre en évidence

les trophozoïtes sur un fond grisâtre [Levine (1973)].

Cette technique est facile à réaliser et relativement simple. La solution colorante est

stable et se conserve bien. Les colorations donnent des résultats de bonne qualité [Bullock

(1980)]. Cette technique est cependant relativement longue (les frottis restent au contact du

colorant de 4 à 8 heures), même si le temps de manipulation est court [Rousset (1993)].

3. Coloration d’un frottis sec

Pour ces techniques le frottis est réalisé, fixé selon la technique de fixation choisie

puis séché à l’air ou dans une étuve à 37°C. Lorsque les frottis sont fixés et séchés, ils

conservent leur colorabilité pendant longtemps. Les frottis peuvent donc être réalisés puis

expédiés à un laboratoire.

a) Méthode de Brooke et Goldman

Cette technique permet de colorer à l’aide d’une méthode de coloration d’un frottis

humide, un frottis déjà fixé et séché. Ce frottis est placé dans un bain d’alcool à 70°

additionné de quelques gouttes de lugol, puis il est placé dans de l’alcool à 50° (voir protocole

en annexe 11). Après cette succession de bains, le frottis peut alors être coloré avec une des

techniques précédemment décrite (Hématoxyline, Trichrome ou méthode Kohn [Bailenger

(1982)].

Cette méthode donne de bons résultats lors de la détection de trophozoïtes. Elle permet

de pouvoir fixer les frottis s’il n’est pas possible de les observer immédiatement et de les

56

colorer par la suite. Cependant, cette technique est bien plus longue et rajoute un certain

nombre de manipulations [Golvan et Ambroise-Thomas (1984)].

b) Giemsa

Cette coloration est une méthode qui repose sur les différences de pénétration du

décolorant dans les organismes.

Pour la réalisation d’une coloration de Giemsa, le frottis sec est fixé puis coloré à

l’aide de Giemsa rapide. La lame est alors observée au microscope optique à l’aide des plus

forts grossissements et avec l’objectif à immersion [Polack et al. (1983)].

Cette technique ne donne pas de très bons résultats pour l’observation des formes

végétatives, elle n’est donc pas utilisée.

A retenir :

Les formes végétatives sont rapidement détruites dans les fèces.

Quelques colorations permettent de les mettre en évidence, les plus utilisées et les

plus efficaces sont la technique de MIF (qui permet aussi de concentrer et de conserver la

matière fécale si elle effectuée sur tube), la méthode à l’hématoxyline ferrique et la technique

au trichrome de Gomori-Weatley.

Les formes végétatives et les formes kystiques ne sont pas colorées par les mêmes

techniques en raison de leur structure différente. Les colorants permettant la mise en évidence

des formes kystiques des protozoaires peuvent être identiques à ceux utilisés pour les

trophozoïtes mais d’autres techniques ont également été développées.

57

B. FORME KYSTIQUE

La forme kystique est la forme de résistance des protozoaires. On retrouve la forme

kystique des différents genres de protozoaires intestinaux dans les matières fécales des

ruminants. C’est la forme parasitaire retrouvée dans les fèces lors de coproscopies. Du fait de

la petite taille des kystes, il n’est pas toujours évident de les visualiser en coprologie. L’action

de différentes solutions permettant la coloration mettent en évidence ces éléments parasitaires.

Comme pour les méthodes utilisées pour la forme végétative, les méthodes de

coloration de la forme kystique sont classées en trois catégories, les colorations effectuées

directement entre lames et lamelles, les colorations après fixation d’un frottis humide et les

colorations sur un frottis sec.

1. Colorations entre lames et lamelles

Le principe de ces colorations est le même que celui pour les colorations des formes

végétatives. Mais les méthodes permettant la coloration des formes kystiques entre lames et

lamelles sont plus nombreuses. Toutes ces méthodes sont assez rapides.

a) Méthode de Bailenger et Faraggi

Cette méthode est la même que celle décrite pour les formes végétatives. Elle permet

donc de colorer directement, sans fixation préalable, les formes kystiques et végétatives des

protozoaires.

Les cytoplasmes et les cristalloïdes se colorent en rouge-rosé et les structures

nucléaires ressortent en noir. Les résultats obtenus avec cette technique sont aussi bons pour

les trophozoïtes que pour les kystes.

b) MIF

Cette méthode est la même pour la coloration des kystes que pour celle des

trophozoïtes.

58

Les kystes apparaissent clairs avec des reflets verts sur un fond rose dans un premier

temps, puis la seconde coloration pénètre à l’intérieur des kystes. Elle colore les membranes

nucléaires en rouge foncé et le cytoplasme en rouge [Rousset (1993)].

Cette méthode de coloration est simple, peu cher et rapide, elle donne de très bons

résultats pour la coloration des kystes de giardia [Thornton et al. (1983)). Cependant les

réactifs sont plus compliqués à préparer que pour une coloration au lugol et les résultats

semblent identiques [Bailenger (1982)].

La méthode de Sapero, Lawless et Strome, lorsqu’elle est réalisée en tube, permet la

conservation mais également la concentration des éléments parasitaires comme les oocystes

du genre Cryptosporidium. Cette concentration n’est pas de bonne qualité, la pureté du

sédiment est de moins bonne que celle réalisée par les autres méthodes de concentration

[Kvác et al. (2003), Badparva et al. (2009)].

c) Colorations iodées

Il existe de nombreux protocoles de coloration avec des réactifs iodés (Solution iodo-

acétique, Solution iodée de Faust). Tous les réactifs iodés dérivent du lugol. La réalisation des

solutions rend les protocoles légèrement plus compliqués alors que les résultats sont

semblables. Ils ne semblent donc pas plus avantageux que la coloration au lugol [Bailenger

(1982)].

Tous les réactifs iodés se conservent mal, il est donc nécessaire de les renouveler

fréquemment et de les conserver en respectant certaines mesures (flacon opaque et fermé

hermétiquement).

La technique de réalisation de la coloration au lugol est simple et courte (voir

protocole de coloration en annexe 13). La technique peut être identique à celle des autres

colorations entre lames et lamelles. Elle peut également se faire sur un étalement de fèces

recouvert d’une lamelle, une goutte de lugol est alors déposée au bord de la lamelle.

L’observation au microscope se fait immédiatement.

Avec cette coloration, les trophozoïtes sont immobilisés et seule leur chromatine est

colorée, cette technique ne permet donc pas la coloration de ceux-ci [Rousset (1993)].

59

Les kystes de giardia apparaissent jaune-orangé sur un fond marron. La paroi des

kystes de flagellés prend une teinte orange foncé et les structures internes sont soulignées. Les

kystes dégénérés sont colorés en bleu [Bioforma (1998)]. Les oocystes du genre

Cryptosporidium apparaissent non colorés sur un fond marron ce qui les différencie des

levures qui sont colorées par le lugol [Garcia et al. (1983), O’Donoghue (1995)]. Les lames

sont à lire rapidement car les oocystes de cryptosporidies se colorent au bout de 15 minutes

environ.

Cette méthode met en évidence tous les kystes de protozoaires dans les matières

fécales, elle permet une bonne coloration des kystes de giardia, mais elle ne colore pas les

oocystes coccidiens [Hendrix (1998), Beugnet et al. (2004)].

Cette technique est rapide et simple, elle peut être réalisée après une observation de

matière fécale en routine. Elle permet surtout la mise en évidence des kystes de giardia. Elle

est donc souvent réservée à l’observation de fèces lors d’une suspicion de giardiose.

d) Coloration au saccharose

La solution de saccharose ou solution de Sheather est utilisée pour la concentration des

parasites par la technique de flottation mais elle peut également être utilisée pour colorer une

lame. Un étalement de fèces peut être réalisé à partir du surnageant issu d’une flottation au

saccharose ou à partir d’un mélange d’une goutte de saccharose et d’une goutte de matière

fécale directement sur la lame [Beugnet et al. (2004)].

La solution de saccharose est réalisée à saturation (voir protocole de coloration en

annexe 14). Certains auteurs décrivent également la possibilité d’utiliser du sirop de sucre

[MacPherson et McQueen (1993)].

La lame doit être observée dans les 20 à 30 minutes suivant la coloration, les oocystes

se collabent après un certain temps dans cette solution et finissent par disparaitre.

Les oocystes de cryptosporidies apparaissent roses et sont réfringents, leur

morphologie est très bien conservée si l’observation est faite rapidement [Garcia et al.

(1983)].

60

Des études ont montré que la sensibilité de ce test est identique à celle d’un test

ELISA sur un prélèvement moyennement riche et très riche en cryptosporidies [Robert et al.

(1990)].

Cette technique ne nécessite pas de matériel onéreux et le réactif est facile à trouver,

de plus ce réactif n’est pas toxique et ne détériore pas le matériel, mais elle ne permet pas la

conservation des lames et la lecture doit être réalisée immédiatement. La solution est très

épaisse, par conséquent elle n’est pas très facile à utiliser.

Cette coloration, ou montage au saccharose, est facile à réaliser et rapide. Elle est donc

recommandée pour un examen rapide ou en routine sur des prélèvements de fèces de veaux

[Trotz-Williams et al. (2005)].

e) Méthode de Heine

Cette technique utilise la fuchsine (voir protocole de coloration en annexe 15), une

petite quantité de réactif est mélangée à une quantité égale de matière fécale sur une lame

[Beugnet et al. (2004)].

La lame doit être observée, à microscopie à contraste de phase, dans les 15 minutes

suivant la coloration, car les oocystes perdent leur réfringence.

En microscopie optique, les oocystes de C. parvum apparaissent non colorés mais

réfringents sur un fond rouge. Ils présentent un point sombre central représentant le corps

résiduel. Pour mieux les distinguer, il faut passer en microscopie à contraste de phase, les

oocystes sont alors très brillants sur fond noir. La réfringence des oocystes n’excède pas une

quinzaine de minutes [Khelef et al. (2002), Polack et al. (1983)].

Cette technique est simple, très rapide et facile à mettre en œuvre. Elle fait partie des

méthodes les plus sensibles dans la détection des oocystes de C. parvum. Pour bénéficier des

qualités de cette coloration il est nécessaire d’avoir un microscope à contraste de phase. Les

bulles d’air apparaissent également réfringentes ce qui complique la lecture de la lame

[Boufassa-Ouzrout et al. (1986), Khelef et al. (2002), Polack et al. (1983)].

La coloration de Heine est très rapide et sensible, elle est donc à conseiller pour

orienter le diagnostic de cryptosporidiose.

61

f) Coloration négative à la nigrosine

Pour cette coloration, le réactif utilisé est une solution de nigrosine à 1% (voir

protocole en annexe 16).

Les oocystes de cryptosporidies ne sont pas colorés par cette solution mais ils

deviennent brillants, la structure interne des oocystes est peu visible. Le fond est coloré en

noir, c’est donc une coloration négative. Les levures apparaissent presque semblables aux

oocystes, mais elles sont moins brillantes, plus petites et moins rondes [Boufassa-Ouzrout et

al. (1986), O’Donoghue (1995)].

Cette technique présente des résultats comparables à ceux obtenus avec une coloration

par une méthode de Ziehl-Neelsen modifiée.

Elle est rapide, sensible, peu couteuse et assez facile à interpréter. Ce colorant

convient donc bien à la détection d’organismes ayant un faible pouvoir de coloration comme

les oocystes de cryptosporidies. Il peut ainsi être utilisé en routine [Pohjola (1984)].

2. Fixation –coloration d’un frottis humide

Les techniques permettant la fixation et la coloration d’un frottis humide sont les

mêmes pour les formes végétatives que pour les formes kystiques des protozoaires.

a) Techniques en trois temps

Ces techniques en trois temps sont représentées essentiellement par les méthodes à

l’hématoxyline et la méthode du trichrome de Gomori-Wheatley.

Méthodes à l’hématoxyline i).

Comme pour la coloration des formes végétatives, la méthode la plus utilisée parmi les

méthodes à l’hématoxyline est la méthode à l’hématoxyline ferrique.

Les avantages et inconvénients de cette technique sont identiques pour la mise en

évidence des formes végétatives comme kystiques.

62

Trichrome (Gomori-Wheatley) ii).

Certains auteurs recommandent la coloration par le trichrome pour la recherche des

formes kystiques et végétatives de giardia [Garcia et al. (1979)]. En effet cette technique

colore bien les deux formes de giardia. Elle est d’une sensibilité équivalente voir supérieure à

celle de la méthode de MIF pour la détection des kystes de giardia par exemple [Thornton et

al. (1983), Badparva et al. (2009)].

Par contre cette coloration est décrite comme peu fiable pour la détection des oocystes

de cryptosporidies qui sont mal colorés et par conséquent difficile à retrouver sur les frottis de

fèces [Boufassa-Ouzrout et al. (1986)].

b) Technique en 1 temps

La principale méthode est la méthode de coloration au noir chlorazol de Kohn.

Le protocole est identique à celui effectué pour la coloration des formes végétatives.

Avec cette coloration, les kystes prennent une couleur bleu-gris à vert-gris. Les

noyaux sont facilement observables et les contours de ceux-ci sont nets, les structures

cellulaires se détachent en vert foncé à noir sur le cytoplasme incolore. Les levures se colorent

en gris foncé à noir [O’Donoghue (1995)].

Cette technique est facile à réaliser mais elle est longue (même si elle demande peu de

manipulations) [Rousset (1993)].

3. Coloration d’un frottis sec

Pour ces différentes méthodes, tout comme pour celles utilisées pour la détection des

trophozoïtes, un frottis mince de fèces est réalisé puis séché à l’air. Par la suite il sera souvent

fixé à l’aide d’alcool avant d’être coloré. Il y a différents types de méthodes, celles utilisant

les différents types de résistance aux acides des différents éléments présents dans les fèces

(Giemsa, Ziehl-Neelsen), la méthode de Brooke et Goldman et les méthodes par fluorescence.

63

a) Giemsa

Cette technique fut la première coloration pour la détection des oocystes de

Cryptosporidium parvum. Elle a été remplacée par les techniques de Ziehl-Neelsen.

Grâce à cette coloration, les oocystes sont entourés d’un halo clair. Ils présentent un

cytoplasme bleuté granuleux avec un centre plus clair et jusqu’à 6 corpuscules rouge foncé.

Les levures sont également colorées en bleu, leur contenu est moins granuleux. La taille et la

forme sont donc les deux seuls éléments permettant de différencier les levures des kystes

parasitaires [Polack et al. (1983), O’Donoghue (1995)].

Cette technique est simple à réaliser et permet de conserver la morphologie des

éléments parasitaires. De plus elle permet la conservation des lames colorées.

Cette méthode ne donne pas de résultat satisfaisant pour la détection des

cryptosporidies. Le risque de confusion des kystes parasitaires avec les levures est important

et les lames sont difficiles à lire étant donné le manque de contraste. Cette technique demande

donc plus de temps de lecture que d’autres et un personnel plus expérimenté [Khelef et al.

(2002), Garcia et al. (1983), MacPherson et McQueen (1993)].

La coloration de Giemsa a été abandonnée par les laboratoires car cette technique est

plus difficile à lire qu’une coloration de Ziehl-Neelsen modifiée.

b) Les méthodes de Ziehl-Neelsen

Il existe un grand nombre de méthodes de Ziehl-Neelsen, elles ont été modifiées par

rapport à la méthode de base pour être plus rapide, plus pratique et pour en augmenter

l’efficacité.

Méthode de Ziehl-Neelsen modifiée par Henriksen i).

Cette méthode est la plus utilisée par les laboratoires, elle est issue de la coloration de

Gram.

Les étapes de cette technique sont identiques pour toutes les méthodes de coloration de

Ziehl-Neelsen. Il y a une étape de fixation, puis une étape de coloration, une étape de

décoloration et une dernière étape de recoloration.

64

Le protocole donné par Henriksen et Pohlenz (voir en annexe 17) décrit la fixation du

frottis dans du méthanol ou de l’éthanol, puis il est séché et flambé à la lame. La lame est

alors colorée dans de la fuchsine puis décolorée avec une solution de différenciation (acide

sulfurique). Pour finir il est recoloré avec une solution de vert de malachite [Henriksen et

Pohlenz (1981)]. Le frottis est ensuite observé au microscope optique.

Quelques modifications de ce protocole originel ont été réalisées, l’acide sulfurique

peut être remplacé par un mélange d’acide chlorhydrique et d’alcool et les durées d’action des

différents produits peuvent être modifiées.

Cette méthode permet de mettre en évidence les oocystes qui prennent une couleur

rouge facilement distinguable sur le fond vert. Le cytoplasme de ceux-ci est d’aspect

granuleux avec le centre plus clair, 0 à 6 corpuscules apparaissant de couleur foncé sont

visibles à l’intérieur des kystes. Les autres coccidies apparaissent également colorées en rouge

tandis que les cellules, les bactéries et les débris le sont en vert [Polack et al. (1983),

Henriksen et Pohlenz (1981), Boufassa-Ouzrout et al. (1986)]. Cependant, les oocystes ne

sont pas toujours colorés de façon uniforme [Kar et al. (2011), Casemore (1991)]. Cette

technique est donc plus facile à lire que la coloration par le Giemsa étant donné le plus grand

contraste de couleur et la distinction aisée entre les levures et les éléments parasitaires

[MacPherson et McQueen (1993)].

La morphologie des oocystes est bien conservée et il n’y a pas de risque de confusion

avec les levures ou les débris fécaux ce qui rend l’observation des lames facile. Cette

technique est simple et d’une très bonne sensibilité. Certaines études montrent qu’il y a

seulement 5,5% de sensibilité de moins pour la détection de Cryptosporidium parvum avec le

Ziehl-Neelsen modifiée qu’avec l’immunofluorescence [Kvác et al. (2003)].

Après coloration, les lames peuvent être conservées et leur lecture peut se faire

quelques temps après, mais cette technique est relativement longue et demande plusieurs

manipulations. Elle est donc difficile à utiliser en routine [Trotz-Williams et al. (2005),

Henriksen et Pohlenz (1981)].

Cette méthode de coloration de Ziehl-Neelsen modifié par Henriksen est la méthode

de référence pour la détection des oocystes de Cryptosporidium du fait de sa sensibilité, de sa

facilité de lecture et de sa fiabilité [Garcia et al. (1983), Khelef et al. (2002)]. Elle permet

également de visualiser les giardias, mais cette technique est relativement lente et par

conséquent difficile à utiliser dans les laboratoires pour des analyses de routine.

65

Autres modifications de la méthode de Ziehl-Neelsen ii).

Depuis la parution du protocole de coloration de Ziehl-Neelsen modifié par Henriksen,

d’autres auteurs ont décrit des modifications différentes.

Le temps de décoloration peut être diminué, ou le vert de malachite peut être remplacé

par du bleu de méthylène [Beugnet et al. (2004), Ortolani (2000)].

Certaines de ces modifications sont très utilisées, comme la modification apportée par

Angus (voir protocole en annexe 18) ou par Kinyoun. Ce dernier décrit un temps plus court de

coloration à la fuchsine et une décoloration à l’aide d’un mélange d’acide et d’alcool. La

contre-coloration s’effectue à l’aide de bleu de méthylène.

Cette technique permet donc de diminuer le temps total de coloration et de limiter les

vapeurs inflammables car toutes les étapes se réalisent à froid. La morphologie reste bien

conservée et les oocystes apparaissent toujours de couleur rouge mais sur un fond de couleur

bleu [Garcia et al. (1983), MacPherson et McQueen (1993)].

Une autre méthode de coloration de Ziehl-Neelsen modifiée utilise un mélange de

fuchsine diamant et de dimethylsulphoxide comme solution colorante (voir protocole en

annexe 19). La contre-coloration se fait avec du vert de malachite après une décoloration avec

de l’acide acétique.

Les oocystes sont de couleur rose brillant à rose fuchsia ce qui ressort sur le fond vert

pâle. Les levures sont, elles, colorées en bleu-gris. La structure interne est bien conservée. Les

formes végétatives sont partiellement colorées par cette méthode, elles sont marron à noires.

Cette technique permet une bonne coloration, elle est rapide, elle diminue le temps de

coloration par rapport à la méthode décrite par Henriksen et elle est facile à lire. Par contre,

elle est instable et nécessite plusieurs manipulations [Pohjola et al. (1985), Bronsdon (1984)].

c) Méthode de Brooke et Goldman

La technique de Brooke et Goldman a déjà été décrite dans la partie sur les colorants

des formes végétatives puisqu’elle permet de colorer les kystes et les trophozoïtes des

protozoaires.

66

Toutefois, lors de la réalisation de cette technique pour la mise en évidence de kystes,

ceux-ci sont moins visibles car ils perdent leur réfringence et subissent une distorsion.

Cette méthode n’est donc pas à privilégier pour la détection des formes kystiques en

coproscopie.

d) Méthode à fluorescence

Les méthodes à fluorescence sont utilisées pour avoir une vision rapide de

l’échantillon et permettent d’orienter le diagnostic. Tout comme les colorations de Ziehl-

Neelsen, le principe repose sur la résistance à la décoloration des éléments parasitaires

recherchés, mais le colorant utilisé est un colorant fluorescent.

Les différents protocoles s’effectuent donc en trois étapes, une étape de coloration

avec le colorant fluorescent, une étape de décoloration et une dernière étape de contre-

coloration.

Ces techniques permettent une visualisation rapide des oocystes coccidiens puisque

ceux-ci sont alors colorés en orange ou rose fluorescent sur un fond très foncé [O’Donoghue

(1995)]. L’inconvénient majeur est la nécessité de disposer d’un microscope à fluorescence

[MacPherson et McQueen (1993)].

Différents colorants fluorescents sont utilisés comme l’Auramine-O, l’auramine-

phénol, la mépacrine ou l’acridine orange.

Auramine-fuchsine carbolique i).

Cette technique associe le principe de la coloration négative avec celui de la coloration

par fluorescence.

Le colorant fluorescent utilisé est de l’auramine-phénol et la recoloration s’effectue

avec de la fuchsine carbolique. Dans ce protocole (voir en annexe 20), il n’y a pas d’étape de

décoloration [Casemore et al. (1984)].

Les oocystes ressortent alors du fond rouge-noir par leur aspect fluorescent. Cette

technique ne permet pas la coloration des formes végétatives et kystiques de Giardia

[Harrington (2008)]. La morphologie des coccidies n’est pas très nette et en cas de doute, il

67

peut parfois être nécessaire de recolorer la lame avec la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée

par Henriksen.

La coloration à l’auramine-fuchsine carbolique est rapide, simple et pratique pour

réaliser un dépistage. Néanmoins, elle nécessite un microscope à fluorescence et un contrôle à

l’aide d’une autre coloration peut être nécessaire [Beugnet et al. (2004), Casemore et al.

(1984), Casemore et al. (1985)].

Auramine-phénol ii).

Pour cette coloration, le colorant fluorescent est toujours l’auramine-phénol, mais le

second colorant est une solution de permanganate de potassium (voir protocole en annexe 21).

La décoloration entre les deux étapes est réalisée à l’aide d’un mélange acide-alcool.

Les oocystes coccidiens sont clairement visibles, ils sont colorés en jaune sur le fond

noir.

L’auramine-phénol a une plus grande affinité pour les oocystes que la fuchsine

carbolique, c’est pour quoi cette coloration donne de meilleurs résultats [Boufassa-Ouzrout et

al. (1986), Nichols et Thom (1984)].

Cette technique est utilisée en routine dans de nombreux laboratoires, les lames

positives peuvent être recolorées par une autre technique comme celle de Giemsa ou de Ziehl-

Neelsen, mais cela n’est pas forcément nécessaire [Casemore et al. (1984)].

Mépacrine iii).

Le protocole est identique à celui de la coloration à l’auramine-phénol, mais le

colorant fluorescent utilisé est la mépacrine (voir protocole en annexe 22). L’Auramine-O

peut également être utilisée comme colorant fluorescent, mais celle-ci est plus chère que la

mépacrine.

Les oocystes de cryptosporidies apparaissent sous forme de disques fluorescents très

caractéristiques qui sont mis en évidence par leur couleur sur fond noir. La morphologie des

68

éléments parasitaires n’est pas bien conservée. Les levures ne prennent pas la mépacrine donc

elles sont facilement discernables des oocyste de C. parvum.

Cette méthode est rapide et facile à réaliser, de plus elle est peu chère. Mais comme

pour toutes les autres colorations fluorescentes, elle nécessite un matériel particulier pas

toujours présent dans tous les laboratoires [Ungureanu et Dontu (1992)].

Ces colorations ne sont pas spécifiques mais elles permettent de réaliser un diagnostic

rapide sur un grand nombre de lames. La méthode est rapide, simple et peu chère, de plus la

lecture est aisée, mais ces techniques demandent un matériel spécialisé, des contrôles qualités

réguliers et parfois une confirmation par une autre coloration de la présence des oocystes

coccidiens [Hanscheid et al. (2008), Garcia et al. (1983)].

Il est donc recommandé d’utiliser une technique à fluorescence pour étudier un grand

nombre de lames et de recolorer à l’aide de la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée les lames

positives [MacPherson et McQueen (1993)].

A retenir :

Pour le diagnostic de cryptosporidiose, la technique de référence est la coloration de Ziehl-

Neelsen modifiée. Elle donne de très bons résultats, cependant elle est assez longue. D’autres

techniques plus rapides sont alors régulièrement utilisées en laboratoire ou en clinique

comme la coloration par le saccharose. Certains laboratoires utilisent une coloration

fluorescente ou la coloration de Heine pour orienter le diagnostic.

Pour la recherche de kystes de giardia, la coloration de choix est la coloration au lugol, la

coloration de Ziehl-Neelsen modifiée permet également ce diagnostic.

69

CONCLUSION

Chez les ruminants, trois genres de protozoaires digestifs sont principalement

rencontrés : Cryptosporidium, Giardia et Eimeria. Tous ont une forme kystique retrouvée

dans les matières fécales, mais le genre Giardia présente également une forme flagellée. Pour

le genre Eimeria, il existe un grand nombre d’espèces non pathogènes. Il est donc utile

d’identifier l’espèce ou les espèces présentes dans l’échantillon.

Pour permettre un bon diagnostic, il est nécessaire de respecter certaines règles de

prélèvement et de conservation de l’échantillon. Pour l’observation de formes végétatives de

giardia, il faut une conservation rapide du prélèvement ou un acheminement très rapide (de

l’ordre de quelques heures) tandis que pour les autres éléments parasitaires, l’échantillon peut

être expédié sous 2 à 3 jours sans conservation spéciale. L’examen des fèces peut nécessiter

une concentration des éléments parasitaires pour limiter les débris et augmenter les chances de

retrouver les parasites. La méthode de flottation est la principale technique employée pour

cette étape. Pour la préparation de certaines colorations, un frottis fécal peut être nécessaire, il

est alors à réaliser de façon rigoureuse pour permettre une bonne lecture.

Différents moyens de diagnostic existent pour la détection des protozoaires digestifs

dans les matières fécales chez les ruminants. Les techniques immunologiques et de biologie

moléculaire se développent de plus en plus de nos jours, mais l’examen microscopique reste

un examen de choix et réalisable sans nécessiter de matériel spécialisé. En ce qui concerne la

coproscopie, les méthodes de coloration permettant la mise en évidence des éléments

parasitaires sont nombreuses et parfois assez spécifiques d’un genre de parasite. Certains

colorants ne colorent pas toutes les formes parasitaires mais parfois seulement les formes

kystiques. Parmi les colorants présentés, les plus couramment utilisés sont les colorations

iodées pour la détection de giardia, ainsi que les colorations de Ziehl-Neelsen modifiées ou

les colorations rapides par la méthode de Heine ou le saccharose.

Dans la suite de ce travail, nous allons donc étudier le résultat d’une enquête réalisée

sur les techniques de diagnostic utilisées par les laboratoires en France ainsi qu’une

comparaison de la sensibilité, de la spécificité et de l’aspect pratique de différentes

colorations rapides des protozoaires intestinaux.

70

71

PARTIE II : BILAN SUR LES METHODES DE

DIAGNOSTIC DES PROTOZOAIRES DIGESTIFS EN

FRANCE ET ETUDE EXPERIMENTALE

COMPARATIVE DE TECHNIQUES DE COLORATION

RAPIDES POUR LA MISE EN EVIDENCE DES

PROTOZOAIRES INTESTINAUX

72

I. INTRODUCTION

Les protozoaires sont des parasites pathogènes chez les jeunes bovins.

Cryptosporidium parvum affecte les veaux dès l’âge de 6 jours puis ils peuvent être

contaminés par Giardia intestinalis ou Eimeria sp.. Ils sont donc souvent recherchés pour

déterminer la cause de diarrhées ou de ralentissements de croissance en élevage.

De nombreuses techniques coproscopiques peuvent être utilisées dans les laboratoires

ou en clinique vétérinaire pour la détection des protozoaires dans les fèces de bovins, qu’elles

soient immunologiques ou microscopiques.

Cette partie expérimentale a pour but de connaitre et de faire un bilan des diverses

techniques employées en France pour la recherche des protozoaires en coproscopie et de

comparer des méthodes de coloration rapide pour la détection des 3 genres principaux de

protozoaires : Cryptosporidium, Giardia et Eimeria.

Afin de connaitre les techniques employées en France, les laboratoires vétérinaires

départementaux et les laboratoires départementaux d’analyses ont été questionnés. L’étude de

leurs réponses permet de réaliser un état des lieux des techniques actuellement utilisées.

De nombreux examens coproscopiques ont été réalisés à l’aide de 3 méthodes de

coloration (Heine, Lugol et Saccharose). Ils ont été comparés à une coproscopie réalisée à

l’aide d’une méthode de référence choisie : La méthode de Ziehl-Neelsen modifiée pour C.

parvum et une coproscopie sans coloration pour les genres Giardia et Eimeria.

73

II. MATERIELS ET METHODES

A. RECUEIL DE DONNEES ET D’ECHANTILLONS

1. Modalités de contact

La liste des laboratoires et les coordonnées de ceux-ci ont été récupérées grâce au site

internet des pages jaunes, à l’annuaire Roy ainsi qu’aux sites internet officiels des conseils

généraux.

Les laboratoires ont été contactés par e-mail dans un premier temps. En cas d’absence

de réponse ou d’erreur dans les adresses e-mail, les laboratoires ont été contactés par fax.

Un questionnaire permettant une entrée rapide des données a été envoyé par e-mail en

pièces jointes. Ce questionnaire a été réalisé grâce à l’outil de formulaire disponible sur le

logiciel Word. Cet outil a permis au personnel des laboratoires de pouvoir répondre

rapidement aux questions grâce à des cases à cocher et des zones d’entrée lors de

renseignements supplémentaires. Les réponses nous ont été transmises par e-mail ou par fax.

Un lien vers un site disposant du même questionnaire leur a également été envoyé dans le

corps de l’e-mail. Ce site donne aux laboratoires la possibilité de répondre directement en

ligne (http://www.mon-enquete-enligne.fr/index.php?sid=99725&lang=fr).

Lorsqu’aucune réponse n’a été obtenue après deux contacts par e-mail, le

questionnaire leur a été transmis par fax, avec un retour possible par e-mail, fax et téléphone.

Pour la récupération des échantillons de fèces, des éleveurs laitiers et allaitants ont été

contactés. Des vétérinaires exerçant en clientèle rurale ainsi que le service de pathologie du

bétail de VetAgro Sup nous ont permis de réaliser des prélèvements et nous ont fait parvenir

quelques échantillons de fèces.

2. Zone et période d’étude

Les questionnaires ont été envoyés aux LVD et LDA de France métropolitaine. Les

envois se sont déroulés sur 3 mois, les premiers contacts ont été pris à partir de la fin du mois

74

de juin 2012. Les envois se sont poursuivis sur les mois de juillet et d’août. La réception des

questionnaires s’est principalement déroulée au cours des mois d’été, mais les dernières

réponses sont arrivées au début du mois de septembre.

Après la prise de contact avec des éleveurs, des vétérinaires et le service de pathologie

du bétail de VetAgro Sup, les fèces ont été prélevées sur des jeunes bovins laitiers et

allaitants. Les prélèvements proviennent d’élevages répartis sur 3 départements : l’Allier, la

Loire et le Rhône. La collecte des échantillons s’est faite, de façon étalée, sur une période

d’un mois et demi. Ces prélèvements ont été réalisés sur les mois de septembre et d’octobre

2012.

3. Collectes et modalités de prélèvement des échantillons

Les animaux prélevés sont de jeunes bovins, de 5 jours à 3 mois venant d’élevages laitiers

et d’élevages allaitants. Certains veaux présentaient des signes de diarrhées aigües, quelques

un présentaient une diarrhée chronique. Les autres bovins ne montraient aucune anomalie

clinique.

Pour récupérer des matières fécales, pour l’échantillon, les bovins ont été stimulés pour

déféquer afin d’obtenir des fèces les plus fraiches possibles. Les selles sont alors prélevées

puis mises dans des pots adaptés. Ils sont ensuite placés directement au réfrigérateur avant et

après leur acheminement au laboratoire. En moyenne les analyses ont été réalisées 2 jours

après l’émission des selles.

Au total, 84 échantillons ont été obtenus, 30 échantillons ont été colorés et analysés pour

la recherche de C. parvum, 27 ont été observés à la recherche de kystes de G. intestinalis et 27

autres ont été utilisés pour comparer les méthodes de coloration pour le genre Eimeria.

75

B. PREPARATION DU QUESTIONNAIRE ET DES ECHANTILLONS

1. Réalisation du questionnaire

Cette enquête sur la coproscopie chez les ruminants a été menée pour deux thèses, les

questionnaires comportent donc 2 parties, une sur les méthodes de flottation en coproscopie

(thèse de doctorat vétérinaire de Fabienne RICHARD) et une partie sur la recherche des

protozoaires digestifs dans les fèces.

La partie concernant la recherche des protozoaires intestinaux comporte 7 questions.

Les deux premières questions concernent le coût de la recherche de Giardia et celui de la

recherche de Cryptosporidium.

Deux autres questions concernent les colorations utilisées en routine et lors d’une

demande de recherche spécifique. La liste des colorants proposée est Ziehl-Neelsen modifié,

Heine, Saccharose, Lugol, MIF. Ce sont les 5 techniques de colorations utilisées les plus

fréquemment, une zone d’entrée était disponible en cas d’utilisation d’un colorant absent de la

liste.

La durée moyenne d’une coloration leur est demandée.

Dans cette enquête, nous demandons la ou les raisons du choix du ou des colorants

utilisés. Il y a 4 possibilités de réponse : le coût, la facilité de préparation, le type de parasite

recherché et la facilité de lecture.

En raison d’un grand nombre de techniques de Ziehl-Neelsen modifiées, la dernière

question de cette enquête porte sur les réactifs et les durées d’action de ceux-ci lors

d’utilisation d’une technique de Ziehl-Neelsen (voir le questionnaire envoyé aux laboratoires

en annexe).

2. Préparation des échantillons en vue de la coloration

Les prélèvements issus de bovins âgés de moins de 3 semaines n’ont pas été utilisés

pour la recherche des protozoaires du genre Eimeria, de même les échantillons provenant de

bovins âgés de plus de 5 semaines n’ont pas été utilisés pour la recherche de C. parvum.

Lors de la recherche de cryptosporidies, les méthodes de colorations comparées

nécessitent une texture de selles assez liquide pour pouvoir être correctement effectuées.

Lorsque les fèces sont trop solides, une petite quantité de celles-ci (environ 2g) est placée

76

dans un verre à pied. Du sérum physiologique est alors ajouté (environ 3 ml) afin d’obtenir

un mélange de selles pâteux. La quantité de sérum physiologique est à adapter en fonction de

la texture initiale des selles.

Pour une des techniques de coloration réalisée pour la détection des cryptosporidies,

un frottis fécal est nécessaire. Pour cela une goutte de fèces ou une goutte du mélange de

fèces avec du sérum physiologique est prélevée et déposée sur une lame. A l’aide d’une autre

lame, la goutte est alors étalée pour obtenir une mince couche de matière fécale homogène sur

la lame. Le frottis ainsi réalisé est alors laissé à l’air ambiant pendant une heure environ

jusqu’à ce qu’il soit secs.

Lors de la comparaison des colorations pour la détection des formes parasitaires des

genres Giardia et Eimeria, une méthode de flottation est effectuée afin de concentrer les

éléments parasitaires présents.

Pour cela, 5 g de fèces sont mélangés avec 20 ml d’une solution de sulfate de zinc

(d=1,36). Le mélange est alors filtré à l’aide d’un tamis et d’une gaze. Le filtrat est enfin placé

dans un tube à centrifuger, le tube est complètement rempli jusqu’à ce que la solution forme

un ménisque surmontant le tube. Une lamelle est alors déposée sur le tube, l’ensemble est

placé ensuite dans la centrifugeuse. La centrifugation s’effectue pendant 5 minutes à 1500

tours par minute. A la fin de l’étape de centrifugation, la lamelle est récupérée et posée sur

une lame porte-objet présentant ou non une goutte d’un colorant étudié.

3. Dilution des échantillons

Pour la réalisation de différentes dilutions d’un échantillon riche en oocystes de C.

parvum, le nombre d’oocystes dans cet échantillon a été quantifié.

Une cellule de Malassez est nécessaire afin de réaliser la quantification. L’épaisseur

des fèces de veau nécessite une dilution pour pouvoir distinguer le quadrillage de la cellule.

200µl de l’échantillon initial est mélangé à 1800µl de la solution de saccharose. Ce mélange

est alors agité afin d’être homogénéisé. Avant que la solution ne se stabilise, une petite

quantité de la solution est prélevée et déposée sur la cellule de Malassez.

77

Les oocystes sont comptés sur tous les rectangles de la cellule de Malassez, puis la

moyenne par rectangle est effectuée. Le volume d’un rectangle étant de 1.10-5

ml, le nombre

d’oocystes par ml est donc connu.

Lors des dilutions de l’échantillon initial pour la comparaison des colorations de Heine

et de lugol, celui-ci est dilué dans du sérum physiologique.

Pour chaque dilution, 100 µl de fèces sont diluées dans différents volumes de sérum

physiologique selon la concentration voulue.

Pour la réalisation des colorations au saccharose, la dilution s’effectue dans la solution

de saccharose.

78

C. MODALITES DE COLORATION ET DE LECTURE DES PRELEVEMENTS

1. Coloration des prélèvements

Chaque échantillon est analysé selon plusieurs procédures.

En vue de la comparaison des techniques de coloration pour la détection de

Cryptosporidium parvum, les fèces sont utilisées directement et colorées par 4 techniques

différentes. La méthode de Ziehl-Neelsen a été choisie comme méthode de référence en raison

de son importance historique. Les autres colorations testées sont les colorations par une

solution de saccharose, par la méthode de Heine (solution de fuchsine) et par une solution de

lugol.

En ce qui concerne la comparaison des colorants pour la recherche d’éléments

parasitaires des genres Giardia et Eimeria, un autre type de procédure est réalisé. Une

concentration des fèces est effectuée par la méthode de flottation au sulfate de zinc. La

lamelle issue de cette concentration est alors placée sur une goutte de colorant déposée sur

une lame.

a) La coloration par une solution de saccharose

Pour cette coloration, une solution de saccharose à saturation est préparée. On mélange

environ 20g de saccharose dans 10 ml d’eau (voir protocole en annexe 14). Cette solution est

agitée pendant plus d’une heure jusqu’à la dissolution complète des derniers cristaux de

saccharose. La solution peut être chauffée pour accélérer la dissolution.

Une goutte de saccharose est déposée sur une lame.

Pour l’observation directe de fèces, une goutte de fèces est mélangée à la goutte de

saccharose à l’aide d’une pipette pasteur fermée. Ensuite une lamelle est déposée sur le

mélange. L’observation se fait immédiatement après la préparation, on regarde l’étalement au

microscope optique à l’aide des objectifs x10 et x 40.

Pour la coloration suite à une méthode de concentration, la lamelle est alors posée

directement sur la goutte de saccharose. L’observation se fait rapidement après la coloration.

79

b) La méthode de Heine ou coloration à la fuchsine

Comme pour la technique de coloration avec la solution de saccharose, lors

d’observation directe, une petite quantité de fèces est mélangée à une égale quantité de

fuchsine sur une lame. Elle est ensuite recouverte d’une lamelle avant que le mélange ne

sèche. De même lors de l’utilisation d’une méthode de concentration, la lamelle est posée

directement sur une goutte de fuchsine disposée sur une lame.

L’observation de la lame se fait rapidement après la coloration pour limiter les effets

dus à la déshydratation du mélange. Cette technique a été souvent décrite avec une

observation au microscope optique à contraste de phase. Dans le cadre de cette étude,

l’observation s’est effectuée avec un microscope optique à l’objectif x40.

c) La méthode de Ziehl-Neelsen modifiée

Différentes solutions et colorants sont nécessaires pour la réalisation de cette

technique, le protocole choisi est celui décrit par Beugnet [Beugnet et al. (2004)].

Un mélange d’acide chlorhydrique à 3% dans de l’éthanol à 95° est réalisé avant le

début des manipulations, ce mélange se conserve bien dans un flacon hermétique.

Le frottis sec est fixé pendant 5 minutes avec de l’éthanol à 95° puis l’alcool restant

sur la lame est flambé. La lame est alors placée dans un bain de fuchsine pendant 3 minutes

30. Puis elle est rincée à l’eau et décolorée à l’aide du mélange acide-alcool par deux passages

rapides, un rinçage à l’eau est effectué après et entre les décolorations. La recoloration se fait

dans un bain de vert de malachite à 0,5% pendant 1 minute. La lame est ensuite rincée et

séchée (voir le protocole en annexe 24).

L’observation se fait après séchage de la lame à l’air ambiant. Les objectifs x10 et x40

sont utilisés.

d) La coloration au lugol

Une solution de lugol est préparée à l’aide d’un mélange d’iode et d’iodure de

potassium (voir annexe 13).

Un étalement de fèces est réalisé en déposant une goutte de fèces liquide ou d’un

mélange fèces-sérum physiologique que l’on recouvre d’une lamelle. Avant que l’étalement

80

ne se dessèche, une goutte de lugol est déposée au bord de la lamelle. Le colorant migre alors

sous la lamelle et colore les éléments.

Lors d’une coloration d’une lamelle après centrifugation, la technique est identique,

une petite quantité de lugol est placée au bord de la lamelle.

L’observation se fait dans la zone de progression du colorant, à l’aide d’un microscope

optique et d’objectifs x 10 et x 40.

2. Lecture des lames

La lecture des lames se fait à plusieurs grossissements.

Pour la recherche des éléments parasitaires du genre Eimeria, la lame est observée à

l’aide de l’objectif x10. Toute la lame est parcourue et tous les parasites aperçus sont observés

à plus fort grossissement pour leur identification. Leur taille est mesurée à l’aide d’un oculaire

micrométrique étalonné sur le microscope. Tous les parasites du genre Eimeria sont alors

identifiés et classés par espèce, ils sont également comptabilisés sur toute la lamelle.

Pour le genre Eimeria, l’échantillon est qualifié de négatif lorsqu’aucun parasite n’est

observé sur la lamelle, présence lorsque le nombre de parasites vu est compris entre 1 et 10,

positif entre 11 et 50, très positif de 51 à 100 et fortement positif lorsque le nombre

d’oocystes est supérieur à 100.

Pour la recherche des éléments parasitaires du genre Giardia, la lame est observée à

l’objectif x10, en cas d’observation d’éléments semblables à des kystes, l’objectif x40 est

utilisé.

Lors de la lecture d’une lame à la recherche d’oocystes de C. parvum, celle-ci est

observée à l’objectif x40.

Les oocystes de C. parvum et les kystes de G. intestinalis, sont comptés sur 25 champs

au plus fort grossissement, pris sur la diagonale de la lamelle.

En fonction de la quantité d’oocystes observés sur 25 champs à l’objectif x 40, les

échantillons sont qualifiés d’une catégorie.

Pour C. parvum, un résultat de présence est rendu lorsqu’il y a de 1 à 5 oocystes,

positif (+) de 6 à 50, très positif (++) de 51 à 100, fortement positif (+++) de 101 à 200 et très

fortement positif (++++) au-delà.

81

Pour G. intestinalis, la limite des catégories est différente. De 1 à 5 kystes vus dans les

25 champs c’est une présence (P), de 6 à 10 le prélèvement est positif (+), de 11 à 20 il est

très positif (++) et au-delà de 20 il est fortement positif (+++).

Après la lecture de toute la lamelle, les lames sont éliminées. Les colorants employés

n’ont pas une toxicité chimique importante et les lames utilisées (en verre) sont

potentiellement coupantes. Ces 2 critères justifient que les lames soient considérées comme

des déchets d’activité de soins à risques. Elles doivent donc être conservées dans des

collecteurs adaptés et éliminées en vue de leur incinération.

82

D. ETUDE STATISTIQUE

Les données étudiées sont analysées à l’aide d’outils statistiques. En raison de données

provenant de l’analyse des mêmes prélèvements par des méthodes de coloration différentes et

de leur caractère non paramétrique, le test de rang de Wilcoxon est utilisé pour leur analyse.

Les tests ont été réalisés avec des tables de contingences représentant le nombre

d’oocyste de C. parvum sur 25 champs selon le colorant utilisé. La quantité d’éléments

parasitaires est représenté par 5 catégories (négatif, présence, +, ++, +++, et ++++), à chaque

catégorie est associé un chiffre (1 pour négatif, 2 pour présence etc.).

Pour les tables de contingences pour les genres Giardia et Eimeria, celles-ci sont

réalisées avec le nombre de kystes de giardia observés sur 25 champs ou le nombre

d’oocystes d’Eimeria vus sur la lame.

Le logiciel de statistique R a été utilisé pour réaliser les différents tests des rangs de

Wilcoxon pour tous les colorants et tous les genres de protozoaires.

83

III. RESULTATS

A. ENQUETE SUR LES METHODES DE DETECTION DES PROTOZOAIRES EN

COPROSCOPIE EN FRANCE

Sur les 73 questionnaires envoyés aux LVD et LDA de France métropolitaine, 49

laboratoires ont répondu. Parmi ces réponses, 3 laboratoires nous ont informés qu’ils ne

réalisent plus d’analyse concernant la parasitologie.

Les laboratoires ont utilisé différents moyens pour nous répondre, 16 laboratoires ont

choisi de nous répondre grâce au questionnaire en ligne, 14 ont répondu par l’intermédiaire du

fax et 16 par e-mail.

Figure 10 : Répartition des laboratoires départementaux ayant répondu

Pour la détection des protozoaires dans les selles chez les jeunes bovins, 91,3% des

laboratoires interrogés utilisent une méthode de coloration pour Giardia intestinalis et

Cryptosporidium parvum. Certains laboratoires utilisent les tests immunologiques pour la

recherche des formes parasitaires de Giardia et de Cryptosporidium. 21,7% des laboratoires

ayant répondu, utilisent ce type de test pour la détection des kystes de giardia ou des oocystes

de C. parvum.

84

1. Les colorations en routine lors d’analyse coproscopique de jeunes bovins

dans les laboratoires départementaux

Après étude des réponses des LDA et LVD, la coloration la plus fréquemment utilisée

par les laboratoires départementaux est la coloration de Ziehl-Neelsen modifiée, puisque

60,6% des laboratoires utilisant une coloration, emploient cette technique pour leurs analyses

coproscopiques. En seconde place on retrouve la coloration de Heine, qui est effectuée par

36,4% des laboratoires, suivie de la méthode de coloration au lugol (27,3%). Les techniques

de MIF et de coloration par une solution de saccharose sont des colorations moins utilisées.

Figure 11 : Part des laboratoires utilisant chaque colorant en routine

Les laboratoires utilisant des colorations signalent mettre en moyenne 18 minutes pour

réaliser la technique de coloration permettant la recherche des éléments parasitaires de

protozoaires dans les selles.

2. Les colorations lors de demande de recherche de Cryptosporidium

D’après les réponses des laboratoires recherchant les cryptosporidies, 95,6% d’entre

eux utilisent une technique de coloration pour la recherche des oocystes de C. parvum. Un

autre type de méthode diagnostique est également employé, les méthodes immunologiques

sont utilisées par près de 9% des laboratoires pour la recherche de ce genre de protozoaire.

Z-N modifié

60,60%

Heine

36,40%

Lugol

27,30%

M.I.F.

18,20%

Saccharose

12,10%

85

La moitié des laboratoires employant une technique de coloration pour leur diagnostic

utilise la méthode historique de Ziehl-Neelsen modifiée. Au vu des réponses sur les

protocoles réalisés de Ziehl-Neelsen modifiée, la plupart des laboratoires utilisent un

protocole différent. Parmi les 17 laboratoires nous ayant indiqué leur protocole, seuls 2

protocoles sont communs à 2 laboratoires chacun. 13 protocoles différents ont donc été décrits

par les laboratoires, avec des nuances dans la durée de chaque étape, le type de décolorant et

de recolorant. 11 laboratoires utilisent de l’acide sulfurique pour l’étape de coloration et 5

emploient un mélange d’acide chlorhydrique et d’éthanol à 3%. De même pour l’étape de

recoloration, 13 recolorent les lames à l’aide de vert de malachite (à des concentrations

différentes), 3 laboratoires utilisent le bleu de méthylène. Les temps de coloration à la

fuchsine phéniquée varient de 5 à 60 minutes.

La technique de Heine est la seconde coloration la plus utilisée pour la recherche de C.

parvum chez les ruminants, en effet 36% des laboratoires notifient son application dans le

questionnaire. La dernière coloration utilisée est la technique de coloration par une solution de

saccharose. Aucune autre coloration n’est utilisée pour ce diagnostic dans les laboratoires

ayant répondu à nos questions.

Figure 12 : Pourcentage d’utilisation des colorants lors de recherche de C. parvum

Le tarif d’un examen coproscopique pour la recherche des éléments parasitaires du

genre Cryptosporidium est en moyenne de 9,59 €. Le tarif varie de 3 à 20 € avec une moyenne

de 9,11 € lors d’un diagnostic à l’aide d’une coloration. Ce tarif varie de 7,65 à 20,74 € et la

moyenne s’élève à 15,10 € lors d’utilisation d’une technique immunologique.

Z-N

modifié

50% Heine

36,10%

Saccharose

13,90%

86

Figure 13 : Tarifs de recherche de C. parvum pour des méthodes de colorations et pour des

méthodes immunologiques

Les laboratoires utilisant la technique de Ziehl-Neelsen modifiée pour le diagnostic de

cryptosporidiose notifient une durée moyenne de la technique de coloration de 24 minutes.

Elle est de 15 minutes pour le saccharose et de 9,5 minutes pour la technique décrite par

Heine.

3. Les colorations lors de demande de recherche de Giardia

Les réponses au questionnaire montrent que près de 85% des LVD et LDA réalisent le

diagnostic de la giardiose lors de demande spécifique. Plus de la moitié de ces laboratoires

utilisent un colorant pour la recherche des kystes de giardia. Un quart des laboratoires

départementaux recherchant ce genre de protozoaire utilise une technique immunologique

pour le diagnostic.

Seul 2 colorants ont été notifiés dans le questionnaire, les colorations citées font toutes

les deux partie des colorations iodées. La technique la plus utilisée est la coloration au lugol,

en effet cette technique est employée dans plus de 56% des laboratoires. L’autre méthode

employée est celle de MIF,

9

22

8

0 1 0 1 0 2 1

[3€-7€[ [7€-11€[ [11€-15€[ [15€-19€[ [19€-23€[

Coloration

Immunologie

87

Figure 14 : Pourcentage d’utilisation des colorants lors de recherche spécifique de Giardia

Le tarif pour une recherche de G. intestinalis dans les selles est en moyenne de 13,21

€. Lors de diagnostic par une technique de coloration, les tarifs s’échelonnent de 5 à 25 €

avec un tarif moyen de 11,18 €. Les tarifs varient de 6,50 à 30,50 € et la moyenne passe à

18,96 € lorsque la méthode utilisée est immunologique.

Figure 15 : Tarifs de recherche de kystes de giardia pour des méthodes de colorations et pour

des méthodes immunologiques

Les laboratoires ayant répondu utiliser la coloration de MIF pour la recherche des

kystes de giardia, mettent environ 25 minutes pour réaliser cette technique. Le temps de

réalisation de la coloration au lugol est d’approximativement 4 minutes 40 en moyenne.

Lugol

56,25%

MIF

43,75%

1

7

15

5

1 1 0 0 0

1 0

4

1 1 2

1

Coloration

Immunologie

88

4. Critères de choix des colorants par les laboratoires

Au sein de l’enquête, il a été demandé aux LVD et LDA de nous préciser quels sont

leurs critères de choix de leur technique de coloration.

Les deux critères qui s’avèrent être les plus importants sont le type de parasite

recherché (selon les hypothèses diagnostiques et l’âge de l’animal) et la facilité de lecture de

la lame (69% et 66,7% respectivement). La facilité de réalisation du protocole est un critère

qui a été cité dans un peu moins de 40% des réponses reçues. Pour finir la sélection du

colorant par son coût est le dernier critère choisi, seul 28,6% des laboratoires utilisant une

technique de coloration pour le diagnostic l’ont mentionné.

Figure 16 : Critères de choix des laboratoires de leur méthode de coloration

69% 66,70%

38,10%

28,60%

Parasites

recherchés

Facilité de

lecture

Facilité de

préparation

Coût

89

B. COMPARAISON DE QUATRE TECHNIQUES DE COLORATION EN COPROSCOPIE

1. Comparaison de la sensibilité des colorants vis-à-vis de trois genres

courants de protozoaires

Afin de comparer la sensibilité de 3 techniques de coloration rapide, des échantillons

de fèces ont été observés avec 4 méthodes. Les 3 techniques qui sont la coloration au

saccharose, la coloration à la fuchsine ou coloration de Heine et la coloration au lugol, ont été

comparées à une méthode de référence.

a) Comparaison pour le genre Cryptosporidium

Pour tester la sensibilité des colorants pour la mise en évidence des oocystes de C.

parvum, les 3 techniques ont été comparées à une technique de référence : la méthode de

Ziehl-Neelsen modifiée.

Les résultats sont notés dans le tableau I.

90

Tableau I : Résultats du nombre d’oocystes de Cryptosporidium parvum à l’aide des 4

colorations

Echantillons Z-N modifiée Heine Lugol Saccharose

1 - - - -

2 - - - -

3 - - - -

4 - - - P

5 - P - +

6 - + - +

7 P - - P

8 P P - P

9 P P P +

10 + P P +

11 + P P ++

12 + + - +

13 + + P +

14 + ++ P +++

15 + ++ + +++

16 + + + ++

17 ++ P P ++

18 ++ + P ++

19 ++ + + ++

20 ++ ++ + ++

21 ++ ++ ++ +++

22 ++ ++ ++ +++

23 +++ ++ ++ +

24 +++ ++ ++ ++

25 +++ ++ ++ ++

26 +++ ++ ++ +++

27 +++ ++ + +++

28 +++ ++ ++ +++

29 ++++ +++ + ++++

30 ++++ ++ ++ ++++

- = aucun parasite sur la lame, P = présence (de 1 à 5 parasites sur 25 champs) ; + (de 6 à 50

parasites sur 25 champs) ; ++ (de 51 à 100 parasites sur 25 champs) ; +++ (>100 parasites sur

25 champs)

Les techniques de coloration de Ziehl-Neelsen modifiée et de montage au saccharose

donnent des résultats supérieurs aux colorations à la fuchsine et au lugol. En effet c’est dans

ces méthodes de coloration que l’on retrouve le plus grand nombre d’échantillons fortement et

très fortement positifs. Les techniques de Heine et au lugol possèdent les plus grands nombres

de résultats négatifs ou de présence, parmi ces deux techniques, la méthode de Heine parait

91

être plus efficace au vu de son plus grand nombre de résultats très positifs et fortement

positifs.

Figure 17 : Nombre d’échantillons, dans chaque catégorie de semi-quantification de C.

parvum, pour les 4 méthodes de coloration

En analysant les données grâce au test des rangs de Wilcoxon, une différence

significative est observée entre la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée et la coloration au lugol

(p<0 ,01) ainsi qu’avec la coloration de Heine (p<0,05).

Il n’y a pas de différence significative entre la technique de Ziehl-Neelsen modifiée et

celle au saccharose (p=0,07).

0

2

4

6

8

10

12

14

Z-N modifiée

0

2

4

6

8

10

12

14

Saccharose

0

2

4

6

8

10

12

14

Lugol

0

2

4

6

8

10

12

14

Heine

92

Il existe une différence entre les techniques de coloration au saccharose et celle au

lugol et à la fuchsine. Avec l’aide des statistiques, on peut voir que les différences sont

significatives (p<0 ,01 pour le lugol et la méthode de Heine).

Le test des rangs de Wilcoxon appliqué pour les techniques de Heine et au lugol

montre une différence significative entre celles-ci (p<0 ,01).

Pour la recherche des oocystes de C. parvum, les méthodes de coloration de Ziehl-

Neelsen modifiée et au saccharose sont significativement plus sensibles que les colorations de

Heine et au lugol. Parmi ces dernières, la coloration de Heine est significativement plus

sensible que le lugol.

Pour apprécier la limite de détection des colorations au saccharose, au lugol et à la

fuchsine, des dilutions d’un échantillon positif ont été réalisées. L’échantillon initial a été

quantifié à l’aide d’une cellule de Malassez à 4,175.106

oocystes de C. parvum par ml.

Chaque dilution a été testée 5 fois pour chaque méthode de coloration et les résultats

ont été reportés dans le tableau II.

93

Tableau II : Résultats du nombre d’oocystes de Cryptosporidium parvum à l’aide des 4

colorations sur des dilutions

dilution Concentration Saccharose Heine Lugol

1/1 4,17.106/ml

+++ ++ ++

+++ ++ ++

+++ ++ +

++++ ++ ++

+++ ++ ++

1/10 4,17.105/ml

++ + +

+ ++ +

++ + +

++ ++ +

++ + +

1/15 2,78.106/ml

+ + +

+ + +

+ + +

++ + +

+ + +

1/30 1,39.105/ml

+ + P

+ + P

+ + P

+ + P

+ + +

1/60 6,95.104/ml

+ P P

+ P P

+ + P

+ + -

+ + P

1/120 3,48.104/ml

+ P -

P P -

+ P P

+ P -

+ P -

1/240 1,74.104/ml

P P -

P P -

P P -

P P -

P P -

1/480 8,70. 103/ml

- - -

P P -

- - -

- P -

- - -

1/960 4,35. 103/ml

- - -

- - -

- - -

- - -

- - -

94

Une différence entre les résultats obtenus avec la coloration au saccharose et les

colorations de Heine et au lugol est visible pour les premières dilutions, mais celle-ci

s’amenuise lorsque la dilution augmente. La coloration à la fuchsine et au lugol donnent des

résultats presque équivalents pour les premières dilutions puis la coloration au lugol semble

moins mettre en évidence les oocystes de C. parvum.

En dessous de 3,48.104/ml les oocystes de Cryptosporidium ne sont plus détectés par

la coloration au lugol alors qu’ils sont encore détectés par la coloration au saccharose et à la

fuchsine jusqu’à 8,70. 103/ml ce qui parait être le seuil de détection de C. parvum. A partir de

4,35. 103

oocystes /ml aucune des 3 colorations ne détecte la présence du protozoaire.

La coloration de Heine apparait donc plus sensible que la coloration au lugol, car elle

permet la mise en évidence des oocystes à des concentrations plus faibles que le lugol. A de

faibles concentrations, le saccharose et la fuchsine semblent être des colorants équivalents.

b) Comparaison pour le genre Giardia

Pour tester la sensibilité des colorants pour la mise en évidence des kystes de giardia, 3

techniques de coloration rapide ont été comparées à une lame non colorée. Ces techniques

sont : la méthode de coloration au saccharose, au lugol et à la fuchsine.

Tous les échantillons ont été analysés avec toutes les techniques.

En raison de la faible quantité de prélèvements positifs en G. intestinalis chez les

bovins et de la présence de la même espèce de Giardia chez les bovins et chez les carnivores

domestiques, de petites quantités de fèces de chiens présentant des kystes de giardia (moins de

10%) ont été introduites dans des fèces des bovins. Les nouveaux échantillons ont été

analysés de façon identique aux prélèvements de bovins purs.

Les résultats sont renseignés dans le tableau III.

95

Tableau III: Résultats du nombre de kystes de giardia à l’aide des 4 colorations

Echantillons Sans coloration Saccharose Heine Lugol

1 - - - -

2 - - - -

3 - - - P

4 - - P P

5 - P + +

6 - P P -

7 - P P -

8 - P P P

9 - P P P

10 P - P +

11 P P - -

12 P P - P

13 P P - P

14 P P - P

15 P P P P

16 P P P P

17 P P P P

18 P P P +

19 P P P +

20 P + P +

22 P P P +

23 + + ++ ++

24 ++ + ++ +

25 ++ ++ ++ ++

26 ++ ++ ++ +++

27 +++ ++ ++ +++

- = aucun parasite sur 25 champs ; P = présence (de 1 à 5 parasites sur 25 champs) ; + (de 5 à

10 sur 25 champs) ; ++ (de 10 à 20 sur 25 champs) ; +++ (>20 sur 25 champs)

Le plus grand nombre de résultats positifs à fortement positifs est retrouvé pour la

coloration au lugol, celle-ci parait donc plus sensible que les autres colorations.

Les autres méthodes paraissent sensiblement équivalentes en raison d’un nombre

identique de résultats négatifs et faibles.

96

Figure 18 : Nombre d’échantillons, dans chaque catégorie de semi-quantification de kystes de

giardia, pour les 4 méthodes diagnostiques étudiées

L’analyse des données avec le logiciel R, permet de détecter une différence

significative entre la méthode de coloration au lugol et toutes les autres techniques (p<0 ,01).

La méthode de coloration au lugol est donc la coloration la plus sensible parmi les 3

testées. Elle améliore la détection par rapport à une analyse sans méthode de coloration.

02468

10121416

Lugol

02468

10121416

Heine

02468

10121416

Sans coloration

02468

10121416

Saccharose

97

c) Comparaison pour le genre Eimeria

Dans le but de comparer des techniques de coloration rapide, la quantité d’oocystes

d’Eimeria observée sur chaque lame est renseignée dans le tableau IV.

Tableau IV: Résultats du nombre d’oocystes d’Eimeria à l’aide des 4 colorations

Echantillons Sans colorant Saccharose Heine Lugol

1 - - - -

2 - - - -

3 P P - -

4 P P P -

5 P P P -

6 P P - P

7 P P - P

8 P P - P

9 P P P P

10 P P P P

11 P P P P

12 P P P P

13 P P P P

14 P P P P

15 P P P P

16 P P P P

17 + P P P

18 + P P P

19 + + P P

20 + + + P

21 + + + P

22 + + P +

23 + + + +

24 + + + +

25 ++ ++ ++ ++

26 ++ + P P

27 +++ +++ +++ ++

- = aucun parasite ; P = présence (de 1 à 10 parasites sur la lame) ; + (de 11 à 50) ; ++ (de 51 à

100) ; +++ (>100)

98

Figure 19 : Nombre d’échantillons dans chaque catégorie de quantité d’Eimeria pour les 4

méthodes diagnostiques étudiées

Après analyse statistique, il existe une différence significative entre la méthode sans

coloration et les méthodes de coloration au lugol (p<0,01) et de Heine (p<0,01). La technique

sans coloration est donc plus sensible que les colorations au lugol et à la fuchsine.

Il n’existe pas de différence significative entre la méthode de coloration au saccharose

et la technique sans coloration (p=0,625). La technique au saccharose est significativement

différente de la méthode au lugol (p<0,01) et à la fuchsine (p<0,01).

Les techniques sans colorant et au saccharose sont donc plus sensibles que les

techniques au lugol et à la fuchsine pour ces éléments parasitaires.

02468

10121416

Sans coloration

02468

10121416

Saccharose

02468

10121416

Lugol

02468

10121416

Heine

99

2. Comparaison de la spécificité des colorants

Selon la technique de détection employée, les éléments parasitaires des 3 genres de

protozoaires se dessinent de façon variée.

a) Genre Cryptosporidium

Les oocystes de C. parvum apparaissent de façon différente selon la méthode de

coloration utilisée.

Lors d’une coloration par la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée, les oocystes sont

colorés en rose sur un fond vert, ce qui représente un contraste important. Ce contraste permet

une bonne visualisation des éléments parasitaires recherchés. De plus aucun autre élément

présent sur la lame ne reste coloré en rose après l’étape de décoloration. La recoloration par le

vert de malachite permet donc une coloration en vert de tous les débris permettant la mise en

évidence des oocystes de C. parvum (voir figure 20). Les parasites sont détectables à l’aide

d’un faible grossissement (objectif x10), mais il est souvent nécessaire de passer à un plus fort

grossissement.

Figure 20 : Oocystes de C. parvum par la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée (objectif x40)

Le montage au saccharose rend les oocystes de C. parvum réfringents, ceux-ci

apparaissent rosés sur un fond gris à orangé (voir figure 21) ce qui permet une bonne

visualisation de ceux-ci. Seuls les oocystes de C. parvum semblent être teintés par le

saccharose. Lors d’une présence d’un grand nombre d’oocystes, ils sont visibles à partir du

grossissement observé avec l’objectif x10. Le contenu de l’oocyste est bien visible à l’objectif

100

x4. Les oocystes sont ronds et la morphologie est bien conservée dans les 15 premières

minutes. A partir d’une vingtaine de minutes, les oocystes se déforment et deviennent

réniformes. Seules les bulles peuvent apparaitre légèrement rosées et réfringentes. Cette

solution fais remonter les oocystes sous la lamelle, ils sont donc tous sur le même plan.

Figure 21: Oocystes de C. parvum par dans une solution de saccharose (objectif x40)

Lors d’une coloration du prélèvement par du lugol, les éléments parasitaires de C.

parvum apparaissent non colorés légèrement réfringents sur un fond jaune-orangé (voir figure

22). Les débris sont colorés en orange-brun, lorsque les oocystes se superposent à des débris,

ils deviennent difficilement visibles en raison de leur transparence, il est donc parfois

nécessaire de diluer les fèces dans du sérum physiologique pour éliminer des débris. Le

contraste ne permet pas toujours une bonne visualisation de ces parasites. Quelques autres

éléments apparaissent non colorés, mais ceux-ci ne sont pas ronds et n’ont pas la même taille

que les oocystes, ils ne peuvent donc pas être confondus.

Figure 22: Oocystes de C. parvum sur une lame colorée par du lugol (objectif x40)

101

Comme pour la coloration au lugol, la méthode de Heine fait paraitre les oocystes

réfringents et non colorés. Tous les débris sont colorés en rose (voir figure 23). Tout comme

pour la coloration au lugol, il peut être difficile de distinguer les éléments parasitaires de C.

parvum lorsque ceux-ci se superposent à des débris, et il est parfois utile de diluer le

prélèvement pour diminuer la quantité de débris sur la lame. Avec cette coloration, la

différenciation entre les levures et les oocystes se fait facilement, en raison de la coloration

rose prise par les levures grâce à la fuchsine.

Figure 23 : Oocystes de C. parvum dans une solution de fuchsine (objectif x40)

Les colorations de Ziehl-Neelsen modifiées et au saccharose sont les méthodes

permettant le meilleur contraste entre les oocystes et le fond.

b) Genre Giardia

Aucune forme végétative de Giardia n’a été observée sur les lames examinées, les

formes kystiques le sont différemment selon la méthode employée.

En l’absence de méthode de coloration, les kystes de giardia apparaissent non colorés

et assez réfringents. Ils sont ovales, de 8 à 12 µm de longueur et présentent généralement un

signe en forme de vague (voir figure 24). Certains kystes apparaissent légèrement plus petits

(entre 8 et 10 µm de longueur) et renfermant un contenu granuleux visible. De nombreux

éléments sont également non colorés, ovalaires et de 10 à 15 µm de longueur. Il peut donc

être difficile de faire la distinction entre des kystes de giardia et des débris. De plus, dans

102

certaines zones où l’étalement est épais, les kystes de giardia sont difficilement visibles au

milieu des débris.

La coloration au saccharose ne modifie pas l’apparence des kystes de giardia. Ils sont

non colorés, réfringents et leur morphologie n’est pas modifiée (voir figure 24). Comme pour

la méthode sans coloration, des débris peuvent facilement être confondus avec des kystes. Les

kystes sont très difficilement repérables dans les zones où l’étalement est plus épais.

La coloration au saccharose est donc très peu spécifique pour le genre Giardia.

Figure 24 : Kystes de giardia sur une lame non colorée (à gauche) et dans une solution de

saccharose (objectif x40)

Lors de coloration au lugol, les kystes apparaissent ovales de 8 à 10 µm de longueur.

La paroi est colorée en brun-vert et souligne la couleur orangée du cytoplasme (voir figure

25). La teinte prise par les kystes de giardia avec le lugol permet de pouvoir les distinguer à

l’objectif x10, ils sont également facilement détectables parmi les débris. Les débris,

d’apparence proche des éléments parasitaires de Giardia sans coloration, ne prennent pas la

même teinte que les kystes ce qui permet de les distinguer. Toute la lame est colorée en

orangé-brun, il n’y a donc pas un très bon contraste avec les kystes de giardia qui apparaissent

légèrement plus bruns que les débris.

La coloration au lugol colore uniquement les kystes de giardia en marron avec la paroi

soulignée de vert, cette méthode permet donc de différencier les kystes de giardia du reste des

éléments présents sur la lame. A ce titre, elle parait très spécifique pour la détection des

éléments parasitaires du genre Giardia.

103

Figure 25 : Kystes de giardia colorés par du lugol (objectif x40)

Après la réalisation de la technique de Heine, les kystes de giardia sont révélés par une

couleur rose entourée par une paroi plus sombre, ils sont ovales et de 8 à 12 µm de longueur

(voir figure 26). Tous les éléments présents sur la lame sont colorés en rose. Des débris de la

taille des kystes apparaissent moins colorés que ceux-ci ce qui permet de faire la distinction

(voir figure 26). Mais lorsque ces débris ressemblants aux kystes se superposent à d’autres

débris, il devient difficile de les distinguer des éléments parasitaires de G. intestinalis.

Les kystes de giardia sont mis en évidence par la coloration de Heine, par la teinte rose

et la paroi noire acquise après coloration. En ce sens, la coloration par la fuchsine semble

relativement spécifique des giardia, car ils prennent un aspect permettant leur différenciation.

Cependant, les autres éléments de la lame apparaissent dans des teintes très proches de celles

des kystes de G. intestinalis.

Figure 26 : Kystes de giardia et artefact colorés par la méthode de Heine (objectif x40)

104

Le colorant le plus spécifique pour la détection des kystes de G. intestinalis est le

lugol, il permet une bonne visualisation des éléments parasitaires et une bonne distinction de

ceux-ci avec les débris.

c) Genre Eimeria

Dans le genre Eimeria, il existe différentes espèces, 11 d’entre elles sont retrouvées

chez les bovins. Les différentes espèces sont distinguables par leur forme, leur taille, leur

contenu, la présence de micropyle ou de capsule polaire et leur couleur.

Les différentes espèces d’Eimeria apparaissent légèrement réfringentes lors de

coproscopie sans colorant. La paroi de l’oocyste est foncée, la cellule unique qui remplit plus

ou moins l’oocyste apparait granuleuse, grise et réfringente (voir figure 27). Les oocystes

d’Eimeria sont bien visibles sur les lames, ils peuvent être plus difficiles à distinguer lors

d’amas de débris.

La distinction des espèces se fait en mesurant les éléments parasitaires dans leur

longueur et leur largeur. La couleur, la forme, la présence d’un micropyle ou d’une capsule

polaire et la taille de la cellule unique par rapport à l’oocyste sont des éléments importants

pour la distinction des espèces. E. subspherica, E. zuernii, E. alabamensis, E. bovis, E.

cylindrica et E. ellipsoidalis sont de couleur claire (cf. photographies A à F figure 27), leur

contenu apparait de couleur rose et très réfringent. Les espèces E. auburnensis et E.

brasiliensis ont une teinte jaune-marron et E. bukidnonensis et E. pellita apparaissent marron

(cf. photographies G à I figure 27).

105

Figure 27 : Oocystes d’Eimeria photographiés sur des lames non colorées (objectif x40)

A : E. zuernii ; B : E. alabamensis ; C : E. bovis ; D : E. subspherica ; E : E. cylindrica;

F : E. canadensis ; G : E. auburnensis ; H : E. brasiliensis ; I : E. pellita

Les éléments parasitaires du genre Eimeria ne sont pas colorés par le saccharose, le

cytoplasme apparait rosé tout comme ce que l’on peut observer sans coloration (voir figure

28).

Il n’apparait aucune différence pour toutes les espèces d’Eimeria entre leur apparence

sans colorant et dans le saccharose.

La coloration par une solution de saccharose n’est donc pas spécifique du genre

Eimeria puisque celle-ci ne les colore pas et ne modifie nullement leur aspect.

A B C

D

A

E F

G H I

106

Figure 28 : Oocystes d’Eimeria dans une solution de saccharose (objectif x40)

A : E. zuernii ; B : E. alabamensis ; C : E. bovis ; D : E. subspherica ; E : E. cylindrica;

F : E. canadensis ; G : E. auburnensis ; H : E. pellita

Sur les lames colorées au lugol, les éléments parasitaires du genre Eimeria

apparaissent teintés en jaune plus ou moins foncé sur un fond jaunâtre, la morphologie n’est

pas modifiée (cf. figure 29). La distinction par la couleur devient plus difficile car les

différentes teintes naturelles des oocystes sont modifiées par la couleur jaune. Les oocystes

des espèces incolores à roses sans colorant apparaissent alors jaune, alors que les oocystes

jaunâtres apparaissent légèrement plus foncés. Cela diminue donc le contraste de couleur

entre les diverses espèces (voir figure 29 G).

A B C

D E F

G H

107

Figure 29 : Oocystes d’Eimeria colorés par le lugol (objectif x40)

A : E. zuernii ; B : E. alabamensis ; C : E. bovis ; D : E. canadensis ; E : E. auburnensis

F : E. bukidnonensis ; G : E. bovis et E. alabamensis

Comme lors de la recherche de G. intestinalis, la coloration à la fuchsine colore tous

les éléments de la lame. Les oocystes d’Eimeria sont donc également colorés en rose.

Certaines espèces apparaissent moins colorées comme E. zuernii ou E. alabamensis (cf. figure

30 A et B) Au contraire E. bovis semble mieux prendre le colorant et apparait souvent plus

foncé dans les mêmes zones (voir figure 30 C et F).

Comme la coloration au lugol, la coloration à la fuchsine ne modifie pas la

morphologie des oocystes mais seulement leur couleur. Les oocystes colorés perdent leur

réfringence et semblent être moins facilement différenciables des débris.

A B C

D

A

E F

G

108

Figure 30 : Oocystes d’Eimeria colorés par la fuchsine (objectif x40)

A : E. zuernii ; B : E. alabamensis ; C : E. bovis ; D : E. cylindrica; E : E. auburnensis

F : E. bovis et E. zuernii

Sans coloration les oocystes du genre Eimeria sont plus facilement repérables sur la

lame en raison d’un meilleur contraste. De plus, les douze espèces d’Eimeria sont plus

facilement distinguables lorsqu’elles ne sont pas colorées car le critère de la couleur est alors

utilisable.

A B C

D E

F

109

3. Comparaison de la mise en pratique des différentes techniques de

coloration de formes parasitaires de protozoaires

a) Temps de préparation

Les 3 techniques de coloration comparées dans cette étude sont des méthodes rapides.

Le temps de réalisation des techniques est court et approximativement identique pour les

colorations au saccharose, au lugol et à la fuchsine.

Pour ces 3 techniques, le temps de préparation est évalué à 1 minute 30 environ.

Le temps de manipulation de la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée est cependant bien

plus long. Il correspond au temps de réalisation d’un frottis, de séchage de celui-ci et le temps

de réalisation des différentes étapes de coloration, décoloration et recoloration.

Le temps de manipulation est donc d’environ 8 minutes, mais il faut rajouter la durée

de séchage après la réalisation du frottis et après les étapes de coloration, il faut donc au

minimum une heure et demie entre la réalisation du frottis et la lecture de la lame.

Les techniques de coloration au lugol, au saccharose et à la fuchsine sont les méthodes

de coloration ayant une durée de réalisation très courte.

Ces techniques ne rajoutent que très peu de temps de manipulation à la réalisation

d’une coproscopie sans coloration.

b) Coût des différentes techniques de coloration

Les colorations employées dans cette étude nécessitent des solutions différentes pour

chaque technique, il est donc intéressant de connaitre le coût total de chaque technique.

Seul le coût cumulé des colorants, des solutions de fixation et des décolorants a été

calculé. Les tarifs ont été relevés sur le catalogue en ligne de la société Merck millipore.

La technique de Ziehl-Neelsen modifiée est la technique nécessitant le plus de

solutions. Le coût estimé pour la coloration d’une centaine de lames est de 7,38 €.

La technique de coloration au lugol s’avère être la moins couteuse. En effet, la

coloration de 100 lames est estimée à 0,04 €.

110

La réalisation d’une solution de saccharose permettant de colorer 100 lames coûte

0,53€.

Pour la méthode de Heine, le coût correspondant au volume de fuchsine phéniquée

nécessaire pour traiter 100 lames est de 1, 03 €.

Toutes ces techniques sont très peu onéreuses, la plus chère étant la méthode de Ziehl-

Neelsen modifiée dont le coût est d’un peu plus de 7 centimes par lame.

c) Facilité de lecture des différentes techniques

Selon le parasite recherché, certaines techniques donnent des lames plus faciles à lire

que d’autres.

Pour la recherche de cryptosporidies, les lames obtenues à l’aide d’une coloration de

Ziehl-Neelsen modifiée sont faciles à lire en raison d’un fort contraste entre les éléments

parasitaires recherchés colorés en rose et le fond vert.

La solution de Sheather colore les C. parvum en rose et ils deviennent réfringents. Le

contraste n’est pas très important mais le fait que les oocystes apparaissent plus colorés sur un

fond grisâtre facilite la lecture. De plus, lorsque les fèces analysées sont très liquides, le

mélange des selles à cette solution fait remonter les oocystes et les repousse sur les bords de la

lamelle. Ils se retrouvent alors juste en dessous de la lamelle et sur le pourtour de celle-ci, ce

qui facilite la recherche surtout lors d’une faible quantité d’oocystes.

Pour les lames colorées par de la fuchsine ou du lugol, la lecture est plus délicate en

raison de la non-coloration des oocystes. En effet, il semble plus difficile de voir des éléments

incolores sur un fond coloré que l’inverse. A cela s’ajoute la difficulté lorsque des éléments

parasitaires se superposent à des débris colorés.

Pour la recherche des cryptosporidies, les colorations donnant des lames ayant la plus

grande facilité de lecture sont donc le saccharose et la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée.

111

Pour la recherche des éléments parasitaires de Giardia, les techniques ne colorant pas

les kystes, comme la solution de Sheather, ne permettent pas une lecture facile des lames. En

effet, les kystes étant de petite taille et incolores, ils ressortent difficilement sur le fond

incolore.

Au contraire la coloration de Heine colore tous les éléments présents sur la lame en

rose. Il est alors difficile de détecter les kystes de G. intestinalis, la lecture est rapidement

fatigante en raison de l’apparence de tous les débris.

La coloration au lugol donne des lames avec un meilleur contraste entre les kystes de

giardia de couleur brun et le fond avec des débris jaune-orangé. De plus la lame peut être

parcourue plus rapidement en l’observant à l’objectif x10.

La coloration au lugol semble être la technique permettant la lecture la plus facile pour

la détection des kystes de giardia.

Lors de la recherche d’oocystes du genre Eimeria, les méthodes ne colorant pas les

formes parasitaires comme la méthode sans coloration ou le saccharose, donnent des lames

relativement faciles à lire, les oocystes d’Eimeria apparaissant légèrement colorés sur fond

incolore.

Les méthodes colorant les oocystes d’Eimeria c’est-à-dire les méthodes de Heine et au

lugol, colorent également le fond de la préparation, cela diminue donc le contraste entre les

éléments parasitaires recherchés et les débris.

Les méthodes sans coloration et au saccharose donnent les lames les plus faciles à lire

pour la recherche d’éléments parasitaires du genre Eimeria.

4. Comparaison de différentes durées des étapes de la coloration de Ziehl-

Neelsen modifiée

Divers protocoles de Ziehl-Neelsen modifiés ont été publiés.

Ils présentent des temps de coloration à la fuchsine différents, ils varient de 4 minutes

à 1 heure. Deux types de solutions ont été décrits pour l’étape de décoloration, un mélange

acide-alcool ou une solution d’acide sulfurique. La recoloration peut également se faire de

112

plusieurs façons, du vert de malachite est utilisé pour recolorer le frottis. La durée de

recoloration varie de 30 secondes à 15 minutes. Du bleu de méthylène peut également être

utilisé.

Des frottis ont été colorés en utilisant différents temps de coloration à la fuchsine (4, 5,

15, 30 minutes et 1 heure). L’étape de décoloration s’est effectuée à l’aide d’un mélange

acide-alcool pendant quelques secondes suivie d’une recoloration par une solution de vert de

malachite à 0,5% pendant 1 minute. Les frottis issus de ces essais sont colorés de façon

presque identique.

Quelques soit le temps de coloration par la fuchsine, les oocystes se colorent de façon

identique.

Des frottis ont été colorés et décolorés en suivant le protocole de l’annexe 24. L’étape

de recoloration s’est effectuée à l’aide de vert de malachite à 0,5%. Plusieurs temps de

recoloration ont été testés : 30 secondes, 1 minute, 5 minutes, 10 minutes et 15 minutes.

Les débris présents sur les lames se recolorent tous de la même façon quel que soit la

durée de recoloration.

Il n’y a pas d’influence de la durée de coloration ou de recoloration sur la qualité de

coloration du frottis.

113

IV. DISCUSSION

L’observation des formes kystiques de protozoaires digestifs dans les selles peut être

facilitée ou non par l’utilisation de méthodes de coloration. Le travail présenté dans cette

thèse a été réalisé afin de faire un bilan des techniques de coproscopie employées en France

pour la recherche des protozoaires digestifs, mais également afin d’effectuer une comparaison

de 3 méthodes de coloration rapides pour la détection de ces parasites dans les fèces de jeunes

ruminants.

A. ENQUETE SUR LES METHODES DE DETECTIONS DES PROTOZOAIRES

DIGESTIFS EN FRANCE

Près de 90% des laboratoires français ayant répondu à notre enquête déclarent utiliser

des méthodes de coloration pour la détection des protozoaires digestifs.

Pour la recherche de C. parvum, les méthodes les plus utilisées sont la méthode de

Ziehl-Neelsen modifiée (dans 50% des laboratoires), puis celle de Heine (36%) et la méthode

de coloration au saccharose (14%).

Pour la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée, les laboratoires utilisent des protocoles

légèrement différents. Les temps de coloration à la fuchsine varient, la décoloration est

réalisée par un mélange d’acide et d’alcool ou par une solution d’acide sulfurique, la

recoloration s’effectue avec du vert de malachite, avec une concentration et un temps d’action

variant ou avec du bleu de méthylène.

Parmi les laboratoires recherchant les cryptosporidies, 10% d’entre eux ont choisi

l’emploi d’une méthode immunologique pour cette recherche. Le tarif moyen d’une recherche

de C. parvum par coloration est de 9,60 € alors qu’il est d’environ 15 € lors de l’emploi d’une

technique immunologique.

Lors de la recherche de kystes de giardia, les méthodes employées par les LVD et

LDA sont la coloration au lugol, majoritairement, ainsi que la méthode de MIF. Le tarif

moyen est d’environ 11 € pour une coloration.

114

Pour cette recherche, près d’un quart des laboratoires utilise une technique

immunologique, le tarif moyen est alors de près de 19 €.

Aucun laboratoire n’a spécifié utiliser une méthode de coloration ou immunologique

pour rechercher les oocystes du genre Eimeria.

Les laboratoires interrogés sur leurs critères de choix des techniques de coloration ont

répondu majoritairement sélectionner la méthode de coloration en fonction du parasite

recherché et de la facilité de lecture de la lame obtenue.

Ainsi les méthodes citées par les laboratoires lors de notre enquête pour la recherche

de C. parvum et de G. intestinalis, sont les plus rencontrées dans la bibliographie. Les

méthodes employées par les laboratoires sont les techniques jugées comme ayant de bonnes

sensibilités et spécificités [Khelef et al. (2002)].

Les différents protocoles de la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée utilisés par les

laboratoires proviennent de modifications par différents auteurs. Certains protocoles se

rapprochent de la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée par Henriksen et Pohlenz, la

décoloration s’effectuant avec de l’acide sulfurique [Henriksen et Pohlenz (1981)], d’autres se

rapprochent de la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée par Angus qui est beaucoup plus

rapide, la solution décolorante est alors un mélange d’acide chlorhydrique et d’éthanol

[Boufassa-Ouzrout et al. (1986)]. Les derniers sont issus de la modification de la méthode de

Ziehl-Neelsen par Kinyoun qui utilise une décoloration à l’aide d’un mélange acide-alcool

mais également la recoloration dans du bleu de méthylène [Ortolani (2000)].

Selon certains chercheurs comme Addis [Addis et al. (1991)], les techniques

immunologiques sont très spécifiques et très sensibles, elles permettent donc de réaliser une

bonne analyse des fèces. Les tarifs des techniques immunologiques semblent supérieurs à

ceux des techniques de coloration. Certains auteurs ont montré un coût équivalent entre une

technique immunochromatographique et un montage au sucrose pour la détection de

cryptosporidies chez des veaux [Trotz-Williams et al. (2005)], mais ces tests sont rapides et

peuvent être réalisés par du personnel non expérimenté. Les tests ELISA nécessitent une

préparation par du personnel qualifié même s’il n’est pas nécessaire que celui-ci soit

spécialisé en parasitologie. Le laboratoire doit être équipé du matériel nécessaire à la

115

réalisation de cette analyse, cela implique donc un coût supplémentaire. L’analyse d’un

prélèvement par une technique ELISA parait donc plus coûteuse que par de

l’immunochromatographie ou de la coloration.

Dans les articles écrit par O’Donoghue et Martinez et Belda Neto [O’Donogue (1995)

et Martinez et Belda Neto (2001)], les auteurs ont montré que les différentes colorations

utilisées pour la recherche de C. parvum n’ont pas la même sensibilité, ni la même spécificité,

il en est de même pour G. intestinalis. Il parait donc raisonnable de choisir la méthode de

coloration en fonction du parasite recherché comme le fait la majorité des laboratoires. De

plus la spécificité des colorants permet en général d’améliorer la lecture de la lame en limitant

les situations douteuses, ce qui est également un autre critère choisi par les laboratoires.

116

B. METHODOLOGIE

Parmi les nombreuses méthodes permettant la coloration d’un échantillon de fèces

pour la recherche de protozoaires intestinaux, nous avons choisi de comparer 3 techniques : le

montage au saccharose, la méthode de Heine et la coloration au lugol.

Ces colorations ont été sélectionnées en raison de plusieurs critères. Comme notre

enquête l’a montrée, ces méthodes font partie des colorations les plus utilisées par les

laboratoires français, ce sont aussi les plus décrites en médecine humaine comme vétérinaire

[Polack et al. (1983), O’Donoghue (1995), Hendrix (1998)]. Ces techniques font également

parties des colorations réalisables entre lames et lamelles, elles sont rapides et les solutions

nécessaires sont faiblement toxiques pour les manipulateurs et pour l’environnement. De plus

la même quantité de fèces est utilisée dans ces différentes techniques ce qui permet de pouvoir

les comparer. La technique de MIF n’a pas été sélectionnée car selon Bailenger, celle-ci

donne des résultats semblables au lugol pour la coloration des kystes de giardia avec des

réactifs plus compliqués à préparer [Bailenger (1982)].

Finalement, les colorations de Heine, au saccharose et au lugol ont été choisies en

raison de leurs importances bibliographiques, de leur fréquence d’utilisation et de leur rapidité

de réalisation.

Afin de pouvoir les comparer, des méthodes de référence ont été choisies pour la

recherche des 3 genres de protozoaires intestinaux étudiés.

Pour la comparaison des méthodes de coloration pour les genres Giardia et Eimeria, la

méthode de référence que nous avons sélectionnée est une méthode sans coloration. En effet,

dans l’enquête aucun laboratoire n’a mentionné utiliser de colorant pour l’observation des

coccidies, de plus de nombreuses études utilisent une technique sans coloration comme

méthode coproscopique pour la recherche de G. intestinalis dans le cadre de comparaison

avec d’autres techniques de diagnostic [Dixon et al. (1997), Aldeen et al. (1995)].

Pour la comparaison des méthodes de coloration lors de la recherche des oocystes de

C. parvum, la méthode de référence choisie est la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée. Cette

technique a été choisie en raison de son importance historique et bibliographique, en effet de

nombreux articles ont été rédigés sur cette méthode et l’ont comparé à d’autres colorations ou

méthodes immunologiques ou de biologie moléculaire [Garcia et al. (1983), Casemore et al.

117

(1985) et MacPherson et McQueen (1993)]. Elle a également été choisie en raison de sa forte

fréquence d’utilisation dans les LDA et LVD.

Pour choisir le protocole de Ziehl-Neelsen modifié, nous avons coloré des frottis selon

les différents protocoles mentionnés par les laboratoires dans le questionnaire. Aucune

différence n’a été observée. Le temps de coloration par la fuchsine a donc été réduit à 4

minutes, le temps de recoloration dans du vert de malachite à 0,5% à 1 minute. Cela permet

de faciliter la succession des manipulations et de diminuer le temps nécessaire à la coloration

du frottis. La solution décolorante utilisée est le mélange acide-alcool, comme décrit par

Beugnet [Beugnet et al. (2004)]. Selon Lenette cité par Martinez [Martinez et Belda Neto

(2001)], ce protocole permet également d’éviter un excès de fuchsine sur la lame, ce qui

diminue le temps de lecture du frottis.

Pour la réalisation des techniques lors de la recherche de C. parvum, seule une goutte

de fèces est nécessaire. Cette faible quantité de selles utilisée peut donc introduire un biais de

prélèvement, en effet, même si l’échantillon est homogénéisé, la quantité d’éléments

parasitaires présente dans la goutte peut être très différente. L’analyse peut donc ne pas être

représentative du nombre d’oocystes présent dans l’échantillon de fèces. Il en est de même

pour la recherche de G. intestinalis et d’Eimeria, malgré une quantité de matière fécale

nécessaire plus importante (5 grammes), il peut également avoir une fluctuation du nombre

d’éléments parasitaires dans chaque portion du prélèvement [Cartwright (1999)]. Ce biais est

donc présent pour tous les échantillons et donc toutes les techniques, par conséquent, la

comparaison des techniques les unes par rapport aux autres ne doit pas être modifiée par ce

biais.

Lors de la réalisation de la technique de Ziehl-Neelsen modifiée, la qualité du frottis

est très importante. En effet, lorsque la matière fécale est mal répartie, les oocystes se

superposent et forment des amas avec les débris, les lames sont alors plus difficiles à lire. Le

nombre d’oocystes peut donc être sous-estimé lors de mauvaise réalisation du frottis.

118

C. COMPARAISON DES 3 METHODES DE COLORATION

1. Pour la recherche de C. parvum

Lors de la comparaison des méthodes de coloration pour la mise en évidence de C.

parvum, Le montage au saccharose s’est avéré aussi sensible que la méthode de Ziehl-Neelsen

modifiée, il est également très spécifique. Les colorations au lugol et de Heine sont

significativement moins sensibles que la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée et le montage au

saccharose, celles-ci sont également plus difficiles à lire en raison d’un faible contraste et de

la présence d’un grand nombre de débris colorés. La coloration par la fuchsine reste

cependant plus spécifique que la coloration par le lugol.

Le coût des colorants de toutes les techniques comparées est sensiblement identique

(inférieur à 1€ pour 100 lames) sauf pour la méthode de Ziehl-Neelsen où celui-ci est plus

important (7€ pour 100 colorations), cela reste négligeable sur le coût total de l’analyse

coproscopique.

Dans un article écrit par Garcia et al. en 1983, il a été montré que le montage au

saccharose et une coloration de Ziehl-Neelsen modifiée sont deux méthodes de diagnostic très

efficaces lorsque le nombre d’oocystes présents dans les selles est assez important, ce que

confirme notre étude.

Les lames colorées par le saccharose sont faciles à lire en raison de la teinte rosée prise

par les oocystes mais également grâce à leur réfringence ce qui a été observé lors de nos

expérimentations ainsi que par MacPherson et McQueen en 1993. Peter O’Donoghue décrit

dans un article qu’un microscope optique à contraste de phase peut être utilisé pour augmenter

le contraste, les oocystes de C. parvum apparaissent alors clairs et biréfringents sur un fond

noir alors que les levures ne deviennent pas réfringentes [O’Donoghue (1995)].

La lecture de la lame se fait très rapidement, moins de 3 minutes selon MacPherson et

McQueen (1993), environ 10 minutes d’après Trotz-Williams, pour réaliser les manipulations

et la lecture [Trotz-Williams et al. (2005)].

Par contre, comme l’a décrit MacPherson et McQueen, la solution est très poisseuse et

visqueuse, elle peut donc être pénible à manipuler et le matériel doit être régulièrement rincé à

l’eau.

La solution de saccharose est très facile à réaliser, elle peut être faite à partir de

saccharose ou de sucre blanc. Pendant la durée de nos expériences, elle a été conservée au

frais, dans un flacon hermétiquement fermé au cours de ce travail et n’est pas apparue

119

contaminée. Elle peut cependant être contaminée par des moisissures, il peut donc être

nécessaire de la renouveler.

En résumé, la coloration au saccharose est sensible et spécifique pour la recherche

d’oocystes de C. Parvum. De plus, le coût est faible, la préparation et la lecture sont très

rapides en raison de la simplicité du protocole et la facilité de lecture des lames.

La coloration par le lugol n’est pas souvent décrite dans les articles pour la mise en

évidence de C. parvum, en effet notre étude a montré qu’elle est significativement moins

sensible que la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée ou le montage au saccharose. Elle apparait

également moins spécifique, la morphologie des oocystes n’est pas bien conservée ils sont

parfois difficiles à distinguer de certains débris incolores de taille identique.

La lecture des lames parait difficile en raison du faible contraste, en effet, comme la

décrit Garcia, cette méthode est une coloration négative (les oocystes sont incolores sur un

fond coloré), ce qui est plus difficile à lire que les autres colorations [Garcia et al. (1983)].

La méthode de Heine est une technique de coloration des cryptosporidies

fréquemment décrite. Dans ce travail, la sensibilité de cette méthode s’est avérée

significativement inférieure à celle des colorations de Ziehl-Neelsen et au saccharose,

pourtant elle a été décrite comme étant une des méthodes les plus sensibles par Khelef [Khelef

et al. (2002)]. Cette différence de sensibilité peux provenir de la méthode d’observation, en

effet au cours de ce travail, les lames ont été observées à l’aide d’un microscope sans

contraste de phase, alors qu’elles ont été observées avec un microscope à contraste de phase

dans l’étude dirigée par D. Khelef. Il est donc possible que ce soit la modification de la mise

en évidence faite par le microscope à contraste de phase qui augmente la sensibilité [Vohra et

al. (2012)].

La spécificité de la coloration par la fuchsine semble bonne, mais les lames colorées

sont difficiles à lire en raison de la coloration négative, tout comme pour la coloration par le

lugol.

Avec cette coloration, nous avons pu lire correctement les lames jusqu’à 24 heures

après la coloration. Cela n’est pas le cas avec l’observation à l’aide d’un microscope à

contraste de phase où la lecture doit être effectuée dans les 15 minutes [Boufassa-Ouzrout et

al. (1986)]. La conservation des lames est donc correcte même si elle reste inférieure à celle

des lames issues de la technique de Ziehl-Neelsen modifiée, mais la méthode de Heine est

plus rapide et moins coûteuse [Amato Neto et al. (1996), Vohra et al. (2012)].

120

La méthode de Heine est une méthode rapide, peu coûteuse mais elle est peu sensible

lorsqu’elle est observée au microscope sans contraste de phase. La sensibilité peut être

augmentée par l’utilisation d’un microscope à contraste de phase, par conséquent, les lames

sont plus faciles à lire mais elles doivent être observées rapidement et le matériel nécessaire

est assez couteux.

Au final, les colorations les plus efficaces pour la détection de C. parvum sont la

méthode de Ziehl-Neelsen modifiée et la coloration au saccharose. Cette dernière est à

conseiller en raison de sa rapidité, sa facilité de lecture et son très faible coût. Elle peut aussi

être facilement réalisée en laboratoire ainsi qu’en clinique vétérinaire.

2. Pour la recherche de G. intestinalis

Dans la bibliographie, le saccharose a été décrit comme une solution ne colorant pas

les kystes de giardia, c’est également ce que l’on a pu constater au cours des

expérimentations. Le montage au saccharose s’avère donc identique à un protocole sans

coloration, par conséquent la sensibilité de ce test est semblable à celle de la méthode sans

coloration. Les kystes sont visibles sans coloration [Dixon et al. (1997)], mais ceux-ci peuvent

être confondus avec des débris végétaux, ce qui complique la lecture.

La solution de saccharose peut toutefois avoir une utilité comme liquide de flottation

pour faciliter la détection des kystes du genre Giardia, [McNabb et al. (1985), Weber et al.

(1992)].

Lors de nos expérimentations, la coloration par le lugol s’est montrée la technique la

plus sensible pour la mise en évidence de G. intestinalis, ce résultat est en accord avec la

bibliographie, en effet, cette méthode est la technique conseillée par la plupart des auteurs

pour le diagnostic de giardiose en coproscopie [Beugnet et al. (2000), Dorchies et al. (2012)].

La spécificité de cette technique s’avère importante et très intéressante car celle-ci permet de

distinguer facilement les débris végétaux des kystes de giardia qui changent légèrement de

morphologie au contact du lugol. La coloration par une solution de lugol peut donc être

utilisée pour détecter les kystes de giardia mais aussi pour confirmer leur présence lors d’un

doute sur une coproscopie simple [Dorchies et al. (2012)].

121

La teinte prise par les kystes grâce au lugol permet de les repérer plus aisément sur la

lame, celle-ci permet également de les discerner facilement lors d’une observation à l’objectif

x10 au lieu de x40 sans coloration, cela diminue donc le temps de lecture. Mais le lugol colore

également un grand nombre de débris rendant la lame plus difficile à lire.

La solution de lugol se conserve bien lorsqu’elle est maintenue dans un flacon

hermétique [Bailenger (1982)], de plus elle est peu coûteuse, rapide et demande peu de

matériel, cette méthode peut donc être effectuée en laboratoire et dans les cliniques

vétérinaires.

Les lames doivent être observées rapidement après la coloration, en effet, au bout de

quelques dizaines de minutes, le lugol cristallise sur le pourtour de la lamelle. De plus, selon

Tangtrongsups, les kystes semblent se collaber après une vingtaine de minutes, l’identification

devient alors plus difficile [Tangtrongsups et Scorza (2010)].

La coloration par le lugol est une méthode sensible et spécifique. Cette technique peut

être parfois difficile à lire, mais elle permet d’augmenter la sensibilité et la rapidité de lecture

par rapport à une coproscopie simple sans en augmenter la durée ni le coût.

La méthode de Heine n’a pas été décrite pour la mise en évidence des kystes de

giardia. Cependant, nous avons observé que la fuchsine colore les kystes en rose mais cette

méthode est significativement moins sensible que le lugol.

La lame est cependant difficile à lire car la fuchsine colore les débris et les kystes dans

la même teinte, il peut donc s’avérer nécessaire d’utiliser une autre technique pour donner un

diagnostic précis [Badparva et al. (2009)].

La méthode de coloration la plus efficace pour mettre en évidence les kystes de giardia

est donc la coloration au lugol, elle est rapide et peu coûteuse, elle peut également être utilisée

pour confirmer un diagnostic douteux sur une coproscopie simple.

3. Pour la recherche d’Eimeria

Tout comme pour les kystes de giardia, le saccharose n’a pas été décrit comme

permettant une modification de couleur ou de morphologie des oocystes d’Eimeria, ce qui

correspond aux observations faites pendant ce travail. Le montage de la lamelle issue d’une

122

concentration par flottation dans du saccharose ne montre donc aucun intérêt. Cependant la

solution de Sheather peut être utilisée directement pour la flottation [McNabb et al. (1985),

Weber et al. (1992)]. En effet cette solution est utile car nous avons pu constater qu'elle ne

cristallise pas rapidement et ne déforme par les oocystes.

Nous avons observé que le lugol donne une teinte jaunâtre à tous les éléments présents

sur les lames (hormis les oocystes de C. parvum et les kystes de giardia), il teinte donc

également les oocystes d’Eimeria ce qui diminue le contraste. La sensibilité est également

diminuée par rapport à une méthode sans coloration, de plus le jaunissement des oocystes ôte

le critère de couleur des caractéristiques utilisables pour l’identification des espèces

d’Eimeria. Il a été constaté au cours de cette étude, que les oocystes d’E. bovis, se colorent

mieux que les autres, ceux-ci sont donc plus faciles à reconnaitre grâce au lugol, mais cette

solution améliore seulement l’identification de cette espèce. Ces observations n’ont pas été

mentionnées dans d’autres études, il convient donc de rester prudent quant à ces constatations.

Tout comme la coloration au lugol, l’action de la fuchsine sur les oocystes d’Eimeria

n’a pas été décrite dans la bibliographie. Les colorations réalisées au cours de cette étude,

nous ont permis de voir que la fuchsine colore les oocystes de coccidies et les débris

végétaux, la lecture de la lame est rendue plus difficile en raison d’une diminution du

contraste par rapport à une lame non colorée. L’identification des espèces est également

compliquée par la fuchsine sauf pour les oocystes d’E. bovis qui apparaissent plus foncés que

les autres après l’action du colorant, mais cette observation n’a pas été confirmée par d’autres

études.

Au final, les colorations au lugol et à la fuchsine apparaissent néfastes sur la mise en

évidence et l’identification des espèces d’Eimeria. Le montage au saccharose semble inutile.

La méthode la plus efficace pour la recherche de coccidies est donc la coproscopie simple.

123

Pour conclure, certaines méthodes de colorations rapides permettent d’améliorer la

sensibilité et de faciliter la lecture lors de la recherche de formes kystiques de C. parvum ou

de G. intestinalis. De plus elles peuvent être aisément réalisées en laboratoire ou en clinique

vétérinaire. Mais il est important de choisir le colorant en fonction de l’hypothèse

diagnostique.

Lors de la recherche des oocystes d’Eimeria ainsi que leur identification, l’utilisation

de colorant n’apporte pas d’intérêt et diminue même la sensibilité de la coproscopie. Un

protocole de coloration apparait donc inutile voire néfaste pour la détection des oocystes de

coccidies. Les colorants n’ont pas permis de faciliter l’identification des oocystes non

sporulés d’Eimeria, mais il pourrait être intéressant de réaliser à nouveau ce test sur des

oocystes sporulés.

Lors d’une demande de recherche de cryptosporidies, nous conseillons l’utilisation

d’une solution de saccharose pour mettre en évidence les oocystes de C. parvum, le montage

au saccharose étant facile à réaliser et à lire, aussi sensible qu’une méthode de Ziehl-Neelsen

modifiée tout en étant plus rapide et moins couteuse. L’utilisation du montage au saccharose

de façon systématique sur tous les prélèvements pourrait permettre la détection de

nombreuses cryptosporidioses sub-cliniques jusqu’à présent non détectées lors de

coproscopies simples.

En ce qui concerne la recherche de kystes de giardia, le lugol est le colorant rapide de

choix, il permet d’améliorer significativement la sensibilité et d’augmenter la rapidité de

lecture par rapport à une coproscopie simple. Malgré l’utilisation de ce colorant, le diagnostic

de giardiose peut parfois s’avérer délicat, l’utilisation de tests immunochromatographiques est

alors un bon moyen de réaliser ce diagnostic.

124

125

CONCLUSION GENERALE

Parmi les protozoaires présents chez les bovins, trois genres ont une importance

majeure. Les éléments parasitaires de ces genres sont détectables en coproscopie, mais la

petite taille de certains peut rendre le diagnostic difficile. D’autres méthodes d’examen des

selles peuvent alors être utilisées afin de les détecter, comme les méthodes immunologiques

ou de biologies moléculaires. Pour faciliter le diagnostic coproscopique, des techniques

utilisant des solutions colorantes ont été décrites, elles ont des sensibilités et des spécificités

différentes et ne concernent pas tous les protozoaires intestinaux.

Dans l’enquête réalisée pour ce travail auprès des LVD et LDA, la majorité d’entre

eux a choisi d’utiliser des techniques de coloration pour mettre en évidence les éléments

parasitaires de Giardia et de Cryptosporidium.

En effet, après comparaison de 3 méthodes de coloration rapides et couramment

utilisées dans les laboratoires, il existe des techniques assez sensibles et spécifiques.

Le lugol est le colorant le plus sensible et spécifique pour la détection des kystes de

giardia, c’est également le colorant le plus utilisé par les laboratoires pour cette recherche.

La méthode de Heine observée au microscope optique ne s’est pas avérée facile ni

efficace pour la détection des 3 genres de protozoaires étudiés.

La coloration au saccharose est aussi sensible et spécifique que la coloration de Ziehl-

Neelsen modifiée pour la mise en évidence de C. parvum. Le montage au saccharose est

cependant plus rapide et moins coûteux, c’est toutefois la méthode la moins utilisée dans les

laboratoires ayant répondus à l’enquête.

Aucun laboratoire n’a mentionné utiliser une méthode spéciale pour la détection des

coccidies, et lors de l’étude des colorants sur les éléments du genre Eimeria, aucune solution

colorant les éléments parasitaires n’a permis d’améliorer la sensibilité d’une coproscopie

simple.

Il est donc nécessaire d’avoir de bonnes hypothèses diagnostiques afin de pouvoir

mettre en place la technique correspondant au parasite recherché.

126

Les techniques de coloration spécifiques d’un parasite permettent le diagnostic de

façon aisée et elles sont réalisables par une personne non expérimentée. Des colorations

pourraient être testées pour la détection et la distinction d’autres éléments parasitaires, comme

par exemple pour les nématodes ou les trématodes.

127

127

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144

145

ANNEXES

146

Annexe 1 : Les sites de prédilections, les périodes prépatentes des espèces d’Eimeria chez

les bovins

[D'après TAYLOR et al. (2007)]

Espèces Site de prédilection Période prépatentes (en

jours)

Espèces pathogènes

E. alabamensis Intestin grêle et gros intestin 6-11

E. zuernii Intestin grêle et gros intestin 15-17 (12-14 pr georgi’s)

E. bovis Intestin grêle et gros intestin 16-21

Espèces non pathogènes

E. auburnensis Intestin grêle 16-24

E. brasiliensis ? ?

E. bukidnonensis ? ?

E. canadensis ? ?

E. cylindrica ? 10

E. ellipsoidalis Intestin grêle 8-13

E. pellita ? ?

E. subspherica ? 7-18

E. wyomingensis ? 13-15

147

Annexe 2 : Les sites de prédilections et les périodes prépatentes des espèces d’Eimeria

chez les ovins

[D'après Taylor et al. (2007)]

Espèces Site de prédilection Période prépatente (en

jours)

Espèces pathogènes

E. crandallis Intestin grêle et gros intestin 15-20

E. ovinoidalis Intestin grêle et gros intestin 12-15

Espèces non pathogènes

E.ahsata Intestin grêle 18-30

E. bakuensis Intestin grêle 18-29

E. faurei Intestin grêle et gros intestin 13-15

E. granulosa ? ?

E. intricata Intestin grêle et gros intestin 23-27

E. marsica ? 14-16

E. pallida ? ?

E. parva Intestin grêle et gros intestin 12-14

E. weybridgensis Intestin grêle 23-33

148

Annexe 3 : Les sites de prédilections et les périodes prépatentes des espèces d’Eimeria

chez les caprins

[D'après Taylor et al. (2007)]

Espèces Site de prédilection Période prépatente

(en jours)

Espèces pathogènes

E. caprina Intestin grêle et gros intestin 17-20

E. ninakohlyakimovae Intestin grêle et gros intestin 10-13

E. christenseni Intestin grêle 14-23

E. hirci ? 13-16

Espèces non pathogènes

E. alijevi Intestin grêle et gros intestin 7-12

E. aspheronica ? 14-17

E. arloingi Intestin grêle 14-17

E. caprovina ? 14-20

E. jolchijevi ? 14-17

149

Annexe 4 : Schéma et description de la morphologie des oocystes sporulés des espèces

d’Eimeria présentes chez les bovins

[D'après Taylor et al. (2007) et Dorchies et al. (2012)]

150

Espèces Description des oocystes Taille (µm)

Espèces pathogènes

E. alabamensis

Ovoïde, transparent, coque lisse, absence de micropyle,

absence de CR d’oocyste et de sporocyste

18 x 13,4

E. zuernii

Sphérique à subsphérique, transparent, absence de micropyle,

absence de corps résiduel d’oocyste et de sporocyste

15,6 x 17,8

E. bovis

Ovoïde à subsphérique, transparent, micropyle difficilement

visible, présence d’un CR

27,7 x 20,3

Espèces non pathogènes

E. auburnensis

Ellipsoïde à ovoïde, couleur jaune-marron, micropyle avec

granule polaire, absence de CR d’oocyste, présence de CR de

sporocyste

38,4 x 23,1

E. brasiliensis

Ellipsoïde à ovoïde, couleur jaune-marron, micropyle

recouvert d’une capsule polaire, granules polaires parfois

présent, absence de CR d’oocyste, présence de CR de

sporocyste

37 x 27

E.

bukidnonensis

Piriforme à ovoïde, aplati à un pôle, couleur jaune-marron,

coque striée, micropyle, granule polaire parfois présent

48,6 x 35,4

E. canadensis

Ovoïde à ellipsoïde, transparent à jaune, micropyle et granules

polaires, absence de CR d’oocyste, présence de CR de

sporocyste

32,5 x 23,4

E. cylindrica

Allongé à cylindrique, transparent, coque lisse, absence de

micropyle et de CR d’oocyste, présence de CR de sporocyste

23,3 x 12,3

E. ellipsoidalis

Ellipsoïde à ovoïde, transparent, coque lisse, absence de

micropyle et de CR d’oocyste, présence de CR de sporocyste

23,4 x 15,9

E. pellita

Ovoïde, coque marron présentant parfois des protubérances,

micropyle et granules polaires, absence de CR d’oocyste,

présence de CR de sporocyste

40 x 28

E. subspherica

Sphérique à subsphérique, transparent, absence de micropyle

et de CR d’oocyste et de sporocyste

11 x 10,4

E.

wyomingensis

Ovoïde, couleur jaune-marron, coque fine, présence d’un

micropyle, absence de CR

40,3 x 28,1

151

Annexe 5 : Schéma et description de la morphologie des oocystes sporulés des espèces

d’Eimeria présentes chez les ovins

[D'après Taylor et al. (2007)]

152

Espèces Description des oocystes Taille

moyenne

(µm)

Espèces pathogènes

E. crandallis

Ellipsoïde à subsphérique, avec ou sans capsule polaire,

absence de CR d’oocystes, présence de CR de sporocystes

21,9 x 19,4

E. ovinoidalis

Ellipsoïde, transparent à jaune pâle, absence de CR

d’oocystes, présence de CR de sporocystes

23 x 18

Espèces non pathogènes

E.ahsata

Ovoïde avec une capsule polaire, couleur jaune-marron,

absence d’oocyste résiduel

33,4 x 22,6

E. bakuensis

Ellipsoïde avec une capsule polaire, couleur jaune-marron

pâle, absence de CR d’oocystes, présence de CR de

sporocystes

31 x 20

E. faurei

Ovoïde, couleur jaune-marron pâle, absence de CR

d’oocystes ou de sporocystes

33 x 23

E. granulosa

En forme d’urne, avec une large capsule polaire, couleur

jaune- marron, absence d’oocystes résiduels

29,4 x 20,9

E. intricata

Ellipsoïde, coque mince et striée couleur marron, absence

d’oocystes résiduels

48 x 34

E. marsica

Ellipsoïde, micropyle inconstant, couleur pâle à jaune-

marron, absence de CR d’oocystes et de sporocystes

19 x 13

E. pallida

Ellipsoïde, coque fine, couleur pâle à jaune, absence de CR

d’oocystes, présence de CR de sporocystes

14 x 10

E. parva

Sphérique à subsphérique, couleur pâle, absence de CR

d’oocystes, présence de CR de sporocystes

16,5 x 14,0

E.

weybridgensis

Ellipsoïde à subsphérique, présence d’un micropyle avec ou

sans calotte, absence de CR d’oocystes ou de sporocystes

24 x 17

153

Annexe 6 : Schéma et description de la morphologie des oocystes sporulés des espèces

d’Eimeria présentes chez les caprins

[D'après Taylor et al. (2007)]

154

Espèces Description des oocystes Taille

moyenne (µm)

Espèces pathogènes

E. caprina

Ellipsoïde, couleur jaune-marron à marron foncé,

présence d’un micropyle et de CR de sporocystes.

absence de CR d’oocystes

32 x 23

E.

ninakohlyakimovae

Ellipsoïde, coque fine, transparent, absence de

micropyle et de CR d’oocyste, présence de CR de

sporocystes

20,7 x 14,8

E. christenseni

Ovoïde, coque fine, couleur claire à jaune pâle,

présence d’un micropyle, d’une capsule polaire et de

CR de sporocystes, absence de CR d’oocystes

38 x 25

E. hirci

Rond à ovale, couleur jaune pâle, présence d’un

micropyle et d’une capsule polaire, absence de CR

d’oocystes

20,7 x 16,2

Espèces non pathogènes

E. alijevi

Ovoïde à ellipsoïde, micropyle inconstant, transparent

à jaune pâle, absence de CR d’oocystes, présence de

CR de sporocystes

17 x 15

E. arloingi

Ellipsoïde, coque fine, présence d’un micropyle, d’une

capsule polaire de CR de sporocystes, absence de CR

d’oocystes

27 x 18

E. aspheronica

Ovoîde, couleur vert à jaune-marron, présence d’un

micropyle et de CRde sporocystes, absence de résidus

d’oocystes

31 x 32

E. caprovina

Ellipsoïde à subsphérique, transparent, présence d’un

micropyle et de CR de sporocystes, absence de résidus

d’oocystes

30 x 24

E. jolchijevi

Ellipsoïde à ovoïde, couleur jaune pâle, présence d’un

micropyle d’une capsule polaire et de CR de

sporocystes, absence de résidus d’oocystes

31 x 22

155

Annexe 7 : Protocole de coloration par la méthode de Bailenger et Faraggi

[Bailenger (1982)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Violet cristal

Fuchsine basique

Alcool à 95°

Phénol cristallisé

Eau distillée

PREPARATION PRELIMINAIRE :

Réactif :

Violet cristal : 50g

Fuchsine basique : 10mg

Alcool à 95° : 20 ml

Phénol cristallisé fondu : 4 ml

Eau distillée : 100 ml

Dissoudre le violet cristal et la fuchsine dans l’alcool à 95° et le phénol. Ajouter l’eau après

dissolution.

Maintenir le réactif à l’abri de la lumière dans un flacon hermétique. Utiliser

seulement le surnageant.

MODE OPERATOIRE :

1- Mettre une goutte de fèces liquide ou réaliser un mélange de fèces dans une goutte de

sérum physiologique

2- Avec le coin d’une lamelle mélanger une goutte de réactif

3- Recouvrir d’une lamelle

4- Observer au microscope avec un objectif à immersion

156

Annexe 8 : Protocole de coloration par la méthode M.I.F.

[Bailenger (1982)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Solution de lugol

Teinture de merthiolate n°99 à 1‰ Lilly

Solution de formol

PREPARATION PRELIMINAIRE :

Réactif :

Teinture de merthiolate : 77,5 ml

Lugol : 10 ml

Formol : 12,5 ml

Les proportions peuvent être modifiées car le lugol s’altère avec le temps, il peut alors

être nécessaire d’augmenter la proportion de lugol pour compenser sa détérioration.

La conservation du mélange ne dépasse pas 6 à 8 heures.

MODE OPERATOIRE :

1- Mélanger une goutte de réactif et une goutte d’eau distillée

2- Délayer une petite quantité de fèces

3- Recouvrir d’une lamelle

4- Observer au microscope optique à l’objectif x40

157

Annexe 9 : Protocole de coloration de la technique d’Heindenhain

[Bailenger (1982)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Alun de fer

Hématoxyline cristallisée

Alcool à 90°

PREPARATION PRELIMINAIRE :

Mordant :

Alun de fer : 3g

Eau distillée : 100 ml

La solution doit être réalisée à froid, elle est jaune et se conserve au réfrigérateur.

Colorant :

Solution mère :

Hématoxyline cristallisée : 10g

Alcool à 90° : 100 ml

Cette solution doit être préparée et laissée à la lumière diffuse pendant 15 jours minimum.

Solution extemporanée : dilution de la solution mère au dixième

Différenciateur : Mordant dilué au demi

MODE OPERATOIRE :

1- Réaliser un frottis fécal

2- Fixer la lame

3- Plonger la lame dans le mordant à 37°C pendant 30 minutes

4- Rincer à l’eau distillée

5- Plonger la lame dans la solution extemporanée de colorant pendant 30 minutes à 37°C

ou 24 heures à température ambiante

6- Laver la lame à l’eau distillée

7- Placer la lame sur la platine du microscope (ou sur une boite de Pétri pour ne pas salir

la platine du microscope)

8- Mettre quelques gouttes de différenciateur sur la lame

9- Lorsque les structures nucléaires ressortent, rincer la lame à l’eau courante

10- Réaliser le montage de la lame

11- Observer au microscope optique à l’objectif x40

158

Annexe 10 : Protocole de la méthode de coloration de Trichrome de gomori-Weathley

[Bailenger (1982)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Chromotrope 2R

Vert lumière SF

Acide phosphotungstique

Acide acétique cristallisable

Alcool à 90°

PREPARATION PRELIMINAIRE :

Colorant trichrome de Gomori :

Chromotrope 2R : 0,6g

Vert lumière SF : 0,3g

Acide phosphotungstique : 0,7g

Acide acétique cristallisable : 1 ml

15 à 30 minutes plus tard ajouter 100ml d’eau distillée

Alcool acétique :

Alcool à 90° : 10 ml

Acide acétique cristallisable : 1 goutte

MODE OPERATOIRE :

1- Réaliser un frottis fécal

2- Fixer au Schaudinn acétique

3- Laver le frottis

4- Plonger le frottis dans le colorant trichrome pendant une dizaine de minutes

5- Rincer rapidement à l’aide de l’alcool acétique (10 à 20 secondes)

6- Monter la lame

7- Observer au microscope optique à l’objectif x40

159

Annexe 11 : Protocole de la méthode de coloration au noir chlorazol de Kohn

[Bailenger (1982)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Noir chlorazol

Alcool éthylique à 90°

Alcool méthylique

Acide acétique cristallisable

Phénol cristallisé fondu

Solution aqueuse d’acide phosphotungstique à 1%

PREPARATION PRELIMINAIRE :

Réactif :

Noir chlorazol : 0,5g

Broyer au mortier et dissoudre progressivement dans le mélange suivant :

Alcool éthylique à 90° : 17 ml

Alcool méthylique : 16 ml

Acide acétique cristallisable : 2 ml

Phénol cristallisé fondu : 2 ml

Solution aqueuse d’acide phosphotungstique à 1% : 1,2ml

Eau distillée : q.s.p. 100 ml

Transvaser les portions bien dissoutes dans un flacon et laisser à la lumière pendant

plusieurs semaines. Un dépôt se forme, le réactif est un liquide limpide pourpre

MODE OPERATOIRE :

1- Réaliser un frottis fécal

2- Plonger le frottis encore humide dans le colorant pendant une dizaine d’heures

3- Rincer les frottis à l’eau courante

4- Monter la lame

5- Observer au microscope optique à l’objectif x40

160

Annexe 11 : Protocole de coloration par la méthode de Brooke et Goldman

[Bailenger (1982)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Alcool à 70°

Alcool à 50°

Lugol

MODE OPERATOIRE :

1- Réaliser et fixer un frottis fécal à l’aide d’un fixateur polyvinylique

2- Plonger le frottis fixé dans un bain d’alcool à 70° avec quelques gouttes de lugol

pendant 20 minutes

3- Plonger le frottis dans un bain d’alcool à 50° pendant 10 minutes

4- Plonger le frottis dans l’eau pendant 5 minutes

5- Colorer le frottis par une technique de coloration de frottis humide

6- Monter la lame

7- Observer au microscope optique à l’objectif x40

161

Annexe 12 : Protocole de la méthode de coloration de Giemsa

[Jokipii, Pohjola et Jokipii (1983)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Méthanol

Solution de Giemsa à 10%

MODE OPERATOIRE :

1- Réaliser un frottis fécal

2- Laisser sécher à l’air pendant 1 heure

3- Fixer à l’aide de méthanol pendant 10 minutes

4- Plonger le frottis dans la solution de Giemsa à 10% pendant 10 minutes

5- Rincer les frottis à l’eau courante

6- Monter la lame

7- Observer au microscope optique à l’objectif x40 et à immersion

162

Annexe 13 : Protocole de coloration au lugol

[Bailenger (1982)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Iode

Iodure de potassium

PREPARATION PRELIMINAIRE :

LUGOL :

Iode (cristallisé) : 1 g

Iodure de potassium : 2 g

Eau distillée : 100 ml qsp

Faire dissoudre l’iodure de potassium dans une très faible quantité d’eau puis ajouter

lentement les cristaux d’iode.

Agiter jusqu’à dissolution puis ajouter le reste de l’eau. Pour finir filtrer la solution.

MODE OPERATOIRE :

1- Mettre une goutte de fèces liquide ou réaliser un mélange de fèces dans une goutte de

sérum physiologique

2- Recouvrir d’une lamelle

3- Déposer une goutte de lugol au bord de la lamelle

4- Observer au microscope sur la zone de progression du colorant à l’objectif x40

163

Annexe 14 : Protocole de coloration au saccharose

[Beugnet et al. (2004)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Saccharose

Lame

Lamelle

PREPARATION PRELIMINAIRE :

Solution de saccharose :

Saccharose : 20g

Eau distillée : 10 ml

Agiter le mélange jusqu’à dissolution complète (environ une heure)

MODE OPERATOIRE :

1- Déposer une goutte de solution de saccharose sur une lame

2- Mélanger avec une goutte de matière fécale

3- Recouvrir d’une lamelle

4- Observer immédiatement au microscope optique à l’objectif x40

Annexe 15 : Protocole de coloration pour la méthode de Heine

[Beugnet et al. (2004)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Fuchsine

MODE OPERATOIRE :

1- Mettre 10µL de fuchsine sur une lame

2- Mélanger 10µL de fèces

3- Réaliser un frottis (ou recouvrir directement par une lamelle)

4- Sécher

5- Observer au microscope optique à l’objectif x 40 et/ ou à immersion

164

Annexe 16 : Protocole de la coloration négative à la nigrosine

[Pohjola (1984)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Solution de Nigrosine à 1%

MODE OPERATOIRE :

1- Mélanger 20 µl de fèces et 20 µl de solution de nigrosine sur une lame

2- Etaler le mélange

3- Laisser sécher le frottis à l’air

4- Observer au microscope optique à l’objectif x40

165

Annexe 17 : Protocole de la technique de coloration de Ziehl-Neelsen modifiée par

Henriksen et Pohlenz

[Henriksen et Pohlenz (1981), Jokipii et al. (1983)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Méthanol à 96°

Fuchsine basique

Phénol à 5%

Ethanol à 95°

Acide sulfurique

Vert de Malachite à 5%

PREPARATION PRELIMINAIRE :

Fuchsine carbolique :

Fuchsine basique : 1g

Ethanol : 10 ml

Phénol à 5% : 90ml

MODE OPERATOIRE :

1- Réaliser un frottis fécal

2- Laisser sécher à l’air ambiant

3- Plonger le frottis dans du méthanol à 96% pendant 2 à 5 minutes

4- Laisser sécher

5- Fixer brièvement à la flamme

6- Plonger le frottis dans de la fuchsine carbolique pendant 20 à 30 minutes à froid

7- Rincer à l’eau

8- Décolorer à l’aide d’acide sulfurique (de 0,25 à 10%) pendant 20 à 60 secondes

9- Rincer à l’eau

10- Colorer avec la solution de vert de malachite pendant 5 minutes

11- Rincer à l’eau

12- Sécher

13- Monter la lame à l’aide d’Eukitt

14- Observation au microscope optique à l’objectif x40 ou à immersion

166

Annexe 18 : Protocole de la technique de Ziehl-Neelsen modifiée par Angus

[Boufassa-Ouzrout et al. (1986)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Fuchsine phéniquée

Ethanol à 95°

Acide chlorhydrique

Vert de Malachite à 0,25%

PREPARATION PRELIMINAIRE :

Mélange HCl-éthanol :

Acide chlorhydrique : 3ml

Ethanol à 95° : 100ml

MODE OPERATOIRE :

1- Réaliser un frottis fécal

2- Laisser sécher à l’air ambiant

3- Fixer le frottis à l’éthanol

4- Laisser sécher

5- Plonger le frottis dans de la fuchsine carbolique pendant 5 minutes à froid

6- Rincer à l’eau

7- Décolorer dans le mélange HCl-éthanol jusqu’à ce que le colorant s’élimine

8- Rincer à l’eau

9- Colorer avec la solution de vert de malachite à 0,25% pendant 30 secondes

10- Rincer à l’eau

11- Sécher

12- Monter sous lamelle

13- Observation au microscope optique à l’objectif x40 ou à immersion

167

Annexe 19 : Protocole de coloration de diméthylsulphoxyde-Ziehl-Neelsen

[Pohjola et al. (1985)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Méthanol

Fuchsine diamant

Glycérol

Ethanol à 95°

Diméthylsulphoxyde

Vert de malachite à 2%

Acide acétique à 99,5%

Glycérol

PREPARATION PRELIMINAIRE :

Solution 1 :

Fuchsine diamant : 4 g

Glycérol : 12 g

Ethanol à 95° : 25 ml

Diméthylsulphoxyde : 25 ml

Eau distillée : q.s.p. 160ml

Solution 2 :

Vert de malachite à 2% : 220 ml

Acide acétique à 99,5% : 30 ml

Glycérol : 50 ml

MODE OPERATOIRE :

1- Réaliser un frottis fécal

2- Laisser sécher à l’air ambiant

3- Plonger le frottis dans du méthanol pendant 10 minutes

4- Laisser sécher

5- Recouvrir de la solution 1 pendant 2 minutes

6- Rincer à l’eau

7- Recouvrir de la solution 2 pendant 1 minute

8- Rincer à l’eau

9- Sécher à l’air

10- Observation au microscope optique à l’objectif x40 ou à immersion

168

Annexe 20 : Protocole de coloration à l’auramine-fuchsine carbolique

[Casemore et al. (1984)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Auramine

Fuchsine phéniquée

Microscope à fluorescence avec un filtre Leitz KP 540

MODE OPERATOIRE :

1- Réaliser un frottis fécal

2- Laisser sécher à l’air ambiant

3- Plonger le frottis dans l’auramine pendant 5 minutes

4- Rincer à l’eau

5- Immerger rapidement dans la fuchsine phéniquée (10 secondes environ)

6- Rincer à l’eau

7- Sécher

8- Observation au microscope à fluorescence avec un objectif x10

169

Annexe 21 : Protocole de coloration à l’auramine-phénol

[Nichols et Thom (1986)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Auramine O

Phénol

Acide chlorhydrique

Ethanol à 95°

Méthanol

Formol

Permanganate de potassium

Microscope à fluorescence

PREPARATION PRELIMINAIRE :

Solution d’auramine-phénol :

Auramine O : 0,03g

Phénol : 3g

Eau distillée : 100 ml

Mélange acide-alcool :

HCl concentré : 3 mL

Ethanol 95° : 100mL

MODE OPERATOIRE :

1- Réaliser un frottis fécal

2- Laisser sécher à l’air ambiant

3- Fixer dans du méthanol pendant 3 minutes

4- Exposer à des vapeurs de formol à 37°C pendant 30 minutes

5- Colorer le frottis avec la solution d’auramine-phénol pendant 10 minutes

6- Rincer à l’eau

7- Décolorer avec le mélange acide-alcool pendant 5 minutes

8- Rincer à l’eau

9- Recolorer avec une solution de permanganate de potassium à 0,1% pendant 30

secondes

10- Rincer à l’eau

11- Sécher

12- Observation au microscope à fluorescence avec un objectif x10

170

Annexe 22 : Protocole de coloration à la mépacrine

[Ungureanu et Dontu (1992)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Formol à 10%

Solution de mépacrine à 0,05%

Acide chlorhydrique

Ethanol à 97°

Permanganate de potassium

Microscope à fluorescence

PREPARATION PRELIMINAIRE :

Mélange acide-alcool :

Acide chlorhydrique : 1ml

Ethanol à 97° : 100 ml

MODE OPERATOIRE :

1- Réaliser un frottis fécal

2- Laisser sécher à l’air ambiant

3- Fixer le frottis dans du formol à 10% pendant 2 à 3 minutes

4- Recouvrir la lame d’une solution de mépacrine à 0,05% pendant 5 minutes

5- Rincer à l’eau

6- Décolorer dans le mélange acide-alcool pendant 1 à 2 minutes

7- Rincer à l’eau

8- Recolorer dans une solution de permanganate de potassium à 1% pendant 30 secondes

9- Rincer la lame

10- Sécher

171

Annexe 23 : Questionnaire envoyé aux laboratoires

METHODES UTILISEES POUR LE DIAGNOSTIC COPROLOGIQUE CHEZ

LES RUMINANTS.

Nous sommes étudiantes vétérinaires et dans le cadre de notre thèse d’exercice vétérinaire nous

cherchons à connaitre les méthodes utilisées en coprologie chez les ruminants dans les laboratoires

départementaux.

Merci de votre participation à cette étude.

Quel est votre département ? : ……………..

Quels sont vos tarifs en parasitologie ?

- Coprologie simple (qualitative) : …………….. €

- Coprologie quantitative (mac master) : …………….. €

- Recherche spéciale : de giardia : ………….. € de cryptosporidies : ……………..€

I. Méthode de flottation

a) Quel liquide de flottation utilisez-vous en routine (merci de préciser sa densité) :

Iodomercurate de potassium ……… Sulfate de zinc ……… Sucrose ………

Chlorure de sodium ……… Chlorure de zinc ……… Autre (précisez) : ……………..

b) Réalisez-vous une coproscopie : Qualitative Semi-quantitative Quantitative

c) Quelle est la durée d’une coproscopie simple ? ……………………….

d) Quelles mesures de sécurité et hygiène sont en place lors de la manipulation des liquides :

Port de gants Port de masque Manipulation sous hotte Recyclage

Autre : ………………………………………………………………..

e) En cas de demande diagnostique précise, utilisez-vous d’autres liquides :

OUI NON si oui lesquelles : …………………………………………

II. Colorations des protozoaires en coproscopie

a) Quelles colorations utilisez-vous en routine :

Ziehl-Neelsen modifié Heine Saccharose Lugol

MIF Autres : (précisez) …………………………………………

b) Quelles colorations utilisez-vous lors d’une demande spécifique (précisez le parasite recherché)

Ziehl-Neelsen modifié ………………. Heine …………… Saccharose ……………….

Lugol ………………. MIF ………………. Autres : (précisez) ………………………

c) Quelle est la durée d’une coloration : …………………………………………

d) Quelles sont les raisons qui vous ont fait choisir les colorants :

Coût Facilité de préparation Type de parasite recherché Facilité de lecture

e) Si vous utilisez la coloration de Zieh-Neelsen modifiée, quelles sont les durées et la concentration

des produits pour chaque étape :

1- Fixation méthanol : …………….. min 2-Coloration fuchsine phéniquée : …………… min

3-Décoloration acide sulfurique : ….%, tps: …. 4-Recoloration vert de Malachite : …………… sec

Fabienne RICHARD : fabienne.richard@vetagro-sup.fr Jeanne CHANUDET : jeanne.chanudet@vetagro-sup.fr

172

Annexe 24 : Protocole de la technique de coloration de Ziehl-Neelsen modifiée choisie

pour l’étude expérimentale

[Beugnet et al. (2004)]

MATERIEL NECESSAIRE :

Fuchsine phéniquée

Ethanol à 95°

HCl

Vert de Malachite à 0,5%

PREPARATION PRELIMINAIRE :

Mélange HCl 3%-Ethanol 95°

HCl concentré : 3 ml

Ethanol 95° : 100 ml

MODE OPERATOIRE :

1- Réaliser un frottis fécal

2- Laisser sécher à l’air ambiant

3- Recouvrir le frottis par de l’éthanol à 95° pendant 5 minutes

4- Fixer brièvement à la flamme

5- Plonger le frottis dans de la fuchsine pendant 4 minutes

6- Rincer à l’eau

7- Décolorer à l’aide du mélange acide-alcool par 2 giclées

8- Rincer à l’eau

9- Colorer avec la solution de vert de malachite pendant 1 minute

10- Rincer à l’eau

11- Sécher

12- Observation au microscope optique à l’objectif x40 ou à immersion

NOM PRENOM : CHANUDET Jeanne

TITRE : COMPARAISON DE DIFFERENTES COLORATIONS POUR

LA MISE EN EVIDENCE DES PROTOZOAIRES DANS LA

COPROSCOPIE DES RUMINANTS

Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, le 21 décembre 2012

RESUME :

Dans cette étude, nous avons réalisé un bilan des différentes techniques utilisées par les LVD et LDA français à

l’aidé d’un questionnaire qui leur a été envoyé, mais aussi une comparaison de 3 méthodes de coloration rapides:

la coloration au lugol, le montage au saccharose et la méthode de Heine pour la détection de 3 genres de

protozoaires intestinaux courants dans les fèces.

En France, les laboratoires utilisent en majorité des colorations lors d’une recherche spécifique de protozoaires

digestifs comme C. parvum et G. intestinalis. Certains choisissent pour ces recherches des techniques

immunologiques, les tarifs sont alors plus élevés.

Les différents résultats ont permis de mettre en évidence 2 techniques de coloration. La coloration par une

solution de saccharose est la méthode la plus sensible, spécifique et facile d’utilisation pour mettre en évidence

les oocystes de C. parvum dans les fèces. Ce n’est pourtant que la troisième méthode la plus employée par les

laboratoires pour cette recherche, derrière la technique de Ziehl-Neelsen modifiée et la méthode de Heine.

La coloration par le lugol est la méthode ayant la meilleure sensibilité, la plus forte spécificité et la plus grande

facilité de lecture pour détecter les kystes de giardia. C’est également celle qui est la plus employée par les

laboratoires français. Les laboratoires ayant répondus à notre enquête n’utilisent pas de technique de coloration

lors de la recherche de coccidies. En effet, nous avons pu voir que les colorations engendrant une modification

de teinte des oocystes d’Eimeria (le lugol et la fuchsine), diminuent la sensibilité et compliquent la lecture et

l’identification des oocystes d’Eimeria.

MOTS CLES : - diagnostic

- coloration

- protozoaire

- coproscopie

- ruminants

JURY :

Président : Monsieur le Professeur Jean-Alain CHAYVIALLES

1er Assesseur : Monsieur le Professeur Lionel ZENNER

2ème Assesseur : Madame le Docteur Marie-Anne ARCANGIOLI

DATE DE SOUTENANCE : 21 décembre 2012

ADRESSE DE L’AUTEUR :

Corcelette

69910 VILLIE-MORGON