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République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université de Larbi Tébessi Tébessa- Faculté des Sciences Exactes et des Sciences de la Nature et de la Vie Département : Sciences de la Nature et de la Vie MEMOIRE DE MASTER Domaine: science de la nature et de la vie Filière: Biologie Appliqué Option: Toxicologie Xénobiotiques et Risques Toxicologiques Thème: Présenté par: Ghezil Sara Rouabhia Saïda Devant le jury: Ben amara A MAA. Université de Tébessa Président Hamel mehdia MAA. Université de Tébessa Rapporteur Rouachdia R MAA. Université de Tébessa Examinateur Date de soutenance: 29/05/2016 Note :…………Mention :……………… Etude de l’effet de salvia officinalis sur les variations de quelques paramètres du stress oxydatif chez la souris supplémentée en méthionine

Thème: Etude de l’effet de salvia officinalis sur les ... · Homocysteine is a sulfur amino acid precursor of cystathionine to cysteine, an ami no acid that enters in the formation

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République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université de Larbi Tébessi –Tébessa-

Faculté des Sciences Exactes et des Sciences de la Nature et de la Vie

Département : Sciences de la Nature et de la Vie

MEMOIRE DE MASTER

Domaine: science de la nature et de la vie

Filière: Biologie Appliqué

Option: Toxicologie Xénobiotiques et Risques Toxicologiques

Thème:

Présenté par:

Ghezil Sara Rouabhia Saïda

Devant le jury:

Ben amara A MAA. Université de Tébessa Président

Hamel mehdia MAA. Université de Tébessa Rapporteur

Rouachdia R MAA. Université de Tébessa Examinateur

Date de soutenance: 29/05/2016

Note :…………Mention :………………

Etude de l’effet de salvia officinalis sur les

variations de quelques paramètres du stress oxydatif

chez la souris supplémentée en méthionine

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ملخص

هذه العواملمن بين ومضادات األكسدة تنتج من عدة عوامل، و الجذور الحرةاختالل توازن بين هي األكسدة

واإلنزیمات البروتينات بنية في یدخل والذي أساسي أميني حمض وهوالميثيونين، التركيز المرتفع من

الھوموسستيين كبریتي أميني حمض لتشكيل الكبد في للميثيونين الھدم عمليةتتم حيث

األحماض من واحدة سيستين، و نسيستاثيونينيبين نتائجه من يأميني كبریتحمض هو الھوموسستيين

.والبروتينات واألنزیمات للجلوتاثيون المنتجة مينيةاال

یؤدي یوما 02وزن الحي من الميثيونين لمدة من ال كغ/مغ 022 الفئران بالجرعة عالج أن ظھرت نتائجنا

انخفاض محتوى الجلوتاثيون ونشاط الجلوتاثيون البيروكسيدیز, وزن للكبد في نخفاض نسبيالى ا

-s ، الجلوتاثيون(PAL) ، الفوسفاتيز القلویة TGO ،(TGP)االنزیمات الناقلة لالمين مع زیادة النشاط

ترانسفيراز وكاتاالز

ذلك عن فينتج والكبریتي الميثيلي نالمساری یثبط الذي جرعة زائدة من الميثيونينو هذا الخلل ناتج عن

الكبد تحلل الخالیاو یسبب نخر الھوموسستين نسبة ارتفاع

في والذي یظھر تحسنا یوما 02 لمدةكغ من وزن الجسم /مغ 222بالجرعة هالمر یميو لعالج هذا الخلل استعملنا

و هذا یعني ان المریميه تخفف الضرر الناتج (النسيج الكبدي) المؤشرات البيوكيميائيھة الدمویة و النسيجية بعض

عن تاثير حمض المثيونين

.

خلل في الخالیا الكبدیة ،المریميهألكسدة، الميثيونين، امضادة ، يأكسدالتجھاد اإل:الكلمات الرئيسية .

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Abstract

Abstract

Oxidative stress is an imbalance between pro-oxidants and antioxidants produce by

several factors, one of this factors is methionine, which is an acid amino substance

that enter in the structure of proteins and enzymes. Their metabolism takes place in

the liver to form homocysteine.

Homocysteine is a sulfur amino acid precursor of cystathionine to cysteine, an ami

no acid that enters in the formation of glutathione, proteins and enzymes.

Our results show that administrating 200 mg/kg of live weight of methionine for

21 days leads to decrease of the relative weight of the liver, the hepatic reduced

Glutathione (GSH) content, and the activity of Glutathione peroxidase, with an

increase of the enzymatic activity of transaminases (TGO, TGP), alkaline phosphatase

(PAL), of glutathione s-transferase and catalase.

These defects and damage are the consequences of an overdose of methionine

which blocks the pathway of the remethilation as well as the transsulfuration and this

block of two metabolic pathways cause a hyperhomocysteinemia, prooxidant factor,

leads to necrosis and hepatic cytolysis.

The protective and antioxidant effect of Salvia officinalis in the prevention of

stress induced by methionine in male mice after introducing a treatment with 100

mg/kg of body weight for 21 days and which shows an improvement of the blood and

tissue (liver tissue) parameters which meant that this plant prevented and saved

liver damage .

Key words: stress oxidative, antioxidant, methionine, salvia officinalis, and alteration.

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Résumé

Résumé

Le stress oxydant est un déséquilibre entre système le pro-oxydants et l’antioxydant

produit par plusieurs facteurs, parmi ces facteurs en trouve la méthionine, qui est un acide

aminé essentiel entre dans la structure des protéines et des enzymes. Leur métabolisme se

déroule dans le foie pour former l’homocystéine.

L'homocystéine est un acide aminé soufré précurseur de la cystathionine et de la cystéine,

l'un des acides aminés qui entre dans la formation du glutathion, des protéines et des enzymes.

Nos résultats montrent que l’administration de 200 mg/kg de poids vif de la méthionine

chez la souris pendant 21 jours provoque une diminution du poids relatif du foie, de la teneur

hépatique en glutathion réduit (GSH), et de l’activité enzymatique de la glutathion

peroxydase, associée à une augmentation de l’activité enzymatique des transaminases (TGO,

TGP), de phosphatase alcaline (PAL), de la glutathion s-transférase et celle de la catalase.

Ces anomalies et détériorations sont les conséquences d’un surdosage de la méthionine

qui bloque la voie métabolique de la reméthylation ainsi que celle de la transulfuration et ce

blocage des deux voies métaboliques provoque une hyperhomocystéinémie, facteur

prooxydant, conduit à des nécroses et cytolyse hépatique.

Alors que le traitement des souris par la salvia officinalis à une dose de 100mg /Kg de

poids vif pendant 21 jours provoque une augmentation de GSH et GPx et une diminution de

Transaminase, GST et CAT qui indique une amélioration fonctionnelle et structuralle via son

effet antioxydant sur les tissus hépatiques ce qui signifie que cette plante à prévenir et à

sauvée les dommages du foie.

Mots clés: stress oxydant, antioxydant, méthionine, salvia officinalis, altération

hépatique.

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REMERCIEMENTS

Nous remercions, du plus profond de notre cœur, Dieu le tout puissant de

nous avoir donné le courage et la volonté d’achever ce travail.

Nous remercions, très chaleureusement madame Hamel mehdia notre

encadreur

Merci pour votre encadrement efficace, votre disponibilité.

Nous remercions tout particulièrement les enseignants qui ont contribués

A notre formation durant l'année théorique surtout

Nous tenons également à remercier les membres De jury:

Mme Rouachdia R, Melle Ben amara A.

Nous adressons nos remerciements à l'ensemble des techniciens

De laboratoire de la biologie de l'université de Tébessa

Mes remerciements vont également à tous ceux qui m’ont aidé, à un titre

ou un autre, qu’il s’agisse de la fourniture d’informations précieuses, ou

du conseil

Un grand merci à tous

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Table des matières ملخص

Abstract

Résumé.

Remerciements

Dédicace.

Liste des tableaux

Liste des figures

Liste des abréviations

Table des matières

Introduction

Partie théorique

Chapitre 01: la méthionine

1. La méthionine ……………………………………………………………………..... 02

1.1. Définition de la méthionine………………………………………………..…..…... 02

1.2. Source de la méthionine ………………………………………………………..… 02

1.3. Rôles biologiques………………………………………………………………...... 03

1.4. Métabolisme de la méthionine…………………………………………...……....... 03

Chapitre 02: l' homocystéine

2. l'homocystéine……………………….………………………................................... 05

2.1. Définition et structure…………………………………………………………..…...05

2.2. Métabolisme de l'homocystéine………………………………………………..……06

2.2.1.Reméthilation........................... ……………………………………………….......06

2.2.2.Transsulfuration …………………………………………………………………. 07

2.3.Valeurs normales et pathologiques d’homocystéine…………………………….…. 08

2.4. L'hyperhomocystéinémie……………………………………………….................. 08

2.4.1.Définition et classification……………………………………………………….. 08

2.4.2. Facteurs favorisant une hyperhomocystéinémie…………………………...….…. 09

2.4.2.1. Facteurs nutritionnels……………………………………………………....….. 09

2.4.2.2. Facteur génétique………………………………………………………………. 09

2.5. Actions physiopathologiques de l’homocystéine…………………………………... 09

2.5.1. Formation d’athérome et thrombose……………………………………………… 09

2.5.2. Carcinogenèse………………………………………………………………...….. 10

2.6. L'hyperhomocystéinémie et maladies du foie………………...………………...….. 10

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Table des matières 2.7. Production d’un stress oxydant……………............................................................ 10

2.8. Traitement de l’hyperhomocystéinémie..……………………………………..…... 11

Chapitre 03: Stress oxydant

3. le stress oxydatif ........................................................................................................ 12

3.1. Définition.……………………………………………………………………….... 12

3.2. Les radicaux libres...................................................................................................12

3.2.1. Origine des radicaux libres................................................................................... 13

3.2.2. Nature des radicaux libres…………………………………………………….… 14

3.2.2.1. Espèces réactives dérivées de l’oxygène (ERO)………………………….…... 14

3.2.2.2. Espèces libres non oxygénées………………………………………………… 16

3.3. Système antioxydant................................................................................................ 17

3.3.1. Les systèmes antioxydants enzymatiques............................................................ 17

3.3.1.1. La superoxyde dismutase (SOD)……………………………………………… 17

3.3.1.2. La glutathion peroxydase (GPx)…………………………………………….…. 18

3.3.1.3. La catalase……………………………………………………………………… 18

3.3.2. Les systèmes antioxydants non enzymatiques………………………………….... 18

3.3.2.1. Glutathion…………………………………………………………………….… 18

3.3.2.2. La vitamine C…………………………………………………………………... 19

3.3.2.3. La vitamine E…………………………………………………………………… 19

3.4. Utilisation des antioxydants………………………………………………………… 20

3.5. Les maladies liées au stress oxydant……………………………………………....... 20

Matériel et méthodes

I. Matériel et méthodes ……………………...………………………………………..... 22

1.1. Matériel biologiques……………………………………………………….............. 22

I.1.1.Matériel animal………………………………………………...……………….….. 22

1.1.2. Matériel végétal........................................................................................................ 22

1.2. L’élevage..................................................................................................................... 23

I.3.Lotissements…………………………………………….……………………............. 24

I.4. Prélèvement du foie............... ………………………………………………….......... 24

1.5. Estimation du poids relative du foie ..........................................................................27

1.6. Méthode de dosage des paramètres biochimiques...................................................... 27

1.6.1. Dosage de transaminase glutamateoxaloacétate(TGO)........................................... 27

1.6.2. Dosage du Glutamopyruvate Transférase (TGP)..................................................... 28

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Table des matières 1.6.3. Dosage de phosphatase alcaline(PAL).................................................................... 30

1.7. Dosage des paramètres enzymatiques.........................................................................31

1.7.1. Dosage du glutathion réduit (GSH)………………………………………............. 31

1.7.2. Dosage du glutathion S-Transférase (GST)…………………………………........ 32

1.7.3. Dosage du glutathion peroxydase (GPx)…………………………....................... 33

1.7.4. Dosage de la catalase.............................................................................................. 34

1.8. Dosage des protéines ………………………………………………….................... 35

2 .Résultats ………………………………………………………………………………35

2.1. Variation de l’activité enzymatique des transaminases sériques (TGP et TGO (UI/

L) suite au traitement par salvia officinalis et la supplémentation de la méthionine........ 37

2.2.1. Variation de l’activité enzymatique de TGO (UI / L) dans les différents lots

expérimentaux…...............................................................................................................37

2.2.2. Variation de l’activité enzymatique de TGP (UI /L) dans les différents lots

expérimentaux………………………..............................................................................38

2 .2.Variation de l’activité enzymatique de phosphatase alcaline(PAL) suite au traitement par

Salvia Officinalis et la supplémentation de la méthionine……………………………... 39

2.3.Variation de la teneur en GSH hépatique (μmol /min/ mg protéine) dans les différents lots

expérimentaux (protéine)……………………………………………………………….. 40

2.4. Variation de l’activité enzymatique de GST (μmol min//mg protéine) dans les différents

lots expérimentaux………………………………………………….......………………..… 41

2.5. Variation de l’activité enzymatique du glutathion peroxydase GPx (µmol/min/mg de.

protéine) dans les différents lots expérimentaux…………………….…………….….. 42

2.6. Variation de l’activité enzymatique du catalase (µmol/min/mg de protéine) dans les

différents lots

expérimentaux…………………………………..………………….…………..….. 43

2.7. Variation du poids relatif du foie…………………………………………………..... 44

3. Discussion………………………………………………………………………..….… 45

3.1. Effet de salvia officinalis sur l’activité enzymatique des transaminases chez la souris

supplémentée en méthionine………………………………………………….………..…. 45

3.2. Effet de salvia officinalis sur l’activité enzymatique de phosphatase alcaline (PAL) chez

la souris supplémentée en méthionine………….………………………………………… 46

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Table des matières 3.3. Effet de salvia officinalis sur la teneur en glutathion réduit (GSH) et l’activité

enzymatique de la glutathion peroxydase (GPx) chez la souris supplémentée en

méthionine………………………………………………………………………………...46

3.4. Effet de salvia officinalis sur l’activité enzymatique du glutathion S-transférase (GST)

chez la souris supplémentée en méthionine………………………………………………..48

3.5. Effet de salvia officinalis sur l’activité enzymatique du catalase chez la souris

supplémentée en méthionine ………………………………………………………………48

3.6. Effet de salvia officinalis sur le poids relatif du foie chez la souris supplémentée en

méthionine………………………………………………………………………………….49

Conclusion.

Références bibliographiques.

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Liste des tableaux

Liste des tableaux

Page Titre Tableau

2 Pourcentage de méthionine dans quelque aliment en poids sec 01

8 Valeurs normales et pathologiques d’homocystéine 02

9 Classification des hyperhomocystéinémies 03

22 Classification des Souris 04

23 classification des végétaux 05

36 gamme d’étalonnage pour dosage des protéines 06

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Liste des figures

Liste des figures

Page Titre Figure

2 structure chimiques de la méthionine 01

4 métabolisme de la méthionine 02

5 Structures chimique d’homocystéine 03

6 Formules chimiques de l’Hcy, de ses formes circulantes et de ses dérivés

04

7 Schéma du métabolisme de l’homocystéine 05

12 Regulation du stress 06

13 Origine extra- et intracellulaire des radicaux libres dérivés de l’oxygène. XO : xanthine oxydase ; P-450 : cytochrome P-

450.

07

14 Anion superoxyde et ses dérivés 08

16 Origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de l’oxygène impliqué en biologie

9

23 salvia officinalis 10

24 l'élevage des souris 11

26 protocole expérimental 12

37 Variation de l’activité enzymatique de TGO (UI /L) dans les différents lots expérimentaux

13

38 Variation de l’activité enzymatique de TGP (UI/ L) dans les

différents lots expérimentaux

14

39 Variation de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline dans les différents lots expérimentaux

15

40 Variation de la teneur hépatique en GSH (μmol min//mg

protéine) dans les différents lots expérimentaux

16

41 Variation de l’activité enzymatique de GST (μmol min//mg protéine) dans les différents lots expérimentaux

17

42 Variation de l’activité enzymatique du glutathion peroxydase

GPx (µmol/min/mg de protéine) dans les différents lots expérimentaux

18

43 Variation l’activité enzymatique du catalase (µmol/min/mg de protéine) dans les différents lots expérimentaux

19

44 Variation de poids du foie (mg) dans les différents lots

expérimentaux.

20

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Liste d’abréviation

Liste d’abréviation

Abréviation Signification

ADN Acide Désoxyribonucléique

ARN Acide Ribonucleique

ASAT Aspartate Amino Transferase

ATP Adenosine Triphosphate

BBC Blue Brillant de Coomassie

BHMT Bétaine-Homocystéine méthyltransférase

BSA Bovine Serum Albumine

C concentration.

CAT catalase

CBS Cystathionine-B-Synthase

CDNB Chloro-2, 4-Dinitrobenzène

DTNB dithio bis (acide 2-nitriobenzoïque)

DO Densité optique

E- électron

EDTA Acide Ethiléne Diamide Tetraacetique

EOA espèces oxygénées activées

ERO Espèce réactive d’oxygène

Fe fer

GPX glutathion peroxydase

GSH glutathion

GSSG Glutathion Oxydée

GST Glutathione-S-Transférase

Hcy Homocystéine

HHcy

hyperhomocystéinémie

H+ proton d'hydrogène

H2O molécule d'eau

H2O2 peroxyde d'hydrogène.

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Liste d’abréviation

Kg kilogramme

Mg milligramme

Min Minute

MTHFR méthylènetétrahydrofolate-reductase

M Méthionine

μl microlitre

ML Milliliter

NO monoxide d’azote

NO2 nitrique dioxide

Nm nanometre

O2 oxygene

O2• radical superoxyde

OH• radical hydroxyl

ONOO– peroxynitrite

PH potentiel d'hydrogène

POD peroxydase

PL phospholipides

ROS espèce réactive dérivée de l’oxygène

SOD superoxyde dismutase

Sec seconde.

S

Salvia officinalis

Stand standard

T temps

TBS Tris Buffered Saline

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Liste d’abréviation

TCA Acide Trichloroacetique

TG triglycérides

TGO Glutamooxaloacetate

TGP Glutamopyruvate Transferase

THF Acide tétrahydrofolique

TRIS N-tris(hydroxyméthyle)éthyle-2-aminométhanesulfonate

UI Unite Internationale

UV ultra-violet.

Vit Vitamine

Vs Vis à vis

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Introduction

Introduction Le stress oxydant est une circonstance anormale de la physiologie cellulaire lorsqu’il est

soumie à une production endogène ou exogène, des radicaux libres oxygénés qui dépasse la

capacité du système antioxydants.

Les sources de ces radicaux peuvent être : Physiologique, produits par la respiration, les

cytokines, et le processus phagocytaire. Ou physiopathologique stimulées par les maladies, les

inflammations, et les xénobiotique comme les médicaments, les polluants, ou par un

déséquilibre métabolique. (Alain , 2006).

Ces radicaux libres sont métabolisés au niveau du foie qui est un centre de plusieurs

réactions de l’anabolisme, le catabolisme, et la biotransformation des différents composants,

endogènes et exogènes : hormones, aliments, médicaments. (Maitre , 2016).

Mais cette organe peut être altérer structurellement et fonctionnellement par l’oxydation

induite par le déséquilibre de la balance pro-oxydant antioxydant. Parmi les facteurs qui

affecte ce déséquilibre l’alimentation riche en lipides qui conduit à une stéatose, et en acide

aminé méthionine qui provoque une augmentation de la concentration de l’homocystéine

oxydée, facteur principale de l’oxydation hépatique, cardiaque, endothélial, et nerveuse, d’où

l’apparition des maladies hépatiques, des inflammations, et l’Alzheimer, (Valko , et al, 2006).

Les cellules utilisent de nombreuses stratégies antioxydants pour contrôler le niveau

d’espèce réactive de l’oxygène. Un antioxydant est une substance qui inhibe ou ralentir

l’oxydation cellulaire (Alain , 2006).

Dans ce contexte on a visé à élucider l’activité antioxydante de salvia officinalis sur les

souris traité par la méthionine.

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Chapitre 01 : Méthionine

2

1- la méthionine :

1-1- Définition de la méthionine :

La méthionine est un acide aminé essentiel soufré, (Alan et al., 2003). Cette

Acide- aminé se caractérise par une chaine latérale avec un groupement Thio éther. Dans le

code génétique, la méthionine est spécifiée par le codon ATG sur l’ADN et par AUG sur

l’ARN, son groupe méthyl (CH3) intervient dans de nombreuse réaction de méthylation du

métabolisme. (Chape et al., 2006).

Figure 01:structure chimiques de la méthionine (Francis et al., 2014)

1-2- Source de la méthionine :

Les sources de la méthionine sont : les légumineuses, les œufs, les poisons, l’ail, les

l’Antilles, les viande, les oignons, le soja, le yaourt, et le gruyère, un apport alimentaire élevé

de méthionine est un risque d’entraine à une augmentation de l’homocystéine si la réaction de

reméthylation de l’HCY en méthionine n’est pas fonctionnée (Hélène, 2012).

Tableau 01 : Pourcentage de méthionine dans quelque aliments en poids sec (Oberli, 2013)

source

poule

Blé

farine

complète

mais

viande

Lait

de

vache

Pomme

de terre

poissons

Riz

Lentille

%

3.0

1.6

2.1

2.4

2.4

1.6

2.9

2.1

0.18

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Chapitre 01 : Méthionine

3

1-3- Rôle biologique :

La méthionine joue un rôle particulier dans la biosynthèse des protéines, puisque toutes les

chaines protéiques démarrent par l’incorporation d’une méthionine en position N-terminale.

D’autre résidus peuvent ensuit être incorporé de manière interne à les chaine polypeptidique.

.La première méthionine des protéines n’est pas toujours retrouvée dans les protéines

terminées. Elle est en effet fréquemment clivée par une enzyme spécifique appelée

méthionine amino-peptidase. La méthionine joue aussi un rôle important dans les réactions

cellulaires de la méthylation. L'activation du soufre du groupement -S-CH3 dans la S-

adénosyl- méthionine fait du méthyl un bon groupement partant qui peut alors être transféré

aux divers substrats par des méthyles transférases (Mouchabac, 2008).

Cet acide aminé est aussi utilisé par les plantes pour synthétiser l'éthylène. Ce

processus est connu sous le nom de cycle de la méthionine. Également, elle est utilisée

comme antidote au paracétamol: 100 mg de méthionine pour500 mg de paracétamol (Michel,

2007).

1-4- Métabolisme de la méthionine :

Outre son rôle comme amino-acide constitutif des protéines et dans l’initiation de la

biosynthèse protéique, la méthionine est surtout un fournisseur du groupement méthyl. Il doit

d’abord être activée par l’ATP pour donner la S-adénostyle méthionine (SAM) (Louis, 1994).

Grace à l’énergie fourni par l’ATP, Le groupement méthyl de la méthionine est activé et

pourra être transféré par une réaction de transméthylatoin au cours de diverse voie de

biosynthèse. Dans la deuxième étape il y a la formation de la S-adénosyl- homocystéine

(SAH) par le départ d’un groupement méthyl, puis il y a un départ de l’adénosyl et formation

d’homocystéine.

La différence entre la formule chimique de l’homocystéine et de la méthionine c’est

que un atome hydrogène dans la formule de l’Hcy remplace le groupement méthyl dans la

formule de la méthionine. L’homocystéine peut se condenser avec la sérine pour former la

cystathionine, puis la cystéine. Le cofacteur de ces deux réactions est la vitamine B6.

La méthionine peut être régénérée par transfert d’un groupement méthyle du N5 sur

l’homocystéine. La réaction est catalysée par le méthyle cobalamine (dérivé de la vitamine

B12) (Jaque et al,. 2004).

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Chapitre 01 : Méthionine

4

Figure 02: métabolisme de la méthionine (Karine et al., 2000)

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Chapitre 02 : Homocystéine

5

2. L’homocystéine :

2-1-Définition et structure :

L’homocystéine est un acide aminé soufré produit au cours du catabolisme de la

méthionine (Elizabeth, 2008). Elle sera synthétisée par toutes les cellules de l’organisme et

elle existe soit sous forme libre (30%) soit sous forme liée à l’albumine et à l’hémoglobine

(70%). (Jakubowski, 2006)

Figure 03: Structures chimique d’homocystéine. (Jakubowski, 2006).

Cet acide aminé n’est pas retrouvé dans la structure des protéines, mais il constitue un

intermédiaire important dans la fonction de donneur de méthyle de la méthionine (un acide

aminé essentiel) et dans le métabolisme de ce dernier vers les autres acides aminés soufrés

comme la cystéine (un acide aminé non essentiel). L’homocystine constitue la forme

dimérique oxydée de l’Hcy présente de manière permanente dans les milieux biologiques, car

l’oxydation est spontanée et rapide. (Guilland et al., 2003). C’est une molécule prooxydante

qui devient, à des niveaux élevés, néfaste à l’intégrité des vaisseaux sanguins. (Marie-Edith,

2010), des cellules nerveuses, et des cellules hépatiques. (Alan, 2002).

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Chapitre 02 : Homocystéine

6

Figure 04: Formules chimiques de l’Hcy, de ses formes circulantes et de ses dérivés

(Guilland et al., 2003)

2-2-Métabolisme de l’homocystéine :

L'homocystéine est un acide aminé intermédiaire dans le métabolisme de la méthionine

dont l’origine est principalement alimentaire (Guilland et al., 2002). La méthionine est

utilisée par l’organisme sous sa forme activée, la S-adénosyl- méthionine, au cours des

réactions de méthylation catalysées par les méthyl-transférases. La fixation des groupements

méthyl sur leur substrat (par exemple acides nucléiques, protéines, catécholamines) forme la

S-adénosyl-homocystéine, à partir de laquelle l’homocystéine est libérée par hydrolyse.

(Gillery, 1999) ;

2-2-1- La reméthylation :

La reméthylation en méthionine est réalisée par l’action de la méthionine synthétase

(MS) grâce à la présence de la vitamine B12 (cobalamine) comme cofacteur. (Demuth, 2000).

Le résidu méthyl qui est nécessaire à cette réaction est essentiellement fourni par le

métabolisme de l’acide tétrahydrofolique (THF). Cette réaction nécessite l’action du

méthylène-tétrahydrofolate réductase (MTHFR) et la présence de la vitamine B9 (acide

folique) comme cofacteur. Ainsi, une partie de l’Hcy est reméthylée grâce à l’action de la

bétaïnehomocystéine méthyl transférase (BHMT) à partir de la bétaïne comme donneur de

méthyl. (Aubard et al., 2000).

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Chapitre 02 : Homocystéine

7

2-2-2- La transsulfuration :

Quand la voie de la reméthylation est saturée ou quand un besoin en cystéine existe, l’Hcy

subit une transsulfuration où elle est catabolisée en cystathionine, puis en cystéine par l’action

de la cystathionine bêta synthétase (CBS). Cette réaction nécessite la présence de la

vitamine B6 (pyridoxine) comme cofacteur enzymatique. (Aubard et al., 2000). Enfin la

cystéine formée à partir de l'Hcy donne soit du glutathion (antioxydant majeur), soit elle est

convertie en sulfates qui sont excrétés dans les urines. (Demuth, 2000)(Afssap, 2001)

Figure 05 : Schéma du métabolisme de l’homocystéine (Stalder et al., 2007)

Le taux d’Hcy va donc dépendre d’une part des activités enzymatiques de la CBS, de la

MS et de la MTHFR et d’autre part de la disponibilité en THF, issus du métabolisme de

l’acide folique (vitamine B9) et des vitamines B6 et B12 comme cofacteurs indispensables au

bon fonctionnement de ce cycle métabolique (Aubard et al., 2000).

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Chapitre 02 : Homocystéine

8

2-3-Valeurs normales et pathologiques d’homocysteine :

Les valeurs normales d’Hcy varient légèrement entre les différents laboratoires et suivant

les techniques utilisées. Sur la base des travaux mènes, la gamme de la concentration totale en

Hcy dans le plasma des adultes en bonne sante est de 5 a 15 μmol/l (Tableau I) (Ueland,

1993)

Tableau 02 : Valeurs normales et pathologiques d’homocystéine. (Ueland, 1993)

Homocystéine μmol/L

Normal 5 – 15

Souhaitable < 10

Hyperhomocystéinémie

Modérée 16 – 25

Intermédiaire 26 – 50

Sévère > 50

2-4-Hyperhomocystéinémie :

2-4-1- Définition et classification :

L’homocystéinémie a été investiguée dans de nombreuses pathologies

neuropsychiatriques, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, les maladies

cardiaque, et des maladies hépatiques. (Mabrouk et al., 2011)

L’hyperhomocystéinémie (HHcy) signifie l’élévation du taux d’Hcy total dans le sang au-

delà de 15 μmol/l due à une perturbation dans le métabolisme de l’Hcy causée par des facteurs

génétiques, nutritionnels ou environnementaux. (Mouchabac, 2008)

La classification des différentes HHcy est montrée dans le tableau 02.

L'hyperhomocystéinémie, qui dépend d'une inhibition de la voie de reméthylation, d'une

inhibition ou d'une saturation de la voie de transsulfuration, résulte d'une altération de la

régulation coordonnée du métabolisme de l'homocystéine par la S

adénosylméthionine. (Philippe et al., 1989)

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Chapitre 02 : Homocystéine

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Tableau 03 : Classification des hyperhomocystéinémies (Mouchabac, 2008)

Hyperhomocystéinémie normale 10 μmol/l (seuil 15 μmol/l)

Hyperhomocystéinémie modérée 15 à 30 μmol/l

Hyperhomocystéinémie intermédiaire 30 à 100 μmol/l

Hyperhomocystéinémie sévère ou majeure > 100 μmol/l

2-4-2.-Facteurs favorisant une hyperhomocystéinémie :

2-4-2-1- Facteurs nutritionnels :

Une concentration plasmatique insuffisante en vitamines B6 ou B12 ou en folates.

(Borson-Chazo et al., 1999) Ces molécules sont toutes associées au métabolisme de l’Hcy,

que ce soit dans le cycle de reméthylation (B2, B9, B12 et choline) ou dans la voie de

transsulfuration (B6). (Mann, 1999)

2-4-2-2-Facteur génétique :

Les polymorphismes ou variantes génétiques du génome sont la conséquence de mutations

qui sont plus souvent des mutations uniques (single nucléotide polymorphisme ou SNP). Il

existe plusieurs polymorphismes des enzymes intervenant dans le métabolisme de

l’homocystéine. (Min, 2009). Il s’agit principalement de variant génétiques des la

méthylènetétrahydrofolate-reductase (MTHFR), méthionine synthase (Carle, 2004), méthionine

synthase réductase (MTRR A66G). De plus, un polymorphisme portant sur une protéine de

transport de vitamine B12, la transcobalamine (TCN C776G), a été rapporté et peut également

s’associer à une hyperhomocystéinemie modérée. (Min, 2009)

2-5-Actions physiopathologiques de l’homocystéine :

2-5-1-Formation d’athérome et thrombose :

L’homocystéine possède de nombreuses actions sur le système cardiovasculaire :

perturbation du relargage et de l’effet du NO, prolifération des cellules musculaires lisses,

modification de la matrice extracellulaire, oxydation des lipoprotéines. L’homocystéine se lie

aux lipoprotéines et augmente ainsi leur capacité de liaison à la fibrine, potentialisant le risque

athérogène. (Guilland et al, 2003). Inhibition de l’expression et de l’activité de la

thrombomoduline à la surface des cellules endothéliales, qui permet l’activation de la protéine

C, un des puissants anticoagulants naturels. (Dayal et al., 2001). La peroxydation de lipides

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Chapitre 02 : Homocystéine

10

ce qui se traduit par une réponse inflammatoire, accélérant le phénomène d’athérosclérose.

(Trabetti, 2008)

2-5-2- Carcinogenèse :

Les cellules cancéreuses ont un défaut de métabolisation de l’ homocystéine situé sur la

voie de formation du thiorétinaco. La S. adénosyl-homocystéine inhibe le transfert des

groupes méthyles de la S-adénosyl-méthionine aux cytosines de l’ADN, par les méthyl-

transférases. Par ailleurs, la S-adénosyl-homocystéine inhibe aussi le transfert de méthyle aux

oestrogènes réalisé par les catéchol-O-méthyl transférases, diminuant la détoxication de ces

hormones carcinogènes et augmentant ainsi le risque de cancer du sein. (Guilland et al.,

2003)

2-6-L'hyperhomocystéinémie et maladies du foie

Le catabolisme de l'homocystéine se produit principalement dans le foie par deux voies. La

voie de la reméthylation et la voie de la transsulfuration. L'accumulation intracellulaire

d'homocystéine provoque de différentes altérations hépatiques comme la nécrose, cirrhose, la

fibrose ou de la stéatose. L'hyperhomocystéinémie menant à la production d'anion

superoxyde, le peroxyde d'hydrogène (H2O2), hydroxyle, le radicale(HO) et la formation

accrue de peroxynitrites qui provoquent des lésions cellulaire. Ces composants oxydants

induisent aussi la peroxydation des lipides, perturbant ainsi le fonctionnement de certaines

enzymes dans le foie. (Woo et al., 2006).

2-7-Production d’un stress oxydant :

L’homocystéine porte un groupement thiol réducteur qui est aisément auto-oxydé et peut

engendrer des radicaux libres (ROS) responsables de lésions vasculaires (Jacobsen, 2000).

L’oxydation de l’homocystéine en homocystine libère du peroxyde d’hydrogène, H2O2.

(Guilland et al, 2003). Le groupe Thiol de l’Hcy se lierait aussi aux ions ferreux ou cuivreux

pour former des ROS, suggérant que l’Hcy induit des lésions et des dysfonctions cellulaires à

travers un mécanisme impliquant l’auto-oxydation et des lésions oxydatives de protéines

cible. (Smach et al., 2013). Ce complexe participe à l’inactivation des systèmes

enzymatiques, la perturbation de la fonction de deux enzymes anti-oxydantes: superoxyde

dismutase (SOD) et glutathion peroxydase (GPX). (Wilcken et al., 2000). La forme cyclique

de l’homocystéine, l’homocystéine thiolactone, est oxydée en sulfate par un processus mettant

en jeu l’ascorbate, le thiorétinamide (produit de conjugaison entre l’homocystéine et l’acide

rétinoïque) et le superoxyde, sous contrôle de la thyroxine et de l’hormone de croissance.

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Chapitre 02 : Homocystéine

11

L’hormone de croissance stimule la production de sulfates à partir de l’homocystéine

thiolactone. (Guilland et al., 2003).

2-8-Traitement de l’hyperhomocystéinémie :

Elles sont toutes concordantes, montrant l’efficacité de ces thérapeutiques même en

l’absence de carence nutritionnelle. Dans une méta-analyse récente, un traitement journalier

par 0,5 mg d’acide folique diminuait de 25 % l’homocystéinémie, ce qui permettait de la

normaliser dans la majorité des cas. L’adjonction de vitamine B12 per os. La dose de 0,5 mg

par jour permettait d’obtenir une réduction complémentaire de 7 %. En revanche, l’adjonction

de vitamine B6 n’apportait aucune amélioration supplémentaire S’il n’existe pas, à ce jour, de

preuve de l’efficacité de la prise en charge thérapeutique de l’hyperhomocystéinémie, il est

important de souligner que deux essais randomisés sont actuellement en cours pour démontrer

l’effet du traitement par folates sur la morbimortalité cardiovasculaire. (Borson-Chazot et al.,

1999)

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Chapitre 03 : stress oxydatif

12

3-Le stress oxydant :

3-1- Définition :

Le stress oxydant comme un déséquilibre entre pro-oxydants et antioxydants en faveur

des premiers (Coste et al., 2007). Ce déséquilibre peut se produire quand le système de

défense antioxydant est surmené par l’augmentation des oxydants ou lorsque les défenses sont

affaiblies par une carence d’apport et/ou de production d’antioxydants (Kirschvink et al.,

2008).

Figure 06 : régulation du stress (Catherine et al., 2005)

3-2-Les radicaux libres :

Un radical libre est une molécule ou un fragment moléculaire qui contient un électron (ou

plus) non apparié sur sa couche électronique externe. (Justine et al., 2005). Ce qui augmente

considérablement sa réactivité par nécessité de se combiner avec un autre électron pour

atteindre la stabilité selon un phénomène d’oxydation (Bonnefont-Rousselot et al., 2003).

Ces radicaux résultant soit d’un gain soit de la perte d’un électron. Par exemple, par gain d’un

électron, la molécule d’O2 devient l’anion superoxyde :

O2 + 1e- O2°-

(Chabaud, 2007).

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Chapitre 03 : stress oxydatif

13

3-2-1- Origine des radicaux libres :

Les radicaux libres peuvent être d’origine endogène, sont produits par divers mécanismes

physiologiques afin de détruire des bactéries au sein des cellules phagocytaires (macrophages,

polynucléaires) ou pour réguler des fonctions cellulaires létales telle la mort cellulaire

programmée ou apoptose.

Toutefois, au contact entre l'oxygène et certaines protéines du système de la respiration,

une production d'anions superoxydes se produit lors du fonctionnement de la chaîne

respiratoire mitochondriale. Des sources importantes de radicaux libres sont les mécanismes

de cycles redox qui produits dans l’organisme l'oxydation de molécules comme les quinones.

(Mohammedi, 2005).

Les sources métaboliques produisant les RLO sont nombreuses : cytochromes P-450,

activité de la NADPH oxydase, myéloperoxydase, NO synthase, xanthine oxydase (Fig. 7).

(Valéry et al., 2007).

Lorsqu’ils sont d’origine exogène, les radicaux libres sont produits en majorité dans les

polluants de l’air (N, NO2), produits des radiations (rayon X, lumière UV), solvants

organiques, anesthésiques, pesticides, drogues, et xénobiotiques. (Tessier et al., 1994).

Figure 07 : Origine extra- et intracellulaire des radicaux libres dérivés de l’oxygène. XO :

xanthine oxydase ; P-450 : cytochrome P-450. (Valéry et al., 2007).

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Chapitre 03 : stress oxydatif

14

3-2-2-Nature des radicaux libres :

3-2-2-1- Espèces réactives dérivées de l’oxygène (ERO) :

Les espèces réactives de l’oxygène (ERO) sont des dérivés de l’oxygène, hautement

réactifs et instables, participant au vieillissement des protéines, à la peroxydation lipidique, et

à l’altération de l’ADN (Dhalla et al., 2000)

Ces espèces possèdent deux électrons célibataires non appariés sur sa couche orbitale

externe. Cette molécule est essentielle au bon fonctionnement de l’organisme. (Mohammedi,

2005)

Ion superoxyde (O2

. -

) :

L’ion super oxyde O2

. -est un dérivé très réactif de l’oxygène, relativement stable, il n’est

pas très toxique pour l’organisme, mais il est à l’origine de cascades de réactions conduisant à

la production de molécules très nocives. (Kahina, 2011)

Figure 08: Anion superoxyde et ses dérivés. (Valéry et al., 2007).

Radical libre hydroxyle (OH.) :

Les radicaux hydroxyles (OH.) sont les radicaux libres plus réactifs. Capable de réagir avec

un très grand nombre de cible moléculaire, (Jaques et al., 2003) comme l’ADN, les glucides,

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Chapitre 03 : stress oxydatif

15

les nucléotides, les protéines et être à l’origine de lésions de nécrose. C’est un dérivé de l’ion

super oxyde (Kahina, 2011).

Oxygène singulet (1O2) :

Forme excitée de l’oxygène moléculaire, est souvent assimilée à un radical libre en raison

de sa forte réactivité (Delattre et al., 2005).

Lorsque de l’énergie est apportée à l’oxygène, celui-ci passe à l’état singulet qui représente

la forme activée. C’est une forme très énergétique de grande réactivité qui peut oxyder de

nombreuses molécules. (Kahina, 2011)

Il est formé à partir de l’ion superoxyde selon la réaction suivante :

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Chapitre 03 : stress oxydatif

16

Figure 09 : Origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de

l’oxygène impliqué en biologie . (Kahina, 2011)

3-2-2-2- Espèces libres non oxygénées :

Les espèces libres non oxygénées sont les produits des réactions de certaines molécules

avec les espèces réactives dérivées de l’oxygène.

Ils peuvent à leur tour réagir avec d’autres molécules et être à l’origine de la multiplication

des réactions d’oxydation et de la propagation de dommages oxydatifs. Nous citerons.

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Chapitre 03 : stress oxydatif

17

Exemple :

Les acides gras peroxydés, résultats de l’action des espèces oxygénées sur les membranes

biologiques. Les fractions protéiques, les acides aminés et les acides nucléiques peuvent aussi

réagir avec les ERO générant des molécules réactives et nocives. (Kahina, 2011)

3-3-Système anti oxydant :

Notre organisme est équipé de tout un système complexe de défenses antioxydants

enzymatiques et non enzymatiques, localisé dans les compartiments intra- et extracellulaire.

(Mette, 2006)

Les antioxydants sont des substances qui retardent ou inhibent l’oxydation d’un substrat

quand ils sont présents à faible concentration comparée à celle du substrat. (Mette, et al,

2001). L’organisme dispose d’une large gamme d’antioxydants endogènes sous forme de

systèmes enzymatiques, ou non enzymatiques (Berger et al., 2001)

3-3-1- Les systèmes antioxydants enzymatiques :

Le système antioxydant enzymatique est constitué de l’interaction de 3 enzymes

principales : le superoxyde dismutase (SOD), la glutathion peroxydase (GPx) et la catalase

(CAT)

3-3-1-1- La superoxyde dismutase (SOD) :

C’est une métalloenzyme qui catalyse la dismutation de l’O2.- en H2O2 et O2. Son

intervention en première ligne dans l’élimination des RLO lui confère un rôle décisif dans le

contrôle du statut redox cellulaire et dans la survie en milieu aérobie. (Charlotte, 2012)

Il existe plusieurs types de SOD qui se différencient par leur structure et leur localisation

cellulaire (Jaques et al., 2003):la SOD cuivre-zinc (CuZnSOD ou SOD1) présente au niveau

du cytoplasme et de l’espace mitochondrial inter-membranaire ; la SOD manganèse (MnSOD

ou SOD2) localisée au niveau de la matrice et de la membrane interne mitochondriales ; et la

CuZnSOD extracytosolique (ou SOD3) que l’on retrouve surtout au niveau de la matrice

extracellulaire. L’activité de la SOD donnant lieu à la formation d’H2O2, son action

antioxydant n’est complète que si d’autres enzymes, la GPx et la CAT, permettent

l’élimination de cette molécule. (Charlotte, 2012)

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Chapitre 03 : stress oxydatif

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3-3-1-2- La glutathion peroxydase (GPx) :

La GPx permet d’éliminer l’H2O2 en couplant sa réduction avec l’oxydation d’un substrat

réducteur, le glutathion.

Ainsi H2O2 est catalysé en H2O tandis que le glutathion réduit (GSH) est transformé en

glutathion oxydé (GSSG). (Zhu et al., 2008).

Il est à noter que la GPx peut également catalyser d’autres hydroperoxydes d’origine

lipidique et qu’il en existe 5 isoformes de localisations tissulaires différentes. La plus

abondante est l’isoforme 1 (GPx1) présente au niveau cytoplasmique et mitochondriale, et

exprimée dans la plupart des cellules. (Charlotte, 2012).

3-3-1-3- La catalase (CAT) :

La CAT est une enzyme héminique réduit le peroxyde d'hydrogène H202 en libérant de

l'oxygène et de l'eau. Elle localisée surtout dans les peroxysomes (Lindau-Sehpard et al.,

1993). Il est à noter que la constante de Michaelis-Menten (Km) de la CAT pour l’H2O2 est

supérieure à celle de la GPx, lui conférant un rôle prépondérant lorsque la concentration en

H2O2 est supérieure au Km de la GPx. Néanmoins les différentes localisations subcellulaires

de la CAT et de la GPx leurs confèrent un rôle complémentaire. (Charlotte, 2012)

3-3-2- Les systèmes antioxydants non enzymatiques :

Les antioxydants sont des agents redox qui réagissent (effet scavenger) avec les oxydants

et soit stoppent, soit ralentissent les processus d’oxydation antioxydants s’oxydent en dérivés

stables, ou persistent pendant un certain temps sous forme radicalaire. Ces formes radicalaires

peuvent devenir des prooxydants. Comme évoqué précédemment, ces antioxydants se divisent

en deux principales catégories, les endogènes (molécules issues de la biosynthèse), et les

exogènes (vitamines, oligoélements, ou antioxydants de synthèse). (Benaissa, 2012)

3-3-2-1-Glutathion :

Le glutathion est un tripeptide (acide glutamique-cystéine-glycine). Il est le thiol (-SH)

majoritaire au niveau intracellulaire (l’albumine étant son équivalent plasmatique) où il est

présent sous forme essentiellement réduite (GSH). Dans des conditions p hysiologiques, sa

forme oxydée (GSSG) est en concentration très faible. Le rapport GSH/GSSG est considéré

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Chapitre 03 : stress oxydatif

19

comme un excellent marqueur de la peroxydation des lipides et permet d’objectiver

l’importance du stress. Au cours du vieillissement et lors d’un exercice intense, ce rapport

tend à diminuer. Les autres propriétés antioxydants du GSH sont nombreuses : cofacteur de la

GPx, chélateur des métaux de transition, régénérateur final des vitamines E et C, à partir de

leur forme radicalaire. L’apport recommandé journalier est d’environ 300 mg (agrumes).

La plupart des protéines dont l’albumine contiennent des groupements « thiols » qui

pocèdent des propriétés réductrices et piègent facilement les espèces oxygénées activées.

(Haleng, 2007)

3-3-2-2-La vitamine C :

L’acide L-ascorbique ou vitamine C est considéré comme le plus important antioxydant

dans les fluides extracellulaires. C’est un piégeur très efficace des ions superoxydes, du

peroxyde d’hydrogène, de I’hypochlorite, des radicaux hydroxyles et pyroxyles, et de

l’oxygène singulet. Le rôle antioxydant de la vitamine C est basé sur sa réaction avec les

radicaux peroxyles aqueux. Le produit formé est le radical ascorbyle. En piégeant les radicaux

peroxyles dans la phase aqueuse avant qu’ils initient la peroxydation lipidique, la vitamine C

protège les biomembranes et les lipoprotéines (Kabouche, 2010). Ses principales sources

alimentaires sont les fruits (agrumes, kiwi, cerises, melon) et les légumes (tomates, légumes

verts, brocoli et choux) (Jean, 2002)

3-3-2-3-La vitamine E :

La vitamine E est un antioxydant lipophile appartenant à la famille des tocophérols (α, β, δ,

γ). (Dominique, 2012)

Le caractère hydrophobe de la vitamine E lui permet de s’insérer au sein des acides gras de

la membrane cellulaire et des lipoprotéines, où elle joue un rôle protecteur en empêchant la

propagation de la peroxydation lipidique induite par un stress oxydant. Seuls α et δ

tocophérols possèdent les propriétés antioxydantes les plus intéressantes. (Vertuani et al.,

2004). Ses principales sources alimentaires sont les huiles végétales et produits dérivés, le

germe de blé, les noix et certains légumes à feuilles vertes. (Jean, 2002)

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Chapitre 03 : stress oxydatif

20

3-4-Utilisation des antioxydants :

Les Antioxydants ont un grand choix d'utilisations dans l'industrie. Ils sont les plus utilisés

généralement comme conservateurs et suppléments.

Antioxydants comme conservateurs : sont employés pour retarder l'oxydation d'une

substance organique. Ceci augmente la vie utile ou la durée de conservation de ce matériau.

Le but principal d'utiliser un antioxydant en tant qu'additif alimentaire est de mettre à jour la

qualité de cette nourriture et de prolonger sa durée de conservation plutôt qu'améliorant la

qualité de la nourriture. (Ananya, 2012)

Des Antioxydants sont ajoutés aux essences et aux lubrifiants pour éviter l'oxydation, et en

essence pour éviter la polymérisation - cette polymérisation d'essence mène aux résidus qui

peuvent endommager les engines.

Ces antioxydants peuvent être utilisés aussi dans l'industrie teinturerie pour éviter

l'oxydation des colorants au soufre ou des colorants de cuve lors de la teinture et dans

l'industrie chimique pour éviter le durcissement du caoutchouc ou en métallurgie pour

protéger les métaux de l’oxydation. (Kahina, 2011)

3-5-Les maladies liées au stress oxydant :

En faisant apparaître des molécules biologiques anormales et en surexprimant certains

gènes, le stress oxydant sera la principale cause initiale de plusieurs maladies : cancer,

cataracte, sclérose latérale amyotrophique, syndrome de détresse respiratoire aigu, oedème

pulmonaire, vieillissement accéléré. (Alain, 2003)

La production des ERO a été impliquée principalement dans l'athérosclérose comme

moyen de nuisibles lipoprotéines de basse densité, qui lance à son tour l'accumulation de

cholestérol dans les macrophages. La diversité des nouvelles modifications oxydatives

aux lipides et protéines récemment identifiés dans les lésions athérosclérotiques a révélé

surprenant de complexité dans les mécanismes des dommages oxydatifs et leur rôle

potentiel dans l'athérosclérose. (Rakesh et al., 1999)

Ainsi, les relations entre stress oxydant et cancer s'avèrent très étroites, les radicaux libres

intervenant dans l'activation des pro-carcinogènes en carcinogènes, créant les lésions de

l'ADN, amplifiant les signaux de prolifération et inhibant des gènes suppresseurs de tumeur.

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Chapitre 03 : stress oxydatif

21

Le stress oxydant est aussi un des facteurs potentialisant l'apparition de maladies

plurifactorielles tel le diabète, la maladie d'Alzheimer, les rhumatismes et les maladies

cardiovasculaires. (Alain, 2003).

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Matériel et méthodes

22

1-Matériel et méthodes :

1-1- Matériel biologiques :

1-1-1-Matériel animal :

Dans notre étude expérimentale, nous avons travaillé sur 24 souris blanches males de la

souche BALB/C, provenant de l’institut pasteur-Alger, d’un âge entre deux à trois mois et

avec poids moyen de 30 g.

Tableau 04 : Classification des souris (Orsini et al., 1983).

Classification des souris

Règne Animale

Embranchement Vertébrés

Classe Mammifère

Ordre Rongeurs

Sous-ordre Myomorphes

Famille Muridés

Genre Mus

Espèce Musmusculus

Nom commun Souris domestiques

1-1-2-Matériel végétal :

salvia officinalis :

Salvia officinalis est une plante à racines ramifiées et ligneux, à tige quadrangulaire et très

ramifiée peux atteindre de 20 à 60 cm de haut. (Komet, 2011). Elle est caractérisée par ces

feuilles de 3 à 10 cm de long et de 1.5 cm de large sont opposées, ovales, et allongées, vert-

gris, feutrées, avec des fleurs bleu-rose lilas, visibles de mai à août, se situent sur des hampes

florales érigées, et sont regroupées en petits glomérules formant de grands épis.

Les feuilles de la Sauge officinale sont un condiment courant, apprécié depuis l’antiquité.

Elles peuvent être consommée fraiches, mais leur parfum s’affine au séchage (Loic, 2009),

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Matériel et méthodes

23

Il existe plus d’une centaine d’espèce du genre salvia dont beaucoup sont utilisées en

phytothérapie. (Komet, 2011).

Figure 10 : salvia officinalis (Loic. 2009)

Propriétés :

Salvia officinalis a des propriétés digestives, astringentes, antiseptiques, cholérétiques,

balsamique, aromatique, antioxydants, anti- inflammatoires, carminatives, expectorantes, anti

sudorifiques et toniques. On lui prête aussi une action œstrogènique. (Komet, 2011)

Tableau 05:classification de la plante (Loic, 2009) (Defayolle, 2005).

Règne Plantae

Sous-règne Tracheobionta

Division Magnoliophyta

Classe Magnoliopsida

Sous-classe Asteridae

Ordre Lamiales

Famille Lamiaceae

Genre Salvia

Espèce officinalis

La partie utilisée de la plante est la partie aérienne : Les feuilles moulues en poudre.

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Matériel et méthodes

24

1-2-L'élevage :

Les animaux sont mis dans des cages spéciales pour les souris, celles-ci sont tapissées

d'une litière constituée de copeaux de bois. Elle est changée deux fois par semaine jusqu'à la

fin de l'expérimentation suivie l'alimentation et l'eau est remplie dans des biberons.

La dose de chaque traitement est calculée selon le poids vif moyen des souris de chaque lot

et donnée à la souris une fois par jour.

La méthionine et salvia officinalis sont utilisé sous forme poudre.

Chaque dose de méthionine ou d’extrait de la plante est incorporée dans une boule de

farine (0.1g) puis administrée à la souris par voie orale.

Figure 11:l'élevage des souris

1-3-Lotissements :

Les souris sont reparties en (04) lots:

- lot 1 : contient 06 souris témoins : ne subit aucun traitement.

- lot 2 : contient 06 souris traitées par la méthionine de la dose 200mg/kg de

poids vif incorporé dans la farine. (Zerizer, 2006)

- lot 3 : contient 06 souris traitées par salvia officinalis de la dose 100mg/kg de

poids vif et méthionine de la dose 200mg/kg de poids vif incorporé dans la farine.

- lot 4 : contient 06 souris traitées par la salvia officinalis de la dose 100 mg/kg

de poids vif incorporé dans la farine. (Sparg et al., 2004).

1-4-Prélèvement du foie :

Après 21jours du traitement quotidien, les souris sont sacrifiées. Après la dissection des

animaux on a pris le sang et les organes.

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Matériel et méthodes

25

- Le sang prélevé de chaque souris est posé dans des tubes EDTA qui subit une

centrifugation 2800 tours/min pendant 10 min. le sérum obtenu a été récupéré dans

des tubes éppendorff et conservé a -80°C.

- Le foie a été prélevé, rincer avec l'eau physiologique préparé comme suite: 0,9g de

NaCl avec 100 ml d'eau distillée pour éliminer le sang et sécher avec un papier

absorbant.

- Puis pesés 1g du foie et conservé dans le réfrigérateur -80°C pour le dosage des

paramètres du stress oxydant : GSH, GST, GPx et CAT.

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Matériel et méthodes

26

Figure 12: protocole expérimental

Phosphatase alcaline (PAL)

6 souris traitées

par la salvia

officinalis à la

dose 100mg/kg

6 souris traitées par

la méthionine à la

dose 200mg/kg du

poids vif

6 souris témoins

ne subissent

aucun traitement

6 souris traitées par

la salvia officinalis

à la dose 100mg/kg

et le méthionine à la

dose 200mg/kg

Après 21 de traitement

Décapitation

Foie Sérum

Dosage des enzymes Dosage de

du glutathion

réduit

Dosage de catalase

Transférase glutathion peroxydase

Dosage du glutathion S-Transférase

Dosage des transaminases

(TGO-TGP)

Prélèvement des organes Prélèvement du sang

24 souris males

Etude biochimique

Poids

relatif de

foie

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Matériel et méthodes

27

1-5-Estimation du poids relatif du foie :

Après le sacrifice des animaux, le foie a été rapidement prélevé et rincés dans l'eau

physiologique préparé comme suite: 0,9g de NaCl avec 100 ml d'eau distillée. Puis séchée par

un papier absorbant et pesés.

Le foie a été conservée à -80C pour le dosage des paramètres du stress oxydatif à savoir

GSH, GST, GPx et CAT.

Calcul :

- Calculer le poids relatif du foie (PRF (g/100g de pois corporel)) par rapport au poids

total de la souris.

PF : poids du foie (g).

PS : poids de la souris (g).

1-6- Méthodes de dosage des paramétrés biochimiques :

1-6-1-Transaminase glutamate oxaloacétate(TGO) :

Méthode cinétique de dosage des transaminases sériques selon la fiche technique

Spinreact.

Principe

Transaminase glutamate oxaloacétate (TGO) appelée aussi aspartate aminotransferase

(ASAT) catalyse le transfert réversible d'un groupe aminé à partir de l'aspartate au α-

cétoglutarate formant le glutamate et l'oxaloacétate. L'oxaloacétate est réduit au malate

par la malate déshydrogénase (MDH) et le NADH, H+

(Murray, 1984):

Aspartate + α –cétoglutarate glutamate oxaloacétate + oxaloacétate

Oxaloacétate + NADH+ H + MDH Malate + NAD

PRF (g/100gPC)=

ASAT

T

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Matériel et méthodes

28

Réactifs :

Réactif 1 : Substrat TGO

Tampon phosphate

ph7,5AspartateΑ-cétoglutarate

85 mmol/l

200 mmol/l

2 mmol/l

Réactif 2 : Réactif de

Coloration

2,4 dinitrophénylhydrazone

1 mmol/l

Réactif 3

Etalon pyruvate

-

Réactif auxiliarie

Soude 0,4 N -

-

Les réactifs sont stables plusieurs années à 2-8°C. Les réactif 3 est à conserver à l’abri de la

lumière.

*Pour obtenir le réactif de travaille(RT) il faut :

-Mélanger 1 ml de réactif 2 avec 1 ml de Réactif, et laisser 20 mn à température ambiante.

- Ajouter 10 ml de soude 0,4 N.

Mode opératoire :

RT (mL) 1.0

Incuber 5 min à 37 °C

Sérum (µL) 100

Incubation pendant 01 minute. Lecture de l’absorbance (A) à λ=340 nm chaque minute

pendant 03 minutes.

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Matériel et méthodes

29

Calcul :

U/L : unité international/L est la quantité d’enzyme qui transforme 1 μmol de substrat par minute

1-6-2-Dosage du Glutamopyruvate Transférase (TGP) : Le dosage du Glutamopyruvate Transférase (TGP) appelée aussi alanine

aminotransférase sérique (ALAT) est fait selon la méthode de (Reitmans et Frankels, 1957).

Principe

Détermination cinétique de l’activité TGP selon les réactions suivantes /

TGP

L-alanine+a -cétoglutarate glytamate+pyruvate

Le pyruvate formé est dosé sous forme de leur dérivé 2,4 dinitrophénylhydrazone

Réactifs :

Réactif 01 : Substrat TGP

Tampon phosphate ph7,5 Alanine Α-cétoglutarate

95 mmol/l

200 mmol/l 2 mmol

Réactif 02 : Réactif de Coloration

2,4 dinitrophénylhydrazone

1mmol /L

Réactif 03

Etalon pyruvate

Réactif auxiliaries

Soude0,4 N

Les réactifs sont stables plusieurs années à 2-8°C. Les réactif 3 est à conserver à l’abri de la

lumière.

* Pour obtenir le réactif de travaille(RT) il faut :

-Mélanger 1 ml de réactif 2 avec 1 ml de Réactif 1, et laisser 20 mn à température ambiante.

6 Ajouter 10 ml de soude 0,4 N.

ΔA/min X 1750 = U/L de TGO

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Matériel et méthodes

30

Mode opératoire :

RT (mL) 1.1

Incuber 5 min à 37 °C

Sérum (µL) 100

Incubation pendant 01 minute. Lecture de l’absorbance (A) à λ=340 nm chaque minute

pendant 03 minutes.

Calcul :

U/L : unité international/L est la quantité d’enzyme qui transforme 1 μmol de substrat par minute

1-6-3-Dosage de phosphatase alcaline :

La phosphatase alcaline (PALc) catalyse l’hydrolyse de p-nitrophenyl phosphate à pH 10.4,

en libérant p-nitrophenol et le phosphate (Wenger et al, 1984), selon la réaction :

p-nitrophenyl phosphate +H 2 O p-nitrophenol + phosphate

La formation de p-nitrophénol est mesurée photométriquement, où elle est proportionnelle

à l’activité catalytique de la phosphatase alcaline dans le sérum selon la fiche technique

Spinreact :

Réactifs

R1

Tampon

Diéthanolamine (DEA) pH 10.4 1mmol /L

Chlorure de magnésium 0.5mmol/L

R2

Substrat

p-Nitrophenylphosphate (pNPP) 10mmol/L

ΔA/min X 1750 = U/L de TGP

PAL

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Matériel et méthodes

31

Pour obtenir le réactif de travaille(RT), il faut que dissolvez un comprimée de R2 dans un

15mL de tampon R1 et laisser le mélange 1 heure de temps.

La stabilisation de réactif de travaille 21 jour après la préparation et la conservation en 2-8°C.

Mode opératoire :

RT (mL) 1.2

Incuber 5 min à 37 °C

Sérum (µL) 20

Incubation pendant 01 minute. Lecture de l’absorbance (A) à λ=405 nm chaque minute

pendant 03 minutes.

Calculs :

U/L : unité international/L est la quantité d’enzyme qui transforme 1 μmol de substrat par

minute.

1-7-Dosage des paramètres enzymatiques :

1-7-1-Dosage du glutathion réduit (GSH) :

Le dosage du glutathion réduit hépatique (GSH) est fait selon la technique de (Weckbeker et

Cory., 1988).

Principe

La mesure de la concentration du GSH intracellulaire repose sur l’absorbance optique de

l’acide 2-nitro 5-mercapturique, ce dernier résulte de la réduction de l’acide 5,5’-dithio-bis-2-

nitriobenzoïque (DTNB) par les groupements thiol (-SH) du glutathion.

Mode opératoire

- On obtient un homogénat par broyage de 200 mg de tissu hépatique congelé avec

0,8ml de solution EDTA (0,02M).

- On procède à la déprotéinisation de l’homogénat pour le glutathion avec 0,2 ml de

l’acide sulfosalycilique (0,25%).

L’homogénats obtenue se laisse reposer 15 min au congélateur, puis on centrifuge 5 min à

1000 tours/min.

(ΔA)/min X 3300 = U/L de PAL

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Matériel et méthodes

32

- A 0,5 ml de surnagent, on ajoute 1 ml de tampon tris/EDTA d’un ph 6,9 (contenant

0,02 M d’EDTA) et 0,025 ml d’acide 5,5’-dithio-bis-2- nitriobenzoïque (DTNB) à

0,01M.

- Laisser 5 min pour l’incubation.

Lecture

La lecture se fait à la spectrophotométrie à λ = 412 nm, contre un blanc préparé comme

suite : 0,5 ml d’eau distillée avec 1 ml de tampon tris/EDTA et 0,025 ml de DTNB.

Calcule de concentration

La concentration en glutathion réduit est obtenue par la formule suivante :

DO : Densité optique ;

1 : Volume totale de solution utilisées dans la déprotéinisation (0,8 ml de solution EDTA +

0,2 ml d’acide sulfosalycilique) ;

1.525 : Volume totale des utilisées dans le dosage de GSH (1ml de tris/EDTA+0,025 ml

DTNB+ 0,5 ml de surnageant) ;

13100 : Coefficient d’absorbance de groupement thiol (-SH) à 412 nm ;

0,8 : Volume de l’homogénat trouvé dans 1 ml ;

0,5 : Volume de surnageant.

1-7-3- Dosage du glutathion S-Transférase (GST) :

Le dosage de glutathion S-Transférase (GST) est réalisé selon la méthode de (Habig et al .

1974).

Principe

Le dosage de GST est basé sur la mesure spectrophotométrique de la cinétique de la

conjugaison du produit formé avec des substrats tels que le glutathion réduit et le 1- chloro-2-

4-dinitrobenzène (CDNB).

Mode opératoire

La procédure expérimentale du dosage de la GST se fait comme suit :

- Le tissu hépatique est homogénéisé dans 1ml de tampon phosphate sodique

(0,1 M, ph 6);

é

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Matériel et méthodes

33

- Puis l’homogénat est centrifugé pendant 30 mn à 14000 tours/ mn ;

- Le surnageant récupéré sert comme source d’enzymes (GST et GPX) et il est conservé

au congélateur à -80°C jusqu’au moment de dosage.

- A 200 μl de surnageant, on ajoute 1,2 ml du mélange [(CDNB1mM, GSH

5mM) dans tampon phosphate sodique (0,1 M, ph 6)].

Lecture

La lecture des absorbances est effectuée toutes les 1 mn pendant 5 mn à λ = 340 nm,

contre un blanc préparé comme suit : 200 μL d’eau distillée avec 1,2 ml du mélange

[(CDNB 1mm, GSH 5mm) dans tampon phosphate sodique (0,1 M, ph 6)

Calcul de la concentration

L’activité enzymatique de la GST est déterminée par la formule suivante :

A : Absorbance.

Ѵ: Volume totale de la cuve = 1400 μl [200 μl de surnageant + 1200 μl du mélange

CDNB (1mm)/GSH (5mm)/tampon phosphate sodique (0,1 M, ph 6)].

E : Coefficient d’extinction = 9,6 mm-1cm-1.

D : Épaisseur de la cuve = 1 cm.

V : Volume du surnageant = 200 μl.

Mg de protéine : Concentration des protéines dans l’échantillon.

1-7-2- Dosage du glutathion peroxydase (GPx) :

Principe

L’activité enzymatique de la GPx a été mesurée par la méthode de (Flohe et al, 1984).

Cette méthode est basée sur la réduction de peroxyde d’hydrogène en présence de GSH. Ce

dernier est transformé en GSSG sous l’influence de la GPX :

H2O2 + 2GSH GSSG + 2H2O

Mode opératoire

- Prélever 200 μl de l’ homogénat.

- Ajouter 400 μl de GSH (0,1mm).

- Ajouter 200 μl de la solution tampon TBS (Tris 50 mm, nacl150 mm, ph 7,4).

- Incuber au bain marie (25°C/5min).

μ

GPx

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Matériel et méthodes

34

- Ajouter 200 μl de H2O2 (1,3 mm) pour initier la réaction et laisser agir pendant 10

minutes.

- Ajouter 1 ml de TCA (1%) pour arrêter la réaction.

- Mettre le mélange dans la glace pendant 30 minutes.

- Centrifuger durant 10 minutes à 3000 tours/min.

- Prélever 480 μl de surnageant et mélanger avec 2,2 ml de tampon TBS et 320 μl de

DTNB (1,0 mm).

Lecture:

La lecture de la densité optique est faite après 5 minutes à λ = 412 nm, le blanc : 480 μl de

l’eau distillée avec 2,2 ml de tampon TBS et 320 μl de DTNB (1,0 mm).

Calcul de la concentration :

- Activité de GSH consommée/mn/g de protéine (x)

X : la quantité de glutathion réduit disparus (oxydée) dans 0,2 ml de l’échantillon.

Doe : densité optique de l’échantillon.

Dob : densité optique du blanc.

Activité de GPX :

[Protéine] : Concentration des protéines dans l’échantillon.

1-7-4- Dosage de la catalase (CAT)

Principe

L’activité enzymatique de CAT est déterminée par la méthode de Clairborne (1985). Le

principe est basé sur la disparition de l’H2O2 en présence de la source enzymatique à 25°C

selon la réaction suivante :

2H2O2 2H2O+O2

DOe 0 04

DO mg de protéine

x 5

protéine

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Matériel et méthodes

35

Mode opératoire

- Préparation d’une fraction enzymatique selon la méthode d’Iqbal et al. (2003) comme suite :

- Un volume de tissu hépatique est homogénéisé dans 3 volumes de tampon phosphate de

(0,1M, pH 7,4)

- L’homogénat est centrifugé durant 15 min à 2000 tours/ min à 4°C

- Le surnageant obtenu est centrifugé 30 min à 9600 tours/ min à 4°C

- Le surnageant final est la source utilisée pour l’évaluation de l’activité enzymatique du CAT

- L’évaluation de l’activité enzymatique du CAT :

A 0,025 ml de surnageant, on ajoute 1 ml de tampon phosphate (0,1 M, pH 7,2) et 0,975 ml de

H2O2 fraichement préparé (0,091 M).

Lecture

L’absorbance est lue à 560 nm chaque minute pendant 2 minutes.

Calcul de la concentration

L’activité enzymatique de CAT est calculée en termes d’unité internationale par minute et par

gramme de protéine (UI/min/g de protéine), selon la formule :

L’activité de CAT (µmol/min/mg de protéine)

= (2.3033/T) (logA1/A2)/mg de protéine

A1 : Absorbance de la première minute

A2 : Absorbance de la deuxième minute

T : Intervalle de temps en minute

g de protéine : Concentration des protéines dans la solution.

1-8- Dosage des protéines:

Les dosages des (GSH), (GST), d (GPX) dépend toujours aux dosages des protéines. Pour

cela, On utilise la méthode de (Bradford., 1976). Pour déterminer la concentration totale de

protéines dans un mélange complexe par spectrophotométrie d'absorption.

Cette méthode se fonde sur l’ajout du colorant, le (BBC), à une solution contenant des

protéines (surnagent) à fin de déterminer la concentration en protéines totales. Le BBC en

solution acide possède la particularité de se lier aux protéines, par des interactions non-

covalente (ponts hydrogène, interactions hydrophobes et interactions ioniques), avec un effet

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Matériel et méthodes

36

immédiat sur son spectre d'absorption (interaction du colorant principalement avec des acides

aminés basiques (lysine, arginine, histidine et aromatiques).

Mode opératoire

* A 100 μl de l’échantillon, on ajoute 4 ml de réactif de Bradford.

* La lecture se fait à la spectrophotométrie à λ = 595 nm, contre un blanc préparé comme

suite : 100 μl d’eau distillée avec 4 ml de réactif de Bradford.

Courbe d’étalonnage

A partir d’une solution mère de BSA (1mg/ml), une gamme d’étalonnage allant de 1 mg/ml

de BSA a été préparée.

Tableau 06 : gamme d’étalonnage pour dosage des protéines.

Tube

1

2

3

4

5

6

Solution mére BSA (μl)

0

20

40

60

80

100

H2O (μl)

100

80

60

40

20

0

Réactif de Bradford (ml)

4

4

4

4

4

4

Lecture

La lecture de la DO est faite à 595 nm.

Analyse statistique des résultats

Les résultats obtenus sont exprimés sous forme de moyenne ± écart-type et analysés

statistiquement avec le logiciel «statistica » par le test de student et lorsque :

- p≥0.05 : la différence n’est pas significative

- 0.05≥p≥0.01 : la différence est significative *

- 0.01≥0.001 : la différence est hautement significative **

- p≤0.001 : la différence est très hautement significative ***

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Résultat

37

2-Résultat :

2-1- Variation de l’activité enzymatique des transaminases sériques (TGP et TGO (UI/ L) suite

au traitement par salvia officinalis et la supplémentation de la méthionine :

Les résultats obtenus à partir de notre étude montrent des variations de l’activité

enzymatique des transaminases sériques (TGO et TGP).

2-1-1- Variation de l’activité enzymatique de TGO (UI /L) dans les différents lots

expérimentaux :

L’analyse statistique révèle une augmentation très hautement significative de l’activité

enzymatique du TGO chez les souris traitées par la dose 200mg/kg du poids vif de la

méthionine par rapport au lot traité par salvia officinalis de la dose 100mg/kg du poids vif, au

témoin et au lot traité par l’association de la méthionine et la salvia officinalis : dose M Vs

dose S (100,455 ±1,63 -53,411 ±1,687) et dose M Vs témoin (100,455 ±1,635 -62,261

±2,56),dose M Vs dose M+S (100.45 ± 1.63-71.91± 2.29).

En revanche nos résultat montre une diminution très hautement significatifs de l’activité

enzymatique du TGO chez les souris traitées par la dose 100mg/kg du poids vif de salvia

officinalis par rapport au lot traité par la méthionine et cette même diminution est hautement

significatifs par apport au lot traité par l’association de la méthionine et la salvia officinalis ,et

significatif par apport au témoin : dose S Vs dose M (53,411 ±1,687 -100,455 ±1,635) et dose

S Vs témoin (53,411 ±1,687 -62,261 ±2,56).

Figure 13: Variation de l’activité enzymatique de TGO (UI /L) dans les différents lots

expérimentaux a : comparaison avec le lot Témoin, b : comparaison avec le lot traité par le

Méthionine, c : comparaison avec la combinaison la méthionine et la salvia officinalis d :

0

20

40

60

80

100

120

T M M+S S

T

M

M+S

S

Les lots expérimentaux

Vari

ati

on

de

l'act

ivit

é

enzy

mati

qu

e d

e T

GO

UI/

L

ac d***

d** a*

Page 55: Thème: Etude de l’effet de salvia officinalis sur les ... · Homocysteine is a sulfur amino acid precursor of cystathionine to cysteine, an ami no acid that enters in the formation

Résultat

38

comparaison avec le lot traité par le la salvia officinalis. (P : Seuil de signification *** :

p≤0.001).

2-1-2- Variation de l’activité enzymatique de TGP (UI / L) dans les différents lots

expérimentaux :

D’après nos résultats, l’activité enzymatique du TGP montre une augmentation très

hautement significative chez le lot traité par la dose 200mg/kg du poids vif de la méthionine

par rapport au témoin, et cette augmentation est hautement significatifs par rapport au lot

traité par l’association de la méthionine et salvia officinalis: dose M Vs témoin (61,353 ±2.55

-23,781 ±2.35) et dose M Vs dose M+S (61,353 ±2.55-43.23± 3.79).

Cette même augmentation est signalée chez le lot traité par la combinaison de la

méthionine et salvia officinalis par apport au témoin.

Tandis que le lot traité par la dose 100mg/kg du poids vif du salvia officinalis présente

une diminution hautement significatifs par apport au lot traité par la méthionine : Dose S Vs

dose M (38.06± 3.25-61.35± 2.55).

Figure 14: Variation de l’activité enzymatique de TGP (UI/ L) dans les différents lots

expérimentaux c : comparaison avec la combinaison la méthionine et la salvia officinalis d :

comparaison avec le lot traité par le la salvia officinalis,. P : Seuil de signification (* :p≤0.05,

, *** : p≤0.001).

0

10

20

30

40

50

60

70

T M M+S S

T

M

M+S

S

Les lots expérimentaux

Vari

ati

n d

e l'act

ivit

é en

zym

ati

qu

e

de

TG

P U

I/L

a***

c d**

a**

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Résultat

39

2-2-Variation de l’activité enzymatique de phosphatase alcaline(PAL) suite au

traitement par Salvia Officinalis et la supplémentation de la méthionine :

Nos résultats montrent une augmentation très hautement significative de l’activité

enzymatique de la phosphatase alcaline chez les souris traités par la méthionine de la dose

200mg/kg de poids vif par rapport aux souris témoins, et une augmentation hautement

significatifs par apport au lot traité par la salvia officinalis de la dose 100mg/kg de poids vif,

et au lot traités par la combinaison de la méthionine et salvia officinalis : dose M Vs témoin

(141,058 ±3.97 -87,655 ±2,883) ; dose M Vs dose S (141,058 ±3.97 -99,871 ±1,691) et dose

M Vs dose M+S (141,058 ±3.97 -110,643 ±2,890).

Tandis que, le lot traité par salvia officinalis présente une diminution significatif de

l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline par apport au lot traité par l’association de la

méthionine et de salvia officinalis et une diminution hautement significative par rapport au

lot traité par la méthionine.

Nos résultats montrent aussi une augmentation hautement significative chez le lot traité par

l’association de la méthionine et salvia officinalis par rapport au témoin.

Figure 15: Variation de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline dans les différents

lots expérimentaux c : comparaison avec la combinaison la méthionine et la salvia officinalis

d : comparaison avec le lot traité par le la salvia officinalis, P : Seuil de signification (*** :

p≤0.001).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

t m m+s s

t

m

m+s

s

Les lots expérimentaux

Vari

ati

on

de

l’act

ivit

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qu

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se a

lcalin

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UI

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)

a*** cd**

a** d*

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Résultat

40

2-3-Variation de la teneur en GSH hépatique (μM /min/ mg protéine) dans les

différents lots expérimentaux (protéine) :

Nos résultat montre une diminution très hautement significative de la teneur hépatique en

glutathion réduit (GS H) chez le lot traité par 200mg/kg de poids vif de la méthionine par

rapport au lot témoin, au lot traité par salvia officinalis et au lots traité par la combinaison de

la méthionine et la plante : Témoin Vs M(0.00054 ± 0.63*10-5- 0.00025 ± 0.33*10- 5), dose M

Vs dose S(0.00025 ± 0.33*10- 5 -0.00056 ± 0.97*10-5 ), et dose M Vs dose M+S( 0.00025 ±

0.33*10- 5 ). Et cette diminution est hautement significative chez le lot traité par l’association

de la méthionine et salvia officinalis par apport au témoin.

Par contre le lot traité par la salvia officinalis de la dose 100mg/kg présente une

augmentation très hautement significative par apport au lot traité par la méthionine et

hautement significatif par apport au lot traité par la combinaison.

Figure 16: Variation de la teneur en GSH hépatique (μM /mg protéine) dans les différents

lots expérimentaux c : comparaison avec la combinaison la méthionine et la salvia officinalis

d : comparaison avec le lot traité par le la salvia officinalis,.P : Seuil de signification ( **

:p≤0.01, *** : p≤0.001).

0

0,0001

0,0002

0,0003

0,0004

0,0005

0,0006

0,0007

T M S+M S

Vari

ati

on

de

la t

eneu

r en

GS

H

hép

ati

qu

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Les lots expérimentaux

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Les lots expérimentaux

Vari

ati

on

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la t

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g p

roté

ine

Les lots expérimentaux

a c d***

ad** b***

b*** c**

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Résultat

41

2-4-Variation de l’activité enzymatique de GST (μmol /min/mg protéine) dans les

différents lots expérimentaux :

L’administration de la méthionine à 200 mg/kg de poids vif chez les souris induit une

augmentation significative de l’activité enzymatique de la glutathion-S-transférase (GST)

hépatique par rapport à ceux témoins. Tandis que, la combinaison de la méthionine et la salvia

officinalis présente une diminution significative de l’activité enzymatique GST comparée

aux lots témoins et les traités par la méthionine : Dose M Vs dose M+S (6.57*10-5± 0.33*10

-4

-3.63*10-5

± 0.33*10-4

).

Par contre le lot traité par la salvia officinalis présente une diminution très hautement

significative de l’activité enzymatique GST par apport aux témoins et aux traités par la

méthionine : Dose S Vs dose T (2.97*10-5

± 0.22*10-4

-7.11*10-5

±0.24*10 -4

) et dose S Vs M

(2.97*10-5

± 0.22*10-4

-6.57*10-5

± 0.33*10-4

).

Figure 17: Variation de l’activité enzymatique de GST (µmol /mg de protéine) dans les

différents lots expérimentaux c : comparaison avec la combinaison la méthionine et la salvia

officinalis d : comparaison avec le lot traité par le la salvia officinalis,. P : Seuil de

signification (* :p≤0.05).

0

0,00001

0,00002

0,00003

0,00004

0,00005

0,00006

0,00007

0,00008

T M MS S

T

M

MS

S

Les lots expérimentaux Vari

ati

on

de

l’act

ivit

é en

zym

ati

qu

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e

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ine)

ac* d***

a* ab***

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Résultat

42

2-5-Variation de l’activité enzymatique du glutathion peroxydase GPx

(µmol/min/mg. Protéine) dans les différents lots expérimentaux :

Nos résultats révèlent une diminution hautement significative chez le lot traité par la

méthionine à la dose 200mg/kg de poids vif par apport au lot témoin et au lot traité par

l’association de la méthionine et la salvia officinalis. Cette diminution devient très hautement

significative par apport lot traité par la salvia officinalis.

Cette même activité présente augmentation une hautement significative chez le lot traité

par la salvia officinalis à dose de 100 mg /kg de poids vif par apport au témoin et au lot traité

par la combinaison salvia officinalis et méthionine: Dose S Vs T (1.22± 0.23-0.77± 0.03), dose

S Vs M (1.22± 0.23-0.44± 0.087) et Dose S Vs M+S (1.22± 0.23-0.59± 0.12).

Figure18: Variation de l’activité enzymatique du glutathion peroxydase GPx (µmol/mg

deprotéine) dans les différents lots expérimentaux c : comparaison avec la combinaison la

méthionine et la salvia officinalis d : comparaison avec le lot traité par le la salvia

officinalis,. P : Seuil de signification (* :p≤0.05, ** :p≤0.01, *** : p≤0.001).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

T M M+S S

T

M

M+S

S

Les lots expérimentaux

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ivit

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a**

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Résultat

43

2-6-Variation de l’activité enzymatique du CATALASE (µmol/min/mg de

protéine) dans les différents lots expérimentaux :

Concernant l’activité enzymatique de la catalase(CAT), nos résultats signale qu’il y’a une

augmentation significative chez le lot traité par la dose 200 mg /kg du poids vif de la

méthionine par rapport au lot témoin et au lot traité par la combinaison de la méthionine avec

100mg/kg de poids vif de salvia officinalis

Cette activité enzymatique présente une diminution très hautement significative chez le lot

traité par 100mg/kg de poids vif de salvia officinalis par apport au lot traité par la méthionine

: Témoin Vs dose M (0.083± 0.039-0.167± 0.019) ; dose M Vs dose M+S (0.167± 0.019-

0.065± 0.029) ; et dose M Vs dose S (0.167± 0.019-0.040± 0.0016).

Figure 19 : Variation l’activité enzymatique du catalase (µmol/mg de protéine) dans les

différents lots. c: comparaison avec la combinaison la méthionine et la salvia officinalis d :

comparaison avec le lot traité par le la salvia officinalis.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

T M M+S S

Vari

ati

on

de l’

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ivit

é

enzy

mati

qu

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(UI

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Les lots expérimentaux

ac* d***

b*

b***

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Résultat

44

2-7-Variation du poids relatif du foie :

Nos résultats montrent d’une part une diminution significative du poids relatif du foie chez

le lot traités par la méthionine à une dose de 200 mg/kg de poids vif comparant au lot

témoin : dose M Vs dose témoin (3.966 ±0.597 -4.484 ±1.062) cette même diminution est

très hautement significative par rapport au lot traités par salvia officinalis à la dose 100mg/kg

de poids vif : dose M Vs dose S (3.966 ±0.597 -5.143 ±1.001).

D’autre part on observe une augmentation significative du poids relatif du foie chez le lot

traités par la salvia officinalis et le lot traité par la combinaison de la méthionine et salvia

officinalis comparant au témoin : dose M+S Vs témoin (5.143 ±1.001 - 4.484 ±1.062).

Figure 20: Variation du poids relatif du foie dans les différents lots expérimentaux. a :

comparaison avec le lot Témoin, b : comparaison avec le lot traité par le Méthionine, c :

comparaison avec la combinaison la méthionine et la salvia officinalis d : comparaison avec

le lot traité par le la salvia officinalis,. P : Seuil de signification (* :p≤0.05, ** :p≤0.01, *** :

p≤0.001).

0

1

2

3

4

5

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T M M+S S

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Les lots expérimentaux

a* c d***

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a*

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Discussion

45

3. Discussion

3.1. Effet de salvia officinalis sur l’activité enzymatique des transaminases chez la souris

supplémentée en méthionine:

La transaminase Glutamate Oxaloacétique (TGO) est un enzyme cytosolique et

mitochondriale qui se trouve dans le cœur, foie et les reins. L’activité de cette enzyme

augmente dans le cas des destructions des cellules, en particulier en cas d'infarctus du

myocarde et de myopathie, et le dosage de cette enzyme est utilisé pour détecter des lésions

hépatiques. (Astier-Théfenne et al, 2001).

La transaminase Glutamate Pyruvate (TGP) est un marqueur sensible et spécifique d'une

atteinte hépatocellulaire. (Buswell, 2001). Son activité augmente en cas de désordre cellulaire

dû aux infections, cirrhose et altération hépatiques. (Ardle et al, 2004).

Ces enzymes catalysent le transfert des groupes (-NH2) des acides aminés vers les acides

cétoniques, processus très général de dégradation et de synthèse des acides aminés

(Arock et al, 2007).

Le traitement des souris par la méthionine avec la dose 200mg/kg du poids vif pendant 21

jours provoque l’augmentation de l’activité enzymatique des transaminases sériques.

Les activités de ces deux enzymes sont toujours demandées simultanément, le plus souvent

dans :

– un bilan hépatique, comme marqueur de cytolyse ;

– un bilan cardiaque, comme marqueur de nécrose ; elles sont alors associées à d’autres

dosages (activité CK, troponine…). (Astier-T et al, 2001)

Ces résultats concordent avec l’étude de (Bin et al, 2013), qui a montré une augmentation

significative des transaminases chez des rats recevant un régime alimentaire riche en

méthionine.

La dose 200 mg/kg de la méthionine chez les rats provoque une augmentation de l’activité

transaminases sérique (Seda et al, 2007)

Contrairement à l’effet de la méthionine le traitement quotidien pendant 21 jours avec la

dose 100mg/kg de poids vif réduit l’activité enzymatique des transaminases sériques ce qui

confirme que cette plante possède un effet antioxydant au niveau. (Demet et al 2016).

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Discussion

46

3.2. Effet de salvia officinalis sur l’activité enzymatique de phosphatase alcaline (PAL)

chez la souris supplémentée en méthionine:

La phosphatase alcaline est un indicateur hépatique de toute perturbation dans le système

biologique, responsable du métabolisme, de la détoxification, et de la biosynthèse des

macromolécules énergiques pour les différentes fonctions physiologiques. L’interférence avec

cette enzyme mène aux perturbations biochimiques, aux lésions tissulaires et la perte de la

fonction cellulaire. (Arock et al, 2007).

Le traitement des souris par la méthionine avec la dose 200mg/kg du poids vif pendant 21

jours provoque l’augmentation de l’activité de la phosphatase alcaline.

L’augmentation de la phosphatase alcaline est en faveur d’une obstruction des voies

biliaires et des autres atteintes hépatiques ; en plus dans les problèmes osseuses (Kubab et al,

2007).

Tandis que l’administration pendant 21jours du salvia officinalis avec la dose 100mg/kg

améliore l’activité de la méthionine par leur propriété de neutraliser les radicaux libres

pourrait avoir un effet hépatoprotecteur. (Maryam et al, 2011).

3.3. Effet de salvia officinalis sur la teneur en glutathion réduit (GSH) et l’activité

enzymatique de la glutathion peroxydase (GPx) chez la souris supplémentée en

méthionine:

Le glutathion est un composé thiol qui se trouve dans toutes les cellules du corps et joue un

rôle de détoxification.

Le traitement des souries par la méthionine avec la dose 200mg/kg du poids vif pendant 21

jours provoque une diminution de la teneur hépatique en GSH. (Natalia, 2010). Un apport

alimentaire important en protéines animales riche en méthionine, augmente la concentration

de Sulfonium-adénosyl-L-méthionine (SAM) ce qui stimule la voie du transméthylation de

méthionine en homocystéine et elle limite la voie de reméthylation de l'homocystéine en

méthionine (Wang et al, 2001). Le blocage de la méthylation de l’homocystéine peut

également être obtenu en agissant sur la voie de la Bétaine-Homocystéine méthyltransférase

(BHMT), induisant une carence en choline qui est un précurseur de la bétaine. Ce dernier

intervient dans la transformation d'une grande quantité d’homocystéine en cystéine. Donc

provoque une diminution d’acide aminé cystéine nécessaire à la synthèse du glutathion

(Finkelstein, 2003).

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Discussion

47

Des résultats similaires sont rapportés par (Bagnyukova, 2003). Qui a trouvé que

l’exposition à des doses élevées et répétées de la méthionine provoque la diminution de GSH

intracellulaire dans le foie.

Par contre l’administration d’une dose de 100mg/kg de poids vif de salvia officinalis

résulte une augmentation de la teneur hépatique de GSH grâce à leur effet anti oxydant.

Des résultats similaires sont rapportés par (Ladislav et al, 2014). Qui ont trouvé que les

niveaux de GSH étaient plusieurs fois plus élevés que chez les souris témoins, après

l’exposition à une dose de salvia officinalis. Et par (Joseph et al, 2007) : des études montre

qu’il y a un effet de l’extrait de cette plante a la dose 100mg/ml chez les rats pendant 7 jours

contre le stress oxydatif.

La GPx est une sélénoprotéine avec cinq isoformes qui réduit les peroxydes aux dépens de

son substrat spécifique, le glutathion réduit (GSH). Son rôle principal consiste en

l’élimination des peroxydes lipidiques résultant de l’action du stress oxydant sur les acides

gras polyinsaturés. (Haleng, 2007)

Le traitement des souris par la méthionine avec la dose 200 mg/kg du poids vif pendant 21

jours provoque la diminution de l’activité enzymatique de (GPx).

La glutathion peroxydase joue un rôle primordial dans la défense antioxydante des cellules

grâce à sa capacité de détoxification de radicaux activés mais également grâce à un effet

épargne sur d’autres éléments antioxydants présents dans les cellules (Schoonheere et al,

2006)

Des résultats montrent que l’homocystéine diminue l’expression et l’activité de la

glutathion peroxydase (GPx). La GPx catalyse la réduction de peroxyde d’hydrogène (H2O2)

en H2O par oxydation du GSH en GSSG. Une hyperhomocystéinémie pourrait empêcher ou

limiter le potentiel antioxydant de certaines cellules. (Min, 2009)

D’autre part, un traitement des souris par100mg /kg de Salvia officinalis améliore la

diminution de l’activité de cette enzyme de stress oxydatif. Car le traitement des souris par

cette plante possède une activité antioxydant grâce à leur capacité de balayage les radicaux

libres.

L’effet antioxydant du salvia officinalis contre la peroxydation des lipides a été confirmé

dans les travaux de (Biljana et al, 2007) (Katarina, 2013) sur l’huile essentielle de cette

plante avec la dose 100mg/ml pendant 24 h.

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Discussion

48

3.4. Effet de salvia officinalis sur l’activité enzymatique du glutathion S-transférase

(GST) chez la souris supplémentée en méthionine:

Le GST est un principal acteur du métabolisme des composées électrophiles. Elles

catalysent souvent la conjugaison des molécules électrophiles avec le glutathion réduit (GSH)

(Lecomte, 2005). La glutathion S-transférase (GST), cette enzyme joue un rôle important dans

la détoxification des xénobiotiques et/ou dans la protection contre des métabolites nocifs

générés après la dégradation des macromolécules suite à leur exposition au stress oxyda nt

(Hayes et al, 1995).

Les résultats concernant l’activité du glutathion S-transférase (GST) indiquent une

augmentation de l’activité spécifique de cette enzyme chez les souris traité par la méthionine

par la dose 200mg/kg du poids vif.

L’excès de la méthionine favorise le développement de l'hépatotoxicité induite par le

déséquilibre pro-oxydant – antioxydant dans le foie. (Seda et al, 2007)

Tandis que les souris traitées par salvia officinalis de la dose 100mg/kg du poids vif

présente une diminution de l’activité du glutathion S-transférase (GST). Ce qui suggère que la

Salvia officinalis possèdent des composants phenolique basé sur une caractéristique de

l'activité anti-oxydante, par sa capacité de piégeage des radicaux libres, (Biljana et al, 2007)

Certains des composés phénoliques des plantes appartenant a ce genre ont montré

également excellente activité antimicrobienne, ainsi que l’activité antiradicalaire del’oxygène

actif, en inhibant la peroxydation lipidique (Osman et al, 2012)

3.5 Effet de salvia officinalis sur l’activité enzymatique du catalase chez la souris

supplémentée en méthionine:

La catalase est une enzyme heminique à cofacteur fer, localisée dans les peroxysomes, en

particulier dans les hépatocytes et les érythrocytes (Clausse 2001, Alain 2003).

Elles réduisent le peroxyde d'hydrogène H20

2 en libérant de l'oxygène et de l'eau.

Les souris traités par la méthionine de la dose 200mg/kg présente une augmentation de

l’activité enzymatique de catalase (CAT)

La méthionine en excès exerce un effet stimulateur de la catalase ce qui témoigne d’une

production exagérée des radicaux libres suite à la formation de l’homocystéine et l’inhibition

de la voie de réméthylation de homocystéine en méthionine et le blocage d e la

transsulfuration de l’homocystéine en cystéine. (Sánche, 1997).

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Discussion

49

Par contre les souris traité par salvia officinalis de la dose de 100 mg /kg présente une

diminution de l’activité enzymatique de catalase (CAT) dans le tissu hépatique.

Les composés phénoliques c’est l’un des composants de salvia officinalis sont connues

pour leurs propriétés antioxydantes et qui ont été proposés en tant qu'agents thérapeutiques

des agents pour contrer le stress oxydatif. (Ladislav et al, 2014)

C’est la capacité de capter où de piéger les radicaux libres produits spontanément et d’une

façon continue dans l’organisme vivant (Madi, 2010).

3.6. Effet de salvia officinalis sur le poids relatif du foie chez la souris supplémentée en

méthionine :

Le traitement des souries par la méthionine avec la dose 200mg/kg du poids vif pendant 21

jours provoque une diminution de poids relatif du foie. Cette diminution du poids relatif est

interpréter par une dégradation des cellules hépatiques suite à une nécrose et la cytolyse

hépatique provoquée par l’augmentation de l’homocystéine induite par l’administration en

excès de la méthionine.

L’altération fonctionnelle des cellules hépatiques est interprétée par l’augmentation

plasmatique de l’activité des transaminases et phosphatase alcaline.

Le même résultat a été trouvé dans l’étude de (Mennouni et al, 2012), menée sur des

souris recevant 200 mg/kg de méthionine.

Cette diminution est améliorée par l’administration de salvia officinalis grâce à sa propriété

digestive, antioxydante et anti inflammatoire. (Komet, 2007)

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Conclusion

Conclusion

Ce travail permet de mettre en évidence les effets de l’extrait de salvia officinalis sur

les variations de quelques paramètres biochimiques de stress oxydatifs chez les souris

supplémenté en méthionine.

Notre travail est réalisé sur des souris mâles Mus musculus de la race BALB/c traitées,

pendant 21 jours par la salvia officinalis avec la dose 100mg/kg de poids vif et la méthionine

de la dose 200mg/kg , les activités enzymatiques spécifiques du glutathion S-Transférase

(GST) sont mesurées, du glutathion peroxydases (GPx) et du catalase (CAT) dans le foie, la

concentration des transaminases sériques (TGO/TGP) ,PAL ainsi que la teneur en glutathion

réduit (GSH).

A travers notre étude nous avons montré que l’utilisation de méthionine à la dose

200mg/kg provoque une augmentation des activités enzymatiques des transaminases (TGP et

TGO), PAL, de GST et de la Catalase et une diminution de GSH, GPx et du poids relatif de

foie.

Ce qui suggère que ces détériorations sont la conséquence de la transformation de la

méthionine en homocystéine facteur oxydatif et cause principale des maladies hépatique.

Alors que le traitement des souris par salvia officinalis à une dose de 100mg /Kg de poids

vif provoque une diminution TGO-TGP, PAL, GST, CAT et une augmentation

GSH, GPx et Poids relatif de foie. Ce qui prévient les dommages qui peuvent être provoqués

par la génération des radicaux libre au cours d’un excès de l’homocystéine. Cette plante

utilisée sous différentes formes en phytothérapie par sa puissance de l’activité antioxydant

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