THÈSE - Paul Sabatierthesesups.ups-tlse.fr/3229/1/2016TOU30071.pdf · combinaisons au total) C et R ont été mesurées, en temps réel dans les cellules vivantes, à la recherche

THÈSE

En vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE

Délivré par :

Université Toulouse 3 Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier)

Présentée et soutenue par :

Lauriane ONFROY

Le Vendredi 01 Juillet 2016

Titre :

Développement de biosenseurs BRET prédictifs de la cardiotoxicité des

médicaments anti-tumoraux

Ecole doctorale et discipline ou spécialité :

ED BSB : Pharmacologie

Unité de recherche :

U1048 I2MC - INSERM - Equipe 8

Directeur(s) de Thèse :

Dr. Céline GALES et Pr. Jean-Michel SENARD

Rapporteurs : Dr. Julie PERROY

Dr. Laurent DUCA Dr. Luc DE VRIES

Autre(s) membre(s) du jury :

Dr. Jacky MARIE – Président Dr. Céline GALES – Co-directrice de thèse

Pr. Jean-Michel SENARD – Co-directeur de thèse Dr. Thierry SULPICE - Invité

REMERCIEMENTS

La réalisation d’une thèse, depuis son commencement jusqu’à l’achèvement tant attendu de la soutenance, n’est pas le fait uniquement de nous-même mais dépend beaucoup des personnes qui nous entourent et nous soutiennent. C’est pourquoi j’aimerai remercier ici un certain nombre de ces personnes sans qui cette thèse n’aurait pu voir le jour.

La première personne qu’il me faut remercier est le Dr. Thierry Sulpice, directeur de Cardiomedex. A la suite de mon master, à un moment de questionnement sur mon avenir, le Dr. Sulpice a eu la générosité de me proposer de présenter un dossier pour obtenir un financement de l’ANRT. Je le remercie pour cette générosité et pour la confiance qu’il m’a accordé en me confiant ce projet, ainsi que pour la bienveillance et la disponibilité dont il a fait preuve tout au long de ces trois ans. Je remercie également Caroline Dubroca pour sa gentillesse et son amitié.

Les personnes que je souhaite remercier ensuite sont mes directeurs de thèse, le Pr. Jean-Michel Senard et le Dr. Céline Galés. Vous m’avez accueilli dans votre équipe lors de mon stage de M2R et m’avez recommandé à Thierry pour ce travail de thèse. Le soutien sans faille et la confiance que vous m’avez accordé ont été des piliers indispensables pour la réussite de ce travail. Céline, j’ai adoré travailler avec toi. Je n’avais jamais rencontré personne faisant montre d’une telle passion pour la science, qui soit exaltée au moindre résultat obtenu, positif ou négatif, possédant autant de connaissances scientifiques et toujours en soif d’en apprendre plus et dont la motivation ne failli jamais. Merci pour ton soutien, ta confiance, ton aide, pour toutes ces discussions enflammées. Tu m’as fait découvrir le monde de la recherche, tu m’as donné l’envie de Chercher et de Comprendre avec un C, tu as développé mon esprit critique et tant d’autre choses encore. Merci pour TOUT !

Qui dit équipe dit membres de cette équipe et les membres de l’équipe 8 à l’I2MC sont des personnes formidables. Merci à vous, Marie, Mathias, Du, Dina, Marie-Hélène, Ségolène, Céline M et Céline G. Votre bonne humeur et vos caractères bien trempés ont mis de l’ambiance dans ces trois années ! Un grand merci particulièrement à Véronique, dernière arrivée dans l’équipe. Merci de m’avoir appris les ficelles du clonage et merci pour ton aide et ta disponibilité ! Je vous souhaite à tous bon courage pour la suite et de trouver votre voie pour ceux qui n’en sont encore qu’au début.

Tous mes remerciements également aux membres du jury et rapporteurs, les Dr. Jacky Marie, Julie Perroy, Laurent Duca et Luc De Vries. Je vous suis reconnaissante de l’intérêt que vous avez porté à mon travail et de la pertinence de vos remarques et des discussions qui en ont découlé. Merci aussi aux membres de mon comité de thèse, Fabien Despas et Audrey Ferrand, dont les conseils ont été précieux pour mon apprentissage.

Une pensée également pour toutes les personnes de l’institut qui ont été présentes tout au long de ce temps passé ici. Guillaume, Jordy et Marc sans qui travailler serait souvent techniquement difficile voir impossible, Marianne, Stéphanie, Michel, Dounia, Natahalie et bien d’autres que je n’oublierai pas.

Je ne serais pas ici sans ma famille. Vous m’avez soutenue et encouragée tout au long de ce travail. La joie et la fierté que j’ai pu voir dans vos yeux le jour de la soutenance est la plus belle chose que j’ai pu contempler à ce jour. Raphaël, tu m’as supporté tout au long de ce travail et surtout pendant la rédaction de ce manuscrit, ce qui n’a pas dû être une mince affaire !, merci d’être là avec moi. Enfin, merci à mes amis grâce à qui j’ai pu me changer les idées et repartir toujours du bon pied.

Je conclurai ces propos par une pensée spéciale pour ma maman qui, je le sais, a toujours été là avec moi et serais fière de ce travail accompli.

A ma mère, à mon grand-père,

INSERM Développement de biosenseurs BRET des PI3K CARDIOMEDEX

Lauriane Onfroy Page 5/201

RESUME

Beaucoup de médicaments anticancéreux entrainent à plus ou moins long terme une cardiotoxicité, dont les mécanismes moléculaires restent encore très mal connus. Aujourd’hui, peu de moyens existent pour prédire, au stade du développement préclinique, le potentiel cardiotoxique de ces molécules. Dans ce contexte, l'objectif de ce travail de thèse a consisté à utiliser le principe de transfert d’énergie bioluminescente par résonance (BRET) pour créer des biosenseurs de l’activité des phosphoinositide-3-kinases (PI3K) de classe IB. En effet, ces protéines kinases ubiquitaires sont des cibles pharmacologiques majeures de part leur implication dans les phénomènes cancéreux, et sont également importantes pour l'homéostasie cardiaque. Ainsi, elles pourraient constituer une cible cardiaque des agents anticancéreux participant au développement de la cardiotoxicité.

Les PI3K-IB sont des hétérodimères formés d'une sous-unité catalytique (C) p110 associée à une sous-unité régulatrice (R) dont il existe deux isoformes, p87 et p101. Pour

développer le senseur PI3K, un donneur (Rluc8) et un accepteur (GFP2) d’énergie BRET ont été fusionnés en position N- ou C-terminale de chacune des sous-unités C et R (senseur intermoléculaire). Après vérification de l’expression cellulaire de ces constructions dans les cellules HEK293T, les interactions entre les différentes paires de senseurs BRET (8 combinaisons au total) C et R ont été mesurées, en temps réel dans les cellules vivantes, à la recherche d’un couple capable de refléter l’activation de la PI3K. Nos résultats démontrent des

interactions spécifiques basales entre les sous-unités C et R des couples p110/p87 et

p110/p101. Par contre, aucune des conditions de stimulations testées (nature du récepteur, concentrations de ligand, temps de stimulation, stœchiométrie des senseurs) n'a permis de

détecter des modulations du signal BRET. La présence de co-activateurs connus de la PI3K tels que les protéines Ras ou les protéines G hétérotrimériques n'a pas non plus aidé à la modulation du signal BRET. Nous avons ensuite tenté de créer un senseur indirect de l’activité

de la PI3Ken mesurant par BRET les interactions entre les sous-unités de PI3K et des

protéines G (décrites dans la littérature) lors de l'activation de la PI3K. Étonnamment, les

résultats révèlent une pré-association basale entre les sous-unités de la PI3K et celles des protéines G mais sans détection de modulation significative de signal BRET après stimulation.

En conclusion, nous n'avons pu établir un biosenseur BRET de l'activité de la PI3K en mesurant les interactions entre les sous-unités régulatrices et catalytiques. Ainsi, l’absence de modulations détectables du signal BRET après stimulation entre les deux sous-unités pré-complexées pourrait rendre compte d’un mécanisme d'activation impliquant des changements conformationnels plutôt qu'une association-dissociation physique. Dans le futur, l'étiquetage intramoléculaire des sous-unités C ou R avec les deux sondes BRET pourrait peut-être mieux

détecter ces conformations et l'activité de la PI3K. D'un point de vue fondamental, l’existence

de pré-complexes PI3K/protéines G pourraient également rendre compte d’une régulation spatio-temporelle plus fine et spécifique de la kinase, en accord avec les récents concepts de modules de signalisation préformés





AVANT-PROPOS

Le cancer est aujourd’hui la première cause de mortalité en France et représente un problème de santé publique majeur à l’échelle mondiale. Il touche tous les âges, toutes les strates de la société, les hommes comme les femmes. D’après l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), en 2012, 14.1 millions de nouveaux cas de cancer ont été détectés dans le monde (poumons 13 %, seins 11 %, intestin 9.7 %) et 8.2 millions de personnes sont décédées des suites d’un cancer (19.4 % du fait d’un cancer du poumon, 9.1 % d’un cancer du foie et 8.8 % d’un cancer de l’estomac). La découverte de nouveaux traitements anticancéreux plus efficaces et plus spécifiques est donc un enjeu primordial.

Depuis la découverte de la première molécule chimio-thérapeutique vers le milieu du XXème siècle, les scientifiques n’ont cessé de faire preuve d’une opiniâtreté sans bornes afin de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce fléau. Les traitements chimio-thérapeutiques, en particulier les cytotoxiques, utilisés aujourd’hui en clinique sont à double tranchant. De par leur mécanisme d’action, ils ont un fort potentiel curatif qui leur permet de ralentir, parfois même de guérir, de nombreux cancers. Malheureusement, ils sont également à l’origine de nombreux effets indésirables et d’une toxicité souvent limitante en termes de dosage, de durée du traitement et d’association à d’autres médicaments et donc de comorbidités. Parmi les toxicités les plus connues des médicaments anticancéreux figurent la toxicité digestive (diarrhées, stomatites, mucites), neurologique (neuropathies périphériques), médullaire (atteinte des lignées sanguines de la moelle osseuse) ... Par ailleurs, de nombreux médicaments, y compris certains anticancéreux non cytotoxiques ont une toxicité cardiovasculaire. Par l’induction d’effets indésirables graves (hypertension artérielle, cardiomyopathies, insuffisance cardiaque), souvent non réversibles, ces traitements peuvent mettre la vie du patient en danger. Alors que les toxicités limitantes sont bien connues et évaluées systématiquement dans les essais cliniques par exemple pour le calcul de la dose maximale tolérée en phase I, la mise en évidence d’une toxicité cardiovasculaire est trop souvent tardive et le risque n’est en général identifié qu’après la mise sur le marché du médicament.

Ainsi, outre la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, il est nécessaire de développer et d’améliorer les outils permettant de détecter précocement la cardiotoxicité potentielle des nouveaux anticancéreux. Les connaissances quant aux mécanismes moléculaires d’induction de la toxicité au niveau cardiaque sont encore peu abondantes. Pourtant certaines cibles, notamment la production d’espèces réactives de l’oxygène ou l’interférence avec des voies de signalisation essentielles à la survie des cellules cardiaques, sont connues. Toutes ces voies de signalisation mettent en jeu une famille de protéines communes, les phosphoinositide-3-kinases (PI3K). Pour cette raison, ces protéines ont fait l’objet de ce travail de thèse. En effet, ce sont des protéines affectées directement ou indirectement par les médicaments anti-tumoraux, et dont l’activité est cruciale pour le bon fonctionnement des cardiomyocytes, les cellules contractiles du cœur, et qui jouent un rôle prépondérant dans l’induction des altérations morphologiques et fonctionnelles du cœur.

Aujourd’hui, les outils permettant de mesurer l’activité des PI3K in vitro et in vivo sont basés sur des mesures indirectes qui sont la quantification de la production de leurs produits ou l’activation de leurs effecteurs. La problématique de ce travail de thèse a été d’utiliser le



principe du transfert d’énergie bioluminescente par résonance (BRET) pour construire un nouveau type de senseurs permettant de mesurer de façon précise, en temps réel, et dans des cellules vivantes l’activité des PI3K. Le but final était de tenter de produire un outil capable de déceler précocement les potentiels effets cardiotoxiques des molécules candidats médicaments.

L’introduction bibliographique, premier chapitre de ce mémoire, sera consacrée aux médicaments utilisés aujourd’hui pour lutter contre le cancer et à leurs mécanismes d’action, y compris ceux rendant compte de la cardiotoxicité en insistant particulièrement sur les mécanismes impliquant les PI3K. Par la suite, nous décrirons les structures, les mécanismes de régulation et d’action des PI3K ainsi que les moyens techniques disponibles aujourd’hui pour mesurer leur activité in vitro afin de comprendre le besoin de nouveaux outils.

Le deuxième chapitre de ce mémoire sera consacré à l’exposé des résultats expérimentaux obtenus pendant ma thèse. Ce chapitre sera organisé autour de deux axes. Le premier concerne la base de mon projet de thèse c'est-à-dire la fabrication de biosenseurs d’activité des PI3K. Dans cette partie nous aborderons également le principe du BRET et son intérêt dans le développement des biosenseurs pour sonder la signalisation cellulaire. Bien que ce travail n’ait pas débouché sur l’obtention d’outils fonctionnels capables de mesurer l’activité des PI3K, il a en revanche conduit à des résultats originaux que je discuterai dans la conclusion de ce travail. Le deuxième axe s’inscrit dans la continuité de mon travail de M2R dans mon équipe d’accueil à l’I2MC et comporte une revue générale et un article original bientôt publiés. Ces publications scientifiques s’inscrivent dans une thématique majeure de l’équipe qui est de comprendre les mécanismes moléculaires rendant compte de l’efficacité pharmacologique des ligands des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG).

Dans le dernier chapitre de ce manuscrit, je présenterai une brève conclusion générale de mes travaux discutant les implications fondamentales et thérapeutiques qui en découlent.



TABLE DES MATIERES

Remerciements ..............................................................................................................................................................3

Résumé ..............................................................................................................................................................................5

Avant-propos ..................................................................................................................................................................7

Table des Matières ........................................................................................................................................................9

Table des Illustrations .............................................................................................................................................. 12

Table des Tableaux .................................................................................................................................................... 15

Abréviations ................................................................................................................................................................. 16

CHAPITRE 1 INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE ..................................................................................... 17

I. LES MEDICAMENTS ANTI-TUMORAUX ........................................................................................... 19

A. Les trois grandes stratégies thérapeutiques pour lutter contre le cancer ......................... 19

B. Les médicaments anti-tumoraux ........................................................................................................ 20

1. Les chimiothérapies « classiques » ................................................................................................ 21

2. Les nouvelles stratégies chimio-thérapeutiques ..................................................................... 23

a. L’immunothérapie ........................................................................................................................... 23

b. Les inhibiteurs de protéines kinases ........................................................................................ 24

II. LA CARDIOTOXICITE ASSOCIEE AUX MEDICAMENTS ANTI-TUMORAUX ........................ 28

A. Définition et évaluation de la cardiotoxicité .................................................................................. 28

B. Manifestations cliniques et mécanismes moléculaires associés à la cardiotoxicité des médicaments anti-tumoraux......................................................................................................................... 31

1. Augmentation des facteurs de risque cardiovasculaire ........................................................ 31

2. Cardiotoxicité directe ......................................................................................................................... 32

a. Manifestations cliniques ............................................................................................................... 32

b. Mécanismes moléculaires ............................................................................................................. 33

III. LA FAMILLE DES PHOSPHOINOSITIDE-3-KINASES (PI3K) ..................................................... 38

A. Les PI3K de classe I .................................................................................................................................. 38

1. Structure .................................................................................................................................................. 39

2. Mécanismes d’activation ................................................................................................................... 41



3. Mécanismes d’action ........................................................................................................................... 44

a. Activité kinase-dépendante de la sous-unité catalytique ................................................. 44

b. Activité kinase-indépendante de la sous-unité catalytique ............................................. 45

c. Rôles des sous-unités régulatrices ............................................................................................ 46

4. Mécanismes d’inactivation ............................................................................................................... 47

B. Les PI3K de classe II ................................................................................................................................ 49

C. Les PI3K de classe III ............................................................................................................................... 50

D. Mesures expérimentales de l’activité des PI3K de classe I ....................................................... 50

1. Les inhibiteurs pharmacologiques ................................................................................................ 50

2. Mesures expérimentales in vitro .................................................................................................... 51

a. Les essais radioactifs ...................................................................................................................... 51

b. Les essais immuno-réactifs .......................................................................................................... 52

c. Les essais de fluorescence et de luminescence .................................................................... 53

3. Mesures expérimentales in cellulo ................................................................................................. 56

a. Les essais d’immunofluorescence ............................................................................................. 56

b. Les essais de transfert d’énergie par résonance .................................................................. 57

CHAPITRE 2 RESULTATS EXPERIMENTAUX ................................................................................................. 61

TRAVAIL PRINCIPAL: Projet de Thèse ............................................................................................................. 62

ETUDE N°1: Développement de biosenseurs BRET prédictifs de la cardiotoxicité des médicaments anti-tumoraux ................................................................................................................................. 63

I. OBJECTIF DE LA THESE ......................................................................................................................... 65

II. LE TRANSFERT D’ENERGIE PAR RESONANCE ............................................................................. 67

A. Principe du transfert d’énergie par résonance ............................................................................. 67

B. Utilisation du transfert d’énergie par résonance : le FRET et le BRET ................................ 69

1. Le transfert d’énergie fluorescente par résonance (FRET) ................................................. 69

2. Le transfert d’énergie bioluminescente par résonance (BRET)......................................... 72

3. Applications du FRET et du BRET .................................................................................................. 74

III. MATERIELS ET METHODES ................................................................................................................. 76

IV. RESULTATS ................................................................................................................................................. 77



A. Construction des sondes BRET² de PI3K ....................................................................................... 77

B. Validation des constructions BRET ................................................................................................... 80

C. Mesures des interactions entre les sous-unités catalytiques et régulatrices de PI3K par BRET en condition basale....................................................................................................................... 81

D. Mesures des interactions entre les sous-unités catalytiques et régulatrices de la PI3K après stimulation de la kinase ...................................................................................................................... 88

E. Mesures des interactions entre les sous-unités de la PI3K et les sous-unités des protéines G hétérotrimériques. ................................................................................................................ 107

V. CONCLUSION ET DISCUSSION .......................................................................................................... 112

A. Les interactions entre les sous-unités catalytiques et régulatrices des PI3K .............. 112

B. Les interactions PI3K/protéines G hétérotrimériques ......................................................... 115

C. Discussion générale .............................................................................................................................. 116

TRAVAUX ANNEXES: Résultats expérimentaux supplémentaires...................................................... 119

ETUDE N°2: Delineating biased ligand efficacy at 7TM receptors from an experimental perspective ................................................................................................................................................................ 121

Résumé ................................................................................................................................................................... 122

ETUDE N°3: G protein isoforms and stoichiometry dictate biased-ligand texture at GPCRs ... 153

Résumé ................................................................................................................................................................... 154

CHAPITRE 3 CONCLUSION GENERALE ......................................................................................................... 185

Conclusion générale ........................................................................................................................................... 187

Bibliographie............................................................................................................................................................. 189

Abstract ....................................................................................................................................................................... 201



TABLE DES ILLUSTRATIONS

Figure 1: Mécanismes d’action des médicaments anti-tumoraux. .......................................................... 21

Figure 2: Etapes du cycle cellulaire. .................................................................................................................... 21

Figure 3: Voies de signalisation intracellulaires impliquant des protéines à activité kinase....... 25

Figure 4: Schéma décrivant les voies de signalisation PI3K-Akt-mTOR et Ras-Raf-MEK-Erk en aval de récepteurs à activité kinase (RTK). ...................................................................................................... 27

Figure 5: Schéma d’un électrocardiogramme (A) et du potentiel d’action ventriculaire (B). ...... 29

Figure 6: Evénements indésirables cardiaques cumulés rapportés au Système de Rapport d’Evénements Défavorables (AERS) de la Food and Drug Administration américaine. .................. 31

Figure 7: Mécanismes de cardiotoxicité médiée par la doxorubine. ...................................................... 35

Figure 8: Les PI3K contrôlent les processus cardiovasculaires. .............................................................. 37

Figure 9: Les familles de PI3K. .............................................................................................................................. 39

Figure 10: Structures cristallographiques de p110 (A), p110 en interaction avec Ras-G12V

(B) et p110 en complexe avec le domaine iSH2 de p85 (C). ................................................................ 41

Figure 11: Mécanismes d’activation des PI3K. ............................................................................................... 44

Figure 12 : Protéines à domaine PH recrutées au niveau du PI3,4,5P3 et du PI3,4P2. .......................... 45

Figure 13: Régulation de la signalisation associée aux PI3K de classe I. .............................................. 48

Figure 14 : Régulation rétro-contrôlée de la signalisation canonique des PI3K. .............................. 49

Figure 15 : Structures d’inhibiteurs pharmacologiques des PI3K et valeurs d’IC50 qui leur sont connues. ......................................................................................................................................................................... 51

Figure 16 : Essais de quantification des PI3,4,5P3 produits in vitro par les PI3K, basés sur la fluorescence. ................................................................................................................................................................ 54

Figure 17 : Essais de quantification des PI3,4,5P3 produits in vitro par les PI3K, basés sur la luminescence. .............................................................................................................................................................. 55

Figure 18 : Localisation de p110, p101 et YFP-GRP1-PH à l’état basal ou après activation par le

dimère G des protéines G hétérotrimériques ou par le fMLP............................................................... 57

Figure 19 : Principe des senseurs de l’activité d’Akt. ................................................................................... 58

Figure 20 : Conditions nécessaires pour un transfert d’énergie par résonance. ............................... 68

Figure 21 : Schéma illustrant le calcul du ratio RET. .................................................................................... 68

Figure 22 : Structure de la GFP native d’Aequoria victoria et propriétés spectrales de protéines dérivées de la GFP. ..................................................................................................................................................... 70



Figure 23 : Représentation schématique des spectres d’excitation et d’émission de la CFP et de la YFP. ............................................................................................................................................................................. 71

Figure 24 : Structure de la luciférase de Renilla reniformis. ...................................................................... 73

Figure 25 : Propriétés spectrales du BRET1 et du BRET2. .......................................................................... 74

Figure 26 : Principe de quelques biosenseurs FRET et BRET. .................................................................. 75

Figure 27 : Exemples de cartes vectorielles de constructions BRET. .................................................... 79

Figure 28 : Représentation schématique des sous-unités p110 (A), p87 (B) et p101 (C) fusionnées aux protéines Rluc8 et GFP2 et des différentes combinaisons BRET de sous-unités catalytiques et régulatrices possibles (D). ....................................................................................................... 80

Figure 29 : Expression et localisation intracellulaire des constructions BRET des sous-unités

p110, p87 et p101. ................................................................................................................................................... 81

Figure 30 : Schéma explicatif du calcul du Net BRET. .................................................................................. 82

Figure 31 : Mesure du Net BRET basal entre les couples p110-Rluc8/p87-GFP2 et p110-Rluc8/p101-GFP2. ..................................................................................................................................................... 83

Figure 32 : Mesure du BRET basal pour les 8 possibilités de couples de PI3K. ............................... 84

Figure 33 : Schéma explicatif des courbes de saturation BRET. .............................................................. 85

Figure 34 : Courbes de saturation BRET des 8 possibilités de couples R/C de PI3K. ................... 87

Figure 35 : Schéma explicatif du fonctionnement des biosenseurs BRET mesurant directement l’activité des protéines G hétérotrimériques. .................................................................................................. 89

Figure 36 : Activation des hétérotrimères de protéines G, Gi112, Gi212 et Gi312, par le récepteur au fMLP. ................................................................................................................................................ 91

Figure 37 : Schéma explicatif des différentes courbes de saturation BRET pouvant être obtenues après changements de l’affinité relative ou de la conformation des protéines en interaction. .................................................................................................................................................................... 93

Figure 38 : Mesure des interactions R/C de la PI3K par BRET après stimulation du récepteur au fMLP........................................................................................................................................................................... 94

Figure 39 : Mesure des interactions R/C de la PI3K par BRET après stimulation du récepteur au fMLP : conditions de surexpression de la sous-unité fusionnée au donneur d'énergie Rluc8. ........................................................................................................................................................................................... 96

Figure 40 : Mesure des interactions R/C de la PI3K par BRET après stimulation des récepteurs P2Y12 ou S1P1R. .......................................................................................................................................................... 97

Figure 41 : Mesure des signaux BRET entre les biosenseurs R/C de PI3K en présence ou non

du récepteur au fMLP et des protéines G hétérotrimériques Gi112............................................... 99



Figure 42 : Mesure des interactions R/C de la PI3K par BRET après stimulation du récepteur au fMLP : impact des protéines Ras ou RasV12. .......................................................................................... 102

Figure 43 : Impact de la présence de RasV12 sur la localisation intracellulaire des sous-unités

R/C de PI3K fusionnées à la GFP2. ................................................................................................................. 104

Figure 44 : Activation de la protéine Gi112 par le fMLP, mesurée par BRET, en présence des

sous-unités p110 et p87 de la PI3K et de Ras ou RasV12.................................................................... 105

Figure 45 : Mesure des interactions R/C de la PI3K par BRET dans des cellules adhérentes. 107

Figure 46 : Mesure des interactions entre les sous-unités p110 ou p87 des PI3K et les sous-

unités Gi1 ou G2 des protéines G hétérotrimériques par BRET. ..................................................... 109

Figure 47 : Courbes de saturation BRET mesurant les interactions entre les sous-unités de

protéines G hétérotrimériques et les sous-unités de PI3K. .................................................................. 111

Figure 48 : Schéma hypothétique proposé à l’issue de ce travail de thèse sur l’activation des

PI3K. ........................................................................................................................................................................... 118



TABLE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Cardiotoxicité associée aux médicaments anticancéreux. .................................................. 33

Tableau 2 : Propriétés spectrales des différentes protéines dérivées de la GFP d’Aequoria victoria. ........................................................................................................................................................................... 71

Tableau 3 : Propriétés spectrales des différentes protéines dérivées de la DsRed de Discosoma striata. ............................................................................................................................................................................. 72

Tableau 4 : Résumé des conditions utilisées pour les constructions des fusions. ............................ 79

Tableau 5 : Valeurs de BRETmax et BRET50 obtenues pour les 8 combinaisons de biosenseurs

BRET mesurant les interactions R/C des PI3K. ............................................................................................ 88

Tableau 6 : Valeurs de BRETmax et BRET50 obtenues pour 5 combinaisons de biosenseurs BRET

des PI3K et protéines G hétérotrimériques ................................................................................................ 110



ABRÉVIATIONS

Å : Angström ABD : Adaptator Binding Domain Abl : Abelson murine leukemia viral oncogene ADCC : Antibody-dependant cell-mediated cytotoxicity ADP : Adénosine Diphosphate ADN : Acide DéoxyriboNucléaique AlphaScreenTM : Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay AMPc : Adénosine Monophosphate cyclique AMPK : AMP-activated protein kinase ATP : Adénosine triphosphate ARK1 : AR kinase-1 Bcr : Breakpoint cluster region protein BCR (domaine) : Breackpoint cluster region homology domain BiFC : Bi-molecular Fluorescence Complementation BNP : Brain Natriuretic Peptide BRET : Bioluminescent resonance Energy Transfer C2 (domaine) : Protein-kinase-C homology-2 domain CDC : Complement-dependant cytotoxicity CFP : Cyan Fluorescent Protein CIFRE : Conventions Industrielles de Formation par la Recherche dTMP ; deoxythymidine monophosphate dUMP : deoxyuridine monophosphate EGF : Epidermal Growth Factor EGFP ; enhanced GFP EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EPAC : Exchange Protein Directly Activated by cAMP Erk : Extracellular signal-regulated kinase FDA : US Food and Drug Administration FEVG : Fraction d‘Ejection du Ventricule Gauche fMLP : N-formylméthionine-leucyl-phénylalanine fMLPR : N-formylméthionine-leucyl-phénylalanine Recepteur FP : Fluorescent Polarization FRET : Fluorescent Resonance Energy Transfer (ou Förster Resonance Energy Transfer) GAP : GTPase-Activating Protein GDP : Guanosine Diphosphate GEF : Guanine nucleotide Exchange Factor GRP1 : General receptor for phosphoinositides 1-associated scaffold protein GSK3 : Glycogen Synthase kinase 3 GST : Gluthation S-transférase GTP : Guanosine Triphosphate HEK293T ; Human Embryonic Kidney 293T HER2 : Human epidermal growth factor receptor 2

hERG : human Ether-a-go-go Related Gene HTA : Hypertension Artérielle HTRF : Homogeneous Time-Resolved Fluorescence HTS : High Throughput Screening IGFR : Insulin Growth Factor Receptor IRM : Imagerie par resonance magnétique IRS-1 : Insulin Receptor Substrate 1 kDa : kilo Dalton MAPK : Mitogen Activated Protein Kinase mmHg : millimètre de Mercure µM : MicroMolaire mTOR : mammalian Target of Rapamycin nm : nanomètre OMS : Organisation Mondiale de la Santé PCR : Polymerase Chain Reaction PDGFR : Platelet-derived Growth Factor Receptor PDE3B : Phosphodiesterase 3B PDK1 : Phosphoinositide-dependent kinase 1 PH : Pleckstrin Homology domain PI : Phosphatidylinositol PI3P : Phosphatidylinositol-3-phosphate PI4,5P2 : Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate PI3,4P2 : Phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate PI3,4,5P3 : Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate PI3K : phosphoinositide-3-kinase PIK3IP1 : PI3K interacting protein 1 PKA : Protein Kinase A PKB : protéine kinase B PKC : Protein Kinase C PTEN : Phosphatase and TENsin homologue RCPG : Récepteurs Couplés aux Protéines G RET : Resonance Energy Transfer Rluc : Renilla luciferase RTK : Récepteur à activité tyrosine kinase RBD : Ras Binding Domain ROS : Reactive Oxygen Species Ruk : Regulator of ubiquitous kinase RyR2 : Ryanodine Receptor 2 SH2 : SRC homology 2 domain SH3 : SRC homology 3 domain SHIP : SH2-containing inositol phosphate 5-phosphatase SVF : Sérum de Veau Foetal TdP : Torsade de Pointe VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor VEGFR : Vascular Endothelial Growth Factor Receptor Vps : Vacuolar protein sorting YFP : Yellow Fluorescent Protein



CHAPITRE 1

INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE





I. LES MEDICAMENTS ANTI-TUMORAUX

Le cancer est l’une des principales causes de morbidité et de mortalité chez l’Homme dans le monde. La maladie cancéreuse correspond à la multiplication incontrôlée de cellules de l’organisme qui échappent aux mécanismes normaux de régulation de leur différenciation et de leur multiplication. Ces cellules acquièrent des capacités de prolifération incontrôlée et forment une tumeur dite primaire. Puis elles migrent dans l’organisme pour former des tumeurs secondaires ou métastases. Tout l’enjeu des stratégies thérapeutiques réside dans la destruction, au stade de la tumeur primaire, de toutes les cellules constituant la tumeur. Une seule cellule survivante peut être à l’origine de la réapparition du cancer. Malheureusement la majorité des cas de récidives est due à ces cellules survivantes. Trois grandes stratégies thérapeutiques sont utilisées aujourd’hui pour lutter contre le cancer : la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie.

A. Les trois grandes stratégies thérapeutiques pour lutter contre le cancer

La chirurgie est la méthode la plus invasive et la plus limitée en termes de réalisation. En effet, la chirurgie ne peut se faire que lorsque la tumeur est encore de petite taille, dans une zone de l’organisme accessible et non délétère si elle doit être enlevée. Par exemple, dans le cas de certains glioblastomes, on ne peut parfois avoir recours à la chirurgie lorsque la zone impactée est trop importante pour les fonctions cérébrales du patient. Un autre défaut de la chirurgie est l’absence de certitude quant au retrait de toutes les cellules tumorales. Cela oblige le praticien à exciser beaucoup de tissu autour de la tumeur, augmentant les lésions tissulaires. Paradoxalement, en prenant ce genre de précautions lorsque cela est possible, l’élimination de la tumeur est très efficace.

La radiothérapie est le deuxième recours que le cercle médical peut mettre en place pour tenter de guérir un patient. Développée dans les années 1900 grâce à la découverte de deux éléments radioactifs par Marie Curie en 1898, la radiothérapie a constamment été améliorée et s’utilise aujourd’hui dans le traitement du cancer afin d’éliminer les cellules malignes par exposition à des rayons X et à des faisceaux d’électrons. L’avantage de cette technique par rapport à la chirurgie est qu’elle peut être utilisée pour traiter des tumeurs inaccessibles à la chirurgie. Mais, à l’instar de la chirurgie, elle ne peut être utilisée généralement que lorsque les tumeurs sont peu étendues. Malgré les progès effectués, la radiothérapie présente aussi l’inconvénient de toucher les tissus environnant la tumeur générant ainsi des complications tardives qui limitent son utilisation.

Ces deux techniques sont donc le plus souvent limitées aux cancers dont le diagnostic est précoce et l’extension limitée. Malheureusement, dans la plupart des cas, le diagnostic est tardif (la tumeur est toujours localisée mais trop étendue) voire très tardif (le cancer est généralisé). A ce stade du développement de la pathologie, le seul recours reste la chimiothérapie. Littéralement, la chimiothérapie se définit comme l’utilisation d’une ou plusieurs substances chimiques pour traiter une maladie. Apparue également dans les années 1900, elle reste la stratégie thérapeutique la plus utilisée, malgré ses effets indésirables fréquents et souvent graves, du fait de la détection souvent tardive des cancers chez les patients. Elle consiste alors dans l’élimination des cellules malignes grâce à l’utilisation de



substances cytotoxiques, capables d’endommager et de tuer les cellules cancéreuses. L’avantage de la chimiothérapie repose sur la diffusion dans tout l’organisme du médicament, augmentant les chances d’atteindre toutes les cellules cancéreuses. Cet avantage constitue également l’inconvénient principal de cette méthode puisque l’on assiste à une relative absence de spécificité de la molécule active vis-à-vis des cellules saines ou des cellules malades. De ce fait, la chimiothérapie constitue un traitement extrêmement lourd pour le patient car associée à un grand nombre d’effets indésirables pouvant aller, dans certaines circonstances, jusqu’à mettre en danger la vie de l’individu. D’autres médicaments plus récents agissent sans être cytotoxiques, sur la prolifération des vaisseaux tumoraux ou sur les mécanismes de la division ou de la survie des cellules cancéreuses. Quoi qu’il en soit, les médicaments anticancéreux sont utilisés à visée curative, adjuvante ou complémentaire de la radiothérapie et/ou de la chirurgie, ou encore à visée palliative. La recherche de nouveaux médicaments vise à améliorer la spécificité d’action des molécules et à multiplier les mécanismes d’action afin d’identifier des molécules ayant la toxicité la plus faible. Dans les sections suivantes, nous nous concentrerons sur ces médicaments anti-tumoraux en insistant sur les nouvelles stratégies thérapeutiques.

B. Les médicaments anti-tumoraux

En 1909, le professeur Paul Ehrlich, médecin allemand, découvre et met au point un médicament contre la syphilis, commercialisé sous le nom de Salvarsan, présentant une très grande efficacité malgré beaucoup d’effets indésirables. Ce composé arsenical sera très utilisé pendant une dizaine d’années et est par beaucoup considéré comme le premier agent chimio-thérapeutique moderne. Il fera considérer Paul Ehrlich comme le père de la chimiothérapie dite classique [1]. La découverte qu’une molécule administrée systémiquement peut induire une régression tumorale s’est faite dans les années 1940 avec le tristement célèbre gaz moutarde développé par l’industrie militaire. Deux pharmacologistes, Alfred Gilman et Louis Goodman, après analyse des conclusions des médecins militaires rapportant que les soldats exposés au gaz moutarde présentaient une régression du système lymphatique et du nombre de globules sanguins, traitèrent des patients atteints d’un lymphome Hodgkinien, alors mortel à 100 %, avec des dérivés du gaz moutarde, dont la caryolysine. Ils observèrent une rémission temporaire de la maladie [2]. La preuve était faite. Le mécanisme moléculaire découvert plus tard montra la formation de liaisons covalentes de l’ADN par une alkylation des bases puriques. Une deuxième constatation importante fut également établie, les cellules tumorales sont plus sensibles aux toxines que les cellules saines.

Depuis ces premières observations, les agents chimio-thérapeutiques se sont diversifiés en termes de mécanismes d’action et de spécificité (Figure 1). La mitose est l’événement cellulaire ciblé par les premiers médicaments antinéoplasiques. Leur action se situe au niveau de l’ADN ou du fuseau mitotique. Plus récemment, un deuxième type de molécules, les anticorps monoclonaux, prend son essor. Cette stratégie thérapeutique cible soit des antigènes tumoraux soit les processus permettant le développement de la tumeur (angiogénèse, croissance tumorale) et met en jeu les effecteurs du système immunitaire. Enfin, ces dernières années, grâce aux avancées effectuées dans la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le développement des différents cancers, de nouvelles cibles thérapeutiques intéressantes ont émergé : les protéines kinases.



Figure 1: Mécanismes d’action des médicaments anti-tumoraux. Les cibles cellulaires des chimiothérapies sont l’ADN, le cytosquelette de microtubules ou la signalisation intracellulaire.

1. Les chimiothérapies « classiques »

La mitose est la division de la cellule mère ayant dupliquée son matériel génétique pour donner deux cellules filles identiques. Le cycle cellulaire se décompose en différentes phases. La phase G1 qui est la première phase de croissance cellulaire, la phase S durant laquelle le génome de la cellule est répliqué, une deuxième phase G2 de croissance et enfin la phase de mitose proprement dite appelée phase M. Les phases G1, S et G2 constituent l’interphase. Les étapes ciblées par la majorité des médicaments anti-tumoraux se situent au stade de la phase S, lorsqu’ils présentent une interaction directe avec la molécule d’ADN, et au stade de la phase M, lorsqu’ils ciblent le fuseau mitotique (Figure 2).

Figure 2: Etapes du cycle cellulaire. Les cellules qui ne se divisent pas sont dans un état de quiescence en phase G0. L’entrée dans le cycle cellulaire commence par la phase G1 de croissance et de préparation de la réplication, suivie de la phase S de réplication de l’ADN puis de la phase G2 de croissance et de préparation à la mitose. Le cycle se termine par la phase M de division cellulaire (mitose). Les deux cellules filles peuvent ensuite entrer en phase de quiescence G0.

Mécanismes d’action des médicaments anti-tumoraux

Inhibiteurs de topoisomérases

Topologie ADN Composition ADN

Structure ADN

Agents alkylants

Anti-métabolites

Microtubules

Alcaloïdes

Taxanes

Signalisation

Anticorps monoclonauxInhibiteurs d’activité kinase

G1G2

S

M

Croissance, préparation de la réplication

Réplication de l’ADN

Croissance, préparation de la

mitose

Division cellulaire

G0Quiescence

Cycle cellulaire



La phase S constitue la phase de réplication de l’ADN. Pour commencer, les deux brins d’ADN de chaque chromosome sont séparés au niveau de fourches de réplication pour que les ADN polymérases puissent copier leur code génétique, créant ainsi deux chromatides sœurs. C’est à ce niveau qu’intervient un premier type de médicaments anti-tumoraux appelé « agent alkylant ». Les agents alkylants présentent un groupement alkyle et se fixent de manière covalente à l’ADN, bloquant les possibilités de dépliement et de réplication du matériel génétique. La cellule bloquée dans cet état de phase S, sans capacité de poursuivre son cycle cellulaire, active les processus apoptotiques entrainant sa mort. Les alkylants représentent une famille chimique assez vaste (cyclophosphamide, busulfan, carmustine…) utilisée depuis plusieurs décennies et entrent toujours aujourd’hui dans la composition de nombreux protocoles de chimiothérapie. Des molécules apparentées aux alkylants, présentant le même mécanisme d’action que ceux-ci mais ne portant pas de groupement alkyle dans leur formule chimique, sont également utilisés. Nous retrouvons principalement dans cette famille les dérivés du platine (cisplatine, oxaliplatine et carboplatine).

Les ADN polymérases dupliquent le matériel génétique en ajoutant les nucléotides adéquats les uns à la suite des autres. Les médicaments dits « anti-métabolites » interviennent ici. Ils peuvent agir selon deux mécanismes : soit ils inhibent les enzymes nécessaires à la synthèse des acides nucléiques, soit ils s’incorporent dans l’ADN à leur place. Un exemple du premier groupe est le 5-Fluorouracile, anti-pyrimidine inhibiteur de la thymidylate synthase. Cette enzyme est responsable de la production de deoxythymidine monophosphate (dTMP) à partir de deoxyuridine monophosphate (dUMP). Or le dTMP est la base thymine utilisée pour répliquer l’ADN. Dans le second groupe se trouve la gemcitabine, un analogue de la deoxycytidine constituant la cytosine ou encore la mercaptopurine, analogue de la purine, structure de base de l’adénine et de la guanine. Leur incorporation dans le chromosome nouvellement répliqué empêchera la transcription des gènes dans lesquels ces molécules seront localisées.

La réplication de l’ADN est fortement dépendante de la topologie plus ou moins enroulée de l’ADN. Celle-ci est contrôlée par des enzymes appelées topoisomérases, de type I ou II, capables de générer des clivages transitoires dans l’ADN et de les refermer. Leur rôle est fondamental pour contrôler la réplication de l’ADN, la transcription des gènes, la séparation des chromosomes lors de la mitose… De même que l’incorporation d’un substitut de base azotée ou la création d’une liaison entre les deux brins d’ADN, la perturbation de la topologie de l’ADN affecte donc non seulement la division de la cellule mais également tous les processus internes dépendants de la transcription de nouveaux gènes. Les anthracyclines, telles que la doxorubicine ou l’épirubicine, sont des antinéoplasiques isolés à partir de micro-organismes. Ils s’intercalent dans les brins d’ADN et forment un complexe ADN-anthracycline-topoisomérase qui altère la labilité de la structure ADN. Ils appartiennent de ce fait à la classe des médicaments anti-tumoraux « inhibiteurs de topoisomérases ».

Les médicaments anti-tumoraux que nous venons de décrire agissent au niveau de la phase S. D’autres médicaments agissent au niveau de la phase M. C’est au cours de cette phase que les deux copies de chaque chromosome s’alignent sur le plan équatorial de la cellule pour ensuite être menées chacune à un pôle de la cellule afin d’être intégrées dans le futur noyau des cellules filles. L’alignement puis la tractation des chromatides sœurs se fait via l’utilisation des filaments de microtubules constituant le fuseau mitotique. Les médicaments anti-tumoraux dont la cible est le fuseau mitotique sont des alcaloïdes dérivés de végétaux. Les vinca-



alcaloïdes, comme la vincristine issue de la Pervenche de Madagascar, séquestrent les dimères de tubuline constituant les microtubules et inhibent ainsi l’élongation du fuseau mitotique. A l’inverse, les taxanes, tels que le paclitaxel ou son dérivé synthétique le docétaxel, lient les extrémités du fuseau de microtubules et empêchent ainsi leur déstructuration. Toutes les étapes de la mitose sont impactées par ces molécules puisque les microtubules sont des structures dynamiques, en constant réarrangement.

2. Les nouvelles stratégies chimio-thérapeutiques

a. L’immunothérapie

En 1909, le docteur Paul Ehrlich fut également le premier à émettre l’idée que les cancers pouvaient être un phénomène plus ou moins ordinaire chez les organismes à longue durée de vie. Il surenchérit en proposant qu’il puisse exister un lien entre le contrôle de ces cancers et le système immunitaire [3]. 60 ans plus tard, le professeur Lloyd J. Old démontra pour la première fois l’existence d’antigènes tumoraux [4]. A la suite de ce travail pionnier, des centaines d’antigènes associés aux tumeurs ont été identifiés :

- Des antigènes spécifiquement exprimés par les cellules tumorales. Ils peuvent correspondre à des antigènes mutés (KRas, p53...) ou à des néoantigènes générés par exemple à la suite d’une translocation chromosomique comme c’est le cas dans la leucémie myéloïde chronique (Bcr-Abl).

- Des antigènes exprimés par les cellules saines et surexprimés par la tumeur. Par exemple, HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) est un récepteur à activité tyrosine kinase, impliqué dans la transmission des signaux anti-apoptotiques et pro-prolifératifs, surexprimé dans 15 à 30 % des cancers du sein [5]. Ce type d’antigène expose à un risque d’auto-immunité.

- Des antigènes dérivés d’agents pathogènes. Chez l’homme, 15 à 20 % des cancers seraient associés à des agents pathogènes [6], notamment des virus (papillomavirus et cancer du col de l’utérus, virus de l’hépatite B ou C et cancer du foie…), des bactéries (Helicobacter pylori et cancer de l’estomac) ou des parasites (schistosome et cancer de la vessie).

Tous ces antigènes peuvent être reconnus par des anticorps produits par les lymphocytes B, ou par des lymphocytes T. L’activation du système immunitaire via ces protéines nouvelles ou surexprimées déclenche des processus pro-inflammatoires et la sécrétion de cytokines pour créer un microenvironnement permettant la mise en place d’une réponse adaptative anti-tumorale. Il a été émis une théorie de l’immuno-surveillance qui propose que tout au long de la vie, des cellules tumorales sont éliminées par le système immunitaire. Le contrôle des cellules tumorales par le système immunitaire se présenterait en trois phases : Elimination : les cellules tumorales sont détruites par le système immunitaire ; Equilibre : les cellules tumorales sont gardées sous contrôle mais ne sont pas détruites ; Echappement : les cellules tumorales échappent au contrôle du système immunitaire [3].

Depuis le début du XXIème siècle, des anticorps monoclonaux dirigés contre certains antigènes tumoraux ont démontré leur efficacité clinique et sont prescrits dans un nombre croissant de cancers. Notamment le rituximab dirigé contre le récepteur CD20 et utilisé dans



les lymphomes [7], le trastuzumab ciblant le récepteur HER2 de la famille des récepteurs à l’EGF (Epidermal Growth Factor) surexprimé dans certains cancers du sein [8], le cetuximab dirigé contre l’isoforme 1 de cette même famille (EGFR) également surexprimé dans le cancer colorectal métastatique [9] ou encore le bevacizumab, dirigé contre le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) impliqué dans l’angiogénèse [10]. Les antigènes tumoraux ciblés pouvant être également présents sur les cellules saines, la réponse anti-tumorale peut s’accompagner d’une réponse auto-immune qui reste en général bénigne (vitiligo, thyroïdite). Le potentiel anti-tumoral de ces anticorps passe par une action directe sur les cellules malignes entrainant leur lyse par le système immunitaire et/ou via l’inhibition de molécules pro-angiogéniques par blocage de la signalisation cellulaire associée. On développe également des anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes tumoraux pour vectoriser des médicaments cytotoxiques au plus près de la tumeur améliorant ainsi leur efficacité tout en limitant les doses et donc les effets indésirables.

Lorsque l’anticorps se fixe sur sa cible tumorale, il peut entrainer sa destruction par activation de la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC).

L’anticorps est reconnu par des récepteurs, appelés FcR, activateurs des macrophages ou des cellules Natural-killer (NK) ce qui engendre l’excrétion de perforines et granzymes afin de détruire la cellule cible par perforation de sa membrane plasmique. De la même façon, la liaison de l’anticorps sur l’antigène tumoral peut activer la cytotoxicité dépendante du complément (CDC). Le complément est un mécanisme de défense anti-infectieux, complémentaire du système immunitaire classique, qui permet l’élimination des cellules cibles via la reconnaissance de complexes immuns antigènes/anticorps. C’est un groupe d’une trentaine de protéines, solubles dans le plasma ou membranaires sur certaines cellules, fonctionnant en cascade. La voie classique activée par les anticorps thérapeutiques consiste en la reconnaissance d’un complexe immun par le premier élément, C1q, déclenchant une cascade d’activation de protéines qui aboutit à la formation d’un complexe d’attaque membranaire capable de lyser la membrane plasmique de la cellule tumorale.

b. Les inhibiteurs de protéines kinases

La dernière stratégie thérapeutique développée pour détruire les cellules tumorales repose sur la compréhension des mécanismes moléculaires intracellulaires impliqués dans le développement de la pathologie (Figure 1). Il est connu que les altérations initiatrices du cancer sont d’ordre génétique. Elles ont pour origine une ou plusieurs mutations provoquant la modification quantitative et/ou qualitative des gènes appartenant aux groupes des oncogènes, régulateurs positifs de la prolifération cellulaire, des suppresseurs de tumeurs ou des réparateurs de l’ADN.

Parmi les protéines codées par ce type de gènes, beaucoup sont des protéines à activité kinase. Ces protéines kinases peuvent être des récepteurs de surface ou des protéines intracellulaires et possèdent une activité catalytique de type kinase qui leur confère la capacité de modifier l’activité d’autres protéines par phosphorylation. Cette phosphorylation d’une protéine ou d’un récepteur résulte en la modification de son activité enzymatique, de sa localisation cellulaire et/ou de son interaction avec d’autres protéines. Les récepteurs et protéines de type kinase régulent la grande majorité des voies de signalisation dans les cellules eucaryotes, et contrôlent de ce fait beaucoup de processus physiologiques tels que le métabolisme, la transcription et la traduction des protéines, la progression dans le cycle



cellulaire, les réarrangements du cytosquelette, l’apoptose, la prolifération, la différenciation… (Figure 3). Ainsi il n’est pas étonnant de constater qu’approximativement 518 kinases sont codées par le génome humain [11] et que l’activité de nombreuses protéines kinases est dérégulée dans un grand nombre de pathologies (immunologiques, neurologiques, métaboliques…) dont les cancers, ce qui a généré un intérêt considérable dans le développement de molécules inhibitrices pour le traitement de ces pathologies [12].

Figure 3: Voies de signalisation intracellulaires impliquant des protéines à activité kinase. Exemple de quelques voies de signalisation médiées par des récepteurs à activité tyrosine kinase, faisant intervenir des protéines à activité kinase et impliquées dans différentes fonctions cellulaires (D’après [13]).

De façon générale, les « inhibiteurs d’activité kinase » sont rassemblés en quatre groupes selon leur mécanisme d’action [14]. Les inhibiteurs de type I sont des inhibiteurs compétitifs de l’ATP (Adénosine triphosphate) qui reconnaissent la forme active de l’enzyme et déplacent l’ATP de son site de liaison au sein de l’enzyme. Ces inhibiteurs de type I sont les plus nombreux car ils ont généralement été découverts via l’utilisation des tests classiques d’activité enzymatique dans lesquels les kinases sont introduites sous leur forme active, et ont été synthétisés pour mimer la molécule d’ATP. Les inhibiteurs de type II sont dirigés contre la forme inactive de l’enzyme et prennent la place de l’ATP sur son site de liaison avant que celui-ci ne se soit fixé. Les inhibiteurs de type III sont des inhibiteurs allostériques de l’enzyme qui se lient dans une région extérieure à celle du site de liaison à l’ATP. Ce mécanisme leur confère une plus grande spécificité car ils font intervenir des régions spécifiques à chaque kinase.

Prolifération Angiogénèse Adhésion

Différenciation

Prolifération Survie

Migration

Ligands = signal extérieur

Récepteurs= initiateurs

Adaptateurs et voies de signalisation= médiateurs intracellulaires

Facteurs de transcription= effecteurs

Résultats



Enfin, il existe un quatrième type d’inhibiteurs dits covalents qui lient de façon irréversible le site d’activité kinase de la protéine.

L’initiation des voies de signalisation contrôlant l’homéostasie cellulaire, que l’on retrouve dérégulée dans les cancers, commence par l’activation de récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK). Ces récepteurs font partie de la famille des récepteurs de facteurs de croissance, parmi lesquels nous pouvons citer les EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), PDGFR (Platelet-derived Growth Factor Receptor), IGFR (Insulin Growth Factor Receptor) ou VEGFR (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor). Ils constituent des cibles thérapeutiques majeures puisque leur inhibition bloque toutes les conséquences cellulaires associées à leur sur-activation pathologique. Aujourd’hui, beaucoup de molécules inhibitrices de ces récepteurs sont commercialisées pour le traitement de différents cancers. L’EGFR et le récepteur HER2 sont les cibles d’une molécule appelée lapatinib utilisée dans le traitement du cancer du sein [15]. Le sorafenib, un inhibiteur de plusieurs kinases telles que des membres des familles PDGFR et VEGFR, est utilisé dans le traitement des carcinomes hépatiques rénaux et thyroïdiens [16]. Le ramucirumab est un inhibiteur d’activité tyrosine kinase ciblant le VEGFR actuellement en cours de développement clinique comme stratégie thérapeutique de cancers colorectaux [17].

De façon intéressante, tous ces récepteurs de type RTK initient des voies de signalisation mettant en jeu des protéines à activité kinase. Parmi les plus connues se trouvent les phosphoinositide-3-kinases (PI3K), au carrefour des voies de signalisation Akt-mTOR (mammalian Target of Rapamycin), et Ras-Raf-MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase), fondamentales dans la régulation du cycle cellulaire (Figure 4). Ces protéines, activées par toutes les familles de RTK, sont centrales dans le contrôle de tous les processus physiologiques cellulaires. Comme dans le cas des RTK, ces protéines sont fréquemment hyperactives dans les cellules cancéreuses et constituent des cibles pharmacologiques d’intérêt. En effet, elles sont codées par des gènes suppresseurs de tumeurs ou des oncogènes dont les mutations peuvent favoriser le développement d’un processus tumoral. Les gènes codant pour les PI3K présentent des mutations activatrices dans une majorité des cancers chez l’homme [18-21]. Les protéines Akt, mTOR, Ras et Raf présentent également des altérations importantes. Plus de 50 % des adénocarcinomes pancréatiques portent une mutation de K-Ras entrainant une activité constitutive et plus de 50 % des cancers affectant le système nerveux sont liés à une mutation activatrice du gène BRAF codant pour la protéine Raf [22].



Figure 4: Schéma décrivant les voies de signalisation PI3K-Akt-mTOR et Ras-Raf-MEK-Erk en aval de récepteurs à activité kinase (RTK). La plupart des RTK partagent des effecteurs intracellulaires communs dont les plus connus sont PI3K-Akt-mTOR et Ras-Raf-MEK-Erk. Ces voies de signalisation, très inter- et intra-connectées, sont impliquées dans la régulation de la balance survie/mort des cellules et rétro-contrôlent l’expression et l’activité des récepteurs (D’après [23]).

Beaucoup de molécules ciblant la voie PI3K-Akt-mTOR sont actuellement en cours de tests dans des essais cliniques pour le traitement de différents types de cancers [24, 25]. Parmi ces molécules se trouvent des inhibiteurs des PI3K, des inhibiteurs doubles de PI3K et mTOR, des inhibiteurs allostériques de l’activité catalytique d’Akt, des inhibiteurs de mTOR ou encore des inhibiteurs de Ras, Raf ou des MAPK, dont MEK (Mitogen-Activated Protein Kinase kinase) et Erk (Extracellular signal-regulated kinase). Malheureusement très peu sont aujourd’hui commercialisées du fait de leur pauvre spécificité. En effet, la majorité d’entre elles ciblent la poche de liaison de l’ATP qui est une région commune à toutes les protéines kinases et extrêmement conservée au cours de l’évolution. La Food and Drug Administration (FDA) a approuvé en 2014 la mise sur le marché d’un inhibiteur réversible ATP-compétitif de PI3K, l’idelalisib, à utiliser en combinaison avec le rituximab dans le traitement des leucémies lymphoïdes chroniques [26]. Nous pouvons citer également en exemple deux inhibiteurs de mTOR, l’everolimus et le temsirolimus, des analogues de la rapamycine, également utilisés dans le traitement de cancers du rein [27, 28]. La protéine Raf est ciblée par le vemurafenib dans les mélanomes exprimant le gène BRAF muté en position V600E [29]. Les voies PI3K/Akt/mTOR et Ras/Raf/MAPK présentent plusieurs boucles de rétroaction. Ainsi, l’inhibition d’une protéine peut ne pas inhiber la voie de signalisation associée puisque maintenue par les autres protéines. L’existence de ces mécanismes d’échappement induit la nécessité soit de cibler plusieurs de ces protéines pour obtenir une meilleure efficacité clinique soit de cibler les protéines initiatrices de ces voies de signalisation telles que les PI3K.

Expression et activité RTKSurvie / Mort



Le traitement d’une pathologie telle que le cancer représente un challenge pour la communauté scientifique. Connaitre les évènements conduisant à l’apparition d’une tumeur ainsi que les mécanismes de défense mis en place par les cellules tumorales pour échapper au système immunitaire et aux traitements constitue un enjeu thérapeutique majeur.

Aujourd’hui trois approches à but curatif existent, la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie. La chirurgie et la radiothérapie ne peuvent être appliquées qu’à des cancers localisés et restreints. Lorsque le cancer est généralisé, seule la chimiothérapie est envisageable. Malgré des approches variées et recherchées, les chimiothérapies présentent toujours un problème majeur : quel que soit leur mode d’action, toutes les molécules chimio-thérapeutiques causent une toxicité cellulaire et tissulaire plus ou moins importante. Elles entraînent l’apparition d’effets indésirables importants pouvant aller jusqu’à la mise en danger de la vie du patient. En cause, le manque de spécificité des évènements moléculaires ou des protéines ciblés par les molécules antinéoplasiques. Les chimiothérapies classiques ciblent des processus de prolifération qui existent également dans les cellules saines. C’est le cas par exemple des cellules sanguines, du tractus gastro-intestinal, du système immunitaire, des gonades, du système pileux… Les nouvelles stratégies de chimiothérapies ciblent quant à elles des protéines de surface ou intracellulaires également présentes au sein des cellules saines et nécessaires pour leur fonctionnement physiologique. Par conséquent, la toxicité induite par les médicaments anti-tumoraux peut toucher tous les organes d’un individu. La toxicité atteignant le système cardiovasculaire représente une affection fréquente et sérieuse, responsable aujourd’hui d’une grande partie des interruptions de développement des médicaments [30].

De ce fait, et parce que l’entreprise Cardiomedex pour qui j’ai également réalisé ce travail de thèse dans le cadre d’un contrat CIFRE possède une grande expertise scientifique dans les maladies cardiovasculaires et cherche à développer un axe d’onco-cardiologie préclinique, nous nous sommes particulièrement intéressés à la cardiotoxicité associée aux médicaments anti-tumoraux.

II. LA CARDIOTOXICITE ASSOCIEE AUX MEDICAMENTS ANTI-TUMORAUX

A. Définition et évaluation de la cardiotoxicité

Par définition, la cardiotoxicité d’une molécule est sa capacité à induire des dysfonctions électro-physiologiques cardiaques et/ou des dommages au muscle cardiaque. Les médicaments anticancéreux de première génération sont connus depuis longtemps pour leurs effets indésirables sur le système cardiovasculaire chez l’homme et chez l’animal [31, 32]. Les atteintes cardiaques liées aux nouvelles chimiothérapies semblent peu fréquentes par rapport aux chimiothérapies classiques. Cependant leur risque est sans doute encore sous-estimé du fait du peu de recul concernant leur utilisation. La cardiotoxicité constitue une cause majeure de retrait des médicaments anti-tumoraux du marché [30]. Ceci s’explique par l’absence de moyen permettant d’évaluer précocement et de façon fiable la cardiotoxicité éventuelle d’une molécule avant son utilisation sur un grand nombre d’individus. Il est donc absolument nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les phénomènes de



cardiotoxicité afin d’éviter la mise en danger des patients et l’investissement des entreprises dans le développement de molécules qui ne pourront jamais être utilisées pour leur potentiel thérapeutique.

L’évaluation précoce de la toxicité cardiaque n’est pas aisée. Au stade préclinique, durant les phases d’études in vitro, le potentiel cardiotoxique des molécules est évalué sur des modèles de cellules cardiaques tels que les cardiomyocytes néonataux de rat H9C2, les cellules HL-1 dérivées de la lignée de cellules cardiaques atriales tumorales murines AT-1 ou des cardiomyocytes canins ou murins isolés [33-35]. Sur ces cellules, deux mécanismes moléculaires principaux sont évalués afin de prédire le potentiel cardiotoxique des molécules : les flux de courants ioniques, notamment les courants issus des canaux potassiques de type hERG (human Ether-a-go-go Related Gene) et des canaux potassiques à rectification retardée IKr, et la durée du potentiel d’action membranaire. Les flux ioniques, notamment de potassium, sont importants pour les évènements de dépolarisation et de repolarisation des cellules cardiaques nécessaires pour la contraction des cellules et du muscle cardiaque (Figure 5). Une altération des canaux hERG, régulateurs des canaux IKr, induit un retard dans la repolarisation des membranes cellulaires, à l’origine d’altérations physiologiques associées cliniquement à un allongement de l’intervalle QT que nous décrirons un peu plus loin [36, 37]. L’étude du fonctionnement des canaux hERG a pu être adaptée pour le criblage de molécules [37]. Cependant du fait de l’implication de multiples mécanismes intracellulaires, que nous décrirons également plus loin, dans les phénomènes de cardiotoxicité induits par les molécules anticancéreuses le sondage de leur activité sur ces canaux n’est pas suffisante pour prédire assurément le potentiel cardiotoxique des molécules.

Figure 5: Schéma d’un électrocardiogramme (A) et du potentiel d’action ventriculaire (B). L’onde P correspond à la dépolarisation des oreillettes. L’onde QRS correspond à la dépolarisation des ventricules. L’intervalle QT reflète la durée du potentiel d’action ventriculaire comprenant la dépolarisation et la repolarisation ventriculaire (D’après [38]).

Durée du potentiel d’action

a

b

A

B



Au stade des études précliniques in vivo, les altérations discrètes du muscle et du rythme cardiaque ou de la pression artérielle nécessitent l’exposition d’un nombre suffisamment important d’animaux au médicament. L’évaluation de la cardiotoxicité des molécules chez les rongeurs ou le chien se fait via l’enregistrement de paramètres physiques (hypertrophie du muscle cardiaque, dilatation des cavités cardiaques…) et fonctionnels (mesure du rythme cardiaque et de la fraction d‘éjection du ventricule gauche…), par la mesure de la pression artérielle et/ou par le dosage de marqueurs sanguins tels que les troponines cardiaques ou les peptides natriurétiques. Après prélèvement du cœur des animaux, la cardiotoxicité est évaluée via des observations histologiques du tissu cardiaque (taille et nombre des cardiomyocytes, apparition de fibrose...) [39, 40].

Au stade des essais cliniques, l’évaluation des risques d’effets indésirables et/ou d’une cardiotoxicité inclut la mesure de marqueurs sanguins (troponines cardiaques ou peptides natriurétiques de type B (BNP)), ainsi que l’imagerie non invasive (échocardiographie 2D, 3D, scintigraphie ou IRM...). Les techniques d’imagerie non invasive ne présentent pas toutes le même degré de précision et de sensibilité de détection des lésions cardiaques débutantes, qui sont les critères les plus importants. Leur reproductibilité et leur rapport coût-efficacité influent également sur le choix de leur utilisation. L’augmentation de la concentration sanguine en troponine I, que l’on ne peut déceler que pendant ou à la fin d’une cure de chimiothérapie, est connue comme étant un facteur prédictif de la survenue d’un évènement cardiaque dans les trois années suivantes [41]. Les évènements plus précoces que l’on peut dépister comprennent les allongements de l’intervalle QT et les évènements de Torsade de Pointe (TdP). L’intervalle QT est la durée entre la dépolarisation des ventricules qui correspond à leur contraction et leur repolarisation qui correspond à leur relaxation (Figure 5). L’allongement de l’intervalle QT est lié à un risque accru de TdP pouvant dégénérer en fibrillation ventriculaire et entrainer un arrêt cardiaque fatal. L’apparition d’une TdP compte pour 1/3 des retraits de médicaments du marché entre 1990 et 2006 [30].

Les techniques d’imagerie permettent également de mesurer la fraction d‘éjection du ventricule gauche (FEVG). Cette FEVG reflète la santé du muscle cardiaque car évalue la capacité contractile du ventricule gauche qui est la partie la plus importante du cœur pour son rôle de pompe. Chez l’adulte, la FEVG est de l’ordre de 60 %. Une diminution de la FEVG reflète l’apparition d’une insuffisance cardiaque systolique, bien qu’il existe des insuffisances cardiaques diastoliques où la FEVG est conservée. Les autres signes cliniques, tels que l’hypertrophie ventriculaire, l’hypertension artérielle ou les atteintes coronaires, sont également moins aisément observables durant les phases précliniques du développement des molécules. En conséquence, le risque de survenue de ces effets cardiovasculaires n’est souvent détecté qu’après l’utilisation du médicament dans une large cohorte de patients (Figure 6). De plus, l’association de plusieurs anticancéreux (anthracyclines et taxanes ou anthracyclines et trastuzumab notamment) peut majorer les risques de cardiotoxicité. Enfin, de nombreux individus, non inclus lors des tests cliniques des molécules, sont atteints, en même temps, de cancers et d’une ou plusieurs pathologies cardiaques. Cette population est à haut risque de développement d’une cardiotoxicité imputable aux traitements auxquels elle sera soumise.



Figure 6: Evénements indésirables cardiaques cumulés rapportés au Système de Rapport d’Evénements Défavorables (AERS) de la Food and Drug Administration américaine. Cumul des évènements indésirables cardiaques rapportés entre les années 1969 et 2000 (D’après [42]).

B. Manifestations cliniques et mécanismes moléculaires associés à la cardiotoxicité des médicaments anti-tumoraux

Il existe 3 types de toxicités définies en fonction du délai d’apparition après l’administration de la molécule :

- Une toxicité aigüe qui apparait pendant ou peu de temps après l’administration du traitement.

- Une toxicité subaigüe qui apparait quelques semaines après l’administration du médicament.

- Une toxicité chronique qui se manifeste généralement dans l’année suivant la fin du traitement mais peut apparaitre également plusieurs années après.

Les toxicités induites par les chimiothérapies peuvent être dose-dépendantes et/ou dose-cumulatives. Elles sont dose-dépendantes lorsque les symptômes apparaissent suite à l’administration d’une dose supérieure à un certain seuil et dose-cumulatives lorsque l’administration régulière de doses peu élevées de la molécule induit une toxicité due à l’accumulation du médicament dans l’organisme. Dans le cas de la doxorubicine par exemple, l’apparition de cardiopathies est observée au delà d’une dose cumulée de 550 mg/m², 400 mg/m² chez les patients âgés de plus de 65 ans [43]. Dans certains cas, notamment si les patients n’ont pas de prédisposition à des dysfonctions cardiaques au moment du traitement, ces toxicités peuvent être réversibles [44].

Il est important de distinguer les effets indésirables toxiques augmentant les facteurs de risque cardiovasculaire, tels que l’induction d’une hypertension artérielle, et les effets indésirables affectant directement le muscle cardiaque.

1. Augmentation des facteurs de risque cardiovasculaire

L’hypertension artérielle (HTA) se définit par une pression artérielle trop élevée de façon soutenue. On considère communément qu’il y a hypertension lorsque la pression

Effets indésirables cardiaques rapportés après approbation

Nombre de cas rapportés à l’AERS

Arythmies cardiaques

Dysfonctions des artères coronaires

Symptômes de dysfonction cardiaque

Insuffisance cardiaque

Dysfonctions des valves cardiaques

Dysfonctions péricardiques

Dysfonctions myocardiques

Dysfonctions endocardiques

0 50000 100000 150000



artérielle systolique est supérieure à 140 mmHg et la pression artérielle diastolique supérieure à 90 mmHg. L’HTA est un facteur de risque bien établi de morbidité et de mortalité cardiovasculaire. C’est une conséquence connue de certaines thérapies anti-tumorales de type anti-angiogénique dirigées contre le système VEGF/VEGFR [45]. Il s’agit dans ce cas d’une toxicité spécifiquement liée à l’inhibition de la signalisation VEGF au sein des cellules endothéliales. En effet, des études ont montré que le VEGF avait des effets hypotenseurs par production d’oxyde nitrique, via l’activation de l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) [46, 47]. La diminution d’oxyde nitrique endothélial par inhibition de la signalisation dépendante du VEGF favoriserait la vasoconstriction, l’augmentation des résistances vasculaires périphériques et de ce fait l’augmentation de la pression sanguine [48]. Ceci est confirmé par des études cliniques qui ont montré que les inhibiteurs de VEGF/VEGFR induisaient la perte des biomarqueurs urinaires d’oxyde nitrique chez l’homme [49]. Par conséquent, il n’est pas étonnant de constater que lors d’un traitement au bevacizumab, un anticorps monoclonal anti-VEGF, une HTA survient dans 4 % à 35 % des cas [50]. 17 % à 43 % des patients traités avec le sorafenib, un inhibiteur d’activité tyrosine kinase non sélectif, développent une HTA. Jusqu’à 38 % de ces HTA sont de grades 3 ou 4, sévères. L’apparition d’une HTA de grade 3 induit obligatoirement l’administration au patient de traitements antihypertenseurs et peut conduire à l’arrêt du traitement anti-angiogénique.

2. Cardiotoxicité directe

a. Manifestations cliniques

Quel que soit leur mécanisme d’action, les chimiothérapies sont responsables d’une cardiotoxicité qui se manifeste cliniquement par des troubles du rythme cardiaque et/ou des cardiomyopathies pouvant dégénérer en insuffisance cardiaque [50] (Tableau 1).

On appelle troubles du rythme, ou arythmies, des altérations de la fréquence cardiaque. Ces altérations peuvent diminuer le rythme cardiaque (bradycardie), l’augmenter (tachycardie) ou le rendre irrégulier. Lorsque ces arythmies sont induites par un médicament anticancéreux elles sont généralement liées à un allongement de l’intervalle QT pouvant dégénérer en Torsade de Pointe dont les conséquences peuvent être fatales. Ces troubles du rythme peuvent être également associés à des cardiomyopathies apparaissant plus tardivement lors d’un traitement avec une molécule anti-tumorale. Ces cardiomyopathies sont des dysfonctions du ventricule gauche, ischémies myocardiques, infarctus du myocarde ou hypertrophies cardiaques (Tableau 1). Ces pathologies peuvent, à plus ou moins long terme, entrainer l’apparition d’une insuffisance cardiaque irréversible où le cœur n’est plus à même d’assurer un débit cardiaque suffisant pour couvrir les besoins en oxygène de l’organisme.

L’incidence des troubles cardiaques peut être majorée lors de la combinaison de plusieurs médicaments. Nous pouvons citer par exemple le trastuzumab, un anticorps monoclonal utilisé dans le traitement du cancer du sein pour lequel 1 à 7 % des patientes l’ayant reçu en monothérapie, 2 à 13 % des patientes traitées par une association de paclitaxel-trastuzumab et plus de 27 % des patientes traitées par une association anthracycline-cyclophosphamide-trastuzumab développent une cardiomyopathie aboutissant parfois à une insuffisance cardiaque [50]. De même, le paclitaxel potentialise la cardiotoxicité des anthracyclines [51].



Tableau 1 : Cardiotoxicité associée aux médicaments anticancéreux. Liste non exhaustive de médicaments anticancéreux et de leur cardiotoxicité associée (D’après [50]).

Au niveau cellulaire, la cardiotoxicité induite par les molécules antinéoplasiques est divisée en deux groupes. L’un est appelé « on-target toxicity », que nous traduirons par toxicité spécifique, lorsque la protéine cible du médicament est directement impliquée dans le bon fonctionnement des cellules. L’autre est appelé « off-target toxicity », que nous traduirons par toxicité non-spécifique, lorsque la molécule, en plus d’inhiber sa protéine cible, inhibe une ou plusieurs autres protéines importantes pour le bon fonctionnement cardiaque.

b. Mécanismes moléculaires

Au niveau cellulaire, les mécanismes moléculaires de survenue des cardiomyopathies ne sont pas encore totalement élucidés. Les plus connus sont ceux liés aux anthracyclines et aux agents alkylants pour lesquels les premières altérations sont des altérations du métabolisme énergétique, avec une diminution de la production et/ou une augmentation de la consommation d’ATP. Les mitochondries jouent un rôle crucial au sein des cellules en fournissant la majorité de l’énergie cellulaire sous forme d’ATP via des échanges d’électrons et des phosphorylations oxydatives. Le muscle cardiaque est très dépendant du métabolisme aérobie et de ce fait très sensible aux molécules perturbant le métabolisme et l’homéostasie mitochondriale. Les cardiomyocytes sont en effet les cellules les plus riches en mitochondries qui assurent la production énergétique nécessaire à la contraction continue de ces cellules. Il

Classe thérapeutique Médicament Effet indésirable cardiaque

Anthracycline

Doxorubicine Insuffisance cardiaque, troubles du rythme

Epirubicine Dysfonction du ventricule gauche

Idarubicine Dysfonction du ventricule gauche

Agents alkylants

Cisplatine Hypertension, ischémie cardiaque

Cyclophosphamide Insuffisance cardiaque, dysfonction du ventricule gauche

Ifosfamide Insuffisance cardiaque, arythmies

Anti-métabolite 5-Fluorouracile Ischémie cardiaque, arythmies

Poisons du tubulePaclitaxel

Arythmies (bradycardies), hypotension, insuffisancecardiaque

Vinca-alcaloïdes ischémie cardiaque

Anticorps monoclonaux

Cetuximab Hypotension

Rituximab Hypotension, arythmies

Bevacizumab Hypertension

Trastuzumab Insuffisance cardiaque, dysfonction du ventricule gauche

Inhibiteurs d’activité kinase

Sunitinib Hypotension, insuffisance cardiaque

SorafénibHypotension, ischémie cardiaque



est établi que certaines anthracyclines, notamment la doxorubicine (Figure 7), et certains agents alkylants interfèrent avec la chaine respiratoire des mitochondries des cardiomyocytes et provoquent une augmentation du taux de radicaux libres oxygénés (ROS), tels que l’anion superoxyde O2- ou le peroxyde d’hydrogène H2O2. Ces radicaux altèrent les membranes plasmiques des cardiomyocytes et donnent naissance à des hydropéroxydes lipidiques également très toxiques pour la cellule. Une étude réalisée par Ichikawa et collègues en 2014 a montré que la doxorubicine s’accumule au sein des mitochondries des cardiomyocytes et augmente de ce fait la teneur intracellulaire en fer, Fe(II) et Fe(III), et en ROS O2- [52]. En 2011, Nagi et collaborateurs ont observé chez le rat que la cardiotoxicité induite par le cyclophosphamide, un agent alkylant, passerait principalement par la diminution de glutathion, glutathion peroxydase et glutathion catalase [53]. Ces protéines sont les éléments majeurs du processus de détoxification de la cellule en métaux lourds (mercure, plomb...) et en oxydants de type peroxydes. Certaines molécules inhibitrices d’activité kinase, telles que le sunitinib ou le nilotinib, semblent également pouvoir altérer le fonctionnement des mitochondries au sein des cellules cardiaques augmentant la production de ROS, et initiant l’apoptose par activation des voies de signalisation associées aux caspases [54].

Récemment, un nouveau mécanisme de cardiotoxicité des anthracyclines a été évoqué (Figure 7). Il existe deux isoformes de topoisomérases II chez les mammifères, la

topoisomérase II et II. Les anthracyclines sont décrites pour interagir avec la topoisomérase

II, exprimée dans les cellules à fort taux de réplication. L’isoforme II ne serait pas exprimée dans ces cellules mais serait présente dans les cellules cardiaques. Il semblerait que les

anthracyclines en interagissant avec l’isoforme II au sein des cellules cardiaques diminueraient l’expression de la calcium ATPase du réticulum sarcoplasmique conduisant ainsi à une diminution de la contractilité des cardiomyocytes [55].



Figure 7: Mécanismes de cardiotoxicité médiée par la doxorubine. La doxorubicine induit des dommages au sein des mitochondries et la péroxydation des lipides membranaires via la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Elle altère la captation du calcium au niveau du réticulum sarcoplasmique et compromet la transcription des gènes par interférence avec les topoisomérases II (D’après [56]).

L’altération de voies de signalisation stratégiques pour la physiologie des cellules cardiaques est un autre mécanisme de cardiotoxicité, bien qu’encore peu élucidé. Ces altérations induisent des dysfonctionnements cellulaires qui, à terme, convergent vers l’apparition de cardiomyopathies. Il a été montré, dans des cardiomyocytes néonataux de rat, que le sunitinib interfère avec le fonctionnement de la protéine kinase AMPK (AMP-activated protein kinase), protéine régulatrice du métabolisme énergétique, diminuant la quantité protéique de sa cible, l’acetyl-coenzyme A carboxylase, impliquée dans la synthèse des acides gras [57]. Bien que cela ne soit pas encore prouvé, les inhibiteurs ciblant les récepteurs à activité tyrosine kinase de type EGFR ou PDGFR pourraient impacter le cœur du fait de leur implication dans le développement et le fonctionnement cardiaque [58, 59]. Etant donné que l’évaluation in vitro du potentiel cardiotoxique d’une molécule passe notamment par l’analyse de son interaction avec les canaux potassiques de type hERG, il n’est pas étonnant que plusieurs études établissent un lien entre certaines molécules et l’altération de ces canaux. Il a ainsi été montré in vitro que l’imatinib et le lapatinib interfèrent avec ce canal [60, 61].

Peroxydation des lipides Apoptose

Déplétion en énergie

Peroxydation des lipides

Peroxydation des lipides

Dommages ADN

mitochondries

Altération captation Ca2+

Déficit en protéines

musculaires

Déplétion en énergieDysfonction

adrénergique

Membrane

plasmique

Transcription

Traduction

Sarcomère (Appareil

contractile)

Récepteur-adrénergique

Réticulum sarcoplasmique Noyau

ADN

Mitochondrie

doxorubicin doxorubicin

doxorubicin-semiquinone

doxorubicin-Fe2+doxorubicin-Fe2+



Un autre type de protéines centrales pour le fonctionnement des cellules cardiaques semble concerné par les mécanismes de cardiotoxicité des médicaments anticancéreux. Nous avons précédemment expliqué que les PI3K constituent des protéines kinases ubiquitaires importantes pour le fonctionnement physiologique des cellules et sont impliquées notamment dans la régulation de la balance survie/apoptose. De façon intéressante, deux études récentes ont montré sur des cultures primaires de cardiomyocytes néonataux de rats que la neureguline-1, un facteur de croissance cardiaque, et l’astragaloside IV, un composé issu des plantes de type astragale, protègent les cardiomyocytes de l’apoptose induite par la doxorubicine via l’activation de la voie PI3K-Akt [62, 63]. En accord avec ces résultats, il a été montré que les ROS, que nous avons présentés comme largement produits par certains types de médicaments anti-tumoraux, pouvaient inhiber la voie PI3K/Akt et induire l’autophagie et l’apoptose de cellules de glioblastome [64].

Au niveau cardiaque, les PI3K régulent positivement la contractilité via l’activation des canaux calciques voltage-dépendants de type L contrôlant le couplage excitation-contraction des cardiomyocytes [65] et le maintien de la structure des cardiomyocytes (formation des tubules-T et localisation de la protéine d’architecture junctophiline 2, alignement des canaux calciques de type L de la membrane plasmique et RyR2 du réticulum sarcoplasmique, et expression génique de certains composants des stries Z) [66-68]. Elles régulent également négativement la contractilité cardiaque via l’arrêt de la signalisation AMPc (Adénosine monophosphate cyclique) [69, 70] (Figure 8). Dans les études de cardiotoxicité, les PI3K ont effectivement été impliquées dans la survenue de troubles du rythme. Lu et collègues ont montré in vitro sur des myocytes canins que l’inhibition des PI3K via des inhibiteurs d’activité kinase induit une augmentation de la durée du potentiel d’action liée à des altérations des courants ioniques cardiaques, notamment les courants potassiques à rectification retardée IKr, les courants calciques de type L ICa,L, ou les courants sodiques persistants et transitoires INa et INaP [35].

Au niveau cardiaque l’hyper-activation des PI3K résulte en l’apparition d’une hypertrophie tandis que leur inhibition induit une hypotrophie [70-73] (Figure 8). En accord avec ces études, il a été montré que l’induction d’une hypertrophie suite à un traitement de cardiomyocytes embryonnaires H9C2 par la doxorubicine implique l’activation des PI3K [74].

Ainsi, les PI3K se situent au carrefour des différentes voies de signalisation activées ou inhibées par les médicaments anti-tumoraux lors de l’induction de cardiotoxicité. La mesure de leur activité dans les cellules cardiaques pourrait constituer un bon reflet du potentiel cardiotoxique des molécules anticancéreuses du fait de leur situation en amont de tous les mécanismes cardiotoxiques.



Figure 8: Les PI3K contrôlent les processus cardiovasculaires.

Les PI3K sont impliquées dans la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et l’infiltration des

leucocytes lors d’une insuffisance cardiaque. Les PI3K et PI3K régulent la contractilité, l’hypertrophie et la survie des cardiomyocytes en réponse à différents stimuli médiés par des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) ou des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) (D’après [75]).

Nous venons de voir que la plupart des médicaments anti-tumoraux, quel que soit leur mécanisme d’action, sont responsables d’une toxicité cardiovasculaire. Cette cardiotoxicité peut prendre la forme d’altérations du rythme cardiaque, de dysfonctions ventriculaires ou d’hypertrophies pathologiques pouvant aboutir à une insuffisance cardiaque. L’induction de ces troubles débute à l’échelle des cardiomyocytes par l’altération de processus vitaux pour leur fonctionnement. Les chimiothérapies de première génération semblent avoir la capacité d’interférer avec la chaine respiratoire et le cycle d’oxydoréduction des mitochondries convergeant à l’accumulation de ROS au sein des cellules et induisant des dommages membranaires à l’initiation de voies de signalisation pro-apoptotiques et/ou pro-nécrotiques.

Contractilité

RCPG

CroissanceSurvieHypertrophie physiologique

Trafic endosomal

Autophagie

Migration / ROS

RCPG

noyau



Les nouvelles stratégies thérapeutiques induisent également des toxicités liées à leurs cibles pharmacologiques qui sont des récepteurs ou protéines de signalisations intracellulaires impliquées dans le contrôle de processus physiologiques importants pour la survie des cellules.

Compte tenu de leur rôle cellulaire névralgique, les PI3K sont particulièrement concernées. Les PI3K sont une famille de protéines dont il existe plusieurs isoformes fonctionnant en hétérodimères, dont les rôles patho-physiologiques précis sont très mal connus probablement du fait qu’il n’existe pas, à l’heure actuelle, d’outil pharmacologique assez puissant et sensible pour étudier spécifiquement chaque isoforme et chaque dimère de PI3K.

III. LA FAMILLE DES PHOSPHOINOSITIDE-3-KINASES (PI3K)

Les PI3K ont été découvertes dans les années 1980 par Lewis Cantley et ses collègues [76, 77]. Ce sont des protéines de type lipide-kinase constituant une famille d’enzymes très conservées au cours de l’évolution, essentielles pour le fonctionnement des cellules eucaryotes. Ces enzymes assurent la transformation des phosphatidylinositoles en phosphoinositides. Les PI3K sont divisées en trois classes en fonction de leur spécificité de substrats in vitro, de leur structure et de leur mode de régulation [78] (Figure 9).

A. Les PI3K de classe I

Les PI3K de classe I, retrouvées chez tous les mammifères, fonctionnent en hétérodimères formés entre une sous-unité régulatrice et une sous-unité catalytique portant l’activité lipide-kinase. Cette classe est divisée en deux sous-groupes en fonction du type de sous-unité régulatrice à laquelle s’associent les isoformes catalytiques. La classe IA (Figure 9)

regroupe les sous-unités catalytiques p110, p110 et p110 qui s’associent aux isoformes

régulatrices de type p85 (p85, p85, p55, p50 et p55). La classe IB ne contient qu’une

isoforme catalytique, la p110, qui se lie aux sous-unités régulatrices p101 et p87 (aussi

appelée p84). Tandis que les sous-unités p110 et p110 sont exprimées de façon ubiquitaire,

les isoformes p110 et p110 sont majoritairement exprimées dans les cellules immunitaires

[79]. De plus, les sous-unités p110 et p110 sont également enrichies au niveau cardiaque [79]. Les isoformes de sous-unités régulatrices de la classe IA sont ubiquitairement exprimées alors que celles de la classe IB sont majoritairement exprimées dans les leucocytes, les cellules immunitaires et au niveau cardiaque [79].



Figure 9: Les familles de PI3K. Les PI3K sont regroupées en fonction de leur spécificité de substrat in vitro, de leur structure et de leur mode de régulation. Chaque classe compte une ou plusieurs isoformes de sous-unités catalytiques et une ou plusieurs isoformes de sous-unités régulatrices (D’après [80]).

1. Structure

Les sous-unités catalytiques des classes IA et IB, de 110 à 120 kDa, présentent une

structure de base identique (Figure 9). Pourtant, l’homologie de séquence entre la p110 et la

p110 chez l’homme n’est que de 35 %. De l’extrémité N-terminale vers le côté C-terminal les sous-unités catalytiques sont constituées d’un domaine de liaison à la petite GTPase Ras (RBD) suivi d’un domaine C2 (protein-kinase-C homology-2), qui pourrait être impliqué dans l’interaction entre la PI3K et les phospholipides de la membrane [81], d’un domaine hélicoïdal et d’un domaine catalytique. En amont du domaine RBD, a été identifié un domaine ABD (Adaptator Binding Domain) de liaison à la sous-unité régulatrice. Aucune modification post-traductionnelle de ces protéines n’a été décrite.

Les sous-unités régulatrices des PI3K de classe I font entre 55 et 100 kDa. L’isoforme

régulatrice la plus étudiée et la mieux décrite est la p85. A partir de l’extrémité N-terminale, elle est constituée successivement, d’un domaine SH3 (SRC homology 3 domain), d’un domaine BCR (Breackpoint cluster region homology domain), entouré de deux régions riches en proline, qui pourrait porter une activité GAP (GTPase-Activating Protein) activatrice des GTPases [82], puis de trois domaines SH2 (SRC homology 2 domain). Les domaines nSH2 et cSH2 entourent le domaine iSH2 et constituent tous trois des domaines de liaison à la sous-unité catalytique (Figure 9). La structure des sous-unités régulatrices p101 et p87 est beaucoup moins connue. En effet, aucun domaine particulier n’a pu être identifié par correspondance avec d’autres protéines. Néanmoins, en 2005, grâce à la génération de plusieurs mutants de l’isoforme de



sous-unité régulatrice p101, Voigt et collaborateurs ont caractérisé un domaine d’interaction

avec la sous-unité catalytique p110 du côté N-terminal, constitué au minimum des acides

aminés 25 à 175, et en C-terminal un domaine de liaison aux sous-unités G des protéines G

hétérotrimériques, nécessaire pour l’activation de la p110, situé entre les acides aminés 650 et 850 [83]. Bien qu’ils n’aient pas encore été clairement définis, l’isoforme p87 semble posséder des domaines fonctionnels similaires puisque c’est le haut degré de conservation dans les régions correspondant à ces domaines fonctionnels de p101 qui a permis la découverte de cette protéine, p87 [84, 85].

La structure cristallographique des sous-unités de PI3K entières n’est pas encore

élucidée. Celle du domaine catalytique de la sous-unité p110 (résidus 144-1102) a été résolue en 1999 [86] (Figure 10 A). Il consiste en un petit lobe N-terminal (résidus 726-883) et un plus gros en C-terminal (résidus 884-1092) entre lesquels se trouve le domaine d’interaction avec l’ATP. Cette région compte parmi les plus conservées dans la famille des PI3K. L’année suivante, Pacold et collaborateurs ont publié la structure cristallographique de la zone

d’interaction entre la p110 et la protéine Ras sous sa forme active liée au GTP [87] (Figure 10

B). Cette interaction se fait via un changement de conformation du domaine RBD de p110 qui forme une boucle non visible en absence de Ras et qui interagit avec le domaine Switch II de cette dernière. Cette interaction avec le domaine Switch II est unique et n’est retrouvée chez aucun autre effecteur de Ras. La liaison de Ras à la PI3K induit d’autres changements conformationnels significatifs principalement dans le domaine C2 et le lobe C-terminal du domaine catalytique.

La première structure cristallographique de la p110 en présence du domaine iSH2 de

p85 a montré que ce domaine se logeait dans un creux formé par les domaines ABD et C2 [88] (Figure 10 C). Ce contact iSH2-ABD est responsable de la grande spécificité d’interaction entre les deux sous-unités tandis que le contact iSH2-C2 fait partie de la fonction d’inhibition de la

p85. La structure cristallographique de p110 en présence des domaines iSH2 et nSH2 de

p85a montre que ce dernier interagit avec trois régions de p110, le domaine hélicoïdal, le

domaine C2 et le domaine catalytique [89]. Comme dans le cas de la p110, le domaine catalytique présente une structure en deux lobes.



Figure 10: Structures cristallographiques de p110 (A), p110 en interaction avec Ras-G12V (B)

et p110 en complexe avec le domaine iSH2 de p85 (C).

A) Diagramme en ruban de p110 montrant 4 domaines : RBD (bleu), C2 (bleu clair), hélicoïdal (vert) et catalytique N-lobe (rouge, orange) et C-lobe (bleu foncé) (figure d’après PBD 1E8X). B) Diagramme en ruban du

complexe Ras-PI3K montrant Ras (rouge) et 4 domaines de p110 : RBD (bleu), C2 (bleu clair), hélicoïdal (vert) et catalytique N-lobe (bleu foncé) et C-lobe (jaune) (figure d’après PBD 1HE8). C) Deux vues alternatives d’un

diagramme en ruban du complexe p110-iSH2 p85 montrant le domaine iSH2 de p85 (rouge) et 5 domaines de

p110 : ABD (vert), RBD (bleu foncé), C2 (bleu clair), hélicoïdal (jaune) et catalytique (rose) (D’après [88]).

2. Mécanismes d’activation

La formation des hétérodimères de PI3K a lieu dans le cytosol. Cette interaction est constitutive et permet à la sous-unité régulatrice d’inhiber la sous-unité catalytique, via des contacts inhibiteurs établis entre ses domaines SH2 et la sous-unité catalytique [90, 91]. Plusieurs études, dont une utilisant une technique d’échange hydrogène/deutérium associée à la spectrométrie de masse, ont montré que l’interaction inhibitrice se faisait par les domaines

nSH2 et C2/iSH2 pour toutes les isoformes de PI3K de classe IA et que seules les p110 et

p110 étaient inhibées également via une interaction avec le domaine cSH2 de la p85 [90, 91]. Dans le cas des PI3K de classe IB, un domaine fonctionnel d’interaction entre la sous-unité

catalytique p110 et la sous-unité régulatrice p101 a été décrit mais de façon encore peu précise [83]. Ce domaine semble exister également chez p87 mais n’a été identifié que par

p110 - niSH2 p85C

RBD

RBD

kinase

kinaseC2

C2

Helical

Helical

ABD

ABDiSH2

iSH2

p110 – Ras-GTPB

C2

Helical

KinaseN-lobe

KinaseC-lobe

RBD

Ras

p110A

C2

RBD

Helical

Kinase

C-lobe

KinaseN-lobe



l’alignement des séquences de p101 et p87 [84]. L’activation des PI3K est essentiellement décrite au niveau de la membrane plasmique, posant la question de son mode de recrutement et d’activation à la membrane plasmique.

Le mécanisme canonique d’activation des PI3K de classe I au niveau de la membrane est le suivant (Figure 11 A) : les PI3K de la classe IA sont activées via des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK). L’activation des RTK par leurs ligands au niveau de la membrane plasmique se traduit par une homo- ou une hétérodimérisation des récepteurs qui permet l’autophosphorylation des tyrosines présentes dans leurs parties intracellulaires. La sous-unité régulatrice p85 vient alors interagir avec ces tyrosines phosphorylées via ses domaines nSH2, ce qui permet le recrutement à la membrane de la PI3K et induirait ainsi la levée d’inhibition de la sous-unité catalytique qui exercera son activité kinase via une modification

conformationnelle du dimère [91]. La PI3K de classe IB fonctionne de la même façon que les PI3K de classe IA mais son activation est médiée par des récepteurs de type Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG). Les protéines G hétérotrimériques, premiers effecteurs

directs communs à toutes les familles de RCPG, sont des hétérotrimères de sous-unités , et

(G) constitutivement associées à l’état basal. Leur activation, suite à l’activation du

récepteur, résulte en la dissociation de la sous-unité et du dimère qui vont activer leurs

effecteurs secondaires respectifs. Ce dimère G peut ainsi interagir avec les sous-unités régulatrices et catalytiques de la PI3K [92, 93] permettant leur activation [94]. Les mécanismes

moléculaires induits par le recrutement à la membrane du dimère de PI3K et qui

permettraient le déclenchement de l’activité catalytique de p110 ne sont pas encore connus.

La composition du dimère , notamment l’isoforme de G, semble importante pour l’activité

de la p110 [95].

De façon intéressante, depuis un peu plus d’une dizaine d’années, certaines études semblent indiquer que cette description du mécanisme d’action de la PI3K est quelque peu trop simplifiée. En effet, les PI3K de classe IA pourraient également être régulées par des RCPG.

Dès 1997, Kurosu et collaborateurs ont montré que la p110 de la classe IA pouvait également

être activée in vitro par le dimère de la protéine G associée aux RCPG [96], ce qui a été

confirmé par la suite [97, 98]. C’est également le cas pour la p110 pour laquelle la sous-unité

Gserait prépondérante dans l’activation de cette isoforme. En effet, il semblerait que la

protéine Gq, apparemment grâce à une interaction directe avec le dimère p110/p85 [99],

soit impliquée dans la régulation de l’activité de la p110. Cependant son rôle dans l’activation ou l’inhibition de cette PI3K est plus controversé [100, 101].

Les PI3K constituent une famille de protéines dont les rôles physiologiques et l’implication dans différentes pathologies sont très étudiés et représentent des cibles pharmacologiques majeures. Pourtant, paradoxalement, nous ne possédons que très peu d’informations concernant les mécanismes moléculaires régulant leur activité. Le recrutement des dimères de PI3K du cytosol vers la membrane plasmique sous-entend l’intervention de partenaires (vésicules intracellulaires, cytosquelette d’actine ou de microtubule...) inconnus à ce jour. Une fois à la membrane et en interaction avec les tyrosines phosphorylées des RTK et probablement également avec les phospholipides de la membrane via le domaine C2 de la sous-unité catalytique, il a été proposé que la stimulation de l’activité catalytique du dimère

p110p85 implique des modifications de conformation [91]. Nous ne savons pas à l’heure



actuelle si l’activation des PI3K via les RCPG ou celle des autres isoformes de PI3K de classe IA met en jeu des mécanismes similaires.

Il est connu que l’activation des PI3K peut nécessiter l’implication d’une protéine de la famille des petites GTPases Ras [102, 103]. L’activation des PI3K par Ras est un mécanisme qui peut être indépendant de l’activation des RTK ou des RCPG en amont [87, 104] et qui met en jeu une interaction directe, montrée in vitro, entre la forme de Ras active et la sous-unité catalytique des PI3K, en accord avec la présence d’un domaine RBD dans leur structure [87, 104]. Un des rôles de Ras dans l’activité des PI3K semble passer par une amélioration du recrutement de certains dimères de PI3K à la membrane qui permettrait le déclenchement de l’activité de la PI3K via des mécanismes inconnus à ce jour. Il a été montré in vitro et in cellulo

que le dimère p110/p101 ne nécessite pas la présence de Ras pour être localisé à la

membrane [103, 105] alors que le couple p110/p87 requiert la liaison de la petite GTPase

Ras-GTP à la sous-unité p110 pour augmenter l’efficacité de recrutement de ce couple à la membrane, efficacité de recrutement corrélée à une augmentation de l’activité catalytique de la

p110 [105]. Ainsi, ces travaux suggèrent un rôle spécifique de Ras en fonction de la

composition des dimères de PI3K mais également en fonction de l’isoforme de la sous-unité catalytique [106, 107]. La participation de Ras dans l’activité des PI3K parait cependant spécifique de certaines voies de signalisation de la PI3K [108, 109]. En effet, concernant les PI3K de classe IA, il a été montré par exemple que dans des neurones larvaires de Drosophile leur capacité à inhiber l’excitabilité des neurones se faisait de façon Ras-dépendante tandis que leur implication dans la croissance du neurone était Ras-indépendante [108].

Jusqu’à encore récemment, l’activation et la signalisation associée aux PI3K étaient décrites comme ayant lieu en tout point de la membrane plasmique. Or, nous nous apercevons que la signalisation associée aux PI3K est extrêmement compartimentée au sein des membranes cellulaires [110-112]. Les protéines Ras [113, 114], les RTK [115, 116], les RCPG et leurs effecteurs associés [117, 118] sont également compartimentés au sein de micro-domaines membranaires de type raft lipidique. Ainsi, l’activation des PI3K semble être en réalité un processus extrêmement contrôlé dans le temps et l’espace ce qui pourrait conduire à l’induction de voies de signalisations spécifiques en fonction de la localisation des complexes récepteurs/Ras/PI3K activés par un stimulus.



Figure 11: Mécanismes d’activation des PI3K. A) Les PI3K de classe I peuvent être activées par des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK), des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) et des petites GTPases monomériques de la famille RAS. B) Les mécanismes d’activation des PI3K de classe II sont mal connus mais pourraient concerner différents stimuli impliquant des RTK, des GPCR, des phospholipides et du calcium. C) Les PI3K de classe III, dont les mécanismes d’activation sont peu connus, s’intègrent dans différents complexes multi-protéiques impliqués dans les processus spécifiques d’autophagie et de phagocytose (D’après [80]).

3. Mécanismes d’action

a. Activité kinase-dépendante de la sous-unité catalytique

Une fois localisées à la membrane, les PI3K de classe I génèrent du phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PI3,4,5P3), à partir de phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI4,5P2) en ajoutant un groupement phosphate issu de l’ATP en position 3 du noyau inositol de ce lipide. La production de PI3,4,5P3 se produit au niveau de zones très spécifiques de la membrane plasmique [119], des membranes endosomales suite à l’endocytose du récepteur [120] et parfois même au niveau de la membrane nucléaire [121]. Ce PI3,4,5P3 permet le recrutement à la membrane de protéines intracellulaires possédant un domaine PH (Pleckstrin Homology Domain) (Figure 12). Ces protéines peuvent être des sérine/thréonine ou tyrosine kinases telles que PDK1 (Phosphoinositide-dependent kinase 1) ou Akt (aussi nommée Protéine kinase B), des protéines adaptatrices comme GRP1 (General receptor for phosphoinositides 1-associated scaffold protein) ou des protéines régulatrices de type GAP (GTPase-activating protein) ou GEF (Guanine nucleotide exchange factor) des petites GTPases, comme Vav2, GEF des protéines de la famille Rho/Rac. Parmi les protéines kinases activées en aval des PI3K de classe I, la sérine/thréonine kinase Akt a été l’une des premières identifiées et reste la principale associée à l’activation de la PI3K (voie de signalisation PI3K/Akt) [122]. De ce fait et parce qu’elle n’est activée que par les PI3K de classe I, le recrutement et l’activation par phosphorylation d’Akt sont considérés comme un reflet de l’activation des PI3K et sont

• Croissance• Migration• Cil primaire

• Métabolisme du glucose• Survie• Angiogénèse

Acides aminésGlucoseAutres nutriments?

• Autophagie• Phagocytose• Endocytose

• Traduction• Croissance• Métabolisme du glucose• Réarrangements du cytosquelette• Survie

A

B C



souvent utilisés pour évaluer indirectement leur activité. La grande diversité de protéines activées directement ou via Akt par les PI3K intervient dans des processus cellulaires extrêmement variés, allant de la survie cellulaire à la synthèse protéique et au contrôle du cycle cellulaire/prolifération cellulaire, en passant par la réorganisation du cytosquelette et la régulation du métabolisme [122, 123].

Figure 12 : Protéines à domaine PH recrutées au niveau du PI3,4,5P3 et du PI3,4P2. Les protéines à domaine PH, recrutées au niveau du PI3,4,5P3 produit par les PI3K et du PI3,4P2 issu de leur dégradation par des 5-phosphatases, régulent la plupart des processus cellulaires (D’après [124]).

b. Activité kinase-indépendante de la sous-unité catalytique

En plus de leur activité catalytique, les PI3K possèdent une activité kinase-indépendante

encore peu connue. Dans le cas de p110, l’expression homozygote de l’enzyme délétée de son activité catalytique est létale [125]. Cela suggère un rôle très mineur, si elle existe, de l’activité

kinase-indépendante de p110. Concernant la p110, alors que des souris déficientes pour cette isoforme au complet présentent un défaut de contractilité cardiaque [70], Patrucco et collègues ont observé que des animaux transgéniques exprimant au niveau cardiaque une

forme de p110 dont l’activité catalytique est inactivée ont une activité cardiaque contractile normale et que la réponse adaptative de ces souris à une constriction aortique transverse est

semblable à celle des animaux sauvages [69]. Ainsi, la régulation de la contractilité par p110 passe par un mécanisme indépendant de son activité catalytique. Ce mécanisme ferait intervenir, au niveau cellulaire, la régulation spatiotemporelle de la signalisation liée à l’AMPc via la formation d’un complexe multi-protéiques incluant sa sous-unité régulatrice p87, la protéine PDE3B (phosphodiesterase 3B) et la protéine PKA (protein kinase A) [69, 84, 126]

Migration Phagocytose TraficProlifération Survie

RéorganisationActine

CroissanceTrafic



(Figure 8). L’interaction directe de PKA avec p110 permet son rapprochement de PDE3B, en interaction avec p87, qu’elle pourra activer par phosphorylation induisant ainsi la dégradation

de l’AMPc par PDE3B. L’implication d’un rôle indépendant de l’activité kinase de p110 a également été suggérée dans les processus d’angiogénèse [127] et d’agrégation plaquettaire

[128] grâce à l’utilisation des souris déficientes pour l’activité catalytique de p110, cependant les mécanismes moléculaires ne sont pas encore décrits. Une interaction directe entre le

domaine hélicoïdal de p110 et la protéine ARK1 (AR kinase-1), régulant l’internalisation des

récepteurs -adrénergiques, a également été montrée [129].

L’activité kinase-indépendante de p110 a été montrée par deux équipes en parallèle la

même année, grâce à la génération d’animaux transgéniques exprimant une protéine p110

mutée dans son site catalytique [130, 131]. Alors que la délétion complète de p110 est létale,

les souris porteuses d’une mutation du site catalytique de p110 survivent mais grandissent plus lentement [130]. Cette observation a été reliée à un défaut de prolifération des

fibroblastes embryonnaires murins délétés pour p110 mais pas de ceux exprimant la p110

sans activité catalytique [130, 131]. De plus, l’activité kinase-indépendante de p110 semble impliquée dans l’internalisation des RTK activés, probablement via son interaction avec la protéine Rab5, petite GTPase de la famille Ras impliquée dans la formation des vésicules recouvertes de clathrines [130, 131]. De façon intéressante, il semble que l’activité catalytique

de p110 ne soit pas nécessaire pour l’activation d’Akt via les récepteurs de type RTK (IGF1R, EGFR ou PDGFR) mais qu’elle le soit pour l’activation d’Akt via les RCPG [130-132].

Si la génération d’animaux transgéniques nous permet de commencer à élucider les implications physiologiques spécifiques de chacune des isoformes catalytiques de PI3K, beaucoup de chemin reste à faire pour mieux comprendre la régulation et le rôle précis de chacune dans les différents types cellulaires. Il en est de même concernant l’implication des différentes isoformes de sous-unités régulatrices associées aux sous-unités catalytiques.

c. Rôles des sous-unités régulatrices

Les isoformes de sous-unités régulatrices des PI3K de classe IA les plus étudiées sont

p85, p et p50 [133]. Alors que la délétion de ces isoformes ne semble pas avoir de conséquences pendant le développement embryonnaire, les souriceaux nouveau-nés ne survivent pas longtemps. Ils présentent notamment des nécroses tissulaires, des dysfonctions de l’homéostasie glucidique et des dysfonctions immunitaires [133]. Au niveau cellulaire, il est connu que les sous-unités régulatrices inhibent, à l’état basal, l’activité de la sous-unité

catalytique [90, 91]. L’isoforme p85 a également été montrée comme capable d’activer la protéine PTEN par interaction directe, régulant ainsi l’activité de la sous-unité catalytique une

fois activée [134]. Il semblerait que p85 ait aussi un rôle, indépendamment de la sous-unité

catalytique, dans le contrôle de l’expression des gènes [135, 136]. Les isoformes p55 et p50 ont, elles, été montrées comme inhibitrices des processus d’autophagie et d’apoptose [137, 138]. Ces travaux étudient le rôle des isoformes de sous-unités régulatrices seules. Elles ont pourtant très certainement un rôle important au sein des dimères de PI3K en fonction de leur

association à p110, p110 ou p110, probablement dans la sélection/localisation des voies de signalisation activées en aval de ces dimères. Ce rôle n’a pas été décrit à l’heure actuelle.



Le rôle des sous-unités régulatrices de la PI3K de classe IB, p87 et p101, au sein des

dimères formés avec p110 a été surtout étudié dans le fonctionnement du système immunitaire. En effet, si les animaux n’exprimant pas l’isoforme p101 ou l’isoforme p87 sont viables, fertiles et grandissent normalement [109, 139], les neutrophiles délétés pour p101 présentent un défaut de migration mais sont capables de produire des ROS tandis que les neutrophiles délétés pour p87 sont mobiles mais ne sont pas capables de produire des ROS via la stimulation de RCPG [109, 139]. Ces observations sont confirmées au niveau cellulaire, où il

a ainsi été montré que, dans des mastocytes en culture, le dimère p110/p87 est impliqué dans

la dégranulation tandis que le dimère p110p101 régule la migration [112]. Le rôle positif de p101 dans la migration cellulaire a été confirmé dans des cellules recombinantes de cancer du sein dans lesquelles son absence provoque un défaut de mobilité des cellules [140]. Au niveau

cellulaire, la signalisation du dimère p110/p87 se fait principalement au niveau de la membrane plasmique dans des micro-domaines de type raft lipidique, à l’inverse du dimère

p110/p101 rapidement endocyté et insensible à la déstabilisation des rafts [112]. L’activité du

dimère p110/p87 semble également dépendante de la présence de la protéine Ras [105]. Ces études montrent que les isoformes de sous-unités régulatrices de classe IB participent à la régulation de processus distincts au sein des cellules. Cependant, si l’isoforme p87 semble

intervenir dans le complexe p110/p87/PKA/PDE3B régulant négativement la contractilité cardiaque [69, 84, 126], le rôle de l’isoforme de sous-unité régulatrice p101 au niveau cardiaque n’est pas encore connu.

4. Mécanismes d’inactivation

Les PI3K étant impliquées dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires et leur activité retrouvée dérégulée dans un grand nombre de cancers, il apparait nécessaire que leur inactivation soit extrêmement contrôlée. S’il est clairement établi aujourd’hui que l’arrêt de la signalisation médiée par les PI3K, c’est-à-dire par les interactions entre le PI3,4,5P3 et les protéines effectrices à domaines PH, fait intervenir des protéines phosphatases, les mécanismes régulateurs négatifs des PI3K elles-mêmes sont beaucoup moins connus.

Les protéines phosphatases dégradent le PI3,4,5P3 en ôtant un groupement phosphate en position 3 dans le cas de la protéine PTEN (Phosphatase and TENsin homologue) ou en position 5 dans le cas des protéines de la famille SHIP (SH2-containing inositol phosphate 5-phosphatase) [141] (Figure 13). PTEN est une protéine d’environ 47 kDa identifiée en 1997 comme une protéine suppresseur de tumeurs dont l’activité est fortement diminuée dans un grand nombre de cancers [142, 143]. PTEN hydrolyse le PI3,4,5P3 pour recréer du PI4,5P2. Ce lipide étant déjà présent en excès dans les membranes cellulaires, aucune nouvelle signalisation n’est engendrée par ce processus. En revanche, en enlevant un groupement phosphate en position 5, les protéines SHIP créent un nouveau phospholipide, PI3,4P2, à l’initiation de nouvelles voies de signalisation [124]. La balance entre le niveau d’expression et l’activité des PI3K, de PTEN et des protéines SHIP détermine la dynamique des signalisations qui leur sont associées.



Figure 13: Régulation de la signalisation associée aux PI3K de classe I. Les PI3K génèrent du PI3,4,5P3 à partir de PI4,5P2. Les PI3,4,5P3 sont métabolisés en PI4,5P2 par la protéine 3-phosphatase PTEN ou en PI3,4P2 par des protéines 5-phosphatases de la famille SHIP. Le PI3,4P2 est à son tour métabolisé en PI3P par des protéines 4-phosphatases telles que INPP4 (D’après [141]).

Peu de mécanismes négatifs intervenant en amont ou directement sur les PI3K sont connus aujourd’hui. Plusieurs études montrent que la signalisation médiée par les PI3K est rétro-contrôlée positivement ou négativement par les effecteurs activés en aval des PI3K [144] (Figure 14). Par exemple, le complexe protéique mTORC1 peut inhiber, directement ou via ses effecteurs, l’expression et/ou l’activité des récepteurs à activité tyrosine kinase [145] ou de la protéine adaptatrice IRS-1 (Insulin receptor substrate 1) activatrice des PI3K de classe IA [146]. Un autre mécanisme consisterait, dans des cellules stimulées avec de l’EGF, en l’interaction

entre la sous-unité p85 et la protéine PTEN pour augmenter son activité [134]. En 2000, une protéine inhibitrice des PI3K de classe IA, appelée Ruk (Regulator of ubiquitous kinase),

interagissant directement avec le domaine SH3 de la sous-unité p85, a été découverte pour la première fois [147]. Une autre protéine inhibitrice des PI3K a été identifiée en 2007 et appelée PIK3IP1 (PI3K interacting protein 1) [148]. Cette protéine possède un domaine homologue au

domaine iSH2 de p85 et interagit directement avec les isoformes p110 et p110 des PI3K

sans détruire l’interaction p110/p85. Il a récemment été montré que cette protéine participe à la répression de l’activité pro-hypertrophique des PI3K [149]. Les mécanismes régulant l’interaction entre PI3K et Ruk et entre PI3K et PIK3IP1 ne sont pas encore élucidés. Nous ne savons pas non plus si ces protéines interagissent et régulent l’activité des PI3K de classe IB, ou si d’autres protéines seraient capables de le faire.



Figure 14 : Régulation rétro-contrôlée de la signalisation canonique des PI3K. La voie de signalisation canonique des PI3K (vert) est rétro-contrôlée à de multiples niveaux : les récepteurs membranaires et leurs protéines adaptatrices (bleu) activent les isoformes de PI3K dont la signalisation génère un grand nombre de boucles de rétrocontrôle (rose) positives ou négatives. UPR : « unfolded protein response » (D’après [144]).

B. Les PI3K de classe II

Les PI3K de classe II, dont il existe chez les mammifères trois isoformes (PI3K-C2,

PI3K-C2 et PI3K-C2), ont été découvertes grâce à leur homologie de séquence avec les PI3K de classe I. Elles n’existent pas chez la levure et une seule isoforme est présente chez D. melanogaster et C. elegans. Ce sont des protéines d’environ 170 kDa fonctionnant sous forme de monomères [150], dont le mode d’action et les rôles physiologiques sont encore aujourd’hui

mal connus. Se basant sur des expériences de Northern blot, il semblerait que PI3K-C2 et

PI3K-C2 soient exprimées de façon ubiquitaire dans les tissus tandis que l’expression de

PI3K-C2 semble plus restreinte [79]. Ces PI3K-C2 semblent également constitutivement associées aux membranes intracellulaires [151] et ne possèderaient pas de sous-unités régulatrices. Il a été montré in vitro que ces PI3K peuvent phosphoryler le PIP et le PI4P pour générer du PI3P et du PI3,4P2. Leur substrat préférentiel in vivo semble être le PIP pour la

PI3K

PDK1

Akt

TSC1/2

Rheb

mTORC1

FKBP38

PRAS40

GSK3

p85

PTEN ROCK

RhoA

eiF4ENBS-1

PP2A

FOXO

mTORC2

GPCR

VPS34

4EBP1

S6K

PDGFR

IRS-1RTK

NEDD4-1

Canonical PI3K pathway

Feedback regulators

Upstream regulators



production de PI3P mais quelques études rapportent également la production de PI3,4P2 [150]. Malgré leur similarité de séquence avec les PI3K de classe I, elles ne sont que peu sensibles aux inhibiteurs pharmacologiques classiques de ces dernières, et il n’existait aucun inhibiteur sélectif de cette classe de PI3K avant le développement de molécules ciblant l’isoforme PI3K-

C2 en 2015 [152]. Il semblerait que de nombreux stimuli puissent activer les PI3K de classe II, tels que des cytokines, chimiokines ou des facteurs de croissance mais le mécanisme d’action de ces agonistes pour activer l’enzyme reste encore inconnu [78] (Figure 11 B). De récentes études ont impliqué les PI3K de classe II dans des processus tels que la migration cellulaire, l’exocytose, l’apoptose, le trafic des récepteurs ou les réarrangements du cytosquelette [153-

156]. Récemment, Hirsch et son équipe ont montré que la PI3K-C2 était responsable de la production de PI3P dans une région très localisée des membranes cellulaires, le compartiment de recyclage d’endocytose péricentriolaire situé à la base du cil primaire participant au contrôle de la fonctionnalité de cette structure [157, 158].

C. Les PI3K de classe III

La classe III des PI3K ne comporte qu’un seul membre chez les mammifères, Vps34 aussi appelé PI3K-C3, dont l’unique substrat est le PI. Cet homologue de Vps34p (Vacuolar protein sorting 34) présent chez S. cerevisae lie une protéine adaptatrice Vps15 myristoylée en N-terminal régulant la localisation intracellulaire et l’activité de Vps34 [159]. Vps15 interagit également avec des protéines membranaires telles que Rab5 afin de coordonner l’activité de Vps34 au niveau des endosomes [159]. Vps34 est impliquée dans les processus de trafic vésiculaires comprenant notamment l’autophagie, l’endocytose et la phagocytose, grâce à son association avec différents complexes multi-protéiques [160] (Figure 11 C).

D. Mesures expérimentales de l’activité des PI3K de classe I

Il existe différentes techniques permettant d’apprécier l’activité des PI3K reposant soit directement sur la mesure de l’activité enzymatique en quantifiant la production de leur produit, le PI3,4,5P3, soit indirectement sur la mesure de l’activation de leurs effecteurs secondaires [161]. Ces différentes techniques emploient des principes variés, allant de la radioactivité à l’utilisation de la fluorescence ou de la luminescence en passant par les immuno-réactions, en fonction desquels elles pourront être réalisées in vitro ou in cellulo. Certaines techniques peuvent être utilisées pour effectuer des criblages à haut débit (HTS/High Throughput Screening) de molécules en industrie. L’activité des PI3K peut être modulée par des inhibiteurs pharmacologiques utilisés afin de déterminer leur implication dans un processus cellulaire donné.

1. Les inhibiteurs pharmacologiques

Pour déterminer l’implication des PI3K dans un processus cellulaire, il est possible de les inhiber via l’utilisation de molécules inhibitrices de l’activité catalytique. Les premiers inhibiteurs pharmacologiques des PI3K ont été découverts dans les années 90 (Figure 15). Parmi ceux-ci, la wortmannine est un inhibiteur sélectif et irréversible des PI3K, issu d’un champignon, Penicillium funiculosum, qui a été découvert en 1993 [162]. Le LY294002 est une molécule dérivée de la quercetine, flavonoïde inhibiteur non-sélectif des PI3K, qui a été longtemps décrite comme inhibant spécifiquement les PI3K de façon réversible [163].



Cependant cette molécule est également capable d’inhiber des protéines autres que les PI3K [164, 165]. Ces premiers inhibiteurs sont des compétiteurs du site de liaison de l’ATP et ciblent toutes les familles de PI3K sans distinction entre les isoformes de sous-unités catalytiques, encore moins de sous-unités régulatrices. Beaucoup d’autres molécules ont depuis été développées, dont certaines sont en phase d’essais cliniques, afin d’inhiber sélectivement une ou plusieurs isoformes de sous-unité catalytique de PI3K, avec une meilleure efficacité [166]. Ces molécules peuvent cibler le site de liaison de l’ATP ou des régions proches de ce site qui permettent d’augmenter la spécificité puisque particulières à chaque protéine (voir Chapitre 1.

I. B.) Par exemple, le composé NVP-BYL719 est un inhibiteur sélectif de la p110 [167], le TGX-

221 inhibe sélectivement l’isoforme p110 [168] et le AS-605240 cible spécifique l’isoforme

p110 [169]. Ces molécules sont dites spécifiques d’une isoforme, cependant elles sont capables d’inhiber les autres isoformes mais avec une efficacité beaucoup moins bonne.

Récemment, un anticorps monoclonal reconnaissant la forme entière de p110 a été identifié

comme inhibant sélectivement le dimère p110/p87 et non le dimère p110/p101 [170], constituant un outil d’intérêt pour étudier les rôles spécifiques de ces deux isoformes.

Figure 15 : Structures d’inhibiteurs pharmacologiques des PI3K et valeurs d’IC 50 qui leur sont connues. Les valeurs d’IC50 sont obtenues in vitro lors d’essais d’activité kinase (D’après [167-169, 171]).

Ces outils pharmacologiques sont utilisés pour étudier l’implication des PI3K dans un contexte cellulaire particulier. La mesure de l’activité des PI3K (activation ou inhibition) se fait via l’utilisation d’essais réalisables in vitro ou in cellulo.

2. Mesures expérimentales in vitro

a. Les essais radioactifs

La méthode la plus ancienne pour apprécier l'activité des PI3K est un essai radioactif mesurant l'activité enzymatique de la kinase en quantifiant la production de PI3,4,5P3 [163]. Elle peut être appliquée en chromatographie sur couche fine ou dans des essais de scintillation par proximité. Ces méthodes reposent sur le transfert d’un phosphate radiomarqué, 32P ou 33P, sur

NVP-BYL7419

0.074 µM(p110 )

TGX-221 0.005 µM(p110)

Reported IC50Reported IC50

4.2 nM(classe IA PI3K)

1.4 µM(Bovine brain PI3K)

AS-605240 0.008 µM(p110)

Wortmannin

LY294002



le substrat lipidique PI4,5P2 de l’enzyme. La réaction se fait in vitro en présence de la PI3K qui a été préalablement immuno-précipitée à partir de lysats cellulaires, de son substrat et d’ATP radiomarqué. Après arrêt de la réaction, le mélange lipidique est extrait de différentes façons en fonction de la méthode employée et la quantité de lipides radiomarqués produite est détectée grâce à un compteur à scintillation ou un système d’imagerie à luminophores. Cette méthode a été déclinée en plusieurs techniques basées sur ce même principe de détection des PI3,4,5P3 radiomarqués [161]. Par exemple, la société Perkin Elmer a développé un essai radioactif de quantification des PI3,4,5P3 dans lequel les puits d’une plaque 96 puits ou 384 puits sont recouverts d’une couche de phospholipides [172]. L’ajout de PI3K purifiée en présence d’ATP radiomarqué permet la génération de PI3,4,5P3 radiomarqué dont la quantification pourra être réalisée grâce à un compteur à scintillation.

Les avantages des techniques utilisant la radioactivité sont bien sûr leur sensibilité et leur précision permettant des quantifications fiables. De plus, utilisant des PI3K purifiées, ils permettent de connaitre les isoformes de PI3K à l’origine de la production de PI3,4,5P3. Cependant, ce sont des expérimentations lourdes, coûteuses et non sans risque, qui ne peuvent pas forcément être appliquées en HTS. C’est pourquoi les essais utilisant la radioactivité sont quelque peu délaissés aujourd’hui au profit de techniques utilisant la colorimétrie, la fluorescence ou la luminescence. Par ailleurs, ces essais radioactifs ne permettent de connaitre que l'activité globale des PI3K en condition non physiologique puisque la kinase doit être préalablement purifiée et ne permettent donc pas d’apprécier les défauts de l’activité de la kinase au niveau local dans la cellule.

b. Les essais immuno-réactifs

L’activité des PI3K est souvent mesurée également grâce à des techniques basées sur les immuno-réactions de type western blot. L’activation des PI3K ne met pas en jeu de modifications connues de ces protéines, telles que des phosphorylations ou la liaison au GDP ou au GTP que l’ont peut détecter dans le cas d’autres protéines à activité catalytique. Par conséquent, l’activité des PI3K est déterminée au travers de l’activation de leurs effecteurs secondaires dont le plus utilisé est la protéine Akt, spécifiquement activée par les PI3K de classe I. La détection de son activation constitue donc un très bon reflet indirect de l’activation des PI3K. L’activation de la protéine Akt met en jeu des évènements de phosphorylation sur sa sérine 473 et sa thréonine 308 [122] qui peuvent être détectés grâce à des anticorps spécifiques dirigés contre ces résidus phosphorylés et permettent ainsi de distinguer l’état actif et l’état inactif de la protéine.

Si l’activation d’Akt, via la stimulation des PI3K, peut se faire en cellules vivantes, la détection de son activité requiert la lyse des cellules, entrainant la perte des informations de régulation spatio-temporelle de leur activité. De plus, elle ne permet pas non plus de déterminer l’isoforme de PI3K impliquée dans l’activation d’Akt. En revanche, la réalisation des expériences de western blot est relativement simple et généralement effectuée en routine dans les laboratoires. Cette technique reste peu coûteuse et est donc avantageuse pour un laboratoire.



c. Les essais de fluorescence et de luminescence

Parmi les nouvelles techniques utilisant la fluorescence, nous trouvons des essais basés sur la polarisation de fluorescence (FP) ou la fluorescence homogène en temps résolu (HTRF, Homogeneous time-resolved fluorescence) [161]. Ces techniques reposent sur des essais de compétition entre du PI3,4,5P3 fluorescent et le PI3,4,5P3 nouvellement produit après réaction enzymatique en présence de la PI3K. Ces deux produits sont en compétition pour une protéine « détectrice de PI3,4,5P3 », qui est généralement le domaine PH de la protéine Akt ou de la protéine GRP1 présentant une grande affinité pour le PI3,4,5P3. Dans les essais de polarisation de fluorescence, seul le PI3,4,5P3 est fusionné à un fluorophore. En revanche, dans les essais HTRF, tel que celui développé par la compagnie EMD Millipore (PI 3-Kinase HTRF™ Assay) (Figure 16 A), le PI3,4,5P3 et la protéine détectrice sont fusionnés à des fluorophores, permettant la détection d’un transfert d’énergie fluorescente par résonance (FRET) dont nous expliquerons le principe dans le chapitre 2 de ce mémoire. Dans les deux cas, le PI3,4,5P3 nouvellement formé entre en compétition avec le couple marqué PI3,4,5P3/protéine détectrice et la fluorescence ou le transfert d’énergie FRET est ainsi diminué. Cette diminution reflète l’activité de la PI3K. Des essais similaires de compétition utilisant la colorimétrie pour détection ont également été développés, tel que celui de l’entreprise Echelon bioscience (PI3-Kinase Activity ELISA : Pico) (Figure 16 B). D’autres essais HTRF permettent de détecter, non pas la quantité de PI3,4,5P3 produite, mais la quantité de nucléotides ADP générés au cours de la réaction enzymatique. C’est le cas par exemple de l’essai Adapta™ créé par Invitrogen (Adapta™ Universal Kinase Assay Kit) (Figure 16 C) qui repose sur la compétition entre les molécules d’ADP et un traceur spécialement conçu pour un anticorps anti-ADP. Le traceur et l’anticorps sont couplés à des fluorophores permettant la détection d’un signal FRET en absence d’ADP qui est diminué en présence d’ADP.



Figure 16 : Essais de quantification des PI3,4,5P3 produits in vitro par les PI3K, basés sur la fluorescence. Schémas explicatifs des essais « PI 3-Kinase HTRF™ Assay » (EMD Millipore) (A), « PI3-Kinase Activity ELISA : Pico » (Echelon bioscience) (B) et « Adapta™ Universal Kinase Assay Kit » (Invitrogen) (C). A) Le signal TR-FRET est mesuré entre les PI3,4,5P3 biotinylés et le domaine PH de GRP1 fusionné à la GST et détectés respectivement par de la streptavidine couplée allophycocyanine et un anticorps anti-GST couplé Europium. Le signal FRET est diminué en présence des PI3,4,5P3 nouvellement générés par les PI3K purifiées. B) Les PI3,4,5P3 produits par la réaction enzymatique en présence de PI3K purifiées sont incubés en présence d’une protéine détectrice de type domaine PH de GRP1 ou Akt. La solution est transférée dans une microplaque préalablement recouverte de PI3,4,5P3 avec lesquels les protéines détectrices libres vont interagir. L’ajout d’un anticorps secondaire couplé a la péroxydase permettra de quantifier la quantité de protéines détectrices en interaction. C) Le Adapta™ essai consiste en une première étape de réaction enzymatique suivie d’une étape de détection de l’ADP formé. En présence d’une kinase active, l’ADP est en compétition avec le traceur et ne permet pas la détection d’un signal TR-FRET. En présence d’une kinase inhibée, le traceur interagit avec l’anticorps anti-ADP et permet la détection d’un signal TR-FRET.

La luminescence peut également être utilisée pour les essais d’activité de la kinase. Deux essais principaux ont été développés basés sur ce principe permettant, comme dans le cas de la fluorescence, la mesure des interactions entre du PI3,4,5P3 et une protéine détectrice marqués (PI3-Kinase Activity AlphaScreen® Assay par Echelon bioscience), ou la détection des nucléotides ADP (ADPGlo™ par Promega [173]) (Figure 17). L’essai AlphaScreenTM (Amplified

A B

C



Luminescent Proximity Homogeneous Assay) est un essai semblable au FRET développé par Perkin Elmer utilisant une bille donneuse d’énergie et une bille accepteuse d’énergie pouvant être fusionnées à différents partenaires. Pour les essais d’activité PI3K, le signal est mesuré entre des PI3,4,5P3 et des protéines détectrices fusionnées aux billes donneuses ou accepteuses d’énergie. Le signal produit par les billes est diminué par compétition du PI3,4,5P3 nouvellement généré en présence des PI3K (Figure 17 A). Cet essai a également été adapté pour mesurer, entre autres, la quantité de protéines Akt phosphorylées reflétant l’activité des PI3K (AlphaScreen® SureFire® Phospho-AKT (Thr308) Kit, Perkin Elmer).

L’essai ADPGloTM de Promega permet de quantifier l’ADP produit lors de la réaction enzymatique en présence des PI3K (Figure 17 B). Il comporte une première étape de réaction enzymatique permettant d’obtenir du PI3,4,5P3, de l’ADP et de l’ATP non utilisé. Cet ATP non utilisé est détruit via l’ajout d’une première solution puis l’ADP restant est transformé, grâce à une deuxième solution, en ATP. La quantité d’ATP produite pourra être mesurée via une réaction de bioluminescence d’une enzyme luciférase en présence de son substrat, la luciférine, utilisant cet ATP et dont l’intensité sera donc le reflet de l’activité préalable de la PI3K.

Figure 17 : Essais de quantification des PI3,4,5P3 produits in vitro par les PI3K, basés sur la luminescence. Schémas explicatifs des essais « PI3-Kinase Activity AlphaScreen® Assay » (Echelon Bioscience/Perkin Elmer) (A) et « ADP-Glo™ Kinase Assay » (Promega) (B). A) Le signal est mesuré entre les PI3,4,5P3 biotinylés et les protéines détectrices fusionnées à la GST interagissant respectivement avec la streptavidine couplée à la bille donneuse et un anticorps anti-GST couplé à la bille accepteuse d’énergie. L’excitation de la bille donneuse génère de l’oxygène singulet qui excite la bille accepteuse. L’excitation est diminuée par la compétition des PI3,4,5P3 nouvellement générés par les PI3K. B) La réaction enzymatique produite par les PI3K utilise de l’ATP et génère du PI3,4,5P3 et de l’ADP. L’ATP non utilisé est déplété, puis l’ADP produit est transformé en ATP dont la quantité sera mesurée par une réaction de bioluminescence luciférase/luciférine.

B

Europium-labeled anti-

GST

Streptavidin-Allophycocyanin Europium-

labeled anti-GST

Streptavidin-Allophycocyanin

GST-taggedPH domain

BiotinylatedPIP3 GST-tagged

PH domainBiotinylated

PIP3New PIP3generated

A



Ces essais de fluorescence, luminescence ou colorimétriques sont très sensibles, spécifiques, robustes et rapides ce qui permet leur utilisation en HTS. Ce sont des outils quantitatifs permettant de comparer précisément l’efficacité des composés testés pour moduler l’activité des PI3K. Comme dans le cas des essais radioactifs, l’utilisation de PI3K purifiées permet de déterminer les isoformes responsables de la génération des PI3,4,5P3. Cet atout représente également un inconvénient majeur de ces méthodes puisque les PI3K purifiées sont extraites de leur environnement physiologique et de leurs partenaires régulateurs. Ces techniques ne permettent pas non plus d’étudier les régulations spatio-temporelles de l’activité des PI3K. Elles sont également relativement coûteuses et requièrent des appareils de détection (fluorimètre ou luminomètre) spécifiques.

3. Mesures expérimentales in cellulo

Si les essais expérimentaux in vitro sont nombreux aujourd’hui pour mesurer l’activité des PI3K, les essais in cellulo sont beaucoup moins variés. Ces essais in cellulo extrêmement indirects utilisent l’immunofluorescence pour détecter la localisation intracellulaire de la PI3K d’intérêt ou de ses effecteurs. En effet, la description de l’activation des PI3K les place, à l’état inactif, dans le cytosol et à l’état actif au niveau des membranes plasmiques et intracellulaires (voir Chapitre 1. III. A.). Après génération de PI3,4,5P3, les protéines effectrices sont également recrutées à la membrane via l’interaction de leur domaine PH avec ces lipides néoformés.

a. Les essais d’immunofluorescence

Il n’existe pas aujourd’hui d’anticorps réellement spécifique de chacune des isoformes de sous-unités catalytiques et régulatrices des PI3K. Par conséquent il est nécessaire d’utiliser des sous-unités de PI3K fusionnées avec un fluorophore de type CFP (Cyan Fluorescent Protein) ou YFP (Yellow Fluorescent Protein) pour visualiser par microscopie de fluorescence leur localisation intracellulaire à l’état basal et en réponse à un stimulus (Figure 18 A, panels de gauche et panel en haut à droite). Cette méthode est peu utilisée car si le recrutement à la membrane semble nécessaire pour l’activation de la PI3K, il n’est pas obligatoirement signe de son activation, comme illustré par la Figure 18 car en présence de wortmannine, un inhibiteur de l’activité des PI3K, la PI3K reste quand même localisée au niveau des membranes (Figure 18 A, panels en bas à droite) [174]. De plus, elle nécessite la transfection d’au moins une des sous-unités de PI3K étiquetées ce qui altère la stœchiométrie des dimères de PI3K et pourrait altérer également leur fonction. Il est donc préféré, de façon alternative, d’utiliser le domaine PH de la protéine Akt ou de la protéine GRP1, qui sont deux des effecteurs principaux des PI3K, fusionné à un fluorophore de type YFP. L’activation des PI3K est reflétée par une relocalisation de la fluorescence associée aux domaines PH, initialement cytosoliques, au niveau de la membrane plasmique (Figure 18 B).



Figure 18 : Localisation de p110, p101 et YFP-GRP1-PH à l’état basal ou après activation par le

dimère G des protéines G hétérotrimériques ou par le fMLP.

A) Les sous-unités de PI3K fusionnées ou non à la YFP sont transfectées dans des cellules HEK. La fluorescence

est détectée à l’état basal (panel de gauche) ou après stimulation avec G en absence (panel en haut à droite) ou en présence de 100 nM de wortmannine (panel en bas à droite) (D’après [174]). B) Recrutement du domaine PH

de GRP1 fusionné à la YFP dans des cellules HEK transfectées également avec le fMLPR, p110 et p101, après stimulation des cellules pendant 2 minutes avec 1 µM de fMLP (D’après [83]).

L’avantage principal de ces techniques de détection de fluorescence est qu’elles sont réalisées sur des cellules vivantes fournissant ainsi un bon aperçu de l’activité des PI3K dans un système davantage « intégré ». Un autre avantage provient de la possibilité d’observer les compartiments intracellulaires au sein desquels les PI3K et/ou leurs effecteurs sont recrutés. Néanmoins, l’observation de ces localisations subcellulaires est dépendante de la résolution du microscope qui est en général d’environ 200 nm donc assez peu résolutive. De plus, si la transfection des domaines PH ne semble pas avoir d’impact sur l’activité des PI3K et constitue un très bon reflet de leur activation, ces domaines ne représentent qu’une petite partie des protéines effectrices et n’intègrent donc pas tous les mécanismes de régulation spatio-temporelle et d’interactions protéiques qui participent normalement au contrôle de l’activité des PI3K. L’immunofluorescence ne peut donc pas être utilisée pour étudier l’activation des isoformes de PI3K d’un point de vue spatio-temporel suffisamment résolutif.

b. Les essais de transfert d’énergie par résonance

Ces dernières années, des techniques basées sur le principe du transfert d’énergie par résonance (voir Chapitre 2. II. A.) ont été développées pour mesurer et visualiser in cellulo le recrutement et les interactions des protéines effectrices des PI3K avec le PI3,4,5P3 qu’elles produisent ou pour mesurer directement leur activation. Un exemple du premier cas est celui de Kuo et collaborateurs qui ont développé un senseur, utilisant le principe de transfert d’énergie bioluminescente par résonance (BRET) (voir Chapitre 2. II. B.), reposant sur l’utilisation du domaine PH de la protéine Akt fusionné à l’enzyme donneuse d’énergie Rluc et une YFP accepteuse d’énergie fusionnée à une séquence de localisation membranaire [175]. Lors de la production de PI3,4,5P3 suite à l’activation des PI3K, le domaine PH d’Akt est recruté à la membrane et permet la détection d’un signal BRET lié au rapprochement des senseurs au moment de l’interaction d’Akt avec le PI3,4,5P3.

B

A



Plusieurs autres senseurs de l’activité de la protéine Akt ont été développés. Ces senseurs sont des protéines chimériques constituées de domaines particuliers de certaines protéines auxquels sont fusionnés des fluorophores donneur et accepteur d’énergie. Le senseur le plus direct de l’activité d’Akt est le senseur Aktind qui mesure à la fois le recrutement d’Akt au niveau du PI3,4,5P3 et son activité [176]. Ce senseur FRET est composé du domaine PH d’Akt fusionné consécutivement à la YFP puis à des domaines catalytiques et régulateurs d’Akt et enfin à un fluorophore CFP (Figure 19 A). A l’état inactif, le signal FRET est faible. Il est augmenté lors du recrutement et de l’activation du domaine catalytique d’Akt du fait d’une modification de conformation des domaines catalytique et régulateur.

La protéine Akt est une protéine kinase qui phosphoryle d’autres protéines. Ainsi, des senseurs utilisant cette caractéristique ont été développés. Ils consistent en la fusion de domaines de protéines particulières phosphorylées par Akt à des domaines de reconnaissance des résidus phosphorylés et flanqués de part et d’autre des donneurs et accepteurs d’énergie FRET (Figure 19 B). Par exemple, le senseur Aktus reflète l’activité d’Akt car il est formé du domaine de phosphorylation d’un effecteur d’Akt, tel que Bad ou eNOS, et de la protéine 14-3-3 comme domaine de reconnaissance de phosphorylation entourés du donneur et de l’accepteur d’énergie [177]. La phosphorylation du domaine de l’effecteur par Akt induit l’interaction avec 14-3-3 et permet le rapprochement des fluorophores et la détection d’un signal FRET. Un senseur similaire a été développé en 2014, appelé Eevee-iAkt, utilisant la séquence de

phosphorylation de GSK3, effecteur d’Akt, et le domaine de reconnaissance des thréonines phosphorylées, FHA1 [178]. La principale différence entre ces deux senseurs est le nombre d’acides aminés positionnés entre ces deux domaines permettant une meilleure flexibilité. De plus, Eevee-iAkt semble plus sensible et spécifique que le senseur Aktus [178].

Figure 19 : Principe des senseurs de l’activité d’Akt . A) Le senseur Aktind est constitué du domaine PH d’Akt, suivi des domaines catalytique et régulateur d’Akt entourés de la YFP et de la CFP. A l’état basal, aucun signal FRET n’est mesuré. Après production de PI3,4,5P3 et recrutement du senseur via son domaine PH, la phosphorylation d’Akt induit un changement de conformation permettant la génération d’un signal FRET (D’après [176]). B) Les senseurs Aktus et Eevee-iAkt sont constitués du domaine de phosphorylation d’un effecteur d’Akt et d’une protéine ou d’un domaine de liaison aux résidus phosphorylés entre deux fluorophores. L’activation d’Akt résulte en la phosphorylation du domaine de l’effecteur et en l’interaction avec le domaine de liaison aux phospho-résidus permettant la génération d’un signal FRET (D’après [178]).

A B

Substrat peptide

Phosphoaminoacid-binding

domain

InactiveActive



Tous ces biosenseurs basés sur le transfert d’énergie par résonance permettent de refléter l’activité d’Akt en temps réel dans des cellules vivantes ce qui constitue un net avantage comparé aux méthodes que nous avons présentées jusqu’ici. Couplés à la microscopie à fluorescence (voir Chapitre 2. II.), ils permettent en plus la visualisation directe dans ces cellules de l’activation des effecteurs d’Akt. Cependant, un inconvénient majeur de ces biosenseurs, outre le fait qu’ils mesurent des évènements se produisant bien en aval des PI3K, est qu’ils n’utilisent qu’une partie des protéines cibles ne tenant ainsi pas compte, une fois de plus, des interactions protéiques régulatrices de leur activité dans le temps et l’espace. De plus, ces biosenseurs utilisent le FRET qui est une technique présentant des inconvénients importants liés à la nature des molécules donneuses et accepteuses d’énergie qui ne permettent pas actuellement une bonne résolution (voir Chapitre 2. II. B.).

Nous venons de voir qu’il existe un certain nombre de stratégies développées pour mesurer l’activité des PI3K. Ces stratégies peuvent être réalisées in vitro ou in cellulo et reposent sur différents principes biophysiques qui sont la radioactivité, les immuno-réactions, la fluorescence etc… Chaque méthode présente des avantages et des inconvénients en termes de coût, d’adaptation HTS, de sensibilité, de spécificité ou de pertinence physiologique. Le choix de la technique à utiliser dépend de la question biologique posée et doit tenir compte des avantages et limitations de chaque outil. Il apparait évident qu’aucun outil à l’heure actuelle ne permet de réunir chacun des avantages que nous avons présentés tout en diminuant nettement le nombre des inconvénients. Ce constat est surprenant compte tenu de l’énorme intérêt que représentent les PI3K en physiopathologie. Il est donc indispensable aujourd’hui de trouver de nouveaux outils sensibles, spécifiques, résolutifs, utilisables en cellules vivantes et en temps réel, et permettant de discriminer les isoformes de sous-unités catalytiques et régulatrices des PI3K impliquées. Nous avons tenté de développer un tel outil dans ce travail de thèse.





CHAPITRE 2

RESULTATS EXPERIMENTAUX



TRAVAIL PRINCIPAL :

PROJET DE THESE



ETUDE N°1 :

DEVELOPPEMENT DE BIOSENSEURS BRET PREDICTIFS DE LA CARDIOTOXICITE DES

MEDICAMENTS ANTI-TUMORAUX





I. OBJECTIF DE LA THESE

Mon projet de thèse se situe dans le contexte du programme CIFRE financé par l’ANRT (Agence Nationale pour le Recherche et la Technologie), qui permet la mise en place de collaborations entre des équipes de recherche publique et des entreprises privées. Mon équipe d’accueil à l’Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires (I2MC) s’intéresse aux déterminants cliniques et moléculaires de l’architecture cardiaque. Nombre de ses travaux ont concerné le rôle du système nerveux sympathique dans les processus expliquant la progression et les complications de l’insuffisance cardiaque [179, 180] ainsi que les déterminants de la morphologie du cardiomyocyte (entité contractile cardiaque) et leur importance dans la fonction cardiaque [181, 182]. De son côté, l’entreprise Cardiomedex est spécialisée dans l’examen, au stade du développement préclinique et des premières étapes des essais cliniques, des effets sur le système cardiovasculaire de molécules à visée thérapeutique. Cardiomedex, en collaboration avec mon équipe d’accueil, souhaite développer un axe d’onco-cardiologie préclinique visant à étudier les effets cardiotoxiques des médicaments anticancéreux chez l’homme [50] et qui constitue aujourd'hui un axe prioritaire de nombreuses compagnies pharmaceutiques.

Si beaucoup de progrès ont été faits dans le domaine de l’optimisation des stratégies thérapeutiques pour lutter contre le cancer grâce à la combinaison des traitements et au développement de thérapies utilisant des médicaments ciblant une protéine ou un mécanisme spécifiquement impliqué dans le développement du cancer, la prédiction, au stade du développement préclinique, des effets indésirables cardiaques de cette classe thérapeutique reste encore très limitée. En effet, l’étude du potentiel cardiotoxique des molécules est basée principalement, in vitro, sur leur interaction potentielle avec les canaux potassiques hERG. Ces canaux ioniques jouent un rôle clé dans l'activité électrique du cœur en régulant la durée du potentiel d’action des cellules cardiaques. In vivo, les molécules potentiellement cardiotoxiques sont testées directement sur la mesure de paramètres physiques et fonctionnels du cœur tels que l’allongement de l’intervalle QT, représentation électro-cardiographique de la durée du potentiel d’action des cellules ventriculaires (voir Chapitre 1. II. A.). Ces paramètres ne reflètent néanmoins qu’une partie infime des mécanismes pouvant être mis en jeu lors de l’établissement d’une toxicité cardiaque. En effet, le développement de pathologies cardiaques fait intervenir, au niveau cellulaire, un nombre important d’évènements autres que l’altération de canaux ioniques. Nous manquons aujourd’hui d’outils pour mesurer ces évènements et ainsi détecter le risque de cardiotoxicité au stade préclinique du développement des candidats médicaments. Cela entraine un risque pour la santé des patients, y compris pour ceux se prêtant aux essais cliniques, et un risque financier important pour l’entreprise pharmaceutique à l’origine de cette molécule. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux outils pour anticiper l’apparition de cette cardiotoxicité dès le stade in vitro.

Dans ce contexte, l’objectif de ma thèse a été de développer des biosenseurs permettant l’identification précoce, au stade préclinique, du potentiel cardiotoxique des molécules destinées au traitement du cancer. Pour cela, nous avons décidé de cibler le développement de biosenseurs capables de mesurer spécifiquement, en temps réel et dans des cellules vivantes l’activité de protéines se situant au carrefour des voies de signalisation sous-jacentes au développement d’une cardiotoxicité par la plupart des médicaments anticancéreux : les phosphoinositide-3-kinases (PI3K).



Comme précédemment décrit (voir Chapitre 1. I. B.), les PI3K sont une famille de protéines régulant la prolifération, la survie ou encore le métabolisme énergétique des cellules. Leur hyper-activation dans de nombreux cancers en fait ainsi des cibles privilégiées des médicaments anticancéreux. Malheureusement, ces protéines sont ubiquitaires et on les retrouve exprimées également au niveau cardiaque où elles régulent les propriétés physiologiques intrinsèques de cet organe. Selon l’isoforme, les PI3K régulent positivement ou négativement la contractilité et la trophicité cardiaques (voir Chapitre 1. II. B.). Par conséquent, les médicaments anticancéreux ciblant les PI3K dans les cellules tumorales peuvent être à l’origine d’effets indésirables graves au niveau cardiaque, du fait de leur interférence directe avec l’activité de ces protéines déterminant des dysfonctions électro-physiologiques et/ou physiques majeures (voir Chapitre 1. II. B.). L’induction d’une cardiotoxicité est également observée pour des médicaments anticancéreux ayant des mécanismes d’action différents mais qui ont également pour conséquence, au niveau cardiaque, une altération du fonctionnement des PI3K (voir Chapitre 1. II. B.). De ce fait, la mesure de l’activité des PI3K au niveau cardiaque peut constituer un bon reflet de la cardiotoxicité potentielle des molécules développées pour le traitement des cancers.

Les PI3K fonctionnent en hétérodimères de sous-unités, une sous-unité catalytique et une sous-unité régulatrice, dont les interactions sont modulées en fonction de l’activité de la protéine (voir Chapitre 1. III. A.). Il existe aujourd’hui des techniques, basées sur le principe du transfert d’énergie par résonance (RET), qui permettent de mesurer sensiblement et spécifiquement des interactions protéine-protéine, en temps réel et en cellules vivantes. Nous avons donc choisi d’utiliser l’une de ces techniques, basée sur le transfert d’énergie bioluminescente par résonance (BRET), pour mesurer les interactions entre les sous-unités catalytiques et régulatrices des PI3K, ce qui pourrait constituer un bon reflet de leur activité. Plus particulièrement, nous avons choisi d’utiliser le BRET de deuxième génération, BRET2, qui présente de nombreux avantages, notamment en termes de sensibilité, par comparaison aux deux autres techniques basées sur le RET, le BRET de première génération (BRET1) et le FRET (transfert d’énergie fluorescente par résonance) (voir Chapitre 2. II. B.). De plus, la technologie BRET2 est adaptée pour le criblage de molécules in cellulo et peut être utilisée in vivo pour la création d’animaux transgéniques.

Dans un premier temps il nous faudra développer les biosenseurs BRET2 mesurant les interactions entre les différentes isoformes de sous-unités catalytiques et régulatrices des PI3K qui seront d’abord validés dans un modèle cellulaire hétérologue, les cellules HEK293T. Ce travail a représenté l’essentiel de mon projet de thèse dont les résultats sont présentés dans la section IV de ce chapitre.

A terme, nous souhaitons optimiser l’utilisation de ces biosenseurs pour le criblage de molécules dans un contexte cellulaire plus pertinent pour l’étude de la cardiotoxicité en utilisant des cultures primaires de cardiomyocytes de rat ou de souris que nous maitrisons au laboratoire. Ces cellules étant difficilement transfectables, nous produirons des vecteurs de type lentivirus ou adénovirus afin de permettre l’expression de nos biosenseurs dans ces cellules. Du fait du rôle cardio-protecteur ou cardio-délétère des différentes isoformes de PI3K, nous évaluerons le potentiel cardiotoxique des molécules en pré-stimulant ou non leur activation suivant que l’on souhaite mesurer la capacité des molécules à les inhiber ou à les activer respectivement. Dans ces expériences, nous utiliserons en référence des molécules connues pour être cardiotoxiques, ou au contraire cardio-protectrices, via des mécanismes



impliquant les PI3K. Pour aller plus loin, nous pourrons envisager la création d’animaux transgéniques exprimant nos biosenseurs BRET2 spécifiquement dans le cœur afin d’évaluer in vivo le potentiel cardiotoxique des molécules en développement.

Dans les sections suivantes nous expliquerons le principe/utilisation et applications du principe biophysique du RET, en particulier le FRET et le BRET. Puis nous présenterons les principaux résultats des expériences que nous avons réalisées dans le but de construire et valider l’utilisation des biosenseurs BRET2 pour la mesure de l’activité des PI3K. Nous avons

commencé par développer des biosenseurs BRET2 ciblant l’isoforme PI3K, dont les dimères

sont constitués de la sous-unité catalytique p110 associée à l’une des sous-unités régulatrices p87 ou p101. Lorsque la validation de ces biosenseurs aurait été effectuée, nous avions prévu

de développer des biosenseurs ciblant l’isoforme PI3K, dont les dimères sont constitués d’autres isoformes de sous-unités catalytiques et régulatrices. Cependant, n’ayant pas trouvé

de conditions adéquates pour mesurer l’activité des PI3K avec nos biosenseurs BRET2, nous

n’avons pas pu développer les biosenseurs des PI3K.

II. LE TRANSFERT D’ENERGIE PAR RESONANCE

A. Principe du transfert d’énergie par résonance

Le transfert d’énergie par résonance (RET) est un phénomène biophysique "distance-dépendant" de transfert d’énergie non radiatif se produisant à partir d'une molécule donneuse d’énergie excitée vers une molécule accepteuse d’énergie appropriée. D’après la théorie énoncée par Théodore Förster dans les années 1940 [183], le RET ne peut se produire entre un donneur et un accepteur d’énergie que sous certains critères (Figure 20). i/ Il faut que les spectres d’émission du donneur et d’excitation de l’accepteur se recouvrent. Plus le recouvrement spectral est grand, meilleur est le transfert (Figure 20 A). ii/ Le RET dépend également de l’orientation des moments dipolaires du donneur et de l’accepteur. Pour qu’il y ait transfert d’énergie, les dipôles doivent être parallèles. Lorsqu’ils sont perpendiculaires, le transfert est nul (Figure 20 B). iii/ Le dernier critère important pour que le transfert d’énergie soit possible est celui de la distance entre donneur et accepteur. Le transfert n’est en effet possible qu’à une distance inférieure ou égale à 100 Å. D’après l’équation de Förster, où R représente la distance effective entre le donneur et l’accepteur d’énergie et R0 la distance pour laquelle l’efficacité du transfert est de 50 %, l’efficacité de transfert (E) est inversement proportionnelle de la distance à la puissance 6 entre donneur et accepteur (Figure 20 C). Ainsi, de très petits changements de distance auront un impact important sur la qualité du RET ce qui en fait un principe physique particulièrement intéressant pour mesurer des événements intermoléculaires (interactions protéine-protéine) mais également intramoléculaires comme des changements de conformation.



Figure 20 : Conditions nécessaires pour un transfert d’énergie par résonance. D’après les équations de Förster, le transfert d’énergie par résonance (RET) n’est possible que si les spectres d’émission du donneur et d’excitation de l’accepteur se recouvrent (A), si les dipôles sont orientés de façon

parallèle (B) et si la distance entre les dipôles est inférieure à 100 Å (C). J : intégrale de recouvrement, : facteur

d’orientation des dipôles, E : efficacité de transfert, R : distance entre donneur et accepteur, R0 : distance pour laquelle on obtient 50 % du transfert d’énergie (D’après [184]).

Le transfert d’énergie par résonance est déterminé par le calcul du rapport (ratio RET) entre la quantité de photons émis par l’accepteur d’énergie sur la quantité de photons émis par le donneur (Figure 21).

Figure 21 : Schéma illustrant le calcul du ratio RET. Le ratio RET correspond à l’émission de l’accepteur sur l’émission du donneur, mesurées avec les filtres adéquats. La flèche rouge représente la contamination du filtre de l’accepteur par les photons émis par le donneur.

D A

100% RET

D A

0% RET

D

A B

C

Distance

Efficacité du RET

R0

D A

R < 100 Å

RET

D A

R >> 100 Å

Pas RET

Orientation des dipôles

Distance entre les dipôles

Recouvrement spectral

R

l (nm)

Emission donneur

Excitation accepteurI

l (nm)

Intensité

Emission donneur Emission accepteur

Ratio RET =Em. accepteur

Em. donneur

FiltresFiltres



Pour mesurer les interactions intermoléculaires de type interaction protéine-protéine, les molécules donneuses et accepteuses d’énergie peuvent être fusionnées génétiquement à deux protéines d’intérêt et être exprimées dans des cellules vivantes, permettant ainsi de suivre leurs interactions en temps réel dans la cellule. Le RET peut également être utilisé pour mesurer les changements de conformation d'une protéine en fusionnant donneur et accepteur sur cette même protéine.

Les premiers outils basés sur le principe du RET ont utilisé des fluorophores comme donneurs et accepteurs d’énergie, mesurant des transferts d’énergie fluorescente par résonance, le FRET. Plus tard, le phénomène de bioluminescence, déjà largement utilisé dans des systèmes rapporteurs, a été adapté pour mesurer des transferts d’énergie bioluminescente par résonance, donnant naissance au BRET.

B. Utilisation du transfert d’énergie par résonance : le FRET et le BRET

1. Le transfert d’énergie fluorescente par résonance (FRET)

Le FRET repose sur le principe biophysique du RET et utilise des fluorophores en tant que donneur et accepteur d’énergie. Il présente un certain nombre d’inconvénients non négligeables que nous allons développer ici et qui le rendent peu sensible et quelque fois peu fiable pour la détection de faibles signaux RET. Pourtant le FRET reste encore très utilisé car ce fut la première méthode développée utilisant le RET et, jusqu’à récemment, la seule technique permettant de visualiser les interactions protéiques ou les changements de conformation des protéines au niveau subcellulaire dans les cellules vivantes.

Pour mesurer un signal FRET, l’excitation du donneur d’énergie est effectuée grâce à un laser émettant des photons à une longueur d’onde appropriée. L’utilisation d’un laser pour exciter la molécule donneuse constitue un premier inconvénient majeur du FRET lorsqu’il est utilisé en biologie car beaucoup de molécules biologiques possèdent des propriétés de fluorescences intrinsèques (auto-fluorescence) et pourront être excitées de façon non spécifique par le laser. Cela est d’autant plus vrai que les fluorophores généralement utilisés pour le FRET sont dérivés d’une protéine fluorescente verte appelée GFP (Green Fluorescent Protein) issue de la méduse Aequora victoria. Cette protéine de 27 kDa a été clonée pour la première fois en 1992 [185] et sa structure élucidée par cristallographie en 1996 [186] (Figure 22 A). Elle possède un pic principal d’absorption qui se situe à 395 nm, dans l’ultraviolet, qui est également la gamme de longueurs d’onde excitant la plupart des biomolécules. Du fait de cet inconvénient important, de nombreuses équipes se sont attelées à la production de mutants dérivés de cette protéine afin de l’optimiser et de modifier ses propriétés spectrales (Tableau 2; Figure 22 B). Nous pouvons citer la EGFP (enhanced GFP) obtenue grâce à la mutation du résidu sérine 65 en tyrosine (S65T) du chromophore [187] dont la fluorescence est nettement supérieure à celle émise par la GFP native et dont le pic d’excitation est situé à 488 nm, la CFP obtenue par la mutation d’un résidu tyrosine en tryptophane (Y66W) au sein du chromophore qui crée une protéine cyan et la YFP issue de la mutation du résidu 203 (T203Y) de la GFP native qui fluoresce dans le jaune [188]. La CFP, dont le pic d’excitation à 439 nm limite l’excitation non spécifique des protéines cellulaires, est la protéine fluorescente la plus communément utilisée en tant que donneur d’énergie en FRET.



Afin de s’éloigner encore de la gamme de longueurs d’onde excitant les protéines cellulaires, des protéines fluorescentes présentant des propriétés spectrales situées dans le rouge ont été clonées à partir de coraux ou d’anémones de mer (Tableau 3). La protéine DsRed est issue de l’anémone Discosoma striata mais son l’utilisation en biologie n’est cependant pas optimale du fait de sa structure quaternaire tétramérique [189] ayant tendance à agréger. Par la suite, le Dr. Tsien et son équipe ont créé de nombreuses protéines dérivées de la DsRed [190, 191]. Des améliorations par mutations sont continuellement réalisées et de nouvelles protéines sont créées afin d’optimiser la résolution spectrale, la brillance et la stabilité de ces fluorophores [192]. Cependant, quelles que soient les améliorations effectuées, les fluorophores générés seront toujours sujet au phénomène de photoblanchiment correspondant à la perte de leur capacité de fluorescence après un temps d’excitation donné, spécifique à chacun.

Figure 22 : Structure de la GFP native d’Aequoria victoria et propriétés spectrales de protéines dérivées de la GFP. A) Structure de la GFP native, vue latérale, où sont représentés les résidus responsables de la formation de son chromophore au centre (figure d’après PBD 1EMA). B) Spectres d’absorption et d’émission de fluorophores dérivés de la GFP native (D’après [192]).

Un inconvénient majeur de l’utilisation du couple CFP/YFP comme partenaires RET vient de la trop grande proximité des spectres d’excitation et d’émission des deux protéines (Figure 23) qui peut facilement résulter : i/ en l’excitation simultanée des deux protéines qui se produit lors de l’excitation du donneur d’énergie (Figure 23, triangle rouge) et ii/ en la forte contamination du spectre d’émission de l’accepteur d’énergie (YFP) par les photons émis par le donneur d’énergie (CFP) (Figure 23, triangle vert). Lors de la réalisation des mesures de FRET et de l’analyse des résultats, ces deux paramètres doivent être pris en compte afin de corriger les valeurs et éliminer toute trace de contamination et les signaux RET non spécifiques.

chromophore

A B



Figure 23 : Représentation schématique des spectres d’excitation et d’émission de la CFP et de la YFP. La CFP est excitée à 439 nm et émet de l’énergie à 476 nm. Cette énergie peut être transférée à la YFP qui est excitée à 514 nm et émet à son tour à 527 nm. Les hachures noires représentent le chevauchement des spectres d’émission et d’excitation respectivement des deux fluorophores. Le triangle rouge représente l’excitation croisée des fluorophores. Le triangle vert représente la contamination des signaux d’émission lorsque les photons émis par le donneur d’énergie sont captés par le filtre mesurant les photons émis par l’accepteur d’énergie . Abs : pic d’absorption, Em : pic d’émission.

Tableau 2 : Propriétés spectrales des différentes protéines dérivées de la GFP d’ Aequoria victoria. Liste non exhaustive de protéines dérivées de la GFP issue d’Aequora victoria. Ex : longueur d’onde d’excitation, Em : longueur d’onde d’émission, * faible dimère (D’après [192]).

Nom Ex (nm) Em (nm)Brillance relative

(% de EGFP)Structure

quaternaire

GFP native 395 et 475 509 < 20 Monomère*

Sirius 355 424 43 Monomère*

EBFP 383 445 27 Monomère*

EBFP2 383 448 53 Monomère*

ECFP 439 476 39 Monomère*

Cerulean 433 475 79 Monomère*

SCFP 433 474 45 Monomère*

EGFP 488 507 100 Monomère*

GFP2 (Perkin) 400 510 n.d. Monomère*

Sapphire 399 511 79 Monomère*

EYFP 514 527 151 Monomère*

Venus 515 528 156 Monomère*

Citrine 516 529 174 Monomère*



Tableau 3 : Propriétés spectrales des différentes protéines dérivées de la DsRed de Discosoma striata. Liste non exhaustive de protéines dérivées de la DsRed issue de Discosoma striata. Ex : longueur d’onde d’excitation, Em : longueur d’onde d’émission (D’après [192]).

2. Le transfert d’énergie bioluminescente par résonance (BRET)

La bioluminescence est un phénomène observé chez beaucoup d’êtres vivants qui consiste en la production de lumière grâce à la dégradation d’un substrat par une enzyme, la luciférase [193]. Il existe différents types de luciférases utilisant différents types de substrats selon les organismes dont elles proviennent [194]. Ces luciférases sont à la base du BRET.

La principale différence entre le FRET et le BRET est que le BRET utilise une enzyme de type luciférase comme donneur d’énergie. L’accepteur est toujours un fluorophore. Cette différence constitue le premier avantage du BRET par rapport au FRET car l’excitation du donneur ne nécessite plus un laser externe. Elle est donc spécifique et ne risque pas d’exciter l’accepteur ou les protéines intracellulaires. De plus, la luciférase n’est pas sujette au phénomène de photoblanchiment ce qui permet l’enregistrement de signaux BRET pendant une durée relativement importante (plusieurs minutes).

La luciférase utilisée en BRET est issue de l’anémone de mer Renilla reniformis et appelée Renilla Luc ou Rluc. C’est une protéine de 36 kDa dont la structure a pu être cristallisée en 2007 [195] (Figure 24). Elle produit de la lumière et de l’énergie par oxydation de son substrat, une coelenterazine, molécule perméable aux cellules et non-toxique. L’énergie peut être transmise par résonance à une autre protéine de type GFP existant chez Renilla reniformis, la Renilla GFP, qui entre alors dans un état excité. Ce transfert d’énergie bioluminescente par résonance est régi par les principes du RET quant au recouvrement spectral, à l’orientation des dipôles et à la distance entre les partenaires.

Nom Ex (nm) Em (nm)Brillance relative

(% de EGFP)Structure

quaternaire

mOrange 548 562 146 Monomère

dTomato 554 581 142 Dimer

DsRed 558 583 176 Tétramère

DsRed2 563 582 72 Tétramère

DsRed-Express 555 584 58 Tétramère

DsRed-monomer 556 586 10 Monomère

mRuby 558 605 117 Monomère

mApple 568 592 109 Monomère

mStrawberry 574 596 78 Monomère

mRFP1 584 607 37 Monomère

mCherry 587 610 47 Monomère

mRaspberry 598 625 38 Monomère



Figure 24 : Structure de la luciférase de Renilla reniformis. Structure de la luciférase de Renilla reniformis en présence de coelenterazine (figure d’après PBD 2PSJ).

Le premier couple donneur/accepteur développé a donné naissance au BRET de première génération, le BRET1. L’enzyme Rluc et son substrat, la coelenterazine h, sont utilisés comme donneur d’énergie et la EYFP comme accepteur d’énergie (Figure 25 A). Les spectres d’émission de ces deux partenaires, 480 nm et 530 nm respectivement, sont assez proches ce qui génère, comme dans le cas du FRET, une contamination importante par les photons émis par le donneur dans le filtre captant les photons émis par l’accepteur. Pour pallier ce problème, l’entreprise Packard a développé un nouveau substrat et un nouvel accepteur créant ainsi une deuxième génération de BRET, le BRET2. La nouvelle coelenterazine, la coelenterazine 400a aussi appelée DeepBlueC (DBC), permet de décaler le pic d’émission de la Rluc à 400 nm. Les protéines fluorescentes GFP10 ou GFP2, dérivées de la GFP, possèdent un pic d’absorption à 400 nm et un pic d’émission à 510 nm et ont été spécialement développées pour être utilisées comme accepteuses d’énergie, Le recouvrement spectral du couple Rluc-DBC/GFP2 permet un bon transfert d’énergie tout en permettant une très bonne séparation des pics d’émission (Figure 25 B). Grâce à ce nouveau couple, le BRET2 est ainsi beaucoup plus sensible puisque le bruit de fond est quasiment inexistant, permettant la détection de très faibles signaux RET.

L’utilisation de la coelenterazine 400a permet au BRET2 d’avoir une meilleure résolution spectrale par rapport au BRET1 mais diminue fortement l’intensité de luminescence émise par la Rluc, nécessitant souvent la surexpression importante des partenaires fusionnés à la Rluc et reléguant l’utilisation du BRET2 au second plan. Pour pallier à ce problème, dans les années 2000, le Dr. Gambhir et son équipe ont généré par mutations aléatoires des protéines dérivées de la RLuc afin d’en améliorer les propriétés spectrales. Ils ont ainsi obtenu différentes protéines dont deux se distinguent : la Rluc-M obtenue après 2 mutations dans la Rluc native, et la Rluc8, obtenue après 8 mutations au sein de la Rluc native, présentent une intensité de luminescence respectivement 20 et 30 fois supérieure en présence de coelenterazine 400a à celle de la Rluc native sans modification des longueurs d’ondes d’absorption et d’émission [195, 196]. La Rluc8 est également très stable et permet ainsi l’enregistrement de signaux BRET pendant un temps plus long. Du fait de ces optimisations, le nouveau BRET2 représente un outil de choix pour mesurer des interactions inter-protéiques mais également des réarrangements structuraux intra-protéiques, c’est pourquoi nous l’avons utilisé dans ce travail de thèse.

Coelenterazine



Figure 25 : Propriétés spectrales du BRET1 et du BRET2. Les différences majeures entre les deux configurations BRET, BRET1 (A) et BRET2 (B), sont les substrats utilisés (coelenterazine h pour le BRET1, coelenterazine 400a pour le BRET2) ainsi que le type de protéine fluorescente utilisée comme accepteur d’énergie (YFP dans le cas du BRET1 et GFP2 dans le cas du BRET2). La différence entre la Rluc et la Rluc8 vient de mutations permettant d’augmenter l’intensité de luminescence de la Rluc8 comparée à la Rluc (D’après [197]).

Initialement, le BRET1 et le premier BRET2 n’étaient pas suffisamment sensibles pour permettre l’imagerie des signaux BRET dans les cellules en microscopie du fait de la faible intensité des photons émis par la luciférase. L’optimisation des couples donneur/accepteur d’énergie, en termes d’intensité et de contraste, associée au développement de nouveaux appareils de détection beaucoup plus sensibles utilisant notamment un dispositif à transfert de charge refroidi (CCCD/cooled charge-coupled device) a permis d’étendre l’utilisation du BRET2 à la visualisation des interactions protéiques en cellules vivantes mais également in situ chez le petit animal [196, 198-200].

Comparé au FRET et au BRET1, le BRET2 utilisant la Rluc8, et la coelenterazine 400a, en donneur d’énergie et la GFP2 en accepteur d’énergie présente donc de nets avantages, en termes de résolution spectrale, de sensibilité et de spécificité et peut en plus être utilisé in vivo, c’est pourquoi nous avons choisi d’utiliser cette technologie pour le développement de notre outil de mesure de l’activité des PI3K.

3. Applications du FRET et du BRET

Les techniques basées sur le RET sont aujourd’hui largement utilisées pour suivre en temps réel l’activité biologique d’une cellule. En effet, les signalisations intracellulaires sont caractérisées par une multitude d’interactions protéiques, par l’association ou la dissociation de partenaires ainsi que par des réarrangements structuraux des protéines.

Des senseurs basés sur le FRET ont été générés pour étudier en cellules vivantes la localisation spatio-temporelle de certaines protéines. Nous pouvons citer par exemple les senseurs de la protéine Akt (voir Chapitre 1. III. D.) ou les sondes mesurant l’activité des petites GTPases des familles Ras, nommées Raichu [201], et Rho, nommées Raichu-Rac et

YFPRluc

528 nm480 nm

Coelenterazine h

BRET1

GFP2Rluc8

510 nm400 nm

Coelenterazine 400a

BRET2A B



Raichu-cdc42 [202]. Ces dernières sont constituées de la protéine Ras, Rac ou cdc42 respectivement fusionnées au domaine d’interaction RBD (Ras binding domain) ou CRIB (cdc42 and Rac interactive binding domain) de leur protéines effectrices principales Raf ou PAK respectivement et à un donneur et un accepteur d’énergie FRET (Figure 26 A).

La technologie du RET est également très utilisée pour étudier les mécanismes d’activation et de signalisation associés aux récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) [203] et aux récepteurs à activité tyrosine kinase [204], ce qui a permis de vérifier et développer le concept d’agonisme biaisé ou sélectivité fonctionnelle des ligands [205]. En effet, elle a permis de mettre en évidence les subtilités de fonctionnement des RCPG [206], en termes d’oligomérisation des récepteurs [207] et de réarrangements conformationnels induits par la liaison de ligand au récepteur [208, 209], et d’étudier l’activité spatio-temporelle de protéines intracellulaires et de seconds messagers, tels que les protéines G hétérotrimériques [210]

(Figure 26 B), les -arrestines [211], les effecteurs de l’AMPc, PKA (protéine kinase A) [212, 213] et EPAC (Exchange Protein Directly Activated by cAMP) [212, 214] (Figure 26 C) et bien d’autres. Il est même possible de sonder les flux calciques intracellulaires [215]. L’utilisation de tels senseurs a permis par exemple de mettre en évidence les spécificités de couplage des RCPG à certaines isoformes de protéines G hétérotrimériques [210] ou de révéler la compartimentation de la production intracellulaire d’AMPc dans des cardiomyocytes isolés [216].

Figure 26 : Principe de quelques biosenseurs FRET et BRET. A) Senseur FRET Raichu des petites GTPases de la famille Rho (D’après [202]). B) Senseur BRET2 des protéines G hétérotrimériques (D’après [210]). C) Senseur FRET de la protéine EPAC (D’après [217]).

Les sous-unités de PI3K ont déjà été fusionnées à des donneurs et accepteurs FRET [174]. Dans cette étude, Brock et collègues ont mesuré le transfert d’énergie basal entre le donneur et l’accepteur mais n’ont pas utilisé ces senseurs pour mesurer l’activité de la PI3K après stimulation ce qui parait surprenant. Il est possible que la résolution du FRET dans cette étude ne fut pas suffisante pour visualiser l’activité des PI3K en cellules vivantes. Dans le présent travail, nous avons souhaité utiliser la technologie basée sur le BRET2 afin d’étudier l’activité des PI3K. En effet, comme nous l’avons expliqué précédemment, le BRET2 présente de grands avantages comparés au FRET ou au BRET1, notamment une meilleure résolution

GFP10

Rluc8

GFP10

Rluc8

BRET2

C

A

B

FRET

GTP



spectrale qui pourrait nous permettre normalement de distinguer des réarrangements structuraux au sein du dimère de PI3K qui ne seraient pas visibles/détectables en FRET.

III. MATERIELS ET METHODES

Matériels

N-formylméthionine-leucyl-phénylalanine (fMLP), L-(−)-noradrénaline, et ADP ont été achetés chez Sigma-Aldrich. La coelenterazine 400a et la coelenterazine h proviennent de chez Interchim.

Vecteurs d’expression

Les plasmides codant pour les isoformes Homo sapiens p110, Homo sapiens p101 et Mus musculus p87, nous ont été généreusement fournis par le Dr. Patrick Raynal (Université de Toulouse III, France) et le Dr. Matthias Wymann (Université de Bâle, Suisse) respectivement. Les trois ADNc ont été insérés en phase dans les plasmides pGFP2-N ou pGFP2-C (PerkinElmer) pour une insertion de l’accepteur d’énergie GFP2 en position C-terminale ou N-terminale des différentes protéines, ou bien dans le plasmide pRluc8-N (PerkinElmer) pour une insertion du donneur d’énergie Rluc8 en position C-terminale, et dans le plasmide pcDNA3.1-Rluc8 pour une insertion du donneur d’énergie en position N-terminale. Les constructions finales ont été vérifiées par séquençage.

Le vecteur d’expression codant pour le récepteur du fMLP humain (fMLPR) étiqueté HA en position N-terminale a été acheté chez UMR cDNA Resource Center. Les vecteurs

d’expression des protéines humaines Gi1 non étiquetée ou étiquetée Rluc8, G2 non étiquetée

ou étiquetée GFP10 et G1 non étiquetée ont été décrits précédemment [210]. Les récepteurs humains S1P1R, P2Y12 et les vecteurs codant pour les protéines humaines H-Ras et H-RasG12V nous ont été généreusement fournis respectivement par les Dr. Véronique Pons, Armelle Yart et Véronique Gigoux de l’Université de Toulouse.

Culture cellulaire et transfection

Les cellules HEK293T (Human Embryonic Kidney 293T cells) sont cultivées en DMEM Glutamax supplémenté avec 10 % de SVF et 100 U/ml de pénicilline/streptomycine à 37 °C dans une atmosphère humide contenant 5 % de CO2. Les transfections transitoires sont effectuées vingt-quatre heures après ensemencement en utilisant du polyéthylénimine (PEI, Polysciences Inc.) selon le protocole du fournisseur. Les expériences de BRET et d’immunofluorescence sont réalisées quarante-huit heures après transfection.

Immunofluorescence

Les cellules HEK293T sont ensemencées et transfectées en plaques 6 puits contenant des lamelles de verres préalablement traitées avec de la poly-L-lysine (1 mg/ml, Sigma). Quarante-huit heures après transfection, les cellules sont rincées deux fois au PBS, fixées 15 minutes avec du paraformaldéhyde 4 %, bloquées en PBS-0.3 % BSA et incubées sur la nuit à 4°C avec un anticorps anti-Renilla luciferase (MAB4410, Merck Millipore) ou 1h à température ambiante avec un anticorps anti-HA (clone 16B12, Covance) produits chez la souris. L’immuno-



réactivité est révélée en utilisant un anticorps secondaire anti-souris produit chez la chèvre et couplé Texas-Red (T6390, Life Technology). Les noyaux sont marqués au DAPI (Sigma). Les images sont obtenues en utilisant un microscope à fluorescence (Carl Zeiss, Jena, Allemagne) et collectées avec le logiciel AxioVision Rel. 4.8.

Transfert d’énergie bioluminescente par résonance (BRET)

Les différents plasmides d’intérêt sont transfectés dans les cellules HEK293T comme indiqué dans les légendes des figures. Quarante-huit heures plus tard, les cellules sont rincées au PBS et reprises dans une solution de PBS-0.1 % glucose à température ambiante. Les cellules sont ensuite distribuées (80 µg de protéines par puits) dans des plaques 96 puits (Wallac, PerkinElmer Life and Analytical Sciences) et incubées en présence des différents ligands ou du véhicule pendant les temps indiqués dans les figures. Le transfert d’énergie BRET entre la RLuc8 et la GFP2 est mesuré après l’addition du substrat de la Rluc8, la coelenterazine 400a, à une concentration finale de 5 µM (Interchim). Les signaux BRET sont collectés immédiatement après l’ajout du substrat en utilisant un appareil Infinite F500 modifié (Tecan Group Ltd.) et calculés comme le ratio de la fluorescence émise par la GFP2 (510 nm) sur la luminescence émise par la Rluc8 (420 nm).

Pour les expériences de saturation, une concentration fixe de protéines étiquetées avec le donneur d’énergie Rluc8 est transfectée en présence de concentrations croissantes de protéines fusionnées à l’accepteur d’énergie GFP2. Le niveau d’expression de chaque protéine étiquetée est déterminé par la mesure de la fluorescence et de la luminescence totale des cellules transfectées. La fluorescence totale est d’abord mesurée via un filtre d’excitation à 400 nm et un filtre d’émission à 510 nm. Le même échantillon est ensuite incubé 8 min avec 5 µM de coelenterazine h (Interchim) et la luminescence totale est mesurée en utilisant un Infinite F500 modifié (Tecan Group Ltd).

Analyses statistiques

L’ensemble des résultats sont présentés sous la forme de moyennes ± erreur standard à la moyenne (s.e.m.) d’au moins 3 expériences indépendantes. Les tests statistiques sont réalisés avec le logiciel GraphPad Prism version 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) comme indiqué dans la légende des figures. La valeur P<0.05 a été retenue comme seuil minimal de significativité.

IV. RESULTATS

A. Construction des sondes BRET² de PI3K

Pour générer des biosenseurs BRET mesurant l’activité de la PI3K, il nous a fallu fusionner les séquences ADNc codant pour les donneurs et accepteurs d’énergie BRET, respectivement la Rluc8 et la GFP2, aux ADNc codants pour les isoformes des sous-unités

catalytiques (p110) et régulatrices (p101 ou p87) de PI3K. Nous avons choisi de fusionner les sondes d’énergie BRET indifféremment en position N-terminale ou C-terminale de chaque sous-unité. Ce choix a été fait pour trois raisons : i/ il est plus aisé de fusionner des étiquettes



protéiques aux extrémités d’une protéine d’intérêt plutôt qu’au sein même de sa séquence, auquel cas les risques d’altération de la fonction de la protéine finale sont souvent plus importants ; ii/ la fusion de différents types d’étiquettes, notamment des fluorophores qui sont des protéines d’environ une trentaine de kDa, aux extrémités N- et C-terminales des différentes

sous-unités de PI3K a déjà été réalisée et validée pour l’étude de ces protéines [84, 174] ; iii/

nous n’avons aucune idée des arrangements moléculaires adoptés par les dimères p110/p87,

d’une part, et p110/p101, d’autre part, à l’état basal comme à l’état actif, étant donné qu’il n’existe aucun cristal de ces différents dimères. Il n’y a donc pas de logique à étiqueter un couple de sous-unité PI3K plus en N- qu’en C-terminal.

Pour fusionner le donneur et l’accepteur d’énergie aux sous-unités de PI3K, nous avons

amplifié les séquences codantes des sous-unités p110, p87 et p101 par PCR en utilisant des amorces sens et anti-sens contenant les sites de restriction enzymatiques spécifiques au vecteur de clonage dans lequel elles seront insérées. Une fois amplifiées, les séquences

codantes des différentes sous-unités des PI3K ont été insérées dans le site multiple de clonage de différents vecteurs (Tableau 4) qui sont : pGFP2-N ou pGFP2-C pour une fusion des protéines avec l’accepteur d’énergie en position C-terminale et N-terminale respectivement, le vecteur pRluc8-N pour une fusion avec le donneur d’énergie en position C-terminale, et le vecteur pcDNA3.1-Rluc8, que j’ai préalablement construit en insérant la séquence codante de la Rluc8 délétée de son codon STOP dans un plasmide pcDNA3.1, pour une fusion avec le donneur d’énergie en position N-terminale. A titre d’exemple, la Figure 27 représente les cartes

des plasmides provenant du clonage de la p110 dans pGFP2-C3 et pRluc8-N1 (Figure 27).

Nous avons ainsi obtenu au total 9 constructions : p110-Rluc8, p110-GFP2, GFP2-p110, p87-Rluc8, Rluc8-p87, p87-GFP2, GFP2-p87, p101-GFP2 et GFP2-p101 (Figure 28 A-C). Par manque de temps, nous ne sommes pas parvenus à construire les protéines de fusion

Rluc8-p110Rluc8-p101 et p101-Rluc8. Les 9 constructions obtenues permettent de tester 8 combinaisons de biosenseurs BRET en associant les différentes constructions de la sous-unité

catalytique p110 aux constructions de sous-unités p87 ou p101 dont les partenaires BRET

sont complémentaires : p110-Rluc8/p87-GFP2, p110-Rluc8/GFP2-p87, p110-GFP2/p87-

Rluc8, GFP2-p110/p87-Rluc8, p110-GFP2/Rluc8-p87, GFP2-p110/Rluc8-p87, p110-

Rluc8/p101-GFP2 et p110-Rluc8/GFP2-p101, (Figure 28 D).



Tableau 4 : Résumé des conditions utilisées pour les constructions des fusions. Amorces sens (PS) et anti-sens (PAS) : en bleu sont indiquées les bases correspondant aux sites de restriction enzymatiques utilisés. En vert sont indiquées les séquences KOZAK ajoutées pour diriger la traduction à partir de

l’ATG. En rouge sont indiquées les bases complémentaires des gènes codant pour Rluc8, p110, p87 ou p101 (18 bases minimum) avec ou sans le codon STOP (en gras) selon que la fusion est respectivement en N-terminal ou C-terminal du gène.

Figure 27 : Exemples de cartes vectorielles de constructions BRET.

Schémas des cartes vectorielles de deux de nos constructions : GFP2-p110 (A) et p110-Rluc8 (B). pCMV : promoteur cytomegalovirus, Kan/neo R ou zeo R : gènes de résistance à la kanamycine/néomycine ou zeocine.

Construction Amorces

Sites de

restriction

5’ et 3’

Vecteur de clonage

pcDNA3.1-Rluc8PS : GGA AGA TGG CTA GCG GCC GCC ACC ATG GCT TCC AAG GTG TACPAS : TAT TAT GGT ACC CTG CTC GTT CTT CAG CAC

Nhe I / Kpn I pcDNA3.1 (+)

p110-Rluc8PS : CCT CGA GGG GCC GCC ACC ATG GAG CTG GAG AAC TATPAS : GGG GTA CCC GGC TGA ATG TTT CTC TCC TTG

Xho I / Kpn I pRluc8-N1

p110-GFP2PS : CCG CTC GAG GCC GCC ACC ATG GAG CTG GAG AAC TAT

PAS : GGG TAC CCC GGC TGA ATG TTT CTC TCC TTGXho I / Kpn I pGFP2-N1

GFP2-p110PS : GGA TAT CGC TCG AGT TCA GCC GGA GGA ATG GAG CTG GAG AAC

TAT AAA CAGPAS : CCT TAT GCC CGC GGT TTA GGC TGA ATG TTT CTC TCC TTG

Xho I / Sac II pGFP2-C3

p87-Rluc8PS : CCA AGC TTG GCC GCC ACC ATG GAG AGC TCA GAT GTG

PAS : GGG GTA CCC TTG GAT GAT GCC AGA GAA TGT GTTHind III / Kpn I pRluc8-N1

Rluc8-p87PS : GGA TAT CGC TCG AGT TCA GCC GGA GGA ATG GAG AGC TCA GAT

GTGPAS : CCT TAT GGG TTT AAA CGG TTA TTG GAT GAT GCC AGA GAA

Xho I / Pme I pcDNA3.1-Rluc8

p87-GFP2PS : CCC AAG CTT GCC GCC ACC ATG GAG AGC TCA GAT GTG GAG

PAS : GGG TAC CCC TTG GAT GAT GCC AGA GAA TGT GHind III / Kpn I pGFP2-N1

GFP2-p87PS : GGA TAT CGC TCG AGT TCA GCC GGA GGA ATG GAG AGC TCA GAT

GTGPAS : CCT TAT GCC CGC GGT TTA TTG GAT GAT GCC AGA GAA


p101-GFP2PS : CCC AAG CTT GCC GCC ACC ATG CAG CCA GGG GCC ACGPAS : CGG AAT TCC GGG CAG AGC TCC ACT GAA AGT CAT GAT

Hind III / EcoRI pGFP2-N1

GFP2-p101PS : GGA TAT CGC TCG AGT TCA GCC GGA GGA ATG CAG CCA GGG GCCACGPAS : CCT TAT GCC CGC GGT CTA GGG CAG AGC TCC ACT GAA




Figure 28 : Représentation schématique des sous-unités p110 (A), p87 (B) et p101 (C) fusionnées aux protéines Rluc8 et GFP2 et des différentes combinaisons BRET de sous-unités catalytiques et régulatrices possibles (D).

B. Validation des constructions BRET

L’introduction de la Rluc8 ou de la GFP2 aux extrémités d’une protéine n’est pas forcément sans conséquence sur sa synthèse, sa maturation ou sa fonction ; il est donc important de vérifier que la protéine chimérique a bien conservé les propriétés de la protéine native. Pour ce faire, nous pouvons vérifier l’expression intracellulaire de nos constructions mais également mesurer l‘activité catalytique des dimères de PI3K via l’utilisation des méthodes classiques de mesure de son activité (incorporation de 32P lors de la production de PI3,4,5P3 ou western blot pour vérifier la phosphorylation d’Akt (voir Chapitre 1. III. D.)). Ces méthodes sont assez lourdes et coûteuses et nous ne les maîtrisons pas totalement au

laboratoire. Comme l’ajout d’étiquettes protéiques aux extrémités des sous-unités de PI3K a déjà été montré comme n’altérant pas la fonction catalytique de l’enzyme [84, 174], nous avons

p110

N-term

Rluc8

C-term

p110

N-term

p87

C-term

p87

N-term C-term

p87

p87

p101

N-term C-term

p101

A

B

C

p110 GFP2

N-term C-termp110-Rluc8

p110-GFP2 GFP2-p110

p87-Rluc8

p87-GFP2 GFP2-p87

RLuc8-p87

GFP2-p101

p101-GFP2

p110

p87

p110

p87

p110

p101

p110

p101

p87

p110

p87

p110

p87

p110

p87

p110

Combinaison 1 Combinaison 2




DRluc8

GFP2

Rluc8

GFP2

Rluc8

GFP2

GFP2

Rluc8

Rluc8

Rluc8Rluc8

Rluc8

GFP2

GFP2 GFP2

GFP2

GFP2

GFP2

GFP2

Rluc8

GFP2

Rluc8

GFP2



estimé que, dans un premier temps, l’observation de l’expression intracellulaire des constructions serait suffisante. Pour cela, nous avons transfecté transitoirement des cellules

HEK293T avec les plasmides codant pour les constructions BRET des sous-unités p110, p87 et p101 seules ou en présence de leurs sous-unités complémentaires. L’observation de leur expression intracellulaire, dont quelques exemples sont présentés Figure 29, a été réalisée par immunofluorescence en utilisant un anticorps primaire dirigé contre la luciférase (rouge) ou en excitant directement la GFP2 (vert) (Figure 29). Nos résultats montrent que l'ensemble des

sous-unités p110, p87 et p101 fusionnées aux partenaires BRET transfectées seules (Figure 29 A) ou en présence de leur sous-unité complémentaire (Figure 29 B) est bien exprimé et présente une localisation diffuse dans le cytosol. Ces résultats sont en accord avec la littérature présentant les dimères de sous-unités catalytiques et régulatrices inactifs exprimés au niveau du cytosol [84, 174] et indiquent que la fusion des partenaires BRET aux différentes sous-unités n’altère pas leur localisation intracellulaire lorsqu’elles sont transfectées dans des cellules HEK293T.

Figure 29 : Expression et localisation intracellulaire des constructions BRET des sous -unités

p110, p87 et p101.

A-B) Observation par immunofluorescence des constructions BRET des sous-unités p110, p87 ou p101 fusionnées à la Rluc8 (rouge) ou à la GFP2 (vert) et transfectées transitoirement dans les cellules HEK293T. Les différentes sous-unités sont exprimées seules (A) ou co-transfectées avec la sous-unité étiquetée complémentaire (B). Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu).

C. Mesures des interactions entre les sous-unités catalytiques et

régulatrices de PI3K par BRET en condition basale

Une fois l‘expression intracellulaire des constructions BRET des sous-unités de PI3K vérifiée, nous nous sommes intéressé aux interactions entre les différentes sous-unités catalytiques et régulatrices à proprement parler et donc aux mesures de transfert d’énergie par résonance. Dans un premier temps nous avons mesuré le transfert d’énergie BRET, aussi appelé signal BRET ou ratio BRET (voir Chapitre 2. II. A.), à l’état basal dans des cellules HEK293T transfectées avec les différentes combinaisons de donneurs et d’accepteurs que nous

p87-GFP2

p101-GFP2

p110-GFP2p110-Rluc8

p87-Rluc8 GFP2-p87

GFP2-p110

GFP2-p101

A B p110-Rluc8 p87-GFP2 Merge

p110-Rluc8 p101-GFP2

Merge

Merge

p87-Rluc8 p110-GFP2

+

+

+



avons générées et présentées Figure 28 D. Le signal BRET est calculé comme le ratio BRET : rapport entre la fluorescence émise par la GFP2 (510 nm) et la luminescence émise par la Rluc8 (420 nm). Afin de déterminer l'existence d'un transfert d’énergie par résonance réel entre les différents couples de biosenseurs BRET à l’état basal, nous calculons le "Net BRET" (Figure 30). Le Net BRET correspond au ratio BRET mesuré dans des conditions expérimentales où le donneur (Rluc8) et l’accepteur (GFP2) d'énergie BRET sont co-transfectés dans les cellules (condition 1), auquel nous retranchons le ratio BRET mesuré dans des cellules uniquement transfectées avec le donneur d’énergie Rluc8 (condition 2). Le ratio mesuré dans cette dernière condition correspond en fait à la contamination du filtre intégrant l’émission de fluorescence de la GFP2 par les photons émis par la Rluc8 et dépend bien sûr des filtres et de l'appareil utilisés pour les mesures. Dans nos expériences, ce ratio BRET est d’environ 0,04.

Figure 30 : Schéma explicatif du calcul du Net BRET. Le Net BRET correspond à la différence entre le ratio BRET mesuré dans la condition 1, en présence du donneur et

de l’accepteur d’énergie (exemple de p110-Rluc8 et p87-GFP2), et le ratio BRET mesuré dans la condition 2, en présence du donneur d’énergie exprimé seul.

Nous avons d’abord mesuré le Net BRET de deux couples, p110-Rluc8/p87-GFP2 et

p110-Rluc8/p101-GFP2, en transfectant une quantité croissante de vecteurs codant pour la

p110-Rluc8 en présence d’une quantité saturante de vecteurs codant pour la sous-unité régulatrice fusionnée GFP2 afin de vérifier l’impact du niveau de luminescence, reflétant l’expression relative de la sous-unité étiquetée avec le donneur d’énergie, sur le transfert d’énergie par résonance (Figure 31). Les résultats présentés Figure 31 montrent qu'il existe

un signal Net BRET entre les sous-unités p110-Rluc8 et p87-GFP2 d’une part et p110-Rluc8

et p101-GFP2 d’autre part (Figure 31 A). Les sous-unités catalytiques et régulatrices de PI3K testées par ces couples semblent donc interagir à l’état basal. Ce résultat est en accord avec la littérature décrivant une interaction constitutive entre les sous-unités catalytiques et régulatrices en absence de stimulation (voir Chapitre 1. III. A.). L’intensité du transfert d’énergie est spécifique à chaque couple régulatrice/catalytique (R/C) testé et n’est pas dépendante de l’expression relative de la sous-unité étiquetée Rluc8 reflétée par l’intensité de luminescence (Figure 31 B). Plusieurs hypothèses peuvent être émises pour expliquer les différences des intensités de Net BRET entre les deux couples. La première hypothèse est qu’elles sont simplement dues à une plus grande proximité entre les sous-unités R et C pour le

couple p110/p87 comparé au couple p110/p101. La deuxième hypothèse s’appuie sur les

p110-Rluc8

p87-GFP2

l émission (nm)

Lum

ines

cenc

e(U

.A.)

GFP2Rluc8

la lbl émission (nm)

Lum

ines

cen

ce(U

.A.)

GFP2Rluc8

la lb

p110-Rluc8

Net BRET = Ratio BRETcondition 1

Ratio BRETcondition 2-



paramètres influant sur la qualité du transfert d’énergie. En effet, la qualité du transfert d’énergie dépend également, outre la distance entre les partenaires BRET, de l’orientation respective de leurs dipôles (voir Chapitre 2. II. A.). Ainsi, la différence d’intensité des Net BRET

peut provenir d’une conformation différente adoptée par les dimères p110/p87 et

p110/p101 modifiant la distance et/ou l’orientation des dipôles des sondes BRET qui leur sont fusionnées. En effet, deux couples de protéines peuvent interagir et présenter des distances similaires entre le donneur et l'accepteur d'énergie et présenter cependant des orientations de dipôles plus ou moins permissives au transfert d'énergie entrainant des signaux BRET différents pour les deux couples. Nous ne pouvons conclure quant à la véracité de l’une ou l’autre des hypothèses à ce stade des expérimentations.

Figure 31 : Mesure du Net BRET basal entre les couples p110-Rluc8/p87-GFP2 et p110-Rluc8/p101-GFP2.

Les cellules HEK293T sont co-transfectées transitoirement en présence de la sous-unité p110 fusionnée à la Rluc8 et de la sous-unité p87 ou p101 fusionnée à la GFP2. A) Le Net BRET est mesuré à l’état basal et calculé en

retranchant le ratio BRET mesuré en présence de la sous-unité p110-Rluc8 seule. B) Niveaux d’expression

relative de p110-Rluc8 correspondant à l’émission de luminescence mesurée à l’état basal. Données provenant de 3 expériences indépendantes dont les résultats sont représentés sous forme des moyennes ± s.e.m.

Nous avons ensuite mesuré les valeurs de Net BRET pour les 8 combinaisons des sondes

BRET R/C possibles de PI3K dans le but de définir les paires de biosenseurs qui permettraient d’obtenir un transfert d’énergie par résonance optimal à l’état basal (Figure 32). Nous avons mesuré le Net BRET dans des cellules co-transfectées avec une quantité saturante de la protéine fusionnée à l’accepteur d’énergie et une quantité fixe de la sous-unité fusionnée au donneur d’énergie, choisie de façon à obtenir un niveau de luminescence similaire pour chaque combinaison. En effet, même si pour les deux couples présentés ci-dessus le niveau de luminescence n’influe pas sur la valeur du Net BRET, nous ne pouvons exclure que d’autres combinaisons y soient sensibles. La comparaison des Net BRET entre les différentes combinaisons R/C, ne pourra être envisageable que s’ils sont mesurés dans des conditions d'expression relative du donneur (luminescence de la Rluc8) et de l'accepteur (fluorescence de la GFP2) proches. Les résultats présentés Figure 32 montrent que les 8 combinaisons de

biosenseurs BRET p110/p87 et p110/p101 des PI3K permettent de détecter un Net BRET

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

p110-Rluc8 / p87-GFP2


Quantité de plasmides codant pourla sous-unité fusionnée Rluc8 (µg)

Net

BR

ET

0

50 000

100 000

150 000p110-Rluc8 / p101-GFP2


Quantité de plasmides codant pourla sous-unité fusionnée Rluc8 (µg)

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

s

pro

téin

es

fu

sio

nn

ée

s R

luc

8 (

U.A

.)A B

p110-Rluc8

P87 GFP2 / p101 GFP2



différent de zéro à l'état basal (Figure 32 A). Les Net BRET sont mesurés dans des cellules exprimant des quantités similaires de protéines fusionnées au donneur d’énergie vérifiées par la mesure de la luminescence (Figure 32 B). Nous voyons que chaque couple de biosenseurs

mesurant le dimère p110/p87, p110-Rluc8/p87-GFP2, p110-Rluc8/GFP2-p87, p87-

Rluc8/p110-GFP2, p87-Rluc8/GFP2-p110 Rluc8-p87/p110-GFP2, Rluc8-p87/GFP2-p110, présente des valeurs de Net BRET très différentes. En revanche, les dimères constitués de

p110 et de la régulatrice p101, p110-Rluc8/p101-GFP2 et p110-Rluc8/GFP2-p101, présentent des valeurs de Net BRET similaires. Comme nous l’avons expliqué pour la Figure 31, les valeurs de Net BRET sont dépendantes à la fois de l’interaction effective entre les deux sous-unités mais également de la conformation qu’adoptent les deux sous-unités au sein du dimère entrainant une distance et une orientation des dipôles d’émission du donneur et d’absorption de l’accepteur BRET plus ou moins permissive à un transfert d’énergie par résonance. Ainsi, ces résultats montrent que nous sommes capables, quelle que soit la position

des partenaires BRET, de mesurer une interaction basale entre les sous-unités p110/p87,

d’une part, et p110/p101, d’autre part, ce qui est en accord avec la littérature. Cependant, dans nos conditions expérimentales, le signal BRET mesuré ne permet pas de déterminer la localisation des interactions R/C. En effet, nous mesurons des signaux provenant de l'ensemble des compartiments cellulaires membranaires et cytosoliques. Au-delà, ces résultats soulèvent également l’importance de tester toutes les orientations possibles de biosenseurs BRET en termes de fusion des partenaires BRET aux extrémités N- ou C-terminales de chaque protéine, de façon à tenir compte des structures tridimensionnelles des protéines issues des différentes combinaisons de couples R/C.

Figure 32 : Mesure du BRET basal pour les 8 possibilités de couples de PI3K.

A) Les cellules HEK293T sont co-transfectées transitoirement avec la sous-unité catalytique p110 fusionnée en position N- ou C-terminale et une des sous-unités régulatrices, p87 ou p101, fusionnée en N- ou en C-terminale, de façon complémentaire entre le donneur et l’accepteur d’énergie. Les quantités de plasmides transfectées sont celles que l’on sait correspondre à la saturation du donneur par l’accepteur. Les Net BRET sont mesurés en condition basale et correspondent à la différence entre le ratio BRET mesuré entre la Rluc8 et la GFP2 et le ratio BRET mesuré en présence du donneur d’énergie exprimé seul. Les valeurs moyennes de Net BRET sont reportées au-dessus de chaque barre. B) Niveaux d’expression relative des sous-unités fusionnées à la Rluc8 correspondant à l’émission de luminescence mesurée en condition basale. Données provenant de 3 expériences indépendantes dont les résultats sont représentés sous forme des moyennes ± s.e.m. La significativité des différences entre les Net BRET, d’une part, et les luminescences, d’autre part, mesurés pour chaque combinaison à l’état basal, est analysée par une ANOVA à une voie suivie d’un test de Tukey ($$P<0.05, $$$P<0.001, ns : non significatif).

Les mesures de Net BRET basal effectuées dans les expériences précédentes ont été réalisées en présence d’une quantité fixe saturante d’accepteur d’énergie afin de maximiser nos chances de détection d’un signal BRET, ce qui a été le cas pour toutes les interactions R/C

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4p110-Rluc8 / p87-GFP2

p110-Rluc8 / GFP2-p87





Rluc8-p87 / p110-GFP2

Rluc8-p87 / GFP2-p110

$$$

ns

$$$

$$$

$$$

0,012

0,15

0,0610,056 0,062

0,145

0,021

0,29

Net

BR

ET

0

50 000

100 000

150 000ns

$

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

s

pro

téin

es

fu

sio

nn

ée

s R

luc

8 (

U.A

.)

A B



testées. Il nous a fallu ensuite vérifier si les interactions observées étaient bien spécifiques de l’interaction de nos deux protéines et non le reflet d’interactions aléatoires, ou collisionnelles. Pour cela, nous avons réalisé des expériences de saturation BRET. Ces expériences consistent à transfecter les cellules avec une quantité fixe de protéines fusionnées au donneur d’énergie en présence d’une quantité croissante de protéines fusionnées à l’accepteur d’énergie (Figure 33). Dans le cas d'une interaction spécifique, il arrivera un moment où toutes les protéines donneuses d’énergie seront en interaction avec une protéine accepteuse d’énergie et seront ainsi saturées, donnant lieu à une courbe de saturation du signal BRET (Axe Y) en fonction de l'expression relative du donneur sur l'accepteur d'énergie (Axe X) (Figure 33 B, courbe verte). Le plateau de la courbe de saturation correspond au transfert d’énergie maximum, appelé BRETmax. Cette courbe apporte une information supplémentaire en termes d’affinité des interactions entre les deux partenaires BRET. En effet, la valeur de BRET50 représente l’affinité relative des partenaires et correspond au ratio d'expression relative de l'accepteur (fluorescence GFP2) sur le donneur d'énergie (luminescence Rluc8) permettant d’obtenir 50 % du BRETmax (Figure 33 B). Par opposition, en cas d’interaction non spécifique, les courbes sont généralement linéaires, et le BRETmax n’est jamais atteint car l’affinité relative des partenaires est si faible que la valeur de BRET50 est bien supérieure à celle d’une interaction spécifique, et en général jamais atteinte non plus (Figure 33 B, courbe rouge).

Figure 33 : Schéma explicatif des courbes de saturation BRET .

A) Schéma représentatif du transfert d’énergie entre un des couples possibles de biosenseur de PI3K, p110-Rluc8/p87-GFP2. B) Schéma représentatif de courbes de saturation BRET reflétant une interaction spécifique (courbe verte) ou non spécifique (courbe rouge) en présence d’une quantité fixe de donneur d’énergie Rluc8 et de quantités croissantes d’accepteur d’énergie GFP2. Le BRETmax correspond au signal BRET mesuré lorsque chaque molécule de donneur d’énergie Rluc8 interagit avec une molécule d’accepteur d’énergie GFP2 (plateau de saturation). Le BRET50 représente l’affinité relative des deux partenaires BRET et correspond à la concentration relative de l’accepteur sur le donneur d’énergie générant 50 % du signal BRET maximal.

Pour vérifier la spécificité et l’affinité relative de chaque couple p110/p87 et

p110/p101, nous avons réalisé des courbes de saturation BRET pour chacune des 8

combinaisons BRET de sous-unités catalytique/régulatrice de PI3K (Figure 34, courbes colorées). Nous avons également réalisé des courbes de saturation entre la sous-unité fusionnée à la Rluc8 et une protéine GFP2 soluble comme contrôle d’interaction non spécifique (Figure 34, courbes noires). Les résultats présentés Figure 34 montrent que toutes les paires

de biosenseurs BRET des dimères catalytique/régulatrice de PI3K testées permettent d’obtenir des courbes hyperboliques saturables à partir desquelles nous pouvons calculer des valeurs de BRETmax et de BRET50, récapitulées dans le Tableau 5. Les valeurs de BRETmax

p110-Rluc8

p87-GFP2

BRETmax

BRET50

Non spécifique

Spécifique

Fluo GFP2

Lum Rluc8

[Rluc8]

[GFP2]

Ne

t BR

ET

A

B



obtenues pour chacune des courbes, excepté pour les couples p110-Rluc8/GFP2-p87 et p87-

Rluc8/p110-GFP2 (Figure 34 B et C), sont similaires aux valeurs de signal Net BRET obtenues lors des premières mesures de signal BRET présentées Figure 32 en présence d'une concentration maximale d'accepteur d'énergie. Les disparités observées pour les deux couples que je viens de citer signifient que nous ne nous trouvions pas en présence d’une quantité d’accepteur d’énergie suffisante pour saturer le donneur Rluc8 lors de ces premières

expériences. Dans le cas des couples p110-Rluc8/p87-GFP2 et p87-Rluc8/p110-GFP2 (Figure 34 A et C), nous n’atteignons pas les valeurs de BRETmax calculées après analyse des courbes par le logiciel GraphPad Prism 5. Cela signifie que nous n’avons pas saturé le donneur d’énergie Rluc8 avec l’accepteur GFP2, mais par extrapolation le logiciel calcule une valeur de

BRETmax. Dans le cas du couple p110-Rluc8/p87 GFP2 (Figure 34 A), cette valeur est identique à celle obtenue lors des premières expériences de mesure du transfert d’énergie à l’état basal (Figure 32) et semble donc cohérente.

Les valeurs de BRET50 informent sur l’affinité relative des partenaires. Concernant les

dimères p110/p87 (Tableau 5), nous constatons que les paires p110-Rluc8/p87-GFP2 et

p110-Rluc8/GFP2-p87 (Figure 34 A et B) présentent un BRET50 d'environ 0,49 chacune,

reflétant une affinité relative moins bonne que les paires p87-Rluc8/GFP2-p110 et Rluc8-

p87/GFP2-p110 (Figure 34 D et F) qui permettent d'obtenir des BRET50 de l'ordre de

0,02/0,01. Dans le cas des dimères p110/p101, les deux paires testées p110-Rluc8/p101-

GFP2 et p110-Rluc8/GFP2-p101 (Figure 34 G et H) ont une très bonne affinité relative (0,01

et 0,003 respectivement) avec quand même une meilleure affinité pour le couple p110-Rluc8/GFP2-p101.



Figure 34 : Courbes de saturation BRET des 8 possibilités de couples R/C de PI3K.

A-H) Les cellules HEK293T sont co-transfectées transitoirement avec la sous-unité catalytique p110 fusionnée en position N- ou C-terminale en présence d’une des sous-unités régulatrices, p87 ou p101, fusionnée en N- ou en C-terminale (courbes colorées), ou d’une protéine GFP2 soluble (courbes noires), de façon complémentaire entre le donneur et l’accepteur d’énergie. Les protéines fusionnées à la Rluc8 sont transfectées à une concentration fixe et les partenaires GFP2 sont transfectés en concentrations croissantes. Les Net BRET sont mesurés en condition basale et correspondent à la différence entre le ratio BRET mesuré entre la Rluc8 et la GFP2 et le ratio BRET mesuré en présence du donneur d’énergie exprimé seul. Les valeurs de BRETmax et BRET50 sont reportées dans le Tableau 5. Données provenant de 3 expériences indépendantes. L’analyse des courbes a été réalisée par régression non linéaire à l’aide d’un modèle assumant l’existence d’un seul site de liaison.

Rluc8 p87 / p110 GFP2

0.0 0.2 0.4 0.6 0.80.00

0.01

0.02

0.03

0.04

Rluc8 p87 - p110 GFP2

Rluc8 p87 - GFP2

GFP2 fluorecence/Rluc8 luminescence (U.A.)

Net

BR

ET

p110 Rluc8 / p87 GFP2

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

p110 Rluc8 - p87 GFP2

p110 Rluc8 - GFP2


Net

BR

ET

p110 Rluc8 / GFP2 p87

0 2 4 60.00

0.05

0.10

0.15

p110 Rluc8 - GFP2

p110 Rluc8 - GFP2 p87


Net

BR

ET


0.0 0.1 0.2 0.3 0.40.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

p110 Rluc8-p101 GFP2

p110 Rluc8-GFP2


Net

BR

ET


0.0 0.1 0.2 0.3 0.40.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10


p110 Rluc8 - GFP2


Net

BR

ET

Rluc8 p87 / GFP2 p110

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Rluc8 p87 - GFP2

Rluc8 p87 - GFP2 p110


Net

BR

ET


0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.50.00

0.01

0.02

0.03

p87 Rluc8 - p110 GFP2

p87 Rluc8 - GFP2


Net

BR

ET


0.0 0.2 0.4 0.6 0.80.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25


p87 Rluc8 - GFP2


Net

BR

ET

A B

C D

E F

G H



Tableau 5 : Valeurs de BRETmax et BRET50 obtenues pour les 8 combinaisons de biosenseurs

BRET mesurant les interactions R/C des PI3K.Les valeurs de BRETmax et BRET50 sont obtenues à partir des courbes de saturation présentées Figure 34.

D. Mesures des interactions entre les sous-unités catalytiques et

régulatrices de la PI3K après stimulation de la kinase

Nous venons de démontrer que les différentes combinaisons possibles de biosenseurs

BRET des couples p110/p87 et p110/p101 interagissent spécifiquement à l’état basal bien que les différentes combinaisons présentent des propriétés de BRETmax et BRET50 propres à chaque couple testé. Aussi, pour la poursuite du travail, nous avons focalisé sur les couples de

biosenseurs p110/p87 et p110/p101 présentant de bonnes affinités relatives (p87-

Rluc8/GFP2-p110 Figure 34 D et p110-Rluc8/p101-GFP2 Figure 34 G).

Nous avons construit originellement ces senseurs BRET dans le but de sonder

l’activation des dimères R/C de PI3K qui pourrait se traduire par une modulation des signaux BRET entre les deux partenaires suite à l’application d’un stimulus. Pour cela, nous avons

choisi de stimuler les PI3K via l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G hétérotrimériques (RCPG), le fMLPR, récepteur au fMLP, largement décrit et utilisé pour

stimuler les PI3K dans des expériences in vitro [84, 174].

Dans un premier temps, nous avons vérifié que ce récepteur, transfecté dans des cellules HEK293T, était bien fonctionnel. Pour vérifier sa fonctionnalité, nous avons mesuré l’activation des protéines G hétérotrimériques qui constituent leurs effecteurs privilégiés. Pour

cela, nous disposons de biosenseurs BRET, mesurant directement l'activité des protéines G hétérotrimériques, qui ont été développés au laboratoire et permettent de mesurer en temps réel dans des cellules vivantes l’activation de la protéine G en réponse à la stimulation du

Paires BRET BRETmax BRET50

p110-Rluc8p87-GFP2

0.1320 0.4996

p110-Rluc8GFP2-p87

0.1084 0.4893

p110-Rluc8P101-GFP2

0.07741 0.01085

p110-Rluc8GFP2-p101

0.06946 0.003167

p87-Rluc8

p110-GFP20.03647 0.2424

p87-Rluc8

GFP2-p1100.1985 0.02603

Rluc8-p87

p110-GFP20.0287 0.2653

Rluc8-p87

GFP2-p1100.2804 0.01258



récepteur par un ligand agoniste (Figure 35) [210]. Ce biosenseur BRET repose sur la mesure

de l'interaction entre les sous-unités G et G des protéines G (Figure 35 A). En absence de

stimulation, le trimère de sous-unité G des protéines G est constitutivement associé. La

fusion de la sous-unité G au donneur d’énergie Rluc8 et de la sous-unité G à l’accepteur d’énergie GFP10 permet ainsi la détection d’un signal BRET basal de par la faible distance séparant les deux protéines (Figure 35 A). Lorsque le récepteur est activé par un ligand

agoniste, l’activation de la protéine G se traduit par un éloignement de la sous-unité G et du

dimère G générant une perte du signal BRET par rapport au BRET de l'état basal. L’activation de la protéine G est donc reflétée par une modulation négative du signal BRET par rapport à la condition basale (état inactif) (Figure 35 B).

Figure 35 : Schéma explicatif du fonctionnement des biosenseurs BRET mesurant directement l’activité des protéines G hétérotrimériques.

A) Schéma de l’activation des protéines G hétérotrimériques mesurée par BRET : A l’état basal, le trimère de

sous-unités G est constitutivement associé, réduisant la distance entre le donneur d’énergie Rluc8 fusionné à

la sous-unité G et l’accepteur d’énergie GFP10 fusionné à la sous-unité G. Le transfert d’énergie entre la sous-

unité G-Rluc8 et la sous-unité GFP10-G est donc important. L’activation de la protéine G induit la séparation du

dimère G de la sous-unité G et une diminution du signal BRET mesuré entre la sous-unité G et la sous-unité

G. B) Le ratio BRET mesuré à l’état basal (état inactif) est supérieur à celui mesuré à l’état actif. Un ligand agoniste induit ainsi une modulation négative du ratio BRET.

Le récepteur fMLPR est un RCPG qui active préférentiellement les protéines G

hétérotrimériques de la famille Gi [218]. Pour vérifier la fonctionnalité du récepteur, nous l’avons transfecté en quantité saturante dans des cellules HEK293T en présence des sous-

unités Gi1-Rluc8, Gi2-Rluc8 ou Gi3-Rluc8, de la sous-unité GFP10-G2 et de G1 non marquée (Figure 36). Nous avons stimulé les cellules avec deux concentrations différentes (1 µM et 10 µM) d'agoniste du récepteur, le fMLP. Les signaux BRET sont enregistrés après 1 minute de stimulation. Ce temps de stimulation est suffisant pour observer l’activation des

protéines G puisque le 1/2 d’activation des protéines G est de l’ordre de la milliseconde [219]. Les résultats présentés Figure 36 montrent que le fMLP induit une modulation négative du signal BRET à 1 µM et à 10 µM pour les trois protéines G testées, uniquement dans les conditions exprimant le récepteur au fMLP (Figure 36 B-D, panels du haut), confirmant

l’activation des protéines Gi112, Gi212 et Gi312 et la fonctionnalité du récepteur. Les deux concentrations activent chacun des trimères de protéines G avec la même efficacité maximale (Figure 36 B-D, panels du haut), mais nous ne pouvons comparer l’efficacité

d’activation entre les différentes isoformes de Gi par le fMLP car les sondes BRET sont différentes et ne peuvent être comparées en termes de qualité du transfert d’énergie.

RCPG

RCPGagoniste

Etat inactif= BRET maximum

Etat actif= BRET ↘

BRET

BasalÉtat inactif

AgonisteÉtat actif

Rat

io B

RET

Modulation négative du signal BRET par le ligand

BA



De façon intéressante, si l’on compare les ratios BRET mesurés à l’état basal entre les

sous-unités Gi-Rluc8 et GFP10-G2 (Figure 36 B-D, panels en bas à gauche), nous constatons que les ratios BRET dans les cellules transfectées avec le récepteur fMLPR sont statistiquement inférieurs aux ratios BRET mesurés dans les cellules qui n’ont pas été transfectées avec le fMLPR. Ces ratios en présence et en absence de récepteur ont été mesurés

dans des conditions expérimentales avec un niveau d’expression similaire de la sous-unité G-Rluc8 (Figure 36 B-D, panels en bas à droite) et à saturation de l’accepteur d’énergie. Une hypothèse pouvant rendre compte de cette différence de ratios BRET est que le récepteur

fMLPR possède une activité constitutive envers les protéines Gi12. En effet, un récepteur constitutivement actif induit l’activation, et donc la dissociation, de la protéine G en absence de stimulation par un ligand. La dissociation de la protéine G sera ainsi reflétée par un niveau de signal BRET diminué à l’état basal. Nous avons confirmé cette hypothèse récemment dans une étude publiée en 2015 en collaboration avec une équipe de Montpellier et dans laquelle nous montrons qu’un ratio BRET mesuré entre des biosenseurs de protéines G en présence d’un récepteur constitutivement actif est inférieur au ratio BRET mesuré en absence du récepteur

[220]. Le fMLPR présente donc une activité constitutive envers les protéines Gi112,

Gi212 et Gi312, en accord avec ce qui a déjà été décrit dans la littérature [218].



Figure 36 : Activation des hétérotrimères de protéines G, Gi112, Gi212 et Gi312, par le récepteur au fMLP.

A) Schéma représentatif de l’essai BRET mesurant l’interaction entre les sous-unités Gi1-Rluc8 et GFP10-G2. B-D) Les cellules HEK293T sont transfectées transitoirement avec (+ fMLPR) ou sans (- fMLPR) le récepteur au

fMLP, en présence des sous-unités Gi1-Rluc8 (B), Gi2-Rluc8 (C) ou Gi3-Rluc8 (D) et des sous-unités GFP10-

G2 et G1 non marquée. Panels du haut : Les signaux BRET sont mesurés après stimulation ou non (basal) avec 1 µM (barres blanches) ou 10 µM (barres noires) de fMLP pendant 1 minute. Les résultats sont exprimés comme la différence des signaux BRET mesurés en présence et en absence de ligand. Panels en bas à gauche : Ratios BRET mesurés en condition basale en présence (+ fMLPR) ou en absence (- fMLPR) du récepteur fMLPR. Panels

en bas à droite : Niveaux d’expression relative des sous-unités G-Rluc8 correspondant à l’émission de luminescence mesurée en condition basale. Données provenant de 4-5 expériences indépendantes dont les résultats sont représentés sous forme des moyennes ± s.e.m. L’analyse statistique a été réalisée en utilisant un test-t de Student apparié comparant la modulation BRET dans la condition stimulée et la condition non stimulée correspondante (**P<0.01, ***P<0.001). La différence entre les ratios BRET, d’une part, et les luminescences, d’autre part, mesurées à l’état basal a été analysée en utilisant un test-t de Student non apparié ($$$P<0.001, ns : non significatif).

Gi2

Gi1

Gi3

G i1-Rluc8 + G1 + GFP10-G2

- fMLPR + fMLPR

-0.3

-0.2

-0.1

-0.0

0.1

fMLP 1µM

fMLP 10 µM***

**

Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P

Expression relative de

G-Rluc8

- fMLPR + fMLPR0

100 000

200 000

300 000

400 000ns

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

la

G

-Rlu

c8

(U

.A.)

Ratio BRET

- fMLPR + fMLPR

1.5

1.7

1.9

2.1

2.3

2.5

$$$

Ra

tio

BR

ET

ba

sa

l


- fMLPR + fMLPR

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

fMLP 1µM

fMLP 10 µM***

***

Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P


G-Rluc8

- fMLPR + fMLPR0

20 000

40 000

60 000

80 000

100 000ns

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

la

G

-Rlu

c8

(U

.A.)

Ratio BRET

- fMLPR + fMLPR1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

$$$

Ra

tio

BR

ET

ba

sa

l


- fMLPR + fMLPR

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

fMLP 1µM

fMLP 10 µM ***

***

Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P


G-Rluc8

- fMLPR + fMLPR

0

50 000

100 000

150 000ns

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

la

G

-Rlu

c8

(U

.A.)

Ratio BRET

- fMLPR + fMLPR

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0$$$

Ra

tio

BR

ET

ba

sa

l

i

1

2

fMLPR

fMLP

A B

C D



Nous venons de voir que le récepteur que nous avons choisi pour stimuler nos

biosenseurs BRET R/C de PI3K est bien fonctionnel après stimulation avec son ligand agoniste, le fMLP, lorsqu’il est transfecté dans des cellules HEK293T. Nous avons ensuite tenté

de stimuler des cellules HEK293T transfectées avec nos biosenseurs BRET de PI3K avec le fMLP en présence du récepteur fMLPR. Les stimulations ont été réalisées avec 1 µM ou 10 µM de fMLP. Dans les résultats que nous présentons ci-après, nous ne montrerons que ceux obtenus avec 10 µM de fMLP car les résultats obtenus avec 1 µM de fMLP sont identiques. Dans

la littérature, l’activation des PI3K est mesurée généralement après 2 à 5 minutes de stimulation par le fMLP. Par conséquent, les mesures de transfert d’énergie BRET entre les différentes combinaisons de biosenseurs R/C de PI3K ont été enregistrées après plusieurs temps de stimulation avec le fMLP : 1, 2, 5 et 10 minutes. Nous avons choisi de réaliser une cinétique de stimulation des biosenseurs de PI3K afin de trouver peut-être un temps de

stimulation où l’activation de PI3K serait maximale et afin de voir si elle est soutenue dans le temps.

Dans ces expériences nous avons choisi de transfecter deux ratios de sous-unités fusionnées Rluc8 et GFP2. En effet, les mécanismes moléculaires mis en jeu lors de l’activation

des dimères p110/p87 et p110/p101 ne sont pas encore connus. Il pourrait s’agir aussi bien de phénomènes d’association-dissociation physiques que de réarrangements conformationnels au sein du dimère. Les phénomènes d’association-dissociation physiques font généralement intervenir des modifications de l’affinité relative des protéines [221] (Figure 37). Ainsi, un ratio de biosenseurs situé aux alentours de la valeur de BRET50 pourrait permettre d’observer ces évènements. En revanche, si les mécanismes mis en jeu sont de type conformationnel alors ils seront plutôt observables pour un ratio de biosenseurs permettant d’obtenir un BRET maximum [221] (Figure 37). Afin de tester ces deux possibilités, nous avons réalisé nos expériences de stimulation en transfectant un ratio de protéines étiquetées situé aux environs du BRET50 que nous dénommerons « pente » (pour rappel par rapport à la pente des courbes de saturation, Figure 34) et un ratio de protéines étiquetées permettant d’obtenir le BRETmax que nous dénommerons « plateau ». Nous ne pouvons pas nous fier uniquement à la valeur de Net BRET pour savoir si nous nous situons réellement dans ces conditions de ratio GFP2/Rluc8. En effet, un même Net BRET peut être obtenu pour des quantités (ratios) de protéines différentes. Pour renforcer l’hypothèse que nous nous situerons dans les bonnes conditions de ratio GFP2/Rluc8, nous avons essayé de transfecter une quantité de protéines étiquetées Rluc8 qui soit similaire dans les deux conditions afin que la variation du Net BRET à l’état basal soit réellement une variation du ratio de protéines fusionnées GFP2 par rapport aux protéines fusionnées Rluc8.



Figure 37 : Schéma explicatif des différentes courbes de saturation BRET pouvant être obtenues après changements de l’affinité relative ou de la conformation des protéines en interaction. Une modification dans l’affinité relative des protéines résulte en un déplacement de la courbe de saturation BRET vers la gauche ou vers la droite et une diminution ou une augmentation respectivement de la valeur du BRET50, qui peut ou non être associée à une modification du BRETmax. Des modifications de conformation entre les deux protéines peuvent résulter en une augmentation ou une diminution de la valeur du BRETmax sans modification de la valeur de BRET50. (D’après [221]).

La Figure 38 présente les résultats obtenus pour les paires de bonne affinité p87-

Rluc8/GFP2-p110 et p110-Rluc8/p101-GFP2 à titre d’exemple. Néanmoins, ces

expériences ont été ensuite réalisées pour les 6 autres paires de senseurs PI3K que nous avons construits et pour lesquelles nous avons obtenu les mêmes résultats que présentés ci-après. Les résultats montrent que nous nous trouvons bien dans les conditions pente et plateau que nous avions choisi puisque les Net BRET sont effectivement ceux correspondant au

BRETmax et au BRET50 de chaque combinaison de senseurs BRET de PI3K (Figure 38 B-C, panels en bas à gauche) et les luminescences reflétant le niveau d’expression relative de la sous-unité fusionnée Rluc8 sont similaires (Figure 38 B-C, panels en bas à droite). Les résultats de stimulation des cellules transfectées avec 10 µM fMLP sont exprimés en amplitude d’augmentation ou de diminution du signal BRET dans la condition stimulée comparée à la condition basale correspondante. Nous constatons qu’après 1, 2, 5 ou 10 minutes de stimulation avec 10 µM de fMLP, aucune modulation positive ou négative significative du signal BRET n’est observée, quelle que soit la paire de senseurs BRET testée (Figure 38 B-C, panels du haut).

BRET spécifique

Changement conformation

Changement affinité

Ratio accepteur/donneur



Figure 38 : Mesure des interactions R/C de la PI3K par BRET après stimulation du récepteur au fMLP. A) Schéma représentatif de l'essai BRET mesurant l'interaction entre un des couples possibles de biosenseurs de

PI3K : p110-Rluc8/p87-GFP2. B-C) Les cellules HEK293T sont co-transfectées transitoirement avec les sous-

unités p87-Rluc8 et GFP2-p110 (B) ou p110-Rluc8 et p101-GFP2 (C), en présence du récepteur fMLPR. Les conditions « pente » et « plateau » correspondent aux quantités de vecteurs codant pour les senseurs BRET des PI3K permettant d’obtenir respectivement le BRET50 et le BRETmax de chaque couple, obtenus à partir des courbes de saturation Figure 34. Panels du haut : Les signaux BRET sont mesurés après stimulation ou non avec 10 µM de fMLP pendant les temps indiqués. Les résultats sont exprimés comme la différence des signaux BRET mesurés en présence et en absence de ligand. Panels en bas à gauche : Les Net BRET sont mesurés en condition basale et correspondent à la différence entre le ratio BRET mesuré entre la Rluc8 et la GFP2 et le ratio BRET mesuré en présence du donneur d’énergie exprimé seul. Panels en bas à droite : Niveaux d’expression relative de la sous-unité fusionnée à la Rluc8, correspondant à l’émission de luminescence mesurée à l’état basal. Données provenant de 3 expériences indépendantes dont les résultats sont représentés sous forme des moyennes ± s.e.m. L’analyse statistique a été réalisée en utilisant un test-t de Student apparié comparant la modulation BRET dans la condition stimulée et la condition non stimulée correspondante.

p110

p87

fMLPR

fMLP

A

Net BRET

pente plateau

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Net

BR

ET

Expression relative de laprotéine fusionnée Rluc8

pente plateau0

50 000

100 000

150 000

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

s

pro

téin

es

fu

sio

nn

ée

s R

luc

8 (

U.A

.)

fMLPR +


1 2 5 10-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010

plateau

pente

Temps (min)Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P

Net BRET

pente plateau0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

Net

BR

ET

fMLPR +


1 2 5 10-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010 pente

plateau

Temps (min)

Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P


pente plateau0

10 000

20 000

30 000

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

s

pro

téin

es

fu

sio

nn

ée

s R

luc

8 (

U.A

.)

B Cp110/p87 p110/p101



Dans les expériences que nous venons de montrer, nous nous situons à un niveau d’expression relative des protéines fusionnées à la Rluc8 qui est inférieur à 100 000 U.A. Or, dans une étude que j’ai menée dans mon équipe d’accueil en parallèle de ce travail de thèse et dans laquelle je me suis intéressée aux protéines G hétérotrimériques, nous avons montré que

le niveau d’expression relative de la sous-unité G des protéines G hétérotrimériques peut impacter la capacité des ligands à activer la protéine G via leur récepteur (voir étude n°3). Ainsi, nous nous sommes demandé si cette observation ne pouvait pas être également

appliquée pour l’activation de la PI3K par le récepteur au fMLP. Nous avons donc refait les mêmes expériences que précédemment en transfectant un niveau de protéines fusionnées Rluc8 plus important, supérieur à 100 000 U.A. (Figure 39), tout en conservant dans les transfections des ratios de protéines GFP2/Rluc8 correspondant au BRET50 ou au BRETmax de chaque combinaison R/C. La Figure 39 présente les résultats obtenus pour les couples p87-

Rluc8/GFP2-p110 et p110-Rluc8/p101-GFP2. Les résultats obtenus pour d’autres

combinaisons de biosenseurs BRET de PI3K sont similaires. Les valeurs de Net BRET correspondent effectivement au BRETmax et au BRET50 de chacune des combinaisons de senseurs BRET de PI3K (Figure 39 B-C, panels en bas à gauche). Les valeurs de luminescence reflétant le niveau d’expression relative de la sous-unité fusionnée Rluc8 sont supérieures à 100 000 U.A. et sont similaires au sein d’une même combinaison pour les deux valeurs de Net BRET testées (Figure 39 B-C, panels en bas à droite). Nous nous situons donc dans les conditions « pente » et « plateau » choisies. Néanmoins, dans ces nouvelles conditions d'expression du partenaire fusionné au donneur d'énergie Rluc8 plus importante, la stimulation des cellules pendant 1, 2, 5 ou 10 minutes avec 10 µM de fMLP n’induit pas non plus de modulation négative ou positive du signal BRET significative comparée aux conditions non traitées correspondantes (Figure 39 B-C, panels du haut). Ainsi, contrairement à l'activation des protéines G hétérotrimériques, il semblerait que le niveau d’expression de la protéine étiquetée Rluc8 ne soit pas un paramètre décisif pour visualiser l’activation de la

PI3K par BRET.



Figure 39 : Mesure des interactions R/C de la PI3K par BRET après stimulation du récepteur au fMLP : conditions de surexpression de la sous-unité fusionnée au donneur d'énergie Rluc8. A) Schéma représentatif de l'essai BRET mesurant l'interaction entre un des couples possibles de biosenseurs de


unités p87-Rluc8 et GFP2-p110 (B) ou p110-Rluc8 et p101-GFP2 (C), en présence du récepteur fMLPR. Les conditions « pente » et « plateau » correspondent aux quantités de vecteurs codant pour les senseurs BRET des PI3K permettant d’obtenir respectivement le BRET50 et le BRETmax de chaque couple, obtenus à partir des courbes de saturation Figure 34. Panels du haut : Les signaux BRET sont mesurés après stimulation ou non avec 10 µM de fMLP pendant les temps indiqués. Les résultats sont exprimés comme la différence des signaux BRET mesurés en présence et en absence de ligand. Panels en bas à gauche : Les Net BRET sont mesurés en condition basale et correspondent à la différence entre le ratio BRET mesuré entre la Rluc8 et la GFP2 et le ratio BRET mesuré en présence du donneur d’énergie exprimé seul. Panels en bas à droite : Niveaux d’expression relative de la sous-unité fusionnée à la Rluc8, correspondant à l’émission de luminescence mesurée à l’état basal. Données provenant de 3 expériences indépendantes dont les résultats sont représentés sous forme des moyennes ± s.e.m. L’analyse statistique a été réalisée en utilisant un test-t de Student apparié comparant la modulation BRET dans la condition stimulée et la condition non stimulée correspondante.


pente plateau0

100 000

200 000

300 000

400 000

500 000

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

s

pro

téin

es

fu

sio

nn

ée

s R

luc

8 (

U.A

.)

Net BRET

pente plateau0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Net

BR

ET

fMLPR +


1 2 5 10-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010

plateau

pente

Temps (min)

Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P

Net BRET

pente plateau0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

Net

BR

ET

fMLPR +


1 2 5 10-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010

plateau

pente

Temps (min)

Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P


pente plateau0

50 000

100 000

150 000

200 000

250 000

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

s

pro

téin

es

fu

sio

nn

ée

s R

luc

8 (

U.A

.)

A

B Cp110/p87 p110/p101

p110

p87

fMLPR

fMLP



Nous avons réalisé ces expériences de stimulation de la PI3Ken présence du récepteur

fMLPR, qui est un récepteur classiquement utilisé pour activer la PI3K. Etant donné l’absence de modulation des signaux BRET entre les différentes combinaisons de sondes BRET testées après stimulation du fMLPR, nous avons réalisé des expériences avec d’autres RCPG afin de

tester deux autres couples ligand/récepteur activateurs de la PI3K. Nous avons choisi d’utiliser les récepteurs P2Y12 (récepteur purinergique) et S1P1R (récepteur type 1 à la

sphingosine-1-phosphate) décrits dans la littérature comme activateurs des PI3K et que nous possédons au laboratoire [128, 222]. Nous avons ainsi reproduit les expériences de BRET

précédentes en transfectant les biosenseurs BRET de PI3K mais en présence des récepteurs P2Y12 ou S1P1R que nous avons stimulés avec 10 µM de leur ligand agoniste respectif, l’ADP (adénosine disphosphate) ou le S1P (sphingosine-1-phosphate) pendant 1, 5 ou 10 minutes (Figure 40 B et C). La Figure 40 présente les résultats obtenus pour les couples p87-

Rluc8/GFP2-p110 et p110-Rluc8/p101-GFP2 mais les mêmes résultats ont été obtenus avec les autres couples de biosenseurs BRET. Comme pour le fMLPR, nous ne mesurons aucune modulation significative du signal BRET après différents temps de stimulation des deux récepteurs (Figure 40 B et C). Ainsi, l’absence de modulation du signal BRET entre les

biosenseurs BRET de PI3K que nous constatons depuis les premières expériences ne semble pas être liée à un mauvais choix de couple ligand/récepteur.

Figure 40 : Mesure des interactions R/C de la PI3K par BRET après stimulation des récepteurs P2Y12 ou S1P1R. A) Schéma représentatif de l'essai BRET mesurant l'interaction entre un des couples possibles de biosenseurs de


unités p87-Rluc8 et GFP2-p110 en présence du récepteur P2Y12 (B) ou p110-Rluc8 et p101-GFP2 en présence du récepteur S1P1R (C). Les signaux BRET sont mesurés après stimulation ou non avec 10 µM d’ADP ou de S1P pendant les temps indiqués. Les résultats sont exprimés comme la différence des signaux BRET mesurés en présence et en absence de ligand. Données provenant de 3 expériences indépendantes dont les résultats sont représentés sous forme des moyennes ± s.e.m. L’analyse statistique a été réalisée en utilisant un test-t de Student apparié comparant la modulation BRET dans la condition stimulée et la condition non stimulée correspondante.

Nous venons de présenter trois expériences dans lesquelles nous avons tenté de

mesurer l’activation des dimères de PI3K, pour les couples p110/p87 et p110/p101, via l’utilisation des biosenseurs BRET mesurant l’interaction entre les sous-unités catalytiques et

P2Y12 +


1 5 10-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010

Temps (min)

Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le A

DP

p110

p87

RCPGagoniste

B CA p110/p87

S1P1R +


1 5 10-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010

Temps (min)

Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le S

1P

p110/p101



régulatrices que nous avons développés et après stimulation par un couple ligand/récepteur

utilisé classiquement pour activer la PI3K in cellulo. Nous avons transfecté différents ratios de sondes BRET des sous-unités catalytiques et régulatrices fusionnées Rluc8 et GFP2 dans le cas où les mécanismes moléculaires mis en jeu seraient du type association-dissociation physique ou modification conformationnelle. Nous avons également joué sur le niveau d’expression relative des biosenseurs qui pourrait éventuellement moduler la capacité des ligands à les activer. Nous avons stimulé ces biosenseurs BRET avec différentes concentrations de ligand agoniste pendant différents temps de stimulation (1, 2, 5 et 10 minutes) afin de déceler des conditions optimales de modulation du transfert d’énergie entre les deux partenaires BRET. Enfin, nous avons tenté d’activer ces biosenseurs grâce à deux autres couples ligand/récepteur. Aucune de ces tentatives n’a abouti à l’observation d’une modulation du transfert d’énergie

entre les deux partenaires BRET fusionnés aux différentes sous-unités de PI3K, quelles que soient les combinaisons testées, et qui reflèterait leur activation.

Après ces échecs, nous nous sommes demandé s’il n’y aurait pas un autre moyen pour

obtenir des modulations du signal BRET des biosenseurs de PI3K. L’idée qui nous est venue repose sur une étude de développement de biosenseurs BRET mesurant indirectement

l’activation des protéines G hétérotrimériques en sondant l’interaction entre la sous-unité G des protéines hétérotrimériques et les RCPG [223]. Dans cette étude, Galés et collaborateurs ont montré que les modulations du signal BRET reflétant l’activation de la sonde n’étaient

mesurables que lorsque la sonde BRET était co-transfectée en présence des sous-unités G et

G non étiquetées complémentaires de l’hétérotrimère G, mettant en avant l’importance de la stœchiométrie des protéines dans l’essai BRET. Partant de ce constat, nous nous sommes

demandé si la surexpression d’un ou plusieurs partenaires des PI3K ne serait pas nécessaire

pour obtenir des modulations du BRET reflétant l’activation de la PI3K.

Les PI3Ksont des protéines activées en aval des RCPG. De plus, dans la littérature, les

dimères G des protéines G sont parfois utilisés pour activer les PI3K in vitro [94, 174]. De ce fait, nous avons émis l’hypothèse que les protéines G hétérotrimériques endogènes des cellules HEK293T ne seraient peut-être pas exprimées en quantité suffisante après surexpression des

sondes BRET de PI3K pour transmettre le signal initié par la liaison du ligand fMLP sur son récepteur et activer ainsi nos biosenseurs BRET. Comme mentionné précédemment, le fMLPR,

activateur reconnu des PI3K est un récepteur couplé aux protéines G de la famille Gi, comme

nous l’avons également montré dans la Figure 36 de ce travail. Les isoformes G1 et G2 des

protéines G sont décrites comme activatrices de p110 [95]. Nous avons donc réalisé des

expériences dans lesquelles nous avons co-transfecté les sous-unités Gi1, G1 et G2, en présence ou non du fMLPR, et observé leur impact sur le transfert d’énergie entre les

partenaires BRET des biosenseurs de PI3K à l'état basal et après stimulation avec 1 µM ou 10 µM de fMLP (Figure 41). La Figure 41 B présente les résultats obtenus pour les couples p87-

Rluc8/GFP2-p110 et p110-Rluc8/p101-GFP2 mais des résultats similaires ont été obtenus en

présence des autres paires de biosenseurs de PI3K. Nous observons que la co-transfection du

trimère Gi112 ne modifie pas la qualité du transfert d’énergie mesuré à l’état basal entre la sous-unité catalytique et les différentes sous-unités régulatrices (Figure 41 B et C, panels en bas à gauche). Ces mesures ont été réalisées à des niveaux d’expression relative de la sous-unité fusionnée Rluc8 relativement similaires, nous situant aux environs du BRET50 et du BRETmax de chaque couple (Figure 41 B et C, panels en bas à droite). Dans ces conditions, nous avons stimulé les cellules transfectées avec 10 µM de fMLP pendant 1, 5 et 10 minutes et



nous n’avons pas observé de modification du signal BRET malgré la co-transfection des sous-

unités de protéines G hétérotrimériques Gi112 (Figure 41 B et C, panels du haut). La stimulation des cellules avec 1 µM de fMLP a donné les mêmes résultats (résultats non montrés).

Figure 41 : Mesure des signaux BRET entre les biosenseurs R/C de PI3K en présence ou non du

récepteur au fMLP et des protéines G hétérotrimériques Gi112. A) Schéma représentatif des transfections réalisées et du transfert d’énergie mesuré entre un des couples

possibles de biosenseurs de PI3K, p110-Rluc8/p87-GFP2. B-C) Les cellules HEK293T sont co-transfectées

transitoirement avec les sous-unités p87-Rluc8 et GFP2-p110 (B) ou p110-Rluc8 et p101-GFP2 (C), en présence

du récepteur fMLPR et en présence ou non du trimère Gi112. Les conditions « pente » et « plateau » correspondent aux quantités de vecteurs codant pour les senseurs BRET des PI3K permettant d’obtenir respectivement le BRET50 et le BRETmax de chaque couple, obtenus à partir des courbes de saturation Figure 34. Panels du haut : Les signaux BRET sont mesurés après stimulation ou non avec 10 µM de fMLP pendant les temps indiqués. Les résultats sont exprimés comme la différence des signaux BRET mesurés en présence et en absence de ligand. Panels en bas à gauche : Les Net BRET sont mesurés en condition basale et correspondent à la différence entre le ratio BRET mesuré entre la Rluc8 et la GFP2 et le ratio BRET mesuré en présence du donneur d’énergie exprimé seul. Panels en bas à droite : Niveaux d’expression relative de la sous-unité fusionnée à la

B

Net BRET

pente plateau

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25 + fMLPR

+ fMLPR

+ G i112

Net

BR

ET


pente plateau0

50 000

100 000

150 000

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pre

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ion

re

lati

ve

de

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pro

téin

es

fu

sio

nn

ée

s R

luc

8 (

U.A

.)

CfMLPR + G i112 +


1 5 10-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010pente

plateau

Temps (min)Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P

Net BRET

pente plateau0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10+ fMLPR

+ fMLPR

+ G i112

Net

BR

ET


pente plateau0

50 000

100 000

150 000

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pre

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pro

téin

es

fu

sio

nn

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s R

luc

8 (

U.A

.)

fMLPR + G i112 +


1 5 10-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010

plateau

pente

Temps (min)

Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P

p110/p87 p110p101

A

p110

p87

fMLPR

fMLP

i1

1

2



Rluc8, correspondant à l’émission de luminescence mesurée à l’état basal. Données provenant de 2-4 expériences indépendantes dont les résultats sont représentés sous forme des moyennes ± s.e.m. L’analyse statistique a été réalisée en utilisant un test-t de Student apparié comparant la modulation BRET dans la condition stimulée et la condition non stimulée correspondante.

Ces mêmes expériences, dont nous ne montrerons pas les résultats ici, ont été effectuées

en co-transfectant différentes quantités de vecteurs codant pour les sous-unités Gi1, G1 et

G2 afin de vérifier si le niveau d’expression de ces protéines pouvait impacter sur le transfert

d’énergie mesuré entre les senseurs BRET de PI3K. Nous avons également testé la

surexpression d’une autre isoforme de Gi, Gi2, dans le cas où l’isoforme Gi1 ne serait pas

celle impliquée dans l’activation de la PI3K après stimulation du récepteur fMLPR. Enfin, nous avons aussi tenté de prétraiter les cellules à 37 °C avec 10 µM de fMLPR pendant 1 heure avant de mesurer le transfert d’énergie. Toutes ces conditions ont abouti au même résultat : aucune différence dans la qualité du signal BRET n’est observée entre les conditions traitées et les conditions non traitées (résultats non montrés).

Nous avons testé sans succès l’implication des protéines G hétérotrimériques dans la

fonctionnalité de nos biosenseurs BRET de PI3K. Au vu de la littérature, nous avons testé une

autre protéine, la petite GTPase Ras, impliquée dans l’activation des PI3K [87] (voir Chapitre 1. III. A.). Comme dans le cas des protéines G hétérotrimériques, nous avons émis l’hypothèse que les protéines Ras endogènes des cellules HEK293T pouvaient ne pas être exprimées en quantité suffisante après surexpression des biosenseurs BRET pour participer à l’activation

des dimères R/C de constructions BRET de PI3K et qu’il pourrait être nécessaire de co-transfecter ces protéines pour optimiser la fonctionnalité des biosenseurs BRET.

Nous nous sommes procuré un vecteur codant pour la protéine H-Ras et un autre codant pour sa forme constitutivement active H-RasG12V, que nous appellerons RasV12. Nous avons alors réalisé une série de nouvelles expériences de BRET en co-transfectant les

différents biosenseurs de PI3K en présence du fMLPR, en présence ou non des protéines G

hétérotrimériques Gi112 et en présence ou non de la protéine Ras ou de la protéine RasV12

(Figure 42). Nous avons utilisé RasV12 car c’est un activateur direct reconnu de PI3K et nous avons voulu voir l’impact de la surexpression de cette protéine sur le transfert d’énergie mesuré entre les différentes combinaisons de biosenseurs. Nous avons mesuré les transferts

d’énergie entre les sous-unités catalytiques et régulatrices des dimères BRET p110/p87 et

p110/p101 dans des cellules co-transfectées avec les différents plasmides, toujours avec des ratios GFP2/Rluc8 permettant de nous situer dans les conditions « pente » et « plateau » (Figure 42 B-D, panels en bas à gauche) en essayant de calibrer les niveaux d'expression relative de la sous-unité fusionnée Rluc8 dans chaque condition (Figure 42 B-D, panels en bas à droite). Les résultats présentés Figure 42 sont ceux obtenus pour les couples p87-

Rluc8/GFP2-p110 (Figure 42 B), p110-Rluc8/p101-GFP2 (Figure 42 C) et p87-

Rluc8/p110-GFP2 (Figure 42 D), après 1 minute de stimulation avec 1 µM et 10 µM de fMLP ou à l’état basal. Les autres combinaisons et conditions de stimulation ont fournies des résultats semblables. Ces résultats montrent qu’après 1 minute de stimulation avec 1 µM ou 10 µM de fMLP aucune modulation significative du signal BRET n'est détectée (Figure 42 B-D,

panels du haut). Par contre, dans le cas des couples p110-Rluc8/p101-GFP2 et p87-



Rluc8/p110-GFP2, la co-transfection de Ras ou de RasV12, en présence comme en absence des protéines G hétérotrimériques, induit une augmentation significative du Net BRET mesuré entre les deux sous-unités de PI3K à l’état basal dans les conditions « plateau » de transfection des biosenseurs (Figure 42 C-D, panels en bas à gauche, barres rouges, jaunes, bleues et violettes). Ces augmentations de ratio sont observées à des niveaux de luminescence similaires dans chacune des conditions de transfection (Figure 42 C-D panels en bas à

droite). Comme nous pouvons le constater dans le cas du couple p87-Rluc8/GFP2-p110, toutes les paires de biosenseurs ne sont pas impactées par la présence de Ras ou RasV12 (Figure 42 B).

Ainsi, il semblerait que l’ajout de la protéine Ras entraine des modifications dans la

qualité du transfert d’énergie mesuré entre la sous-unité catalytique p110 et la sous-unité régulatrice p87 ou p101 dépendamment de la position du donneur/accepteur d'énergie BRET

en N- ou C-terminal des sous-unités R/C de la PI3K. La présence de Ras constitutivement activée par la mutation induit le même type de modification dans la qualité du transfert

d’énergie. De façon intéressante, dans le cas du dimère p110/p87, il semblerait que la paire ayant la plus faible affinité et le plus faible BRETmax (voir Tableau 5) soit celle qui soit sensible à la présence de Ras ou RasV12. Ainsi, les couples ayant les meilleurs BRET50 et BRETmax ne sont pas forcément les plus adéquats pour visualiser des modulations de BRET. L’augmentation du Net BRET peut être liée à un rapprochement du donneur et de l’accepteur d’énergie ou à un réarrangement de l’orientation de leur dipôle qui deviendrait plus permissif au transfert d’énergie. Ces modifications de distance ou d’orientation des dipôles BRET sous-tendent des modifications dans l’arrangement spatial des sous-unités catalytiques et régulatrices de PI3K en présence de Ras ou RasV12 et laissent soupçonner une interaction

entre ces protéines et le senseur BRET du dimère de PI3K. Néanmoins, nos expériences ne permettent pas de déterminer si cette interaction est directe ou indirecte, faisant intervenir d’autres protéines intermédiaires. Cependant, si il n’a jamais été décrit d’interaction directe

entre Ras inactive et le dimère de PI3K, une interaction directe entre RasV12 et p110 a déjà été montrée lors d’études in vitro par immuno-précipitation et par cristallographie [87, 104]. Pacold et collaborateurs ont aussi proposé que cette interaction conduirait à une modification

de conformation de p110 [87]. Ainsi, nous pouvons émettre l’hypothèse que les constructions BRET de PI3K que nous avons réalisées permettraient de visualiser ce changement de

conformation de p110 au sein du dimère R/C de PI3K en présence de Ras.



Figure 42 : Mesure des interactions R/C de la PI3K par BRET après stimulation du récepteur au fMLP : impact des protéines Ras ou RasV12. A) Schéma représentatif des transfections réalisées et du transfert d’énergie mesuré entre un des couples

possibles de biosenseurs de PI3K : p110-Rluc8/p87-GFP2. B-D) Les cellules HEK293T sont co-transfectées

transitoirement avec les sous-unités p87-Rluc8/GFP2-p110 (A), p110-Rluc8/p101-GFP2 (B) ou p87-

Rluc8/p110-GFP2 (C), en présence du récepteur fMLPR et/ou du trimère Gi112 et/ou des protéines Ras ou RasV12. Panels du haut : Les signaux BRET sont mesurés après stimulation ou non avec 1 µM (barres unies) ou 10 µM (barres rayées) de fMLP. Les résultats sont exprimés comme la différence des signaux BRET mesurés en présence et en absence de ligand. Panels en bas à gauche : Les Net BRET sont mesurés en condition basale et correspondent à la différence entre le ratio BRET mesuré entre la Rluc8 et la GFP2 et le ratio BRET mesuré en présence du donneur d’énergie exprimé seul. Panels en bas à droite : Niveaux d’expression relative de la sous-

Net BRET

pente plateau

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

***

***$$

***

***

$$$

Net

BR

ET


pente plateau0

50 000

100 000

150 000

200 000

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

s

pro

téin

es

fu

sio

nn

ée

s R

luc

8 (

U.A

.)

B

D

+ fMLPR

+ fMLPR + Ras

+ fMLPR + RasV12

+ fMLPR + G i112

+ fMLPR + G i112 + Ras

+ fMLPR + G i112 + RasV12

Net BRET

pente plateau

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Net

BR

ET


pente plateau0

50 000

100 000

150 000

200 000

250 000

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pre

ss

ion

re

lati

ve

de

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pro

téin

es

fu

sio

nn

ée

s R

luc

8 (

U.A

.)


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-0.005

0.000

0.005

0.010fMLP 1 µM

fMLP 10 µM

Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P


pente plateau-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010fMLP 1 µM

fMLP 10 µM

Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P

A

Net BRET

pente plateau0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

******

******

$

******

***

**

Net

BR

ET


pente plateau0

10 000

20 000

30 000

40 000

100 000

200 000

300 000

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

s

pro

téin

es

fu

sio

nn

ée

s R

luc

8 (

U.A

.)


pente plateau-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010 fMLP 1 µM

fMLP 10 µM

Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P

p110/p101

p110/p87

p110/p87C

p110

p87

fMLPR

fMLP

i1

1

2

Ras



unité fusionnée à la Rluc8, correspondant à l’émission de luminescence mesurée à l’état basal. Les conditions « pente » et « plateau » correspondent aux quantités de vecteurs codant pour les senseurs BRET des PI3K permettant d’obtenir respectivement le BRET50 et le BRETmax de chaque couple, obtenus à partir des courbes de saturation Figure 34. Données provenant de 3-6 expériences indépendantes dont les résultats sont représentés sous forme des moyennes ± s.e.m. L’analyse statistique a été réalisée en utilisant un test-t de Student apparié comparant la modulation BRET dans la condition stimulée et la condition non stimulée correspondante. La significativité des différences entre les Net BRET mesurés pour chaque condition à l’état basal est analysée par une ANOVA à une voie suivie d’un test de Tukey (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

La protéine RasV12 est capable d'activer la p110 en absence d’autres stimulations [87].

En absence de RasV12, la localisation intracellulaire de p110 observée par immunofluorescence est cytosolique. Cependant, il a été montré que la transfection de RasV12

dans des cellules HEK ou Cos-1 induit la relocalisation de p110 à la membrane et dans des structures intracellulaires de type endosomes [105, 224]. Pour aller plus loin, nous avons donc

vérifié si la co-transfection de RasV12 en présence de nos biosenseurs de PI3K déterminait la

relocalisation intracellulaire des sondes BRET des couples p110/p87 ou p110/p101 comme décrit dans la littérature. Nous avons réalisé une expérience d’immunofluorescence sans perméabilisation membranaire, sur des cellules HEK293T transfectées avec les couples de

biosenseurs BRET de PI3K présentés Figure 42 en présence du récepteur fMLPR et en présence ou non de RasV12 (Figure 43). Nous avons marqué les membranes plasmiques en rouge grâce à un anticorps dirigé contre le tag HA présent à l’extrémité N-terminale du récepteur fMLPR et nous avons visualisé (en vert) la sous-unité catalytique ou régulatrice fusionnée à la GFP2 via une excitation directe de la GFP2. Malgré la qualité non optimale des photographies, nous pouvons observer assez clairement qu’en absence de RasV12, la sous-unité fusionnée à la GFP2 présente une expression intracellulaire diffuse dans le cytosol (Figure 43, panels du haut) alors qu'en présence de RasV12, la fluorescence émise par la GFP2 est retrouvée sous forme de spots ou d’amas à proximité du noyau (Figure 43, panels du bas). Ces localisations intracellulaires en absence et en présence de RasV12 sont en accord avec la littérature, validant d’une certaine façon la bonne fonctionnalité de nos constructions BRET, et apportent également des arguments en faveur d'une modulation du signal BRET entre

les sous-unités R/C liée à l’activation de la PI3K par RasV12. De plus, nous constatons que le couple dont le transfert d’énergie n’était pas impacté par la présence de RasV12 (p87-

Rluc8/GFP2-p110) est également relocalisé dans des compartiments intracellulaires. Ainsi, l’absence d’augmentation du Net BRET de ce couple semble être liée à une modification de conformation qui n’affecte pas l’orientation et/ou la distance des dipôles de ce couple plutôt qu’à une absence de réponse de ce couple envers la présence de RasV12.



Figure 43 : Impact de la présence de RasV12 sur la localisation intracellulaire des sous-unités

R/C de PI3K fusionnées à la GFP2.

Localisation des sous-unités de PI3K fusionnées à la GFP2 (vert) et du récepteur HA-fMLPR (rouge) par expériences d'immunofluorescence dans des cellules HEK293T transfectées transitoirement en présence de la sous-unité de PI3K complémentaire fusionnée à la Rluc8 (non marquée). Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu).

Dans les expériences de BRET que nous venons de présenter, nous transfectons jusqu’à 7 vecteurs codant pour nos protéines d’intérêt dans les cellules HEK293T. Nous ne savons pas si le fait de transfecter autant de plasmides dans les cellules n’entraine pas une mauvaise expression et/ou fonctionnalité des protéines dont ils sont porteurs, peut-être du fait de la saturation de la machinerie de transcription, de traduction ou tout autre mécanisme nécessaire pour la bonne expression de ces protéines. Néanmoins, nous pouvons exclure l’hypothèse

d'une absence de modulation des signaux BRET mesurés avec nos biosenseurs BRET de PI3K après stimulation du fMLPR qui pourrait être lié à une absence de fonctionnalité du récepteur fMLPR du fait du trop grand nombre de plasmides transfectés. En effet, nous avons mesuré

directement l’activation du trimère de protéines G Gi112 en réponse à une stimulation par le fMLP, en utilisant les biosenseurs BRET d'activité de protéines G que nous avons précédemment décrits et utilisés (Figure 36). Nous avons réalisé des expériences de BRET sur

des cellules HEK293T co-transfectées avec le fMLPR, les sous-unités Gi1-Rluc8, GFP10-G2 et

G1 des protéines G, les sous-unités p110 et p87 des PI3K et, ou non, Ras ou RasV12 (Figure 44). Les résultats présentés Figure 44 montrent que le fMLP à 1 µM ou 10 µM est capable d’induire une diminution du signal BRET similaire après 1 minute de stimulation, démontrant une activation de la protéine G. L’efficacité d’activation de la protéine G n’est pas modifiée lorsque l'on co-transfecte Ras ou RasV12. Ainsi, l’absence de modulation des signaux BRET

mesurés entre les sous-unités catalytiques et régulatrices de PI3K fusionnées aux partenaires BRET ne serait donc pas liée à une absence de fonctionnalité du récepteur fMLPR.

HA-fMLPRp87 Rluc8

p110 GFP2

- RasV12

+ RasV12

HA-fMLPRp87 Rluc8

GFP2 p110

HA-fMLPRp110 Rluc8p101 GFP2



Figure 44 : Activation de la protéine Gi112 par le fMLP, mesurée par BRET, en présence des

sous-unités p110 et p87 de la PI3K et de Ras ou RasV12.

A) Schéma représentatif de l’essai BRET mesurant l’interaction entre la sous-unité Gi1-Rluc8 et la sous-unité

GFP10-G2. B) Les cellules HEK293T sont transfectées transitoirement avec le récepteur fMLPR, les sous-unités

Gi1-Rluc8, GFP10-G2 et G1 des protéines G, les sous-unités p110 et p87 des PI3K et en présence ou non de Ras ou RasV12. Panel du haut : Les signaux BRET sont mesurés après stimulation ou non (basal) avec 1 µM (barres blanches) ou 10 µM (barres noires) de fMLP pendant 1 minute. Les résultats sont exprimés comme la différence des signaux BRET mesurés en présence et en absence de ligand. Panel en bas à gauche : Les ratios BRET sont mesurés dans chacune des conditions de transfection à l’état basal. Panel en bas à droite : Les niveaux

d’expression relative de la sous-unité Gi1-Rluc8 dans chacune des conditions de transfection correspond à l’émission de luminescence mesurée en condition basale. Données provenant de 3 expériences indépendantes dont les résultats sont représentés sous forme des moyennes ± s.e.m. L’analyse statistique a été réalisée en utilisant un test-t de Student apparié comparant la modulation BRET dans la condition stimulée et la condition non stimulée correspondante (*P<0.05), et l’analyse de la différence de modulation BRET en fonction de la présence de Ras et RasV12 a été réalisée par une ANOVA à une voie suivie d’un test de Tukey (ns : non significatif).

L'ensemble des expériences de mesure de BRET que nous venons de présenter a été effectué sur des cellules en suspension. Or, il est bien connu aujourd’hui que l'activité de cellules adhérentes diffère de celle de cellules en suspension. En effet, le contact des cellules avec la matrice extracellulaire, la densité des cellules permettant ou non des contacts cellule-cellule, l’arrangement du cytosquelette et l’organisation de la membrane plasmique en adhérence ou en suspension sont autant de caractéristiques régulant différemment la capacité des ligands à activer des voies de signalisation données et de ce fait modulant les aptitudes des cellules à proliférer, migrer, survivre… [225, 226]. Nous avons donc émis l’hypothèse que la réalisation des expériences de BRET sur des cellules en suspension pouvait altérer la

signalisation impliquant les PI3K, empêchant de mesurer leur activation en BRET. Afin de répondre à cette hypothèse, nous avons mené une expérience préliminaire de BRET sur des

cellules adhérentes exprimant deux couples BRET de sous-unités R/C de PI3K p87-

Rluc8/p110 GFP2 et p110-Rluc8/GFP2-p87 en présence ou non de Ras ou RasV12. Pour ce

fMLPR +


+ p110 + p87

+ Ras + RasV12

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

fMLP 1 µM

fMLP 10 µM

*

*

**

**

ns

Mo

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lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P

Expression relative de G-Rluc8

+ Ras + RasV120

100 000

200 000

300 000

400 000

500 000

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

la

G

-Rlu

c8

(U

.A.)

Ratio BRET

+ Ras + RasV120.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Ra

tio

BR

ET

ba

sa

l

B

p110

p87

fMLPR

fMLP

i1

12

Ras

A



faire, nous avons ensemencé et transfecté les cellules en boite de pétri 100 mm et 24h après transfection, les cellules ont été récupérées puis réensemencées dans des plaques 96 puits préalablement traitées à la poly-L-lysine pour augmenter leur adhésion. Le lendemain, nous avons réalisé les expériences de BRET. Nous avons ainsi stimulé les cellules pendant 1 et 5 minutes avec 10 µM de fMLP (Figure 45). Les résultats présentés Figure 45 montrent que la stimulation des cellules adhérentes avec 10 µM de fMLP pendant 1 ou 5 minutes n’induit toujours pas de modulation des signaux BRET (Figure 45 B et C, panels du haut). Le ratio

BRET mesuré pour le couple p87-Rluc8/p110-GFP2 en présence de Ras et de RasV12 est supérieur à celui mesuré en absence de ces protéines (Figure 45 B, panel en bas à gauche), ce qui est en accord avec les observations précédentes (Figure 42). Les ratios BRET obtenus en

présence du couple p110-Rluc8/GFP2-p87 sont également en accord avec les observations précédentes (Figure 45 C, panel en bas à gauche). Il serait nécessaire de refaire cette

expérience pour tous les couples de biosenseurs BRET des PI3K en notre possession, ainsi que de tester l’implication des protéines G hétérotrimériques et du niveau d’expression des protéines avant de pouvoir exclure de façon certaine l’implication de la condition de culture

des cellules dans l'activité de nos biosenseurs PI3K. Néanmoins, dans les expériences réalisées ici, l’adhérence des cellules ne semble pas être un critère majeur et semble en accord avec la

littérature puisqu'il est décrit que la p110 est une protéine très exprimée, et fonctionnelle, dans les cellules de type neutrophile et leucocyte qui sont des cellules circulantes rarement adhérentes [79].



Figure 45 : Mesure des interactions R/C de la PI3K par BRET dans des cellules adhérentes. A) Schéma représentatif de l’essai BRET mesurant l’interaction entre la sous-unité catalytique et régulatrice d’un

couple possible de PI3K : p110-Rluc8/p87-GFP2. B-C) Les signaux BRET sont mesurés dans des cellules

adhérentes co-exprimant les sous-unités p87 Rluc8 et p110 GFP2 (B) ou p110 Rluc8 et GFP2 p87 (C) en présence du récepteur fMLPR et en présence ou non des protéines Ras ou RasV12. Panels du haut : Les signaux BRET sont mesurés après stimulation ou non avec 10 µM de fMLP. Les résultats sont exprimés comme la différence des signaux BRET mesurés en présence et en absence de ligand. Panels en bas à gauche : Les ratios BRET sont mesurés dans chacune des conditions de transfection à l’état basal. Panels en bas à droite : Niveaux d’expression relative de la sous-unité fusionnée à la Rluc8, correspondant à l’émission de luminescence mesurée à l’état basal. Données provenant de 1-2 expériences indépendantes réalisées en quadriplicats dont les résultats sont représentés sous forme des moyennes ± s.e.m.

E. Mesures des interactions entre les sous-unités de la PI3K et les sous-unités des protéines G hétérotrimériques.

Nous venons de présenter un certain nombre d’expériences dans lesquelles nous tentions de trouver des conditions permettant de mesurer directement l’activation des dimères

p110/p87 ou p110/p101 de la PI3K en réponse à une stimulation, après avoir fusionné chaque sous-unité au donneur ou à l’accepteur d’énergie BRET, à leur extrémité N-terminale ou

fMLPR +


1 5-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010- Ras

+ Ras

+ Ras V12

Temps (min)Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P

fMLPR +


1 5-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010

+ Ras

+ RasV12

- Ras

Temps (min)Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P

Ratio BRET

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

Ra

tio

BR

ET

ba

sa

l


0

10 000

20 000

30 000

40 000

50 000

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

s

pro

téin

es

fu

sio

nn

ée

s R

luc

8 (

U.A

.)

p110

p87

fMLPR

fMLP

Ras


0

50 000

100 000

150 000

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

s

pro

téin

es

fu

sio

nn

ée

s R

luc

8 (

U.A

.)

Ratio BRET

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

Ra

tio

BR

ET

ba

sa

l

B Cp110/p87 p110/p87

A



C-terminale. Nous n’avons malheureusement jamais réussi à mesurer des modulations de signaux BRET en condition stimulée qui reflèteraient l’activation de la PI3K.

Aussi, nous nous sommes demandé si nous ne pourrions pas trouver un autre moyen indirect de mesurer l’activation des PI3K mais toujours en utilisant le principe du BRET.

Comme précédemment décrit, les PI3K sont activées par le dimère G des protéines G. Cette activation passe par une interaction directe, au niveau de la membrane plasmique, entre le

dimère G et les sous-unités catalytiques et régulatrices des PI3K [84, 93]. Nous avons donc émis l’hypothèse qu’il serait possible de visualiser par BRET les interactions se formant entre

le dimère G et les sous-unités de PI3K suite à leur activation. Etant donné que nous avons

construit au cours de ce travail des senseurs BRET de chacune des sous-unités de PI3K et que nous possédons au laboratoire des senseurs BRET des sous-unités de protéines G, nous avons réalisé des expériences préliminaires de BRET mesurant le transfert d’énergie entre une des

sous-unités de protéines G fusionnée au donneur ou à l’accepteur d'énergie (Gi1 ou G2) et l’une des sous-unités de PI3K fusionnée au donneur ou à l’accepteur complémentaire. Ces mesures de transfert d’énergie ont été réalisées dans des cellules HEK293T co-transfectées avec les sondes BRET ainsi que le récepteur fMLPR et les sous-unités de protéines G et de PI3K non étiquetées complémentaires de celles étiquetées avec les partenaires BRET (Figure 46). Dans ces expériences, nous avons essayé de nous situer à saturation du donneur d’énergie par l’accepteur. Les premiers tests ont été réalisés après stimulation des cellules avec 10 µM de FMLP pendant 1 minute (nous avons également testé 5 minutes de stimulation). Les résultats présentés Figure 46 montrent une absence totale de modulation des signaux BRET après stimulation avec le fMLP (Figure 46 B, panel du haut). Ces expériences ont également été

réalisées en présence du récepteur 2-adrénergique, un autre RCPG activateur de la PI3K au niveau cardiaque [73] et de son ligand agoniste de référence la noradrénaline, et ont fourni des résultats similaires à ceux obtenus avec le récepteur fMLPR (résultats non montrés). Ces expériences restent tout de même préliminaires et il serait nécessaire dans le futur de mesurer les signaux BRET après un temps plus long de stimulation. De plus, nous avons réalisé ces expériences en essayant de saturer le donneur d’énergie par l’accepteur. Peut-être que ces ratios de partenaires BRET ne sont pas optimaux pour visualiser les modifications de signaux BRET et il faudra donc tester d'autres ratios. Enfin, la position des partenaires BRET n’est peut-être pas permissive vis-à-vis d’un transfert d’énergie par résonance. Néanmoins, cette dernière hypothèse est peu probable car, de façon intéressante, lorsque l’on s’intéresse aux valeurs de Net BRET (Figure 46 B, panel en bas à gauche), on peut voir que certaines combinaisons de protéines G/PI3K génèrent un Net BRET à l'état basal, suggérant l’existence de complexes

protéines G/PI3K préformés. Seuls les couples p110-GFP2/Gi1-Rluc8 et p87-GFP2/Gi1-Rluc8 ne permettent pas de mesurer de transfert d’énergie à l’état basal (Figure 46 B, panel en bas à gauche, barre verte et barre beige). Ainsi, la détection de ces Net BRET est aussi

dépendante de la position des partenaires BRET au sein des complexes protéines G/ PI3K.



Figure 46 : Mesure des interactions entre les sous-unités p110 ou p87 des PI3K et les sous-

unités Gi1 ou G2 des protéines G hétérotrimériques par BRET. A) Schéma représentatif de l’essai BRET mesurant l’interaction entre les sous-unités de protéines G et les sous-

unités de PI3K. B) Les cellules HEK293T sont co-transfectées transitoirement avec les sous-unités p110 et p87

des PI3K et les sous-unités Gi1, G1 et G2 des protéines G en présence du récepteur fMLPR. Les protéines fusionnées à la Rluc8 ou à la GFP2 sont indiquées dans la légende à gauche des graphiques. Panel du haut : Les signaux BRET sont mesurés après stimulation ou non avec 10 µM de fMLP pendant 1 minute. Les résultats sont exprimés comme la différence des signaux BRET mesurés en présence et en absence de ligand. Panel en bas à gauche : Les Net BRET sont mesurés en condition basale et correspondent à la différence entre le ratio BRET mesuré entre la Rluc8 et la GFP2 et le ratio BRET mesuré en présence du donneur d’énergie exprimé seul. Panel en bas à droite : Niveaux d’expression relative de la sous-unité fusionnée à la Rluc8, correspondant à l’émission de luminescence mesurée à l’état basal. Données provenant de 4 expériences indépendantes dont les résultats sont représentés sous forme des moyennes ± s.e.m. L’analyse statistique a été réalisée en utilisant un test-t de Student apparié comparant la modulation BRET dans la condition stimulée et la condition non stimulée correspondante.

Ces valeurs de Net BRET basales peuvent correspondre à une interaction spécifique entre nos deux protéines fusionnées aux partenaires BRET ou à des interactions aléatoires du fait de la grande quantité de protéines accepteuses d’énergie qui peut se retrouver à proximité du donneur d‘énergie. Pour vérifier si les interactions mesurées sont réellement spécifiques, nous avons réalisé des courbes de saturation BRET, comme précédemment décrit Figure 33, en co-transfectant des cellules HEK293T avec les paires de sous-unités de protéines G et de PI3K

qui présentent un signal Net BRET basal, p110-Rluc8/GFP10-G2, p87-Rluc8/GFP10-G2,

Rluc8-p87/GFP10-G2, GFP2-p110/Gi1-Rluc8 et GFP2-p87/Gi1-Rluc8, en présence du récepteur fMLPR (Figure 47). Les résultats montrent que, dans le cas des couples faisant

Net BRET

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

Net

BR

ET

fMLPR + G1

G i1 G2 p110 p87

-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010

Mo

du

lati

on

du

BR

ET

par

le f

ML

P


0

50 000

100 000

150 000

200 000

Ex

pre

ss

ion

re

lati

ve

de

s

pro

téin

es

fu

sio

nn

ée

s R

luc

8 (

U.A

.)

A B

p110

p87

fMLPR

fMLP

i1

1

2

p110-Rluc8 + GFP10-G2

p87-Rluc8 + GFP10-G2

Rluc8-p87 + GFP10-G2

p110-GFP2 + Gi1-Rluc8

GFP2-p110 + Gi1-Rluc8

p87-GFP2 + Gi1-Rluc8

GFP2-p87 + Gi1-Rluc8

p110/p87



intervenir la sous-unité G2 (Figure 47 B-D), nous n’avons pas complètement atteint le plateau

de saturation. En revanche, les courbes réalisées en présence de la sous-unité Gi1 ont une forme hyperbolique et permettent d’obtenir des valeurs de BRETmax et de BRET50, reportées dans le Tableau 6, qui ne semblent pas trop exagérées par le logiciel (Figure 47 E, F ; Tableau 6). Ainsi, il semblerait que les sous-unités de protéines G et de PI3K interagissent spécifiquement en absence de stimulation. Les valeurs de BRET50 peuvent être assez élevées,

seul le couple GFP2-p110/Gi1-Rluc8 présente un BRET50 inférieur à 1 (0,5) (Tableau 6), ce qui représente une affinité relative assez basse au regard des valeurs de BRET50 obtenues avec les courbes de saturation entre les sous-unités catalytiques et régulatrices de PI3K (Tableau 5). Nous pouvons noter que les courbes de saturation contrôles, réalisées en présence d’une protéine GFP2 soluble, se situent au-dessus des courbes réalisées en présence de nos protéines d’intérêt avec néanmoins des valeurs de BRET50 supérieures, en présence de la GFP2, à celles obtenues en présence de la protéine d’intérêt (non montré). Ce résultat signifie que pour un ratio de protéines donné, le transfert d’énergie est meilleur en présence de la GFP2 soluble plutôt qu’en présence de la protéine d’intérêt mais que l’affinité relative est meilleure en présence de nos protéines d’intérêt plutôt qu’en présence de la GFP2 soluble. Ce résultat pourrait rendre compte d'un phénomène collisionnel important et propice au transfert d'énergie entre la GFP2 soluble et nos protéines d'intérêt, mais non spécifique étant donné l'absence de saturation.

Tableau 6 : Valeurs de BRETmax et BRET50 obtenues pour 5 combinaisons de biosenseurs BRET

des PI3K et protéines G hétérotrimériques Les valeurs de BRETmax et BRET50 sont obtenues à partir des courbes de saturation présentées Figure 47.

Paires BRET BRETmax BRET50

p110-Rluc8GFP10-G2

0.09116 7.052

p87-Rluc8GFP10-G2

0.05336 1.410

Rluc8-p87GFP10-G2

0.06655 2.491

GFP2-p110Gi1-Rluc8

0.01687 0.5294

GFP2-p87Gi1-Rluc8

0.03751 1.273



Figure 47 : Courbes de saturation BRET mesurant les interactions entre les sous-unités de

protéines G hétérotrimériques et les sous-unités de PI3K. A) Schéma représentatif de l’essai BRET mesurant l’interaction entre les sous-unités de protéines G et les sous-

unités de PI3K. B-F) Les cellules HEK293T sont co-transfectées transitoirement avec les sous-unités GFP10-G2

(B-D) ou Gi1-Rluc8 (E, F) en présence des sous-unités p87 ou p110, fusionnées en N- ou en C-terminal de façon complémentaire entre le donneur et l’accepteur d’énergie (courbes colorées), ou d’une protéine GFP2 soluble (courbes noires). Les protéines fusionnées à la Rluc8 sont transfectées à une concentration fixe et les partenaires GFP2 sont transfectés à concentrations croissantes. Les Net BRET sont mesurés en condition basale et correspondent à la différence entre le ratio BRET mesuré entre la Rluc8 et la GFP2 et le ratio BRET mesuré en présence du donneur d’énergie exprimé seul. Les valeurs de BRETmax et de BRET50 sont reportées dans le Tableau 6. Données provenant de 3-4 expériences indépendantes. L’analyse des courbes a été réalisée par régression non linéaire à l’aide d’un modèle assumant l’existence d’un seul site de liaison.

B

D

F

C

E

p110

p87

fMLPR

fMLP

i1

1

2

A110Rluc8 / GFP10-G2

0 2 4 6 8 10 120.00

0.05

0.10

0.15

p110-Rluc8 + GFP10 G2

p110-Rluc8 + GFP2


Net

BR

ET

p87-Rluc8 / GFP10-G2

0 2 4 6 80.00

0.05

0.10

0.15

0.20

p87-Rluc8 + GFP2

p87-Rluc8 + GFP10 G2


Net

BR

ET

Rluc8-p87 / GFP10-G2

0 2 4 60.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Rluc8-p87 + GFP2

Rluc8-p87 + GFP10 G2


Net

BR

ET

GFP2-p110 / G i1-Rluc8

0.0 0.5 1.0 1.50.000

0.005

0.010

0.015

GFP2 p110 + G i1 Rluc8

GFP2 + G i1 luc8


Net

BR

ET

GFP2-p87 / G i1-Rluc8

0 2 4 60.00

0.01

0.02

0.03

0.04

GFP2 p87 + G i1 Rluc8

GFP2 + G i1 luc8


Net

BR

ET



V. CONCLUSION ET DISCUSSION

A. Les interactions entre les sous-unités catalytiques et régulatrices

des PI3K

Dans ce travail, nous avons développé des biosenseurs basés sur le principe du BRET2

pour mesurer l’activité des PI3K, en mesurant directement les interactions entre la sous-unité

catalytique p110 et l’une des sous-unités régulatrices p87 (dimère p110/p87) ou p101

(dimère p110/p101). L’ensemble de nos protéines de fusion BRET présente, à l’état basal, une localisation cytosolique lorsqu’elles sont exprimées seules dans les cellules HEK et sont délocalisées à proximité des noyaux en présence de la protéine Ras sous sa forme constitutivement active, RasV12. Cette délocalisation en présence de RasV12 est observée par immunofluorescence dans la littérature et corrèle avec l’activation de la PI3K en présence de RasV12 [224]. Ces observations, ajoutées aux données de la littérature quant à la fonctionnalité

conservée des PI3K malgré l’ajout d’étiquettes protéiques à leurs extrémités N ou C-terminales [84, 174], nous permettent de conclure que la fonctionnalité de nos constructions

PI3K-BRET n’est probablement pas altérée.

Nous avons réalisé des mesures de BRET en condition basale et stimulée afin de trouver un couple de biosenseurs et une condition expérimentale qui permettraient de mesurer de façon optimale l’activation de chaque dimère soit sous forme de dynamique d’association/dissociation entre les sous-unités catalytiques et régulatrices soit sous forme de réarrangements conformationnels. En mesurant les interactions R/C par BRET, nous avons observé, à l’état basal, un Net BRET non nul et spécifique pour chacune des combinaisons

possibles de p110/p87 et p110/p101. Nous pouvons conclure à l’existence d’interactions entre ces sous-unités à l’état basal. Nos expériences BRET ne permettent pas de déterminer où se produisent ces interactions puisque les signaux que nous mesurons peuvent provenir indifféremment de l’ensemble des compartiments cellulaires. Ces interactions sont détectables quelle que soit la position des partenaires BRET avec des intensités de signal BRET spécifiques ce qui confirme l’importance de tester toutes les orientations possibles. Ce résultat est en accord avec la littérature où des interactions basales entre sous-unités catalytiques et régulatrices ont été montrées par des méthodes biochimiques (chromatographie à échange d’ions, et immuno-précipitation) ou par FRET [84, 174, 227, 228]. L’utilisation de méthodes biochimiques laisse supposer que ces interactions sont assez fortes puisque non détruites par les différents tampons et détergents utilisés.

L’activation des PI3K et les mesures des modulations de signaux BRET au sein des dimères R/C ont été réalisées dans des conditions extrêmement variées : deux ratios de donneur et d’accepteur d’énergie, deux niveaux d’expression des protéines, différentes concentrations de ligand et différents temps de stimulation, deux modes de culture des cellules (suspension/adhérence) et différents couples ligand/récepteur. Aucune de ces conditions ne nous a permis d’observer une modulation des signaux BRET par rapport aux conditions basales. Nous pouvons conclure de ces expériences que le positionnement des partenaires

BRET aux extrémités terminales (N- ou C-terminale) de chacune des sous-unités R/C des PI3K ne permet pas de refléter l’activation des dimères en réponse à un stimulus. Ainsi nous

pouvons émettre l’hypothèse selon laquelle l’activation des dimères de PI3K fait



davantage intervenir des modifications conformationnelles intra-protéiques et non un phénomène d’association-dissociation physique, qui normalement aurait été visible du fait de la grande sensibilité de la technique BRET2 utilisée. Les mécanismes moléculaires sous-jacents

à l’activation de la PI3K ne sont pas connus à l’heure actuelle. Néanmoins, s’il n’a jamais été décrit une dissociation franche des sous-unités composant les dimères de PI3K, quelles que

soient les isoformes qui les composent, il est proposé, dans le cas de la PI3K, que des

changements conformationnels intramoléculaires de la sous-unité régulatrice p85 permettent de rompre les contacts inhibiteurs inter-protéiques par éloignement des domaines

SH2 de p85 et ainsi de lever l’inhibition de l’activité catalytique de p110 [91]. Même si les

sous-unités régulatrices de PI3K et PI3K sont différentes puisque leurs séquences ne

présentent aucune homologie, au vu de nos résultats et parce que les PI3K et appartiennent malgré tout à la même famille de protéines, nous pouvons imaginer des mécanismes similaires

de régulation de l’activité de la PI3K.

Différentes nouvelles stratégies pourraient être envisagées pour être capable de mesurer les réarrangements structuraux des dimères R/C. En particulier, nous pourrions développer deux types de biosenseurs BRET intramoléculaires. Nous pourrions ainsi fusionner

les deux partenaires BRET aux extrémités d’une même sous-unité R ou C de PI3K, comme cela existe pour mesurer l’activation de protéines monomériques telles que PTEN [229] ou EPAC [214], ou nous pourrions fusionner l’un ou les deux partenaires BRET en une position interne de la séquence de l’une ou des deux sous-unités, comme c’est le cas pour les biosenseurs BRET mesurant l’activation des protéines G hétérotrimériques [210]. L’inconvénient majeur du premier type de biosenseur sera l’absence d’information quant à la composition précise des dimères activés même si ces changements peuvent être mesurés en présence de la sous-unité R ou C complémentaire et non étiquetée. Le développement du deuxième type de biosenseur reste plus complexe dans la mesure où il est nécessaire de connaitre plus ou moins la position des différents domaines fonctionnels dans la séquence des protéines afin de ne pas altérer leur

fonction/régulation. Nous connaissons ceux de la p110 mais nous ne connaissons pas ces domaines dans le cas des sous-unités régulatrices p87 et p101. L’idéal serait de connaitre la structure quaternaire du complexe protéique R/C afin de ne pas, en plus, engendrer d’encombrement stérique compromettant la fonctionnalité des protéines. Le développement de ces biosenseurs n’est certes pas impossible mais trouver la position adéquate pour des mesures en BRET prendrait à l’évidence longtemps.

Avant de conclure définitivement que nos biosenseurs BRET n’étaient pas adéquats

pour mesurer l’activation des dimères R/C de PI3K, nous nous sommes demandé si l’activation correcte des PI3K ne nécessitait pas la présence de cofacteurs tels que les protéines

G et la protéine Ras. L’ajout de ces cofacteurs n’a cependant pas permis d’observer de modification des signaux BRET après stimulation du récepteur fMLPR. Ainsi, l’ajout de

cofacteurs n’est pas déterminant pour visualiser l’activation des PI3K lors de l’insertion des partenaires BRET aux extrémités des sous-unités R/C. Ce résultat confirme que l’absence de modulation précédemment observée est davantage liée à la position des partenaires BRET sur chacune des sous-unités R/C plutôt qu’à un manque de co-activateurs.

De façon intéressante, à l’état basal, nous avons constaté une augmentation des valeurs

de Net BRET pour certaines combinaisons de biosenseurs R/C des dimères p110/p87 et

p110/p101 en présence des protéines Ras et RasV12 pour des niveaux similaires d’expression



relative du donneur et de l’accepteur d’énergie. Ce résultat indique très probablement que l’ajout de ces protéines induit des modifications de conformation au sein des dimères R/C permettant le rapprochement et/ou la réorientation des dipôles des partenaires BRET dans une configuration plus permissive au transfert d’énergie et qui ne sont détectables que pour certaines paires de biosenseurs BRET. Ne mesurant que des signaux entre R et C, nous ne pouvons déterminer si l’impact des protéines Ras sur les conformations de PI3K provient d’une interaction directe entre ces protéines. Néanmoins, il est connu que RasV12 peut activer la

PI3K, en absence d’autres stimulations, via une interaction directe entre RasV12 et la sous-

unité p110 [87, 104]. Nous pouvons donc émettre l’hypothèse selon laquelle la modification du ratio BRET que nous mesurons en présence de RasV12 provient d’une

interaction directe au moins avec la sous-unité p110 et reflète son activation. Ce reflet

de l’activation de PI3K est corroboré par l’augmentation de ratio BRET plus importante en présence de RasV12 par comparaison à celle mesurée en présence de Ras non active, et par les expériences d’immunofluorescence précédemment citées.

Il est intéressant de noter que nous sommes capables de mesurer des changements de

BRET, reflétant potentiellement l’activation des dimères p110/p87 et p110/p101, en présence de RasV12 mais pas après stimulation d’un couple ligand/RCPG, du moins avec les quelques couples RCPG testés dans cette étude. Cela pourrait suggérer que les mécanismes

moléculaires sous-jacents à l’activation des PI3K par Ras et par un RCPG impliquent des

réarrangements structuraux de la PI3K différents. Pour aller plus loin, ces réarrangements structuraux différents pourraient permettre l’activation en aval d’effecteurs spécifiques en fonction de la stimulation à l’origine de l’activation de la PI3K participant ainsi au contrôle spatio-temporel de la signalisation qui leur est associée [108, 109].

En se basant sur l’interaction directe montrée entre RasV12 et p110, sur l’augmentation de ratio BRET similaire mais moins importante en présence de Ras comparée à RasV12 et à la présence d’un domaine de liaison à Ras (domaine RBD) dans la structure de

p110, nous pouvons émettre l’hypothèse selon laquelle la modification de conformation

des dimères de PI3K observée en présence de Ras provient d’une interaction directe entre ces protéines à l’état basal. Lorsque l’on consulte la littérature, il est surprenant de découvrir que si l’activation des PI3K par Ras est largement connue, les interactions entre ces deux protéines sont beaucoup moins étudiées. Une interaction basale entre Ras inactive et

PI n’a été décrite qu’une fois, en 1999, lorsque Rubio et collègues, en étudiant le rôle des

modifications post-traductionnelles de Ras sur les interactions Ras/p110, ont clairement montré par des expériences de GST-pull down que la forme de Ras inactive (liée au GDP)

interagit avec p110 [230]. Cependant, les auteurs ne discutent pas ce résultat et il est étonnant

de constater que cette interaction entre Ras inactive et la p110 n’a jamais été étudiée par la suite.

En effet, les travaux réalisés plus tard ne cherchent pas à comprendre les interactions PI3K/Ras mais utilisent des mutants de p110 délétés pour le domaine d’interaction RBD pour étudier les conséquences phénotypiques de l’absence d’interaction PI3K/Ras [109, 231, 232]. Les quelques études antérieures s’intéressant aux interactions directes PI3K/Ras active liée au GTP, et utilisant Ras-GDP en contrôle négatif ont été réalisées in vitro et n’ont pas permis de mettre en évidence une interaction entre ces deux protéines [104, 233]. Une explication potentielle pourrait provenir des méthodes utilisées pour observer les interactions Ras/PI3K



qui sont des méthodes d’immuno-précipitation suivies d’immuno-réaction de type western blot. Ces méthodes présentent plusieurs défauts qui ne les rendent pas adéquates pour l’étude de certaines interactions protéine-protéine. En effet, les cellules doivent être lysées à l’aide de solutions tampons dont la composition et la stringence, inhérentes au choix du détergent et à sa proportion dans la solution, déterminent grandement le résultat de l’expérience. A cela s’ajoute le manque de sensibilité et de spécificité dont peuvent faire preuve les immuno-réactions. Cependant, en 2009, Tsutsumi et collègues ont utilisé la nouvelle technologie du BiFC (Bi-molecular Fluorescence Complementation) permettant de mesurer des interactions protéine-protéine par reconstitution d’un fluorophore en temps réel dans des cellules vivantes

afin de mesurer l’interaction Ras/RBD-p110 [224]. Dans cette étude, les auteurs ne discutent pas un résultat pourtant visible sur les photos de fluorescence et que les auteurs ont quantifié, qui pourrait correspondre à une interaction basale entre Ras inactive et le domaine RBD de

p110 [224]. Cette étude, associée à celle de Rubio et à nos résultats, soutient réellement

l’existence d’une interaction basale entre Ras et les PI3K et vient appuyer notre hypothèse d’une interaction qui ne serait visible que via l’utilisation d’outils suffisamment sensibles et résolutifs. Par ailleurs, il a déjà été observé, par immuno-précipitation, des interactions basales

entre p110 et d’autres protéines, telles que PDE3B [69] ou PKC [234].

Ras est une protéine localisée au niveau des membranes intracellulaires et pouvant être compartimentée au sein de micro-domaines membranaires particuliers [113, 114]. Nous

pourrions donc supposer que cette interaction basale entre Ras et la PI3K sert à localiser et compartimenter au moins une partie des PI3K au niveau de certaines membranes intracellulaires spécifiques afin d’optimiser la régulation spatio-temporelle de la signalisation qui leur est associée. La compartimentation de la signalisation PI3K/Akt a notamment été décrite [110-112].

B. Les interactions PI3K/protéines G hétérotrimériques

Dans notre étude, nous avons mesuré également par BRET les interactions entre les

sous-unités G et G des protéines G hétérotrimériques et les sous-unités p110 et p87 des

PI3K dans le but de mesurer le recrutement des PI3K au niveau des dimères G des protéines G qui reflèterait indirectement leur activation. De façon surprenante, nous avons mesuré un signal Net BRET basal, et spécifique, qui n’a pas été modifié après stimulation du récepteur fMLPR. Ce résultat suggère i/ l’existence d’une interaction directe basale en absence de stimulation entre les PI3K et les protéines G et ii/ que le recrutement des PI3K par les

protéines Gn’est pas détectable avec ces biosenseurs BRET. Ces deux observations sont d’autant plus étonnantes que i/ une interaction basale PI3K/protéines G n’a encore jamais été décrite dans la littérature et ii/ les biosenseurs basés sur le principe du BRET2 sont généralement suffisamment sensibles pour mesurer les phénomènes de recrutement des protéines impliquant de grandes modifications de distance.

Il est sans doute plus probable que les interactions basales que nous mesurons soient liées à une interaction sous forme active des PI3K et des protéines G. En effet, dans les années

90, il a été décrit que la co-expression de G avec les PI3K résulte en leur activation [92, 94, 227]. Les interactions PI3K/protéines G ont donc toujours été associées, par corrélation, à des interactions sous forme active des protéines. Cela signifierait alors que nous sommes capables de mesurer les interactions entre protéines G et PI3K actives induites par la co-expression de



ces protéines. Dans ce cas, l’absence de modulation des signaux BRET après stimulation peut alors résulter soit d’un temps de stimulation du récepteur trop court soit du fait que toutes les PI3K ont déjà été recrutées. Pourtant, dans nos expériences, nous avons montré que le ligand fMLP, en présence de son récepteur fMLPR, est capable d’activer pleinement les protéines G après ce même temps court de stimulation. Cela signifie que ces protéines G devraient

normalement être capables de recruter les PI3K et ainsi augmenter encore plus les signaux

BRET mesurés entre PI3K et protéines G. Or nous ne voyons pas cette augmentation. Par conséquent, il semblerait que nous ne soyons pas en mesure de détecter les interactions sous forme active des PI3K et des protéines G. Nous pouvons donc postuler que ces interactions en absence de stimulation sont des interactions directes et inactives correspondant à une pré-association PI3K/protéines G en absence de stimulation. Nous pourrions proposer que ces interactions basales n’ont jamais été décrites du fait que la co-immuno-précipitation de ces protéines est, depuis leur découverte, attribuée à leur état actif et n’a jamais été remise en question. De plus, pour les mêmes raisons que nous avons citées précédemment dans le cas des interactions Ras/PI3K inactives, il existe la possibilité que ces interactions à l’état inactif soient plus labiles que celles à l’état actif rendant les méthodes biochimiques utilisées jusqu’alors inadéquates pour leur détection. A cela semble s’ajouter également un manque d’intérêt pour les mécanismes moléculaires régulant ces interactions.

Si notre hypothèse est vraie alors il semblerait qu’au moins une partie des PI3K puisse

être pré-associée à une partie des protéines G. Comme dans le cas de la protéine Ras, les protéines G sont des protéines généralement localisées au niveau de la membrane plasmique, pouvant être compartimentées au sein de micro-domaines de type raft lipidique dans lesquels sont retrouvés également certains de leurs effecteurs [118, 235, 236]. La pré-association par interaction directe des protéines G hétérotrimériques avec différents effecteurs membranaires a déjà été décrite [237, 238]. Ainsi, nous pouvons émettre l’hypothèse que ces pré-complexes PI3K/protéines G pourraient être localisés au niveau de ces différents compartiments cellulaires permettant le contrôle spatio-temporel précis de la signalisation associée aux PI3K.

C. Discussion générale

Les connaissances sur la signalisation des récepteurs et les interactions protéiques proviennent de travaux utilisant des techniques biochimiques développées il y a plus d’un siècle. Ces techniques biochimiques ont permis de découvrir les grands principes de la vie cellulaire et de révéler un grand nombre de mécanismes moléculaires mis en jeu notamment lors de l’activation de protéines. Cependant, nous arrivons aujourd’hui à un moment où ces méthodes ne sont plus suffisamment résolutives, sensibles et spécifiques pour décortiquer réellement les interactions protéine-protéine qui se produisent en temps réel dans les cellules vivantes et leurs implications dans la régulation des signalisations intracellulaires.

Grâce à la nouvelle technologie du BRET2 qui permet de mesurer les interactions entre protéines entières de façon très fine en cellules vivantes et en temps réel, nous avons mis en évidence dans ce travail des interactions protéine-protéine à l’état basal qui n’avaient jusque-là jamais été décrites. En nous appuyant sur les connaissances de la littérature quant à l’existence de pré-complexes RCPG/protéines G [208], protéines G/effecteurs [237] et RCPG/effecteurs [238] impliqués dans la compartimentation de la signalisation calcique, des nucléotides cycliques ou de l’oxyde nitrique par exemple [239], nous pouvons proposer une hypothèse



originale postulant l’existence de pré-complexes composés d’isoformes particulières des

dimères de PI3K, p110/p87 ou p110/p101, des protéines Ras, des protéines G hétérotrimériques, et des RCPG, qui pourraient être compartimentés au sein de micro-domaines membranaires spécifiques, par exemple de type raft lipidique, constituant ainsi des « unités fonctionnelles » particulières (Figure 48). Ces unités fonctionnelles pourraient alors avoir un rôle de plateformes de signalisation assurant la spécificité, la dynamique et le contrôle

spatio-temporel précis de la signalisation des PI3K. Nous pourrions étendre ce concept à la classe IA des PI3K, dont les RTK activateurs ont également été montré compartimentés et pré-associés à certains effecteurs [115, 240].

Ces pré-complexes de PI3K pourraient avoir un rôle majeur pour le développement de molécules thérapeutiques. En effet, connaitre les signalisations et conséquences phénotypiques et biologiques associées à chacune des unités fonctionnelles des PI3K pourrait permettre de trouver de futurs médicaments ayant une meilleure efficacité tout en diminuant leurs effets indésirables. Une molécule de ce genre, le TRV130, est justement actuellement en phase III des essais cliniques [241]. Cette molécule active uniquement la voie protéine G dépendante du

récepteur µ-opioïde au détriment de la voie -arrestine et permet d’obtenir les effets analgésiques thérapeutiques sans induire de dépression respiratoire indésirable. Dans le contexte de notre projet, la caractérisation de ces unités fonctionnelles de PI3K pourrait permettre d’identifier, lors du criblage de molécules afin d’en déterminer le potentiel cardiotoxique, celles qui inhiberaient sélectivement les PI3K responsables du développement des cancers dans les cellules tumorales, mais n’affecteraient pas, dans les cardiomyocytes, les voies de signalisation nécessaires à leur fonctionnement.



Figure 48 : Schéma hypothétique proposé à l’issue de ce travail de thèse sur l’activation des

PI3K. Au sein des membranes cellulaires, dans différents micro-domaines définis notamment par leur composition en

lipides et cavéoles, sont regroupés et associés en position inactive des RCPG, des protéines G

hétérotrimériques, des PI3K, des effecteurs (E) et/ou des protéines Ras, constituant des « unités fonctionnelles » particulières. En fonction des isoformes de ces protéines présentes dans le complexe et de leur localisation dans un domaine donné, la signalisation résultante de leur activation sera spécifique. Ainsi, un même ligand au travers d’un même récepteur peut déclencher l’activation de voies de signalisation différentes, c’est le principe de la sélectivité fonctionnelle des ligands.

Unité fonctionnelle 1

Domaine 1

Domaine 2

Domaine 3

Ligand

RCPG

Réponsephysiologique 1



Unité fonctionnelle 2 Unité fonctionnelle 3

Signal 1

Signal 2

Signal 3



TRAVAUX ANNEXES :

RESULTATS EXPERIMENTAUX SUPPLEMENTAIRES





ETUDE N°2:

DELINEATING BIASED LIGAND EFFICACY AT 7TM RECEPTORS FROM AN EXPERIMENTAL

PERSPECTIVE



Résumé

Le travail de thèse que nous venons de présenter nous a permis d’émettre l’hypothèse de l’existence de complexes protéiques pré-associés regroupant des RCPG et différents effecteurs, tels que les protéines G hétérotrimériques, les protéines Ras et les PI3K, au sein d’un même domaine membranaire créant ainsi des unités fonctionnelles. Selon cette hypothèse, en fonction de l’unité fonctionnelle à laquelle se liera un ligand, celui-ci sera capable de sélectionner l’activation de voies de signalisation particulières. Ce concept de sélection de voies de signalisation par un ligand est déjà évoqué dans le domaine d’étude de la signalisation des RCPG sous le nom d’agonisme biaisé.

L’agonisme biaisé est un concept proposé dans les années 90 qui a été particulièrement étudié dans le cas des RCPG [205, 242]. Avant l’émergence de cette notion, il était décrit qu’un ligand, en se liant à son récepteur, pouvait activer toutes les voies de signalisation associées à ce récepteur. Ainsi le récepteur n’existait que sous deux états, actif ou inactif, et l’efficacité (agoniste, antagoniste ou agoniste inverse) des ligands était définie en fonction de ce récepteur. Le concept d’agonisme biaisé, ou de sélectivité fonctionnelle des ligands, énonce qu’un ligand peut en fait sélectionner l’activation d’une voie de signalisation associée au récepteur au détriment des autres, via la stabilisation de conformations particulières du récepteur, et que l’efficacité des ligands est alors définie au travers d’un couple récepteur/effecteur. Cette notion a des implications majeures en pharmacologie clinique puisqu’elle sous-entend qu’il serait possible de trouver des molécules ayant une grande efficacité thérapeutique associée à une réduction des effets secondaires indésirables selon le couple récepteur/effecteur ciblé.

Ainsi, la caractérisation in vitro de l’efficacité biaisée des ligands est nécessaire pour une future utilisation in vivo en clinique. Dans la revue présentée ci-après, nous nous sommes intéressés aux paramètres expérimentaux pouvant influencer l’évaluation de l’efficacité biaisée des ligands et qui sont liés notamment au choix i/ du modèle cellulaire, ii/ de la voie de signalisation, c’est-à-dire choix de l’effecteur, et iii/ de la méthode expérimentale.

Les références bibliographiques que nous avons réunies dans cette revue scientifique nous permettent de conclure que pour évaluer l’efficacité biaisée de ligands il est impératif de tenir compte i/ du modèle cellulaire sur lequel les essais vont être effectués (statut physiologique/pathologique, cultures cellulaires primaires/établies…), ii/ de l’interconnexion importante des voies de signalisation justifiant la nécessité de se positionner au plus près des récepteurs d’intérêt en mesurant l’activation d’effecteurs situés très en amont de la

signalisation, comme par exemple les protéines G hétérotrimériques ou les -arrestines, et iii/ de tenir compte des interférences et des altérations intracellulaires inhérentes à la technique expérimentale elle-même (protéines surexprimées/endogènes, suspension/adhérence/lyse des cellules…). Une calibration précise de chacun de ces paramètres et une homogénéisation des conditions expérimentales devraient être réalisées systématiquement pour pouvoir comparer l’efficacité biaisée de ligands sur différentes voies de signalisation.

En révision dans The International Journal of Biochemistry and Cell Biology.



Delineating biased ligand efficacy at 7TM receptors

from an experimental perspective

Ségolène Galandrina*, Lauriane Onfroya*, Mathias Charles Poirota*, Jean-Michel Sénarda,b, Céline Galésa

a Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires (I2MC), INSERM, UMR 1048, Université Toulouse, F-31432 Toulouse

b Service de Pharmacologie Clinique, Faculté de médecine, Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse, F-31432 Toulouse, France

*These authors contributed equally to this work

Corresponding author : Dr Céline Galés

Address: INSERM UMR1048

Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires - I2MC

1, avenue Jean-Poulhès - BP84225

31432 Toulouse cedex 4

France

Phone: 33-5-61-32-29-21 / 33-5-61-31-22-40-72

Fax: 33-5-62-17-25-54

Email: [email protected]

Key words:

G protein coupled receptor Functional selectivity Bias factor Resonance energy transfer

-arrestin Second messengers

mailto:[email protected]



Contents

1. Biased agonism at a glance

2. Evaluation of biased agonism: choice of the cellular model

2.1 Primary cell lines versus recombinant systems

2.2 Cellular content and protein expression levels

2.3 Physical properties of cellular plasma membranes

2.4 Microenvironment, extracellular matrix and cell density

3. Evaluation of biased agonism: choice of the signaling pathways

3.1 GPCR canonical versus peculiar signaling pathways

3.1.1 G protein signaling pathways

3.1.2 G protein-independent signaling pathways

3.2 Common effectors for diverse signaling pathways

3.3 Which pathway to select?

4. Evaluation of biased agonism: choice of the assays

4.1 Second messenger-based assays

4.2 Assays catching initial signaling events

4.3 Assays monitoring temporal and spatial events

4.4 Quantifying biased activity or depicting ligand texture?

Acknowledgements

References



Abstract

During the last 10 years, the concept of “biased agonism” also called “ligand-directed trafficking” swamped the pharmacology of 7 transmembrane receptors (7TM) and paved the way for developing signaling pathway-selective drugs with increased efficacy and less adverse effects. Initially thought to select the activation of only a subset of the signaling pathways by the reference agonist, bias ligands revealed higher complexity as they have been shown to stabilize variable receptor conformations that associate with distinct signaling events from the reference. Today, one major challenge relies on the in vitro determination of the bias and classification of these ligands, as a prerequisite for future in vivo and clinical translation. In this review, current experimental considerations for the bias evaluation related to choice of the cellular model, of the signaling pathway as well as of the assays are presented and discussed.

1. Biased agonism at a glance

Seven transmembrane (7TM) receptors also commonly known as G protein coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of cell surface receptors. As general sensors/convertors of extracellular stimuli at the plasma membrane into intracellular signaling modules, they ensure cells to adapt to their environment, thus orchestrating a broad range of physiological processes. Obviously, they have for long time been considered as attractive pharmaceutical targets with, today, ~ 35 % of marketed drugs targeting GPCRs. However, despite providing the desirable effect, these drugs generally face the problem of concomitant side effects more or less undesirable that sometimes unbalance the clinical benefit/risk ratio and thus limit their use. These off-targets effects have been classically associated for a long time with an inherent lack of receptor selectivity of these drugs. However, these last 15 years, careful dissection of the molecular mechanisms underlying GPCRs ligand efficacy shed new light on this aspect.

According to the classical pharmacology, GPCRs were believed to work linearly as on/off switches, activating or shutting down the whole signaling array associated with a peculiar receptor and with all agonists activating a similar set of signaling pathways (Fig. 1A). In line with this concept, ligand efficacy has been defined according to its ability to oscillate the receptor from its inactive (off) to active (on) state. Accordingly, full and partial agonists oscillate the receptor toward the active state, full and partial inverse agonists favor the transition of the receptor toward inactive state, while neutral antagonists do not modify the on-off equilibrium while blocking agonist/inverse agonist action. However, the revolutionary concept of “biased agonism” or " ligand-functional selectivity" (Kenakin, 1995, , 2011) postulated that some ligands can indeed stabilize different active receptor conformations and thus elicit activation of only a subset of signaling pathways associated with the receptor-reference ligand (Fig.1B) or even new signaling (Fig. 1C) (Santos et al. , 2015, Sauliere et al. , 2012). This now well-established paradigm dramatically impacts GPCR drug discovery, since it was clearly demonstrated that biased ligands can activate or block specific intracellular pathways linked to disease outcomes. In the end, biased agonism paves the way for the development of pathway-specific drugs with increased efficacy and less adverse effects for an ensuing better clinical benefit/risk ratio. For instance, TRV130, a G protein-biased ligand currently in Phase III clinical trials for the treatment of acute pain dissociates opiate-related



respiratory depression from desirable analgesia by favoring the G protein dependent signaling

of the µ opioid receptor over the-arrestin deleterious one (Viscusi et al. , 2016). Conversely,

TRV120027, a -arrestin-biased AT1-R ligand, is currently in Phase IIb for the treatment of

acute heart failure with promising specific targeting of the -arrestin dependent myocardial protection (increased contractility and decreased apoptosis) while antagonizing the deleterious Gq-dependent vasoconstriction (Felker et al. , 2015).

Biased agonism deeply modifies the pharmacological classification of ligand efficacy which does no longer exclusively relate on a ligand-receptor (L-R) pair as previously stated, but rather on a ligand-receptor-effector (L-R-E) tripartite, thus highlighting the pluridimensionality of efficacy (Galandrin et al. , 2007). Accordingly, one ligand can elicit agonist efficacy on the R-E1 couple while acting at the same time as an antagonist on the R-E2 one, for the same receptor. The 6’-Guanidinonaltrindole (6’-GNTI) dual G protein-biased

agonist and -arrestin antagonist at the -oipoid receptor nicely illustrates this notion (Rives et al. , 2012). Now, from drug discovery standpoint, identification of biased ligands in the context of the pleiotropic GPCR signaling is not an easy task and raises several questions: which cellular model to select? Which signaling pathway to probe? Which assay to use? How to quantify/illustrate it? We will try to discuss these different aspects in the following sections.

2. Evaluation of biased agonism: Choice of the model / cellular parameters influencing biased

2.1 Primary / recombinant cell lines and others

One of the first questions arising when initiating the identification of a biased ligand relies on the choice of the cellular model to use. Indeed, it is clear that the significance of the in vitro bias of a ligand with its in vivo activity remains totally elusive. Obviously, the in vivo response to a ligand does not arise from a unique cell response but most probably results from the overall actions of specific concentration of both target receptor and ligand in different cell types in the organism, all producing different levels of bias. Moreover, we are still far from understanding the physiological relevance of the intracellular signaling pathways, thus making difficult the assumption to screen for a specific signaling pathway over the other in view of an expected clinical outcome. Another complexity arises from the patho-physiological state when using such biased ligands since diseases can also impact on the intracellular pathways and thus will modify the bias activity. In this context, in vitro biased ligand characterization has to be viewed as a simple first step for the identification of compounds exhibiting selective signaling signature with no a priori on the cell line. The cell can thus be imaged as a test tube allowing screening for a maximum of signaling possibilities. Now, cell lines can really differ in terms of intracellular GPCR effectors contents that will largely influence the output signaling (See 2.2.). This will have major impact particularly when evaluating biased ligand activity using cell assays that play with all the endogenous signaling machinery. Thus, incorporating at least two quite different cell lines for the bias detection should increase the probability of positive hits.

Despite not necessarily essential for a first screening, the use of primary human cell types from multiple tissues offers the possibility to determine ligand biased activity in terms of phenotypic impact on relevant diseases with endogenous level of receptors, i.e. the use of immune cells in the context of inflammation, fibroblasts in fibrosis, but their scarcity impedes large scale screening. It will also comfort about drug pharmacological profile and its future in



vivo translation when bias activity identified in a simplified culture system is preserved in a more physiologically relevant system. For instance, the original pharmacological profile of 6'-

GNTI as a G protein-biased agonist but -arrestin pathway antagonist at the -opioid receptor was originally described in HEK cells (Rives, Rossillo, 2012) and was further confirmed in CHO

and also in primary neuronal cultures where -opioid receptor is expressed endogenously,

paving the way for its in vivo use as a potential valuable nonaddictive analgesic with less -arrestin dependent-dysphoric adverse effect (Schmid et al. , 2013). Recombinant immortalized cell lines could be considered as the better alternative for the bias detection. To date, more than 4000 cell lines relevant for multiple physiological and pathological area are available (ATCC bank) but CHO and HEK293T are the most popular ones for GPCR drug screening. They are generally easy to culture, more or less amenable for transfection thus facilitating the creation of a functional assay and more importantly allowing an accurate setting of receptor/signaling effectors stoichiometry known to easily influence bias responses, and finally they are prone to high throughput screening (HTS) (Sato et al. , 2007). Essentially dictated by functional assays restrictions, the bias characterization results in most cases from multiple comparisons between mixed functional tests obtained from both transient transfected recombinant cell lines (over-expressing the receptor of interest and some signaling probes) and from stable transfected ones (stably-expressing the receptor of interest). However, delineating the bias of a ligand relies on its capability to favor the activation of specific

intracellular signaling pathways (i.e. G protein over -arrestin pathway), and thus to compare the pharmacological profile of the drug on the different pathways. Also, one would expect to be allowed to compare the signaling pathways, meaning to use at least a common cellular background with similar receptor densities for each assay. Up to now, the field largely fails on this criterion as some assays to explore receptor activity require receptor as well as effector

overexpression (i.e. -arrestin assays, See 4.2). Consequently, such experiments using different cell systems should be interpreted with caution. Beyond the questions of protein stoichiometry, another problem restricting the comparison between results obtained in transient versus stable cell lines relates to the integration of the transgene in stable transfection since it can permanently alter the cell genotype / phenotype (Lin et al. , 2014) and thus potentially modify the standard signaling pathways of a set cell. By contrast, transiently transfected genes are only expressed for a limited period of time and are not integrated into the genome. Overall, transient transfection of receptors together with the different signaling probes, followed by an accurate calibration of the receptor/signaling probes in each experimental setting appears maybe as a model of choice to compare different signaling pathways in the context of biased behavior of GPCR ligands.

More recently, the fruit fly has gained interest for drug screening despite not yet used in the GPCR biased agonism field (Dar et al. , 2012, Gasque et al. , 2013). However, this model harbors the perfect characteristics expected for a rapid screening of GPCR biased ligands: integration of the drug bias signaling on the whole organism with physiological outcomes. The fruit fly model indeed parallels to a certain level the human physiology/patho-physiology by involving similar molecular pathways that play a role in the main functions/dysfunctions as for instance in cancer or diabetes (Pandey and Nichols, 2011). The easy genetic manipulation of Drosophila also allows a rapid understanding of the interconnection between a specific signaling pathway and a physiological/patho-physiological outcome. This approach recently led to the elegant identification of different effectors from specific intracellular pathways



whose pharmacological targeting led to an optimum therapeutic index for cancer (Dar, Das, 2012).

2.2 Cellular content and protein expression levels

Taking a cellular model as bait for drug screening tackles the problem of its endogenous protein background that will differ in between cells and will ultimately dictate different signaling responses. Mass spectrometry-based proteomics of 11 human cell lines revealed marked disparities in the expression levels of the proteins despite high similarities in the proteome by itself (Geiger et al. , 2012). Thanks to mRNA quantification, Atwood et al. also confirmed huge disparities in the pattern of expression of all class A, B and C GPCRs and related signaling proteins in four cell lines commonly used for the study of GPCR signaling (HEK293, AtT20, BV2 and N18) (Atwood et al. , 2011). The stoichiometry of GPCRs and their intracellular signaling effectors, ie. G proteins, has long been shown to be crucial in conducting specific signaling pathways both in primary and recombinant cells (Kenakin, 1997, Newman-Tancredi et al. , 2000, Newman-Tancredi et al. , 1997) and it is therefore not surprising that a ligand-receptor pair can promote different output signaling in two different cell lines (Halls et al. , 2009, Sauliere, Bellot, 2012). Paradoxically, this concept has been often forgotten in the pharmacological characterization of biased molecules and studies, most of the time, tend to delineate biased activity of a compound based on the comparison of diverse signaling pathways each performed in a cell line exhibiting different expression levels of receptor and signaling effectors (See 2.1). Furthermore, cell-type variation in ligand efficacy has been observed using cellular impedance or dynamic mass redistribution assays (Deng et al. , 2013, Peters and Scott, 2009) or conventional signaling measurements (Charfi et al. , 2014, Sauliere, Bellot, 2012). For example, in 2013, Deng et al systematically measured efficacies of seven agonists of the endogenous M3 muscarinic receptor expressed to different levels in six different cell lines and demonstrated that the receptor can couple to diverse signaling pathways with distinct biased activities of muscarinic agonists depending on the cell line (Deng, Sun, 2013). Finally, one would generally give preference to biased activity screening on so-called "physiological expression levels of receptors" when possible. However, the ultimate purpose of biased ligands relies on their use in patho-physiological conditions when both GPCRs and signaling effectors are prone to radical modifications of their expression levels. In

heart failure, cardiomyocytes undergo downregulation of 1-AR expression as well as Gi2

proteins (Eschenhagen et al. , 1992) or Gs (Longabaugh et al. , 1988) but also secondary effectors like adenylyl cyclases V/VI (Ishikawa et al. , 1994) that contribute to alterations of the

-signaling (Bristow et al. , 1982). Cancer (Yajima et al. , 2012) or Parkinson (Corvol et al. , 2004) diseases have also been associated with alteration of the expression levels of G protein subunits. Besides, it is clear that receptor expression levels can influence ligand efficacy as

shown for high density of 3-AR that turned SR59230A from an antagonist to an agonist for cAMP formation when compared to low receptor densities (Sato, Horinouchi, 2007). Hence, there is no perfect cellular expression receptor/signaling effectors level for biased research but considering two (or more) expression levels of the GPCR of interest in a similar cellular background could nevertheless favor the appreciation of the different "textures" of a ligand at this receptor.

2.3 Physical properties of cellular plasma membranes



Given that GPCR are transmembrane proteins, it is not surprising that the plasma membrane can markedly influence their activity by modulating their 3D conformation. Accordingly, biased activity of the ligands should be impacted as well. Plasma membrane is a nano-organized structure composed of a variety of lipids and proteins whose proportion differs between cells according to their origin, specialization and physiological/patho-physiological state. Those differences can impact on GPCR conformational landscape through three mechanisms:

- First, lipid and protein composition modifies the physical constraints the plasma membrane exerts on GPCR landscape. This has been well demonstrated for the rhodopsin receptor (Botelho et al. , 2002). Recently, membrane stretch has also been shown to

allosterically modulate -arrestin-biased Angiotensin II type I receptor signaling (Tang et al. , 2014).

- Second, the nanoscale organization of the plasma membrane promotes subcellular compartmentalization of GPCR and related proteins in specific domains. For instance, spatiotemporal diffusion and bioactivity of GPCR and membrane-anchoring proteins are partially controlled by the actin-based cytoskeleton (Kusumi et al. , 2012). A large body of evidences, obtained from primary and recombinant cell lines, also clearly established that plasma membrane cholesterol- and sphingolipids-enriched domains, so-called lipid raft nanodomains, can influence many GPCR signaling cascades by partitioning GPCR, G proteins and their various effectors. This phenomenon has been observed for many receptors (Insel et

al. , 2005) and was largely exemplified for -adrenergic signals in cardiomyocytes (Xiang, 2011) or recombinant cells (Pontier et al. , 2008). Agonist-directed trafficking is also determined by receptor location within the membrane domains as shown for the µ-opioid receptor (Zheng et al. , 2008). In the same line of evidence, membrane lipids composition can modulate GPCR/G proteins interaction (Inagaki et al. , 2012). Moreover, lipid rafts have been assigned a crucial role in pathological contexts such as heart failure, Alzheimer’s disease or spongiform encephalopathies, either by their disruption or their ability to pathologically concentrate ectopic proteins, thus disrupting the physiological signaling (Michel and Bakovic, 2007).

- Third, the influence of lipids on GPCR signaling could arise from a direct mechanism, mediated by lipids interaction with specific domains of the GPCR. Cholesterol binding motif has been shown to be present in several transmembrane proteins (Li et al. , 2001, Scolari et al. , 2010) and accordingly, cholesterol was reported to have a regulatory role on the protein

functions (Derler et al. , 2016). In 2007 and 2008, crystal structures of the 2-AR receptor allowed the observation of a direct cholesterol-receptor interaction (Cherezov et al. , 2007,

Hanson et al. , 2008). However, the first identification of a cholesterol-binding motif in-AR, as well as in rhodopsin and serotonin-1A receptors, was established in 2011 by Chattopadhyay and colleagues (Jafurulla et al. , 2011). This direct cholesterol-GPCR interaction could be important for the modulation of the conformational landscape of the activated GPCR. Indeed,

cholesterol has been shown to modulate biophysical properties of the 2-AR (Zocher et al. , 2012). Apart from cholesterol, Govaerts and colleagues also demonstrated that phospholipids can act as positive (phosphatidylcholine) or negative (phophatidylethanolamine) allosteric

modulators influencing agonists/antagonists binding and activation state of the 2-AR (Dawaliby et al. , 2016).



Based on the preceding observations, an important technical aspect when comparing different signaling pathways in a cell line relies on the nature of the agent used for transfection in between assays or when comparing assays using transfected and non-transfected cells for

evaluation of biased efficacy of ligands (i.e. II messengers assay versus -arrestin recruitment, See 4). Indeed, many transfection methods have been developed to introduce foreign nucleic acids into cells (biological, chemical, and physical) but the use of cationic lipids (lipofection) is the most popular. However, this later method is not completely neutral and can influence the physical properties of the cellular plasma membrane as liposomes vesicles DNA carriers are made of phospholipid layer that can merge with phospholipids of the plasma membrane. This can thus influence the conformations of GPCR as well as those of the signaling transducers anchored in the plasma membrane. In agreement, Lonez et al reported that cationic lipids activate intracellular signaling pathways (Lonez et al. , 2012). Thus, lipid-based transfection can change the basal signaling background of the cell and then could potentially interfere with the determination of ligand biased activity.

2.4 Microenvironment, extracellular matrix and cell density

The cell microenvironment includes all factors and elements surrounding the cell that influence its activity. Those factors include others cells, signaling molecules and the extracellular matrix (ECM). In multicellular organized tissues, the extracellular space surrounding cells is composed of a complex layout of tissue-specific polysaccharides and proteins, such as collagen, laminin, fibronectin, elastin constituting the ECM. It is now well established that the ECM is not just a structural scaffold for cells but more an instructive and communicant environment dictating the cell behavior as its morphology and function (migration, survival) (Gospodarowicz et al. , 1980, Kim et al. , 2011). The bi-directional communication between cells and ECM, mostly via integrins, allows a constant dynamic change of the ECM to facilitate cell plasticity as required in development. The cell response to ECM components is highly variable. It has been well shown that different ECM coating proteins in tissue culture modify cell properties such as adherence, morphology and proliferation (Ragetly et al. , 2010, Vleggeert-Lankamp et al. , 2004), a phenomenon that can rely on differential gene expression regulation (Heng et al. , 2010). It follows that the comparison of the cellular signaling pathways for characterization of a biased ligand should pay attention to the use of similar ECM conditioning of the cell for each of these pathways. However, we are far from such assay calibration since some bias studies are mixing assays performed on adherent versus suspended cells (i.e. BRET studies in cell suspension versus II messengers studies on adherent cells) despite we know that the loss of cell adhesion can profoundly affect cellular intracellular signaling as it was shown for cAMP production (Norambuena and Schwartz, 2011). In a first biased screen, the importance is not to support a cell status versus another one but mainly to have a consensus on the cell status in between signaling assays so to be allowed to establish the biased signature of the ligand.

Finally, cell density/contact can also differently impact on biological processes. Hence, Heng et al demonstrated that the proliferation rate of human umbilical vein endothelial cells is tightly under control of cell-seeding density (Heng et al. , 2011). Thus, cell seeding below/above a specific density threshold can cause a non-optimal cell proliferation. Moreover, cell density has been shown to be an important modulatory factor in ligand agonism (Koizumi et al. , 2003) as well as in biased efficacy of the ligands (Kaya et al. , 2012, Sato, Horinouchi, 2007). Cell density will also selectively influence the signaling output. For example, Koizumi et



al demonstrated that a high level of MC3T3-E1 density increase the [Ca2+]i at basal state while decreasing the cell-response sensitivity to ligand stimulation (Koizumi, Hikiji, 2003). Kaya et al. studied cAMP and ERK responses in confluent or suspended HEK cells upon stimulation with

2-AR ligands (Kaya, Onaran, 2012). They showed that the Gs-induced cAMP-mediated ERK

activation through 2-AR was apparently inhibited by cell-contact whereas the Gi/o-mediated ERK activation was insensitive.

3. Evaluation of biased agonism: choice of the signaling pathways

3.1 GPCR canonical versus peculiar signaling pathways

3.1.1 G protein signaling pathways

GPCRs embedded in the plasma membrane of the cell transmit extracellular signals in the interior of the cell by binding high diversity of extracellular ligands from different chemical classes (photons, ions, biogenic amines, hormones, growth factors, peptides and non-peptidic neurotransmitters or lipids). Extracellular signal transmission then begins instantly with the activation of heterotrimeric G proteins localized in the inner face of the plasma membrane in the vicinity of GPCRs. Despite recent evidences suggesting the existence of G protein-independent signaling, G protein activation represent the only hallmark common to all GPCRs and their canonical intracellular transducers. Heterotrimeric G proteins are composed of three

associated subunits (, and )andencompass multiple isoforms leading to the simultaneous existence of a myriad of heterotrimers in a cell although each cell type displays selectivity in G

protein expression (Denis et al. , 2012). Activated receptors associate with the G protein and catalyze the exchange of guanidine diphosphate (GDP) for guanidine triphosphate (GTP)

on the G subunit which in turn promotes conformational changes of the G heterotrimer

leading to the dissociation of G and G and the ensuing activation of their cognate secondary

effectors localized at the plasma membrane. Basically, it is generally assumed that the G subunit dictates the specificity of the receptor intracellular signaling and that accordingly: i/

7TM receptors coupled to the Gs and Gi/o family essentially activate or inhibit respectively the adenylyl cyclase and thus the production of 3'5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) II messenger that will then activate protein kinase A (PKA) and Epac specific downstream

effectors (Boularan and Gales, 2015), ii/ 7TM receptors coupled to the Gq/11 family preferentially activate phospholipase C which catalyzes the cleavage of membrane-bound phosphatidylinositol-4,5-biphosphate (PIP2) into the second messengers inositol (1,4,5) triphosphate (IP3) and diacylglycerol (DAG). IP3 binds IP3 receptors localized in the endoplasmic reticulum (ER) to elicit Ca²+ release in the cytosol while DAG diffuses along the plasma membrane where it may activate any membrane localized forms of a second

serine/threonine protein kinase C (PKC), iii/ 7TM receptors coupled to the G12/13 family activate RhoGEFs which in turn catalyze the activation of the cytosolic small GTPase Rho that regulates many aspects of cytoskeleton dynamics and thus cell architecture.

Only few biased ligands that specifically target the G protein signaling have been identified so far with some of them presenting potential therapeutic values. As extreme example of G protein biased ligands, oxytocin-receptor ligand atosiban selectively activates

Gi1 and Gi3 but completely fails to recruit -arrestin (Busnelli et al. , 2012) while 6'-GNTI

mediates partial G protein activation at the -opioid receptor while antagonizing the -arrestin recruitment to the receptor (Rives, Rossillo, 2012, Schmid, Streicher, 2013) and far, no-one of



these drugs have been yet tested for their in vivo performances. In vivo, UNC9975, an

antagonist of the Dopamine D2-R/Gi axis and partial agonist at D2-R/-arrestin, displayed

potent -arrestin-dependent antipsychotic activity without the Gi-associated motor side effects that are classically shared by antipsychotic drugs, thus highlighting the therapeutic benefit of blocking the G protein pathway (Allen et al. , 2011). Conversely, TRV130 acts as a potent

analgesic without the -arrestin-related gastrointestinal and respiratory dysfunctions in mice, consistent with its selective G protein-biased agonism at the µ-opioid receptor with no activity

on the -arrestin pathway (DeWire et al. , 2013). More recently, preclinical studies testing a new potent and selective Glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R) G protein-biased agonist in diabetic mice demonstrated its remarkable antidiabetic effects, suggesting GLP-1R-G protein-biased agonists as a novel therapeutic approach to type 2 diabetes mellitus (Zhang et al. , 2015). Indeed, the in vivo effects of G protein pathway-selective biased ligands are unlikely predictable and up to now the physiological significance of G protein-signaling have been more

likely inferred indirectly from the use of -arrestin knockout mice (Allen, Yost, 2011, Bohn et al. , 2000, Bohn et al. , 1999, Conner et al. , 1997). However, some of the G protein-mediated processes have been elucidated using genetic mouse models in physiology and patho-physiology (Wettschureck et al. , 2004), but G protein redundancy and lethality of the knockout models provide a mean for generation of tissue-specific or inducible gene deletion of the G protein subunits so to delineate the specific in vivo functions of each individual G protein subunits in the different tissues. There is thus a need in the future to explore the wide-range biological functions of the heterotrimeric G proteins but also to get further insight into the in vivo relevance of G protein-biased ligands.

Beside G subunits and despite that G complex was initially thought to only favor G anchorage to the plasma membrane and to stabilize its inactive state, it is now well established

that the G complex is also able to control many different signaling pathways on their own

following GPCRs activation (Dupre et al. , 2009). The effectors of G-signaling include various ion channels, such as G-protein-regulated inwardly rectifying K+ channels (GIRKS), P/Q and N-type voltage-gated Ca²+ channels, as well as some isoforms of adenylyl cyclases and PLC, along

with some phosphoinositide-3-kinase (PI3K) isoforms. The existence of dual independent G

and G signaling was nicely illustrated by the recent discovery of the first biased ligand that

discriminates between G and G subunits (Blattermann et al. , 2012). In this study, the authors have identified Gue1654 as a specific oxoeicosanoid receptor (OXE-R) biased

compound which selectively inhibits Gbut exclusively activates Gi signaling.

3.1.2 G protein-independent signaling pathways

Despite GPCRs intracellular signals were long thought to arise from a unique proximal heterotrimeric G protein processor, it became clear over years that GPCRs can directly interact with several other intracellular proteins (Ritter and Hall, 2009) leading to G protein-

independent signaling pathways with -arrestin-dependent signaling as the most popular

example. Paradoxically, -arrestin was originally discovered as a negative regulator of the G protein pathway upon sustained stimulation of the receptor thus leading to G protein

desensitization and receptor internalization (Luttrell and Lefkowitz, 2002). However, -

arrestins (-arrestin 1 and 2) also act as scaffold proteins that promote multi-molecular complexes assembly and control intracellular signaling pathways including those of mitogen-activated protein kinases (MAPK) (DeWire et al. , 2007, Lefkowitz and Shenoy, 2005).



Generally, both G protein- and -arrestin-dependent signaling pathways naturally coexist following stimulation of 7TM with endogenous ligand. Nevertheless CXCR7, a member of the decoys GPCRs originally thought to be a nonsignaling receptor but an extracellular ligand

scavenger, was finally identified as an endogenous biased 7TM that signals through the -

arrestin in the absence of G protein activation (Rajagopal et al. , 2010). The -arrestin-dependent pathway became more largely popular with the discovery of biased-drugs favoring

-arrestin signals over those conducted by the G proteins (Whalen et al. , 2011), early initiated

by Lefkowitz's and Bouvier's groups (Azzi et al. , 2003, Wei et al. , 2003). Up to now, -arrestin

biased ligands were mostly identified for -arrestin 2 isoform. However, given the existence of

two isoforms, -arrestin 1 and 2, both controlling distinct aspects of GPCR signaling (Srivastava

et al. , 2015), it should be not surprising that -arrestin 1 biased emerged as well in the future.

Taking advantages of the -arrestin1/2 KO mice, several -arrestin biased agonists with putative therapeutic advantages have been identified. Thus, the antipsychotic activity of

UNC9975 and related compounds relies on its partial agonism on the D2-R/-arrestin pathway

(Allen, Yost, 2011). TRV120027 and TRV120023 engage the beneficial AT1-R/-arrestin axis at AT1-R and these molecules elicit cardioprotective properties in vivo, reducing blood pressure (TRV120027) while acting as a mild inotropes (TRV120027 and TRV120023) (Violin et al. , 2014). TRV120027 is currently in phase II clinical trials for the treatment of acute heart failure

(Felker, Butler, 2015). Numerous other receptors support biased agonism at -arrestin with promising clinical advantages (Violin, Crombie, 2014).

3.2 Common effectors for diverse signaling pathways: Which pathway to select ?

The massive evolution of the concept of biased agonism in the GPCR field these last 10 years has introduced a somehow simplistic caricature of the GPCR signaling with G protein-

dependent signaling and -arrestin-dependent/G protein-independent pathways and bias

efficacy of the ligands has been screened and classified accordingly. However, G proteins and -arrestin constitute common effectors of multiple intracellular pathways, each of them responsible for specific cellular outcomes. For instance, ERK1/2 activation, that regulates

mitotic and post-mitotic cell function, can be elicited by G protein or -arrestin or both (Sauliere, Bellot, 2012). Mitotic state of the cell has been also recently shown to be tightly controlled by another G protein-dependent Hippo/YAP pathway (Yu et al. , 2012). Tyrosine

kinase receptor transactivation by GPCR can also initiate -arrestin recruitment or involve G protein interaction at these receptors (Cattaneo et al. , 2014). It thus follows that in vivo effects

of G protein- and -arrestin biased ligands are finally unpredictable and care must be thus taken when trying to correlate the signaling responses observed in vitro in cell-based assays with the pharmacological profile obtained in vivo. In line with this concept, multiple ligands can cause similar cellular response but using distinct transductions pathways. For instance, Sato and colleagues compared extracellular acidification rates (ECAR) promoted by CL316,243 and

SR59,230A versus isoproterenol agonist reference at 3-AR and found that all behaves as full agonists (Sato, Horinouchi, 2007). However, when dissecting the molecular mechanisms leading to ECAR activation, they found that while CL316,243 involves a dual cAMP and p38 pathway, SR59,230A almost exclusively leads to ECAR activation through a p38 pathway. In the same line of evidence, while TRV120027 (in Phase IIb for acute heart failure; See 1) was

originally developed as a high affinity [Sar1, Ile4, Ile8]-AngII (SII)-like -arrestin-biased agonist, comparison of TRV120027 and SII downstream signaling events (kinases phosphorylation/gene expression profiling) revealed unexpected specific and different



activation profiling for each peptide also differing from that of the reference agonist

Angiotensin II, demonstrating that -arrestin can be part of distinct signaling cascades (Santos, Duarte, 2015). This result is in agreement with a previous work from Saulière et al that

explored and dissected the -arrestin- and G protein-dependence of the ERK1/2 pathway in different cell lines (Sauliere, Bellot, 2012) and found that SII was not a mimicking peptide of

the -arrestin-dependent pathway activated by Angiotensin II but rather used similar G protein

and -arrestin effectors in different signaling. Conversely, a therapeutic advantage of a drug can arise from various pharmacological in vitro profiles. Thus, classical antipsychotic activity of therapeutic agents used in the clinic for schizophrenia treatment have been assigned a

common antagonism of the D2-R/-arrestin pathway (Masri et al. , 2008). However, a more recent study identified new highly potent antipsychotic drugs (UNC9975/UNC9994) acting at

D2-R but promoting partial activation of the -arrestin while blocking the Gi pathway and without the deleterious motor adverse effects (Allen, Yost, 2011).

Overall these results clearly indicate that diversity of activation can be observed in both

the "G protein-dependent" and the "-arrestin-dependent" signaling, highlighting that bias profiling of a ligand has to be established on a maximum of effectors/signaling events.

Moreover, while so far "canonical" effectors have been mainly sensed (i.e, G protein, -arrestin, ERK1/2, cAMP, Ca2+…), more specific effectors should be introduced in the screening stage of biased ligands so to appreciate the differential texture of the activated pathways. Thus, while cAMP production originates from common adenylyl cyclase proteins, its two downstream effectors (PKA and Epac existing in multiple isoforms) direct different cAMP-outcomes (Boularan and Gales, 2015, Bruzzone et al. , 2014). In this context, the use of PKA or Epac full-length protein biosensors (i.e. FRET/BRET) could thus help dissecting the cAMP pathway (Bruzzone, Sauliere, 2014). Disruption of the interaction between 5-HT2C receptors and the tumor suppressor PTEN has been shown to selectively suppress behavioral responses to drug

of abuse (nicotine and 9-tetrahydrocannabinol) (Ji et al. , 2006), suggesting that a biosensor directly measuring the interaction between 5-HT2C receptor and PTEN could help identifying specific ligands antagonizing the interaction. Beyond the activation state, evaluation of other specific parameters of the effectors could be predictive of differential signaling of the ligands.

The different conformations of -arrestin (Shukla et al. , 2008) or of the receptor--arrestin / receptor-G protein complexes (Bellot et al. , 2015) stabilized by different ligands have been shown to dictate different intracellular signaling. Since GPCR signaling consists in tightly

regulated spatio-temporal events, kinetics of G protein or -arrestin activation could also be indicative of different output signals and was recently used in bias screening (Masuho et al. , 2015, Sauliere, Bellot, 2012). Another important consideration is the sensing of distal versus proximal signaling events from the activated receptor. While measurement of proximal events

will most probably increase the efficacy of the screen (less false positives), i.e G protein and -arrestin, downstream signaling will conversely increases its sensitivity due to the signal amplification. Therefore, multiplexing all these signaling events will probably favor the detection and the establishment of biased ligand signatures.

4. Evaluation of biased agonism: Choice of the assay.

Measurement of biased ligand efficacy and thus ligand pharmacological classification directly results from the availability of the assays and from their sensitivity to sense the different signaling events. Hence, delineation of ligand efficacy has constantly evolved



according to the pleiotropic signaling of GPCRs (See 3) and mainly to the technological breakthroughs in the field of bioassays. Biased ligands do not escape this rule since their generally weak efficacy constitutes an impediment to their detection, thus requiring highly sensitive and specific assays. Moreover, their precise pharmacological profiling constitutes a hard task to characterize since it depends on the simultaneous comparison of ligand efficacy on several signaling pathways using different assays.

4.1 Second messenger’s based assays.

Most likely because intracellular II messengers were the first identified intracellular mediators of active GPCRs at the plasma membrane and easier to quantify than the G protein activity by itself, assays measuring their intracellular levels still represent the most frequently used ones to characterize ligand efficacy and biased agonism. Second messengers levels are classically measured according to the nature of the G protein coupled to the receptor and thus constitute indirect sensors of G protein activity (See 3.1a). Basically, cAMP levels are quantified for GPCR coupled to Gs or Gi/o as a readout of adenylyl cyclase activity whereas for receptors coupled to Gq, IP3/IP1 and Ca2+ levels are evaluated as a readout of phospholipase C activity. Originally, these measurements were performed by direct quantification using radiometric assays (Palmer et al. , 1989, Pineyro et al. , 2005). In an effort to skip the use of radioactivity, II messengers assays largely rely now on the use fluorescence/bioluminescence-based technologies and a wide variety of assays are currently available (Zhang and Xie, 2012). Most of them have initially been developed in an HTS perspective aiming to screen a large number of molecules. Thus, the main characteristics of these assays are rapidity, robustness, reliability and cost-effectiveness but they are often not necessarily highly quantitative. For cAMP or IP3/IP1 detection, assays mostly rely on a immunoassay based on the competitive binding between a radioactive (i.e. RIA) or labeled (i.e. HTRF) antigen ("tracer") (cAMP, IP1…) and the antigen/II messengers to be quantified. Cytosolic BRET-based biosensors using the II-messenger specific binding domain (i.e. cAMP domain of Epac or PKA) have been also recently used for the quantification of ligand bias (Masri, Salahpour, 2008, van der Westhuizen et al. , 2014). Popular calcium assays use the cell-permeable Ca2+-sensitive fluorescent dyes (Fluo-3/Fluo-4) but luminescent-Ca2+-sensitive sensors (aequorine/obelin) have been used as well in the context of ligand bias (van der Westhuizen, Breton, 2014, Zhang and Xie, 2012). Despite high sensitivity, these calcium assays suffer from several limitations. For instance, they cannot detect inverse agonist efficacy. Moreover their quantification constitutes a complex task. Indeed, depending on the affinity of the dye and the system used, a dye saturation could be observed, thus resulting in an overestimation of agonist potency and partial agonist efficacy. Also, the fact that the signal is measured in non-equilibrium conditions could modify ligand efficacy parameters (Charlton and Vauquelin, 2010). Intracellular calcium signal is also highly textured since it results from highly compartmentalized signals that are time regulated and in fine, the spatio-temporal profile of calcium signaling governs specific functional consequences. This orchestration is conducted by the generation of specific multiple second messengers acting on specific Ca2+ channels. For example, IP3 activates IP3-Receptor channels but is not the only second messenger to regulate Ca2+ release since for example cADPR (cyclic-ADP-ribose) activates RyR-R (Ryanodin receptor) channels and NAADP (Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate) acts on NAADP-R channels. Hence, each GPCR/ligand will encode a combination of channels activators to generate a specific signal (Kiselyov et al. , 2003). Hence, pharmacological translation of Ca2+ signals is quite difficult using classical calcium assays.



Finally, another alternative for II messenger quantification consists in the use of cell-based reporter assays relying on a II messenger responsive element upstream of a promoter

controlling the transcription of various enzymes (luciferase, -galactosidase...) that can be easily quantified and offers a large signal to background window.

The measurement of G protein-mediated II-messengers downstream the active receptor offers advantages for the detection of biased ligand with weak activity since they are prone to signal amplification. Nevertheless, despite signal amplification, the assay threshold can prevent detection of low II messengers production. The recent development of broad range of II messengers cell-based assays has helped resolving this problem and provides now high

resolution detection. For instance, the 2C-AT1-R dimer coupling to the Gs/cAMP pathway promoted by the co-stimulation with noradrenaline and angiotensin II was only detectable using the high sensitive cAMP femto kit from Cisbio allowing detection of as little as 28 pM cAMP (Bellot, Galandrin, 2015). Now beside the bright side, measurement of the II messengers can also lead to complex interpretations. Indeed, because their production results from a combination of several signaling outcomes downstream the active receptor, they could not discriminate between the stimulation of distinct effectors (i.e. G proteins, adenylyl cyclase or

Phospholipase C isoforms). Thus, as some GPCRs dually couple to Gs and Gi (i.e. 2-AR), cAMP levels produced at one time point can result from both activation of the adenylyl cyclase via Gs proteins and its inhibition mediated by the various Gi isoforms, making signaling analysis hard to achieve. However, the use of pharmacological tools modulating the G protein activity can be helpful. In this way, CHO cells pretreatment with Pertussis Toxin (PTX)-Gi inhibitor and

Cholera Toxin (CTX)-Gs activator allowed to demonstrate that prototypical Gi-coupled 2-

adrenergic receptors (2A/B/C-AR) can indeed couple also to Gs in a 2-subtype and ligand-structure specific manner (Eason et al. , 1994). Similarly, elevation of cytosolic calcium concentrations can result from various calcium influx through voltage dependent ion channels

via the G protein Go or from the activation of PLC via Gq, G11 or Gi-derived subunits. Furthermore, II messenger production is not always a linear causal process and for example, in sympathetic neurons, acetylcholine leads to DAG production without calcium release (Delmas et al. , 2002). This observation is of interest for biased activity detection since the Gq pathway is generally sensed through a calcium or a IP1/3 assay but it follows that both messengers should be screened so to better appreciate the bias. Likewise, the choice of the II messenger assay in a biased ligand characterization generally relates to the cognate secondary effector of the G protein (i.e, Gs/cAMP…). However, recently, several studies reported the capacity of

some G proteins to activate unexpected secondary effectors. Hence, GXLs has been shown to enhance IP3 production through the parathyroid hormone receptor (He et al. , 2015) while

Gi1 can directly activate the transient receptor potential canonical channel TRPC4 (Jeon et al. , 2013). Vice versa, the choice of the messenger to analyze relies on the canonical coupling recognized for the receptor of interest while it is known that this coupling highly depends on

the cell type or the ligand chemical structure. Thus, the prototypical Gi-coupled 2-AR atypically activates the Gq/PLC pathway in kidney distal convoluted tubule cells (Gesek, 1996).

Overall, these results argue that ligand bias should be finally screened without any a priori on the G

protein or other signaling effectors to increase their window detection. Amplification of the signal

can also result in an overestimation of the relative ligand efficacy because of the presence of “receptor reserve” with a partial agonist leading to the same maximal response as a full agonist and acting thus as a confusing factor for ligand bias classification (Trzeciakowski, 1999a, 1999b). Finally, II messenger-based assays, due to their high sensitivity, can allow the



detection of endogenous receptor activity, thus making difficult bias analysis. As example, -adrenergic receptors are often found as endogenous background in HEK293 cells and interfere with different ligand efficacies tested on overexpressed adrenergic receptors (Bellot, Galandrin, 2015, van der Westhuizen, Breton, 2014).

4.2 Assays catching initial signaling events

Given the large pleiotropic GPCRs signaling, catching the initial and common event of 7TM receptors activation, i.e the heterotrimeric G protein activation, will certainly more accurately depict ligand efficacy. Indeed, G proteins initiate activation of all major II intracellular effectors (See 3.1.1; Adenylyl cyclase, Phospholipases, MAPK, GIRK channels, Ca2+ channels…) which are difficult to assess collectively. GPCRs usually couple to multiple heterotrimeric G protein isoforms but accurate evaluation of the activation of each individual isoforms remains elusive despite they are largely prone to functional selectivity (Hermans, 2003). To date, evaluation of ligand efficacy on direct G protein activation essentially relies on

two assays. The radioactive [35S]GTPS binding assay is the most commonly used and largely proved its efficiency to determine direct potencies and efficacies of ligands toward G proteins (Harrison and Traynor, 2003). However, its restriction to the use of cell membrane extracts and radioactivity, as well as its specificity mostly for the Gi family, limit its use to decipher ligand biased efficacy. More recently, distance-proximity BRET/FRET-based assays directly measuring the interaction between receptors and G protein subunits or interactions between

G and G subunits as sensors of G protein activation have been developed in living cells (Denis, Sauliere, 2012, Lohse et al. , 2012). Originally restricted to some G protein isoforms,

Saulière et al extended the assay to all major G isoforms, allowing to directly monitor all G protein families (Gi/o, Gs, Gq/11, G12/13) activation (Sauliere, Bellot, 2012). These tools offer for the first time the possibility to obtain a specific snapshot of all different and individual G protein isoforms and allow depicting biased agonism in between isoforms particularly difficult

to discriminate as for the Gi family. Thus, Javitch’s group identified a potent GoA-biased

ligand at -opioid receptor in agreement with its efficacy on adenylyl cyclase inhibition (Rives, Rossillo, 2012). Ligand screening at oxytocin receptor led to the identification of original G protein-biased ligands strongly discriminating between the Gi/o family members (Busnelli, Sauliere, 2012). The G protein BRET probes allowed the comprehension of antiproliferative and antisecretory effects of a natural mutant of SST5 receptor that displayed a specific blunt on

GoA activation in human pituitary cells (Peverelli et al. , 2012). These probes also facilitate the

detection of ligand activity on more atypical G proteins like G12 and G13 for which downstream signaling cannot be easily screened in pharmacology, thus extending the repertoire of bias detection (M'Kadmi et al. , 2015, Sauliere, Bellot, 2012). Finally, an unexpected G protein coupling of the Angiotensin-II-related peptide SII, previously classified as

a -arrestin-biased agonist unable to activate the G protein (Wei, Ahn, 2003), was identified and further confirmed using specific G protein inhibitors on downstream signaling (Sauliere, Bellot, 2012). Interestingly, agonist efficacy determined for SII on the G protein pathway seems to rely just on the sensitivity of the assay since Lefkowitz’s group failed to detect any G protein

activation in AT1-R-expressing HEK293T when using radioactive GTPS or IP3 radioactive assays (Wei, Ahn, 2003), while the same group more recently confirmed the ability of SII to couple to G proteins in similar cell system but using a sensitive IP1 HTRF-based assay (Strachan et al. , 2014). Although BRET sensing G protein activity can efficiently monitor agonist or antagonist efficacy of ligands, they also provide powerful and sensitive tools to



depict and quantify constitutive activity of 7TM, thus allowing for instance the recent

identification of Gq and G13 inverse agonist bias at ghrelin receptor (M'Kadmi, Leyris, 2015).

Another early signaling step subsequent to GPCRs activation is the -arrestin recruitment to the receptor, generally leading to G protein uncoupling and ensuing receptor

internalization or formation of new intracellular signalosomes (DeWire, Ahn, 2007). -arrestin assays basically measure protein recruitment from the cytosol to cell surface receptor (Verkaar et al. , 2008), and rely either on classical cell imaging studies or on more quantitative Resonance Energy Transfer (RET)-based assays. Immunofluorescence imaging tracking the

subcellular -arrestin traffic can be useful for ligands with extreme efficacies but is not really adapted to accurately quantify recruitment modulations. To date, BRET/FRET-based assays

measuring the direct interaction between the receptor and -arrestin provide sensitive and commonly used tools to evaluate the ligand efficacy including in HTS applications (Hamdan et

al. , 2005). RET assays allow real-time measurement of -arrestin recruitment in living cells, offering the possibility not only to easily quantify the maximal protein amount recruited to the receptor but also to appreciate its recruitment rate by opposition to one time point recruitment assays (DiscoveRx PathHunter™ eXpress ß-Arrestin Assay or ThermoFisher

TangoTM GPCR assay system). The -arrestin RET assay provides indeed larger information than initially expected and its interpretation should be taken with caution especially for biased agonist classification. Usually, the maximal RET signal recorded is taken as a readout of the

maximum of -arrestin recruitment promoted by a ligand, and its efficacy is classified according to the maximal signal obtained with a reference. However, given that the RET signal depends on both dipole orientation and distance between RET partners fused to the two

proteins, the RET signal magnitude cannot only quantitatively relate to the extent of -arrestin

recruited as it can also sense the conformational state of the receptor/-arrestin complex. This is particularly important for biased ligands stabilizing different receptor conformations.

Indeed, two biased ligands recruiting similar levels of -arrestin could lead to different

conformations of the receptor--arrestin complex with different distances between the energy donor and acceptor that will be sensed as different maximum BRET ratio (Fig. 3). Conversely,

two biased ligands recruiting different levels of -arrestin could lead to different

conformations of the receptor--arrestin complex with similar distances between the energy donor and acceptor that will be sensed as identical maximum BRET signals. Thus, it follows

that determination of ligand efficacy on the -arrestin recruitment could not easily be inferred from the RET-based assay. This theoretical RET analysis has been previously validated when examining similarly the interaction between receptors and G proteins (Gales et al. , 2006) and

has been recently confirmed experimentally by Bellot et al who examined -arrestin

recruitment to the 2C-AT1-R dimer by BRET (Bellot, Galandrin, 2015). They showed that the

use of a N-terminal -Rluc-tagged -arrestin2 probe versus a C-terminal one completely modified the recruitment profile of the ligands, more likely in agreement with a different

conformational sensing of the receptor--arrestin complex depending on the vantage point

within the complex. It follows that, when performed as a single readout of the -arrestin pathway, the RET-based assays could lead to equivocal classification of ligand bias efficacy.

This could also explain, in part, the distortion of the results obtained sometimes from -arrestin translocation RET-based assays versus confocal microscopy experiments (Reiner et al.

, 2010). Thus, assays appreciating the conformation of -arrestin (double brilliance -arrestin,



(Charest et al. , 2005) or -arrestin/receptor complexes (RET assays) will reinforce the

signature of bias ligand efficacy at -arrestin level since different -arrestin conformations correlate with different output signaling (Shukla, Violin, 2008, Zimmerman et al. , 2012).

Besides, assays measuring direct -arrestin binding to the receptor (Verkaar, van Rosmalen,

2008) that only quantify the total amount of -arrestin associated with the receptor would complement the pharmacological characterization of the compound at the efficacy level.

4.3 Assays monitoring temporal and spatial events.

The texture of ligand efficacy can also be appreciated through a spatio-temporal standpoint (Lohse and Hofmann, 2015) since signaling must be coordinated in both space and time to fine-tune a specific response of the cell. Cell signal compartmentalization leading to subtle local II messenger generation/effector activation, as largely highlighted in the cardiomyocytes (Xiang, 2011), could constitute a priority target for some biased ligands as it implies a fine degree of spatial and temporal control over the cellular signaling. The development of several fluorescence-based probes has allowed the investigation of several signaling out-put in both a spatial and temporal manner in living cells. Early sensors include small fluorescent dyes, among them the most widely used Fura-2 ratiometric dye that binds intracellular Ca2+ and permit the observation of a local change of calcium gradients in single living smooth muscle cells (Williams et al. , 1985). More recently a plethora of genetically-encoded fluorescence-based biosensors has been developed, allowing to monitor the dynamics of a large array of signaling events in living cells (Miyawaki and Niino, 2015, Oldach and Zhang, 2014) in highly specialized cell structures, such as primary cilia (Su et al. , 2013). These probes based on the appreciation of protein-protein interactions or protein conformational changes have demonstrated spatio-temporal regulation at different levels of the signaling cascade. Recently, Masuho et al. observed functional selectivity among G protein activation kinetics (Masuho, Ostrovskaya, 2015). Also, a recent study, by combining real-time measurements of receptor internalization and cAMP signaling in living cells, identified functional selectivity on kinetics of GLP-1R internalization, recycling and signaling following stimulation with the natural ligand GLP-1 and the two stable analogues (Roed et al. , 2014). Interestingly, Molden et al, by analyzing intracellular cAMP kinetics in a FRET-assay, have shown that distinct melanocortin-4 receptor agonists can exert temporal selectivity to modulate the duration of the cAMP response and potentially the cellular compartment from which the signal is generated in response to acute agonist stimulation (Molden et al. , 2015).

4.4 Quantifying biased activity or depicting ligand texture?

Ligand biased efficacy can be grasped in both quantitative and qualitative ways. But whatever the case, their classification of biased ligands will always rely on the comparison with a reference ligand, often the physiological ligand. Basically, the choice of the signaling pathway for the characterization of the bias is generally dictated by the signaling commonly associated with the natural receptor agonist used as the reference. However, since it has been shown that some ligands can engage specific receptor signaling outputs not related to those of the “reference agonist” (Santos, Duarte, 2015, Sauliere, Bellot, 2012), a panel of signaling effectors should be systematically tested without a priori. Moreover, the reference by itself may be somehow difficult to define since many GPCRs bind multiple endogenous ligands, i.e. the chemokine receptors family, and these ligands sometimes exhibit biased activity (Corbisier et al. , 2015, Haessler et al. , 2011, Reiner, Ambrosio, 2010).

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030372071300498X#200013117



These last 5 years, several groups tried to accurately quantify the biased activity of ligands so to establish a quantitative "fingerprint". Different calculation models have been proposed to establish a bias factor and there is currently controversy regarding the best way to calculate it (Kenakin and Christopoulos, 2013, Kenakin et al. , 2012, Nagi and Pineyro, 2016, Rajagopal, 2013, Rajagopal et al. , 2011, Stott et al. , 2016). As already discussed, all these quantifications models mostly rely on the use of a reference ligand and on classical parameters obtained from concentration-response curves (Emax and EC50) on two different signaling pathways. In addition, some approaches incorporate ligand affinity parameter derived from competition binding experiments, but assuming that the affinity remains constant for all receptor/effector complexes. However, Rasmussen et al recently reported that conformational changes promoted by the effector on the receptor alter binding properties of ligands, suggesting that receptor/effector complex can dictate the functionnal selectivity (Rasmussen et al. , 2011). Thus, taking into account this observation, other bias quantification tried to introduce in the model variable ligand affinities for the different agonist/receptor/effector complexes (Kenakin, Watson, 2012, van der Westhuizen, Breton, 2014).

The calculation of the biased factor provides a useful comparison between several

compounds as exemplified by a study on clinically relevant 2-adrenergic receptor ligands on four signaling outputs (van der Westhuizen, Breton, 2014). However, because the calculation of the biased factor is restricted to the comparison of only two signaling pathways, it is quite difficult to easily appreciate the overall texture of each ligand for each signaling in a 3D representation (Fig.4A). An alternative to bypass this problem consists in the establishment of a matrix of pairwise-determined biased factors for a given ligand in n dimensions (Reiter et al. , 2012) (Fig. 4B). However, despite its interest, this representation does not allow the face to face comparison of ligands. A more didactic and visual representation of the pluri-dimensionality of the bias could be depicted in multiaxial illustration (Webs of bias) (Fig. 4C). In this representation, each axis relates to a pharmacological parameter of choice (Emax, EC50, kinetics parameter) plotted on a specific signaling output (Appleton et al. , 2013, Koole et al. , 2013, Sauliere, Bellot, 2012). It can be conducted simultaneously on different ligands as well as on different signaling pathways, thus offering a brief but clear overview of the signature of a ligand versus another.

Nevertheless, before any “biased factor” calculation and representation, the possibility of an experimental bias that will potentially pollute data should be kept in mind. First of all, does calculation of a bias factor have any sense when the comparison of ligand effects on two signaling pathways arise from tests carried out using different receptor and effector stoichiometry (See 2.2)? Indeed, the assays available to evaluate multiple pathways are difficult to use exactly in identical conditions setting. As previously discussed, most assays require probe overexpression and are often performed in different buffers. They may require either adherent or suspended cells or even cell membranes. Moreover, comparing transient responses such as Ca2+ release or ERK1/2 activation with long-lasting ones (cAMP, IP3 production) may lack of relevance. The kinetics of signaling also account for biased ligand efficacy texture and could be quantified, as well exemplified by Masuho et al , showing that G protein activation rate (τ/2) was ligand dependent (Masuho, Ostrovskaya, 2015)



Acknowledgements

This work was supported by the “Institut National de la santé et de la Recherche Médicale “ (J.M.S. and C.G.) and the "Fondation Bettencourt Schueller" (C.G.).

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Figure legends

Fig.1. Past and present of agonism. (A) Classical model of agonism (Universal keys): the agonists activate simultaneously all signaling pathways (1-2-3-4) associated with a receptor (Door A). (B) Recent concept of biased agonism: some agonists can select among receptor signaling pathways (1-3). (C) Revisited biased agonism: some agonists can promote activation of signaling pathways unrelated to those activated by the reference agonist.

Fig. 2. GPCR canonical signaling pathways. Illustration of the main G protein-dependent and independent signaling induced upon GPCR activation.

Fig. 3. Classical BRET-based -arrestin assay: example of 2 biased ligands recruiting similar

amount of -arrestin to a GPCR. (A) BRET1 was measured between Rluc-β-arrestin2 (Rluc-β-arr2) and the receptor-Venus (R-Venus) following agonist binding (green) to the receptor, and allowing close distance (D1) between Venus and Rluc BRET partners. (B) Model of Rluc-β-arrestin2 recruited to the same receptor in the presence of a biased ligand stabilizing different receptor and β-arrestin2 conformation. Distances between Rluc and Venus are increased when compared to that in A (D2>D1). (C). Real time kinetics BRET1 measurement of β-arrestin2-Rluc recruitment to the receptor-Venus allowing quantification of both the rate and the maximal ligand-promoted BRET signal. Maximal BRET signals will be different in A and B.

Fig. 4. Representations of the pluridimensional efficacies of biased ligands. (A) 3D representation of the bias factor where ligands are compared for their ability to bias one signaling pathway versus another (adapted from van der Westhuizen et al. 2014). (B) Matrix representation of pairwise biased factors β of one ligand for 6 pathways (adapted from Reiter E et al. 2012). (C) The multiaxial representation “Web of bias”. Efficacy parameters (here the log(EC50)) are plotted on each axis, that relates to a specific pathway.



« Universal keys »

(ligand)

Door A (receptor)

1 2 3 4

Agonism

A B

1 3

« Selective keys »

Door A

Biased agonism

CRevisited biased agonism

5 6 7

Door A

« New keys »

Signaling

Figure 1



Clathrin

PI3K

Arrestin

AKTMAPK

Ion

Channel

q

s

Ca2+

PLCβ

IP3

PKC

DAG

Ions

12

i

Adenylyl cyclase

RhoA

cAMP

RhoGEF

MAPK

Ligand

GPCR

Plasma

membraneLigand

Figure 2



A B

BRET1

Plasma membrane

Rluc-βarr2 / R-Venus

R

Venus

D1

D2

Plasma membrane

R

Venus

BRET1

C

Figure 3

A

B

Rluc-βarr2 / R-Venus





ETUDE N°3:

G PROTEIN ISOFORMS AND STOICHIOMETRY DICTATE BIASED-LIGAND TEXTURE AT

GPCRS



Résumé

Dans la revue bibliographique que nous venons de présenter, nous avons expliqué que beaucoup de paramètres expérimentaux, tels que le modèle cellulaire ou la technique expérimentale utilisée, peuvent modifier l’efficacité biaisée des ligands évaluée in vitro et qu’il serait par conséquent plus rigoureux d’homogénéiser systématiquement les conditions expérimentales pour pouvoir comparer l’efficacité d’un ligand sur différentes voies de signalisation. Parmi les mécanismes impliqués dans l’influence de ces paramètres expérimentaux nous trouvons une modification de la stœchiométrie des protéines, c’est-à-dire une différence dans l’expression génique et protéique des récepteurs et de leurs effecteurs pouvant modifier ainsi leur proportion au niveau cellulaire.

Des modifications du niveau d’expression des RCPG et de leurs premiers effecteurs directs, les protéines G hétérotrimériques, ont été associées à des altérations de la signalisation intracellulaire de ces récepteurs et liées au développement ou à la progression de pathologies [243-245]. Si la question de l’impact du ratio RCPG/protéines G sur l’efficacité des ligands est posée depuis la fin des années 90 [246], les études s‘intéressant à ce sujet se sont surtout concentrées sur l’impact du niveau de récepteurs sans tenir compte de l’effecteur et du concept d’agonisme biaisé [247-249].

Dans l’étude présentée ci-après, nous nous sommes intéressés à l’impact de la stœchiométrie de l’effecteur sur l’efficacité biaisée des ligands en étudiant l’influence du niveau d’expression des protéines G hétérotrimériques sur la capacité des ligands à activer ces

protéines. Nous avons d’abord quantifié l’expression génique des sous-unités G dans des cardiomyocytes isolés de souris saines ou insuffisantes cardiaques. Puis nous avons réalisé une analyse systématique, dans des cellules HEK293T et en utilisant des biosenseurs BRET permettant de mesurer en temps réel et en cellules vivantes l’activation des protéines G, afin de

déterminer l’impact des modifications du niveau d’expression génique de la sous-unité Gsur

l’efficacité de ligands agonistes, naturels ou synthétiques, des récepteurs 1- et 2-adrénergiques. Nous avons également étudié l’impact de ces modifications de niveaux

d’expression de la sous-unité G sur la compartimentation à la membrane des protéines G et

des récepteurs -adrénergiques.

Ce travail nous a permis de valider que, lors d’une insuffisance cardiaque, les sous-

unités G des protéines G hétérotrimériques subissent d’importantes modifications de leur expression génique dans les cardiomyocytes, bouleversant la stœchiométrie RCPG/protéines G. Dans un modèle cellulaire hétérologue, la modulation du niveau d’expression de ces protéines

G a montré d’importantes répercussions sur les propriétés pharmacologiques des ligands (efficacité maximale (Emax) et puissance (EC50)) concernant l’activation des protéines G. Ce résultat pourrait s’expliquer par la répartition différentielle des récepteurs qui leur sont associés au sein des domaines membranaires de type raft lipidique qui semble être dictée par

le niveau d’expression de la sous-unité G. Ces résultats nouveaux sur le rôle de la protéine G sur la compartimentation du récepteur pourraient rendre compte de i/ un rôle prépondérant de la protéine G dans le trafic antérograde des RCPG et ii/ de l’existence de pré-complexes RCPG/protéines G à l’état basal, comme cela a déjà été montré dans la littérature.

Manuscrit en cours de rédaction, sera soumis dans Nature Chemical Biology.



G protein isoforms and stoichiometry dictate biased-ligand texture at GPCRs

Lauriane Onfroy1, Ségolène Galandrin1, Marie-Hélène Seguelas1, Du N'Guyen1, Jean-Michel Sénard1,2, Céline Galés1.

1 Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, U1048, Université Toulouse III Paul Sabatier, F-31432 Toulouse, France.

2 Service de Pharmacologie Clinique, Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse, Faculté de Médecine, F-3100059 Toulouse, France.

Corresponding author: Dr Céline Galés

Address: INSERM UMR1048

Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires - I2MC

1, avenue Jean-Poulhès - BP84225

31432 Toulouse cedex 4

France

Phone: 33-5-61-32-29-21

Fax: 33-5-62-17-25-54

Email: [email protected]

mailto:[email protected]



Introduction

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent primary targets for drug development. However, many of these drugs display adverse side effects, sometimes tempering their clinical use. In recent years, the concept of biased agonism offered the possibility to skip these problems. This now well-accepted paradigm defines the capability of a ligand to stabilize different conformations of a receptor and thus to select among activation or blocking of only a subset of intracellular signaling underlying the ligand texture 1,2. Depending on the specific signaling associated with a disease outcome, it paves the way for the development of pathway-selective drug with increase efficacy and less adverse effects. This concept has been recently taken into consideration by pharmaceutical companies and several clinical trials are currently

in the pipeline 3. For instance, a G protein-biased ligand at -opioid receptor, TRV130, dissociating adverse respiratory depression from desirable analgesia, follows a phase III trial

in the treatment of acute pain 3. The -arrestin-biased AT1-R ligand TRV120027 which favors

-arrestin-dependent myocardial protection while antagonizing the adverse Gq-dependent vasoconstriction is in Phase IIb for the treatment of acute heart failure 4. Despite biased-agonism is more often taken from a clinical benefit standpoint, it could however also refers as

well to an adverse benefit/risk balance. As a good example, -blockers, originally developed to

uniformly block -adrenergic receptors in heart failure and still currently used as first instance drugs prescription, were later identified as biased-ligands 5 which could in part explain

disparities in clinical efficacies among-blockers 6,7. Interestingly, the imprinting of a biased-ligand seems not to be a fixed state of the chemical molecule. For instance, one study reported

classical antipsychotic drugs to commonly antagonize the D2-R/-arrestin pathway 8 which could refer to the efficacy of these drugs, while another independent one measured conversely partial agonism in a similar cell system 9. Likewise, the Angiotensin II-mimicking peptide SII

was originally described as a -arrestin-biased AT1-R agonist with no activity on the G protein pathway 10 but later finally demonstrated partial agonist efficacy on the G protein as well 1. Biased-agonism thus harbors a fickle state and remains a non-comprehending mechanism that needs to be further explored.

Despite the biased-activity of GPCR ligands is well defined as a signaling pathway filter, the molecular basis underlying biased-behavior still remains puzzling. Up to now, this pharmacological classification has been assigned to the stabilization of different conformations of the receptor 11. Recently, temporal exploration of the different signaling pathways appeared as an important determinant differently modulating the biased-profiling of a ligand 12,13. From a molecular standpoint, biased-agonism redefined the pharmacological classification of the efficacy a ligand based not only anymore on a ligand/receptor bipartite but to a more intricate ligand/receptor/effector tripartite, thus highlighting the importance of the effector character. Moreover, the influence of the relative receptor-G protein effector stoichiometry in ligand efficacy has been previously underlined in the classical pharmacology of GPCRs 14,15. However, this notion has never been evaluated in the delineation of biased activity of ligands. Even worse, evaluation of ligand biased activity in recombinant systems relies generally on the comparison on different signaling pathways each probed with different levels of receptor or effectors without calibration (i.e. II messengers production in cells stably expressing the

receptor vs -arrestin recruitment to a receptor transiently expressed) which should preclude any comparisons. This could in part account for the discrepancies in biased activity described for some ligands. Indeed, abnormal stoichiometry of the receptor-effector system has long



been viewed as a specificity of recombinant cell systems allowing high expression levels compared to natural ones 14. However, quantification of receptors or effectors in natural systems mostly relied on studies using tissues expressing different cell types, thus precluding an accurate and specific "physiological" quantification in each cell type. Moreover, both receptors and effectors expression are prone to modifications in pathological context. Some studies already described receptors, G proteins and secondary effectors down-regulation in heart failure 16-18 while other G proteins expression alterations were noticed in cancer 19 or Parkinson 20 diseases. This pathological cell environment should be even better considered from a clinical biased-drug perspective but has been rarely systematically defined.

In this study, we took advantage of recombinant systems allowing flexibility of protein expression to perform the first systematic calibrated study to evaluate and accurately quantify the influence of different heterotrimeric G protein expression levels, the first and common effector to all GPCR families, on the efficacy of ligands. The choice of the G protein subunits as

well as the receptors was dictated by an initial gene expression screen of the G subunits on adult cardiomyocytes isolated from pathological mice as a proof of concept for significant

alteration of G subunits expression in specific cells in a disease context. We demonstrate that

the level of G subunits expression plays a prominent role in the biased profiling of -agonists

that can impact both their affinity and efficacy in a G isoform and receptor specific manner.

Moreover, we show for the first time that the level of the G subunits can differently modify

the repartition of the G but, more surprisingly, also of the receptor in rafts/non rafts

membrane domains. In correlation, only some of the -agonists effects on the G proteins

activation were prevented by raft disruption depending on high or low level of G expression. These results have major impacts for quantification of biased agonism but also for our knowledge on the G protein/receptor interplay at resting state.

Methods

Materials. (-)-isoproterenol hydrochloride (ISO), (-)-norepinephrine (+) bitartrate salt

monohydrate (NE), (-)-epinephrine (EPI, angiotensine II (AngII) and methyl--cyclodextrine were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Coelenterazine 400a and Coelenterazine h were purchased from Interchim.

Gene expression of G proteins alpha subunits. Pathological hypertrophy was induced in C57Bl/6 mice by transverse aortic constriction (TAC) as describe 21. Fifteen days after the TAC, cardiomyocytes isolation, total RNA isolation and real-time PCR were performed as describe 21. Relative genes expression of G proteins alpha subunits in WT versus TAC mice were calculated using the comparative Ct method after quantitative PCR performed using the Fluidigm Biomark HD nano-scale platform. Genes encoding the Glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase (GAPDH) and the Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) were used as housekeeping genes for normalization

cDNA expression vectors. Plasmids encoding HA-AT1-R, HA-2-AR, 2-AR-GFP10, 2-AR-

Rluc, Gs-Rluc8, Gi1-Rluc8, GoA-Rluc8 and GFP10-G2 were previously described 1,22.

Plasmids encoding HA-1-AR and G3 were from UMR cDNA Resource Center.



Cell culture and transfection. Human embryonic kidney 293 cells (HEK293T) cells were cultured in DMEM Glutamax supplemented with 10% (v/v) FBS and 100 units/ml penicillin/streptomycin at 37°C in a humidified atmosphere at 5% CO2. Transient transfections were performed 24 h after cell seeding using polyethylenimine (PEI, Polysciences Inc.) according to manufacturer’s protocol.

Bioluminescence resonance energy transfer measurement. Receptors and G proteins subunits-encoding vectors were transiently transfected into HEK293T cells as indicated in the figure legends. Forty-eight hours after transfection, cells were washed with PBS, detached in PBS and resuspended in PBS / 0.1 % (w/v) glucose at room temperature. Cells were then distributed (80 µg of protein per well) into a 96-well microplate (Wallac, PerkinElmer Life and Analytical Sciences) and incubated in the presence of the different ligands for 1 min, BRET2 between Rluc8 and GFP10 was measured after the addition of the Rluc8 substrate coelenterazine 400a (5 µM, Interchim). BRET readings were collected using a modified Infinite F500 (Tecan Group Ltd). The BRET signal was calculated by the ratio of GFP10 (510 nm) to Rluc8 (450 nm).For concentration-response curves, BRET2 signals were recorded after 1 minute stimulation using nine log concentrations of each ligands.

Biochemical preparation of detergent-resistant membranes microdomains. Receptor and G proteins were transiently transfected in HEK293T cells as indicated in the figures legends. Forty-eight hours after transfection, detergent-resistant membrane microdomains isolation was performed. Briefly, cells were washed in cold PBS, detached with cold PBS and lysed by rotation during 30 min at 4°C in cold lysis buffer (Tris 25 mM pH 7,4 ; NaCl 140 mM ; EDTA 2 mM) containing 1% Triton X100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and a cocktail of protease inhibitor (Complete mini; Roche, Bale, Switzerland). Lysates were then homogenized and centrifuged 10 min at 860 g at 4°C. Supernatants were collected and protein amount was determined using BioRad DCTM protein assay. An equal amount of protein for each condition of transfection was then loaded on a sucrose step gradient (1ml of 60% sucrose, 6.5ml of 35% sucrose and 3.5ml of 5% sucrose in lysis buffer) and placed in an Ultracentrifuge tube (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Gradient were obtained by an 18h centrifugation at 39 000 rpm at 4°C without breakdown in a SW41 rotor (Beckman L70 Ultracentrifuge). Eleven 1ml fractions were collected from the top of the gradient. 180 µl of each fraction were placed in a 96-well microplate and the luciferase emission was collected after the addition of 5 µM of the enzyme substrate, coelenterazine h, using a luminometer Mithras LB 940 (Berthold technologies, Germany). The presence of GM1, a marker of the raft microdomains, was assessed in each fraction by dot plot using the Cholera toxin subunit B conjugates (Molecular probes, Life technologies, Rockville, MD. USA.).

Cholesterol depletion. For cholesterol depletion experiments, HEK293T cells were seeded and transfected in 100 mm dishes. To allow comparison between treated or not treated condition, cells were splited in two new dishes 24h after transfection. On the next day, cells were washed twice with DMEM Glutamax and incubated 45 min at 37°C in humidified

atmosphere at 5% CO2 with 2mM methyl--cyclodextrin in DMEM Glutamax or in DMEM glutamax alone as a control. Following depletion treatment, BRET experiments were performed as described above.

Quantification of cell surface receptors by ELISA. Receptor and G proteins were transiently transfected in HEK293T cells as indicated in the figures legends. 24h after transfection, cells



were splited in 24-well plates coated with poly-L-lysine. The remaining cells were seeded into dishes for Rluc8 luminescence measurement. The next day, 24-well plated cells were fixed in 4% paraformaldehyde, saturated with PBS containing 1% bovine serum albumin and incubated with the primary anti-HA antibody (clone 16B12; Covance) and then with the HRP-labeled secondary antibody (Sigma, St. Louis, MO, USA). After washing, cells were incubated with HRP substrate TMB (3,39,5,59-tetramethylbenzidine; BD Biosciences). The reaction was stopped with HCl 1N and the plates were read at 450nm in a microplate reader (Varioscan Flash, Thermo Electron). The 570nm optic density (back-ground) was subtracted. Rluc8 luminescence measurement in dishes plated cells were recorded as for BRET experiments.

Western blot analysis. For protein analysis, cells were lysed in buffer containing 50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % triton, H2O and cocktail protease inhibitors (ROCHE). Cells lysates (50 µg) were subjected to SDS-PAGE electrophoresis under reducing conditions, transferred onto PVDF membranes (Millipore), and analyzed by immunoblotting according to

standard protocols using anti-Gs polyclonal primary antibody recognizing G sequence specifically outside of the Rluc8 insertion site (PA5-19315; Thermo fisher Scientific), and an anti-GAPDH monoclonal antibody (sc-47724; Santa Cruz Biotechnology). Rabbit anti-Goat and Sheep anti-Mouse HRP-labeled secondary antibodies were from Thermo fisher Scientific (31402) and GE Healthcare (NA931V) respectively.

cAMP quantification. Quantification of cAMP levels was performed using the HTRF assay (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence): dynamic2 cAMP kit (Cisbio, Bedford, USA), based on a competitive immunoassay using Lumi4-TbTM cryptate-labeled antibodies anti-cAMP and d2-labeled cAMP. For that purpose, HEK293T cells were transiently transfected as indicated in the figures legends. The day of the experiment, cells were washed and resuspended in PBS/5mM Glucose/2mM IBMX. Then, 10,000 cells/well (384 wells-plate) were plated and stimulated for 1h at room temperature with increasing doses of ligand in a final volume of 10 µL. Cells were then lysed using 5 µL of lysis buffer containing d2-labeled cAMP and 5µL of Lumi4-TbTM cryptate-labeled anti-cAMP. The signal was measured after 1h room temperature inubtaion using a modified Infinite F500 (Tecan Group Ltd). The RET signal was calculated by the ratio of d2-cAMP/Lumi4-TbTM (665nm/620nm), the specific signal being inversely proportional to the concentration of cAMP in the sample. For each experiment, a calibration curve was established with cAMP standards allowing the quantification of cAMP levels by regression.

Data and statistical analysis. Statistical analysis of genomic changes between WT and TAC cardiomyocytes and BRET signal modulations were carried out using GraphPad Prism 4 software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Statistical test used are indicated in the figure legends. Values of P<0.05 were considered statistically significant.



Results

Alteration of Gsubunits gene expression in hypertrophic cardiomyocytes

We first evaluated the relative expression of the G subunits of all G protein families

(Gi/o: i1, i2, i3, o - Gs: sL - Gq/11: q, 11, 14, 15 - G12/13: 12, 13) in cardiomyocytes isolated from mice that were subjected to a barometric stress as a homogenous cardiac pathological model. Quantitative PCR reported important modifications of

the G genes as shown in Fig. 1. Specifically, Go and G11 encoding mRNA were 7.5 and 12.5 fold over-expressed respectively in failing cardiomyocytes compared to control mice. All other

mRNA encoding other G subunits were also prone to a significant but rather mild up-regulation oscillating between 1.5 and 2 fold. Interestingly, down-regulation of gene expression

was significantly measured only for the Gi1 subunits. Based on these results, we decided to

more specifically focus the next part of the study on Gi1, Go, G11, and Gs as representative isoforms for the different levels of modulation.

G isoform and stoichiometry dictates different ligand maximal responses

Before going on an exhaustive characterization of the influence of G protein expression level on ligand efficacy at G protein activation, we performed a preliminary screened in

HEK293T recombinant cells to test different levels of Gs and GoA on their activation

promoted by synthetic isoproterenol (ISO) following stimulation of 1-AR or 2-AR as well as

of G11 with Angiotensin II (AngII)/AT1-R, all these receptors being prominent drug targets in

heart failure. For that purpose, we assessed the direct activation of the specific G subunits using BRET2 probes that we previously described 1,22,23 by measuring the interaction between

the specific G-Rluc8 and GFP10-G2 subunits in the presence of the complementary untagged

G3 that is specific of adult cardiomyocytes 24. These G protein BRET probes provide powerful and accurate tools to depict ligand pharmacology as they not only allow probing agonist efficacy, as reflected by a decrease in the BRET signal (negative BRET modulation), but also inverse agonist efficacy conversely promoting an increase in the BRET signal 25 compared to

the basal BRET signal representing inactive G complexes. G protein activation was thus

measured under different controlled G-Rluc8 expression levels as reflected by the record of the total luminescence and in conditions of receptor excess and saturating ligand concentration to ensure depicting of the maximal ligand/receptor/G protein complexed fractions of the receptor population. Unexpectedly, for all the conditions tested in this experiment, all reference agonist ligands promoted a significant BRET signal modulation following 1 min

stimulation of 1-AR or 2-AR/Gs (Fig. 2a), 1-AR or 2-AR/GoA (Fig. 2b) or AT1-R/G11

(Fig. 2c) that progressively decreased relative to the increasing of the G subunits expression. Thus, contrary to the prediction in over-expressed systems assuming increased G protein coupling with G protein excess, these results indicate that agonist efficacy of these ligands is

better reflected in a context of low levels of G subunits while higher levels prevent the agonist behavior.

G isoform and stoichiometry dictates different -adrenergic ligand pharmacology

To get further insight the influence of the G expression level on the biased activity of

ligands, we decided to focus on the 1- and 2-AR receptors and Gs, Gi1 and GoA



activation promoted by the reference synthetic ISO and their two natural agonists epinephrine (EPI) and norepinephrine (NE).

We first measured the activation of these different G protein BRET biosensors in

HEK293T cells in absence of 1- and 2-receptors over-expression to evaluate the potential endogenous adrenergic responses (Supplementary Fig. 1). G proteins activation was

evaluated through two high and low G expression levels, similar for all subunits and calibrated in each transfection (Supplementary Fig. 1, inset). Despite we over-expressed the

G-Rluc8 subunits, their two expression levels were still below the expression level of the

corresponding endogenous G subunit as shown in western-blot (Supplementary Fig. 2). As

expected, despite we didn't detect any significant Gs activation, except in the presence of EPI

at high level of Gs expression (Supplementary Fig. 1a), EPI and NE promoted significant

activation of both Gi1 and GoA while ISO was ineffective (Supplementary Fig. 1b, c), thus confirming the presence of endogenous adrenergic receptors as known for HEK293T cells. However, the endogenous receptors were not really problematic when over-expressing both G protein biosensors and receptors, since these conditions always shift the activation response toward the transfected complex. Indeed, no correlation could be found between

conformational changes stabilized by -agonists on the Gi1/2-AR complex and the Gi1

activation pattern with endogenous adrenergic receptors, while they correlated with the Gi1

activation profile obtained when over-expressing the 2-AR (Supplementary Fig. 3). These results were also corroborated by cAMP measurements performed in the presence or not of

Gs or 1- or 2-AR over-expression in similar conditions to that of BRET experiments measuring the G protein activation (Supplementary Fig. 4). EPI and NE promoted a significant concentration-dependent cAMP production with endogenous receptors but with low potency

that was always leftward shifted when over-expressing the 1- or 2-AR and considerably increased in the maximal efficacy (Supplementary Fig. 4; Supplementary Table 1). Further,

addition of the Gs subunit potentiated the maximal efficacy of EPI and NE independently of its

expression level at 1-AR (Supplementary Fig. 4a) but not at 2-AR (Supplementary Fig. 4b), indicative of its high selective influence on the adenylyl cyclase activation.

We then examined the pharmacological activation profile of the three G subunits, Gs,

Gi1 and GoA, in the presence of 1- or 2-AR under high and low G expression levels (Fig.

3). Each receptor was calibrated to similar cell surface expression levels for each G subunits

experimental conditions but not between receptors (Supplementary Fig. 5) while all G subunits expression levels (high or low) were calibrated for the three subunits

(Supplementary Fig. 6). For Gs activation, both NE and EPI displayed different dose-

response curves in the presence of 1-AR only depending on the G expression levels (Fig.3 a).

High level Gs expression specifically increased the EPI potency compared to low levels, while conversely only decreased the maximal efficacy of NE (Supplementary Table 2). Interestingly,

while ISO response was insensitive to Gs levels with 1-AR (Fig. 2a), high Gs level increased

ISO-potency at 2-AR (Fig. 3b; Supplementary Table 3). For Gi1 activation by 1-AR (Fig. 3c), ISO displayed an atypical pharmacological profile with kind of double-bell shaped dose-

response curves showing significant very low-dose activation in the presence of low Gi1

levels. On the contrary, the expression level of Gi1 had no significant impact on NE and EPI

responses. In the presence of 2-AR (Fig. 3d), while low Gi1 level allowed detection of Gi1 activation in low ISO and EPI concentration ranges and specifically potentiated the maximal



activation by EPI, no influence of the Gi1 level was detected for NE response. Although GoA

belongs to the same Gi/o family to that of Gi1, the dose-responses for each ligand were quite

different (Fig. 3e, f). ISO, NE and EPI displayed similar dose-responses profiles with 1-AR in

the presence of low or high GoA levels (Fig. 3e) while for 2-AR, low GaoA levels increased all three ligands maximal potencies (Fig. 3f). The LogEC50 and the Emax values were graphically

represented in a web to better appreciate the fingerprint of each -ligand for the activation of

the three G subunits at both high and low expression for both 1-AR and 2-AR (Fig. 4). It is

pretty clear from all graphics that low and high G expression levels modified the bias fingerprint for almost all ligands and the two receptors, thus demonstrating that the

expression level of the G subunits accurately dictates bias of ligands. Interestingly, all three -agonists displayed different fingerprints from each other for each web, indicating that they most probably stabilize different receptor conformations with specific signaling outputs.

G isoform and stoichiometry dictates different -adrenergic agonist responses in raft and non rafts microdomains

One mechanism which could account for the differential agonist pharmacology of -

agonists as a function of G subunit expression level relies on the Gsubunit membrane

distribution that could fluctuate according to this level and thus modifies its activity with -ligands. Cholesterol enriched-membrane lipid microdomains (rafts) constitute one well-known signaling platform for some receptors and signaling effectors. G proteins do not escape the rule as they've been shown to concentrate in lipid rafts in cardiomyocytes 26. Rafts have also been

shown to play a key role in the regulation of both 2-AR ligands binding and signaling in heterologous and native systems 27,28. We thus examined the raft dependence of the different

G subunits activation by 2-AR at high and low G expression levels using a cell pretreatment

with the cholesterol depleting agent methyl--cyclodextrin (-CD) (Fig. 5). As shown in Fig. 5,

cholesterol depletion differently influenced the maximal efficacy of -agonists with specificity

for each experimental condition. For instance, while Gs responses with the three agonists

were insensitive to -CD treatment (Fig. 5a), it specifically prevented Gi1 activation

promoted by EPI for both high and low Gi1 levels (Fig. 5b). Conversely, 2-AR-mediated

GoA activation was more sensitive to cholesterol depletion with specificity for ISO at both

high and low GoA levels, NE at high GoA level and EPI at low GoA levels (Fig. 5c). It follows

that the isoform but more intriguingly the expression level of the G subunit none uniformly require cholesterol enrichment for their activity.

G isoform and stoichiometry dictates differential -adrenergic receptor membrane distribution

To get further insight molecular mechanisms underlying such differential raft

dependence of -agonists responses depending on the G expression level, we examined the

membrane distribution of both 2-AR and G subunits in high and low expression level

conditions. For that purpose, HEK293T cells co-expressing 2-AR and Gs, Gi1 or GoA in the

presence of G2 and G3 subunits were proceeded for light density membrane microdomains purification based on solubilization with 1% Triton X-100 at 4°C followed by a sucrose

gradient separation as previously described 27. Specifically, we studied the distribution of 2-

AR and the G subunits at high or low G expression levels as in the BRET experiences (Fig. 6).

To gain in detection sensitivity, we took advantage of a 2-AR-Rluc or the G-Rluc8 constructs



allowing luminescence measurements to accurately quantify separately both proteins in each sucrose fraction. The raft marker GM1 was used as a positive control to identify rafts enriched

fractions in western-blot. When following the G subunits distribution (Fig. 6a), each of the three subunits exhibited a specific pattern of distribution. In agreement with their lipid

modifications 29, Gi1 and GoA essentially concentrated in rafts enriched fractions while Gs was distributed among some rafts and non rafts domains. Interestingly, high expression level

shifted the repartition pattern of the Gi1 subunit in the raft domains and also increased the

Gs expression in plasma membrane domains to the detriment of the rafts. However, the

expression level did not affect GoA distribution. Regarding the 2-AR distribution, as

previously reported 27, in the absence of G protein over-expression, 2-AR was enriched in

rafts domains (Fig. 6b). Unexpectedly, while the distribution profiling of 2-AR was similar

with high or low levels of Gi1 or GoA expression, it was completely shifted in the presence of

Gs toward non-rafts fractions which could in part explain, together with the specific Gs

distribution, the cAMP production profile that is modified when over-expressing both the 2-

AR and the Gs protein (Supplementary Fig. 2). This result highlights for the first time the

incidence of the G subunit on the receptor membrane distribution that could account for specific and biased receptor pharmacology.

Discussion

Dans ce travail, nous avons observé que les niveaux d’expression génique des sous-

unités G des protéines G hétérotrimériques subissent de fortes altérations au sein des cardiomyocytes hypertrophiques suite à un stress barométrique cardiaque chez la souris. Or, les RCPG constituent des régulateurs importants de la contraction cardiaque au sein des cardiomyocytes et de telles altérations devraient avoir un impact important sur le fonctionnement cardiaque. Effectivement, des modifications d’expression génique des

protéines G ont été précédemment liées à une dysfonction de la signalisation -adrénergique et à l’apparition ou au développement de l’insuffisance cardiaque 16,17. De plus, nous avons montré, dans un modèle cellulaire hétérologue, que le niveau d’expression génique des sous-

unités G impacte fortement sur l’efficacité maximale et la puissance des ligands adrénergiques, au regard de l’activation de ces protéines G hétérotrimériques, via le contrôle

de leur propre compartimentation et de celle des récepteurs -adrénergiques qui leur sont associés dans les domaines rafts et non rafts des membranes cellulaires. Il est connu que les RCPG et les protéines G hétérotrimériques peuvent être compartimentés au sein de micro-domaines membranaires de type raft en particulier pour la signalisation adrénergique au sein de cardiomyocytes, et que cette compartimentation et la signalisation intracellulaire associée sont dérégulées dans des modèles d’insuffisance cardiaque 27,30. Ainsi, l’altération de l’expression génique des protéines G et les différences d’efficacité des ligands que nous observons en fonction de la stœchiométrie et de la localisation des récepteurs et des protéines G dans les domaines membranaires pourraient rendre compte, au moins en partie, de

l’altération de la signalisation -adrénergique dans l’insuffisance cardiaque

Le résultat le plus surprenant dans notre étude reste l’impact de l’isoforme et du niveau

d’expression des sous-unités G des protéines G sur la compartimentation membranaire des RCPG. Ce résultat a été obtenu dans des conditions basales du système cellulaire. Une



hypothèse qui pourrait rendre compte de ce phénomène repose sur les voies de trafic antérograde (voie de biosynthèse) des RCPG qui pourraient être régulées par les protéines G hétérotrimériques. En effet, ces protéines, à l’origine cytosoliques, son retrouvées au niveau du réticulum endoplasmique 31,32, compartiment cellulaire dans lequel les RCPG suivent leur voie de biosynthèse/maturation/trafic jusqu’à leur adressage à la membrane plasmique. De plus, il

a récemment été montré que les sous-unités G et G pouvaient interagir avec des petites GTPases de type Rab, impliquées dans le trafic vésiculaire intracellulaire des protéines 33,34. A côté, une autre hypothèse de l’existence de pré-complexes RCPG-protéines G inactifs pourrait être également envisagée. En accord avec cette hypothèse, l’existence de pré-complexes constitués de RCPG, de protéines G, mais également d’autres effecteurs, existant à l’état basal est maintenant largement décrite dans la littérature 22,35-38. De plus, Dupré et collaborateurs ont mené plusieurs études montrant que ces pré-complexes semblent se former au niveau du réticulum endoplasmique et de l’appareil de Golgi, donc avant l’adressage du récepteur à la membrane 39,40.

L’impact de la pré-association des protéines G et des RCPG sur la compartimentation

des RCPG suggère que les protéines G, notamment les sous-unités G, peuvent contrôler par ce biais le trafic des récepteurs jusqu’aux différents compartiments membranaires, dictant ainsi l’efficacité biaisée des ligands. En accord avec cette hypothèse, Dupré et collaborateurs ont

montré que le blocage de la localisation membranaire de la sous-unité G ou sa délocalisation au niveau des mitochondries induit une diminution de l’expression à la surface du récepteur qui lui est associé 40.

L’ensemble de ces travaux soutient l’hypothèse d’un rôle décisif de la sous-unité G dans la compartimentation des RCPG à la membrane plasmique à l’état basal. Cependant, il n’existe pas encore d’étude suggérant l’implication directe de la protéine G dans la compartimentation de ces récepteurs. Pourtant, cette hypothèse ne semble pas incohérente au

regard de la compartimentation connue des sous-unités G 41 en fonction de leur modifications lipidiques particulières 29,42. Si ces modifications lipidiques impactent sur leur adressage à la membrane dans des compartiments spécifiques, il est tout à fait possible que les récepteurs auxquels elles sont pré-associées suivent le même trajet. En accord avec cette possibilité, nous

montrons pour la première fois que la nature de la sous-unité G des protéines G contrôle différemment la répartition des récepteurs dans différents micro-domaines membranaires. Dans le futur, il sera intéressant de regarder l’impact d’autres isoformes de protéines G sur différents RCPG.



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Figures legends

Figure 1. Modification of heterotrimeric G protein subunits expression levels in failing

cardiomyocytes. Specific relative gene expression changes of heterotrimeric G proteins G subunit isoforms were quantified in cardiomyocytes, isolated from mice exhibiting or not heart failure, using Fluidigm Real-time PCR analysis. Results are expressed as the relative induction of the genes in C57Bl/6 mice submitted to transverse aortic banding for 15 days (n=6) compared to control mice (n=6) wherein genes expression are equal to 1. The statistical significance of the change in expression level was assessed using unpaired Student’s t-test. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Figure 2. G subunits expression level impacts on ligand maximal efficacy on G protein

activation. a, b) BRET in HEK293T cells co-expressing HA-1-AR (left panels) or HA-2-AR

(right panels) receptors and different levels of BRET biosensors Gs-Rluc8 (a) or GoA-Rluc8

(b) in presence of GFP10-G2 and G3 untagged subunit. Cells were stimulated or not for 1 min with increasing concentrations of the indicated compounds. Results are expressed as the difference in BRET signals measured in presence and absence of ligand. c) BRET performed as

in (a), in HEK293T cells co-expressing AT1a-R receptor and G11-Rluc8, GFP10-G2 and G3 untagged subunit. Data represent the mean ± s.e.m. of at least three independent experiments. The statistical significance between stimulated and un-stimulated cells was assessed using paired Student’s t-test (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001). The statistical significance of the

difference in ligand efficacy between G expression levels was assessed using one-way ANOVA followed by a Tukey multiple comparison test ($P<0.05, $$P<0.01, $$$P<0.001).

Figure 3. G subunits expression level dictates -AR agonists efficacies and potencies. a-

f) BRET in HEK293T cells co-expressing HA-1-AR (a, c, e) or HA-2-AR (b, d, f) receptors and

two different levels (low black curves, high orange curves) of BRET biosensors Gs-Rluc8 (a, b),

Gi1-Rluc8 (c, d) or GoA-Rluc8 (e, f) in presence of GFP10-G2 and G3 untagged subunit. Cells were stimulated or not for 1 min with increasing concentrations of the indicated compounds. Results are expressed as the difference in BRET signals measured in presence and absence of ligand. Data represent the mean ± s.e.m. of at least four independent experiments. The statistical significance between stimulated and un-stimulated cells in low (*) and high ($) condition was assessed using one-way ANOVA followed by a Dunnett’s multiple comparison test (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001). The statistical significance between low and high dose-response curves was assessed using two-way ANOVA followed by a Bonferroni posttest (#P<0.05, ##P<0.01).

Figure 4. Schematic multi-axial representation of -AR agonists pharmacological profiles

according to G isoforms and expression levels. a-d) Data depicted are representative of agonists potencies (a, b) and maximal efficacies (c, d) obtained for G protein activation

through 1-AR (a, c) or 2-AR (b, d) and derive from Fig. 3.

Figure 5. Cholesterol-enriched domains are implicated in 2-AR agonist maximal

efficacy on G protein activation. a-c) BRET in HEK293T cells co-expressing HA-2-AR

receptors and two different levels (low black bar, high orange bar) of BRET biosensors Gs-

Rluc8 (a), Gi1-Rluc8 (b) or GoA-Rluc8 (c) in presence of GFP10-G2 and G3 untagged

subunit. Cells were pretreated (+, hatched) or not (-) with 2mM methyl--cyclodextrine (CD)



during 45 min at 37°C for cholesterol depletion before recording BRET signals. Cells were stimulated or not for 1 min with 10 µM of the indicated compounds. Results are expressed as the difference in BRET signals measured in presence and absence of ligand. Data represent the mean ± s.e.m. of at least four independent experiments. The statistical significance between stimulated and un-stimulated cells was assessed using paired Student’s t-test (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001). The statistical significance between treated and not treated cells was assessed using unpaired Student’s t-test ($P<0.05).

Figure 6. G expression level impacts on membrane compartmentalization of G

subunits and -AR receptors. Sucrose gradient fractionation was performed on cells lysed at

4°C using Triton X-100 detergent. a) HEK293T cells co-expressing untagged 2-AR and two

levels (low black curves, high orange curves) of Gs-Rluc8 (left panel), Gi1-Rluc8 (middle

panel) or GoA-Rluc8 (right panel) along with G3 and G2. b) HEK293T cells co-expressing

2-AR-Rluc along with two levels (low black curves, high orange curves) of untagged Gs (left

panel), Gi1 (middle panel) or GoA (right panel) and G3 and G2 subunits. c) HEK293T cells

expressing 2-AR-Rluc alone. Results are expressed as the percentage of the maximal luminescence measured in each experiment. Grey rectangles represent fractions containing the raft micro-domains, identified by detection of the GM1 protein (upper dot plot). Data represent the mean ± s.e.m. of at least three independent experiments. The statistical significance of the difference in membrane distribution in low versus high conditions (*) or versus receptor alone (¤) was assessed using two-way ANOVA followed by a Bonferroni posttest (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).



G i1 G i2 G i3 Go Gq G11 G14 G15 Gs G12 G130

1

2

35

10

15

20

25

G i/o G q/11 G s G 12/13

***

***

***

**

**

******

*

***

*

*

G subunits gene

rela

tive g

en

e e

xp

ressio

n (

2-

C

t )Onfroy et al.

Figure 1



-ARGs-Rluc8 + G3 + GFP10-G2

a

b

c

PM

GFP10

Luc8

Receptor

Figure 2Onfroy et al.

1-ARGs-Rluc8 + G3 + GFP10-G2

1-ARGoA-Rluc8 + G3 + GFP10-G2

-ARGoA-Rluc8 + G3 + GFP10-G2

AT1a-RG11-Rluc8 + G3 + GFP10-G2

-0.0

08

-0.0

06

-0.0

04

-0.0

02

0.0

00

ns

ns

ns

ns

Isoproterenol

modulated BRET

0

100,0

00

200,0

00

300,0

00

400,0

00

$$

$ $$

$

$$

$$

$$

$$

$

Relative expression of

G -Rluc8 proteins (U.A.)

-0.0

3

-0.0

2

-0.0

1

0.0

0

*

**

ns

ns

$

$$

$$$

Isoproterenol

modulated BRET

0

200,0

00

400,0

00

600,0

00

800,0

00

1,0

00,0

00

$$

$

$$

$

$$

$

$$

$

$$

$



0

200,0

00

400,0

00

600,0

00

800,0

00

1,0

00,0

00

$

$$

$

$$



-0.1

6

-0.1

4

-0.1

2

-0.1

0

-0.0

8

-0.0

6

-0.0

4

-0.0

2

-0.0

0

**

**

**

$

$$

Isoproterenol

modulated BRET

-0.0

4

-0.0

3

-0.0

2

-0.0

1

0.0

0

*

**

ns

Isoproterenol

modulated BRET

0

200,0

00

400,0

00

600,0

00

800,0

00

1,0

00,0

00

1,2

00,0

00

1,4

00,0

00

$

$$

$

$$

$



0

200,0

00

400,0

00

600,0

00

800,0

00

1,0

00,0

00

$$

$$

$$$

$

$$

$



-0.1

2

-0.1

0

-0.0

8

-0.0

6

-0.0

4

-0.0

2

0.0

0

*

***

ns

$$$$

$$$

Angiotensin II

modulated BRET



2-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

Low

High

******

********

$$$$$$

$$

*#

Log [ISO] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

2-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

Low

High

******

*******

$$$$$$$$$

##

Log [ISO] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

1-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

Low

High

***

*****

** **

$$$$$$$

##

Log [ISO] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

2-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.03

-0.02

-0.01

0.00

0.01

Low

High

*

**

$$$$$$

$$$

$

Log [NE] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

1-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.03

-0.02

-0.01

0.00

0.01

Low

high

***

$$$$$$

$$$

$

#

Log [EPI] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

1-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.03

-0.02

-0.01

0.00

0.01

Low

High

*********

$$$$$$

*

$

##

Log [NE] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

2-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.12

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

Low

High

***

***

***

****

$$$

$$$

$$$

$

*

$$$

p=0.0583

Log [EPI] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

2-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.03

-0.02

-0.01

0.00

0.01

Low

High

*****

**

*

$$$$$$

$$$$$$$$$

Log [ISO] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

2-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.03

-0.02

-0.01

0.00

0.01

Low

High

******

***

$$$$$$$$$

$$$

$$

***

Log [EPI] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

1-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.03

-0.02

-0.01

0.00

0.01

Low

High

******

$$$$$$$$$

Log [ISO] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ETa

b

c

e

f

d

1-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

Low

High

******

***

$$$

$$$$$$

Log [ISO] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

1-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

Low

High

***

$$$

$$$

$$

**

***

$$$

Log [EPI] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

1-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

Low

High

***

***

*

$$$

$$$

$$$

Log [NE] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

2-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

Low

High

******

*

$$$$$$

$$$

$

Log [NE] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

2-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

Low

High

******

****

$$$$$$

$

Log [EPI] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

2-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

Low

High

******

*****

$$$$$$

$

Log [NE] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

1-AR

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

Low

High

$$$$$$$$

**** *

Log [EPI] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

1-AR-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

Low

High

$$$$$$

$$$

$$

***

Log [NE] (M)

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

Gs

Gi1

GoA

Figure 3

PM

GFP10

Luc8

Receptor Onfroy et al.



LogEC50

Emax

-8

-7

-6

-5Gas

Gai1GaoA

1-AR

G low expression

ISONEE

-8

-7

-6

-5Gas

Gai1GaoA

1-AR

G high expression

ISONEE

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0Gas

Gai1GaoA

1-AR

G low expression

ISO

NE

E

-0,1

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0Gas

Gai1GaoA

1-AR

G high expression

ISO

NE

E

-0,1

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0Gas

Gai1GaoA

2-AR

G low expression

ISO

NE

E

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0Gas

Gai1GaoA

2-AR

G high expression

ISONEE

-11

-9

-7

-5Gas

Gai1GaoA

2-AR

G low expression

ISONEE

-11

-9

-7

-5Gas

Gai1GaoA

2-AR

G high expression

ISONEE

Gs

Gi1GoA

Gs

Gi1GoA

Gs

Gi1GoA

Gs

Gi1GoA

Gs

Gi1GoA

Gs

Gi1GoA

Gs

Gi1GoA

Gs

Gi1GoA

Figure 4

a

b

c

d

EPIEPI

EPIEPI

EPI EPI

EPI EPI

Onfroy et al.



2-AR

Gs-Rluc8 + G3 + GFP10-G2

ISO NE EPI

-0.03

-0.02

-0.01

0.00

** * ****

********

*p=0.0628

Low

High

Not treated

Treated

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

2-AR


ISO NE EPI-0.06

-0.04

-0.02

0.00

***

***

*

***

**** **

*

** *

p=0.0543

$

$

Low

High

Not treated

Treated

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

2-AR

GoA-Rluc8 + G3 + GFP10-G2

ISO NE EPI

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

****

*

$ **

**

***

**$

$

$

*

Low

High

Not treated

Treated

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

a

b

c

Onfroy et al.Figure 5

PM

GFP10

Luc8

2-AR



2-AR Rluc

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

20

40

60

80

100

120

Fractions

Re

lati

ve

re

ce

pto

r le

ve

l

(% o

f m

ax

ima

l lu

min

es

ce

nc

e)

Onfroy et al.Figure 6

2-AR

GoA-Rluc8 + G3 + G2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

20

40

60

80

100

120low

high

Fractions

Re

lati

ve

G

le

ve

l

(% o

f m

ax

ima

l lu

min

es

ce

nc

e)

GM1

2-AR

G i1-Rluc8 + G3 + G2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

20

40

60

80

100

120lowhigh

****

FractionsR

ela

tiv

e G

l

ev

el

(% o

f m

ax

ima

l lu

min

es

ce

nc

e)

GM1a2-AR


0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

20

40

60

80

100

120Low

High

**

Fractions

Re

lati

ve

G

le

ve

l

(% o

f m

ax

ima

l lu

min

es

ce

nc

e)

GM1

2-AR Rluc

Gs + G3 + G2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

20

40

60

80

100

120low

high

Alone

*

¤¤¤¤

¤¤¤

¤¤¤

¤¤

¤¤¤

¤

Fractions

Re

lati

ve

re

ce

pto

r le

ve

l

(% o

f m

ax

ima

l lu

min

es

ce

nc

e)

GM1

2-AR Rluc

G i1 + G3 + G2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

20

40

60

80

100

120low

high

Alone

Fractions

Re

lati

ve

re

ce

pto

r le

ve

l

(% o

f m

ax

ima

l lu

min

es

ce

nc

e)

GM1

2-AR Rluc

GoA + 3 + 2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

20

40

60

80

100

120low

high

Alone

Fractions

Re

lati

ve

re

ce

pto

r le

ve

l

(% o

f m

ax

ima

l lu

min

es

ce

nc

e)

GM1

GM1

PM

Luc8

2-AR

PM

Luc

2-AR

PM

Luc

2-AR

b

c



SUPPLEMENTARY

FIGURES AND TABLES




ISO NE EPI-0.03

-0.02

-0.01

0.00

0.01

lowhigh

*

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

G-Rluc8 + G3 + GFP10-G2

Gs G i1 GoA0

100,000

200,000

300,000

400,000

500,000high

low

Re

lati

ve

ex

pre

ss

ion

of

G

-Rlu

c8

pro

tein

s (

U.A

.)


ISO NE EPI

-0.1

-0.1

-0.1

-0.0

-0.0

0.0

low

**

*

high

*

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

GoA-Rluc8 + G3 + GFP10-G2

ISO NE EPI-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

low***

high

** ***

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

ba

c

Supplementary Figure 1

Supplementary Figure 1. 2-AR ligand maximal efficacy on endogenous receptor-mediated G

protein activation using BRET. a-c) BRET in HEK293T cells expressing two different levels (low blackbar, high brown bar) of BRET biosensors Gs-Rluc8 (a), Gi1-Rluc8 (b) or GoA-Rluc8 (c) in presence

of GFP10-G2 and G3 untagged subunit. Cells were stimulated or not for 1 min with 10 µM of the

indicated compounds. Results are expressed as the difference in BRET signals measured in presenceand absence of ligand. Data represent the mean s.e.m. of at least four independent experiments. The

statistical significance between stimulated and un-stimulated cells was assessed using paired Student’st-test (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001). inset : Relative expression levels of G-Rluc8 proteins,

corresponding to the emission levels of Rluc8 luminescence measured in each basal condition.

PM

GFP10

Luc8

Onfroy et al.




42 kDa

72 kDa

1 2 3 4 5 6 7

Supplementary Figure 2. Expression of the Gs-Rluc8 transfected protein. Western blot analysis of

HEK293T cells over-expressing untagged Gs (lane 1) or Gs-Rluc8 (lane 2) along with G3 andGFP10-G2; co-expressing same levels as for BRET experiments of 1-AR (lane 3-4) or 2-AR (lane 5-

6) along with G3 and GFP10-G2 in presence of high (lane 3, 5) or low (lane 4, 6) levels of Gs-Rluc8;

or expressing empty pcDNA3.1 vector alone (lane 7). GAPDH was detected as housekeeping protein.Blot is representative of three independent experiments.

Gs

Onfroy et al.

GAPDH

Gs-Rluc8



G i1 + G3 + G2

0.005 0.010 0.015 0.020

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

r² = 0,8915p = 0,2137

E

ISONE

R-G conformation

G p

rote

in a

cti

va

tio

n

2-AR

G i1 + G3 + G2

0.005 0.010 0.015 0.020

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

r² = 0,3187p = 0,0354

ISO

E

NE

R-G conformation

G p

rote

in a

cti

va

tio

n

a

b

c

2-AR-GFP10

G i1-Rluc8 + G3 + G2

ISO NE E

0.000

0.005

0.010

0.015

*

*

***

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET


ISO NE E

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

no R

2-AR**

*

*

*

Lig

an

d m

od

ula

ted

BR

ET

d


Supplementary Figure 3. G i1 protein activation correlates with 2-AR/G i1 conformational

changes upon ligand stimulation. a) BRET in HEK293T cells expressing low level of Gi1-Rluc8 inpresence of GFP10-G2 and G3 untagged subunit. Cells were stimulated or not for 1 min with 10 µM of

the indicated compounds. Results are expressed as the difference in BRET signals measured in

presence and absence of ligand. b) BRET in HEK293T cells co-expressing 2-AR-GFP10 receptor inpresence of low level of Gi1-Rluc8 along with untagged G2 and G3 subunits. Cells were stimulated

or not for 1 min with 10 µM of the indicated compounds. Results are expressed as the difference in theBRET signal measured in presence and absence of ligand. c, d) Correlation between Gi1 protein

activation and 2-AR/Gi1 conformational changes in cells expressing (c) or not (d) the 2-AR receptor.

Results were analyzed by linear regression. Data represent the mean s.e.m. of at least fourindependent experiments. The statistical significance between stimulated and un-stimulated cells was

assessed using paired Student’s t-test (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)

i1

PM

Luc8

2-AR

GFP10

Onfroy et al.

I1

PM

GFP10

Luc8

2-AR



a

b

1-AR


-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -50

5

10

15

20

25

30(-) R (-) G

(+) R (-) G

(+) R (+) High Gs

***

(+) R (+) Low Gs

Log [EPI] (M)

[cA

MP

] p

rod

ucti

on

(n

M)

2-AR


-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -50

5

10

15

20

25

30(-) R (-) G

(+) R (-) G

(+) R (+) Low Gs

(+) R (+) High Gs

Log [EPI] (M)

[cA

MP

] p

rod

ucti

on

(n

M)

2-AR


-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -50

5

10

15

20

25

30(-) R (-) G

(+) R (-) G

(+) R (+) Low Gs

(+) R (+) High Gs

Log [NE] (M)

[cA

MP

] p

rod

ucti

on

(n

M)

-AR +


1-AR 2-AR0

100,000

200,000

300,000

400,000Low

High

Re

lati

ve

ex

pre

ss

ion

of

G

-Rlu

c8

pro

tein

s (

U.A

.)


Supplementary Figure 4. Dose-responses curves of cAMP production by -AR agonists. a, b)

Quantification of cAMP levels was performed in HEK293T cells co-expressing HA-1-AR (a) or HA-2-AR (b) and two different levels (low black, high brown) of Gs-Rluc8 in presence of GFP10-G2 and

G3 untagged subunits. The statistical significance between dose-response curves was assessed using

two-way ANOVA followed by a Bonferroni posttest (*P<0.05, **P<0.01). Inset : Relative expressionlevels of G-Rluc8 proteins, corresponding to the emission levels of Rluc8 luminescence, in presence of

1-AR or 2-AR.

1-AR


-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -50

5

10

15

20

25

30

(-) R (-) G

(+) R (+) Low Gs

(+) R (-) G

(+) R (+) High Gs**

*

Log [NE] (M)

[cA

MP

] p

rod

ucti

on

(n

M)

Onfroy et al.



HA-2-AR


Gs G i1 GoA0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5 low

high

Ce

ll s

urf

ac

e r

ec

ep

tor

de

ns

ity

(OD

45

0n

m -

OD

57

0n

m)

HA-1-AR


Gs G i1 GoA0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 low

high

Ce

ll s

urf

ac

e r

ec

ep

tor

de

ns

ity

(OD

45

0n

m -

OD

57

0n

m)

HA-2-AR


Gs G i1 GoA0

100,000

200,000

300,000

400,000

500,000 low

high

Re

lati

ve

ex

pre

ss

ion

of

G

-Rlu

c8

pro

tein

s (

U.A

.)

HA-1-AR


Gs G i1 GoA0

100,000

200,000

300,000

400,000

500,000lowhigh

Re

lati

ve

ex

pre

ss

ion

of

G

-Rlu

c8

pro

tein

s (

U.A

.)

b

a


c

Supplementary Figure 5. Quantification of HA--AR cell surface expression by ELISA. a, b) ELISA

experiments were performed on HEK293T cells co-expressing HA-1-AR (a) or HA-2-AR (b) receptorsand two different levels (low black bar, high brown bar) of BRET biosensors Gs-Rluc8, Gi1-Rluc8 or

GoA-Rluc8 in presence of GFP10-G2 and G3 untagged subunit. Cell surface expression of -AR

was quantified by ELISA using an anti-HA antibody. Insets: Each transfection conditions were controlledfor G-Rluc8 relative expression levels by measuring emission levels of Rluc8 luminescence. Data

represent the mean s.e.m. of three independent experiments. The statistical significance of thedifference in cell surface receptor density between low and high expression level was assessed using

unpaired Student’s t-test.

Onfroy et al.



ba 1-AR


Gs G i1 GoA0

100,000

200,000

300,000

400,000

500,000 LowHigh

Re

lati

ve

ex

pre

ss

ion

of

G

-Rlu

c8

pro

tein

s (

U.A

.)

2-AR


Gs G i1 GoA0

100,000

200,000

300,000

400,000 Low

High

Re

lati

ve

ex

pre

ss

ion

of

G

-Rlu

c8

pro

tein

s (

U.A

.)2-AR


0

200,000

400,000

600,000

800,000

Gs G i1 GoA

- + - + - + - + - + - + CD

Low

High

Re

lati

ve

ex

pre

ss

ion

of

G

-Rlu

c8

pro

tein

s (

U.A

.)

c


Supplementary Figure 6. Relative expression level of G subunits in doses-responses and CD

experiments. a-c) Relative expression levels of G-Rluc8 subunits, corresponding to the emissionlevels of Rluc8 luminescence measured in basal condition. a, b) Results were obtained from

experiments presented in Fig. 2 and performed in HEK293T cells co-expressing HA-1-AR (a) or HA-

2-AR (b) in presence of two different level (low black bar, high brown bar) of G protein BRETbiosensors Gs-Rluc8, Gi1-Rluc8 or GoA-Rluc8 in presence of GFP10-G2 and G3 untagged

subunit. c) Results were obtained from experiments presented in Fig. 7 and performed in HEK293T cellsco-expressing HA-2-AR along with G protein BRET biosensors and pretreated or not with 5 mM CD

for 45 min at 37 C.

1

PM

GFP10

Luc8

Receptor

Onfroy et al.



NE E

(-) R (-) G

EC50 1,63e-005 1,44e-006

pEC50 sem -4,78 1,14 -5,84 0,10

Emax sem 5,25 7,81 11,18 0,704

Receptor (R) 1-AR 2-AR 1-AR 2-AR

(+) R(-) G

EC50 6,71e-009 5,09e-007 2,08e-007 8,53e-008

pEC50 sem -8,17 0,13 -6,29 0,08 -6,68 0,10 -7,07 0,11

Emax sem 6,031 0,24 13,70 0,54 13,39 0,56 22,25 1,02

(+) R (+) low

Gs

EC50 2,98e-008 1,45e-006 5,11e-007 2,57e-007

pEC50 sem -7,52 0,23 -5,84 0,07 -6,29 0,11 -6,59 0,13

Emax sem 9,81 0,76 13,15 0,56 21,58 1,20 23,18 1,34

(+) R (+) high

Gs

EC50 1,85e-008 1,12e-006 7,85e-007 2,02e-007

pEC50 sem -7,73 0,18 -5,95 0,07 -6,10 0,11 -6,69 0,09

Emax sem 9,63 0,56 12,53 0,5 23,17 1,31 22,79 0,90

Supplementary Table 1

Onfroy et al.

Supplementary Table 1. Potencies (EC50) and maximal efficacies (Emax) of Norepinephrine (NE)

and Epinephrine (E) on cAMP production in HEK293T cells. Results were obtained fromexperiments shown in Supplementary Fig. 4 and represent the mean of EC50, pEC50 +/- s.e.m. and

Emax +/- s.e.m.



Gs Low High Stat L vs H

EC50 pEC50 s.e.m Emax s.e.m EC50 pEC50 s.e.m Emax s.e.m EC50 Emax

ISO 3,61e-008 -7,44 0,86 -0,009 0,001 3,02e-008 -7,52 0,38 -0,009 0,001 ns ns

NE 1,13e-008 -7,94 0,61 -0,011 0,001 1,25e-008 -7,90 0,28 -0,008 0,001 ns 0,033*

E 3,10e-006 -5,50 0,53 -0,014 0,005 4,65e-008 -7,33 0,26 -0,012 0,001 0,0098** 0,7294

G i1 Low High Stat L vs H


ISO 1,01e-007 -6,99 0,67 -0,044 0,007 n.a. n.a. n.a. ns ns

NE 6,09e-008 -7,21 0,57 -0,024 0,005 5,27e-008 -7,27 0,328 -0,039 0,004 ns 0,0505

E 5,84e-008 -7,23 0,77 -0,030 0,008 n.a. n.a. n.a. ns ns

GoA Low High Stat L vs H


ISO 6,17e-008 -7,21 0,15 -0,058 0,004 1,26e-007 -6,9 0,13 -0,060 0,003 ns ns

NE 2,93e-007 -6,53 0,14 -0,074 0,005 2,49e-007 -6,60 0,11 -0,081 0,004 ns ns

E 2,55e-006 -5,59 0,17 -0,079 0,01 1,28e-006 -5,89 0,13 -0,072 0,006 ns ns


Supplementary Table 2. Potencies (EC50) and maximal efficacies (Emax) of -AR ligands on 1-

AR-mediated Gs32, G i132 and GoA32 activation in HEK293T cells using BRET. Resultswere obtained from experiments shown in Fig. 1 and represent the mean of EC50, pEC50 +/- s.e.m. and

Emax +/- s.e.m. The statistical significance between low and high EC50 and Emax was assessed using

unpaired Student‘s t-test (*P<0.05, **P<0.01, ns : not significant).

Onfroy et al.



Gs Low High Stat L vs H


ISO 2,12e-008 -7,67 0,48 -0,017 0,002 7,64e-010 -9,11 0,3295 -0,023 0,001 0,0485* ns

NE 8,03e-007 -6,09 0,51 -0,018 0,004 8,29e-008 -7,08 0,3462 -0,022 0,002 ns ns

E 1,67e-009 -8,77 0,41 -0,017 0,002 8,96e-009 -8,05 0,2458 -0,019 0,001 ns ns

G i1 Low High Stat L vs H


ISO 1,61e-008 -7,79 0,55 -0,057 0,006 4,95e-008 -7,30 0,27 -0,044 0,0046 ns ns

NE 1,92e-007 -6,71 0,27 -0,073 0,008 6,49e-008 -7,19 0,37 -0,064 0,0076 ns ns

E 1,33e-007 -6,87 0,42 -0,097 0,01 5,83e-008 -7,23 0,29 -0,063 0,0063 ns 0,0394*

GoA Low High Stat L vs H


ISO 3,48e-007 -6,46 0,29 -0,041 0,0041 1,22e-007 -6,91 0,25 -0,026 0,0025 ns 0,0152*

NE 2,78e-007 -6,55 0,29 -0,044 0,0049 5,34e-008 -7,27 0,34 -0,028 0,0033 ns 0,0298*

E 2,03e-007 -6,69 0,21 -0,044 0,0036 5,07e-008 -7,29 0,32 -0,030 0,0034 ns 0,0387*


Supplementary Table 3. Potencies (EC50) and maximal efficacies (Emax) of -AR ligands on 2-

AR-mediated Gs32, G i132 and GoA32 activation in HEK293T cells using BRET. Resultswere obtained from experiments shown in Fig. 1 and represent the mean of EC50, pEC50 +/- s.e.m. and

Emax +/- s.e.m. The statistical significance between low and high EC50 and Emax was assessed using

unpaired Student’s t-test (*P<0.05, ns : not significant).

Onfroy et al.



CHAPITRE 3

CONCLUSION GENERALE





CONCLUSION GENERALE

Dans ce travail de thèse nous avons utilisé des biosenseurs basés sur le principe du transfert d’énergie bioluminescente par résonance (BRET) pour mesurer des interactions protéiques. Le principe du BRET constitue un outil puissant pour mesurer sensiblement, spécifiquement, en temps réel et dans des cellules vivantes, des interactions inter-protéiques mais également intra-protéiques. De ce fait, la création de biosenseurs BRET représente une excellente stratégie pour étudier la signalisation cellulaire dont les mécanismes reposent essentiellement sur des phénomènes d’association-dissociation physique ou sur des modifications conformationnelles de protéines. Des biosenseurs basés sur le principe du BRET sont développés et utilisés depuis une dizaine d’années et ont permis de réaliser de grandes avancées dans la classification pharmacologique des ligands de RCPG et dans la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à l’activation et à la régulation d’un grand nombre de protéines et d’évènements cellulaires.

Nous nous sommes d’abord consacrés au développement de nouveaux biosenseurs

BRET mesurant l'activité de la PI3K, depuis leur construction jusqu’à leur validation dans un modèle cellulaire hétérologue. Les biosenseurs que nous avons construits ne nous ont pas permis de mesurer l’activité des protéines que nous avions ciblées. Néanmoins, ces biosenseurs nous ont permis d'avancer dans la compréhension du mécanisme d'activation de

la PI3K et de proposer l’existence, à l’état basal, de pré-associations de cette protéine avec d'autres protéines de la signalisation intracellulaire, notamment les protéines G hétérotrimériques et la protéine Ras. Ces interactions constitutives n’avaient jusqu’à présent jamais été décrites et pourraient jouer un rôle majeur dans la régulation spatio-temporelle fine

de l’activité et de la signalisation associée à ces PI3K ubiquitaires.

En parallèle, nous nous sommes également intéressés à l’utilisation de biosenseurs BRET déjà existants au laboratoire, mesurant l’activité des protéines G hétérotrimériques. Plus particulièrement, nous nous sommes intéressés à l’impact de la stœchiométrie de ces protéines, et donc du niveau d'expression de ces biosenseurs, sur l'efficacité de ligands de RCPG à les activer. Grâce à une calibration précise de l’expression des biosenseurs BRET, nous avons montré que la stœchiométrie des protéines G impacte énormément sur les propriétés pharmacologiques des ligands. Ce résultat pourrait avoir des conséquences importantes en physiopathologie puisque un grand nombre de pathologies sont associées à une dérégulation de l'expression des protéines G hétérotrimériques. Nos travaux montrent plus largement que les résultats d’un essai mesurant la signalisation intracellulaire et réalisé in vitro sont dépendants du contexte cellulaire dans lequel il est réalisé. Cette notion est notamment importante d’un point de vue thérapeutique dans un contexte où l’efficacité des molécules, et le choix de celles dont le développement sera poussé plus avant, est d’abord déterminée in vitro dans des cellules en culture.





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ABSTRACT

Development of BRET biosensors predictive of the anti-cancer drugs cardiotoxicity

Cardiotoxicity is a recognized long-term consequence of a lot of anticancer drugs, but its mechanisms are not well-known. To date, the cardiotoxic potential of anticancer drugs is difficult to predict during preclinical studies due to the lack of appropriate tools. In this context, the aim of this thesis project was to develop biosensors, based on the use of bioluminescent resonance energy transfer (BRET) principle, to measure class IB phosphoinositide-3-kinases (PI3K) activity. Indeed, these ubiquitous kinases are major pharmacological oncotargets due to their participation in cancer development, but they also have a preponderant role in cardiac homeostasis. Thus, they could represent cardiac targets for anticancer drugs participating in the development of cardiotoxicity.

PI3K-IB are heterodimers of a catalytic subunit (C) p110 and a regulatory subunit (R)

p87 or p101. To develop the PI3K sensor, BRET energy donor (Rluc8) and acceptor (GFP2) were fused at the N-terminal or C-terminal of each subunit (intermolecular sensor). After expression control of each probe in HEK293T cells, the interactions between C and R subunits for all BRET pairs (8 combinations) were studied, in living cells in real time, to find one able to

sense PI3K activation. Our results indicated specific basal interaction between C and R

subunits from p110/p87 and p110/p101 pairs. However, none of the stimulation conditions tested (receptor nature, ligand concentration, stimulation kinetics and biosensor

stoichiometry) allowed the detection of BRET signal modulation. Further addition of p110 co-activators such as Ras proteins or heterotrimeric G proteins, did not improve BRET

modulation. We then tried to create an indirect BRET sensor of PI3K activity by measuring the

interaction between PI3K and G proteins subunits, known to occur during PI3K activation.

Surprisingly, results highlighted a basal pre-association of PI3K and G protein subunits

without BRET modulations upon PI3K stimulation.

In conclusion, we failed to create a BRET biosensor of the PI3K activity based on the measure of the interaction between the catalytic and regulatory subunits. However, the pre-

association of PI3K subunits without BRET modulation could reflect a mechanism of PI3K activation based on conformationals changes of the complex between C and R subunits rather than physical association-dissociation. In the future, intramolecular labeling of the C or R subunit with the two BRET probes could better detect conformational changes and therefore

PI3K activity. From a fundamental standpoint, the existence of PI3K/G proteins pre-complexes could reflect a specific spatio-temporal fine-tuning of the PI3K activity, in agreement with recent concept of preformed cell signaling platforms.

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THÈSE - Paul Sabatierthesesups.ups-tlse.fr/3229/1/2016TOU30071.pdf · combinaisons au total) C et R ont été mesurées, en temps réel dans les cellules vivantes, à la recherche