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TP master 1 Transfection

TP master 1 Transfection. La transfection des cellules eucaryotes Définition et Principe Transfert de gènes (ADNc) codant pour une protéine dans une cellule

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TP master 1Transfection

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La transfection des cellules eucaryotes

Définition et Principe

Transfert de gènes (ADNc) codant pour une protéine dans une cellule

= protéine exogèneTransfection Infection (méthode virale)

Surexpression de cette protéine grâce à la machinerie cellulaire (transcription/traduction)

ribosomes

ARN

protéineexogène

ADN

(2) Etude in situ

(1) Etude à partir de lysat protéique

(activité enzymatique)

Une cellule eucaryote

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Techniques

Réactifs chimiques- Calcium phosphate

- DEAE-dextran

- Liposomes artificiels

Méthodes physiques- Microinjection directe (dans la cellule ou le noyau) :

animaux transgéniques

- Electroporation (perturbation de la membrane par un choc électrique)

- Propulsion de microprojectiles contenant de l’ADN (in vivo) :

plantes

Utilisation de particules virales- Rétrovirus

- Adénovirus

- Particules virales non infectieuses

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Réactifs chimiques

DEAE-dextran

1965 par Vaheri et Pagano

Technique classique, in vitro

DEAE-dextran = polymère cationique

Association avec les acides nucléiques chargés négativement

Endocytose cytoplasme noyau

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Réactifs chimiques

Calcium phosphate

1973 par Graham et van der Eb

Technique classique et bon marché, in vitro

Mise en contact de l’ADN avec du chlorure de calcium dans un tampon phosphate

Formation d’un précipité entre le calcium et l’ADN

Précipité dans la cellule par endocytose ou phagocytose

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Réactifs chimiques

Liposomes artificiels

1980 par Fraley et co.

Efficacité de transfection , fragments d’ADN , types cellulaires , in vitro et in vivo

Liposomes = lipides cationiques (+ lipides neutres)

Réaction avec les acides nucléiques chargés négativement

Compaction de l’ADN = complexe liposomes-ADN

Endocytose cytoplasme noyau

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Applications (in vitro)

1. Surexpression de protéines absentes dans un type cellulaire donné :

2. Modifier un gène existant / inhiber l’expression d’un gène existant

Promoteur du vecteur ADNc codant pour la protéine1.1. - sa fonction

- sa localisation in situ

- son interaction avec d’autres protéines de la cellule ou une autre

protéine transfectée (co-transfection avec 2 plasmides)

1.2. - Etude de l’activité d’un promoteur et sa régulation in situ

1.3. - Elaborer une lignée cellulaire immortelle

protéine exogène = Antigène T du virus SV40

- …

Promoteur à étudier Gène rapporteur

Promoteur du vecteur ADNc codant pour l’Ag T

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Surexpression de protéines : Mise en évidence

• Transfection d’un ADNc codant pour une protéine non modifiée

- Détection par immunocytochimie ou par Western blot

• Transfection d’une construction possédant l’ADNc d’intérêt et une étiquette (« tag »)

= Protéine de fusion

- GFP (Green Fluorescent Protein)- HA, flag, c-myc … (anticorps)

ADNc tag

protéinede fusion

ribosomes

ARN

protéineexogène

ADN

Etude in situ

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Etude de l’activité d’un promoteur : Mise en évidence

promoteur gène rapporteur galactosidase 

• Effet de facteurs endogènes (facteurs de transcription)

• Effet de facteurs exogènes sur l’activité du promoteur

- facteurs de croissance ajoutés dans le milieu de culture

- transfection avec une 2ème construction codant pour une protéine pouvant réguler le promoteur étudié = co-transfection

-galactosidase (spectrophotomètre) Luciférase (luminescence)

ribosomes

ARN

protéineexogène

ADN

in situ galactosidase

lysat protéique

activité enzymatique galactosidase

Mesure quantitative

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Préparation de l’ADN à transfecter

• Réalisation de constructions plasmidiques : vecteur + ADNc/promoteur-gène rapporteur

• ETUDE catégorie de vecteurs à utiliser

Vecteur commum d’expression

Plasmide GFPtag Plasmide activité promotrice

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Vecteur commum d’expression

Promega

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Plasmide GFPtag ou étiquette GFP

Promega

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Plasmide permettant d’étudier l’activité d’un site spécifique d’un promoteur

Clontech

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Transfection transitoire

- Analyse de la transfection à 24-72 h

-Perte du plasmide en quelques jours

Transfection stable

-Transfection à long terme

- L’ADN est généralement intégré au niveau chromosomique

- Isolation des clones cellulaires par dilutions limites (clonage cellulaire)

-Criblage par résistance à un antibiotique des clones possédant l’ADN transfecté (néomycine, hygromycine, …)

- 3-4 semaines

Deux approches

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Travaux pratiques de Master BCPP

BUT : Transfecter des cellules COS avec des constructions plasmidiques contenant différents ADNc

Technique des liposomes

Plasmide 1 Plasmide 2 Plasmide 3

Protéine X-GFP Protéine Z-HA galactosidase

Fluorescence directe ImmunocytofluorescenceRéaction enzymatique

colorimétrique

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Plasmide 1

Protéine X-GFP

Fluorescence directe (vert)

ADN

*X-GFP

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ADN

Z-HA

Plasmide 2

Protéine Z-HA

Immunocytofluorescence

Immunocytofluorescence

(1) Anticorps de souris anti-protéine HA (anticorps primaire)

(1)(2)

*

(2) Anticorps de chèvre anti-IgG de souris

conjugué à la rhodamine (TRITC)

(anticorps secondaire)

*

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Plasmide 3

Galactosidase

Réaction enzymatiquecolorimétrique

(cellules bleues)

Avantages

(1) Mise en évidence facile et rapide

(2) Mesure quantitative (in situ) :

nombre de cellules bleues / population totale

(3) Mesure qualitative (dosage colorimétrique : Luciférase)

Rôle de ce type de construction

(1) Vérifier que le type cellulaire utilisé peut être transfecté

(2) Mesurer une efficacité de transfectionSubstrat de l’enzyme = X-gal

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Plasmide 1 + 2

Protéine Z - HA+

Protéine X - GFP

Localisation de 2 protéinesau niveau d’une même cellule

Besoin de 2 fluorochomes

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• Noyaux (PI: iodure de propidium, DAPI, YOYO, …)

• Filaments d’actine, cytosquelette (rhodamine-phalloïdine)

• Marqueurs spécifiques du réticulum endoplasmique

• Marqueurs membranaires

Mise en évidence de la présence d’une cellule

Marqueurs généraux

=

La cellule en entière ou des structures particulières