Travaux dirigés Immunologie BIOL 360 :

Anticorps monoclonaux

Université Paris-Sud 11

Ophélie JOLY

Marie GUILBAUD

Guillaume LEGRAND

Clément GAND

Année 2013/2014L3S6 parcours Biologie Santé

PLAN

Introduction

Etape d’immunisation

Coopérations cellulaires mises en place après immunisation

Etape de fusion ou obtention des hybridomes

Etape de sélection

Etapes de criblage et de clonage des hybridomes

Comparaison anticorps monoclonaux et polyclonaux

Techniques développées à partir des anticorps

Anticorps = Protéine utilisée par le système immunitaire en réaction à l’introduction d’un pathogène dans l’organisme. Sont sécrétés par des cellules dérivées des lymphocytes B :

les plasmocytes.

Intr

oduc

tion Les anticorps

Ag

Paratope

Epitope

Epitope (déterminant antigénique) = Molécule pouvant être reconnue par un paratope, partie variable d'un anticorps

Paratope = Partie de l'anticorps qui assure la fonction de reconnaissance de l'antigène.

Anticorps avant immunisation Animal non immunisé

IgM IgG IgA

L’i

mm

unis

atio

n

produits lors de contacts avec d’autres Ag que la protéine purifiée

Tit

re A

c

Jours Semaines Mois

Question 1

Anticorps après immunisation

Animal immunisé par injection d’une protéine purifiée Après 1ère injection (réaction primaire) L

’im

mun

isat

ion

Sélection LB Prolifération LB Deviennent effecteurs ou LB mémoires

IgG

IgM

Présence d’IgM puis d’IgG

Production d’Ac anti-protéine

Question 1

Anticorps après immunisation Animal immunisé par injection d’une protéine purifiée

Après 2nde injection (réaction secondaire)

LB mémoire activé plus rapidement

Réponse + importante,

+ rapide,

+ spécifique

Après nème injection

L’i

mm

unis

atio

n

IgG

IgG

IgM

IgM

Production d’Ac anti-protéine: + grande quantité, de meilleure qualité

Question 1

Haptène et anticorps monoclonaux

Haptène = Antigène non immunogène, trop petite pour générer une réponse immunitaire seule

Exemple d’haptène :

DiNitroPhénol = DNP

Induction d’une réponse immunitaire par conjugaison

avec une molécule transporteuse (BSA, OVA, ..) :

Doit être soluble

Doit être un corps étranger à l’animal

Doit avoir un temps de ½ vie suffisamment long

L’i

mm

unis

atio

nQuestion 2

Réponse anticorps anti-DNP

Production d’anticorps anti-DNP

Question 5

Coo

péra

tions

ce

llula

ires

Association haptène-protéine porteuse rend immunogène le DNP

Anticorps monoclonaux

Immunisation de l’animal avec l’Ag contre lequel on veut un Ac monoclonal

Pour la production d’Ac spécifique de l’Ag utilisé

Réponse immunitaire adaptative

Production Ac en plus grande quantité

Production Ac de meilleure qualité et plus affin

L’i

mm

unis

atio

nQuestion 3

Système immunitaire et administration de l’antigène

Lieu d’administration de l’Ag important Quand administration dans la voie systémique (SC, ID, IM ..)

L’i

mm

unis

atio

n

Circulation vers les Organes Lymphoides Secondaires Contact rapide avec les cellules du Système Immunitaire

Question 4

Cellules B et réponse anticorps anti-DNP

Plasmocyte = LB différencié capable de produire des anticorps.

Myélome = Cancer hématologique (se développe à partir de cellules hématopoïétiques) de la moelle osseuse caractérisée par une prolifération des lymphocytes B.

O

bten

tion

des

hybr

idom

esQuestion 6

Fusion et cellules spléniques

Cellules spléniques = Cellules de la rate

O

bten

tion

des

hybr

idom

es

Cellules myélomateuses = Cellules cancéreuses

Questions 7/8

Capacité de production des Ac spécifiques de l’Ag utilisé pour immuniser le donneur

Croissance illimitée

Technique des hybridomes

Obtention d’hybridomes : Clones immortels synthétisant l’Ac monoclonal recherché

O

bten

tion

des

hybr

idom

es

Clonage de l’hybridome sélectionné

Immunisation contre l’Ag

Fusion cellules spléniques/myélomateuses

Sélection sur milieu spécifique

Sélection des hybridomes fabriquant l’Ac anti-Ag

Question 6

HGPRT : Hypoxanthine-Guanine PhosphoRibosylTransférase Enzyme permettant synthèse de nucléotides par voie de récupération

Cellules spléniques : HGPRT+ Cellules myélomateuses : HGPRT-

HAT : Hypoxantine Aminopterine Thymidine Aminoptérine : Inhibe synthèse de novo de nucléotides

Sélection des hybridomes

Sél

ectio

n

Milieu de sélection d’hybridomes : HAT

Question 11

Fusion et tissus lymphoïdes

Tissu lymphoïde pouvant être utilisé pour la fusion :

Les ganglions lymphatiques Les MALT (Tissus Lymphoides Associés aux Muqueuses)

O

bten

tion

des

hybr

idom

es

Dans organes lymphoïdes secondaires :

Présence de LB

Lieu de rencontre LB/Ag

Lieu d’activation des LB

Lieu de production Ac anti-Ag

Question 8

Hyperimmunisation

Hyperimmunisation = Injection de doses croissantes d’Ag

But : Obtention d’une concentration importante de plasmocytes et donc d’Ac spécifique de l’Ag d’intérêt

O

bten

tion

des

hybr

idom

es

Tau

x d’

Ac

(UI/

mL

)

Evolution de la quantité d’Ac selon le nombre d’injections

Question 10

Caractéristiques des myélomes

Cellules myélomateuses utilisées:

Immortelles

Incapables de secréter Ac

HGPRT- : Incapables de synthétiser nucléotides par voie de récupération

Sél

ectio

nQuestion 12

Sélection des hybridomes/anticorps anti-DNP

But : Sélectionner les hybridomes produisant des Ac anti-DNP

C

ribl

age

et

cl

onag

e

Dosages de liaison Ac/Ag RIA/ELISA

Marquage fluorescent de l’Ac Immunofluorescence (Immunohistochimie/Immunocytochimie) Cytométrie de flux

Essai de cytotoxicité : Evaluation de la viabilité des Ag après mise en contact avec les lymphocytes.

Question 13

Clonage de l’hybridome

Clonage par dilution limite Principe

C

ribl

age

et

clo

nage

But : Sélection d’un clone produisant un seul type d’anticorps

Dilution du mélange d’hybridomes (1 cellule/puit)

1ère série de dilution : Sélection des cellules sécrétant l’Ac en quantité

2ème série : Vérification de la pureté de la lignée cellulaire

3ème série : 2ème Vérification du clonage

Obtention d’un sérum monoclonal

Question 14

Sérum polyclonal

Sérum = Liquide provenant du sang coagulé et centrifugé,

contient des Ac polyclonaux

Antisérum = Sérum prélevé chez un individu/animal immunisé.

Contient des Ac polyclonaux spécifiques de l’Ag administré

A

c m

onoc

lona

ux

Ac

Pol

yclo

naux

Question 15

Avantages des anticorps polyclonaux/monoclonaux

Anticorps monoclonal

Spécificité : Ac dirigé vers un seul épitope de l’Ag Affinité : Ac très affin Production en grande quantité Constance de ces Ac Production longue et couteuse

Anticorps polyclonal

Diversité : Reconnaissance d’un Ag sur différents épitopes Différents Ac peuvent fixer un même Ag Fixation moins « critique »

A

c m

onoc

lona

ux

Ac

Pol

yclo

naux

Anticorps monoclonaux, liaison à un épitope spécifique

Anticorps polyclonaux, liaison à des épitopes différents

Question 16

Techniques utilisant des anticorps

En diagnostic : Tec

hniq

ues

En thérapeutique :

Question 17

Immunoblot Immunofluorescence Agglutination et hémagglutination Réaction de fixation du complément Immunochromatographie Immunoprécipitation

Cytométrie de flux Radio-Immuno-Assays (RIA) Enzym Linked Immuno Sorbent Assay

(ELISA)

Immunothérapie

Diagnostic Immunoblot (Cas du VIH)

Tec

hniq

ues

Question 17

Dissociation par un détergent du pathogène

Séparation des protéines constitutives du pathogène par SDS PAGE

Transfert sur membrane de nitrocellulose et incubation avec un antiserum (contenant Ac polyclonaux anti-VIH)

Détection des Ac fixés aux Ag par un Ac secondaire couplé à une enzyme

Mise en évidence des anticorps dirigés contre le pathogène dans le sérum des patients infectés

Diagnostic Immunofluorescence

Tec

hniq

ues

Question 17

1er marquage : Fixation de l’Ac monoclonal primaire sur l’Ag

2ème marquage : Fixation de l’Ac polyclonal secondaire sur l’Ac primaire.L’Ac secondaire est couplé à un fluorochrome

Détection du complexe Ac/Ag au microscope électronique à fluorescence

Recherche d’un pathogène

Hemagglutination (Détermination du groupe sanguin)

Tec

hniq

ues

Question 17

Diagnostic

Prélèvement sanguin d’un patient

Mise en contact Ac/GR

Agglutination : Ac reconnait la structure antigénique portée par le GR.

Pas agglutination : Ac ne reconnait pas la structure antigenique portée par le GR.

Réaction de fixation du complément

Question 17

Diagnostic

Tec

hniq

ues

Ajout dans le sérum de l’Ag et du complément

Si présence de l’Ac anti-Ag dans le sérum, fixation Ac/Ag/Complément

Ajout de GR et d’Ac anti-GR

Si le complément est fixé avec le complexe Ac/Ag, ne peut se fixer au complexe GR/Ac anti-GR : Absence d’hémolyse

Si le complément n’est pas fixé au complexe Ac/Ag (car absence d’Ac), se fixe au complexe GR/Ac anti-GR : Hémolyse

Test négatif

Test positif

Immunochromatographie (Cas du test de grossesse)Tec

hniq

ues

Question 17

Diagnostic

En cas de grossesse, il y a production d’hCG retrouvé dans le sang et l’urineFixation de l’hormone sur l’Ac anti-hCGMigration du complexe Ac/Ag jusqu’à reconnaissance de l’Ag par un 2ème Ac spécifique : Arrêt de la migration dans la zone test

Utilisations possibles pour la détection : VIH, Paludisme, Peste, Cholera, ..

Immunoprécipitation

Tec

hniq

ues

Marquage métabolique

Marquage protéines

Marquage des cellules Lyse Ajout d’Ac fixées Lavage Séparation sur des billes SDS-PAGE

Question 17

Diagnostic

Marquage des cellules par un acide aminé radioactif

Lyse des cellules par un détergent : Obtention Ag + Débris cellulaires

Ajout d’Ac monoclonaux fixées sur des billes

Lavage : Elimination des Ag non fixées pas un Ac et des débris cellulaires

Séparation des Ag par SDS PAGE : Migration des Ag selon la taille

Technique du phage display

Diagnostic

Tec

hniq

ues

Question 17

Immunothérapie But : Cibler spécifiquement les cellules tumorales en adressant un Ac

monoclonal modifié.

Thérapeutique

Tec

hniq

ues

Question 17

à un enzyme capable d’activer des prodrogues (3)

Utilisation d’Ac monoclonaux modifiés couplés:

à une toxine bactérienne ou végétale (1)

à un isotope radioactif (2)

Ac = Vecteur d’acheminement des substances vers les cellules tumorales

Différentes actions possibles : - Bloque signal de survie - Bloque signal de prolifération - Induit l’apoptose

(3)

(1) (2)

Les perspectives de demain …

Aujourd’hui : 28 anticorps monoclonaux à la disposition des patients

(le 1er a été mis sur le marché en 1986)

250 anticorps monoclonaux en développement

Quel avenir pour l’immunothérapie ?

Anticorps monoclonaux : vers traitement pour toutes les pathologies ?

IgA : un anticorps plus efficace et plus localisé que IgG ?

Per

spec

tives

Merci de votre attention !!