Faculté des Sciences

Section de chimie et biochimie Département de chimie physique

Travaux Pratiques de chimie physique I

Par

Groupe I

M. Laverrière Romain M. Tissot Jean-Marie M. Dierickx Stéphane

Genève 2011

Cinétique

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Table des matières

Table des matières ..................................................................................................... i  1.   But de lʼexpérience .............................................................................................. 1  2.   Partie Théorique .................................................................................................. 1  3.   Partie pratique ..................................................................................................... 2  4.   Résultats ............................................................................................................. 3  5.   Calcul dʼerreur ..................................................................................................... 5  6.   Discussion conclusion ......................................................................................... 6  7.   Bibliographie ....................................................................................................... 6  8.   Exercices ............................................................................................................. 6  

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1. But de lʼexpérience

Le but de ce TP est de déterminer les propriétés cinétiques dʼune réaction. Notamment, la vitesse de réaction en fonction de la concentraion du substrats. Enfin, en suivant la définition de Michaelis-Mentten la vitesse maximale de la réaction sera évaluée.

2. Partie Théorique

Une réaction enzymatique se déroule en deux étapes :

! + !    !!(!!!)     !"    

!!    ! + ! Lors de la première, la formation du complexe enzyme-substrat à lieu. Puis sʼeffectue alors la formation du produit par libération de lʼenzyme. On admet la vitesse initiale de réaction comme étant constante :

!! = !![!"] Néanmoins, la concentration du complexe, [ES], étant inconnue, on doit lʼexprimer en fonction des concentrations de lʼenzyme et du substrat. En admettant la vitesse de formation et de consommation du complexe comme étant égales (« steady state »), on obtient : Formation du complexe : !!"! = !! ! [!] Consommation du complexe : !!"#$ = !! !" + !′![!"] Steady state (!!"# = !!"#$) : !! ! ! = !! !" + !′![!"] Ainsi : !" = !! ! !

!!!!!!

Lʼenzyme étant présente non seulement en solution mais aussi complexé, on exprime sa concentration totale comme suit :

[!]!"!#$ = ! + !" ⟹ ! = [!]!"!#$ − [!"] On obtient donc :

!" =!! ! !"!#$ − !" [!]

!′! + !!= [!]!"!#$

[!]!! + [!]

avec kM = Cste de Michaelis-Menten = !!!!!!

!!

- 2 -

Lʼéquation de la vitesse initiale de réaction devient alors :

!! = !! ∙ [!]!"!#$[!]

!! + [!]

La vitesse maximale est atteinte lorsque la concentration en substrat [S] est bien plus importante que la valeur de km, ce qui permet dʼapproximer lʼéquation comme suit :

!! = !!"# = !! ∙ [!]!"!#$[!][!] = !! ∙ [!]!"!#$

On obtient donc lʼéquation de Michaelis-Menten :

!! = !!"#[!]

!! + [!]

On peut aussi voir que la vitesse de réaction est linéairement dépendante à la concentration du substrat [S] en inversant lʼéquation comme suit :

1!!=

!!!!"#

∙1! +

1!!"#

3. Partie pratique La solution mère de BAPNA 0.060M, de lʼenzyme, du DMSO et du tampon (pH=8) ont été préparé ulterieument. Une série de 8 solutions ont été préparées à partir de la solution de 0.060M de BNPA, de la manière suivante :

Solution Concentration [M] VBAPNA [ml] VDMSO [ml]

A 0.003 0.25 4.75 B 0.006 0.50 4.50 C 0.009 0.75 4.25 D 0.012 1.00 4.00 E 0.015 1.25 3.75 F 0.021 1.75 3.25 G 0.042 3.50 1.50 H 0.060 5.00 0.00

Avant de mesurer lʼabsorbance (400nm), le spectromètre a dʼabord été calibré. Ensuite, lʼabsorbance a été mesurée par ordre croissant de concentration, en fonction du temps (5minutes). En remplissant, une cuvette avec 2.5 mL de la solution dʼenzyme et 0.5mL de la solution de BAPNA mélangé et introduite rapidement dans le spectromètre.

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4. Résultats

Solution   c.  BAPMA  [M]   V  enzyme    [ml]   V  DMSO  [ml]   [c]  (c.  de  BAPNA  dans  la  cuvette)  [M]  

A   0.003   0.25   4.75   0.0005  B   0.006   0.5   4.5   0.001  C   0.009   0.75   4.25   0.0015  D   0.012   1   4   0.002  E   0.015   1.25   3.75   0.0025  F   0.021   1.25   3.25   0.0035  G   0.042   3.5   1.5   0.007  H   0.06   5   0   0.01  

Solution   Pente  [Abs/min]   [c]-­‐1  [M-­‐1]   V0  [M/min]   V0

-­‐1  [min/M]  

A   0.047618   2000   4.76E-­‐06   2.10E+05  B   0.079183   1000   7.92E-­‐06   1.26E+05  C   0.10429   667   1.04E-­‐05   9.59E+04  D   0.12922   500   1.29E-­‐05   7.74E+04  E   0.14677   400   1.47E-­‐05   6.81E+04  F   0.18648   286   1.86E-­‐05   5.36E+04  G   0.31191   143   3.12E-­‐05   3.21E+04  H   0.41786   100   4.18E-­‐05   2.39E+04  

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Vmax:   4.01644E-­‐05  Km:   0.003848  

y  =  95.803x  +  24898  R²  =  0.98716  

0.0E+00  

5.0E+04  

1.0E+05  

1.5E+05  

2.0E+05  

2.5E+05  

0   500   1000   1500   2000   2500  

V 0-­‐1  [m

in/M

]  

 [c]-­‐1  [M-­‐1]  

v0-­‐1  ([c]-­‐1)  

0.0E+00  5.0E-­‐06  1.0E-­‐05  1.5E-­‐05  2.0E-­‐05  2.5E-­‐05  3.0E-­‐05  3.5E-­‐05  4.0E-­‐05  4.5E-­‐05  

0   0.002   0.004   0.006   0.008   0.01   0.012  

V 0  [M

/min]  

[c]  [M]  

Cinétique  de  Michaelis-­‐Menten  

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5. Calcul dʼerreur

Calculs dʼerreur :

Matériel Volume [mL] Erreur [mL]

Seringue 0.5 0.005 Pipette 1 0.01 Pipette 2 0.02 Pipette 5 0.1 Ballon 5 0.08

Concentrations des solutions :

!!!! = !!"#!!"#

!!"# =!!!!!!"#

ln !!"# = ln

!!!!!!"#

= ln !! + ln !! − ln !!"#

!!!"#!!"#

=!!!!!

+!!!!!

−!!!"#!!"#

!!"# = !! + !!"#$

∆!!"#!!"#

=∆!!!!

+∆!!!!

+∆!! + ∆!!"#$!! + !!"#$

Concentrations des solutions dans les cuvettes :

∆!!"#!!"#

=∆!!"#!!"#

+∆!!"#!!"#

+∆!!"# + ∆!!"#$%é!!"# + !!"#$%é

Erreurs :

Solutions ∆!!"# [mol/L] ∆!!"# [mol/L] A 2∙10-4 4∙10-5 B 2∙10-4 7∙10-5 C 3∙10-4 9∙10-4 D 3∙10-4 1∙10-4 E 5∙10-4 2∙10-4 F 7∙10-4 2∙10-4 G 1∙10-3 4∙10-4 H 1∙10-3 5∙10-4

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6. Discussion conclusion Nos résultats ont des erreurs négligeables, la seule erreur notable provient du temps mis pour placer la solution dans le spectromètre. Effectivement, la réaction enzymatique est très rapide, donc chaque seconde compte dans la mise en place de la cuve. La vitesse initiale augmente en fonction de la concentration de substrat présente dans les cuves. Ce qui est tout à fait logique car plus il y a de molécule de substrat plus les collisions sont fréquente, plus les liaisons peptidiques sont hydrolisées. Des quʼon atteint la vitesse maximale, la concentration de substrat nʼinflue plus sur la réaction.

7. Bibliographie

[1] Hans Hagemann, Protocole des travaux pratiques de chimie physique I

[2] David R. Lide, Handbook of Chemistry and Physics, (2007-2008) 8. Exercices

1. « Une substance A a une constante de décomposition égale à 2.80 x 10-3 M/s à 30 °C et égale à 1.38 x 10-2 M/s à 50 °C. Déterminer les paramètres dʼArrhenius de cette réaction. »

!! =!"# !!

!!! −

!!!

=!"# !.!

!".!!

!"!.!"−!

!"!.!"

= 64960  !/!"#

2. « Déterminez la condition pour laquelle une vitesse de réaction pour une enzymolyse suivant la cinétique Michaelis-Menten est à la moitié de sa valeur maximale. »

On a donc :

!!"#2 = !!"#

[!]!! + [!]

     ⟹      12 =

!!! + !      ⟹       ! = !!