Étude de la fonctionnalité et des propriétés des

© Daphné Govare-Monroe, 2020

Étude de la fonctionnalité et des propriétés des transporteurs d'influx Lsi1 du silicium chez les

plantes

Mémoire

Daphné Govare-Monroe

Maîtrise en biologie végétale - avec mémoire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

i

ii

Résumé

Le silicium (Si) ne figure pas parmi les éléments essentiels des plantes, mais son effet

prophylactique contre divers stress biotiques et abiotiques a été rapporté chez plusieurs

espèces. Il existe toutefois une grande variabilité du taux d’absorption du Si au sein du règne

végétal, qui est corrélée avec la protection que les plantes en retirent. Cette variabilité

s’explique par un transporteur d’influx (Lsi1), une aquaporine de la famille des NIPIII qui

assure la perméabilité du Si au niveau des cellules racinaires. Un filtre sélectif

aromatique/arginine (ar/R) de type G-S-G-R est aujourd’hui reconnu comme étant essentiel

pour la sélectivité du Si, bien que de nouvelles données suggèrent autrement. L’objectif a été

d’étudier la fonctionnalité du transporteur Lsi1 afin de déterminer le premier résidu clé du

filtre sélectif impliqué dans la sélectivité du Si. Différentes substitutions d'acides aminés ont

été étudiées dans le filtre ar/R chez les Lsi1 afin d’évaluer l’impact de ces mutations sur la

perméabilité au Si. L’étude a révélé que le résidu glycine à la première position du filtre

sélectif n’est pas essentiel à la sélectivité du Si. L’acide aminé glycine adjacent, très conservé

au sein des transporteurs de Si, a semblé en revanche plus décisif dans l’accumulation. Ces

résultats apportent une meilleure compréhension de la fonctionnalité du transporteur Lsi1

pour mieux exploiter ses propriétés bénéfiques. L’espèce Brassica napus figure parmi les

faibles accumulateurs de Si en raison de l’absence du gène Lsi1. Le deuxième objectif a été

de mesurer l’effet du Si chez les plants de canola transformés avec le gène Lsi1. Alors que

les plants transformés ont accumulé significativement plus de Si, il ne semble pas que la

différence ait été suffisante pour contrer la maladie causée par Leptosphaeria maculans. Des

études supplémentaires sont nécessaires en vue d’améliorer le taux d’absorption du Si chez

le canola.

iii

Abstract

Silicon (Si) is not considered an essential element for higher plants despite its prophylactic

role against many biotic and abiotic stresses. One of the most puzzling properties of Si is its

differential absorption by plants, which is correlated with the level of protection. This

variability would be explained by the presence or absence of an influx transporter (Lsi1), a

NIPIII aquaporin that allows Si absorption in roots cells. A selectivity filter aromatic/arginine

(ar/R) composed of four amino acids G-S-G-R is known to determine the selectivity for

silicic acid although new data suggest otherwise. The first objective of this project was to

determine the first key residue in the ar/R filter to optimize Si accumulation in plants. For

this purpose, we conducted several substitutions of residues within the filter and evaluated

the impact of each mutation on Si permeability. Our results revealed that the first glycine in

the filter is not required for permeability. On the other hand, the adjacent glycine, highly

conserved in many aquaporins, plays an essential role. These findings bring new insights into

the functionality of Lsi1 transporters that can be applied to better exploit the beneficial

properties of Si in agriculture. Brassica napus is considered as a low Si accumulator due to

the absence of a functional Lsi1. The second objective was to measure the effects of Si

absorption in canola plants transformed with the Lsi1 gene. Even if the transformants were

able to accumulate more Si, it seems that the difference was not enough to give a protection

against Leptosphaeria maculans. Additional studies are needed to improve Si absorption in

canola.

iv

Table des matières Résumé ................................................................................................................................... ii

Abstract ................................................................................................................................ iii

Liste des tableaux ................................................................................................................ vi

Liste des figures .................................................................................................................. vii

Remerciements ................................................................................................................... viii

Introduction .......................................................................................................................... 1

Hypothèses et objectifs ......................................................................................................... 3

Chapitre 1 : Revue de littérature ........................................................................................ 4

Le silicium ............................................................................................................................. 5

Le silicium dans l’environnement et chez les plantes .................................................... 5

Effets bénéfiques du Si chez les plantes .......................................................................... 6

Mécanismes d’action du Silicium .................................................................................... 9

Hypothèse mécanique ................................................................................................... 9

Hypothèse du Si soluble ................................................................................................ 9

Les transporteurs de Si ................................................................................................... 10

Les aquaporines ........................................................................................................... 11

Les transporteurs d’efflux Lsi2 .................................................................................. 15

Expression des transporteurs ..................................................................................... 16

Le canola (Brassica napus) ................................................................................................. 16

Leptosphaeria maculans ...................................................................................................... 17

Chapitre 2 : Étude fonctionnelle des transporteurs d’influx Lsi1 du silicium chez les

plantes .................................................................................................................................. 20

Introduction ........................................................................................................................ 21

Matériels et méthodes ......................................................................................................... 23

Résultats .............................................................................................................................. 29

Activité de transport en influx du Si chez les mutants de OsLsi1 dans les oocytes de

Xenopus ............................................................................................................................ 29

Activité de transport en influx du Si chez les mutants de EaLsi1 dans les oocytes de

Xenopus ............................................................................................................................ 30

Immunofluorescence ....................................................................................................... 31

Test de perméabilité à l’eau ........................................................................................... 33

Discussion ............................................................................................................................ 34

Chapitre 3 : Étude de l’accumulation en silicium et de la résistance à Leptosphaeria

maculans chez Brassica napus génétiquement modifié avec le gène Lsi1 ...................... 38

v

Introduction ........................................................................................................................ 39

Matériels et méthodes ......................................................................................................... 41

Résultats .............................................................................................................................. 44

Caractérisation des plantes transgéniques ................................................................... 44

Accumulation de Si chez le canola transformé avec VaLsi1 ....................................... 45

Accumulation de Si chez le canola transformé avec CaLsi1 ....................................... 46

Sévérité de la maladie causée par Leptosphaeria maculans chez les plants de canola

transformés avec VaLsi1 ou CaLsi1 et fertilisés en Si. ................................................. 47

Discussion ............................................................................................................................ 50

Conclusions générales ........................................................................................................ 55

Bibliographie ....................................................................................................................... 59

vi

Liste des tableaux Tableau 1 Amorces utilisées pour insérer le gène Lsi1 dans le vecteur Pol1 ...................... 24

Tableau 2 Amorces utilisées pour la mutagénèse dirigée ................................................... 25

Tableau 3 Amorces utilisées pour insérer l'épitope Myc dans les gènes Lsi1 ..................... 27

Tableau 4 Amorces utilisées pour détecter le transgène VaNIP2-1 ou CaNIP2-1 chez le

canola transgénique. ............................................................................................................. 42

vii

Liste des figures Figure 1 Activité en influx des transporteurs OsLsi1 et de ses mutants mesurée chez les

oocytes de Xenopus laevis. ................................................................................................... 30

Figure 2 Activité en influx des transporteurs EaLsi1 et de ses mutants mesurée chez les

oocytes de Xenopus laevis .................................................................................................... 31

Figure 3 Localisation des aquaporines et leurs mutants par immunofluorescence. ............ 32

Figure 4 Activité en influx des transporteurs de silicium (Si) contenant un tag Myc chez les

oocytes de Xenopus laevis. ................................................................................................... 33

Figure 5 Test de perméabilité à l’eau chez différentes aquaporines. ................................... 34

Figure 6 Gels illustrant les amplifications par PCR de l’insert VaLsi1 chez les différents

plants de canola issus d’une transformation. ........................................................................ 44

Figure 7 Gels illustrant les amplifications par PCR de l’insert CaLsi1 chez les différents

plants de canola issus d’une transformation. ........................................................................ 45

Figure 8 Contenu en silicium (Si) des feuilles de plants de canola Westar WT et de plants

transformés avec le gène VaLsi1 fertilisés (Si+) ou non (Si-) avec une solution de Si (1,7

mM). ..................................................................................................................................... 46

Figure 9 Contenu en Si dans les feuilles chez les plants de canola Westar WT et les plants

transformés avec le gène CaLsi1 fertilisés (Si+) ou non (Si-) avec une solution de Si (1,7

mM). ..................................................................................................................................... 47

Figure 10 Aire des lésions causées par Leptosphaeria maculans sur les feuilles de plants de

canola Westar WT, de plants transformés avec le gène VaLsi1 ou CaLsi1 fertilisés (Si+) ou

non (Si-) avec une solution de Si (1,7 mM). ........................................................................ 48

Figure 11 Lésions causées par Leptosphaeria maculans chez des plants de canola non

transgéniques (WT), transformés avec le gène Lsi1 de Vigna angularis (VaLsi1) ou avec le

gène Lsi1 de Cicer arietinum (CaLsi1) traités ou non avec le silicium (Si) ........................ 49

Figure 12 Contenu en Si dans les feuilles centrales des plants inoculés avec Leptosphaeria

maculans chez le canola transgénique et non transgénique. ................................................. 50

viii

Remerciements

Ce projet, qui m’a permis d’acquérir une quantité considérable de connaissances et

d’aptitudes, n’aurait jamais été possible sans la confiance et le support offerts par mon

directeur Richard Bélanger. Vous êtes un professeur à l’écoute de vos étudiants, un excellent

conférencier et un chercheur d’une grande rigueur et passionné. Je dois avouer m’être

considérée particulièrement chanceuse de travailler dans votre laboratoire. Toutes les

conditions étaient rassemblées pour se sentir bien et pour progresser dans mes travaux et

apprentissages en toute confiance. Merci de m’avoir encouragée et conseillée tout au long de

mon projet. Votre disponibilité et votre appui ont fait une immense différence et je vous en

remercie. Ces deux dernières années ont été non seulement extrêmement enrichissantes d’un

point de vue professionnel, mais je garde également de très bons souvenirs du quotidien au

laboratoire.

Je souhaite également remercier Dr. Paul Isenring pour ses conseils et ses ressources offertes

dans son laboratoire qui ont été essentielles à l’avancement de mes travaux. Un grand merci

particulièrement à Marie-Jeanne qui a été spécialement présente auprès de moi tous les jours

lors de mes travaux dans votre laboratoire. Sa patience, son ouverture, ses encouragements

quotidiens ont rendu mes journées plus faciles et particulièrement agréables sans compter

toute l’aide qu’elle m’a apportée!

Merci à Devrim Coskun pour le temps accordé à me montrer tous les travaux liés aux

transporteurs. Il fut un mentor soucieux de ma compréhension et de ma réussite. Je remercie

aussi Partha Santhanam pour sa grande générosité et son aide en biologie moléculaire.

Évidemment, un immense merci à Caroline Labbé toujours disponible et ouverte à m’aider

autant lors de petites difficultés ou pour m’accompagner dans des tâches plus laborieuses.

Son travail a apporté une grande stabilité dans mes travaux au quotidien. Elle est étonnante

à voir aller avec une mémoire sans faille et une impressionnante polyvalence!

Merci aussi à tous les membres du laboratoire, avec lesquels j’ai adoré partager mes journées.

Merci à Amandine Lebreton pour son aide et son soutien moral. Merci à Matteo, Chloé,

Vanessa et Maxime et Geneviève pour nos discussions divertissantes et votre bonne humeur

constante. Finalement, je tiens à remercier mon conjoint Benjamin pour son écoute, ses

conseils et surtout sa patience.

1

Introduction

Parmi les nombreux défis auxquels est confrontée l’agriculture, on retrouve entre autres la

nécessité d’augmenter la production et les rendements tout en diminuant les impacts

environnementaux. Pourtant, cette augmentation de la demande alimentaire n’est pas sans

conséquences puisque cela entraine le recours aux pratiques intensives et l’utilisation à

grande échelle de pesticides chimiques. Dans un contexte planétaire de changements

climatiques, les cultures doivent souvent subir et résister à des stress supplémentaires comme

des sécheresse prolongées, l’arrivée massive d’insectes ravageurs ou le développement

sévère de maladies, entrainant par le fait même une augmentation des pesticides dans

l’environnement. La nécessité de développer de nouvelles stratégies de lutte durables pour la

protection des cultures figure donc parmi les priorités. Les recherches sur le silicium (Si) en

agriculture s’inscrivent directement dans cette perspective. Les effets bénéfiques du Si sur la

croissance, le développement, le rendement et en particulier sur la résistance aux maladies

ont été observés chez une grande variété d’espèces végétales. Cet élément est connu pour

apporter des effets positifs sur la croissance des plantes particulièrement lorsqu’elles sont

exposées à des conditions de stress. De plus, en dépit des concentrations auxquelles sont

exposées les plantes, le Si est l’unique élément qui ne cause jamais de phytotoxicité.

Le rôle prophylactique du Si chez les plantes fait de la fertilisation en cet élément une

approche de lutte contre les agents pathogènes en agriculture et a le potentiel de diminuer

l’utilisation de composés de synthèses souvent nuisible pour l’environnement (Liang et al.,

2015). Les études révèlent que certaines espèces végétales comme le riz, le concombre et la

prêle répondent très fortement à une fertilisation en Si, tandis que d’autres espèces, incluant

plusieurs dicotylédones, ne semblent pas répondre au traitement. En réalité, il existe une

variabilité d’absorption en Si chez les plantes et l’importance des effets bénéfiques est

directement liée au taux d’accumulation dans les tissus (Coskun et al., 2019). La découverte

des gènes Lsi1 et Lsi2, responsables de l’entrée de l’acide silicique dans les cellules racinaires

et du transport vers le xylème, expliquent aujourd’hui cette variabilité (Ma et al., 2006; 2007).

En effet, il a été reconnu que l’absence d’un transporteur Lsi1 fonctionnel était en cause dans

la faible accumulation en Si chez plusieurs espèces (Sonah et al., 2017). Ces observations

confirment que le Lsi1 est un déterminant clé pour l’entrée du Si dans les plantes. Ce premier

2

transporteur Lsi1 est une aquaporine de la sous-famille des Nodulin-26-like intrinsic

proteins-III (NIPIII). Chez ce type de protéine membranaire, un canal composé d’un

mécanisme de filtre, appelé le filtre ar/R, contrôle la sélectivité des molécules transportées.

Ce filtre sélectif est composé de quatre résidus participant directement au mécanisme de

contrôle du passage des solutés. Il est aujourd’hui reconnu que le transporteur Lsi1 des

plantes supérieures possède une signature moléculaire de type G-S-G-R au niveau de son

filtre ar/R (Coskun et al., 2019). Or, certaines plantes possèdent un Lsi1 fonctionnel composé

d’un filtre A-S-G-R permettant un transport élevé en Si (Trembath-Reichert et al., 2015).

Bien que l’identification des deux transporteurs Lsi1 et Lsi2 soulève la possibilité

d’améliorer le taux d’absorption du Si chez les plantes, une meilleure compréhension des

déterminants moléculaires impliqués dans le transport de l’élément est nécessaire. La

première partie de ce mémoire est consacrée à l’étude du premier résidu du filtre ar/R

impliqué dans le contrôle du passage du Si chez l’aquaporine Lsi1.

Parmi les dicotylédones, la famille des Brassicacées comporte de nombreuses espèces

d’importance économique par la production d’huile et de légumes pour la consommation

humaine. La production de ces cultures est cependant affectée par une grande variété de stress

biotiques et abiotiques. Les membres de la famille des Brassicacées sont considérés comme

étant de faibles accumulateurs de Si, les empêchant ainsi de bénéficier des effets protecteurs

de cet élément. En outre, il a été démonté que des plantes ne possédant pas naturellement de

Lsi1, comme Arabidopsis, pouvaient devenir des accumulatrices de Si via l’introduction d’un

transporteur Lsi1 d’une autre espèce (Montpetit et al., 2012; Vivancos et al., 2015). La

deuxième partie du présent projet vise à mesurer l’effet d’un ajout du transporteur Lsi1 chez

le canola. L’espèce Brassica napus figure aujourd’hui comme l’une des principales cultures

d’oléagineux au monde (Canola Council of Canada, 2019). Au Canada, la superficie

ensemencée en canola a presque doublé au cours des 20 dernières années (Statistique-

Canada, 2018). Une capacité d’absorption en Si supérieure chez le canola pourrait constituer

une stratégie prometteuse pour améliorer la résistance aux divers stress. Cela permettrait au

secteur de demeurer compétitif sur le marché par le maintien ou l'amélioration de leur

rendement tout en diminuant l'utilisation de pesticides.

3

Hypothèses et objectifs

Ce projet se divise en deux parties distinctes ayant pour objectif commun d’approfondir les

connaissances sur le transport du Si par le transporteur Lsi1 en vue d’améliorer son

accumulation chez les plantes. Dans la première partie du projet, nous avons étudié le rôle de

certains résidus dans la sélectivité au Si chez les aquaporines Lsi1. Nous avons énoncé

l’hypothèse que le filtre sélectif permettant la perméabilité du Si chez les Lsi1 n’est pas basé

sur le modèle actuel de filtre GSGR. L’objectif a consisté à étudier la fonctionnalité du

transporteur Lsi1 afin de déterminer le premier résidu clé du filtre sélectif impliqué dans la

sélectivité du Si. Différentes substitutions d'acides aminés ont été étudiées dans le filtre ar/R

chez les transporteurs de Si afin d’évaluer l’impact de ces mutations sur la perméabilité au

Si.

Dans la deuxième partie du projet, nous nous sommes intéressés à mesurer l’effet du Si chez

les plants de canola (Brassica napus) transformés avec le gène Lsi1. Nous avons posé la

première hypothèse que les plants de canola transformés avec Lsi1 accumulaient des

quantités supérieures de Si dans leurs parties aériennes comparativement aux plants non

transformés. Nous avons ensuite émis l’hypothèse que les plants transformés avec Lsi1

étaient plus résistants au champignon hémibiotrophe Leptosphaeria maculans. L’objectif

sous-jacent visait à démontrer que les plants de canola génétiquement modifiés avec le gène

Lsi1 bénéficient d’apports supérieurs en Si.

4

Chapitre 1 : Revue de littérature

5

Le silicium

Le silicium dans l’environnement et chez les plantes

Le silicium (Si) est un métalloïde tétravalent omniprésent dans l’environnement. En

représentant environ 28 % de la croûte terrestre, il se positionne comme le deuxième élément

le plus abondant sur terre (Liang et al., 2015). Chimiquement, le Si forme des liaisons à une

très faible variété d’atomes et produit principalement des silicates ainsi que des polymères

de dioxyde de silicium (SiO2). L’importance du Si se reflète au travers du sol, dont sa masse

est composée entre 50 et 70 % de SiO2 (Ma et Yamaji, 2008). Malgré cette prépondérance,

le Si n’est pas considéré comme un élément essentiel pour les plantes en raison de l’absence

d’évidences sur son implication dans le métabolisme de base des plantes (Arnon et Stout,

1939). En revanche, Epstein et Bloom redéfinissent l’essentialité en indiquant qu’un élément

est essentiel s’il respecte l’un des deux critères suivants : 1. l’élément fait partie d’une

molécule qui elle-même est un composé structural intrinsèque ou un composé impliqué dans

le métabolisme de la plante. 2. Une trop faible quantité de l’élément peut affecter la plante

de manière à démontrer une faiblesse de sa performance comparativement aux plantes y ayant

accès en plus grande quantité (Epstein et Bloom, 2005). Puisque l’absence de Si peut affecter

la performance de nombreuses espèces végétales, on peut le qualifier de « quasi-essentiel »

pour la croissance des plantes supérieures (Ma et Yamaji, 2008).

Comme l’ensemble des éléments, le Si n’est pas toujours assimilable par les plantes. C’est

sous la forme d’acide silicique (Si(OH)4) qu’il se retrouve disponible dans le sol. Cette

molécule non chargée peut être absorbée par la plante à des pH inférieurs à 9 et est soluble

dans l’eau jusqu’à 2 mM à 25°C (Ma et al., 2001). À de plus hautes concentrations, le Si

commence à se polymériser sous forme de gel (Takahashi, 1978). C’est d’ailleurs grâce à

cette polymérisation que le Si présent en forte concentration ne montre aucun signe de

toxicité chez les plantes, une caractéristique distinctive par rapport aux autres minéraux (Ma

et Takahashi, 2002). Dans la solution du sol, l’acide silicique se retrouve généralement à des

concentrations allant de 0,1 à 0,6 mM (Ma et al., 2001). Une fois absorbée par les racines, la

molécule doit d’abord passer au travers de la zone corticale, elle est ensuite transportée vers

les parties aériennes via le xylème pour y être déposée sous forme de silice amorphe ou de

gel de silice (SiO2 + nH20). Comme le Si est un élément peu mobile, il s’accumule avant tout

6

dans les tissus plus âgés de la plante (Ma et Yamaji, 2006). Sa déposition sous forme

polymérisée a lieu sous la cuticule dans l’apoplasme des cellules des feuilles, des tiges et des

gousses et forme une double couche SiO2/cuticule. Chez certaines espèces comme le riz et le

blé, la déposition se fait dans des cellules spécifiques appelées « cellules silicaphiles » (Côté-

Beaulieu et al., 2009; Ma et Takahashi, 2002).

Toutes les plantes terrestres possèdent du Si dans leurs tissus, mais la proportion de cet

élément varie, allant de 0,1 % jusqu’à 10 % du poids sec (Liang et al., 2015). Cette très grande

variabilité s’explique par la capacité relative des plantes à absorber l’élément. On divise

celles-ci en trois catégories selon leur teneur en Si, soit les faibles accumulateurs (< 0,5 %),

les accumulateurs intermédiaires (0,5 % - 1,5 %), et les forts accumulateurs (˃ 1,5 % du poids

sec) (Hodson et al., 2005). Chez les monocotylédones, les Poacées et les Cyperacées

accumulent des taux de Si élevés (Hodson et al., 2005). Parmi elles, le riz, l’orge et le blé

sont de très forts accumulateurs. Le riz est d’ailleurs l’une des espèces les plus fortement

accumulatrices connues à ce jour dans le règne végétal. Les dicotylédones, quant à elles,

accumulent généralement que de très faibles quantités de Si. À titre d’exemple, le Si contenu

chez les Brassicaceae et les Solanaceae est quasi négligeable, bien que l’on retrouve des

niveaux modérés chez les Urticales et les Cucurbitales. Puis, en dehors des angiospermes, de

forts accumulateurs se retrouvent chez l’embranchement des Bryophyta ainsi que chez les

classes des Lycopsida, des Sphenopsida et des Equisetopsida provenant de la division des

Pteridophyta (Ma et Takahashi, 2002). Comme l’ensemble des Gymnospermes et la majorité

des Angiospermes n’accumulent pas ou peu de Si, cette capacité demeure restreinte au sein

du règne végétal. Il est reconnu à ce jour que la présence de Si a de nombreux effets positifs

chez les plantes et l’importance de ces effets est directement liée au taux d’accumulation dans

la plante (Coskun et al., 2019).

Effets bénéfiques du Si chez les plantes

Depuis deux décennies, des centaines d’études rapportent les conséquences positives du Si

autant au niveau physiologique que physique. Ces effets bénéfiques sont retrouvés

spécifiquement chez les espèces ayant la capacité d’accumuler le Si dans leurs parties

aériennes. On constate également que son influence se fait remarquer uniquement en

condition de stress. D’un point de vue physique, le Si contribue à augmenter la force

7

mécanique des plantes, affecte les propriétés de la surface des plantes, favorise l’élongation

des cellules et augmente la rigidité des parois cellulaires. Cependant, c’est du côté

physiologique que la majorité des études sur le Si se sont concentrées en démontrant une

meilleure résistance à divers stress abiotiques et biotiques.

Le Si influence de nombreux aspects physiologiques majeurs chez les plantes. Notamment,

plusieurs éléments dont le manganèse, le fer, l’aluminium, de cadmium, l’arsénique, le

chrome le plomb, le cuivre et le zinc occasionnent des problèmes de phytotoxicité moins

importants en présence de Si (Liang et al., 2015). À titre d’exemple, l’ajout de Si dans la

fertilisation du haricot a fait passer le seuil de toxicité du manganèse dans la solution nutritive

de 0,5 μM à 5,10 μM (Horst et Marschner, 1978). Une meilleure tolérance à la toxicité des

métaux est donc engendrée par une accumulation en Si, mais les mécanismes y étant liés sont

encore incompris.

Un nombre considérable d’études démontrent également que le Si participe à une

augmentation de la tolérance aux stress de salinité. Les plantes sous stress salin se voient

bénéficier du Si par ses effets d’augmentation de l’activité photosynthétique, de la surface

foliaire et du contenu en chlorophylle, soit des paramètres généralement affectés à la baisse

dans de telles conditions. Le Si joue un rôle dans le maintien de la turgescence à travers

l’inhibition du taux de transpiration et d’une réduction des pertes en eau permis grâce aux

dépôts de silice sous les cellules épidermiques des feuilles et des tiges (Bélanger et al., 1995).

Ce sont donc principalement les répercussions de l’amélioration par le Si du taux

d’assimilation en CO2 dans la plante qui expliquent une meilleure tolérance aux stress salins,

mais plusieurs autres mécanismes sont en cause et demeurent peu connus (Liang et al., 2015).

Le Si améliore également la tolérance à la sécheresse et aux basses températures chez les

plantes. Les plants stressés par ce type de conditions montrent des taux de photosynthèse

supérieurs lorsqu’ils ont été fertilisés en Si. Gong et al. (2005) rapportent en effet que les

plants de blé sous stress hydrique et fertilisés en Si montrent des taux d’assimilation en CO2

supérieurs comparativement aux plants sans Si (Gong et al., 2005). Les mécanismes y étant

reliés sont principalement les mêmes que ceux en cause dans la tolérance au stress de salinité.

Ceux-ci incluent une meilleure activité des enzymes de la photosynthèse, une diminution des

pertes par transpiration, une augmentation de l’absorption en eau ainsi que le nettoyage des

8

dérivés réactifs de l’oxygène via l’amélioration de l’activité antioxydante (Liang et al., 2015).

Divers autres effets ont été rapportés en lien avec des stress abiotiques. On retrouve entre

autres une meilleure résistance aux déséquilibres nutritifs, aux extrêmes de températures et

aux radiations UV.

L’effet du Si le plus étudié chez les végétaux demeure de loin la tolérance aux stress

biotiques. Bien que certaines recherches mesurent l’impact du Si en cas d’infection

bactérienne, virale ou par des nématodes, c’est particulièrement au niveau des infections

fongiques que le rôle prophylactique de cet élément se fait remarquer. Ce sont plus

précisément les champignons biotrophes et hémibiotrophes qui se voient le plus affectés par

le Si chez les plantes. Les blancs poudreux, des champignons strictement biotrophes, sont

rapidement identifiés comme des espèces largement affectées par la présence de Si chez les

plantes (Miyake et Takahashi, 1983). C’est d’ailleurs dès 1991 que l’équipe de Menzies et

al. révèle une taille de colonies et un taux de germination des conidies de Sphaerotheca

fuliginea significativement plus faibles chez le concombre fertilisé en Si (Menzies, Ehret,

Glass, Helmer, et al., 1991). La littérature présente un nombre important de plantes

bénéficiant de l’accumulation du Si dans la lutte contre cette maladie. Le blé, l’orge, le rosier,

le raisin, le pissenlit, le fraisier ainsi que plusieurs cucurbitacées ont en effet été décrits (Liang

et al., 2015). Deux maladies d’importance chez le riz causées par les champignons

pathogènes Magnaporthe grisea, (Rodrigues et al., 2004) et Bipolaris oryzae (Ning et al.,

2014) sont des espèces hémibiotrophes significativement réprimées par le Si. Malgré le faible

effectif de champignons nécrotrophes influencés par le Si, on retrouve tout de même quelques

espèces pathogènes d’importance comme Rhizoctonia solani (Rodrigues et al., 2003) chez le

riz et Pythium ultinum chez le concombre (Chérif et al., 1992). Ainsi, un ensemble d’espèces

fongiques démontrent être affectées par l’accumulation de Si chez une multitude de plantes

accumulatrices (Wang et al., 2017).

Les insectes et autres types d’arthropodes figurent aussi parmi les types de stress biotiques

pouvant être contrôlés par le Si. Les premiers chercheurs proposant un effet du Si dans

l’attaque des plantes par les insectes herbivores sont l’équipe de McColloch et Salmon en

1923 en indiquant qu’une accumulation de l’élément chez le maïs induirait une meilleure

résistance à la mouche de Hesse (McColloch et Salmon, 1923). Depuis, les études révélant

9

l’influence du Si dans la tolérance des plantes aux insectes piqueurs-suceurs et aux broyeurs

sont retrouvées en abondance dans la littérature (Reynolds et al., 2009).

Finalement, les effets bénéfiques du Si s’observent en état de stress des plantes. Sans compter

les effets physiques, le Si permet principalement une meilleure résistance aux stress biotiques

et abiotiques, incluant particulièrement un rôle prophylactique dans la lutte contre les

infections fongiques. Plus une plante absorbe des quantités élevées de Si, plus les

conséquences positives seront importantes (Ma, 2004). Ainsi, les plantes n’ayant pas la

capacité d’absorber le Si ne peuvent pas bénéficier de ses répercussions, d’où la pertinence

de mieux comprendre les mécanismes d’action de cet élément.

Mécanismes d’action du silicium

Hypothèse mécanique

Encore à ce jour, les mécanismes d’action du Si demeurent incompris. La première théorie

proposée par la communauté scientifique pour expliquer ses effets chez les plantes est celui

de la barrière physique (Wagner, 1940). La double couche cuticule-SiO2 déposée dans les

tissus âgés des parties aériennes agirait comme obstacle mécanique. Cette double couche de

Si polymérisé contribuerait à ralentir le processus d’infection par les agents pathogènes et

augmenterait la rigidité des tissus. La pénétration des tissus par les champignons pathogènes

et la mastication par les insectes seraient plus difficiles et protègeraient par conséquent la

plante de manière passive en lui offrant un arsenal de défense supplémentaire. (Ma et Yamaji,

2006).

Hypothèse du Si soluble

Au début des années 90, Samuel et al. (1991) et Chérif et al. (1992) réfutent l’hypothèse

voulant que le Si agirait simplement comme barrière physique. Ils sont les premiers à lier la

présence de Si soluble à des changements métaboliques et à l’accumulation de composés de

défense dans les plantes. Il est aujourd’hui démontré que le Si ne joue pas strictement un rôle

mécanique, mais qu’il a également un rôle actif dans la résistance. En réaction à une infection

fongique, plusieurs réponses biochimiques comme la production accrue de phytoalexines, de

composés phénoliques, de chitinases, de peroxidases, de glucanases, de protéines PR-1 ont

été liées au traitement en Si (Fauteux et al., 2005; Rodrigues et al., 2005; Rodrigues et al.,

10

2004). En constatant que ces molécules étaient mesurées uniquement en présence de Si sous

forme soluble, l’hypothèse indique que l’acide silicique serait impliqué activement dans son

effet prophylactique en agissant comme modulateur de composés clés du signal de stress.

Le concept de « priming » des réactions de défenses a d’abord été suggéré par Fawe et al.

(1998; 2001). Le Si aurait un rôle de « primer », c’est-à-dire qu’il ferait office d’activateur

du système de défense, permettant ainsi une réponse plus rapide et efficace aux divers stress

tout en ayant un coût métabolique minimal. En 2015, Vivancos et al. indiquent toutefois que

le Si activerait d’autres mécanismes de défense qui ne dépendent pas de ce composé.

Les études plus récentes sur les effecteurs ont ensuite amené une autre hypothèse sur le

mécanisme d’action du Si. Les effecteurs sont des molécules sécrétées par le champignon et

sont impliquées dans la pathogénicité chez les plantes. Comme le site de déposition du Si a

lieu au même endroit que la cible de nombreux effecteurs, soit dans l’apoplasme sous la

cuticule, il est suggéré que le Si interfèrerait aussi avec les effecteurs libérés par les agents

pathogènes. Cette interaction empêcherait les effecteurs d’atteindre leur cible, priverait ainsi

le pathogène d’aller moduler les défenses de la plante et préviendrait l’invasion fongique.

Rasoolizadeh et al. (2018; 2020) appuient cette hypothèse en démontrant que l’expression

des gènes codant pour les effecteurs de P. sojae était significativement réduite lors de

l’interaction avec des plants de soya fertilisés au Si.

Les transporteurs de Si

Anciennement, on estimait que seule la transpiration dictait l’accumulation de Si chez les

plantes. La découverte en 2006 et 2007 de deux transporteurs de Si nommés Lsi1 et Lsi2,

apporte les premières explications quant à la grande variation du taux de Si retrouvée chez

les plantes supérieures (Ma et al., 2006; Ma et al., 2007). La translocation du Si est bel et

bien facilitée par la transpiration, mais il est aujourd’hui reconnu que les transporteurs jouent

le rôle décisif dans l’accumulation de cet élément. Les transporteurs Lsi1 et Lsi2 agissent de

concert pour permettre au Si de pénétrer au travers des cellules racinaires et être envoyé dans

le xylème pour atteindre les parties aériennes.

11

Les aquaporines

Les aquaporines (AQPs) sont des canaux protéiques retrouvés au niveau de la membrane

plasmique et de plusieurs autres membranes intracellulaires autant chez les archées, les

bactéries que chez les eucaryotes (Wu et Beitz, 2007). Initialement identifiées chez l’humain

par l’équipe de Peter Agre (Borgnia et al., 1999), il a été découvert par la suite qu’une

diversité nettement supérieure d’aquaporines était présente chez les plantes. Ces importantes

protéines, appartenant à la famille des Major Intrinsic Proteins (MIPs), jouent un rôle

fondamental dans le transport des molécules d’eau et d’éléments nutritifs, ce qui les rend

essentielles à la survie des plantes (Hove et Bhave, 2011). Une variabilité considérable de

substrats, de profils d’expression, de régulation et de localisation existe au sein des MIPs,

leur attribuant des fonctions diverses dans la plante (Hove et Bhave, 2011). Par exemple, les

aquaporines peuvent être perméables à l’eau, au glycérol, au dioxyde de carbone (CO2), à

l’oxyde nitrique (NO), à l’ammoniac (NH3), au peroxyde d’hydrogène (H2O2), à l’arsénite

(As(OH)3), à l’urée (CH4N2O) et à l’acide silicique (Si(OH)4) (Wu et Beitz, 2007). Cette

diversité chez les aquaporines végétales a permis leur subdivision en sept familles en fonction

de leur localisation intracellulaire et de leur séquences homologues. On y retrouve les Plasma

membrane intrinsic proteins (PIPs), les Tonoplast intrinsic proteins (TIPs), les Nodulin-26-

like-intrinsic proteins (NIPs), les Small basic intrinsic proteins (SIPs), les GlpF-like intrinsic

proteins (GIPs), les Hybrid intrinsic proteins (HIPs) et les Uncategorized X intrinsic proteins

(XIPs). Cependant, les GIP et les HIP sont retrouvées uniquement chez les plantes primitives

(Deshmukh et al., 2015). Les PIP et les TIP, quant à elles, jouent essentiellement un rôle de

transport de l’eau et sont généralement exprimés dans les racines et les tissus végétatifs

(Deshmukh et al., 2017). Le présent projet s’intéresse plus particulièrement aux NIP

puisqu’on y retrouve parmi elles une sous-famille fortement perméable au Si.

Structurellement, les MIP sont des tétramères dont chaque monomère possède un pore

permettant le passage des molécules de substrat. En effet, la conformation tridimensionnelle

des aquaporines forme un canal servant de barrière ou de porte d’entrée des différentes

molécules. Ce pore joue un rôle sélectif dans le passage des différents solutés afin de

contrôler l’osmolarité selon les besoins de la plante. Les monomères se caractérisent par la

présence de six hélices alpha transmembranaires (TM1-TM6) reliées par trois boucles

extracytoplasmiques (LA, LC et LE) et deux boucles intracytoplasmiques (LB et LD) (Hove

12

et Bhave, 2011). La présence de deux motifs Asn-Pro-Ala (NPA) dans les boucles LB et LE

permet le repliement du monomère et la formation d’une première constriction. Une seconde

constriction composée de quatre résidus, forme le filtre aromatique/arginine (ar/R)

permettant le passage sélectif du substrat dans le canal. Le premier résidu de ce filtre se trouve

dans l’hélice H2, le deuxième est dans l’hélice H5 et les deux derniers sont dans les boucles

LE. L’acide aminé le plus conservé du filtre ar/R est le dernier résidu arginine (R) et servirait

de donneur de liaisons hydrogènes permettant le transport de l’eau ou de molécules de

glycérol (Jensen et al., 2003). Quant aux trois premiers acides aminés du filtre sélectif, ils

sont spécifiques aux sous-familles d’aquaporines et permettent la formation des liaisons Van

der Waals avec les molécules de substrat (Hove et Bhave, 2011).

Plus d’un rôle et bénéfice sont attribués à la présence d’aquaporines chez les plantes. Non

seulement elles sont reconnues pour permettre le mouvement des nutriments, mais elles

jouent également un rôle dans l’élongation des parties aériennes et des racines. Les

aquaporines participent au développement optimal des graines, à l’hydratation du pollen et à

sa germination. Ces protéines membranaires sont aussi impliquées dans le mouvement des

stomates, renforçant la tolérance des plantes à la sécheresse (Deshmukh et al., 2017). Leur

grande diversité et leur régulation permettent aux plantes une meilleure adaptation aux

diverses conditions environnementales (Maurel et al., 2008). Aux vues des perturbations

climatiques à venir, il semble primordial de mieux comprendre le fonctionnement de ces

protéines membranaires. Malgré l’intérêt majeur que porte la communauté scientifique sur la

question du rôle des aquaporines en conditions de stress, ce sujet demeure largement

incompris.

Les transporteurs d’influx du Si

La découverte des transporteurs de Si marque un point tournant dans l’étude du mécanisme

d’absorption de cet élément chez les plantes. Le transporteur Lsi1 (Low silicon rice 1), est

une aquaporine (AQP) appartenant à la sous-famille des Nodulin 26-like intrinsic protein-III

(NIPIII) permettant l’entrée en influx de l’acide silicique du sol vers les cellules racinaires.

Cette protéine membranaire contrôle de manière passive l’accumulation du Si (Ma et Yamaji,

2006). D’abord découvert chez le riz (Oryza sativa) (Ma et al., 2006), ce transporteur a par

la suite été identifié chez plusieurs autres plantes. Il n’est pas retrouvé chez toutes les espèces

13

végétales et sa présence explique en grande partie la forte accumulation de Si possible chez

ces plantes. En effet, les espèces faiblement accumulatrices étudiées à ce jour ne possèdent

pas de Lsi1. À titre d’exemple, Arabidopsis thaliana, Brassica napus et Eruca vesicaria, tous

de faibles accumulateurs de Si, ne possèdent pas le gène Lsi1 (Sonah et al., 2017). À l’inverse

Cucumis sativus, Glycine max, Oryza sativa, et plusieurs autres sont à la fois de forts

accumulateurs et porteurs du gène Lsi1. Plusieurs homologues ont été identifiés jusqu’à

maintenant chez l’orge (HvLsi1), le blé (TaLsi1), le maïs (ZmLsi1), le concombre (CSiT-1),

la citrouille (CmLsi1) et le soya (GmLsi1) (Ma et Yamaji, 2015). Le transporteur Lsi1 est non

seulement perméable à l’acide silicique mais également à l’eau en plus d’agir de manière

bidirectionnelle en influx et en efflux (Mitani et al., 2008a).

La localisation du Lsi1 varie selon les espèces. Chez le riz, l’aquaporine est située dans la

membrane plasmique à l’extrémité distale des cellules de l’exoderme et de l’endoderme au

niveau de la bande de Caspari. Tandis que chez le l’orge et le maïs, elle est localisée du côté

distal des cellules épidermiques et corticales (Chiba et al., 2009; Ma et al., 2006). À l’inverse,

le CmLsi1 chez la citrouille est localisé dans toutes les cellules racinaires et ne montre aucune

disposition polaire (Mitani et al., 2011). Physiquement, le Lsi1 est retrouvé dans les régions

matures des racines principales et secondaires, mais est très peu présent dans les extrémités

racinaires comme l’apex (Ma et al., 2006).

Comme expliqué précédemment, chaque aquaporine possède une signature moléculaire

spécifique contenant les deux domaines NPA ainsi que le filtre sélectif composé de quatre

acides aminés. Dans le cas du transporteur Lsi1, une étude indique que les deux domaines

NPA semblent devoir être séparés par 108 acides aminés pour que les NIPIII puissent laisser

passer le Si. Chez la tomate par exemple, une plante faiblement accumulatrice, la séparation

de 109 acides aminés entre les deux domaines NPA explique l’incapacité de cette espèce à

absorber le Si (Deshmukh et al., 2015). Malgré le fait que ces deux domaines soient fortement

conservés au sein des NIPIII, ils semblent cependant n’avoir qu’un rôle restreint dans le

passage sélectif du Si. En effet, OsNIP1;1 et OsNIP2;1 possèdent les deux domaines NPA

alors qu’uniquement OsNIP2;1 transporte l’acide silicique (Mitani et al., 2008a). Quant au

filtre sélectif ar/R, une signature moléculaire spécifiquement liée à l’acide silicique semble

caractériser les NIPIIIs. Plus précisément, les résidus du filtre de type Gly88, Ser207, Gly216

14

et Arg222 semblent largement conservés chez les transporteurs Lsi1. Une constriction plus

large (≥6Å) permise par les résidus G-S rendrait possible le passage de l’acide silicique (4.38

Å) (Hove et Bhave, 2011). Ces quatre acides aminés G-S-G-R, de position bien précise dans

la séquence protéique, semblent être le critère actuel pour déterminer la capacité d’une

aquaporine à transporter le Si. C’est le cas pour les transporteurs OsNIP2;1 (Ma et al., 2006)

du riz, TaNIP2;1 du blé (Montpetit et al., 2012), GmNIP2;1 du soya (Deshmukh et al., 2013),

ZmNIP2;1 du maïs (Mitani et al., 2008b), HvNIP2;1 de l’orge (Chiba et al., 2009) et pour la

majorité des aquaporines de type Lsi1 décrites à ce jour. Une étude révèle même que la

mutation d’un acide aminé du filtre GSGR occasionne une diminution marquée du transport

du Si par l’aquaporine (Mitani-Ueno, Yamaji, Zhao, et al., 2011).

Lsi1 chez le riz comme transporteur modèle

Le premier transporteur d’influx du Si a été identifié chez le riz (Oryza sativa) par Ma et al.

en 2006 où l’inhibition de l’expression de OsNIP2;1 résultait en une réduction de l’absorption

de Si (Ma et al., 2006). Ce sont d’ailleurs les résultats de ces expérimentations qui ont mené

au nom de Low silicon rice (Lsi1) donné au gène responsable de l’absorption du Si chez les

plantes. Chez cette espèce, le gène Lsi1 est situé sur le chromosome 2 et inclut 5 exons et 4

introns. La séquence codante du gène (cDNA) est de 1409 pb et la protéine qui en résulte est

composée de 298 acides aminés. Sa signature moléculaire est bien composée des deux

domaines NPA et du filtre ar/R de type GSGR comme l’ensemble des plantes supérieures

étudiées jusqu’à maintenant. Les connaissances acquises sur le transporteur OsLsi1 autant au

niveau de sa composition moléculaire, de son expression et de son activité facilitent les études

de fonctionnalité des transporteurs et le rendent un transporteur modèle idéal.

Lsi1 chez la prêle comme transporteur modèle

Parmi les transporteurs d’influx du Si caractérisés à ce jour, une espèce présente certaines

exceptions. La prêle (Equisetum arvense), une plante ancestrale dont la survie dépend du Si,

possède des aquaporines perméables au Si. Ces dernières font partie de la famille

d’aquaporines des NIPII, contrairement aux NIPIII chez plantes supérieures. Bien qu’ils

appartiennent à des familles différentes, leurs séquences présentent toute de même une

homologie élevée. Reconnues pour être perméables à l’acide borique, les NIPII ont été

décrites chez Arabidopsis (Takano et al., 2006). Contrairement aux aquaporines perméables

15

au Si chez les plantes supérieures, la signature moléculaire de EaNIP3 au niveau du filtre

sélectif n’est pas constituée des résidus GSGR, mais plutôt des résidus STAR. Il s’agit en

réalité d’une différence majeure. Les deux domaines NPA sont, quant à eux, bien présents

(Grégoire et al., 2012). Comme les Equisetum sont d’origine ancestrale, il se pourrait que

leurs transporteurs de Si aient évolué indépendamment des angiospermes. Malgré leurs

différences, l’efficacité des EaNIP3 à transporter le Si les rend des modèles intéressants pour

l’étude des mécanismes d’absorption du Si chez les plantes.

Les transporteurs d’efflux Lsi2

Les transporteurs Lsi2 sont responsables du passage du Si en efflux, faisant sortir l’élément

des cellules racinaires vers l’apoplasme et permettant de charger le xylème. Ce sont des

protéines appartenant à une classe non caractérisée de transporteurs d’anions putatifs qui

possèderaient 11 domaines transmembranaires. Bien que les Lsi2 se retrouvent aussi au

niveau de la membrane plasmique, ils sont généralement positionnés du côté proximal,

contrairement aux Lsi1 (Ma et al., 2007). Cette localisation polaire entre le Lsi1 et le Lsi2

démontre bien que ces deux transporteurs agissent de manière complémentaire afin de

permettre l’entrée efficace de l’acide silicique dans le xylème chez les espèces fortement

accumulatrices. À l’origine identifiés chez le riz, de nombreux homologues ont par la suite

été identifiés chez d’autres espèces dont l’orge (HvLsi2), le maïs (ZmLsi2), la prêle

(Vivancos et al., 2016) et la citrouille (CmLsi2) (Mitani-Ueno, Yamaji, et Ma, 2011; Mitani

et al., 2009). Cependant, il existe une certaine variation dans le type de cellules racinaires où

se trouvent ces transporteurs. Chez le riz, le Lsi2 est présent du côté proximal de l’exoderme

et de l’endoderme des racines, tandis que chez l’orge et le maïs il est uniquement situé à

l’endoderme (Mitani et al., 2009). Ces variations seraient probablement dues aux structures

racinaires distinctes au sein des espèces. On retrouve les transporteurs d’efflux dans les

racines principales et latérales, mais aucune expression n’a lieu au niveau des radicelles et

des apex racinaires (Ma et al., 2007). Malgré ces ressemblances avec le transporteur d’efflux

de l’arsénite des bactéries et des archées ainsi que sa capacité à transporter le Si chez le riz,

peu de connaissances sur le Lsi2 sont disponibles. En effet, le type de transport membranaire

effectué par le Lsi2 reste encore à étudier, en marge du processus actif et anti porteur

Si(OH)4/H+ suggéré par Ma et al. (2007). Il est aujourd’hui reconnu que les transporteurs

Lsi1 et Lsi2 agissent de concert pour permettre une accumulation supérieure et efficace du

16

Si dans les tissus de la plante. En dépit de leurs différences importantes, une comparaison

des régions promotrices révèle que ces deux transporteurs possèdent des domaines communs

(Ma et al., 2007).

Expression des transporteurs

Tel que rapporté plus tôt, les deux transporteurs Lsi1 et Lsi2 sont localisés au niveau de la

membrane plasmique, mais leur expression varie selon les espèces, le type de tissus et de

cellules (Ma et Yamaji, 2015). Les spécificités de localisation cellulaire et d’expression de

chacun de ces transporteurs démontrent qu’ils sont impliqués dans des étapes distinctes mais

complémentaires dans le processus d’accumulation du Si. Un knockout de l’un ou l’autre des

gènes a occasionné une diminution significative de l’accumulation en Si (Ma et al., 2006).

En d’autres termes, la présence conjointe de ces deux transporteurs serait le facteur clé pour

une accumulation optimale du Si chez les plantes. Des études réalisées chez le riz indiquent

qu’il y aurait une relation inverse entre le niveau d’expression des transporteurs de Si et le

niveau d’accumulation de l’élément dans les feuilles. Plus précisément, un taux

d’accumulation en Si élevé dans les feuilles induit une régulation négative de l’expression

des transporteurs dans les racines (Mitani-Ueno et al., 2016). L’expression de ces deux

transporteurs est également régulée négativement par l’indication d’un stress comme une

sécheresse ou la présence d’acide abscissique (Yamaji et Ma, 2007). Aucun consensus sur

l’expression des transporteurs n’a cependant été établie.

Le canola (Brassica napus)

L’espèce Brassica napus, appartenant à la famille des Brassicaceae, est connu sous le nom

commun de colza ou de canola. Cette espèce amphidiploïde serait dérivée des espèces

diploïdes B. nigra, B. rapa et B. oleracea. Le terme canola est spécifiquement employé pour

les variétés de B. napus issues d’un processus d’amélioration génétique visant à améliorer

les propriétés de l’huile en la rendant plus saine pour la consommation humaine et animale.

Plus spécifiquement, l’appellation contrôlée « canola » doit être employée uniquement pour

les variétés à faible teneur en acide érucique et en glucosinolate dont les teneurs ne doivent

pas excéder des seuils bien précis. Cette variété, développée dans les années 1970 par la

recherche d’Agriculture et Agroalimentaire Canada, est depuis devenue l’une des cultures

d’oléagineux la plus importante mondialement et largement cultivée au Canada (Canola

17

Council of Canada, 2019). La production mondiale de canola était estimée à 68 millions de

tonnes en 2016 (USDA, 2017). Au Canada, la superficie ensemencée en canola a presque

doublé au cours des 20 dernières années passant de 12 millions d’acres en 1997 à 23 millions

d’acres en 2017 (Statistique-Canada, 2018). La culture intensive de canola fait aujourd’hui

face à plusieurs difficultés comme le développement de maladies, la compétition des

mauvaises herbes et des problèmes de sécheresse majeurs. Pour affronter ces défis, de

nouvelles variétés de canola ont été développées par l’introduction de gènes de résistance.

Par exemple, différents cultivars plus résistants au champignon pathogène Leptosphaeria

maculans ont été développés (Zhang et al., 2016). Le cultivar Westar, performant mais sans

aucun gène de résistance à la maladie, est rapidement devenu moins intéressant à cultiver.

Pour cette raison, de nouveaux cultivars rendus résistants à L. maculans grâce au gène de

résistance Rlm3 ont été introduits à grande échelle dans les années 90. Toutefois, l’efficacité

de ces cultivars a rapidement été anéantie au début des années 2000 par le développement de

races fongiques résistantes (Zhang et al., 2016). Malgré la mise en place de variétés possédant

plus d’un gène de résistance, les problèmes liés aux maladies chez le canola demeurent des

enjeux majeurs.

Tel que mentionné, les Brassicacées ne possèdent pas de transporteurs Lsi1. Des études ont

cependant démontré qu’en transformant une plante faiblement accumulatrice comme

Arabidopsis avec un gène d’absorption du Si du blé (TaLsi1), la plante devenait plus tolérante

au blanc poudreux en présence de Si (Vivancos et al., 2015). Sachant qu’Arabidopsis fait

partie de la même famille que le canola, une telle transformation serait éventuellement

possible chez ce dernier. La facilité à manipuler génétiquement le canola en laboratoire rend

plus aisée l’amélioration génétique et la création de cultivars plus performants et polyvalents.

Leptosphaeria maculans

La maladie de la jambe noire (blackleg) est causée par un champignon pathogène

hémibiotrophe des Brassicaceae. Leptosphaeria maculans, faisant partie de la famille des

ascomycètes, correspond à la forme sexuée de la maladie, tandis que Phoma lingam est sa

forme asexuée. Cette maladie peut entraîner des dommages majeurs en particulier chez le

canola. C’est d’ailleurs devenu dans l’Ouest canadien l’agent pathogène engendrant les

pertes économiques les plus importantes dans cette culture au cours de la dernière décennie

18

(Canola Council of Canada, 2019). Géographiquement, il se retrouve principalement en

Australie, en Nouvelle-Zélande, au Canada, en Europe, en Afrique du Sud et aux États-Unis

(West et al., 2001). Les pertes de rendements à la récolte engendrées par L. maculans sont

généralement supérieures à 10 % et peuvent atteindre 30 à 50 % (West et al., 2001). Les

principales raisons expliquant l’accélération des problèmes liés à cette maladie sont

l’augmentation des surfaces cultivées, l’absence de rotations de cultures ainsi que la perte

d’efficacité des gènes de résistance utilisés à ce jour (Zhang et Fernando, 2018). La forme

anamorphe du champignon produit des spores de type pycnidiospores (3-5 x 1.5-2 μm)

contenues dans une matrice hygroscopique noire appelée pycnide (Williams, 1992). Ces

pycnides sont produites dans les tissus infectés et nouvellement morts de la plante et libèrent

les pycnidiospores pouvant être disséminées sur quelques mètres grâce aux éclaboussures de

la pluie. La forme téléomorphe, quant à elle, produit des structures fructifères noires et

globuleuse appelées des pseudothèces. Ces ascocarpes contiennent de nombreux asques où

se retrouvent les spores de type ascospores de forme cylindrique à ellipsoïdale (35-70 x 5-8

μm) (Williams, 1992). Contrairement aux spores asexuées, les ascospores se propagent par

le vent sur plusieurs kilomètres (West et al., 2001).

Peu importe le stade sexué ou asexué, l’infection est initiée par la pénétration des spores via

les stomates ou les blessures. Leptosphaeria maculans est donc susceptible d’attaquer

presque toutes les parties de la plante incluant les cotylédons, les feuilles, les tiges, les racines

et les siliques. Les premiers symptômes sont généralement des lésions foliaires circulaires de

couleur blanc à gris où apparaissent ensuite des points noirs représentant les pycnides. Durant

la phase biotrophe, les hyphes se développent dans les tissus via les espaces intercellulaires

et accèdent aux pétioles où elles peuvent atteindre la tige. Une fois les vaisseaux atteints, la

croissance du champignon peut générer un contour noir à la base de la tige et former un

chancre. Ces chancres peuvent affecter le transport de l’eau, engendrer un remplissage

prématuré des siliques, des graines échaudées et peuvent même finir par sectionner la base

du plant. Bien que le chancre soit le stade le plus sévère de la maladie, la présence importante

de lésions foliaires peut également affecter la maturité des plants et la qualité des siliques

(West et al., 2001).

19

Après la récolte, le champignon entre dans sa phase nécrotrophe où les tissus morts sont

colonisés d’abord par la forme asexuée qui produira des pycnides ou entrera dans la phase

sexuée, participant ainsi à l’augmentation du degré d’inoculum. Cet agent pathogène peut

survivre sur les débris végétaux ou les graines de canola pendant plusieurs années sous forme

de mycélium, de pycnides ou de pseudothèces. Sa survie est favorisée par des conditions

estivales sèches et des hivers froids (Howlett et al., 2001). Il existe plusieurs groupes de

pathogénicité de ce champignon (PG); soit PG1 qui englobe les races faiblement virulentes

tandis que PG2, PG3 et PG4 comprennent les races très virulentes (Chen et Fernando, 2006).

20

Chapitre 2 : Étude fonctionnelle des transporteurs d’influx Lsi1

du silicium chez les plantes

21

Introduction

Le silicium (Si) est un élément appartenant aux métalloïdes qui est présent en abondance

dans l’environnement. Il correspond à environ 28 % de la croûte terrestre, ce qui le positionne

comme le deuxième élément le plus abondant sur terre (Liang et al., 2015). Les taux élevés

en SiO2 du sol, généralement entre 50 et 70 % de la masse, exposent les plantes à de grandes

quantités de cet élément (Ma et Yamaji, 2008). Malgré cette omniprésence, le Si ne figure

pas parmi les éléments essentiels des plantes. En réalité, toutes les plantes terrestres possèdent

du Si dans leurs tissus, mais les taux varient de 0,1 à 10 % du poids sec (Liang et al., 2015).

C’est sous forme d’acide silicique (Si(OH)4) que le Si est disponible pour les plantes. Les

concentrations généralement retrouvées de cette molécule dans la solution du sol vont de 0,1

à 0,6 mM, mais elle est soluble dans l’eau jusqu’à 2mM (Ma et al., 2001). Étant un élément

peu mobile, le Si s’accumule avant tout dans les tissus plus âgés de la plante (Ma et Yamaji,

2006). Il se dépose sous forme polymérisée sous la cuticule dans l’apoplasme des cellules

des feuilles, des tiges et des gousses et forme une double couche SiO2/cuticule. Les plantes

sont subdivisées en trois grandes catégories selon leur teneur en Si dans leurs tissus. On

retrouve les faibles accumulateurs (< 0,5 %), les accumulateurs intermédiaires (0,5 % - 1,5

%), et les forts accumulateurs (˃ 1,5 % du poids sec) (Hodson et al., 2005). La variabilité du

taux de Si dans les plantes est liée à leur capacité relative à accumuler l’élément dans leurs

tissus. Le riz (Oryza sativa) et la prêle des champs (Equisetum arvense) figurent parmi les

plus forts accumulateurs.

L’intérêt principal de la communauté scientifique porté sur le Si est lié à ses multiples effets

bénéfiques chez les plantes. Non seulement le Si augmente la rigidité des parois cellulaires

et favorise l’élongation des cellules végétales, mais de nombreux effets physiologiques ont

également été rapportés. Plusieurs de ces effets engendrent une tolérance accrue aux stress

biotiques et abiotiques (Liang et al., 2015). Pour ce qui est des stress abiotiques, une réduction

des problèmes de phytotoxicité des métaux, de salinité et de déséquilibres nutritifs sont

largement rapportés dans la littérature. Le Si contribue également à améliorer la tolérance

des plantes à la sécheresse, aux extrêmes de températures ainsi qu’aux radiations UV. L’effet

du Si le plus étudié chez les végétaux est de loin la tolérance aux stress biotiques. Des

centaines d’études démontrent une réduction des problèmes liés aux infections fongiques

chez une multitudes de plantes accumulatrices (Chérif et al., 1992; Menzies, Ehret, Glass, et

22

Samuels, 1991; Rodrigues et al., 2004). Les insectes et autres arthropodes figurent aussi

parmi les stress biotiques pouvant être réprimés par le Si (Reynolds et al., 2009). Ainsi,

l’influence du Si se fait uniquement remarquer en condition de stress. Il est aujourd’hui

reconnu que ses effets positifs et leur importance relative sont directement liés au taux

d’accumulation du Si dans la plante (Coskun et al., 2019). En d’autres termes, plus la plante

accumule de Si dans ses tissus, plus elle en bénéficie.

Les variations d’accumulation de Si au sein du règne végétal ont été expliquées grâce à la

découverte des transporteurs de Si chez les plantes, appelés Lsi1 et Lsi2 (Ma et al., 2006; Ma

et al., 2007). Ces transporteurs, situés au niveau de la membrane plasmique des cellules

racinaires, agissent ensemble afin de permettre l’accumulation efficace du Si dans les parties

aériennes. L’entrée de l’acide silicique de la solution du sol vers les cellules racinaires est

canalisée par le transporteur d’influx Lsi1. Le transporteur d’efflux Lsi2 agit ensuite de

manière à faire sortir le Si des cellules racinaires vers l’apoplasme afin de charger le xylème.

La présence de ces deux gènes est aujourd’hui l’explication moléculaire de la capacité

relative des plantes à accumuler le Si (Ma et Yamaji, 2015).

Le transporteur Lsi1 est en réalité une protéine appartenant à la grande famille des Major

intrinsic proteins (MIPs), aussi appelées sous le nom d’aquaporines (AQPs) (Hove et Bhave,

2011). Plus précisément, le Lsi1 appartient à la sous famille des Nodulin 26-like intrinsic

protein-III (NIPIII). Comme chez l’ensemble des aquaporines, la conformation

tridimensionnelle du Lsi1 forme deux constrictions impliquées dans le passage des

différentes molécules. La première constriction est composée de deux motifs Asn-Pro-Ala

(NPA), tandis que la seconde, formée de quatre acides aminés, constitue le filtre

aromatique/arginine (ar/R) permettant la sélectivité des molécules transportées. Dans le cas

du Lsi1, une étude indique qu’une séparation des deux domaines NPA par 108 acides aminées

serait un des critères permettant le passage du Si chez les NIPIII (Deshmukh et al., 2015).

Au niveau du filtre sélectif, les résidus Gly-Ser-Gly-Arg (GSGR) constituent la signature

moléculaire permettant le transport du Si chez les aquaporines Lsi1. Ces quatre acides aminés

de position bien précise dans la séquence protéique ainsi que la distance de 108 acides aminés

entre les domaines NPA, semblent être les critères actuels pour déterminer la capacité d’une

aquaporine à transporter le Si (Coskun et al., 2019).

23

Malgré le présent consensus quant aux quatre résidus GSGR impliqués dans la sélectivité du

Si, on retrouve au sein du règne végétal plusieurs espèces fortement accumulatrices de Si

présentant un filtre sélectif de type ASGR. À titre d’exemple, Phaseolus vulgaris, Vigna

radiata, et Vigna angularis sont toutes les trois de fortes accumulatrices de Si et possèdent

pourtant un Lsi1 composé d’un filtre ar/R de type Ala-Ser-Gly-Arg (ASGR). Des tests par

expression hétérologue dans les oocytes de Xenopus laevis révèlent que le transporteur Lsi1

de ces dernières espèces est bel et bien actif dans le transport du Si (données non publiées).

À partir de ces informations, la première position du filtre sélectif du Lsi1 permet le transport

du Si qu’elle soit composée de l’acide aminé Glycine ou Alanine. Il a d’autant plus été

remarqué que le résidu Glycine à la position adjacente au premier acide aminé du filtre

sélectif dans la séquence protéique (Gly88 chez OsLsi1) est davantage conservé au sein des

NIPIII que cette première position. Le transporteur de Si chez la prêle (EaLsi1), appartenant

à la sous-famille des NIPII, présente également une conservation de l’acide aminé Glycine à

la position adjacente de celle du premier résidu du filtre ar/R. Une question se pose ainsi

quant à l’implication dans la sélectivité du Si de ce résidu adjacent fortement conservé chez

les transporteurs Lsi1. Nous avons donc posé l’hypothèse que le filtre sélectif permettant la

perméabilité du Si chez les Lsi1 n’est pas basé sur le modèle actuel de filtre GSGR. Le présent

objectif est de déterminer le premier résidu clé du filtre sélectif impliqué dans la sélectivité

du Si au sein des Lsi1. L’activité de transport du Si chez des Lsi1 mutés au niveau de leur

filtre sélectif a ainsi été testé chez le riz et la prêle par le système d’expression hétérologue

d’oocytes de X. laevis afin de déterminer l’impact de la mutation sur la fonctionnalité du

transporteur.

Matériels et méthodes

Clonage des gènes et construction des plasmides pour l’expression hétérologue dans les

oocytes de Xenopus laevis

Pour le clonage des gènes d’intérêts, l’ARN des tissus de Oryza sativa et Equisetum arvense

a été préalablement isolé. L’ADNc a ensuite été synthétisé par transcription inverse et les

gènes OsLsi1 (numéro d’accession AB222272) et EaLsi1 (numéro d’accession HE858197)

ont été amplifiés par PCR à partir de l’ADN complémentaire (ADNc). Ces étapes ont été

réalisées préalablement à ce projet.

24

Pour faire les constructions, les séquences codantes de OsLsi1 et EaLsi1 ont été amplifiées

en utilisant des amorces PCR créées de manière à introduire les sites de restrictions SpeI/BglII

chez OsLsi1 et EcoRI/HindIII chez EaLsi1 aux extrémités. L’amplicon obtenu a été inséré

dans le vecteur d’expression de Xenopus laevis Pol1 comprenant un promoteur T7, la région

globuline non transcrite de X. laevis et une queue poly(A). Pour l’insertion, le vecteur Pol1 a

été prédigéré avec les enzymes respectives (SpeI/BglII pour OsLsi1 et EcoRI/HindIII pour

EaLsi1). Tous les vecteurs ont été clonés dans les souches compétentes E. coli TOP10 et

gardés à -80°.

Tableau 1 Amorces utilisées pour insérer le gène Lsi1 dans le vecteur Pol1

Nom de

l’amorce Direction Séquence Commentaire

OsLsi1-

Bgl2-F F

CTATAGATCTATGGCCAGCAACAACT

CGAG

Pour intégrer le gène

OsLsi1 dans le

vecteur Pol1

OsLsi1-

Spe1-R R

GTTAACTAGTTCACACTTGGATGTTCT

C


OsLsi1 dans le

vecteur Pol1

EaLsi1-

EcoRI-F F

AGTGGAATTCATGACGAAAGGGGAG

ATATCGATTC


EaLsi1 dans le

vecteur Pol1

EaLsi1-

HindIII-R R

CCCAAGCTTTTAAGTGCTTTCATCTTC

TAGTTTGAG


EaLsi1 dans le

vecteur Pol1

Mutagénèse dirigée

En se basant sur un large alignement de séquences d’acide aminés provenant d’homologues

Lsi1 (NIP2), l’analyse a révélé que le résidu glycine (G) adjacent à la première position du

filtre sélectif est conservé au sein des Lsi1 de toutes les espèces (données non publiées). Le

logiciel PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer) a été utilisé pour prédire l’effet d’un

changement d’acide aminé à ces positions sur la fonctionnalité de la protéine (Choi et al.,

2012). À la lumière de ces analyses, le résidu glycine à la position 88 remplacé avec l’alanine

(G88A) ainsi que le résidu glycine à la position 89 remplacé avec la valine (G89V) ont été

ciblés pour l’étude de fonctionnalité chez OsLsi1. Chez EaLsi1, le résidu sérine à la position

25

70 remplacé par le résidu glycine ou thréonine (S70G et S70T) ainsi que le résidu glycine à

la position 71 remplacé par le résidu alanine (G71A) ont été ciblés.

La méthode de mutagénèse dirigée par PCR a été utilisée pour réaliser les substitutions

spécifiques grâce aux amorces créées pour induire la mutation désirée. Les amorces utilisées

pour générer chaque mutant sont indiquées au Tableau 2. Les mutagénèses ont été réalisées

avec l’ADN polymérase Phusion Taq polymerase (New England Biolabs). Les produits issus

de la réaction PCR ont ensuite été digérés avec l’enzyme DpnI pour dégrader l’ADN

génomique méthylé. Puis la transformation dans des cellules compétentes E. coli TOP10 a

été réalisée. Toutes les séquences ont été confirmées par séquençage des plasmides.

Tableau 2 Amorces utilisées pour la mutagénèse dirigée

Nom de

l’amorce Direction Séquence Commentaires

OsLsi1-

G88A-F F

GTCGATCGCCGCTGGCCTCATCGT

GACGGTGATG

Mutagénèse dirigée du

mutant OsLsi1 G88A

OsLsi1-

G88A-R R

CGATGAGGCCAGCGGCGATCGAC

TGTCCCAGCTG


mutant OsLsi1 G88A

OsLsi1-

G89V-F F CGATCGCCGGTGCCCTCATCGTGACGGTGATGATC


mutant OsLsi1 G89V

OsLsi1-

G89V-R R

CACGATGAGGACACCGGCGATCG

ACTGTCCCAGC


mutant OsLsi1 G89V

EaLsi1G7

1A-F F

AGCAGCTTCTGCCTTGGCGGTCAT

GATGATAATTC


mutant EaLsi1 G71A

EaLsi1G7

1A-R R

TGACCGCCAAGGCAGAAGCTGCT

GCTAAACCAAATG


mutant EaLsi1 G71A

F-EaLsi1-

S70T F

AGCAGCAGCTACTGGCTTGGCGG

TCATGATGATAA


mutant EaLsi1 S70T

R-EaLsi1-

S70T R

CCGCCAAGCCAGTAGCTGCTGCT

AAACCAAATGAGC


mutant EaLsi1 S70T

F-EaLsi1-

S70G F

TAGCAGCAGCTGGTGGCTTGGCG

GTCATGATGATAA


mutant EaLsi1 S70G

R-EaLsi1-

S70G R

ACCGCCAAGCCACCAGCTGCTGC

TAAACCAAATGAG


mutant EaLsi1 S70G

Préparation de l’ARNc

À partir des cellules compétentes E. coli TOP 10 préalablement transformées avec les

différentes constructions et entreposées à -80°C, une culture bactérienne fraîche a été faite.

Les plasmides ont été récupérés en utilisant le kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). La

26

linéarisation des plasmides contenant le gène d’intérêt a été faite par une digestion avec

l’enzyme SphI. Les produits de digestion ont ensuite été purifiés avec le kit QIAquick PCR

purification (QIAGEN). L’ADN linéaire purifié de chaque construction a été transcrit in vitro

pour obtenir l’ARN complémentaire (ARNc) en utilisant le kit mMESSAGE mMACHINE

T7 ULTRA (Thermo Fisher Scientific). L’ARN complémentaire a finalement été précipité

au phénol-chloroforme et ensuite solubilisé dans l’eau ultra-pure.

Préparation des oocytes et micro-injection

Les oocytes de Xenopus laevis ont été récupérés à leur stade 5 ou 6 grâce à une chirurgie de

la grenouille et transférés dans une solution saline de Barth (voir annexe 1). Un traitement

des oocytes a ensuite été fait avec une solution de 0,1 % de collagénase pendant 1,5 h pour

digérer le collagène retenant les oocytes ensemble. Puis, les oocytes ont été nettoyés 5 fois

avec une solution de Barth sans collagénase et triés pour ne sélectionner que ceux de même

taille et en bonne santé. Ils ont ensuite été incubés 24 h dans la solution de Barth à 18°C. Les

oocytes sélectionnés ont été injectés de 25 nL/oocyte d’ARNc d’une construction à 2 μg/μL

en utilisant l’injecteur Nanoject II. Comme témoin négatif, des oocytes ont été injectés de 25

nL/oocyte d’eau MilliQ RNa-free. Finalement, les oocytes ont été incubés à 18°C pendant

24 h dans la solution de Barth (MBS: 88 mM NaCl, 15 mM HEPES, 2.4 mM NaHCO3, 1

mM KCl, 0.82 mM MgSO4, 0.41 mM CaCl2, 0.33 mM Ca(NO3)2∙4H2O, pH 7.4) contenant

de la pénicilline/streptomycine à 100 μM. Ces oocytes ont été utilisés pour le test d’influx du

Si.

Test d’activité de transport en influx du Si par expression hétérologue chez les oocytes de

Xenopus laevis

Les oocytes préalablement injectés selon la méthode présentée (10 oocytes/réplica) ont été

incubés dans la solution MBS supplémentée en Si 2 mM (Carpentier et al., 2016) pour 10 et

30 minutes à la température ambiante. Les oocytes ont ensuite été nettoyés trois fois dans

une solution à 4°C de 0,32 M sucrose et 5 mM HEPES (pH 7,4). Après les lavages, 25 μL

d’acide nitrique concentré ont été ajoutés à chaque réplica de 10 oocytes puis ces derniers

ont été mis à sécher à 82°C pendant 5 heures. Après l’étape de dégradation des oocytes par

l’acide nitrique, 100μl d’eau milliQ a été ajouté à chaque culot obtenu, puis les tubes ont été

vortexés et centrifugés à 14 500 g pendant 10 minutes. La concentration en Si intracellulaire

27

a ensuite été mesurée dans 10 μL de surnageant avec le spectromètre par absorption Zeeman

atomic AA240Z (Varian) équipé d’un tube atomiseur de graphite Zeeman GTA120. La

courbe standard a été obtenue en utilisant une solution 1000 ppm d’hexafluorosilicate

d’ammonium (Thermo Fisher Scientific). Les données ont été analysées avec le logiciel

SpectrA (Varian). Pour la présentation des résultats, les données ont été exprimées en

moyenne ± erreur-type (SE) provenant de quatre expériences indépendantes contenant

minimalement quatre réplicas.

Ajout d’un tag aux protéines

L’ajout de l’épitope Myc en C-terminal à chacune des constructions OsLsi1WT,G88A,G89V et

EaLsi1WT,S70G,S70T,G71A a été fait pour effectuer une analyse par immunofluorescence. L’ajout

du tag cMyc a été réalisé par amplification de OsLsi1 et EaLsi1 avec des amorces

spécifiquement créées afin d’introduire la séquence du tag Myc en C-terminal avant le codon

stop, en plus d’ajouter les sites de restriction permettant l’insertion dans le plasmide. Une

double digestion du plasmide BamHI/XbaI chez les constructions OsLsi1 et BamHI/HindIII

chez les EaLsi1 a été effectuée afin de permettre l’insertion du gène. Après la ligation du

gène étiqueté dans le plasmide Pol1, une transformation a été faite chez les cellules

compétentes E. coli TOP10 et les plasmides ont été récupérés en utilisant le kit QIAprep Spin

Miniprep (QIAGEN). Les séquences de chacune des constructions ont été confirmées par

séquençage.

Tableau 3 Amorces utilisées pour insérer l'épitope Myc dans les gènes Lsi1

Nom de

l’amorce Direction Séquence Commentaires

OsLsi1-

MycStop-F F

AGTCGGATCCGAATTCATGGCCAGCA

ACAACTCGAG

Pour amplifier

OsLsi1 et ajouter une

séquence tag Myc tag

OsLsi1-

MycStop-R R

CAGTTCTAGATCACAGATCCTCTTCTG

AGATGAGTTTTTGTTCCACTTGGATGT

TCTCCATCTCG

Pour amplifier

OsLsi1 et ajouter une


EaLsi1-

MycStop-F F

AGTCGGATCCGAATTCATGACGAAAG

GGGAGATATC

Pour amplifier

EaLsi1 et ajouter une


EaLsi1-

MycStop-R-

bon

R

AGTCAAGCTTTCACAGATCCTCTTCTG

AGATGAGTTTTTGTTCAGTGCTTTCAT

CTTCTAGTTTGAG

Pour amplifier

EaLsi1 et ajouter une


28

Immunofluorescence

Les oocytes ont d’abord été injectés de 25 nL/oocyte d’ARNc d’une construction à 2 μg/μL

en utilisant l’injecteur Nanoject II et incubés à 18°C pour 24h dans la solution de Barth.

Après l’incubation, les oocytes ont été transférés dans des cupules contenant de l’O.C.T.,

gelés à l’azote liquide et transférés sur glace sèche. Les oocytes ont été cryo-sectionnés à une

épaisseur de 10 μm à l’aide d’un microtome-cryostat ajusté à -18°C pour obtenir des coupes

immédiatement déposées sur des lames à 37°C pour y être séchées.

Pour l’immunofluorescence, les coupes ont d’abord été fixées sur les lames durant 30 minutes

dans une solution de paraformaldéhyde 4 % à température ambiante (RT). La

perméabilisation des lames a par la suite été faite dans une solution tampon Perm (0,3 %

Triton, 1 % BSA, 98,7 % PBS 1X) durant 15 minutes à RT. Puis, le blocage des protéines a

été fait par l’incubation pendant 30 minutes à température ambiante avec la solution de

blocage (1 mL de sérum de chèvre, 1 mL de BSA 10 %. 1 mL de PBS 10X, 7 mL H2O).

L’incubation avec l’anticorps primaire Myc a alors été réalisé pendant 1h à RT. Les lames

témoins ont été laissées dans le tampon de blocage sans anticorps primaire. L’anticorps

secondaire anti-mouse Alexa 488 a ensuite été ajouté pour une incubation de 60 min à RT à

la noirceur. La visualisation et la photographie des lames ont été réalisées avec un microscope

confocal à 20X, à une longueur d’ondes de 488 nm et une puissance de 0,3 %.

Test de perméabilité à l’eau

La perméabilité à l’eau des transporteurs Lsi1 et leurs mutants a été déterminée en suivant le

protocole décrit par Beitz et al. (2006). Après l’injection de l’ARNc et l’incubation

préalablement décrite, les oocytes ont été incubés dans l’eau milliQ durant 180 sec. Durant

cette période, les cellules ont été photographiées toutes les 6 sec sous un champ lumineux à

l’aide d’un microscope à fluorescence par réflexion totale interne (Nikon TIRF).

L’acquisition des images et leur analyse ont été réalisées avec le logiciel NIS-Element 4.0

afin de mesurer l’aire (A) de chaque oocyte. À partir des valeurs d’aire obtenues, le volume

(V) des oocytes a été calculé V = (4/3) × A × (A/π)1/2. Puis, un rapport V/V0 a été calculé

où V = volume final, V0 = volume initial.

29

Résultats

Activité de transport en influx du Si chez les mutants de OsLsi1 dans les

oocytes de Xenopus

L’activité de transport du Si en influx du transporteur OsLsi1 ayant une mutation à la

première position du filtre (OsLsi1 G88A) ou une mutation à la position du G conservé

(OsLsi1 G89V) a été testée. Une quantité significativement plus faible de Si absorbé a été

observée chez le témoin négatif (oocytes injectés à l’eau) comparativement au témoin positif

OsLsi1 WT (Figure 1). Par ailleurs, la glycine substituée par l’alanine à la première position

du filtre (OsLsi1 G88A) n’a pas affecté significativement le transport du Si comparativement

au témoin positif OsLsi1 sans mutation (OsLsi1 WT). L’aquaporine OsLsi1 est demeurée

fonctionnelle avec une mutation à la position 88. En ce qui a trait au mutant du G conservé

(OsLsi1 G89V), un transport de Si semblable au témoin négatif a été détecté en présence de

cette mutation. Une différence d’absorption en Si d’environ 80 % a été remarquée entre

OsLsi1 sauvage et le mutant G89V. Puisque l'absorption de Si chez le mutant a été égale à

celle observée avec le témoin négatif, une substitution G/V à la position 89 chez OsLsi1

suggère une perte complète d'activité. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les temps

d’incubation dans le Si de 10 minutes ou 30 minutes

.

30

Activité de transport en influx du Si chez les mutants de EaLsi1 dans les

oocytes de Xenopus

L’activité de transport du Si en influx du transporteur EaLsi1 ayant une mutation à la

première position du filtre (EaLsi1 S70G/S70T) ou une mutation à la position du G conservé

(EaLsi1 G71A) a été testée (Figure 2). Une quantité significativement plus faible de Si

absorbé a été observée chez le témoin négatif (oocytes injectés à l’eau) comparativement aux

témoins positifs (OsLsi1 WT et EaLsi1 WT). Contrairement à OsLsi1, une mutation de la

première position du filtre chez EaLsi1 a affecté le transport du Si. De fait, le taux

d’absorption du Si des mutants EaLsi1 S70G et S70T a été semblable au témoin négatif.

L’aquaporine EaLsi1 a perdu sa perméabilité au Si suite à une mutation à la position 70. Pour

ce qui est du mutant du G conservé (EaLsi1 G71A), un taux d’absorption en Si similaire au

témoin négatif a été mesuré. Les mêmes conclusions ont été obtenues pour les temps

d’incubation dans le Si de 10 min ou 30 min.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

H20 OsLsi1 WT OsLsi1 G88A OsLsi1 G89V

Conte

nu e

n S

i (n

mol/

oocy

te)

t = 10 min

t = 30 min

Figure 1 Activité en influx des transporteurs OsLsi1 et de ses mutants mesurée chez les

oocytes de Xenopus laevis. L'absorption en Si a été mesurée dans le temps dans les oocytes

de X. laevis injectés à l'eau (témoin) ou avec l'ARNc du riz (OsLsi1 WT) et de ses mutants

(OsLsi1 G88A et OsLsi1 G89V). Avant le dosage, les oocytes ont été incubés pendant 10 ou

30 min dans la solution MBS enrichie de Si 2 mM. Les valeurs présentées sont les moyennes

± erreur-type (SE) (n = 4)

31

Figure 2 Activité en influx des transporteurs EaLsi1 et de ses mutants mesurée chez les


de X. laevis injectés à l'eau pour le témoin négatif, avec l’ARNc de OsLsi1 WT pour le témoin

positif ou avec l'ARNc du transporteur EaLsi1 WT et ses mutants (EaLsi1 G71A, EaLsi1

S70G, EaLsi1 S70T). Avant le dosage, les oocytes ont été incubés pendant 10 ou 30 min dans

la solution MBS enrichie de Si 2 mM. Les valeurs présentées sont les moyennes ± erreur-

type (SE) (n = 4)

Immunofluorescence

Les tests de localisation des transporteurs OsLsi1, EaLsi1 et de leurs mutants étiquetés avec

l’épitope Myc en C-terminal ont été réalisés afin d’évaluer leur expression. Les oocytes,

ayant été préalablement injectés avec l’ARNc d’une construction, ont ensuite été cryo-

sectionnés. Les aquaporines Lsi1 ont été détectées grâce aux traitements avec l’anticorps

primaire Myc et l’anticorps secondaire anti-mouse Alexa 488. Les résultats

d’immunofluorescence ont démontré que le transporteur OsLsi1 et ses mutants G88A et

G89V étaient bel et bien présents à la surface des cellules (Figure 3). À l’inverse, le

transporteur EaLsi1 de type sauvage ne semble pas être exprimé spécifiquement à la

membrane mais plutôt uniformément dans la cellule. Pour ce qui est du mutant G71A, il ne

semble pas être exprimé dans les oocytes puisque le résultat est semblable au traitement

témoin.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

H2O OsLsi1 WT EaLsi1 WT EaLsi1

G71A

EaLsi1

S70G

EaLsi1 S70T

Conte

nu e

n S

i (n

mol/

oocy

te) t = 10 min

t = 30 min

32

Figure 3 Localisation des aquaporines et leurs mutants par immunofluorescence. Les oocytes

injectés à l’eau ont été utilisés comme témoin négatif (A). L’aquaporine OsLsi1 de type

sauvage est constatée à la membrane des oocytes (B). Le mutant OsLsi1 G88A est également

largement présent à la membrane (C), de même que le mutant du G conservé OsLsi1 G89V

(D). Pour le EaLsi1 de type sauvage (E), la localisation est plutôt uniforme dans la cellule.

Le mutant du G conservé EaLsi1 G71A (F) ne montre aucun signe d’expression dans la

cellule.

Un test d’influx des transporteurs OsLsi1, EaLsi1 et de leurs mutants étiquetés avec l’épitope

Myc en C-terminal a été réalisé afin de s’assurer que la présence du tag n’affectait pas

l’activité de transport du Si. Les résultats présentés à la Figure 4 indiquent que l’ensemble

des constructions étiquetées ont permis un transport de Si similaire aux gènes non étiquetés

obtenus précédemment.

33

Test de perméabilité à l’eau

Un test pour évaluer le transport de l’eau des aquaporines OsLsi1, EaLsi1 et leurs mutants a

été effectué. Le témoin négatif était représenté par des oocytes injectés à l’eau milliQ, tandis

que le témoin positif correspondait à l’aquaporine humaine AQP7, une aquaporine connue

pour permettre un transport de l’eau (Sohara et al., 2005). Une légère augmentation du

volume des oocytes du traitement OsLsi1 WT comparativement au témoin négatif a été

observée, mais cette augmentation était significativement inférieure au témoin positif AQP7.

La mutation du G conservé (OsLsi1 G89V) chez OsLsi1 a occasionné un arrêt du transport

de l’eau par l’aquaporine, ce qui a produit une augmentation du volume des oocytes

comparable à celle observée chez le témoin négatif. Un transport de l’eau similaire au témoin

négatif a également été observé pour l’aquaporine EaLsi1 WT et son mutant du G conservé

(EaLsi1 G71A).

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

H20 OsLsi1

WT Myc

OsLsi1

G88A

Myc

OsLsi1

G89V

Myc

EaLsi1

WT Myc

EaLsi1

G71A

Myc

EaLsi1

S70G

Myc

EaLsi1

S70T

Conte

nu e

n S

i (n

mol/

oocy

te)

t = 10 min

t = 30 min

Figure 4 Activité en influx des transporteurs de silicium (Si) contenant un tag Myc chez les


de X. laevis injectés à l'eau (témoin négatif) ou avec l'ARNc du riz (OsLsi1 WT Myc), des

mutants du riz (OsLsi1 G88A Myc et OsLsi1 G89V Myc), de la prêle (EaLsi1 WT Myc) et

de ses mutants (EaLsi1 G71A Myc, EaLsi1 S70G Myc et EaLsi1 S70T Myc). Avant le

dosage, les oocytes ont été incubés pendant 10 ou 30 min dans la solution MBS enrichie de

Si 2 mM. Les valeurs présentées sont les moyennes ± erreur-type (SE) (n = 4)

34

Figure 5 Test de perméabilité à l’eau chez différentes aquaporines. Pendant l’incubation des

oocytes exprimant les différents transporteurs Lsi1 dans l’eau milliQ, les oocytes ont été

photographiés pour mesurer leur volume. La perméabilité à l’eau a été mesurée dans les

oocytes de Xenopus laevis injectés à l'eau (témoin négatif) ou avec l'ARNc du riz (OsLsi1

WT Myc), le mutant du G conservé du riz (OsLsi1 G89V Myc), de la prêle (EaLsi1 WT

Myc), le mutant du G conservé de la prêle (EaLsi1 G71A Myc) ainsi que l’aquaporine

humaine AQP7 comme témoin positif. Les valeurs présentées sont les moyennes du rapport

du volume final (V0) sur le volume initial (V) de quatre expériences ± erreur-type (SE) (n =

4) dont chaque expérience contenait 5 oocytes par traitement.

Discussion

Les effets bénéfiques du Si chez les plantes ont incité à trouver des moyens pour bénéficier

de ces effets en agriculture. Malgré la découverte des transporteurs de Si, les mécanismes

moléculaires expliquant l’absorption efficace du Si demeurent encore peu compris. L’étude

présente visait à mieux définir les paramètres moléculaires impliqués dans la fonctionnalité

et la perméabilité du Si du transporteur d’influx Lsi1. La signature GSGR du filtre sélectif

constitue aujourd’hui le critère majeur quant à la sélectivité du Si des NIPIII (Coskun et al.,

2019). Les résidus G-S permettent la formation d’une constriction plus large, facilitant ainsi

le passage de l’acide silicique (4.38 Å) (Hove et Bhave, 2011). Pourtant, plusieurs espèces

présentent un filtre de type ASGR, comme Vigna radiata et Phaseolus vulgaris (Trembath-

Reichert et al., 2015). Dans ce projet, nous avons tenté de redéfinir la première position du

filtre ar/R impliquée dans le passage sélectif du Si chez les transporteurs Lsi1.

1

1,02

1,04

1,06

1,08

1,1

1,12

1,14

1,16

1,18

H20 OsLsil1 WT OsLsil1

G89V

EaLsil1 WT EaLsil1

G71A

AQP7

V/V

0

35

Une étude par mutagénèse a été effectuée afin de mesurer l’impact des mutations sur la

fonctionnalité des transporteurs de Si. Le transporteur de Si du riz (OsLsi1), composé d’un

filtre ar/R de type GSGR, et le transporteur NIPII de la prêle (EaLsi1), formé d’un filtre

STAR, sont les deux espèces fortement accumulatrices qui ont servi de modèles pour l’étude

de mutagenèse. Le transport du Si des mutants a été mesuré par expression hétérologue chez

des oocytes de Xenopus laevis. Une substitution de l’acide aminé à la première position du

filtre ou une substitution à la position adjacente, appelée « G conservé », ont été les mutations

étudiées. Les résultats obtenus chez OsLsi1 ont présenté une perte de fonctionnalité majeure

du transporteur lors d’une mutation du G conservé (OsLsi1 G89V). À l’inverse, aucun impact

d’une mutation à la première position du filtre sélectif (OsLsi1 G88A) n’a été mesuré. Chez

EaLsi1, les substitutions de la sérine vers la glycine ou la thréonine à la première position du

filtre (EaLsi1 S70G/S70T) ainsi que la mutation du G conservé en alanine ont toutes entrainé

une faible accumulation en Si. Les tests d’immunofluorescence démontrent que les mutations

G88A et G89V chez OsLsi1 n’ont pas affecté l’expression membranaire de la protéine, mais

uniquement le transport du Si. À l’inverse, la mutation G71A chez EaLsi1 a semblé affecter

l’expression du transporteur puisqu’aucune fluorescence n’a été remarquée.

Dans un récent article, Kirscht, Kaptan et al. (2016) ont révélé la présence d’un cinquième

acide aminé dans le filtre sélectif ar/R de toutes les aquaporines appartenant spécifiquement

à la famille des Tonoplast Intrinsic Proteins (TIPs). Cette cinquième position n’est cependant

pas conservée au sein des autres familles d’aquaporines. Cela suggère qu’il peut exister de la

variabilité au niveau du filtre ar/R entre les familles et sous-familles d’aquaporines. De ce

fait, il est possible que la première position du filtre des NIPIII se différencie des autres

familles. À la lumière des résultats obtenus, il semble que la première position actuelle du

filtre sélectif est moins impliquée dans la sélectivité du Si que la position adjacente. En effet,

une mutation G/V de la position 89 chez OsLsi1 a grandement affecté la perméabilité au Si

du canal, contrairement à la mutation G/A de la position 88 qui n’a entrainé aucun

changement d’activité de transport. Cela suggère que la position 88 chez OsLsi1 ne participe

pas à la perméabilité du Si. Préalablement à ce projet, des tests similaires ont également été

réalisés chez plusieurs espèces possédant un filtre sélectif ASGR et les résultats ont été

comparables (résultats non publiés). De plus, les résultats obtenus par Mitani et al. (2011)

apportent une confirmation supplémentaire quant à l’effet de la mutation G88A. Tout comme

36

nos résultats, ils révèlent qu’une mutation G/A de la première position du filtre chez OsLsi1

n’a pas affecté le transport du Si. D’après notre étude, la première position n’est pas critique

dans le transport du Si et ne fait donc pas partie intégrante du filtre sélectif des transporteurs

Lsi1. À l’inverse, la position adjacente est un résidu clé impliqué dans la sélectivité du Si

chez les aquaporines Lsi1. Selon des analyses préalables de centaines d’alignement

d’aquaporines NIPIII, il semblerait d’autant plus qu’un changement de la première position

du filtre ar/R à la position adjacente du G conservé rendrait plus uniforme ce filtre chez

l’ensemble des monocotylédones. Ces résultats vont à l’encontre de la signature moléculaire

des NIPIII suggérée par Ma et al. (2006). Nos résultats suggèrent donc une redéfinition du

mécanisme moléculaire d’absorption du Si et de la composition du filtre sélectif ar/R des

transporteurs NIPIII.

Puisque la prêle est une plante ancestrale et que le transporteur EaLsi1 fait plutôt partie de la

sous-famille d’aquaporines NIPII, il est possible que les résidus clés impliqués dans la

perméabilité se différencient des aquaporines NIPIII (Grégoire et al., 2012). Les résultats

contradictoires entre OsLsi1 et EaLsi1 quant à l’effet engendré par la mutation de la première

position du filtre pourraient être expliqués par une variation entre le filtre ar/R des

aquaporines NIPII comparativement aux NIPIII. L’arrêt du transport en Si lors d’une

mutation de la position 70 (EaLsi1 S70G et EaLsi1 S70T) pourrait donc être lié à cette

classification différente. Cette différence évolutive du transporteur de Si chez la prêle

pourrait également justifier l’expression uniforme de ce transporteur dans la cellule (Figure

3) puisqu’il a été démontré que plusieurs NIPs ont une localisation intracellulaire

principalement au niveau du réticulum endoplasmique, qui est retrouvée de façon uniforme

dans la cellule (Wudick et al., 2009). Dans le cas des mutations à la position 70, il est

également plausible qu’une substitution de l’acide aminé sérine ait modifié la configuration

de la protéine puisqu’il s’agit d’un changement chimique plus complexe. L’acide aminé

thréonine, très semblable à la sérine autant au niveau des caractéristiques de la chaine latérale

que de la polarité, a pourtant engendré les mêmes effets sur le transport du Si que la

substitution par la glycine. Le score Grantham indique également une très forte similarité

entre la sérine, la glycine et la thréonine (Grantham, 1974). Les résultats suggèrent donc que

la sérine à la position 70 chez EaLsi1 est critique pour la sélectivité du Si. Cependant, des

études d’expression seraient nécessaires pour appuyer cette hypothèse. Pour ce qui est de la

37

mutation du G conservé chez EaLsi1 ayant occasionné un arrêt du transport du Si, il n’est

pas possible de conclure que cette position est spécifiquement impliquée dans la sélectivité

du Si puisque les tests par immunofluorescence indiquent une absence d’expression. La

mutation G71A entraine possiblement un arrêt de l’expression protéique chez les NIPII.

Ainsi, nos résultats n’ont pas remis en question la signature moléculaire de type STAR du

filtre ar/R chez les transporteurs de Si des plantes ancestrales. Des études supplémentaires

sont nécessaires chez les NIPII de ces plantes primitives.

La faible capacité de l’aquaporine OsLsi1 à transporter l’eau (Figure 5), ainsi que l’arrêt

complet de ce faible transport chez le mutant G89V démontrent que le G conservé est

impliqué dans la perméabilité des molécules. Ce faible flux d’eau permis par l’aquaporine

OsLsi1 WT est cependant loin d’être aussi important que le transport de Si mesuré dans les

tests d’influx. Cela suggère que le passage du Si au travers du transporteur n’est pas

simplement lié au flux de l’eau comme le proposent Exley et Guerriero (2019). En plus des

résultats présentés dans ce mémoire qui montrent l’influence des mutations sur la

perméabilité du transporteur, de nombreuses études prouvent également l’implication du

Lsi1 dans le transport spécifique du Si (Coskun et al., 2019; Ma et al., 2001).

En conclusion, ce travail met en lumière le fait qu’un changement de la première position du

filtre sélectif ar/R soit valable uniquement chez les transporteurs de Si des plantes

supérieures, appartenant aux NIPIII. Ces mêmes conclusions ne peuvent être émises pour les

transporteurs de Si des plantes ancestrales. Ce projet a ainsi mené à une meilleure

compréhension des facteurs moléculaires impliqués dans la perméabilité du Si. Cette avancée

permettra de moduler de manière plus précise le passage de cet élément chez les plantes afin

de générer des cultures ayant une absorption en Si plus efficace. Ces nouvelles connaissances

pourraient éventuellement mener à de nouvelles applications en agriculture, puisque ces

transporteurs ont le potentiel d’être exprimés dans des cultures d’importance qui n’absorbent

pas cet élément et ainsi améliorer la résistance aux divers stress. Cette approche s’inscrirait

bien dans une optique de réduction planétaire d’utilisation de pesticides.

38

Chapitre 3 : Étude de l’accumulation en silicium et de la

résistance à Leptosphaeria maculans chez Brassica napus

génétiquement modifié avec le gène Lsi1

39

Introduction

L’importance du silicium (Si) chez les plantes a depuis plusieurs décennies été rapportée.

Retrouvé en très grandes quantités dans l’environnement, le Si n’est cependant par considéré

comme un élément essentiel pour les plantes. Il se retrouve disponible pour les plantes sous

la forme d’acide silicique (Si(OH)4) et peut être absorbé par les racines à des pH inférieurs à

9 (Ma et al., 2001). Cette molécule se caractérise par une solubilité dans l’eau jusqu’à 2 mM

à 25°C et une polymérisation sous forme de gel à des concentrations supérieures (Takahashi,

1978). Dans la solution du sol, l’acide silicique se retrouve généralement à des concentrations

allant de 0,1 à 0,6 mM (Ma et al., 2001). Après l’absorption du Si dans les racines, la molécule

atteint le xylème et est transportée dans les parties aériennes pour y être déposée sous forme

de silice amorphe ou de gel de silice (SiO2 + nH20). Le Si est un élément peu mobile, ce qui

explique son accumulation principalement dans les tissus âgés de la plante (Ma et Yamaji,

2006).

Parmi les effets bénéfiques du Si chez les plantes, on remarque principalement une meilleure

résistance à divers stress abiotiques et biotiques (Coskun et al., 2019). On rapporte que le Si

favorise une meilleure tolérance à la toxicité des métaux, aux stress hydriques et salins. De

même, l’élément améliore la résistance des plantes exposées aux basses températures, aux

déséquilibres nutritifs, aux extrêmes de température et aux radiations UV. Toutefois la

majorité des effets observés du Si sont associés à une meilleure défense contre les stress

biotiques. C’est particulièrement au niveau des infections fongiques que le rôle

prophylactique de cet élément se fait remarquer (Fauteux et al., 2005). Les études rapportent

que les champignons biotrophes et hémibiotrophes sont les organismes les plus réprimés par

le Si chez les plantes. Les effets du Si présentent deux particularités bien reconnues

aujourd’hui. Dans un premier temps, seules les plantes ayant la capacité d’accumuler

l’élément peuvent en bénéficier. D’autre part, ses effets bénéfiques sont observés seulement

en conditions de stress.

Bien que le Si soit généralement abondant dans les sols, sa proportion dans les tissus des

plantes terrestres varie entre 0,1 et 10 % du poids sec (Liang et al., 2015). En réalité, les

plantes n’ont pas toutes la capacité d’absorber le Si en grande quantité, ce qui explique

pourquoi elles sont catégorisées selon leur teneur en cet été élément. On retrouve les faibles

40

accumulateurs (< 0,5 %), les accumulateurs intermédiaires (0,5 % - 1,5 %), et les forts

accumulateurs (˃ 1,5 % du poids sec) (Hodson et al., 2005). Cette variabilité d’absorption

est aujourd’hui expliquée par la présence de transporteurs de Si au niveau des cellules

racinaires, appelés Lsi1 et Lsi2 (Ma et al., 2006; Ma et al., 2007). Le transporteur Lsi1 est

une aquaporine membranaire qui permet l’entrée en influx du Si de la solution du sol dans

les cellules racinaires. Sa présence explique en grande partie la forte accumulation de Si

possible chez les plantes. Les Poacées rassemblent plusieurs espèces porteuses du gène Lsi1

et, de ce fait, sont de fortes accumulatrices de Si. À l’inverse, les espèces de la famille des

Brassicaceae comme Arabidopsis thaliana et Brassica napus figurent parmi les faibles

accumulateurs et ne possèdent pas de gène Lsi1.

Des études réalisées chez Arabidopsis thaliana transformé génétiquement avec le gène

d’absorption du Si Lsi1 ont révélé que l’ajout de ce transporteur permettait à la plante de

bénéficier des effets du Si (Vivancos et al., 2015). Ces auteurs ont en effet démontré que la

présence du gène TaLsi1 chez Arabidopsis contribuait à une meilleure résistance au blanc

poudreux. Il semblerait, par conséquent, que les effets du Si sont universels et que la capacité

d’absorption de l’élément dans les tissus est le principal facteur limitant les plantes à en

profiter. Il s’avère donc envisageable de générer des plants plus résistants aux stress grâce à

l’insertion du gène Lsi1.

Dans ce présent projet, nous nous intéressons à mesurer l’effet du Si chez le canola (Brassica

napus L.) transformé avec le gène Lsi1. Étant donné que cette culture est largement répandue

au Canada et qu’elle fait aujourd’hui face à plusieurs difficultés, incluant la présence de

maladies, il paraît primordial de trouver de nouvelles méthodes pour lutter contre les stress

qu’elle subit. Sachant qu’Arabidopsis fait partie de la même famille que le canola, une

transformation avec le gène Lsi1 permettrait potentiellement d’améliorer sa capacité à lutter

contre divers agents pathogènes. Nous posons donc la première hypothèse que le canola

transformé avec Lsi1 accumule des quantités supérieures de Si dans ses parties aériennes

comparativement au canola non transformé. En seconde partie, nous posons l’hypothèse que

les plants de canola transformés avec Lsi1 sont plus tolérants au champignon hémibiotrophe

Leptosphaeria maculans Desm. Cet organisme est l’agent pathogène engendrant les pertes

économiques les plus importantes dans la culture de canola au Canada. L’objectif de cette

41

présente étude est de démontrer que les effets du Si chez les plantes sont universels et qu’ils

dépendent uniquement de la capacité des plantes à absorber l’élément. L’objectif sous-jacent

vise à démontrer que les plants de canola génétiquement modifiés avec le gène Lsi1

bénéficient d’apports supérieurs en Si. Le taux de Si dans les parties aériennes a été mesuré

chez les plants transformés et non transformés préalablement fertilisés au Si ou non afin de

mesurer leur capacité relative à accumuler l’élément. Les plants de canola transformés ont

ensuite été inoculés avec L. maculans en plus de la fertilisation en Si pour évaluer leur

résistance au stress.

Matériels et méthodes

Production des plants de canola transgéniques

L’espèce modèle Brassica napus (canola), une plante faiblement accumulatrice de Si, a été

transformée avec un des deux homologues de Lsi1 à l’étude afin de permettre l’absorption

de Si. Certains plants de canola de la variété Westar ont subi une transgénèse de manière à

introduire le gène VaNIP2-1 (VaLsi1), un transporteur de Si provenant de Vigna angularis,

et d’autres le gène CaNIP2-1 (CaLsi1), un transporteur de Si provenant de Cicer arietinum.

Le vecteur pCAMBIA-1302 a été utilisé pour la transformation. La présence du promoteur

constitutif CaMV 35S dans la construction a permis de réguler l’expression du gène Lsi1. Le

marqueur de sélection bactérien utilisé a été la kanamycine, tandis que le marqueur de

sélection végétal a été l’hygromycine. Agrobacterium tumefaciens GV3101 comportant la

construction 35S::VaNIP2-1 ou 35S ::CaNIP2-1 a été utilisé pour faire la transformation du

canola. Les transformants (T0) ont été régénérés et sélectionnés par une germination sur un

milieu contenant l’hygromycine comme agent de sélection. Les plants résistants à

l’hygromycine ont été transférés dans des pots contenant du terreau et laissés pousser en serre

sous conditions contrôlées. La présence du transgène VaLsi1 ou CaLsi1 a par la suite été

vérifiée par amplification PCR en utilisant les amorces spécifiques à ces gènes (Tableau 4).

Une fois la floraison et la maturation des siliques, les graines T1 de chaque plant ont été

récoltées individuellement.

42

Tableau 4 Amorces utilisées pour détecter le transgène VaNIP2-1 ou CaNIP2-1 chez le

canola transgénique.

Nom de

l’amorce

Direction Séquence Commentaire

VaNIP2-

1-F

F ATGGAAGGTACCAGCCCAAACAC

Pour détecter le gène

VaNIP2;1 dans le canola

transgénique

VaNIP2-

1-R

R TCAAACCAAGCTTCGTTGGTCGG


VaNIP2;1 dans le canola

transgénique

CaNIP2-

1-F

F ATGGACAGAAGAACACACAGTTT


CaNIP2;1 dans le canola

transgénique

CaNIP2-

1-R

R TCACACTGAACATTGATTGTCCT


CaNIP2;1 dans le canola

transgénique

Croissance des plants de canola

Les graines de canola Westar WT, VaLsi1 et CaLsi1 ont d’abord été stérilisées avec 1 %

d’hypochlorite de sodium pendant 5 minutes puis rincées plusieurs fois à l’eau distillée. Les

graines de canola ont ensuite été semées à une profondeur de 1,5-2,0 cm dans la vermiculite

et arrosées à l’eau distillée. La photopériode pour la germination a été de 16h à une

température de 16 °C la nuit et 22°C le jour. Une semaine après le semis, les plantules ont

été transplantées dans des pots individuels de 8 pouces contenant du terreau Promix et

fertilisées avec un engrais 20-20-20. Préalablement à la transplantation, le terreau a été saturé

d’eau Si+/Si- selon les traitements. L’eau Si+ était composée d’eau de pluie, de silicate de

potassium (Kasil®, PQ Corporation) à 1,7 mM et d’hydroxyde de potassium pour corriger le

pH à 6,5. L’eau Si- était composée d’eau de pluie uniquement. Durant toute la croissance des

plants, ils ont été arrosés à l’eau de pluie, fertilisés au 20-20-20 et en Si+/Si- deux fois par

semaine avec un volume égal pour tous les plants. Ce volume variait d’une fertilisation à

l’autre selon l’humidité du terreau (100 mL ou 200 mL). Les conditions de croissance dans

la serre ont été maintenues identiques à celles de la période de germination, c’est-à-dire 16°C

la nuit, 22°C le jour et une photopériode de 16h.

43

Six semaines plus tard, une fois le stade de floraison atteint, une vielle feuille ainsi qu’une

jeune feuille de chaque plant ont été récoltées et lyophilisées. Ces deux feuilles ont été

récoltées sur un total de cinq plants différents par traitement. Une extraction d’ADN de

chaque canola transgénique a également été réalisée, suivie d’une amplification PCR des

gènes VaNIP2-1 et CaNIP2-1 avec des amorces spécifiques selon les échantillons afin de

confirmer la présence du transgène.

Détermination de la concentration en Si dans les feuilles

Afin de déterminer la concentration en Si des tissus végétaux récoltés préalablement, les

échantillons de feuilles préalablement lyophilisées ont été broyées séparément en une poudre

fine avec un broyeur à billes. Des pastilles de 13 mm de diamètre x 5 mm d’épaisseur ont par

la suite été faites grâce à une intense compression de la poudre. Puis, les pastilles ont été

dosées en Si avec le X-ray fluorescence (XRF) (Niton XL3t GOLDD XRF Analyzer, Thermo

Fisher Scientific) selon la procédure de Reidinger et al. (2012).

Préparation de l’inoculum de Leptosphaeria maculans, inoculation des plants et mesure de

la sévérité de la maladie

Des nouvelles cultures de L. maculans ont été préparées sur milieu de culture V8-Agar

contenant 200 ml de V8, 15 g d’agar et 0,75 g de CaCO3. Elles ont ensuite été entreposées à

température ambiante pendant 14 jours pour obtenir des cultures sporulantes. Deux semis du

témoin et de chaque transformant (WT, VaLsi1 et CaLsi1) ont été effectués à une semaine

d’intervalle afin d’obtenir deux lots de plants d’âges distincts. Après la germination, la

transplantation et la fertilisation ont été réalisées de la manière décrite précédemment, les

plants âgés de 6 semaines et de 5 semaines ont été inoculés avec L. maculans. L’inoculation

a été réalisée le même jour pour les deux lots afin d’uniformiser les conditions d’inoculation.

Pour l’inoculation, une légère blessure au niveau du limbe a été faite au scalpel sur les deux

plus vieilles feuilles matures de chaque plant (Huang et al., 2006). Une pastille de mycélium

de L. maculans sur gélose V8 Agar a ensuite été placée sur chaque blessure tête vers le bas

et maintenue collée grâce à un tissu collant de type Hypafix®. Deux jours avant l’inoculation,

les conditions de la serre ont été ajustées à 90 % d’humidité relative, 12°C (nuit) et 24 °C

(jour) afin de favoriser le développement du champignon. Ces conditions ont été maintenues

44

jusqu’à 48h après l’inoculation. Une photopériode de 16 heures a été conservée durant

l’ensemble de l’expérimentation. Les mesures de la sévérité ont été réalisées 14 jours après

l’inoculation en mesurant le diamètre des lésions en afin d’estimer l’étendue des dommages.

Analyses statistiques

Les résultats ont été présentés sous forme de moyennes ± erreur-type (SE). Les différences

entre les moyennes ont été analysées en suivant le test de comparaisons multiples de Tukey

basé sur l’analyse de la variance (ANOVA) et ont été considérées significatives à P < 0,05.

Résultats

Caractérisation des plantes transgéniques

La présence de l’insert VaLsi1 ou CaLsi1 a d’abord été analysée pour l’ensemble des plants

de canola utilisés pour les différents tests. Les résultats d’amplification démontrent que la

majorité des plants de canola T1 possèdent l’insertion. Les plants de canola démontrant une

amplification PCR du gène VaLsi1 ou CaLsi1 (Figure 6 et 7) ont été sélectionnés pour les

expérimentations. L’ensemble de plants de canola transformés avec VaLsi1 ou CaLsi1 sont

respectivement issus d’un seul évènement de transformation.

Figure 6 Gels illustrant les amplifications par PCR de l’insert VaLsi1 chez les différents

plants de canola issus d’une transformation. Les plants de canola fertilisés (Si+) ou non

(Si-) en Si ont été analysés pour confirmer la présence de l’insert. La taille de l’insert VaLsi1

attendue étant de 867 pb, les amplifications illustrées ont permis de sélectionner précisément

les plants possédant le gène d’absorption du Si pour l’expérimentation.

45

Figure 7 Gels illustrant les amplifications par PCR de l’insert CaLsi1 chez les différents

plants de canola issus d’une transformation. Les plants de canola fertilisés (Si+) ou non

(Si-) en Si ont été analysés pour confirmer la présence de l’insert. La taille de l’insert CaLsi1

attendue étant de 822 pb, les amplifications illustrées ont permis de sélectionner précisément

les plants possédant le gène d’absorption du Si pour l’expérimentation.

Accumulation de Si chez le canola transformé avec VaLsi1

L’accumulation en Si des feuilles de plants de canola transformés génétiquement avec le gène

Lsi1 de Vigna angularis (VaLsi1) et fertilisés avec ou sans Si (Si-/Si+) a été mesurée. Une

quantité significativement plus élevée de Si s’est accumulée dans les feuilles de plants

transformés avec VaLsi1 sans fertilisation en Si (VaLsi1 Si-) comparativement aux feuilles

de canola témoin sans transformation et sans fertilisation en Si (WT Si-) (Figure 8). Pour ce

qui est des traitements avec fertilisation en Si (Si+), une accumulation en Si près de 40 %

plus importante a été remarquée chez les plants transformés avec VaLsi1 comparativement

aux plants de canola WT. Pour l’ensemble des plants WT ou transformés, une quantité

supérieure en Si a été principalement observée dans les vieilles feuilles. Une diminution

graduelle du niveau de Si a été mesurée entre les vieilles feuilles, les feuilles centrales et les

jeunes feuilles. En plus d’accumuler plus de Si dans ses tissus comparativement au canola

WT Si- et Si+, le canola transformé avec VaLsi1 et fertilisé en Si a accumulé

significativement plus de Si que son équivalent sans fertilisation en Si. Par, ailleurs, les taux

46

de Si dans les feuilles des plants WT Si+ sont comparables aux taux retrouvés dans les

feuilles des plants VaLsi1 Si-.

Accumulation de Si chez le canola transformé avec CaLsi1

L’accumulation en Si des feuilles de plants de canola transformés génétiquement avec le gène

Lsi1 de Cicer arietinum (CaLsi1) et fertilisés avec ou sans Si (Si-/Si+) a été mesurée. Une

quantité significativement plus élevée de Si a été obtenue dans les feuilles de canola soumis

à un traitement Si+ (WT et CaLsi1 Si) comparativement aux traitements Si- (WT et CaLsi1)

(Figure 9). Cependant, aucune différence significative d’accumulation en Si n’a été

remarquée entre les plants de canola WT Si+ et CaLsi1 Si+ au niveau des vieilles feuilles.

Une quantité supérieure de Si a néanmoins été mesurée dans les jeunes feuilles de plants de

canola CaLsi1 Si+ en comparaison aux jeunes feuilles de plants de canola WT Si+.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

WT Si- WT Si+ VaLsi1 Si- VaLsi1 Si+

Co

nte

nu

en

Si

(mg/g

MS

)

Vieilles feuilles

Feuilles centrales

Jeunes feuilles

Figure 8 Contenu en silicium (Si) des feuilles de plants de canola Westar WT et de plants

transformés avec le gène VaLsi1 fertilisés (Si+) ou non (Si-) avec une solution de Si (1,7

mM). Les mesures du contenu en Si (mg/g MS) ont été réalisées chez les vieilles feuilles, les

feuilles centrales et les jeunes feuilles. Les valeurs représentent les moyennes ± erreur-type

(SE) de cinq réplicas biologiques indépendants.

47

Figure 9 Contenu en Si dans les feuilles chez les plants de canola Westar WT et les plants

transformés avec le gène CaLsi1 fertilisés (Si+) ou non (Si-) avec une solution de Si (1,7

mM). Les mesures du contenu en Si (mg/g MS) ont été réalisées chez les vieilles feuilles et

les jeunes feuilles. Les valeurs représentent les moyennes ± erreur-type (SE) de six réplicas

biologiques indépendants.

Sévérité de la maladie causée par Leptosphaeria maculans chez les plants

de canola transformés avec VaLsi1 ou CaLsi1 et fertilisés en Si.

Après la croissance, la fertilisation en Si et l’inoculation avec Leptosphaeria maculans, la

sévérité de la maladie a été mesurée chez les plants de canola WT et les plants transformés

avec le gène VaLsi1 ou CaLsi1 afin d’évaluer l’effet protecteur du Si chez les plantes.

Quatorze jours après l’inoculation, la sévérité de la maladie a été évaluée en mesurant le

diamètre des lésions aux régions inoculées et en calculant par la suite leur aire (mm2). Pour

les plants inoculés après 6 semaines de croissance, la sévérité de la malade n’a pas été

différente entre les traitements Si+ et Si- autant chez le canola WT, que chez les

transformants VaLsi1 et CaLsi1 (Figure 10. A). Ce même constat a été fait chez les plants

âgés de 5 semaines lors de l’inoculation (Figure 10. B). De plus, la taille des lésions chez les

plants de canola WT et les plants des transformants VaLsi1 et CaLsi1 n’a présenté aucune

différence significative selon le traitement Si, et ce, pour les plants âgés de 5 ou de 6

semaines.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

WT Si- WT Si+ CaLsi1 Si- CaLsi1 Si+

Conte

nu e

n S

i (m

g/g

MS

)Vieilles feuilles

Jeunes feuilles

48

Un aperçu des plants et des lésions pour chaque traitement est présenté à la Figure 11. La

santé des plants est demeurée similaire entre ceux venant de canola WT, VaLsi1 ou CaLsi1,

qu’ils aient été fertilisés en Si ou non. Un flétrissement des vieilles feuilles ainsi qu’une

décoloration foliaire ont été remarqués pour l’ensemble des traitements. Pour ce qui est des

lésions causées par le champignon L. maculans, aucune différence visuelle n’a été identifiée.

Dans tous les cas, le centre des lésions a présenté les symptômes typiques d’une infection par

ce champignon, soit des tissus nécrosés de couleur grise envahis de pycnides ainsi qu’un halo

jaune illustrant une chlorose des tissus environnants. Aucun symptôme de la maladie n’a été

remarqué dans les tissus n’ayant pas subi d’inoculation.

0

50

100

150

200

250

300

350

WT VaLsi1 CaLsi1

Air

e de

la l

ésio

n (

mm

2)

ASi-

Si+

0

50

100

150

200

250

300

350

WT VaLsi1 CaLsi1

Air

e de

la l

ésio

n (

mm

2)

BSi-

Si+

Figure 10 Aire des lésions causées par Leptosphaeria maculans sur les feuilles de plants de

canola Westar WT, de plants transformés avec le gène VaLsi1 ou CaLsi1 fertilisés (Si+) ou

non (Si-) avec une solution de Si (1,7 mM). L’aire (mm2) des lésions a été mesurée sur les

feuilles centrales. Les plants étaient âgés de 6 semaines (A) ou 5 semaines (B) lors de

l’inoculation. Les valeurs représentent les moyennes ± erreur-type (SE) de quatre réplicas


49

Si -

A B

C D

E F

Si +

Figure 11 Lésions causées par Leptosphaeria maculans chez des plants de canola non

transgéniques (WT), transformés avec le gène Lsi1 de Vigna angularis (VaLsi1) ou avec le

gène Lsi1 de Cicer arietinum (CaLsi1) traités ou non avec le silicium (Si). Lésions sur plants

WT Si- (A), WT Si+ (B), VaLsi1 Si- (C), VaLsi1 Si+ (D), CaLsi1 Si- (E) et sur CaLsi1 Si+

(F). L’inoculation a été effectuée sur les vieilles feuilles et la taille des lésions a été mesurée

au point d’inoculation. Les plants représentés étaient âgés de 5 semaines lors de

l’inoculation.

50

Le contenu en Si des plants de canola WT, VaLsi1 et CaLsi1 inoculés avec L. maculans a été

mesuré chez les feuilles centrales. Les taux de Si des plants sans fertilisation au Si ont été

similaires entre les WT, les VaLsi1 et les CaLsi1. À l’inverse, une différence significative a

été remarquée en comparant les niveaux de Si des traitements Si- avec leur équivalent Si+.

De plus, une quantité supérieure de Si a été mesurée chez les plants des transformants VaLsi1

Si+ et CaLsi1 Si+ comparativement aux plants de canola WT Si+. Par ailleurs,

l’accumulation en Si entre les plants des transformants VaLsi1 et CaLsi1, ont été

comparables.

Discussion

Après la transformation du cultivar de canola Westar avec le gène Lsi1 de Vigna angularis

(VaLsi1) ou de Cicer aretinum (CaLsi1), l’accumulation de Si dans les parties aériennes a

été mesurée chez les plants fertilisés ou non en Si (Si+/Si-). Les résultats obtenus ont révélé

que les plants de canola transformés avec le gène VaLsi1 et fertilisé au Si accumulaient près

de 40 % plus de cet élément dans les vieilles feuilles que les plants WT Si+. L’insertion du

gène VaLsi1 chez le canola a donc permis une amélioration de l’absorption de Si dans les

0

0,05

0,1

0,15

0,2

WT VaLsi1 CaLsi1

Conte

nu e

n S

i (m

g/g

MS

) Si-

Si+

Figure 12 Contenu en Si dans les feuilles centrales des plants inoculés avec Leptosphaeria

maculans chez le canola transgénique et non transgénique. Mesures chez les plants de canola

Westar non transgéniques (WT), transformés avec Lsi1 de Vigna angularis (VaLsi1) ou

transformés avec Lsi1 de Cicer arietinum (CaLsi1) et fertilisés (Si+) ou non (Si-) avec une

solution de Si (1,7 mM). Les feuilles mesurées provenaient des plants âgés de 5 semaines lors

de l’inoculation. Les valeurs représentent les moyennes ± erreur-type (SE) de quatre réplicas


51

parties aériennes. Toutefois, les taux d’accumulation du transformant VaLsi1 Si+ n’étaient

pas très élevés, ce qui a maintenu les plants à des niveaux correspondant aux faibles

accumulateurs, soit inférieurs à 0,5 % du poids sec (Hodson et al., 2005). Il semblerait, par

conséquent, que la transformation du canola avec le gène VaLsi1 n’a pas permis d’augmenter

l’accumulation du Si à des niveaux suffisamment importants pour produire de forts

accumulateurs. Une meilleure caractérisation des transformants au niveau du nombre de

copies du transgène et de leur expression permettrait une meilleure compréhension du

phénomène. Pour ce qui est du canola transformé avec le gène Lsi1 de C. arietinum, le taux

de Si obtenu dans les vieilles feuilles n’a pas été significativement différent entre les plants

CaLsi1 et les plants WT, nonobstant leur fertilisation en Si. Une légère augmentation du taux

de Si dans les jeunes feuilles des plants CaLsi1 Si+ comparativement aux plants WT Si+ a

néanmoins été obtenue, bien que cet écart n’ait pas été pas suffisamment important pour

obtenir le titre d’accumulateur intermédiaire. Le Si mesuré dans les tissus des plants Si-

s’explique principalement par la présence continuelle de traces de cet élément dans

l’environnement. En effet, des quantités de Si peuvent même se retrouver dans l’eau distillée

ou déminéralisée (Epstein, 1994).

Pour ce qui est du niveau d’activité des transporteurs VaLsi1 et CaLsi1, des tests d’influx du

Si de ces deux aquaporines, réalisés préalablement à ce projet, indiquent que leur activité de

transport est similaire (données non publiées). Il ne semblerait donc pas qu’une activité de

transport différente soit à l’origine des taux d’accumulation variables mesurés dans les tissus

des deux transformants. De plus, une confirmation par PCR de la présence du transgène a été

réalisée dans chacun des plants transformés afin de démontrer que les plants étudiés étaient

bien porteurs de l’insertion. L’absence de l’insertion ne peut donc pas être en cause dans la

variabilité d’accumulation en Si mesuré dans les tissus de chacun des transformants.

Initialement, les effets bénéfiques du Si ont été décrits uniquement chez les espèces

naturellement accumulatrices. Les bienfaits du Si ont, entre autres, été rapportés chez le riz

(Rodrigues et al., 2003), le concombre (Chérif et al., 1992) et le blé (Bélanger et al., 2003).

En outre, la découverte des transporteurs Lsi1 et Lsi2 en plus du développement des

biotechnologies permettent aujourd’hui l’étude des effets du Si chez l’ensemble des plantes.

Les travaux de Vivancos et al. (2015) ont démontré qu’une transformation d’Arabidopsis

52

avec le gène Lsi1 du blé (TaLsi1) permettait une meilleure tolérance au blanc poudreux chez

les plants fertilisés avec le Si. Il s’agit d’une des études pionnières révélant les bénéfices du

Si chez des plantes originellement non accumulatrices. Considérant la légère augmentation

de Si accumulé chez les transformants de canola VaLsi1 et CaLsi1, nous avons tenté

d’évaluer la résistance des transformants à un stress biotique.

Aucune augmentation de la tolérance à Leptosphaeria maculans, agent responsable de la

jambe noire, n’a cependant été mesurée chez les deux transformants fertilisés en Si. Plusieurs

raisons peuvent expliquer ces résultats. D’abord, les taux de Si accumulés chez les

transformants n’ont pas été suffisamment élevés pour que les plantes puissent en bénéficier.

Effectivement, il est reconnu que l’importance des effets du Si est directement liée au taux

d’accumulation dans la plante (Coskun et al., 2019). Ainsi, plus la plante accumule de Si

dans ses tissus, plus elle en bénéficie. Tel que mentionné précédemment, les niveaux de Si

mesurés chez les plants VaLsi1 Si+ et CaLsi1 Si+ ont été uniquement à la hauteur des faibles

accumulateurs. Or, les bénéfices du Si ont été rapportés uniquement chez les accumulateurs

intermédiaires et les forts accumulateurs (Bélanger et al., 2003; Chérif et al., 1992; Rodrigues

et al., 2003).

La faible augmentation de Si accumulée dans les tissus des transformants peut principalement

s’expliquer par l’absence du transporteur Lsi2. Ce transporteur est responsables du passage

du Si en efflux, faisant sortir l’élément des cellules racinaires vers l’apoplasme et permettant

de charger le xylème (Ma et al., 2007). Il est aujourd’hui reconnu que la présence conjointe

des deux transporteurs Lsi1 et Lsi2 permet une accumulation supérieure de Si dans les parties

aériennes (Ma et Yamaji, 2008). En effet, la localisation polaire entre le Lsi1 et le Lsi2

démontre bien que ces deux transporteurs agissent de manière complémentaire afin de

permettre l’entrée efficace de l’acide silicique dans le xylème. Malgré que l’espèce

Arabidopsis thaliana soit naturellement pourvu d’un gène Lsi2, aucune étude n’a rapporté la

présence de ce deuxième transporteur chez Brassica napus (Deshmukh et al., 2013). Cette

différence moléculaire expliquerait en grande partie la différence entre les résultats obtenus

dans la présente expérience chez le canola comparativement à ceux rapportés par Vivancos

et al. (2015) à la suite d’une transformation d’Arabidopsis avec TaLsi1. Dans cette

expérimentation, la présence unique du transgène Lsi1 en l’absence du gène Lsi2 chez les

53

transformants priverait les plants d’une forte accumulation de Si. Une double transformation

avec les deux transporteurs permettrait possiblement une accumulation suffisante de Si pour

être bénéfique.

La maladie de la jambe noire (blackleg), causée par le champignon hémibiotrophe

Leptosphaeria maculans, est une contrainte importante de la culture de canola. Grâce à la

très faible taille de ses spores sexuées et asexuées, ce champignon a la capacité de pénétrer

via les stomates ou les blessures et ainsi d’initier une infection sur n’importe quelle partie de

la plante. En outre, l’étude de McGee et Petrie (1979) révèle que le canola est plus sensible

à une infection par L. maculans au stade six feuilles qu’aux stades ultérieurs. Dans la plupart

des infections sévères, la maladie est issue d’un inoculum primaire sur les graines ou

provenant des résidus de culture au sol (West et al., 2001). Le champignon à l’étude se

développe donc principalement au stade primaire de la plantule. C’est entre autres pour cette

raison que la méthode d’inoculation du canola par L. maculans la plus répandue proposée par

Chen et al. (2006) est une méthode adaptée pour évaluer la résistance au champignon sur de

jeunes plantules. Or, dans le cas de la présente expérimentation, il a été nécessaire de

développer une méthode d’inoculation sur des plants plus âgés afin de permettre aux plantes

d’accumuler des quantités suffisantes de Si. En effet, une accumulation élevée en Si a

généralement lieu durant les stades supérieurs de croissances des plantes (Ma et al., 2006).

Bien que les mécanismes d’action du Si soient encore peu compris, l’ensemble des études

indiquent qu’il contribue à ralentir la propagation des champignons lorsque l’élément est déjà

présent dans la plante. La première hypothèse indique que la double couche cuticule-SiO2

déposée dans les tissus âgés des parties aériennes ralentirait le processus d’infection par les

agents pathogènes (Ma et Yamaji, 2006). La seconde hypothèse énonce que le Si aurait un

rôle de « primer », c’est-à-dire qu’il ferait office d’activateur du système de défense,

permettant ainsi une réponse plus rapide et efficace aux divers stress (Fawe et al., 1998; Fawe

et al., 2001). Puisque le site de déposition du Si a lieu au même endroit que la cible de

nombreux effecteurs, il est maintenant suggéré que le Si interfèrerait avec les effecteurs

libérés par les agents pathogènes et les empêcherait d’atteindre leur cible (Rasoolizadeh et

al., 2018). Ces différentes hypothèses concernant le mécanisme d’action du Si indiquent

toutes qu’une accumulation tardive de Si après une infection précoce ne permettrait pas à la

54

plante d’être mieux protégée. Considérant la manière dont le Si agit dans les plantes et le

faible développement du champignon L. maculans aux stades plus âgés des plants,

l’utilisation de cet agent pathogène n’est peut-être pas adaptée pour montrer les effets

protecteurs du Si. Par ailleurs, l’insertion de Lsi2 dans les plants permettrait possiblement

une accumulation de Si beaucoup plus élevée et rapide, et éliminerait la contrainte d’attente

pour l’inoculation.

En conclusion, les résultats obtenus n’ont pas permis de tester adéquatement les effets du Si

chez le canola transformé en raison des accumulations trop faibles observées. Pour mieux

évaluer la capacité du Si à protéger le canola contre les infections fongiques, une double

transformation avec les transporteurs Lsi1 et Lsi2 serait nécessaire pour permettre une

accumulation élevée en Si dans les parties aériennes. Les conclusions apportées par cette

étude soulèvent un doute quant à l’existence d’un Lsi2 chez Brassica napus et confirment

l’importance de la présence commune des deux transporteurs pour une accumulation en Si

optimale.

55

Conclusions générales

L’accumulation du Si chez les plantes et les effets qu’il peut engendrer, en particulier contre

divers stress biotiques et abiotiques, font en sorte qu’il est aujourd’hui qualifié d’élément

bénéfique pour la croissance des végétaux (Ma et Yamaji, 2008). L’absence de réponses

expliquant les variations d’absorption chez les plantes a longtemps limité le potentiel

d’utilisation du Si en agriculture. La découverte des gènes Lsi1 et Lsi2, responsables de

l’absorption et du transport du Si chez les plantes, fait naître la possibilité d’améliorer la

capacité d’accumulation de cet élément chez les espèces faiblement accumulatrices (Ma et

al., 2006; Ma et al., 2007). Le transporteur Lsi1, permettant l’entrée du Si en influx dans les

cellules racinaires, est une aquaporine de la famille de Nodulin-26-like intrinsic protein-III

(NIPIII) dont les propriétés de son filtre sélectif ont fait l’objet de la première partie de cette

étude (Ma et al., 2006). Les résidus G-S-G-R du filtre ar/R, de positions précises dans la

séquence protéique, sont actuellement reconnus comme étant le critère moléculaire pour la

sélectivité du Si (Coskun et al., 2019). Or, la présence d’un filtre de type A-S-G-R chez

certaines espèces accumulatrices en plus de la glycine fortement conservée à la position

adjacente à celle de la première position du filtre ont mené à remettre en question les

composantes clés du filtre ar/R des Lsi1. D’après les résultats obtenus dans cette étude,

l’hypothèse énonçant que le filtre sélectif n’est pas basé sur le modèle actuel des résidus G-

S-G-R s’est avérée confirmée. En effet, l’étude du transport en Si chez OsLsi1 révèle qu’une

mutation à la première position du filtre n’entraine aucun changement d’activité. Les résultats

démontrent également qu’une mutation à la position du G conservé engendre un arrêt complet

du transport en Si chez OsLsi1. Ainsi, la position du G conservé est un résidu clé impliqué

dans la sélectivité du Si chez les aquaporines Lsi1, contrairement à la position de la première

glycine du G-S-G-R actuel. Bien que l’effet de la mutation G88A chez OsLsi1 entraînant

aucun changement de fonctionnalité ait déjà été démontré par l’équipe de Mitani et al. (2011),

les résultats obtenus dans ce projet démontrent pour la première fois que la première position

du filtre sélectif initialement établie est erronée. Cette redéfinition des résidus clés impliqués

dans la sélectivité du Si chez les aquaporines Lsi1 permet une meilleure compréhension des

déterminants moléculaires liés à l’absorption en Si.

La première position révisée du filtre sélectif des aquaporines Lsi1 apporte non seulement

des connaissances supplémentaires sur le rôle de certains résidus dans le contrôle du passage

56

des molécules, mais remet également en question la standardisation des positions des acides

aminés du filtre ar/R chez les aquaporines en général. En effet, il semblerait exister une

certaine variabilité positionnelle des filtres ar/R entre les familles d’aquaporines (Kirscht et

al., 2016). Des études supplémentaires sont nécessaires pour mesurer cette variabilité et

identifier les acides aminés réellement impliqués dans la sélectivité chez chacune des

familles. D’autre part, les preuves apportées quant au rôle du G conservé dans la sélectivité

du Si participent à améliorer les connaissances sur l’absorption de cet élément chez les

plantes. Grâce aux conclusions apportées par ces travaux, il sera éventuellement possible

d’améliorer de manière plus optimale l’absorption en Si chez les plantes faiblement

accumulatrices. L’accumulation élevée en Si chez les plantes d’intérêt agricole constitue un

moyen de défense supplémentaire dans la lutte contre les divers stress environnementaux. Ce

projet s’inscrit donc directement dans le cadre d’une gestion phytosanitaire des cultures plus

respectueuse de l’environnement.

Les résultats de Montpetit et al. (2012) et Vivancos et al. (2015) démontrant qu’une

transformation d’Arabidopsis avec le gène Lsi1 du blé (TaLsi1) permettait aux plantes

d’accumuler des quantités supérieures de Si et de mieux tolérer la maladie du blanc poudreux

sont les premières démonstrations que les plantes génétiquement modifiées avec le gène Lsi1

bénéficient d’apports supérieurs en Si. Grâce à ces travaux, on sait aujourd'hui que les effets

du Si ne sont pas limités aux plantes naturellement accumulatrices de Si, mais, à l’inverse,

ils semblent être universels. Il est donc reconnu que la capacité des plantes à accumuler

l’élément est l’unique facteur limitant pour bénéficier des effets positifs du Si. La deuxième

partie de ce projet s’est intéressée à évaluer l’intérêt d’une transformation de Brassica napus,

une espèce faiblement accumulatrice de Si, avec un transporteur Lsi1. Deux transformants

ont été étudiés; un transformant de canola avec le gène VaLsi1 de Vigna angularis ainsi qu’un

transformant avec le gène CaLsi1 de Cicer aretinum. Les résultats démontrent une

accumulation supérieure en Si uniquement chez le canola transformé avec le gène VaLsi1.

Malgré cette augmentation, les niveaux d’absorption en Si sont demeurés faibles et ont

maintenu les plants de canola au titre de faibles accumulateurs (Hodson et al., 2005). De plus,

les transformants n’ont pas démontré être plus tolérants à l’agent pathogène Leptosphaeria

maculans. Les faibles taux d’accumulation en Si dans les tissus seraient directement en cause

dans cette absence d'augmentation de la résistance au champignon. En effet, plus les plantes

57

accumulent des quantités élevées de Si dans leurs tissus, plus elles peuvent bénéficier des

effets protecteurs de cet élément (Coskun et al., 2019). Un taux d’accumulation inférieur à

0,1 % mesuré chez les transformants n’est pas suffisamment élevé pour que le Si puisse jouer

son rôle dans la résistance. Selon le mécanisme de transport du Si présenté par Ma et al.

(2008), l’action conjointe des transporteurs Lsi1 et Lsi2 est nécessaire pour permettre une

accumulation optimale de Si dans les parties aériennes. Or, la présence du transporteur Lsi2

n’a jamais été rapportée chez le canola, contrairement à l’absence du gène Lsi1 qui a été

démontrée chez l’ensemble des Brassicacées (Sonah et al., 2017). Les résultats obtenus par

la transformation du canola semblent indiquer que cette espèce ne possède pas de Lsi2,

puisque la simple transformation avec le transporteur Lsi1 n’a pas entrainé une importante

accumulation en Si. À la lumière de ces résultats, des expérimentations futures sur de doubles

transformants avec les deux gènes responsables du transport en Si devraient être réalisées.

Une double transformation avec les gènes Lsi1 et Lsi2 permettrait de mieux reproduire le

système de transport du Si chez les plantes fortement accumulatrices où le premier

transporteur facilite l’entrée de l’acide silicique de la solution du sol vers les cellules

racinaires, tandis que le deuxième transporteur agit de manière à exporter le Si de la cellule

pour atteindre le xylème (Ma et Yamaji, 2015). La présence des deux transporteurs de Si

chez le canola donnerait possiblement lieu à une déposition supérieure en Si et, par le fait

même, l’exploitation de ses propriétés bénéfiques. Le développement de cultivars de canola

plus résistants à divers stress répond à la demande croissante d’alternatives pour une gestion

plus raisonnée des cultures. La facilité à modifier génétiquement l’espèce de Brassica napus

rend plus aisée l’amélioration génétique et la création de cultivars plus performants, ce qui

donne une perspective positive sur une éventuelle double transformation du canola.

Les conclusions amenées par ce projet soulèvent l’importance du transporteur secondaire

Lsi2 pour le transport optimal du Si chez les plantes. Il semble que l’amélioration de

l’absorption en Si chez une espèce faiblement accumulatrice est uniquement possible s’il y a

présence conjointe des deux gènes Lsi1 et Lsi2. Les résultats obtenus par cette étude

confirment donc cette condition essentielle à considérer en vue d’une amélioration génétique

visant un transport accru en Si. Il est ainsi recommandé que les futurs travaux ayant pour

objectif d’augmenter la résistance aux agents pathogènes via l’accumulation de Si déploient

des efforts supplémentaires pour effectuer une double transformation efficace. Ce mémoire

58

pourrait donc contribuer au développement d’une meilleure approche génétique dans la lutte

contre les stress environnementaux par l’intermédiaire du Si.

59

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Étude de la fonctionnalité et des propriétés des