Étude des interactions entre des bactéries pathogènes et

Étude des interactions entre des bactéries pathogènes et Dictyostelium discoideum : analyse de la résistance

et de l’enrobage

Mémoire

Myriam Ouellet

Maîtrise en microbiologie Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Myriam Ouellet, 2014

ii

iii

RÉSUMÉ

Les amibes se nourrissent principalement de bactéries. Certaines bactéries pouvant

résister à la digestion dans la voie phagocytique amibienne s’y retrouvent enrobées et

sécrétées dans l’environnement par la suite. Cet enrobage augmente la résistance

bactérienne à différents stress. Les bactéries enrobées pourraient favoriser la propagation de

maladies infectieuses, mais aucune donnée n’est disponible à ce sujet. Les bactéries

pathogènes Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium et Pseudomonas

aeruginosa sont capables de résister à la digestion amibienne, mais leur capacité à être

enrobée est inconnue. L’étude de la résistance de ces bactéries face à l’amibe Dictyostelium

discoideum et l’analyse de la viabilité de cette dernière en présence des bactéries ont été

réalisées pour mieux cibler les souches bactériennes potentiellement enrobables. Des essais

d’enrobage ont été tentés, mais aucune bactérie enrobée n’a été observée en microscopie

électronique. D’autres analyses seront requises pour comprendre la propagation des

maladies infectieuses via les bactéries enrobées.

iv

v

ABSTRACT

Amoebae mainly feed bacteria. Many bacteria are resistant to the digestion in the

phagocytic pathway of amoebae. There they can be packaged and then secreted into the

environment. Packaging increases the resistance of bacteria to different stresses. Packaged

bacteria could improve the spread of infectious diseases, but no data is available regarding

that so far. The pathogenic bacteria Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium

and Pseudomonas aeruginosa are able to resist to digestion by amoeba digestion, but their

ability to be packaged is unknown. The study of the bacteria resistance to the amoeba

Dictyostelium discoideum and the analysis of the viaibility of the latter in the presence of

bacteria were done to better target the bacterial isolates that can be packaged. Assays of

packaging of bacteria were done, but no packaged bacteria were observed by electron

microscopy. Other analyzes are required to understand the spread of infectious diseases by

packaged bacteria.

vi

vii

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ .............................................................................................................................. iii

ABSTRACT ............................................................................................................................ v

LISTE DES TABLEAUX ..................................................................................................... ix

LISTE DES FIGURES .......................................................................................................... xi

LISTE DES ABRÉVIATIONS .......................................................................................... xiii

REMERCIEMENTS ............................................................................................................. xv

DÉDICACE ....................................................................................................................... xvii

CHAPITRE 1 - INTRODUCTION ........................................................................................ 1

1.1 Les protozoaires ............................................................................................................ 1

1.2 Dictyostelium discoideum ............................................................................................. 2

1.3 La voie phago-endocytique chez D. discoideum ........................................................... 2

1.3.1 La dynamique de la voie phago-endocytique ......................................................... 5

1.3.2 Phagocytose versus macropinocytose .................................................................... 7

1.3.3 Les endosomes de recyclage .................................................................................. 9

1.3.4 Les lysosomes ....................................................................................................... 10

1.3.5 Les lysosomes tardifs ........................................................................................... 11

1.3.6 L’exocytose .......................................................................................................... 12

1.4 Résistance à la prédation : Mécanismes de résistance et corps multilamellaires (CML)

........................................................................................................................................... 12

1.5 Bactéries résistantes aux amibes ................................................................................. 17

1.5.1 E. coli O157:H7 .................................................................................................... 17

1.5.2 S. typhimurium ...................................................................................................... 17

1.5.3 P. aeruginosa ........................................................................................................ 18

1.6 Problématique des bactéries enrobées ......................................................................... 20

CHAPITRE 2 – HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS SPÉCIFIQUES ....................................... 21

CHAPITRE 3 – MATÉRIEL ET MÉTHODES ................................................................... 23

3.1 Cultures cellulaires et maintenance ............................................................................. 23

3.2 Test de prédation ......................................................................................................... 27

3.3 Test de lyse .................................................................................................................. 28

3.4 Essai d’enrobage de bactéries ..................................................................................... 29

3.5 Microscopie électronique à transmission (MET) ........................................................ 30

viii

3.6 Production de CML par d’autres amibes .................................................................... 30

CHAPITRE 4 - RÉSULTATS ............................................................................................. 33

4.1 E. coli O157:H7 .......................................................................................................... 33

4.1.1 Test de prédation .................................................................................................. 33

4.2 S. typhimurium ............................................................................................................ 35


4.2.2 Essai de l’enrobage de bactéries .......................................................................... 38

4.3 P. aeruginosa .............................................................................................................. 39

4.3.1 Origine des isolats ................................................................................................ 40

4.3.1.1 RAPD ................................................................................................................ 40

4.3.1.2 Formation de biofilm ........................................................................................ 42

4.3.1.3 Production d’élastase ........................................................................................ 44


4.3.3 Test de lyse .......................................................................................................... 48

4.3.4 Essai de l’enrobage de bactéries .......................................................................... 51

4.4 Levure provenant d’une contamination ...................................................................... 57


CHAPITRE 5 - DISCUSSION ............................................................................................ 63

5.1 E. coli O157:H7 .......................................................................................................... 63

5.2 S. typhimurium ............................................................................................................ 64

5.3 P. aeruginosa .............................................................................................................. 65

5.4 Levure provenant d’une contamination ...................................................................... 69


CHAPITRE 6 – CONCLUSIONS GÉNÉRALES ET PERSPECTIVES ............................ 71

CHAPITRE 7 - BIBLIOGRAPHIE ..................................................................................... 75

ix

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1. Ensemble des bactéries connues pour être résistantes aux amibes et leurs

caractéristiques. ..................................................................................................................... 14

Tableau 2. Tableau descriptif des souches d'E. coli O157:H7 utilisées dans cette étude. .... 24

Tableau 3. Tableau descriptif des souches de S. typhimurium utilisées dans cette étude. .... 25

Tableau 4. Isolats cliniques de P. aeruginosa isolés de patients ayant la fibrose kystique et

utilisés dans cette étude. ........................................................................................................ 26

Tableau 5. Isolats environnementaux de P. aeruginosa provenant d'unités dentaires et

utilisés dans cette étude. ........................................................................................................ 27

Tableau 6. Résultats des tests de prédation pour E. coli O157:H7. ...................................... 35

Tableau 7. Résultats des tests de prédation pour S. typhimurium. ........................................ 37

Tableau 8. Différents milieux de culture testés pour les tests de prédation de S.

typhimurium. ......................................................................................................................... 38

Tableau 9. Résultats des tests de prédation pour P. aeruginosa. .......................................... 47

Tableau 10. Lyse des cellules de D. discoideum exposées au surnageant des cultures des

isolats de P. aeruginosa. ....................................................................................................... 50

Tableau 11. Mise en commun des résultats des tests de prédation et des tests de lyse pour

les isolats de P. aeruginosa pour déterminer ceux qui sont potentiellement enrobables. .... 52

x

xi

LISTE DES FIGURES

Figure 1. Schéma décrivant la voie endocytique chez D. discoideum. ................................... 4

Figure 2. Les différents compartiments de la voie endocytique chez D. discoideum. ............ 5

Figure 3. Cytosquelette d'actine. ............................................................................................. 6

Figure 4. Visualisation des endosomes de recyclage grâce à la protéine p25. ..................... 10

Figure 5. Cycle de multiplication intracellulaire de L. pneumophila dans une cellule

eucaryote. .............................................................................................................................. 15

Figure 6. Bactéries L. pneumophila enrobées dans un corps multilamellaire produit et

sécrété par A. castellanii. ...................................................................................................... 16

Figure 7. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les souches d'E. coli

O157:H7. ............................................................................................................................... 34

Figure 8. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les souches de S.

typhimurium. ......................................................................................................................... 37

Figure 9. Microscopie électronique à transmission d'un essai d'enrobage pour la souche

sauvage X3339 de S. typhimurium. ...................................................................................... 39

Figure 10. Pourcentage des patients atteints de fibrose kystique étant infectés par différents

agents infectieux selon le groupe d'âge. ............................................................................... 40

Figure 11. Dendrogramme obtenu suite à l'analyse informatique du RAPD des isolats

cliniques et environnementaux de P. aeruginosa. ................................................................ 42

Figure 12. Diagramme de la capacité des isolats de P. aeruginosa à former un biofilm en

fonction de leur groupe de similitude. .................................................................................. 43

Figure 13. Diagramme de la production d'élastase par les isolats de P. aeruginosa. ........... 44

Figure 14. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les isolats de P.

aeruginosa. ........................................................................................................................... 46

Figure 15. Lyse des cellules de D. discoideum exposées au surnageant des cultures de P.

aeruginosa. ........................................................................................................................... 49

Figure 16. Phagocytose et exocytose chez D. discoideum. .................................................. 54

xii

Figure 17. Invagination de la membrane du lysosome tardif. .............................................. 55

Figure 18. Essai d'enrobage de bactéries pour l’isolat VD 706 de P. aeruginosa. .............. 56

Figure 19. Corps multilamellaires vides produits par les isolats VD 706 et Chir D-144 de P.

aeruginosa. ........................................................................................................................... 57

Figure 20. Exemple de coculture triple permettant de confirmer qu'une bactérie est une

ARB. ..................................................................................................................................... 58

Figure 21. Isolement et identification partielle du microorganisme inconnu. ..................... 60

Figure 22. Surproduction de couches multilamellaires dans le lysosome tardif contenant

une levure. ............................................................................................................................ 61

Figure 23. Production de CML par A. castellanii et H. vermiformis. .................................. 62

xiii

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ABC : Cassette liant l’ATP (ATP-binding cassette)

ARB : Bactérie résistante aux amibes (Amoeba Resistant Bacteria)

CML: Corps multilamellaire

CRIPA : Centre de recherche en infectiologie porcine et avicole

Ctrl : Contrôle

DO : Densité optique

Gb3 : Globotriosyl céramide

LES : Souche épidémique de Liverpool (Liverpool epidemic strain)

MET : Microscopie électronique à transmission

PCR : Réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction)

RAPD : Amplification aléatoire des polymorphismes de l’ADN (Random amplified

polymorphic DNA)

rpm : Rotation par minute

SPI1-T3SS : Îlot de pathogénicité 1 ou 2 du système de sécrétion de type 3 chez Salmonella

(Salmonella pathogenicity island type 3 secretion system)

spp : Sous-espèce (Subspecies)

SS : Système de sérétion

SST3 : Système de sécrétion de type 3

Tat : Twin Arginin Translocation

xiv

xv

REMERCIEMENTS

Tout d’abord, je tiens à remercier les différents organismes subventionnaires qui ont

contribué au soutien financier pour la réalisation de ce projet, plus particulièrement le

Centre de recherche en infectiologie porcine et avicole (CRIPA) pour l’obtention d’une

bourse de voyage et d’une bourse de dépannage. J’aimerais aussi remercier les membres de

mon comité aviseur pour m’avoir soutenu : Steve Charette (directeur de recherche),

Caroline Duchaine (co-directrice), Jean Barbeau et Manon Couture.

Je tiens aussi à remercier Steve, mon directeur, pour toute l’aide et le support

apportés. Tu as fait grandir mes connaissances et ma passion pour la science, mais tu m’as

aussi fait grandir en tant qu’être humain. Merci de toute la confiance que tu m’as accordée,

merci d’avoir cru en moi. Merci aussi d’avoir été autant disponible.

Maintenant, j’aimerais remercier mes collègues et amis qui m’ont côtoyée durant

ma maîtrise. Premièrement, merci à Valérie, ma poule, d’être ma super acolyte de bactéries

enrobées. Toute ton énergie, en synergie avec la mienne, a fait de nous une équipe du

tonnerre! Faire mon tout premier stage à tes côtés a été vraiment plaisant! Depuis ce temps,

tu m’as permis de m’épanouir en tant que microbiologiste, mais aussi en tant que femme

« qui découvre le monde ». Merci à Geneviève, notre première maman du laboratoire. Ta

bonne humeur et ton sens de l’humour étaient toujours les bienvenus! Je sais maintenant

que je ne dois plus laisser traîner mon cellulaire, surtout durant les partys de Noël! Tu es

une très bonne conseillère, autant au sujet du travail que de la vie en général. Merci à

Stéphanie, la belle rousse, pour ta gentillesse et pour m’avoir fait découvrir et développer,

avec les gars de bio-info, mon goût pour les bonnes bières. Merci à Alix pour ton sens de

l’humour et nos nombreux délires. Merci à Katherine, Mélanie et Sabrina. J’ai moins eu la

chance de collaborer avec vous, mais votre présence au laboratoire a été des plus agréables.

Et merci Antony pour tes nombreux monologues et imitations!

xvi

Un merci tout particulier à mon copain, Jean-Guillaume, qui a su être là pour me

supporter dans les moments plus difficiles et plus stressants. Tu as été là pour m’encourager

et pour me pousser toujours plus loin afin que je me surpasse. Tu as été généreux et patient

avec moi. Tu es l’homme rêvé et je t’admire vraiment beaucoup dans tout ce que tu fais. Je

t’aime mon amour! Tu me rends vraiment heureuse! Je te souhaite de réussir tout ce que tu

entreprends dans la vie.

Merci aussi à mes parents, France et Bruno, et à ma sœur Sophie, pour leur soutien

moral durant ces années d’étude. Depuis que je suis toute jeune, vous m’avez toujours dit :

« On ne te demande pas de faire l’impossible, on te demande juste de faire de ton mieux ».

Cette petite phrase, certains diront qu’elle est banale, mais elle signifie beaucoup pour moi.

Ce n’est pas seulement qu’en obtenant les meilleurs résultats que je vais apprendre. C’est

en faisant du mieux que je peux que la vie me rendra ce que j’ai semé. C’est valable autant

en recherche que dans la vie. Merci à Sophie, ma petite Puce, pour ta complicité. Malgré

que nous ne soyons plus des enfants, tu resteras toujours ma petite sœur que je protégerai.

Finalement, un merci un peu moins pertinent à ma « crème molle » du Chocolats

Favoris bien méritée après mon dépôt initial. Tu as été ma motivation dans les derniers

moments de rédaction.

xvii

DÉDICACE

À mes parents si fiers de moi

« On ne te demande pas de faire l’impossible,

on te demande juste de faire de ton mieux. »

xviii

1

CHAPITRE 1 - INTRODUCTION

1.1 Les protozoaires

Les protozoaires sont des organismes eucaryotes unicellulaires ubiquitaires dans les

environnements humides [1]. Leurs premières observations et descriptions ont été faites par

Antoni van Leeuwenhoek en 1675. Les protozoaires possèdent les mêmes structures et

organites que les autres cellules eucaryotes, mais avec quelques variations. Certains

protozoaires possèdent un seul noyau, alors que d’autres en possèdent deux voire plusieurs.

Il existe aussi différentes dimensions pour les protozoaires. Alors que les mononucléés font

de quelques micromètres à des centaines de micromètres, les multinucléés peuvent faire

une taille de plusieurs centimètres à plusieurs mètres. Les protozoaires se nourrissent par

phagocytose, macropinocytose et certains font de la photosynthèse [2].

Sur la base de leur mode de locomotion, les protozoaires se divisent en quatre

catégories, soit les ciliés, les amibes, les sporozoaires et les flagellés [3]. Parmi les

différents groupes de protozoaires, différentes espèces sont utilisées comme modèle

d’étude, dont les amibes Dictyostelium discoideum [4-6] et Acanthamoeba spp. [7] et

Tetrahymena spp. [8] chez les ciliés. Pour ce qui est des amibes, D. discoideum offre

plusieurs avantages que d’autres modèles amibiens n’offrent pas (voir la section 1.2). Par

contre, d’autres amibes ont aussi permis différentes avancées scientifiques. Il y a, entre

autres, les amibes libres Acanthamoeba castellanii et Hartmannella vermiformis qui ont

déjà été utilisées pour étudier la réplication intracellulaire de Legionella pneumophila, une

bactérie pathogène opportuniste responsable de la légionellose, une maladie respiratoire

parfois mortelle [9-10].

2

1.2 Dictyostelium discoideum

Comme mentionné précédemment, l’amibe D. discoideum est un modèle d’étude

d’eucaryote unicellulaire souvent utilisé en science. Cet organisme a été découvert en 1933

[11], mais ce n’est que depuis les dernières décennies que son utilisation, surtout sous sa

forme végétative, est plus courante. D. discoideum possède plusieurs caractéristiques

faisant de cette amibe un bon modèle d’étude. Parmi celles-ci, il y a sa capacité

d’internaliser les bactéries pour se nourrir, la facilité à la cultiver [5] et son génome

entièrement séquencé [12]. D. discoideum offre aussi l’avantage que son utilisation n’est

pas soumise aux contraintes éthiques et a un temps de génération beaucoup moins long que

certains autres modèles d’étude [5, 13]. De plus, cette amibe permet l’étude des effets de

différents composés ou mutations dans la formation des corps multilamellaires (CML) [14].

En effet, en présence de bactéries, D. discoideum produit et sécrète des CML [15]. La

phagocytose étant un processus dynamique, l’internalisation de bactéries entraîne le

déplacement de certaines protéines membranaires à l’intérieur de la voie phago-

endocytique. Ces protéines sont aussi utilisées comme marqueurs moléculaires permettant

d’identifier les différents compartiments de la voie phago-endocytique [16].

1.3 La voie phago-endocytique chez D. discoideum

La voie endocytique apporte à l’amibe les nutriments essentiels à sa survie [17-18].

Cette voie est composée de nombreux compartiments de nature différente. Ces

compartiments sont des ensembles de vésicules de tailles et de formes différentes [19]. Ils

peuvent ainsi avoir une taille variant entre 100 nm et plusieurs micromètres. Ils peuvent

aussi adopter des formes rondes, ovales, voire même plus complexes comme la forme d’un

fer à cheval [19]. Même si de nombreux échanges ont lieu entre ces différents

compartiments, chacun conserve son identité et sa composition [20]. Pour maintenir cette

composition unique, les divers compartiments sont dotés d’une très grande efficacité de

triage [21]. Pour pouvoir être fonctionnels, les compartiments doivent recruter ce qui est

nécessaire, entre autres, à leur formation, leur transport, leur attachement et leur fusion

membranaire [22].

3

La voie endocytique chez D. discoideum peut être résumée à l’aide du schéma de la

Figure 1. Une coupe phagocytique ou macropinocytique (tout dépendant s’il s’agit de

particules solides ou de fluide) se forme à la surface cellulaire par réarrangement du

cytosquelette d’actine de la cellule (étape 1) [23]. Lorsque la coupe se referme, cela forme

le premier compartiment de la voie endocytique. Ce compartiment naissant est nommé

phagosome lorsqu’il contient des particules solides [24] et macropinosome quand son

contenu est un fluide (étape 2) [19].

Entre une à cinq minutes après l’internalisation, le phagosome/macropinosome perd son

manteau d’actine, ce qui rend possible la fusion d’endosomes contenant des pompes

H+-ATPase à ces compartiments [25]. Ces pompes à protons permettent l’acidification des

phagosomes/macropinosomes [26]. Ces compartiments deviennent alors des lysosomes

(étape 3). L’acidification permet la digestion du contenu du lysosome grâce à des enzymes

lysosomales [27]. Le matériel non digérable est conservé et le lysosome mature en

lysosome tardif (étape 4) [28]. Ce compartiment neutre [29] ne contient pas de pompe à

proton [30]. Le contenu non digérable s’y retrouve et de nombreuses couches protéo-

lipidiques peuvent s’y former, donnant naissance aux CML [14]. L’exocytose du lysosome

tardif se fait par fusion de la membrane du compartiment avec celle de la membrane

cellulaire. Cela crée un domaine d’exocytose provisoire à la surface de l’amibe (étape 5)

[31].

Certaines protéines de la membrane plasmique de l’amibe se retrouvent internalisées

lors de la formation de la coupe phagocytique ou macropinocytique. Pour garder un bon

équilibre, certaines sont recyclées à la surface cellulaire via des endosomes de recyclage

(étape 6) [31]. Une autre organelle de l’amibe, la vacuole contractile, possède certaines

protéines, comme les pompes H+-ATPase qui pourraient être fournies à la voie endocytique

pour en permettre l’acidification. La principale fonction de cette organelle est de contrôler

la pression osmotique dans la cellule en évacuant le surplus d’eau (étape 7) [32]. Puisque la

voie endocytique est un processus continu plutôt qu’une succession distincte de

compartiments, il est difficile de déterminer combien il existe de compartiments

exactement. Toutefois, certains changements durant la voie, comme expliqué plus haut,

4

permettent de bien définir la présence des compartiments décrits. Une explication plus

détaillée de chacun des compartiments sera faites dans les sections suivantes.

Figure 1. Schéma décrivant la voie endocytique chez D. discoideum.

Étape 1: Formation de la coupe phagocytique ou macropinocytique par réarrangement du

cytosquelette d’actine. Étape 2: Fermeture de la coupe, formation du compartiment naissant

(phagosome ou macropinosome) et perte du manteau d’actine. Étape 3: Fusion de vésicules

lysosomales avec le compartiment naissant, acidification du compartiment qui devient un

lysosome, activation des enzymes lysosomales et digestion du matériel digérable. Étape 4:

Maturation du lysosome en lysosome tardif, augmentation du pH, formation de corps

multilamellaires et formation du manteau d’actine. Étape 5: Fusion du lysosome tardif à la

membrane plasmique et exocytose. Étape 6: Récupération de certaines protéines du

compartiment naissant vers la surface cellulaire via les endosomes de recyclage. Étape 7:

Vacuole contractile contenant des pompes H+-

ATPase et servant à l’osmorégulation (figure

provenant de S. Charette, comm. personnelle).

La Figure 2 montre une cellule de D. discoideum marquée à l’aide de trois anticorps

différents reconnaissant trois protéines, soit les pompes H+-ATPase, p80 et Rh-50. L’image

a été obtenue en microscopie confocale. Le marquage des pompes H+-ATPase permet de

situer la membrane plasmique, la vacuole contractile et les compartiments acides, soit les

lysosomes alors que le marquage de la protéine p80 montre la membrane plasmique et tous

les compartiments de la voie endocytique [33]. Le marquage de la protéine Rh-50, quant à

lui, sert à situer la vacuole contractile [34]. Ainsi, on peut voir sur la dernière image de la

même cellule que les compartiments ayant un marquage plus prononcé sont des lysosomes

tardifs, puisqu’ils ne contiennent aucune pompe H+-ATPase.

5

Figure 2. Les différents compartiments de la voie endocytique chez D. discoideum.

Microscopie confocale d’une cellule de D. discoideum. La cellule est marquée à l’aide de

trois anticorps reconnaissant les protéines H+-ATPase (en rouge), p80 (en vert) et Rh-50 (en

bleu). La protéine H+-ATPase se retrouve dans la vacuole contractile et dans les

compartiments acides (lysosomes). La protéine p80 se retrouve à la surface cellulaire

(signal faible) et dans tous les compartiments de la voie endocytique. La protéine Rh-50 se

retrouve dans la vacuole contractile. Les compartiments marqués d’un astérisque sont les

lysosomes tardifs (protéine p80 fortement présente et absence de la H+-ATPase) (échelle à

5 µm) (figure provenant de S. Charette, comm. personnelle).

1.3.1 La dynamique de la voie phago-endocytique

Le cytosquelette d’actine est essentiel au bon fonctionnement de la voie endocytique,

que ce soit par le réarrangement de la membrane plasmique [18], par l’organisation du

cytosol, par le transport vésiculaire et dans le maintien de la morphologie cellulaire [35].

Pour qu’il y ait internalisation de milieu liquide ou de particules solides, il doit y avoir

réarrangement du cytosquelette d’actine [23]. Il y a d’abord accumulation d’actine par sa

polymérisation en périphérie de la cellule et qui provoque la formation de protrusions

membranaires nommées pseudopodes [36], pour former la coupe phagocytique ou

macropinocytique [37-38]. Le phénomène d’endocytose se produit à un rythme de 0,6

µL/106 cellules/heure, c’est-à-dire que 10

6 cellules ingèrent 0,6 µL à chaque heure [39].

L’endocytose représente ici, dans le cas de l’amibe D. discoideum, le phénomène général

d’internalisation de particules solides ou de fluide, soit respectivement la phagocytose et la

macropinocytose. Les filaments d’actine (F-actine) se désassemblent entre 16 et 20

secondes après leur formation [40-41] pour laisser place à l’assemblage de nouveaux

6

filaments d’actine. Ce nouvel assemblage ne dure que quelques secondes [41]. Cette actine

dirige le phagosome loin du cortex cellulaire [41-42]. Le cytosquelette d’actine aide ensuite

à certaines des étapes suivantes de la voie endocytique dont la fusion et le transport des

endosomes [43-44], mais aide aussi à prévenir la fusion avec d’autres endosomes dans les

moments inappropriés [18]. Au dernier compartiment de la voie endocytique, soit le

lysosome tardif, il y a de nouveau formation d’un manteau de F-actine [45] pour ensuite

permettre l’exocytose [18, 46]. Toutefois, ni l’endocytose ni l’exocytose n’ont lieu à des

sites fixes [28] (voir la Figure 3).

Figure 3. Cytosquelette d'actine.

Microscopie confocale d’une cellule de D. discoideum. La cellule est marquée à l’aide d’un

anticorps reconnaissant la protéine p80 (en vert) et d’une molécule se liant à l’actine, la

phalloïdine couplée au Texas Red (en rouge). L’élément 1 montre une coupe

macropinocytique. À l’élément 2, l’actine est toujours présente sur le macropinosome

nouvellement formé. L’actine disparaît à l’élément 3 (lysosome) et réapparaît à l’élément 4

(lysosome tardif) où on retrouve aussi une plus grande accumulation de p80. L’élément 5

montre un domaine d’exocytose de la cellule révélé par une forte présence de la protéine

p80 (échelle à 5 µm). L’élément 6 est un pseudopode en formation à la surface de la cellule

(figure provenant de S. Charette, comm. personnelle).

Les microtubules jouent un rôle crucial dans le transport vésiculaire. Par exemple, après

la formation du phagosome, celui-ci est transporté par les microtubules [47-48] vers le

centrosome [42]. Le transport peut se faire selon différents mouvements, soit par des

directions inversées, en zig-zag [42], bidirectionnellement [19, 49] ou avec des sauts

7

périodiques [50]. Le mouvement bidirectionnel se produit à une vitesse variant entre 0,5 et

2 µm/s [51]. La vitesse des sauts des petits endosomes est de 1,7 à 2,1 µm/s, alors que pour

les gros endosomes, il s’agit de 0,7 à 1,0 µm/s [19].

La voie endocytique est un processus linéaire, ce qui signifie que tout le matériel ingéré

traverse la voie endocytique, en partant de la phagocytose/macropinocytose, pour ressortir

de la cellule par exocytose [36, 52]. Plusieurs études s’entendent pour dire que la voie

endocytique se déroule au complet en 60 minutes [42, 53]. Toutefois, il y a une certaine

homéostasie qui s’installe, pour créer un équilibre entre l’endocytose et l’exocytose [28,

54]. Par exemple, lorsque les nutriments ne sont pas assez abondants, la voie endocytique

ralentie, c’est-à-dire que l’endocytose et l’exocytose sont beaucoup plus lentes [55].

1.3.2 Phagocytose versus macropinocytose

L’endocytose est le processus par lequel D. discoideum acquière les nutriments

essentiels à sa survie [19, 56] par internalisation de fluide ou de macromolécules du milieu

extracellulaire [33, 57]. L’internalisation de particules se nomme la phagocytose [24, 58],

alors que l’internalisation de fluide se nomme la macropinocytose [19, 57]. Lorsque D.

discoideum se trouve dans son environnement naturel (c’est-à-dire le sol forestier), ses

principales sources de nutriments sont les bactéries [41, 59] et d’autres microorganismes

qu’elle internalise par phagocytose.

Le processus de la phagocytose est essentiellement similaire à celui de la

macropinocytose [36, 57] que ce soit morphologiquement [36, 60], biochimiquement [61]

ou fonctionnellement [36]. Tous deux sont des moyens efficaces utilisés par la cellule afin

d’ingérer des nutriments [16, 31]. Les deux processus nécessitent la présence de filaments

d’actine (F-actine) [17, 57]. Toutefois, il existe certaines différences entre la phagocytose et

la macropinocytose. La cellule utilise la phagocytose pour ingérer des particules ayant une

taille de l’ordre du dixième de micromètre ou plus [52, 62]. Le processus débute par la

liaison d’une particule à des récepteurs spécifiques de la surface cellulaire [62-63] suivie du

réarrangement du cytosquelette d’actine tel que mentionné plus haut [64]. Un exemple de

8

récepteurs spécifiques serait les protéines SadA [65] et SibA [66]. Aucun récepteur n’est

connu pour la macropinocytose. Des pseudopodes sont générés et la coupe phagocytique

est alors formée et s’étend autour des particules liées aux récepteurs [38, 67]. Les particules

sont amenées à l’intérieur de la cellule grâce à l’action du cytosquelette d’actine [68]. Les

particules se retrouvent alors dans un phagosome [69]. Dans ce compartiment, le pH est

près de la neutralité [28].

Pour ce qui est de la macropinocytose, le processus débute par l’invagination en forme

de V [18] de la membrane plasmique à l’aide du cytosquelette d’actine [18, 57], ce qui

mène à la formation de pseudopodes [36]. De cette manière, une grande quantité de fluide

est ingérée [57]. Lorsque la coupe macropinocytique se referme, le fluide ingéré se retrouve

dans un compartiment nommé macropinosome [36, 57]. Celui-ci a, en général, une taille

supérieure à 500 nm de diamètre [18]. Le macropinosome naissant se met ensuite à bouger

de manière centripète afin d’avoir une forme circulaire [18].

Tout comme la présence de récepteurs spécifiques est observée seulement pour la

phagocytose, il existe aussi une particularité pour la macropinocytose : le macropinosome

peut se fragmenter en plusieurs petites vésicules (S. Charette, comm. personnelle). Ce

phénomène n’est pas observé pour les phagosomes, puisque ceux-ci contiennent des

particules solides.

Les étapes subséquentes de la voie endocytique, c’est-à-dire l’acidification du

phagosome ou du macropinosome, se déroulent de la même façon pour les deux processus.

L’internalisation de fluide ou de particules solides du milieu extracellulaire mène à la

capture de protéines de la membrane plasmique. De ce fait, le triage des protéines dans ces

compartiments précoces est un processus important pour conserver leur composition

spécifique [70]. Le triage des protéines sera discuté plus profondément dans la section sur

les endosomes de recyclage. Toutefois, certaines protéines sont exclues lors de la formation

de la coupe phagocytique et macropinocytique [70].

9

1.3.3 Les endosomes de recyclage

Comme mentionné dans la section précédente, lors de la phagocytose ou de la

macropinocytose, une partie de la membrane plasmique est internalisée [71]. Ainsi, un tri

de plusieurs protéines membranaires est nécessaire pour en recycler certaines à la surface

cellulaire via les endosomes de recyclage [16] afin de conserver la spécificité de la

composition des compartiments [70] de même que celle de la surface cellulaire [72]. Une

partie du triage se fait dans la coupe phagocytique/macropinocytique alors que le reste se

fait dans le phagosome [70]. Les protéines H36 et PM4C4 sont des exemples de protéines

recyclées dans la coupe phagocytique/macropinocytique avant sa fermeture [70]. Lors du

triage dans le phagosome, les particules et le fluide ingérés passent à l’étape de la digestion

lysosomale tandis que les protéines membranaires sont recyclées à la surface cellulaire par

les endosomes de recyclage [22]. Une des protéines membranaires recyclées dans le

phagosome est p25 [16]. La démonstration de l’existence des endosomes de recyclage chez

D. discoideum s’est faite grâce à la présence de cette protéine dans ces compartiments [16].

Cette protéine se retrouve à la surface de la cellule [33], dans la coupe phagocytique ou

macropinocytique [70], dans le phagosome [33] et dans les endosomes de recyclage [16].

La Figure 4 montre une cellule de D. discoideum en microscopie confocale. Les

protéines p80 et p25 sont marquées par immunofluorescence. Les endosomes de recyclage

(en rouge) se situent à l’extérieur des compartiments (en vert) [16]. Le processus de

recyclage des protéines se déroule pendant environ 10 minutes après l’internalisation des

particules ou du fluide [16]. Les endosomes de recyclage se forment par bourgeonnement

de petites vésicules tubulaires en provenance du phagosome [19].

10

Figure 4. Visualisation des endosomes de recyclage grâce à la protéine p25. Microscopie confocale d’une cellule de D. discoideum. La cellule est marquée à l’aide de

deux anticorps reconnaissant la protéine p80 (en vert) et la protéine p25 (en rouge). La

protéine p80 est présente à la surface cellulaire et dans tous les compartiments de la voie

endocytique. La protéine p25 est aussi une protéine membranaire se retrouvant dans les

compartiments naissants (non montré sur cette image) et absente des compartiments de la

voie endocytique (lysosomes et lysosomes tardifs). Chaque petit point rouge représente un

endosome de recyclage (échelle à 5 µm) (figure provenant de S. Charette, comm.

personnelle).

1.3.4 Les lysosomes

Le lysosome est le compartiment qui permet la digestion enzymatique du matériel

ingéré par D. discoideum [17, 73]. Lors de la phagocytose comme de la macropinocytose, il

y a dépolymérisation du manteau d’actine qui entoure le compartiment naissant [57]. Cela

rend alors possible la fusion du compartiment avec des lysosomes déjà présents dans la

cellule [74]. Cette dépolymérisation d’actine se fait rapidement, c’est-à-dire en quelques

secondes tout au plus une minute [18, 47]. La fusion entre les compartiments naissants et

les lysosomes est facilitée par le transport des endosomes via les microtubules (discuté dans

la section 1.3.1). Cette fusion permet ainsi l’ajout de pompes H+-ATPase [25, 41].

L’abaissement du pH du lysosome se fait à l’aide du transfert de protons par les pompes

H+-ATPase à l’intérieur du compartiment. Ces pompes sont des protéines

11

transmembranaires du lysosome [26, 75]. L’acidification débute environ cinq minutes après

l’internalisation de fluide ou de particules solides [70].

Lors de l’acidification, le pH atteint une valeur inférieure à 3,5 [76]. Cette acidification

active les enzymes lysosomales présentes dans le compartiment, comme des protéases, des

nucléases, des lipases et des glycosidases [77]. Une fois activées, ces enzymes vont

dégrader le matériel digérable. D. discoideum peut digérer jusqu’à 1000 bactéries par

génération [1].

1.3.5 Les lysosomes tardifs

Après la digestion enzymatique, le pH du lysosome augmente pour devenir presque

neutre, soit de 6,0 à 6,2 [29, 77]. Cette augmentation dure environ 20 à 25 minutes [77].

Les enzymes lysosomales et les pompes à protons sont récupérées du lysosome tardif via

des vésicules de recyclage [17, 30]. Ces vésicules servent possiblement à acidifier les

nouveaux phagosomes subséquents [17].

Le lysosome tardif est le dernier compartiment avant l’exocytose. C’est aussi à cette

étape qu’il y a formation de corps multilamellaires (CML) [78]. Cependant, cette

production de CML est observée seulement quand les cellules sont cultivées en présence de

bactéries comme source de nutriments et non lorsque cultivées dans un milieu de culture

liquide [14-15]. Vraisemblablement, les CML se forment par invagination répétée de la

membrane du lysosome tardif pour former des couches protéo-lipidiques provenant de

l’amibe [14]. Le matériel non digéré par les lysosomes se retrouve dans les lysosomes

tardifs avant d’être exocyté hors de l’amibe [28, 42]. Le matériel non digéré peut être du

fluide ou des particules solides [19, 79].

Autour du lysosome tardif, il y a polymérisation d’un manteau de filaments d’actine

[45, 53]. Ce manteau est d’ailleurs nécessaire à l’exocytose (discuté dans la section 1.3.6)

[18] et prévient les interactions et fusions entre les lysosomes tardifs [80]. Il y a aussi une

12

présence plus importante de la protéine p80 à la surface de la membrane du compartiment

[33].

1.3.6 L’exocytose

L’exocytose est la dernière étape de la voie endocytique. Elle consiste en la

sécrétion hors de l’amibe de tout le matériel non digéré/accumulé contenu dans le lysosome

tardif [31, 53]. Le processus d’exocytose nécessite la présence accrue de filaments d’actine

[18, 45]. La protéine p80 est aussi présente de façon plus importante que pour le reste de la

voie endocytique. L’exocytose se fait par fusion du lysosome tardif avec la surface

cellulaire [28, 31]. L’exocytose dure quelques secondes seulement [17, 47]. Les CML se

retrouvent ainsi dans le milieu extracellulaire [78]. Même si certaines enzymes lysosomales

sont récupérées lors du passage au lysosome tardif, une fraction de celles-ci est aussi

sécrétée dans le milieu extracellulaire lors de l’exocytose [81-82]. Le processus

d’exocytose permet à la membrane plasmique qui a été internalisée au début de la voie lors

de la formation de la coupe phagocytique ou macropinocytique d’être récupérée à la surface

cellulaire [36]. Lorsque tout le contenu du lysosome tardif est à l’extérieur de la cellule, le

signal d’actine disparaît [18]. L’exocytose a lieu de 60 à 90 minutes après le début de la

voie, soit l’internalisation de fluide ou de particules solides [83-84].

1.4 Résistance à la prédation : Mécanismes de résistance et corps

multilamellaires (CML)

Certaines bactéries ont développé des mécanismes de résistance à la phagocytose

par les protozoaires [85]. Chez les amibes, on nomme ces bactéries des ARB (amoeba

resisting bacteria, bactéries résistantes aux amibes). Plusieurs bactéries sont connues pour

être ARB (Tableau 1). Certaines sont des pathogènes extracellulaires et d’autres sont des

pathogènes intracellulaires obligatoires ou facultatifs [85]. Puisque certaines bactéries

pathogènes pour l’humain telles les légionelles ou les mycobactéries résistent aussi à la

prédation par les amibes comme Dictyostelium [86], il est important de comprendre la

13

relation entre les ARB et les amibes dans la propagation des maladies infectieuses. La

prédation inclue les processus de phagocytose et de digestion.

Il existe trois grands mécanismes de résistance à la prédation. Il y a la lyse

amibienne, l’évitement de la phagoctyose et l’enrobage de bactéries. La résistance de

certaines bactéries a déjà été étudiée. C’est le cas de L. pneumophila, un pathogène

intracellulaire qui se laisse internaliser par les phagocytes, mais qui empêche sa digestion

pour ensuite profiter des nutriments de l’hôte pour sa multiplication [86]. Ce phénomène

n’est pas unique aux amibes puisque certaines bactéries en font de même chez les

macrophages [1, 87]. L. pneumophila est l’agent infectieux responsable de la légionellose,

une maladie pulmonaire parfois mortelle [88]. Cette bactérie contourne la voie

phagocytique de certaines amibes en recrutant des protéines du réticulum endoplasmique de

la cellule hôte. Ce recrutement est réalisé à l’aide de toxines sécrétées par le système de

sécrétion de type 4 de la bactérie. De cette manière, cette dernière n’est pas reconnue par la

cellule et peut donc profiter des nutriments offerts par celle-ci afin de se multiplier. À la fin

de son cycle de multiplication, la bactérie est sécrétée dans le milieu extracellulaire soit

suite à la lyse cellulaire [85, 89-90], soit par exocytose (Figure 5) [91]. Dans le dernier cas,

il peut y avoir formation de CML dans lesquels sont enrobées les bactéries (Figure 6) [10].

Donc, deux des mécanismes de résistance à la prédation peuvent être utilisés par

L. pneumophila : la lyse amibienne et l’enrobage de bactéries.

14

Tableau 1. Ensemble des bactéries connues pour être résistantes aux amibes et leurs

caractéristiques.

Tableau tiré de Greub et Raoult, 2004 [85]

15

Figure 5. Cycle de multiplication intracellulaire de L. pneumophila dans une cellule

eucaryote.

a. Liaison de L. pneumophila à la cellule hôte et formation d’une vacuole autour de la

bactérie; b. Évitement de la dégradation lysosomale; c. Sécrétion de toxines effectrices par

la bactérie et recrutement de protéines du réticulum endoplasmique de la cellule hôte;

d. Maturation de la vacuole de réplication; e. Multiplication intracellulaire; f. Sortie des

bactéries par lyse cellulaire ou exocytose (figure tirée de Hubber et Roy, 2010) [91].

16

Figure 6. Bactéries L. pneumophila enrobées dans un corps multilamellaire produit et

sécrété par A. castellanii.

Échelle à 1 µm (figure tirée de Berk, 1998) [10].

Le phénomène d’enrobage de bactéries est encore peu connu. Cet enrobage est sous

forme de CML. Comme mentionné dans la section 1.3.5 portant sur la voie endocytique, les

CML sont formés par l’invagination répétée de la membrane du lysosome tardif pour

former des couches protéo-lipidiques provenant de l’amibe [14]. Il s’agit d’un phénomène

dépendant de l’amibe et non de la bactérie internalisée [92]. Une caractérisation des lipides

des CML montre que ceux-ci sont principalement d’origine amibienne [15]. Toutefois, il y

a certaines variations morphologiques des CML dépendant de la bactérie digestible sur

laquelle croît les amibes [92]. Chez D. discoideum, les CML sont produits même s’il n’y a

pas de matériel non digérable présent. Par contre, la présence de bactéries digérables est

requise pour stimuler leur production. Une simple culture des amibes en milieu axénique ne

suffit pas à la production de CML [15]. D’autres amibes sont aussi connues pour produire

des CML telle A. castellanii [92]. La production de CML contenant des bactéries par les

amibes pourrait augmenter la transmission des ARB [92].

17

1.5 Bactéries résistantes aux amibes

Différents types d’ARB seront considérés dans la présente étude afin d’évaluer leur

interaction avec l’amibe D. discoideum (voir le chapitre 2). Les espèces bactériennes

considérées dans cette étude sont toutes des agents pathogènes infectant les humains. Il

s’agit d’Escherichia coli, de Salmonella typhimurium et de Pseudomonas aeruginosa. Une

brève description de leurs caractéristiques est donnée ci-dessous.

1.5.1 E. coli O157:H7

La bactérie à Gram négatif E. coli existe sous différents sérotypes. La majorité

d’entre eux fait partie de la flore gastrointestinale de l’humain. Toutefois certains sérotypes

sont des formes pathogènes de la bactérie. C’est le cas d’E. coli O157:H7, une souche qui a

acquis certains facteurs de virulence. Ces facteurs se retrouvent sur des plasmides, des

transposons, des bactériophages et des îlots de pathogénicité [93]. E. coli O157:H7 est un

agent pathogène responsable de diarrhées sanguignolantes dont la première description a

été faite en 1982 [94-95]. Aux États-Unis, elle cause de grandes pertes économiques

totalisant une somme annuelle de 405 millions de dollars [96]. Cette bactérie pathogène se

transmet principalement par la consommation d’eau et d’aliments contaminés [97].

Cependant, il existe aussi une autre voie de transmission potentielle : les aérosols [98].

Sachant qu’E. coli O157:H7 se retrouve dans les environnements humides, tout comme les

amibes, et que cette bactérie est capable de survivre et de se répliquer à l’intérieur de

certaines amibes, celles-ci pourraient favoriser la transmission de cette bactérie pathogène

[99].

1.5.2 S. typhimurium

S. typhimurium, dont le nom exact est S. enterica sérotype typhimurium, est une

bactérie pathogène intracellulaire facultative. Dans certains cas, cette bactérie a la capacité

de se multiplier à l’intérieur d’une cellule hôte. S. typhimurium est le principal agent

18

responsable de gastroentérites d’origine alimentaire chez les animaux et les humains. Elle

infecte les cellules épithéliales de l’intestin [100-101]. Cette maladie peut entraîner des

problèmes sanitaires et économiques majeurs. Par exemple, aux États-Unis, 550 décès liés à

ce type de gastroentérites sont recensés en moyenne par année [102]. S. typhimurium

possède un système de sécrétion de type 3 encodé par deux îlots de pathogénicité : le SPI1-

T3SS et le SPI2-T3SS (Salmonella pathogenicity island type 3 secretion system). Ces deux

types d’îlots de pathogénicité ont des fonctions différentes lors de la phagocytose de

S. typhimurium par des amibes ou des macrophages. Le SPI1-T3SS stimule la phagocytose

pour que la cellule hôte internalise la bactérie, tandis que le SPI2-T3SS favorise

l’établissement d’une niche de réplication par sécrétion de plusieurs protéines effectrices à

l’intérieur de la cellule [103-104]. Le SPI2-T3SS contrôle aussi la virulence de la bactérie

[105-106]. Puisque les différents types d’îlots de pathogénicité ont des fonctions jouant un

rôle sur la phagocytose par des amibes, il serait intéressant de vérifier leur impact sur le

processus d’enrobage de bactéries.

1.5.3 P. aeruginosa

P. aeruginosa est une bactérie à Gram négatif qui est un pathogène opportuniste.

C’est une bactérie ubiquitaire dans les environnements humides, les sols et l’eau, ainsi que

chez les plantes et les animaux [107-109]. C’est aussi un contaminant fréquent dans les

environnements humains comme les cabinets dentaires [110]. Elle a la capacité de former

des biofilms et elle possède plusieurs systèmes de sécrétion qui permettent la production de

facteurs de virulence [111-112]. Elle produit, entre autres, l’exotoxine A, des protéases, la

pyocyanine, la pyocine et des rhamnolipides [111, 113]. P. aeruginosa possède trois

systèmes de régulation de l’expression de ces gènes nommés quorum sensing : las, PQS et

rhl [111]. L’expression des gènes de virulence de P. aeruginosa est régulée par les

systèmes du quorum sensing. Outre l’atteinte d’un niveau seuil d’individu, les systèmes

nécessitent la présence de stimuli environnementaux pour permettre l’expression des gènes

de virulence de façon adéquate. Les facteurs environnementaux influençant les systèmes du

quorum sensing sont, notamment, le fer et l’azote disponibles, la température, l’osmolarité

ou la densité cellulaire de la population bactérienne [114-115].

19

P. aeruginosa possède plusieurs systèmes de sécrétion. Certains de ces systèmes de

sécrétion produisent des facteurs de virulence à différentes fins, que ce soit pour capturer

des ions essentiels comme le fer, pour se nourrir ou pour se défendre contre des cellules

hôtes eucaryotes ou d’autres bactéries [116]. Dans le dernier cas, les bactéries infectent

l’hôte en sécrétant des facteurs de virulence afin de diminuer la défense de l’hôte, de

bouleverser les signaux de la cellule pour bénéficier de celle-ci ou de l’utiliser pour se

répliquer [117].

Selon le type de système de sécrétion, il existe différents facteurs de virulence. Il

existe deux mécanismes distincts dans les systèmes de sécrétion. Il y a le mécanisme en une

étape et celui en deux étapes. Le mécanisme de sécrétion en une étape permet la

translocation des protéines du cytoplasme de la bactérie directement à la surface cellulaire

[116]. Le mécanisme en deux étapes, quant à lui, permet la transition des protéines dans le

périplasme avant d’être transloquées au travers de la membrane externe [116].

Les systèmes de sécrétion qui fonctionnent selon le mécanisme de sécrétion en deux

étapes utilisent soit la voie Sec-dépendant [118], soit Tat-dépendant (Tat : Twin Arginin

Translocation) [119] pour la première étape de translocation. Cette première translocation

du cytoplasme de la bactérie vers le périplasme est indépendante du système de sécrétion

[116]. Les substrats Sec-dépendants sont transloqués dans le périplasme sous une forme

non repliées, alors que les substrats Tat-dépendant ont une forme repliée [116]. Après la

première translocation, les protéines convergent vers leurs systèmes de sécrétion respectifs,

soit les types II et V. Les systèmes de sécrétion fonctionnant selon le mécanisme de

sécrétion en une étape sont, quant à eux, ceux de types I, III et VI. Étant donné la présence

de P. aeruginosa dans plusieurs environnements humides et même dans les installations

humaines et sa capacité d’être virulente par la formation de biofilm ou par la production de

facteurs de virulence, l’étude de l’interaction de cette bactérie avec des amibes serait

intéressante afin de mieux cibler l’impact des facteurs de virulence sur l’enrobage de

bactéries.

20

1.6 Problématique des bactéries enrobées

L’enrobage de bactéries procure certains avantages aux bactéries présentes à

l’intérieur des CML. Ainsi, il y a une augmentation de la résistance à différents stress

environnementaux [10, 120-121]. Ceux-ci sont, entre autres, les cycles de gel-dégel, les

biocides et les antibiotiques [10, 122-123]. Certaines études proposent que les humains

pourraient être infectés par inhalation de CML contenant des bactéries comme les

légionelles [88, 120] pourvu que les bactéries contenues dans les CML supportent plus

facilement le stress de l’aérosolisation que les bactéries qui ne sont pas enrobées. En effet,

les particules aérosolisées qui sont respirables sont celles ayant une taille inférieure à 3,5

µm de diamètre [124]. Puisque les bactéries enrobées par les protozoaires ont une taille

entre 2 et 6 µm [10, 120], celles-ci auraient la taille adéquate pour être respirées par les

humains et se retrouver dans les alvéoles pulmonaires [10]. Les bactéries enrobées

pourraient donc favoriser la propagation des maladies infectieuses via l’aérosolisation.

21

CHAPITRE 2 – HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS SPÉCIFIQUES

Hypothèse

Étant donné que certaines bactéries pathogènes se retrouvent dans les

environnements occupés par les humains et sachant que les amibes se retrouvent dans ces

mêmes environnements, j’émets l’hypothèse que ces bactéries pourraient se faire enrober

par les amibes. Ce projet de maîtrise permettrait de mieux comprendre le phénomène

d’enrobage de bactéries par les amibes et, ultimement, vérifier si cet enrobage favorise la

propagation de maladies infectieuses via l’aérosolisation. Pour aider à répondre à

l’hypothèse formulée ci-dessus, trois objectifs spécifiques ont été poursuivis au cours de

cette maitrise.

Objectifs spécifiques

1- Déterminer, parmi plusieurs souches d’espèces bactériennes différentes, celles qui sont

résistantes à la prédation par l'amibe D. discoideum

2- Déterminer si les bactéries résistantes affectent la viabilité des amibes

3- Vérifier si les bactéries résistantes à la prédation et non cytotoxiques se font enrober par

D. discoideum

22

23

CHAPITRE 3 – MATÉRIEL ET MÉTHODES

3.1 Cultures cellulaires et maintenance

La maintenance des amibes D. discoideum DH1-10 [125], souche utilisée au

laboratoire, a été faite à raison de deux passages par semaine dans du milieu de culture frais

pour éviter la confluence des amibes. Le milieu utilisé était le HL5 (14,3 g/L de

bactopeptone (Oxoid L37), 7,15 g/L d’extrait de levure, 18 g/L de D-(+)-maltose

monohydrate, 0,641 g/L de Na2HPO4•2H2O et 0,490 g/L de KH2PO4 pour 1 L d’eau

distillée et un pH final d’environ 6,5) [6] additionné de tétracycline (15 µg/mL). La

maintenance des amibes a été faite dans des Pétris stériles en polystyrène (100 mm x 15

mm, Fisherbrand) dans 12 mL de milieu HL5 et incubée à 21°C. La densité optimale pour

l’utilisation des amibes se situe à environ 1 x 106 cellules/mL [6].

Pour les cultures cellulaires bactériennes, le milieu de culture majoritairement utilisé

était le milieu LB-agar (10 g/L de bactopeptone, 5 g/L d’extrait de levure, 10 g/L de NaCl

et 12 g/L de bactoagar) (EMD). Pour E. coli O157:H7, P. aeruginosa et S. typhimurium, les

cultures ont été faites à 37°C [126-127] avec agitation à 200 rpm lorsque cultivées en

milieu LB liquide (même recette que le LB-agar, mais sans bactoagar) (EMD). Étant donné

le caractère pathogène des bactéries utilisées, les manipulations ont été faites dans une

enceinte de biosécurité de classe II type B2 dans un laboratoire de niveau de confinement

de classe 2.

Les neuf souches d’E. coli O157:H7 (Tableau 2) ont été fournies par le laboratoire

de la Dre Josée Harel de l’Université de Montréal. Les sept souches de S. typhimurium

(Tableau 3) ont été fournies par le laboratoire de la Dre France Daigle de l’Université de

Montréal. Les 29 isolats de P. aeruginosa (isolats cliniques et environnementaux) ont été

fournis par le laboratoire de Dr Jean Barbeau. Les isolats cliniques ont été isolés à partir de

patients atteints par la fibrose kystique à l’hôpital de Sainte-Justine (Montréal, Qc). Les

patients étaient âgés entre 4 et 18 ans (Tableau 4). Les ioslats environnementaux ont été

24

isolés des unités dentaires de la Faculté de médecine dentaire (Université de Montréal)

(Tableau 5).

Tableau 2. Tableau descriptif des souches d'E. coli O157:H7 utilisées dans cette étude.

Nom de la

souche Type de souche Description Références

EDL933 Souche sauvage Isolée d'une épidémie de la maladie

du hamburger au Michigan en 1982 [94]

EDL933 +

pKen2-GFP

Souche sauvage contenant

le plasmide pKen2-GFP

Souche sauvage EDL933 exprimant

la GFP

Le plasmide pKen2-GFP est un

phagemide à haute copie contenant

une GFP mutée s'excitant de 20 à 35

fois plus intensément que la GFP

sauvage à 488 nm

[128]

EDL933 ∆stx1-

stx2

Mutant ne possédant pas les

Shiga toxines stx1 et stx2

La cytotoxité de cette souche est

grandement diminuée

comparée à la souche sauvage

EDL933

[129]

EDL933

∆stx1-stx2

+ pKen2-GFP

Mutant de la souche

sauvage EDL933 possédant

le plasmide pken2-GFP,

mais ne possédant pas les

Shiga toxines stx1 et stx2

La cytotoxité de cette souche est

grandement diminuée

comparée à la souche sauvage

EDL933

Version GFP de la souche EDL933

∆stx1-stx2

[129-130]

EDL933 ∆stx1 Mutant ne possédant pas la

Shiga toxine stx1

Souche moins cytotoxique pour

l'amibe A. castellanii que la souche

sauvage EDL933

[129-130]

EDL933 ∆phoB Mutant ne possédant pas le

gène phoB

Ne régule plus la réponse face à la

limitation du phosphate [131-132]

EDL933

∆pstCAB

Mutant ne possédant pas le

gène pstCAB

Activation constitutionnelle du

régulon Pho

Diminution de la virulence

bactérienne

[132-133]

EDL933 ∆escN Mutant ne possédant pas le

gène escN

Système de sécrétion de type 3 non

fonctionnel [134]

EDL933 ∆eae Mutant ne possédant pas le

gène eae

Perte de l'intimine

Perte de la capacité d'attachement de

la bactérie aux cellules épithéliales

(in vitro)

[135-136]

25

Tableau 3. Tableau descriptif des souches de S. typhimurium utilisées dans cette étude.

Nom de la

souche Type de souche Description Références

X3339 Souche sauvage

SL1344 Souche sauvage virulente [137]

DEF208

Mutant de

SL1344 ne

possédant pas

invA

Mutant du système de sécrétion de

type III dans l'îlot de pathogénicité 1

chez Salmonella (SPI-1) avirulent

chez la souris

[138]

DEF458

Mutant de

SL1344 ne

possédant pas

sseB

Mutant du système de sécrétion de

type III dans l'îlot de pathogénicité 2

chez Salmonella (SPI-2)

[139]

X8298

Mutant de

SL1344 ne

possédant pas

phoP

Mutant de la composante phoP du

système phoP/Q

Ne permet pas la réplication

intracellulaire de S. typhimurium dans

les macrophages

[140]

UK-1 Souche sauvage Souche sauvage virulente isolée d'un

cheval [141]

LT2 Souche sauvage

X3000 Souche sauvage virulente [142]

14028 Souche sauvage

X8019 Souche sauvage virulente [143]

26

Tableau 4. Isolats cliniques de P. aeruginosa isolés de patients ayant la fibrose

kystique et utilisés dans cette étude.

Nombre Sexe du

patient

Date de

naissance Ville

Date

d'échantillonnage

279 Femme 09-04-69 Montréal Nord 17-05-88

297 Femme 25-08-80 Saint-Pie-de-Bagot 01-06-88

358 Femme 28-11-80 Laprairie 04-10-88

359 Femme 10-03-75 Répentigny 04-10-88

392 Homme 16-11-84 Saint-Roch-de-

l'Achigan 24-11-88

403 Femme 19-04-74 Trois-Rivière 10-01-89

E-500 Femme 24-02-76 Mont Laurier 26-09-89

506 Femme 26-08-75 Saint-Blaise 10-10-89

578-A Homme 25-09-73 Montréal Nord 31-06-90

578-B Femme 15-06-75 Mont Laurier 31-06-90

585 Femme 18-07-72 Saint-Jean sur

Richelieu 21-08-90

VD 171 Femme 04-11-75 McMasterville 27-10-87





27

Tableau 5. Isolats environnementaux de P. aeruginosa provenant d'unités dentaires et

utilisés dans cette étude.

Section de

clinique

dentaire

Abréviation

de la section

Numéro de

l'unité dentaire

Prothèse

partielle/fixe PPF

1

2

7

13

18

19

20

21

Urgence Urg 5

7

Orthodontie Ortho 1

Chirurgie Chir D-144

D-144 assistante

3.2 Test de prédation

Le test de prédation a été utilisé afin de déterminer le niveau de résistance des

bactéries à la prédation par les amibes selon des concentrations variables de ces dernières

[144]. Le test a été fait trois fois pour chaque souche bactérienne afin d’en confirmer le

résultat. Les souches ont été cultivées dans du milieu LB liquide. Ces précultures toujours

initiées à partir de bactéries congelées et faites dans des tubes Snapcap, ont été incubées

pendant 24 heures à 37°C avec une agitation de 200 rpm. Ensuite, un volume de 300 µL de

la préculture a délicatement été étalé sur l’ensemble de la surface d’un Pétri de 10 cm

contenant 35 mL de milieu de culture gélosé afin d’obtenir un tapis bactérien uniforme. Les

milieux de culture utilisés étaient le HL5-agar (même recette que le HL5 liquide, mais avec

20 g/L de bactoagar) pour les souches d’E. coli O157:H7, de milieu SM-agar (10 g/L de

bactopeptone, 1 g/L d’extrait de levure, 2,2 g/L de KH2PO4, 1 g/L de K2HPO4, 1 g/L de

28

MgSO4•7H2O et 20 g/L de bactoagar pour 950 mL d’eau distillée additionné, après

autoclavage, de 50 mL de glucose 20 g/100 mL filtré stérilement) [6] pour les souches de

S. typhimurium et de milieu SM-agar dilué 1/10 pour les isolats de P. aeruginosa. Les Pétri

ont par la suite été séchés dans une hotte à flux laminaire.

Une fois les tapis bactérien séchés, différentes concentrations d’amibes DH1-10 ont

été déposées sur le tapis bactérien sous forme de gouttes de 5 µL. Les concentrations

d’amibes étaient de 50 000 cellules/5 µL à 0 cellule/5 µL. Les amibes utilisées dans ces

expériences provenaient de cultures n’ayant pas plus de 60% de confluence. Une fois les

gouttes séchées, les Pétri étaient incubés à 21°C. La présence de plages de phagocytose a

été observée après sept jours d’incubation.

3.3 Test de lyse

Le test de lyse a été utilisé afin de déterminer si les isolats de P. aeruginosa

sécrètent des produits ayant la capacité de lyser les cellules de D. discoideum [145]. Le test

a été fait dans une plaque 24 puits stérile en polystyrène. Dans chaque puits, 500 µL de

milieu HL5 contenant 500 000 cellules de D. discoideum ont été déposés pendant un

minimum d’une heure à 21°C. Les amibes pour ces expériences provenaient de cultures

n’ayant pas plus de 60% de confluence.

Le jour précédent l’expérience, une préculture bactérienne de chaque isolat de

P. aeruginosa a été incubée pendant 24 heures à 37°C avec une agitation à 200 rpm dans 2

mL du milieu LB. Par la suite, la préculture bactérienne a été centrifugée à 3220 g pendant

10 minutes. Le surnageant a été recueilli et filtré avec un filtre stérile en polyethersulfone

de 0,2 µm fixé sur une seringue. Ensuite, le milieu HL5 contenu dans le puits a doucement

été enlevé et délicatement remplacé par le surnageant filtré d’un des isolats de

P. aeruginosa. En utilisant une caméra Moticam Pro 252A montée sur un microscope

inversé et le logiciel Motic Images Advanced 3,2, des images des mêmes cellules

amibiennes ont été prises à 0 minute et 10 minutes. Cette procédure a été répétée avec le

surnageant de chaque isolat au moins quatre fois dans des expériences distinctes. La

29

disparition de la réfringence des amibes est associée à leur lyse [145]. Le pourcentage de la

lyse cellulaire a été déterminé. La souche PAO1 a été utilisée comme contrôle positif et les

images ont été prises à 0 minute et 5 minutes étant donné la cytotoxicité importante du

surnageant de cette souche [145]. Cette souche a initialement été isolée en 1955 à

Melbourne, en Australie, à partir d’une plaie [109].

3.4 Essai d’enrobage de bactéries

La stimulation de l’enrobage a permis de déterminer si les bactéries sélectionnées

étaient enrobables. La stimulation nécessitait une coculture de trois microorganismes

différents : des amibes, des bactéries Klebsiella aerogenes et des bactéries résistantes à la

prédation et non cytotoxiques pour les amibes. L’ajout de K. aerogenes dans la coculture

avait pour but de favoriser l’activité de la voie endocytique des amibes et la production de

CML [15].

Une préculture liquide des bactéries résistantes à la prédation et non cytotoxiques a

été incubée en milieu LB liquide à 37°C pendant 24 heures avec agitation à 200 rpm. Les

K. aerogenes ont seulement été cultivées sur milieu LB-agar et resuspendues en milieu

liquide lors des manipulations. Au moment de l’expérience, la densité optique (DO à 600

nm) des bactéries devait être de 1,0, ce qui correspond à 1 x 109 cellules/mL. Les amibes

provenaient d’une culture n’ayant pas plus de 60% de confluence. Pour la coculture, la

concentration d’amibes souhaitée était de 1 x 106

cellules/mL. La coculture d’amibes, de

K. aerogenes et de bactéries ARB a été faite dans des tubes Snapcap contenant un milieu

sans nutriment, le tampon Soerensen 1X (Solution stock 50X : Na2HPO4•2H2O à 100 mM

et KH2PO4 à 735 mM, additionné de 500 mL d’eau et le pH est ajusté à 6,0 une fois la

solution 1X faite) [146]. Un milieu sans nutriment était nécessaire afin d’éviter que les

bactéries enrobées stimulées ressortent de leur enrobage et se remettent à croître. Différents

ratios ont été testés. Par exemple, un ratio de 1 amibe pour 1000 bactéries digérables (K.

aerogenes) et 10 ARB correspond à 1 : 1000 : 10. En termes de quantités, cela représente

1 million d’amibes pour 1 milliard de bactéries digérables et 10 millions d’ARB. Les

quantités d’amibes utilisées parmi les différentes concentrations variaient entre 1 million et

30

5 millions d’amibes. Celles des K. aerogenes variaient entre 100 millions et 1 milliard et

celles des ARB entre 10 et 100 millions. Le volume final des cocultures devait être

d’environ 2 mL. Les cocultures ont été incubées à 21°C pendant 24 heures avec agitation à

200 rpm. L’observation de la présence de bactéries enrobées a été faite par microscopie

électronique à transmission.

3.5 Microscopie électronique à transmission (MET)

La biomasse produite après la stimulation de l’enrobage de bactéries a été

centrifugée une première fois à 200 g pendant 5 minutes afin de sédimenter les amibes. Le

culot d’amibes a été conservé et le surnageant a par la suite été recueilli pour subir une

deuxième centrifugation à 4000 g pendant 1 minute afin de sédimenter les résidus

extracellulaires comme des bactéries enrobées ou des bactéries libres. Ce culot a par la suite

été mélangé au culot résultant de la première centrifugation et le mélange des deux culots a

été fixé pendant 3 heures dans 0,1 M de tampon cacodylate de sodium à pH 7,3. Ce tampon

contient de la glutaraldéhyde à 2% et du tétroxyde d’osmium à 0,3%. Après trois lavages

avec le tampon cacodylate de sodium, il y a eu déshydratation des échantillons dans

différentes concentrations d’éthanol, soit respectivement de 5 minutes dans l’éthanol 30%,

5 minutes dans l’éthanol 50%, 5 minutes dans l’éthanol 70%, 10 minutes dans l’éthanol

95% et une heure dans l’éthanol 100%. Par la suite, les échantillons ont été enrobés dans de

la résine Epon et incubés toute la nuit à 37°C, puis pendant trois jours à 60°C. Après cette

incubation, de très fines tranches de l’échantillon ont été coupées (entre 60 nm et 80 nm) et

colorées à l’aide de citrate de plomb à 0,1% pendant 8 minutes suivi de 5 minutes à l’aide

d’acétate d’uranyl à 3%. L’observation des échantillons a été faite au microscope

électronique à transmission JEOL JEM-1230 à 80 kV.

3.6 Production de CML par d’autres amibes

La production de CML a aussi été vérifiée pour d’autres amibes, soit A. castellanii

et H. vermiformis. Puisque les amibes produisent des CML seulement en présence de

31

bactéries, des K. aerogenes ont été utilisées ici aussi afin de stimuler la production de

CML. Ainsi, une préculture liquide de cette bactérie a été incubée à 37°C pendant 24

heures avec agitation à 200 rpm dans du LB liquide. Par la suite, 300 µL de cette préculture

a été légèrement étalée sur un milieu SM-agar dans des Pétri de 15 cm. Une fois le tapis

bactérien séché, quatre gouttes d’une suspension d’amibes de 5 µL ont été déposées. Les

Pétri ont ensuite été séchés, puis incubés à 21°C. L’apparition de plages de phagocytose a

été observée et lorsque leur croissance était adéquate, le pourtour des plages a été prélevé à

l’aide d’un embout stérile. L’échantillon a été resuspendu délicatement dans 1 mL de PBS

1X (0,262 g/L de NaH2PO4•H2O, 1,442 g/L de Na2HPO4•2H2O et 9,00 g/L de NaCl,

ajouter 900 mL d’eau, ajuster le pH entre 7,2 et 7,4, puis compléter à 1 L d’eau) pour ne

pas faire éclater les amibes. La présence de CML a par la suite été observée en microscopie

électronique à transmission (voir section 3.5 pour les détails de la MET).

32

33

CHAPITRE 4 - RÉSULTATS

4.1 E. coli O157:H7

4.1.1 Test de prédation

Les bactéries qui sont résistantes à la prédation amibienne sont celles qui ne permettent pas

la croissance des amibes lorsqu’elles sont en faible nombre sur le tapis bactérien. La Figure

7 montre un exemple de résultats obtenus pour la prédation d’E. coli O157:H7 par l’amibe

D. discoideum. On peut voir, en A, la souche sauvage EDL933, alors qu’en B, il s’agit de la

même souche, mais mutée pour le gène eae. Puisque la souche en A présente des plages de

phagocytose à toutes les concentrations d’amibes, cette souche n’est pas résistante à la

prédation. Par contre, la souche mutée ne présente qu’une seule plage de phagocytose, soit

à 50 000 amibes. Cela signifie que la souche EDL933 ∆eae est résistante à la prédation

comparativement à la souche sauvage. Le Tableau 6 présente l’ensemble des résultats

obtenus pour toutes les souches d’E. coli O157:H7. Les tests de prédation ont été faits trois

fois pour toutes les souches analysées. Les gènes mutés chez les différentes souches

impliquent des facteurs de virulence connus pour la résistance des bactéries à la prédation

(Voir le Tableau 2). L’absence de ces gènes chez les souches d’E. coli O157:H7 peut

influencer la résistance à la prédation [129-130]. En effet, on peut ainsi voir que la grande

majorité des souches ne sont pas résistantes à la prédation. Les seules souches qui sont

résistantes sont EDL933 ∆stx1 et EDL933 ∆eae. Toutefois, puisqu’il était nécessaire de

cultiver les souches d’E. coli en milieu riche (HL5-agar) pour avoir un tapis bactérien, cela

n’est pas compatible avec l’idée que les essais d’enrobage doivent être fait avec un milieu

sans nutriment. E. coli O157:H7 n’est donc pas une bonne candidate à l’enrobage.

34

Figure 7. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les souches

d'E. coli O157:H7.

Plusieurs quantités d’amibes ont été deposées sur un tapis d’E. coli O157:H7 (de 50 000 à 5

amibes par goutte). Après une incubation de 7 jours, des plages de phagocytose sont

visibles où les amibes ont internalisé les bactéries. La croissance des amibes sur le tapis

bactérien de deux souches est montrée: en A. la souche (EDL933) est sensible à la

prédation des amibes tandis qu’en B. la souche (EDL933 ∆eae) est résistante. Le contrôle

négatif (Ctrl-) était une goutte de milieu HL5 sans amibe.

35

Tableau 6. Résultats des tests de prédation pour E. coli O157:H7.

Souches d’E. coli O157:H7 Exp. 1a

Exp. 2 a Exp. 3

a Moyenne

Résistance à

la prédationb

EDL933 5 5 5 5,0 -

EDL933+pKen2-GFP 5 5 5 5,0 -

EDL933 ∆stx1-stx2 5 5 5 5,0 -

EDL933 ∆stx1-stx2

+pKen2-GFP 5 5 5 5,0 -

EDL933 ∆stx1 2 2 3 2,3 Oui

EDL933 ∆phoB 5 5 5 5,0 -

EDL933 ∆pstCAB 5 5 5 5,0 -

EDL933 ∆escN 5 5 5 5,0 -

EDL933 ∆eae 1 1 1 1,0 Oui

a : « Exp. » : Expérience; Une valeur est associée à la quantité d’amibes requises pour

générer une plage de phagocytose : 0 lorsque la souche résiste à plus de 50 000 amibes;

1 lorsqu’il y a une plage de phagocytose à 50 000 amibes; 2 lorsqu’il y a des plages de

phagocytose à 5 000 amibes et plus; 3 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 500 amibes

et plus; 4 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 50 amibes et plus et 5 lorsqu’il y a des

plages de phagocytose à 5 amibes et plus.

b : Le symbole « - » signifie que la souche n’est pas résistante aux amibes.

4.2 S. typhimurium


Comme pour E. coli O157:H7, les souches de S. typhimurium résistantes à la

prédation ne permettent pas la croissance des amibes lorsqu’elles sont en faible nombre sur

le tapis bactérien. La Figure 8 est un exemple de résultat obtenu pour les souches de cette

bactérie. La souche sauvage X3339 est en A et la souche mutée DEF458 est en B. La

souche X3339 ne montre pas de plage de phagocytose à 500 amibes et moins. Seules les

concentrations de 50 000 et 5 000 amibes/5 µL ont des plages de phagocytose. Cette souche

est donc résistante à la prédation. En B, pour la souche mutée DEF458 qui est un mutant de

la souche X3339, on peut voir que, tout comme la souche sauvage, il n’y a aucune plage de

phagocytose à 500 amibes et moins. Cette souche est donc elle aussi résistante à la

prédation. Comme mentionné dans le Tableau 3, le mutant DEF458 est un mutant pour le

gène sseB qui est impliqué dans le SST3 dans l’îlot de pathogénicité de type 2 chez

36

Salmonella [139]. Toutefois, le fait que cette souche soit résistante à la prédation ne

correspond pas au résultat attendu étant donné sa mutation. Aussi, si on regarde le Tableau

7, on peut voir que toutes les souches de S. typhimurium, sauvages ou mutantes, sont

résistantes à la prédation. Les tests de prédation pour S. typhimurium ont aussi été réalisés

trois fois pour confirmer les résultats.

Un paramètre important influence la résistance à la prédation des différentes

souches. La résistance varie en fonction de la richesse du milieu de culture (Tableau 8).

Plus le milieu est riche, plus la résistance à la prédation est grande. Les souches deviennent

sensibles à la prédation en présence d’un milieu pauvre en nutriments. Le milieu de culture

qui a été conservé est le milieu qui provoquait la plus grande résistance à la prédation, soit

le milieu SM qui est relativement riche. Étant donné cette variation de résistance à la

prédation, S. typhimurium n’est probablement pas une bonne candidate à l’enrobage de

bactéries. Toutefois, puisque cette bactérie est un pathogène intracellulaire facultatif, un

essai d’enrobage a été essayé.

37

Figure 8. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les souches de

S. typhimurium. Plusieurs quantités d’amibes ont été deposées sur un tapis de S. typhimurium (de 50 000 à 5



bactérien de deux souches est illustrée: en A. la souche sauvage X3339 est résistante à la

prédation, tout comme en B où la souche DEF458 (mutant de la souche X3339) l’est aussi.

Le contrôle négatif (Ctrl-) était du milieu HL5 sans amibe.

Tableau 7. Résultats des tests de prédation pour S. typhimurium.

Souches de

S. typhimurium Exp. 1

a Exp. 2

a Exp. 3

a Moyenne

Résistance à

la prédation

X3339 2 2 2 2 Oui

X8298 2 2 2 2 Oui

DEF 208 2 2 2 2 Oui

DEF 458 2 2 2 2 Oui

UK-1 2 2 2 2 Oui

LT2 2 2 2 2 Oui

14028 2 2 2 2 Oui

a : « Exp. » : expérience; Une valeur est associée à la quantité d’amibes requises pour

générer une plage de phagocytose : 0 lorsque la souche résiste à plus de 50 000 amibes;





38

Tableau 8. Différents milieux de culture testés pour les tests de prédation de

S. typhimurium.

Souches de

S. typhimurium

Expérience 1*

Milieu

SM

Milieu

SM 1/2

Milieu

SM 1/5

Milieu

SM 1/10

X3339 2 5 5 5

X8298 2 4 5 5

*Une valeur est associée à la quantité d’amibes requises pour générer une plage de

phagocytose; 0 lorsque la souche résiste à plus de 50 000 amibes; 1 lorsqu’il y a une plage

de phagocytose à 50 000 amibes; 2 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 5 000 amibes

et plus; 3 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 500 amibes et plus; 4 lorsqu’il y a des

plages de phagocytose à 50 amibes et plus et 5 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 5

amibes et plus.

4.2.2 Essai de l’enrobage de bactéries

L’essai de l’enrobage de bactéries est réalisé par coculture d’amibes avec une

bactérie digérable (K. aerogenes) et une bactérie résistante à la prédation. Cela permet de

vérifier si la bactérie résistante se fait enrober par D. discoideum. Étant donné que toutes les

souches étaient résistantes à la prédation, une seule a été testée pour l’enrobage de

bactéries, soit la souche X3339 qui était l’une des souches sauvages disponibles pour

l’étude. À la Figure 9, on peut voir en microscopie électronique à transmission, en A, une

amibe et un lysosome tardif contenant du matériel non digéré. Il y a une bactérie qui semble

être en train de se faire enrober par des couches multilamellaires. Toutefois, il est

impossible de dire s’il s’agit de K. aerogenes ou de S. typhimurium puisque ces deux

bactéries ont une morphologie cellulaire semblable. En B, il s’agit d’un corps

multilamellaire se trouvant dans le milieu extracellulaire. On peut voir les différentes

couches protéo-lipidiques. Par contre, ce CML ne contient pas de S. typhimurium. Parmi

tous les champs observés de cet échantillon en MET, aucune bactérie enrobée à l’extérieur

des amibes n’a été observée. Par contre, il y avait des CML vides dans le milieu

extracellulaire. La morphologie de ces CML ne semblait pas être différente de celle des

CML produits en présence de K. aerogenes seulement.

39

Figure 9. Microscopie électronique à transmission d'un essai d'enrobage pour la

souche sauvage X3339 de S. typhimurium.

Le ratio d’amibes/K. aerogenes/S. typhimurium utilisé pour cet essai était 5 amibes pour

1000 K. aerogenes et 100 S. typhimurium X3339. Les trois microorganismes ont été

incubés à 21°C pendant 24 heures avec agitation à 200 rpm. En A, on peut voir une bactérie

(flèche) en train de se faire enrober dans le lysosome tardif d’une amibe. En B, il s’agit

d’un CML vide dans le milieu extracellulaire. Pour les deux images, l’échelle de mesure est

de 0,2 µm.

4.3 P. aeruginosa

La fibrose kystique est une maladie génétique qui cause l’accumulation de sécrétion

plus visqueuse et plus épaisse au niveau des alvéoles pulmonaires. Ce milieu est donc

propice au développement d’infections [147]. Les traitements de cette maladie étant de plus

en plus efficaces, l’espérance de vie des personnes atteintes de fibrose kystique a

grandement augmenté [148]. Maintenant, ce sont les maladies infectieuses secondaires qui

causent la mort chez ces personnes [149]. À la Figure 10, on peut voir que P. aeruginosa

est le principal agent infectieux selon le pourcentage de gens colonisés au niveau

pulmonaire en fonction de l’âge [150]. Les sources de P. aeruginosa infectant les patients

atteints de fibrose kystique sont inconnues. Toutefois, il est connu que cette bactérie

pathogène se retrouve dans des environnements humains comme les cabinets dentaires

[110]. Puisque les amibes sont aussi des colonisateurs de ce type d’environnements, il se

pourrait que ce soit une des sources d’infection de ces patients à P. aeruginosa.

40

Figure 10. Pourcentage des patients atteints de fibrose kystique étant infectés par

différents agents infectieux selon le groupe d'âge.

Figure tirée de Harrison, 2007 [150].

4.3.1 Origine des isolats

Certaines analyses avaient déjà été réalisées par l’équipe du Dr Jean Barbeau de

l’Université de Montréal sur les isolats de P. aeruginosa utilisées dans cette étude. Les

isolats ont diverses origines, soit clinique et environnementale. Les résultats préliminaires

portent sur une analyse génétique et des analyses phénotypiques de ces isolats, soit une

analyse génomique qui a été réalisée par une amplification aléatoire des polymorphismes de

l’ADN (Random amplified polymorphic DNA - RAPD) et des essais de formation de

biofilm et de production d’élastase.

4.3.1.1 RAPD

Le RAPD consiste en l’hybridation aléatoire de courts oligonucléotides dans une

réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour former un patron de distribution

d’amplicons selon les polymorphismes. Cette technique a déjà été utilisée pour l’étude de

41

certains isolats chez P. aeruginosa [151]. Brièvement, une extraction de l’ADN génomique

a d’abord été faite [152-153]. Après avoir analysé 54 amorces avec deux isolats de

P. aeruginosa, seulement trois montrant des patrons d’amplification utiles ont été

conservées pour analyser les 29 isolats de P. aeruginosa. Les trois amorces sont 910-07

(5’-CCGCGGGAG-3’), 910-25 (5’-GCCCGGCAG-3’) et OPA-10 (5’-GTGATCGCAG-

3’). Les différents patrons de polymorphismes montraient entre trois et quatre bandes

variables. Par la suite, une analyse informatique a été faite avec les programmes

RestrictoScan®, RestrictoTyper®, Adanson® et Dendrograph® pour créer le

dendrogramme présenté à la Figure 11. Les isolats surlignés en orange sont les isolats

cliniques et ceux en vert sont les isolats environnementaux.

Il y a formation de trois groupes distincts entre les différents isolats.

Majoritairement, les isolats cliniques se retrouvent dans le groupe I, sauf 578-B et 506 qui

se retrouvent dans le groupe II. Les isolats environnementaux, eux, se retrouvent dans les

groupes II et III. Le dendrogramme montre la similarité entre les différents isolats. Ainsi, si

on prend la série d’isolats débutant par VD (VD 706, VD 329, etc.) dans le groupe I, il

s’agit d’isolats prélevés à partir du même patient, mais sur une période de trois ans (voir

Tableau 4). Le pourcentage de similarité entre ces isolats est de 90%. L’isolat clinique 297

a aussi 90% de similarité avec la série d’isolats VD, mais il a été isolé à partir d’une autre

patiente atteinte de la fibrose kystique.

42

Figure 11. Dendrogramme obtenu suite à l'analyse informatique du RAPD des isolats

cliniques et environnementaux de P. aeruginosa.

Une analyse informatique permet de séparer les isolats en différents groupes (groupe I, II et

III) à partir des patrons de bandes obtenus par la méthode RAPD. Les isolats surlignés en

orange sont les isolats cliniques et ceux surlignés en vert sont les isolats environnementaux

provenant de cabinets dentaires. Les isolats cliniques se retrouvent majoritairement dans le

groupe I et les isolats environnementaux dans les groupes II et III (Jean Barbeau, comm.

personelle).

4.3.1.2 Formation de biofilm

La première analyse phénotypique réalisée sur ces isolats est la formation de

biofilm. La méthode utilisée était la coloration au Crystal violet en microplaque [154].

Cette méthode consiste en fait à produire un biofilm par incubation des isolats à 30°C

43

pendant 24 heures sans agitation. Après quelques étapes de lavages et de séchage, la

coloration des bactéries ayant formées un biofilm est faite avec le Crystal violet.

L’observation de la formation de biofilm se fait au spectrophotomètre à 570 nm. Les 29

isolats de P. aeruginosa ont été testés et les résultats sont présentés à la Figure 12 sous

forme d’un diagramme en boîte. On peut voir que les isolats du groupe III forment plus

facilement un biofilm, alors que ceux du groupe II n’en forment que très peu. Pour ce qui

est des isolats du groupe I, ils ont un phénotype variable dont la tendance pointe vers une

faible production de biofilm.

Figure 12. Diagramme de la capacité des isolats de P. aeruginosa à former un biofilm

en fonction de leur groupe de similitude.

La formation du biofilm par les isolats de P. aeruginosa est déterminée par coloration des

bactéries au Crystal Violet. La lecture au spectrophotomètre permet d’obtenir différentes

densités optiques représentées dans le diagramme en boîte. Les isolats du groupe III

forment significativement plus de biofilm que ceux des groupes I et II (Annie Leduc,

comm. personnelle).

44

4.3.1.3 Production d’élastase

La deuxième analyse phénotypique faite avec les 29 isolats de P. aeruginosa est la

production d’élastase. La méthode utilisée est tirée de Rust et al. (1994) et consiste à

ajouter de l’élastine au surnageant de P. aeruginosa et de vérifier si elle se fait digérer par

l’élastase en mesurant la densité optique [155]. Ainsi, les données recueillies sont

présentées à la Figure 13. Le groupe III se distingue encore une fois des autres, puisque les

isolats de ce groupe produisent significativement moins d’élastase que ceux des groupes I

et II. Pour ces derniers groupes, la production d’élastase est variable.

Figure 13. Diagramme de la production d'élastase par les isolats de P. aeruginosa.

La production d’élastase est déterminée par la capacité à dégrader l’élastine. L’observation

au spectrophotomètre permet d’obtenir ce diagramme en boîte. Les isolats du groupe III

produisent significativement moins d’élastase que ceux des groupes I et II (Annie Leduc,

comm. personnelle).

45


Tout comme pour les autres espèces bactériennes, les isolats de P. aeruginosa étant

résistants à la prédation sont ceux qui ne permettent pas la croissance des amibes

lorsqu’elles sont en faible quantité sur le tapis bactérien. Ainsi, comme le montre la Figure

14, l’isolat 578-B en A est un isolat clinique sensible à la prédation des amibes puisqu’il

montre des plages de phagocytose à toutes les concentrations d’amibes. En B, il s’agit de

l’isolat environnemental PPF 2 qui est résistant à la prédation, car il n’a qu’une seule plage

de phagocytose. Le Tableau 9 montre l’ensemble des résultats obtenus pour les 29 isolats

de P. aeruginosa. On peut voir que la presque totalité des isolats sont résistants à la

prédation sauf les isolats cliniques 392 et 578-B et l’isolat environnemental PPF 7. Les

isolats sensibles n’appartiennent à aucun groupe en particulier, c’est-à-dire que les isolats

sensibles sont répartis dans chacun des trois groupes : l’isolat 392 dans le groupe I, l’isolat

578-B dans le groupe II et l’isolat PPF 7 dans le groupe III. La grande majorité des isolats

résistants à la prédation a une résistance élevée, puisqu’il n’y a qu’une seule plage de

phagocytose (à 50 000 amibes/5 µL).

46

Figure 14. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les isolats de

P. aeruginosa.

Plusieurs quantités d’amibes ont été deposées sur un tapis de P. aeruginosa (de 50 000 à 5



bactérien de deux isolats est illustrée: en A. l’isolat (578-B) est sensible à la prédation des

amibes tandis qu’en B. l’isolat (PPF 2) est résistant. Le contrôle négatif (Ctrl-) était du

milieu HL5 sans amibe.

47

Tableau 9. Résultats des tests de prédation pour P. aeruginosa.

Isolats de

P. aeruginosa Groupe Exp. 1

a Exp. 2

a Exp. 3

a Moyenne

Résistance à

la prédationb

VD 706 I 1 1 1 1,0 Oui

VD 329 I 0 1 1 0,7 Oui

297 I 1 1 1 1,0 Oui

VD 564 I 1 1 1 1,0 Oui

VD 171 I 1 1 1 1,0 Oui

VD 609 I 1 1 1 1,0 Oui

403 I 1 1 1 1,0 Oui

585 I 2 2 2 2,0 Oui

359 I 1 0 1 0,7 Oui

E-500 I 1 2 1 1,3 Oui

392 I 5 5 5 5,0 -

279 I 1 1 1 1,0 Oui

358 I 1 3 3 2,3 Oui

578-A I 1 2 1 1,3 Oui

PPF 18 II 1 1 1 1,0 Oui

Ortho 1 II 1 1 1 1,0 Oui

Chir D-144 ass. II 1 1 1 1,0 Oui

Urg 7 II 1 1 1 1,0 Oui

Urg 5 II 1 1 1 1,0 Oui

PPF 19 II 1 1 1 1,0 Oui

PPF 20 II 1 1 1 1,0 Oui

PPF 13 II 1 1 1 1,0 Oui

578-B II 5 5 5 5,0 -

506 II 1 1 1 1,0 Oui

PPF2 III 1 1 1 1,0 Oui

PPF1 III 2 1 2 1,7 Oui

PPF21 III 1 2 1 1,3 Oui

PPF7 III 4 3 4 3,7 -

Chir D-144 III 1 2 2 1,7 Oui

a : « Exp. » : expérience; Une valeur est associée à la quantité d’amibes requises pour

générer une plage de phagocytose : 0 lorsque l’isolat résiste à plus de 50 000 amibes;





b : Le symbole « - » signifie que l’isolat n’est pas résistant aux amibes et l’annotation

« ass. » signifie « assistante ».

48

4.3.3 Test de lyse

Le test de lyse sert à déterminer si les isolats de P. aeruginosa affectent la viabilité

des amibes. La lyse des amibes est déterminée selon la proportion de cellules survivantes

après 10 minutes d’exposition au surnageant de culture bactérienne exprimée en

pourcentage. Le résultat est considéré avoir une grande variabilité lorsque l’écart-type de

l’ensemble des résultats pour un même isolat est de 20% et plus. À la Figure 15, on peut

voir, en A, le contrôle négatif ne contenant que le milieu LB. Il y a la même quantité de

cellules après 10 minutes. En B, il s’agit du contrôle positif fait avec la souche de

P. aeruginosa PAO1, une souche virulente connue pour lyser les amibes [145]. Après aussi

peu que 5 minutes, il y avait une grande diminution du nombre de cellules intactes par

rapport à la quantité présente à 0 minute. Lorsqu’une cellule est lysée, on peut voir une

petite tache sombre à l’endroit où était la cellule (voir les flèches dans les panneaux B et

D). En C, il s’agit de l’isolat environnemental Chir D-144 qui ne lyse pas les amibes. Tout

comme le contrôle négatif (en A), il n’y a pas diminution du nombre de cellules après 10

minutes. Toutefois, en D, on peut voir une grande diminution des cellules intactes à 10

minutes. Il s’agit de l’isolat environnemental PPF 13 qui lyse les amibes, tout comme le fait

le contrôle positif. Le Tableau 10 montre l’ensemble des résultats obtenus pour les 29

isolats. Chacun des isolats a été testé quatre fois. On peut voir une certaine disctinction

concernant la capacité de lyse cellulaire entre les différents groupes. Les isolats du groupe I

ont, pour la plupart, une lyse variable. La majorité des isolats du groupe II lyse les amibes

et la totalité des isolats du groupe III ne les lyse pas. Les isolats qui n’affectent donc pas la

viabilité des amibes sont majoritairement des isolats environnementaux (1 du groupe II et la

totalité du groupe III), en plus de quelques isolats cliniques du groupe I. Le test de lyse a

aussi permis de déterminer encore plus précisément les isolats qui sont potentiellement

enrobables par les amibes.

49

Figure 15. Lyse des cellules de D. discoideum exposées au surnageant des cultures de

P. aeruginosa.

Après avoir mis en contact le surnageant des cultures de P. aeruginosa avec les amibes

déposées au fond d’un puits d’une plaque 24 puits, les photos ont été prises à 0 et 10

minutes. Étant donné la grande activité lytique de la souche PAO1 (contrôle positif), les

photos ont été prises à 0 et 5 minutes pour avoir des cellules encore en vie. Pour chaque

condition, les deux photos correspondent au même champ d’observation. A. Le contrôle

négatif a été fait en exposant des cellules de D. discoideum à du milieu de culture frais.

Aucune lyse cellulaire n’a été observée. B. Le contrôle positif a été fait avec le surnageant

d’une culture de la souche PAO1 [145]. Une grande quantité de cellules a été lysée après 5

minutes. C. Exemple d’un isolat étudié qui n’est pas capable de lyser les amibes (Chir D-

144). D. Exemple d’un isolat étudié qui provoque une lyse importante des cellules (PPF

13). Les cellules mortes laissent une marque sombre (flèche).

50

Tableau 10. Lyse des cellules de D. discoideum exposées au surnageant des cultures

des isolats de P. aeruginosa.

Isolats de P.

aeruginosa Groupe

Lyse cellulaire (% de cellules)*

Lyse Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Moyenne

Écart-

type

VD 706 I 106,3 107,3 108,8 107,2 107,4 1,1 N

VD 329 I 41,0 95,7 9,3 18,4 41,1 38,8 V

297 I 48,8 86,6 3,0 111,5 62,5 47,3 V

VD 564 I 86,4 105,9 139,7 113,4 111,3 22,1 V

VD 171 I 100,0 86,4 40,5 100,0 81,7 28,2 V

VD 609 I 107,5 84,0 102,1 107,5 100,3 16,0 N

403 I 90,4 0,6 1,2 0,0 23,1 44,9 V

585 I 106,2 112,9 112,8 107,2 109,8 3,6 N

359 I 124,0 110,5 132,0 1,1 91,9 61,2 V

E-500 I 116,1 83,8 105,9 7,1 78,2 49,3 V

392 I 0,0 22,4 0,0 0,0 5,6 11,2 L

279 I 120,8 68,9 97,0 92,9 94,9 21,2 V

358 I 131,8 100,0 8,9 7,3 62,0 63,6 V

578-A I 97,6 88,4 106,9 96,9 97,5 7,6 N

PPF 18 II 1,3 1,7 21,3 0,0 6,1 10,2 L

Ortho 1 II 0,0 0,0 54,5 1,3 14,0 27,1 V

Chir D-144 ass. II 0,4 1,4 0,0 0,0 0,5 0,7 L

Urg 7 II 21,0 0,0 0,0 0,0 5,2 10,5 L

Urg 5 II 0,0 100,9 0,0 19,6 30,1 48,1 V

PPF 19 II 35,4 2,4 0,0 0,0 9,5 17,3 L

PPF 20 II 0,0 25,3 0,0 1,5 6,7 12,4 L

PPF 13 II 15,4 15,7 1,2 22,2 13,6 8,8 L

578-B II 109,4 114,7 112,5 110,0 111,6 2,4 N

506 II 6,7 111,3 20,5 112,7 62,8 57,1 V

PPF2 III 94,6 116,1 110,5 109,1 107,6 9,2 N

PPF1 III 112,2 97,2 84,7 85,5 94,9 12,9 N

PPF21 III 94,1 97,7 100,0 92,3 96,0 3,5 N

PPF7 III 104,7 110,7 119,8 116,9 113,0 6,7 N

Chir D-144 III 109,6 104,0 103,6 103,7 105,2 2,9 N

*Les différentes annotations signifient : « Exp. » : expérience; « L » en vert: lyse; « N » en

bleu: aucune lyse; « V » en orange: lyse variable; « ass. » : assistante.

51

4.3.4 Essai de l’enrobage de bactéries

À partir des résultats des tests de prédation et des tests de lyse, il est possible de

déterminer les isolats qui sont potentiellement enrobables par les amibes. Ainsi, dans le

Tableau 11, on peut comparer les résultats des différents tests. Une bactérie est

potentiellement enrobable lorsqu’elle résiste à la prédation et lorsqu’elle ne lyse pas les

amibes. Donc, on peut voir que sur les 29 isolats, seulement huit sont de potentiels

candidats à l’enrobage de bactéries. Il s’agit des isolats VD 706, VD 609, 585 et 578-A qui

font partis du groupe I et les isolats PPF 2, PPF 1, PPF 21 et Chir D-144 du groupe III.

Aucun isolat de groupe II n’est un potentiel candidat.

52

Tableau 11. Mise en commun des résultats des tests de prédation et des tests de lyse

pour les isolats de P. aeruginosa pour déterminer ceux qui sont potentiellement

enrobables.

Isolats de

P. aeruginosa Groupe

Résistance à

la prédation Lyse*

Bactérie

potentiellement

enrobable

VD 706 I Oui N Oui

VD 329 I Oui V -

297 I Oui V -

VD 564 I Oui V -

VD 171 I Oui V -

VD 609 I Oui N Oui

403 I Oui V -

585 I Oui N Oui

359 I Oui V -

E-500 I Oui V -

392 I - L -

279 I Oui V -

358 I Oui V -

578-A I Oui N Oui

PPF 18 II Oui L -

Ortho 1 II Oui V -

Chir D-144 ass. II Oui L -

Urg 7 II Oui L -

Urg 5 II Oui V -

PPF 19 II Oui L -

PPF 20 II Oui L -

PPF 13 II Oui L -

578-B II - N -

506 II Oui V -

PPF2 III Oui N Oui

PPF1 III Oui N Oui

PPF21 III Oui N Oui

PPF7 III - N -

Chir D-144 III Oui N Oui

*Les différentes annontations signifient : « L » en vert : lyse; « N » en bleu : aucune lyse;

« V » en orange : lyse variable; « ass. » : assistante; « - » : résultat négatif.

L’essai de l’enrobage de bactéries a donc été fait pour les isolats VD 706, 585, Chir

D-144 et PPF 2, en plus d’un contrôle négatif, l’isolat 578-B, qui est sensible à la prédation

53

et qui ne lyse pas les amibes. D’autres isolats qui n’étaient pas de potentiels candidats à

l’enrobage ont aussi été testés : les isolats 297 et 358, tous deux des isolats résistants à la

prédation, mais ayant une lyse variable. En plus de vérifier si les bactéries sont enrobées,

les échantillons ont permis d’observer différents phénomènes intéressants. Par exemple, à

la Figure 16, on peut observer en microscopie élecctronique à transmission (MET) le début

et la fin de la voie endocytique sur la même image (A). Cette image a été prise lors de

l’essai de l’enrobage de l’isolat 297. Plus précisément, en B, il s’agit de la phagocytose

d’une bactérie par réarragement du cytosquelette d’actine, ce qui forme la coupe

phagocytique où se retrouve la bactérie. En C, il s’agit de l’exocytose d’un CML dans le

milieu extracellulaire. Le phénomène d’enrobage de bactéries n’a pas été observé avec cet

isolat. La Figure 17 montre aussi un phénomène intéressant avec l’isolat 358. En A, on peut

voir une amibe avec des bactéries dans le milieu extracellulaire. À l’intérieur de celle-ci, il

y a plusieurs compartiments de la voie endocytique. La flèche pointe un lysosome tardif en

train de former un CML. En agrandissant l’image (en B), on peut voir l’invagination de la

membrane du lysosome tardif pour former un CML. Cette observation confirme ce qui

avait été observé précédemment, mais dans des conditions artificielles [14]. Toutefois,

aucune bactérie enrobée n’a été observée pour cet isolat.

54

Figure 16. Phagocytose et exocytose chez D. discoideum.

Microscopie électronique à transmission d’une coculture de D. discoideum, K. aerogenes et

l’isolat 297 de P. aeruginosa selon un ratio de 5 amibes pour 1000 K. aerogenes et 10

P. aeruginosa 297 (5 : 1000 : 10). A. Une cellule de D. discoideum phagocyte une bactérie.

Sur la même image, il y a l’exocytose d’un CML (échelle à 1 µm). B. Agrandissement de

l’image de la bactérie en train de se faire phagocyter par l’amibe (échelle à 0,2 µm).

C. Agrandissement de l’image de l’exocytose du CML par l’amibe (échelle à 0,2 µm).

55

Figure 17. Invagination de la membrane du lysosome tardif.

Microscopie électronique à transmission d’une coculture de D. discoideum, K. aerogenes et

l’isolat 358 de P. aeruginosa selon le ratio 1 : 1000 : 10. En A, on peut voir une amibe avec

plusieurs compartiments de la voie endocytique (échelle à 2 µm). Si on agrandit l’image sur

le compartiment pointé, on peut voir, en B, qu’il y a une invagination de la membrane

(flèche). Il s’agit du début de la formation de CML dans un lysosome tardif [14].

L’isolat de P. aeruginosa utilisé dans l’essai de la Figure 18, VD 706, est un

potentiel candidat à l’enrobage de bactéries. En A, on peut voir en MET une amibe avec

différents compartiments de la voie endocytique. Si on regarde de plus près, en B, on peut

voir des bactéries à l’intérieur de l’amibe. Ces bactéries se situent dans le lysosome tardif.

Si on regarde encore plus près, en C, on peut voir qu’une bactérie est en train de se faire

enrober, ce qui confirme qu’il s’agit du lysosome tardif. La bactérie a donc résisté à la

digestion de l’amibe, du moins en partie, lors de son passage dans le lysosome. Toutefois,

aucune bactérie enrobée n’a été observée dans le milieu extracellulaire pour cet isolat. Par

contre, la Figure 19 montre, en A et en B, la présence de CML vide. En A, il s’agit d’un

CML à l’intérieur d’une amibe et en B, un CML dans le milieu extracellulaire. En C, il

s’agit aussi d’un CML à l’extérieur d’une amibe, mais la coculture était constituée de

l’isolat Chir D-144. On peut aussi observer que, en général, les CML à l’intérieur des

amibes (en A) ont des membranes beaucoup plus compactes comparées aux membranes des

56

CML dans le milieu extracellulaire (en B et en C). Donc, aucun des isolats de

P. aeruginosa testés n’a permis d’observer le phénomène d’enrobage de bactéries malgré

les différentes conditions essayées.

Figure 18. Essai d'enrobage de bactéries pour l’isolat VD 706 de P. aeruginosa.

MET d’une coculture de D. discoideum, K. aerogenes et de l’isolat VD 706 de

P. aeruginosa selon le ratio 5 : 100 : 10. En A, on peut voir une amibe avec plusieurs

compartiments de la voie endocytique (échelle à 2 µm). En B, il s’agit de bactéries ayant

résistées à la digestion lors du passage dans le lysosome (échelle à 1 µm). Si on agrandit la

partie pointée par la flèche, on peut voir, en C, que la bactérie est en train de se faire

enrober dans le lysosome tardif (échelle à 500 nm).

57

Figure 19. Corps multilamellaires vides produits par les isolats VD 706 et Chir D-144

de P. aeruginosa.

Images en MET de deux cocultures différentes de D. discoideum, K. aerogenes et

P. aeruginosa selon le ratio 5 : 100 : 10. En A et en B, il s’agit de l’isolat VD 706 et en C,

il s’agit de l’isolat Chir D-144. Le CML de l’image en A se trouve à l’intérieur d’une amibe

(échelle à 200 nm). Les CML des images en B et en C se retrouvent dans le milieu

extracellulaire (échelles à 1 µm).

4.4 Levure provenant d’une contamination

Une contamination a été trouvée au centre de plages de phagocytose d’une coculture

triple. Ce test était initialement fait afin de mieux cibler les bactéries potentiellement

enrobables. Toutefois, le test n’était pas adapté aux souches étudiées. Un autre test a

remplacé la coculture triple : le test de lyse afin de vérifier la cytotoxicité des souches

bactériennes, plus particulièrement les isolats de P. aeruginosa, envers les amibes. La

58

coculture triple consistait à étaler, sur un milieu riche, une coculture contenant des amibes,

des K. aerogenes et la souche bactérienne résistante à la prédation. L’incubation se faisait à

21°C jusqu’à l’apparition de plages de phagocytose (10 jours). Étant donné le milieu de

culture riche, les bactéries qui résistaient à la prédation se remettaient à croître grâce aux

nutriments du milieu de culture. On pouvait ainsi voir une croissance bactérienne au centre

des plages de phagocytose. La Figure 20 montre le type de résultats attendus.

Figure 20. Exemple de coculture triple permettant de confirmer qu'une bactérie est

une ARB.

A. Les amibes D. discoideum (D.d.) ont été déposées sur des tapis bactériens différents, soit

de K. aerogenes (K.a.), de Mycobacterium smegmatis (M.s.) ou d’un mélange des deux

bactéries (K.a. + M.s.). Les cultures composites ont été incubées à 21°C pendant 10 jours.

La présence de plages de phagocytose sur le tapis de K. aerogenes montre que la bactérie

permet la croissance de l’amibe D. discoideum, alors que M. smegmatis ne le permet pas.

Lors de la coculture triple (image au centre), la présence de la bactérie K. aerogenes permet

la croissance de D. discoideum. Toutefois, on peut apercevoir une croissance à l’intérieur

des plages de phagocytose. B. Culture à 37°C pendant 48 heures de la croissance

bactérienne présente initialement sur la coculture triple. Il est possible de constater que le

tapis bactérien est majoritairement constitué de K. aerogenes (colonies luisantes), alors que

le centre des plages de phagocytose contient principalement de M. smegmatis (colonies

mates). Avec cette expérience, il était possible de démontrer que M. smegmatis résiste à la

prédation des amibes et est donc une ARB (S. Charette, comm. personnelle).

Ainsi, puisque la contamination se trouvait au centre des plages de phagocytose,

cela pouvait signifier que la contamination était résistante à la prédation. Cette

59

contamination a donc été isolée en culture pure. Les colonies étaient rondes, roses, opaques

et crémeuses (Figure 21 en A). Lorsque ce microorganisme est incubé dans du milieu de

culture riche additionné de tétracycline (HL5 liquide et 15 µg/mL de tétracycline), il y a

croissance et production d’un pigment rose. Il s’agit soit d’une bactérie résistante à la

tétracycline, soit d’un eucaryote.

La morphologie cellulaire observée dans un montage humide laisse croire qu’il

s’agit d’une levure, puisque les cellules sont beaucoup plus grosses que des bactéries et de

forme ovoïde. Étant donné que ce microorganisme pouvait résister à la prédation et ainsi

potentiellement se faire enrober, un essai d’enrobage a été tenté. Alors, une coculture de 5

D. discoideum pour 100 K. aerogenes et 10 cellules du microorganisme rose inconnu (ratio

de 5 : 100 : 10) a été faite et envoyée en MET pour observation. Les résultats sont présentés

dans les Figures 21 et 22. Dans la Figure 21, on peut voir que la contamination est bien une

levure. En B, la levure à l’intérieur du lysosome tardif présente des filaments autour d’elle.

Ce sont des fibrilles de glucan, phénomène connu chez les levures [156]. En C, on peut voir

le microorganisme dans le milieu extracellulaire. La levure est plus grosse que les

K. aerogenes présentes autour d’elle. Il y a aussi présence d’une paroi cellulaire et des

vacuoles à l’intérieur de la cellule. Toutes ces caractéristiques identifient le microorganisme

comme étant une levure. Dans la Figure 22, on peut constater que la levure cause une

surproduction de couches mulilamellaires à l’intérieur du lysosome tardif qui ont alors une

très grande taille. Toutefois, l’enrobage ne se situe pas autour de la levure. La condition 5 :

100 : 10 n’était peut-être pas optimale pour la levure. Aucune levure enrobée n’a donc été

observée.

60

Figure 21. Isolement et identification partielle du microorganisme inconnu.

A. Isolement en culture pure du microorganisme rose. Un essai de l’enrobage a été fait

selon le ratio de 5 D. discoideum pour 100 K. aerogenes et 10 microorganismes inconnus

(5 : 100 : 10), puis observé en MET. En B, on peut voir une amibe contenant le

microorganisme inconnu dans un des compartiments de la voie endocytique. Il y a présence

de filaments autour de la cellule (flèche) (échelle à 2 µm). En C, le microorganisme est

dans le milieu extracellulaire. On peut voir que sa taille est plus grande que celle des

K. aerogenes présentes autour. Il y a présence d’une paroi cellulaire (flèche) et de vacuoles

(astérisques) (échelle à 1 µm).

61

Figure 22. Surproduction de couches multilamellaires dans le lysosome tardif

contenant une levure.

Images en MET d’un essai d’enrobage pour la levure rose selon le ratio 5 D. discoideum

pour 100 K. aerogenes et 10 levures (5 : 100 : 10). En A, on peut voir une amibe avec

plusieurs compartiments de la voie endocytique (échelle à 2 µm). Si on agrandit la région

contenant la levure, on peut voir en B qu’il y a, autour de la levure, une surproduction de

couches multilamellaires dans le lysosome tardif contenant la levure (flèches) (échelle à

500 nm).


D’autres amibes pourraient être utilisées dans le cas où D. discoideum s’avère ne

pas être un bon modèle d’étude pour l’enrobage de bactéries. Il y a, entre autres,

A. castellanii et H. vermiformis. Les amibes de ces espèces utilisées dans cette étude

provenaient du laboratoire du Dr Jean Barbeau. L’amibe A. castellanii est connue pour faire

de l’enrobage de bactéries [10], alors que H. vermiformis est connue pour permettre la

multiplication et la survie de bactéries à l’intérieur d’elle [157-158]. Toutefois, leur

production de CML a été testée et observée en MET en utilisant les mêmes conditions que

pour D. discoideum, c’est-à-dire en présence de K. aerogenes. Ainsi, on peut voir à la

Figure 23 que les deux amibes produisent des CML. Par contre, on peut remarquer que leur

structure n’est pas tout à fait similaire à celle des CML chez D. discoideum. Si on compare

62

avec un CML de D. discoideum, on peut voir que la structure de ce dernier est plus

complexe que celle des deux autres amibes.

Figure 23. Production de CML par A. castellanii et H. vermiformis.

Images en MET d’amibes produisant des CML par stimulation de la voie endocytique par

des K. aerogenes. En A (échelle à 1 µm) et en B (échelle à 0,5 µm), on peut voir des CML

produits par A. castellanii et en C, un CML produit par H. vermiformis (échelle à 0,5 µm).

On peut comparer la structure des CML à celle du CML produit par D. discoideum en D

(échelle à 1 µm) (panneau D provenant de Valérie Paquet, comm. personnelle).

63

CHAPITRE 5 - DISCUSSION

5.1 E. coli O157:H7

E. coli O157:H7 est le principal agent infectieux responsable de diarrhées

sanguignolantes chez les humains [94-95]. Cependant, qu’en est-il de sa virulence chez

l’amibe modèle D. discoideum? Même si ce modèle est considéré comme très utile pour

l’étude de la virulence de plusieurs espèces bactériennes infectant les humains [5], ceci

n’est pas une règle absolue. Ainsi, dans la présente étude, des tests de prédation ont été faits

avec D. discoideum afin de déterminer le niveau de résistance d’E. coli O157:H7 à la

prédation des amibes. Les résultats montrent que seulement deux souches sur les neuf

analysées sont résistantes à la prédation. Les deux souches en question sont des versions

mutées de la souche sauvage EDL933, celle qui cause des diarrhées sanguignolantes.

Toutefois, celle-ci est sensible à la prédation des amibes. Les souches résistantes à la

prédation sont EDL933 ∆stx1 et EDL933 ∆eae.

La souche EDL933 ∆stx1 porte une mutation inactivant le gène codant pour la Shiga

toxine stx1. Puisque les Shiga toxines permettent à la bactérie sauvage d’être autant

virulente chez les humains et les modèles animaux comme la souris [94, 159-160], on se

serait attendu à ce que l’absence de la Shiga toxine stx1 diminue la virulence de la bactérie

chez l’amibe. Au contraire, celle-ci est augmentée, ce qui suggère que l’amibe est

insensible à cette Shiga toxine. Pour sa part, le gène eae fait partie de l’îlot de pathogénicité

LEE chez E. coli O157:H7. Le LEE encode un système de sécrétion de type 3 (SST3)

[161]. Ces résultats montrent que l’interaction hôte-bactérie peut varier d’un hôte à un

autre. Dans le cas présent, les interactions entre E. coli O157:H7 et les amibes ne sont pas

les mêmes qu’avec les humains. Par exemple, la souche sauvage EDL933 infectant les

humains possède la Shiga toxine stx2, un autre important facteur de virulence. Or, cette

Shiga toxine se lie au récepteur Gb3 (globotriosyl céramide) présent à la surface des

cellules épithéliales intestinales [162]. Toutefois, les amibes ne possèdent pas ce récepteur.

Ce facteur de virulence n’est vraisemblablement pas essentiel à la bactérie lors du test de

64

prédation. Cela pourrait expliquer en partie pourquoi la souche sauvage EDL933 qui est

virulente chez l’humain soit sensible à la prédation chez l’amibe.

Plusieurs choses pourraient expliquer la résistance augmentée des deux mutants

comparativement à la souche sauvage. Premièrement, dans certains cas, lorsqu’il y a

inactivation d’un gène, d’autres peuvent être surexprimés pour compenser la perte de

l’activité du gène muté [163]. Donc, peut-être que d’autres facteurs de virulence, mieux

adaptés pour faire face à l’amibe, sont surexprimés dans les deux mutants, ce qui pourrait

rendre la bactérie plus résistante à la prédation. Deuxièmement, l’inactivation de certaines

fonctions chez une bactérie peut lui donner un gain physiologique lui permettant une

croissance plus rapide. Par exemple, chez Aeromonas salmonicida, lorsqu’il y a

inactivation du SST3, la vitesse de croissance de la bactérie est augmentée (S. Dallaire-

Dufresne, comm. personnelle). Les bactéries mutantes EDL933 ∆stx1 et EDL933 ∆eae

pourraient donc avoir une croissance plus rapide et ainsi avoir l’avantage sur les amibes

lors du test de prédation comparativement à la souche sauvage.

La coculture entre D. discoideum, K. aerogenes et E. coli O157:H7 n’est

vraisemblablement pas adéquate dans les conditions de culture pour l’essai d’enrobage de

bactéries pour maintenir la résistance d’E. coli O157:H7 à la prédation par l’amibe. En

effet, E. coli O157:H7 requiert un milieu de culture riche (HL5 agar) pour être résistante à

la prédation par D. discoideum (résultat non montré). Toutefois, l’essai d’enrobage de

bactéries nécessite un milieu sans nutriment afin de conserver les bactéries dans leur

enrobage et ainsi imiter les conditions environnementales. Cela fait finalement de cette

bactérie une mauvaise candidate pour l’étude du phénomène d’enrobage chez

D. discoideum.

5.2 S. typhimurium

Chez S. typhimurium, la totalité des souches était résistante à la prédation par

l’amibe D. discoideum. Cela correspond à ce qui a déjà été observé dans la littérature :

S. typhimurium résiste à la prédation de D. discoideum [164]. Toutefois, la résistance varie

65

en fonction du milieu de culture. Comme le milieu de culture riche était le seul milieu dont

les résultats de prédation correspondaient à la littérature, c’est ce type de milieu qui a été

conservé. Certains nutriments constituant les milieux de culture pourraient influencer

l’expression de facteurs de virulence comme invA chez S. typhimurium [138] tel que

suggéré chez d’autres modèles bactériens [165-166]. Ainsi, un milieu pauvre n’offrait

probablement pas assez de nutriments pour l’expression des facteurs de virulence

nécessaires à la résistance aux amibes. Aussi, puisqu’il s’agit d’une bactérie pathogène

intracellulaire facultative, la présence de certains nutriments pourrait activer des voies

métaboliques permettant la survie et la réplication de S. typhimurium à l’intérieur de

D. discoideum [167-168]. De plus, parmi les souches analysées, les trois mutants de la

souche sauvage SL1344 n’ont montré aucun effet sur la virulence bactérienne. Cela signifie

que les gènes qui ont été mutés ne sont pas impliqués dans la résistance de la bactérie à la

prédation des amibes.

Comme l’essai d’enrobage se fait sur un milieu de culture sans nutriment, la

résistance à la prédation de S. typhimurium pourrait être affectée dans ce test

comparativement au test de prédation fait en milieu riche. En effet, les images en MET

montrent qu’aucune bactérie enrobée n’a été observée lors de l’essai (Figure 9). Comme

expliqué précédemment, si les nutriments influencent certaines voies métaboliques ou

l’expression de gènes correspondant à des facteurs de virulence, l’absence de nutriments

diminuerait probablement le niveau de résistance, jusqu’à rendre les souches sensibles à la

prédation [138, 167-168]. Donc, S. typhimurium serait finalement aussi une mauvaise

candidate pour étudier le phénomène d’enrobage de bactéries chez D. discoideum.

5.3 P. aeruginosa

P. aeruginosa a une grande capacité à s’adapter à son environnement. Trois grandes

stratégies peuvent être utilisées afin de s’adapter : la formation de biofilm, la diversification

phénotypique et les phénotypes mutateurs [169]. Les mutations induites par cette dernière

stratégie sont en général bénéfiques pour la survie de la bactérie. Ainsi, lorsque

P. aeruginosa se retrouve dans un environnement dont certaines de ses fonctions ne sont

66

pas nécessaires, elle perd celles-ci afin d’être plus efficace [170]. C’est le cas des isolats

cliniques qui se retrouvent à l’intérieur des poumons des patients atteints de fibrose

kystique. Ces bactéries n’ont plus besoin de certains facteurs de virulence et elles les

éliminent [170]. Cela pourrait aussi expliquer l’évolution des isolats VD [171]. En effet,

comme mentionné dans la section Matériel et Méthodes, ces isolats ont été prélevés à partir

de la même patiente, mais sur une période de trois ans. La bactérie a donc évolué dans le

temps, puisqu’on observe une variation dans les tests de lyse (aucune lyse ou lyse variable

selon les isolats).

La forme de vie des bactéries la plus courante est le biofilm. Les bactéries ont

certains avantages à vivre sous cette forme plutôt que sous forme planctonique. La matrice

du biofilm, constituée majoritairement d’exopolysaccharides, est en quelque sorte un

réservoir d’enzymes [172]. Le biofilm ne conserve pas que les enzymes. Il conserve aussi

les particules nutritives environnantes pour les utiliser comme sources de nutriments et

d’énergie. Le biofilm offre aussi l’avantage de protéger les bactéries de différents stress

comme la dessiccation, l’oxydation, les biocides, les antibiotiques et plusieurs autres [172].

Avec l’analyse de la formation de biofilm pour les isolats de P. aeruginosa, il est possible

de dire que les isolats du groupe III sont ceux qui forment significativement plus de

biofilm. Puisqu’il s’agit d’isolats environnementaux, ceux-ci sont probablement soumis à

différents stress environnementaux et ont donc besoin de se défendre. Une des manières

possibles d’y arriver est la formation de biofilm. Pour ce qui est des isolats cliniques du

groupe I, il y a une grande variabilité dans la formation du biofilm. Toutefois, la tendance

tire vers une faible formation de celui-ci.

Avec les différentes analyses phénotypiques, il est possible de remarquer qu’il y a

une grande variabilité des phénotypes pour certains isolats. Que ce soit pour la formation de

biofilm, pour la production d’élastase ou la lyse amibienne, la variabilité des résultats est

surtout présente pour les isolats du groupe I qui sont des isolats cliniques. En effet, cette

variabilité a déjà été observée pour des isolats cliniques provenant de patients atteints de

fibrose kystique et il s’agit d’une des caractéristiques de ce type d’isolats [173]. C’est, entre

autres, le cas pour les souches cliniques LES (Liverpool epidemic strain) [174]. Un des

67

facteurs pouvant influencer la variabilité phénotypique est le quorum sensing. Comme

mentionné dans l’introduction, les systèmes de régulation d’expression de gènes comme

las, rhl et PQS sont influencés par différents facteurs environnementaux comme le fer et

l’azote disponibles, la température, l’osmolarité ou la densité cellulaire de la culture [114-

115]. Puisque ces facteurs peuvent varier d’une expérience à l’autre et leur effet amplifié

sur les phénotypes de la bactérie par l’action des systèmes de détection du quorum, cela

pourrait expliquer pourquoi certains isolats ultra sensibles aux petites variations ont des

phénotypes variables d’une expérience à l’autre.

P. aeruginosa possède les systèmes de sécrétion (SS) de types I, II, III, V et VI. Ces

SS produisent des facteurs de virulence qui ont différentes fonctions. Les SS sont contrôlés

par les systèmes de quorum sensing mentionnés ci-haut. Les différents facteurs de virulence

sécrétés peuvent, entre autres, être l’exotoxine A, la pyocyanine, des protéases comme

l’élastase et des rhamnolipides [111, 113]. Ces facteurs ont différents modes d’action et

sont essentiels à la virulence de P. aeruginosa.

Prenons le cas de l’élastase. D’abord, l’élastine est un constituant important des

fibres élastiques retrouvés dans les poumons, les vaisseaux sanguins et la peau [155]. Étant

donné que l’élastase a une activité protéolytique envers l’élastine, cette protéase détruit des

cellules des poumons, causant des dommages aux tissus et des hémorragies [175]. Elle peut

aussi détruire certaines immunoglobulines [176]. De plus, l’élastase améliore la croissance

bactérienne in vivo [177]. Cela pourrait expliquer que la production d’élastase pour les

isolats cliniques du groupe I soit plus élevée, puisque ces isolats se retrouvent dans les

poumons des patients atteints de fibrose kystique. L’élastine étant produite par beaucoup

d’organismes, la production d’élastase par les isolats environnementaux, dans ce cas-ci les

isolats du groupe II, serait un moyen efficace pour P. aeruginosa de demeurer virulente et

d’infecter d’autres organismes.

Un autre facteur de virulence connu chez P. aeruginosa est le rhamnolipide. Ce

glycolipide est connu pour rapidement lyser les cellules de D. discoideum lorsque produits

par la souche PAO1. Toutefois, les rhamnolipides ne sont pas la seule cause possible

68

expliquant la lyse de l’amibe [145]. Les facteurs de virulence chez P. aeruginosa sont très

nombreux. Advenant que ce ne soit pas les rhamnolipides qui soient responsable de la lyse

amibienne, il pourrait être intéressant d’en identifier la cause.

On peut constater avec le Tableau 10 que la majorité des isolats qui lysent les

amibes se retrouvent dans le groupe II. Les isolats de ce groupe proviennent, pour la

plupart, d’environnements de cabinets dentaires. Puisque ces isolats et les protozoaires ont

plus de probabilités d’interagir ensemble que les isolats cliniques, la lyse des cellules de

D. discoideum causée par les isolats du groupe II pourrait être un moyen de résister à la

prédation. De plus, les isolats du groupe II ne forment pas de biofilm, alors que les isolats

du groupe III qui forment des biofilms ne lysent pas les amibes. La lyse amibienne pourrait

donc être, pour le groupe II, le moyen de résister à la prédation des amibes, alors que la

formation de biofilm pourrait constituer une façon, pour les isolats du groupe III, d’être

virulents. Aussi, ce ne sont pas tous les facteurs de virulence qui lysent les amibes. Ainsi,

certains isolats sont virulents sans nécessairement lyser les amibes. Cela pourrait expliquer

le fait que la grande majorité des isolats de P. aeruginosa, cliniques et environnementaux,

résistent à la prédation.

L’essai d’enrobage de bactéries a été tenté après avoir mis en commun les résultats

de tests de prédation et de tests de lyse. Parmi toutes les conditions testées, aucune n’a

permis d’observer des bactéries enrobées parmi les isolats analysés. Toutefois, un autre test

pourrait être fait afin d’optimiser encore plus la façon de cibler les potentiels candidats à

l’enrobage. Il s’agit du test de killing [164]. Brièvement, ce test consiste à déterminer si les

isolats analysés se font tuer par les amibes une fois phagocytés par D. discoideum. En effet,

il existe trois mécanismes de résistance à la prédation des amibes : l’enrobage de bactéries,

la lyse amibienne et le fait d’échapper à la phagocytose. Le dernier mécanisme pourrait

donc être vérifié par le test de killing. Le phénomène d’enrobage de bactéries chez

D. discoideum pourrait aussi être étudié avec d’autres espèces bactériennes qui seraient de

meilleures candidates. Par exemple, l’enrobage de L. pneumophila a déjà été observé chez

l’amibe A. castellanii [10]. Il pourrait être intéressant d’étudier l’enrobage de cette bactérie

pathogène chez D. discoideum.

69

Certains phénomènes intéressants ont été observés en MET lors de l’essai

d’enrobage de bactéries. La Figure 16 montre le début et la fin de la voie endocytique. La

coupe phagocytique et l’exocytose d’un CML sur la même image prouve, entre autres, que

ces deux phénomènes n’ont pas lieu au même endroit. Ils sont indépendants l’un de l’autre

[31]. Puis, la Figure 17 montre l’invagination de la membrane du lysosome tardif. Ce

phénomène a déjà été observé et permet de comprendre comment se forme l’enrobage de

bactéries [14, 92]. Finalement, la Figure 19 montre des CML plus compacts à l’intérieur

des amibes que dans le milieu extracellulaire. Cela peut s’expliquer par le fait que, à

l’intérieur, il y a une pression cytoplasmique qui force les membranes à être beaucoup plus

compactes.

Cette étude est la première de ce genre à avoir été faite sur autant d’isoltas de

P. aeruginosa provenant de sources si distinctes. De plus, c’est la première fois que des

isolats environnementaux provenant de cabinets dentaires sont analysés avec ce modèle.

Cette recherche est donc pertinente pour déterminer si les isolats provenant des cabinets

dentaires sont similaires aux isolats responsables de l’infection à P. aeruginosa chez les

patients atteints de fibrose kystique. En effet, les isolats environnementaux du groupe II

sont ceux qui, du point de vue génomique, ont le plus de similarités avec les isolats

cliniques. De plus, les résultats des analyses phénotypiques montrent que les isolats du

groupe II ont des phénotypes se rapprochant plus de ceux du groupe I que de ceux du

groupe III.

5.4 Levure provenant d’une contamination

Une levure contaminante est apparue lors d’un test de coculture triple. Sa croissance

était très évidente au centre de plages de phagocytose et laissait croire que cette

contamination pourrait être résistante à la prédation des amibes et peut-être même se faire

enrober par celles-ci. Les différentes analyses ont permis de confirmer qu’il s’agissait bel et

bien d’une levure. De plus, on a pu observer lors de l’essai d’enrobage que la présence de la

levure provoquait la surproduction de couches multilamellaires dans les amibes. En effet, si

on regarde la Figure 22, on peut voir que le lysosome tardif est beaucoup plus rempli de

70

couches multilamellaires que lors de la seule présence de K. aerogenes. Cependant,

puisqu’aucune levure extracellulaire contenue dans des CML n’a été vue, l’interaction

amibe-bactérie digestible-levure non digestible semble plus complexe que suspecté.

Puisque la levure est d’une taille plus grande que les bactéries généralement utilisées lors

des essais, peut-être que l’amibe est forcée de faire beaucoup plus de couches

multilamellaires pour réussir à enrober la levure, mais sans succès. Quelques études

montrent que des levures comme Cryptococcus neoformans diminueraient la capacité de

phagocytose chez des amibes comme A. castellanii [178]. Il faudrait donc déterminer si

c’est aussi le cas pour cette levure-ci, ce qui constituerait une façon de résister à la

prédation des amibes. La production de levure enrobée reste toutefois à confirmer dans

d’autres conditions. De plus, il serait intéressant d’étudier le phénomène de surproduction

de couches multilamellaire afin de comprendre pourquoi cette interaction existe entre la

levure et l’amibe. L’essai d’enrobage avec une levure de plus petite taille pourrait

confirmer cette hypothèse.


La production de CML par d’autres amibes a été vérifiée afin d’utiliser les amibes

A. castellanii et H. vermiformis comme autres modèles d’étude dans le cas où

D. discoideum s’avérerait ne pas être un bon modèle pour l’enrobage de bactéries. La

production de CML par ces amibes a été confirmée par l’observation en MET (voir Figure

23) et correspond à ce qui est connu dans la littérature [10, 92]. La morphologie de ces

CML est différente de ceux produits par D. discoideum. Toutefois, cela demeure une bonne

alternative pour l’étude du phénomène d’enrobage de bactéries. Ces amibes se retrouvant

aussi continuellement en interaction avec les bactéries dans leur contexte naturel, le

phénomène d’enrobage est autant intéressant que pour D. discoideum. Un essai d’enrobage

avec des billes de polystyrène similaire à ce qui a été fait avec D. discoideum [92]

permettrait de comprendre comment ces amibes enrobent les bactéries résistantes à la

prédation.

71

CHAPITRE 6 – CONCLUSIONS GÉNÉRALES ET PERSPECTIVES

L’hypothèse de départ de cette étude était que certaines bactéries pathogènes qui se

retrouvent dans les environnements humains pourraient se faire enrober par les amibes.

Puisque cette étude portait aussi sur plusieurs souches mutées pour des gènes de virulence,

cela aurait permis de déterminer si l’enrobage de bactéries pouvait être influencé par

l’action de ces gènes. Parmi toutes les conditions analysées, les différentes bactéries

pathogènes utilisées n’ont pas permis d’observer de bactérie enrobée par l’amibe

D. discoideum. Toutefois, cette étude a permis de tirer certaines conclusions pouvant

expliquer pourquoi les bactéries utilisées n’étaient pas de bonnes candidates pour l’étude du

phénomène d’enrobage.

L’analyse des résultats des tests de prédation chez E. coli O157:H7 permet

d’affirmer que l’amibe D. discoideum n’est peut-être pas sensible aux Shiga toxines,

facteurs de virulence importants lors d’infections chez les humains. Cela permet de dire que

les interactions hôte-bactérie peuvent varier d’un hôte à l’autre. Une étude du transcriptome

permettrait de confirmer cette hypothèse. Puisque les Shiga toxines n’affectent pas la

virulence de la bactérie envers l’amibe, d’autres facteurs de virulence pourraient être mieux

adaptés pour résister à la prédation des amibes. Dans le cas des mutants, des facteurs de

virulence pourraient être surexprimés. L’analyse du niveau des gènes transcrits chez les

mutants comparativement à la souche sauvage pourrait permettre d’identifier les facteurs de

virulence potentiels ayant une expression augmentée. Il serait aussi intéressant de vérifier si

E. coli O157:H7 est toxique chez les amibes par un test de cytotoxicité du même type que

celui fait pour les souches de P. aeruginosa. Puis, la résistance à la prédation des mutants

EDL933 ∆stx1 et EDL933 ∆eae pourrait aussi être causée par un gain physiologique de la

bactérie suite à l’inactivation de certaines fonctions. Cette hypothèse pourrait être

confirmée en étudiant les courbes de croissance des souches mutantes comparativement à la

souche sauvage. Finalement, les conditions de coculture entre l’amibe (D. discoideum), la

bactérie digestible (K. aerogenes) et E. coli O157:H7 ne sont pas adéquates pour l’essai

d’enrobage, puisque la résistance de la bactérie pathogène ne serait pas maintenue.

72

Les tests de prédation réalisés avec la bactérie pathogène S. typhimurium ont permis

d’affirmer que celle-ci est résistante à la prédation des amibes. Toutefois, la résistance des

souches bactériennes varie en fonction de la richesse en nutriments du milieu de culture

utilisé. En effet, la présence de certains nutriments pourrait activer des voies métaboliques

chez la bactérie permettant sa survie et sa réplication dans l’amibe. Ainsi, il serait

intéressant de vérifier si les nutriments permettent l’expression de gènes pécis en étudiant le

transcriptome de la bactérie dans différents milieux de culture, soit de pauvre à riche en

nutriments. De plus, aucune bactérie enrobée n’a été observée lors de l’essai d’enrobage.

Dans le même ordre d’idée, puisque le milieu de culture de l’essai doit être pauvre en

nutriments, l’absence de nutriments pourrait diminuer le niveau de résistance de la bactérie

jusqu’à la rendre sensible à la prédation. Cela fait donc de S. typhimurium une mauvaise

candidate à l’enrobage chez D. discoideum.

Les différentes analyses faites avec les isolats de P. aeruginosa ont permis de tirer

plusieurs conclusions. La première est que l’évolution de la série d’isolats cliniques VD

pourrait être expliquée par le fait que P. aeruginosa a une grande capacité de s’adapter à

son environnement, tel les poumons ou les cabinets dentaires. Lorsqu’elle se retrouve dans

un type d’environnement donné, la perte de fonctions non essentielles à la survie de la

bactérie est induite par des mutations bénéfiques pour la rendre plus efficace [170]. Puis, la

formation de biofilm offre, entre autres, l’avantage aux bactéries de se protéger de

différents stress. C’est probablement la raison pour laquelle les isolats environnementaux

du groupe III forment plus de biofilm. Il s’agirait de leur moyen de se protéger. Un autre

phénomène observé lors des différentes analyses des isolats de P. aeruginosa est qu’il y a

une grande variabilité phénotypique pour les isolats cliniques du groupe I. C’est le cas lors

de l’analyse de la formation de biofilm, de la production d’élastase et de la lyse amibienne.

La variabilité phénotypique de ces isolats pourrait être expliquée par le quorum sensing. En

effet, certains facteurs pouvant influencer le quorum sensing, comme la densité cellulaire,

peuvent varier d’une expérience à l’autre [114-115].

Ensuite, P. aeruginosa possède plusieurs facteurs de virulence. Le principal facteur

étudié est l’élastase. L’élastine est un constituant important des fibres élastiques dans les

73

poumons, mais aussi chez plusieurs organismes. D’autres facteurs de virulence ont été

analysés via la lyse amibienne. Les rhamnolipides pourraient être un exemple de facteur de

virulence lysant les amibes. D’autres tests pourraient permettre l’identification de ces

facteurs. La majorité des isolats du groupe II lysant les amibes sont d’origines

environnementales. Ils ont donc plus de probabilité d’interagir avec les amibes. La lyse

amibienne pourrait donc être un moyen de résister à la prédation des amibes.

Puis, aucune bactérie enrobée n’a été observée parmi celles analysées et les

conditions testées. Avec les analyses génomiques et phénotypiques, l’étude des isolats de

P. aeruginosa permet d’affirmer que les isolats cliniques du groupe I et les isolats

environnementaux du groupe II provenant de cabinets dentaires montrent plus de

similarités entre eux qu’avec les isolats environnementaux du groupe III.

Cette étude a aussi permis d’observer le phénomène de résistance à la prédation

pour une levure. Toutefois, aucune levure enrobée n’a été observée. Cependant, un

phénomène intéressant a été observé : la surproduction de couches multilamellaires dans les

amibes. Ce phénomène est peut-être causé par la plus grande taille de la levure

comparativement à celle des bactéries. Cette hypothèse pourrait être confirmée en réalisant

l’essai d’enrobage avec une levure de plus petite taille.

Différentes alternatives sont possibles pour l’étude de l’enrobage de bactéries par

les amibes. Puisque les bactéries pathogènes étudiées dans ce projet ne sont pas de bonnes

candidates pour l’enrobage, d’autres modèles bactériens pourraient être utilisés. Il y a, entre

autres, L. pneumophila connue pour se faire enrober par l’amibe A. castellanii. L’étude de

son enrobage par le modèle amibien D. discoideum pourrait être intéressante. Une autre

alternative possible est l’utilisation d’autres amibes. En effet, la production de CML par les

amibes A. castellanii et H. vermiformis a été confirmée dans la présente étude. L’analyse de

l’enrobage de billes de polystyrène par ces amibes pourrait être une première étape pour

comprendre comment ces amibes enrobent les bactéries résistantes à la prédation.

74

Dans le cas où les alternatives proposées permettraient d’observer des bactéries

enrobées, il faudrait purifier ces bactéries enrobées, les aérosoliser et vérifier leur viabilité

post-aérosolisation comparativement à des bactéries libres de même espèce. La quantité de

bactéries enrobées nécessaire à l’aérosolisation est pour le moment inconnue, mais, après

une première aérosolisation, la viabilité des bactéries enrobées pourrait donner une idée de

la quantité requise. Lors des essais d’enrobage de bactéries, le volume utilisé de coculture

d’amibes, de K. aerogenens et d’ARB était de l’ordre du millilitre. Pour l’aérosolisation,

une plus grande quantité est nécessaire et le volume de la coculture serait plutôt de l’ordre

du litre. Aucune donnée n’est présentement disponible quant à l’aérosolisation de bactéries

enrobées et la viabilité des bactéries post-aérosolisation. Toutefois, une étude a déjà était

faite pour l’aérosolisation de CML vide et les CML étaient intactes après l’aérosolisation

(Valérie Paquet, comm. personnelle). Dans le cas où la viabilité des bactéries enrobées

n’est pas affectée, cela permettrait de vérifier si le phénomène d’enrobage de bactéries

favorise la propagation de maladies infectieuses via l’aérosolisation.

75

CHAPITRE 7 - BIBLIOGRAPHIE

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Étude des interactions entre des bactéries pathogènes et