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Ronéo n°4 – ED n°1 – UE1 1/14 UE1 : Biochimie, Biologie moléculaire, Biologie cellulaire ED n°1 Le 19/10/17 de 8h30 à 10h30 Ronéotypeur : Pablo Urtado Ronéoficheur : Catherine Swiergiel UE1 : Biochimie – Biologie moléculaire ED n°1 : Techniques : comment explorer les gènes Le chargé de TD a rappelé que les éléments donnés pendant les ED faisaient fois pour les partiels. Concernant l’ED n°1, il ne faut retenir que les différentes techniques d’exploration, l’exemple utilisé (IL7 et IL7R) ne sert que d’illustration et n’est donc pas à retenir. Attention, la partie sur le séquençage NGS est nouvelle. Le prof n’a pas voulu nous donner les diapos. Les diapos à savoir par cœur sont celles de la ronéo.

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UE1 : Biochimie, Biologie moléculaire, Biologie cellulaire

ED n°1

Le 19/10/17 de 8h30 à 10h30 Ronéotypeur : Pablo Urtado Ronéoficheur : Catherine Swiergiel

UE1 : Biochimie – Biologie moléculaire

ED n°1 : Techniques : comment explorer les gènes

Le chargé de TD a rappelé que les éléments donnés pendant les ED faisaient fois pour les partiels. Concernant l’ED n°1, il ne faut retenir que les différentes techniques d’exploration, l’exemple utilisé (IL7 et IL7R) ne sert que d’illustration et n’est donc pas à retenir. Attention, la partie sur le séquençage NGS est nouvelle. Le prof n’a pas voulu nous donner les diapos. Les diapos à savoir par cœur sont celles de la ronéo.

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Sommaire

IntroductionI- LaPCR1-Objectif2-Principeetétapes3-RésultatetinterprétationII- SéquençageNGS1-But2-Principe3-Interprétation4-Séquençagedel’exomeIII- CytométrieenFlux1-But2-Etapes3-Interprétation4-VariantesIV- SDSPageetWesternBlot(WB)1-But2-Préparationdeséchantillons3-Dépôtsdesprotéinessurgel4-Résultatsetinterprétation

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Introduction Le but de ce cours est la compréhension des articles que nous serons amenés à lire.

ED sur les méthodes d‘exploration des gènes et des protéines Rappel : la structure des chromosomes est en double hélice d’ADN qui s’enroule autour des histones. Ce sont des protéines qui forment des nucléosomes (octamère d’histone). Ces derniers se condensent et forment la chromatine qui elle même condensée forme les chromosomes. Avec deux chromatides identiques on forme un chromosome qui se trouve dans le noyau de la cellule. On va voir différentes techniques pour étudier l’ADN mais aussi l’expression des gènes c’est à dire l’ARNm et les protéines finales. L’ADN par transcription donne l’ARNm simple brin avec des nucléotides. L’ARNm est traduit et donne des protéines, résultat de l’expression des gènes, qui sont constituées d’acides aminés. Quel type de matériel ? Pour étudier l’ADN, l’ARN et les protéines il y a différentes techniques, différentes approches. On peut faire une étude fondamentale dans ce cas, on regarde le rôle d’un gène, d’un transcrit ou d’une protéine. On peut également faire une recherche clinique où l’on regarde le rôle dans la physiopathologie des maladies humaines. Enfin on peut faire un diagnostic à l’aide de biomarqueur d’une pathologie humaine. Les différentes techniques (à retenir) :

• Pour étudier les gènes : le séquençage NGS (l’année dernière on parlait du séquençage Sanger), la PCR, la CGH (met en évidence le nombre de copies des gènes), FISH, Southern Blot, le caryotype.

BIOCHIMIE - L2 - UE1 - EDMéthodes d ’exploration des gènes et des protéines

FISH

CGH-array

PCR

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• Pour étudier l’ARNm : RT-PCR (Real Time PCR), qRT-PCR (non vu), Northen Blot, Microarray

• Pour étudier les protéines : Cytométrie en flux, Western Blot … .

�Pour gènes et ARNm : utilisation des amorces et des sondes

�Pour protéines : utilisation d’anticorps Qu’analyse t-on ? On peut voir au niveau de l’ADN des anomalies qualitatives c’est à dire des mutations (ponctuelles), des insertions, des délétions ; des anomalies quantitatives c’est à dire l’amplification et la perte de gènes (duplication, délétion des grandes parties du génome) ; et des anomalies du génome. Pour l’ARNm nous regardons l’expression des gènes et du génome, ce qui nous montrera l’absence d’expression d’ARNm ou une sur/sous expression. Au niveau des protéines on peut faire une analyse quantitative (sur/sous expression), une analyse qualitative avec en particulier la location cellulaire (présente ou absente) et des analyses fonctionnelles (la protéine peut être présente sans assurer sa fonction).

produit / gène:- Analyse qualitative: présence absence,

localisation cellulaire- Analyse quantitative- Analyse fonctionnelle

ARNm protéineTranscription Traduction

expression / gène, génome:

Absence d’expression, Surexpression,

Sous expression

SéquençageSouthern Blot

PCR FISHCGH

Caryotype

RT-PCR / qRT-PCRNorthern Blot

microarray

Immunohistochimie, immunofluorescence, cytométrie en flux…

Western blot, immunoprécipitation…

Spectrométrie de masse

Amorces - sondes

Qu’analyse t-on? sur quel type de matériel ?

Anticorps

anomalies / gène, génome:- Anomalies qualitatives: mutations (ponctuelles,

délétions, insertions)- Anomalies quantitatives:

amplifications, pertes de gènes- Anomalies du génome:

pertes, gains chromosomiques, translocations

Gène (ADN)

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Exemple de l’Interleukine 7 (IL7) Afin d’illustrer les différentes techniques, l’exemple de l’interleukine 7 a été choisi pour montrer que les mutations dans le gène du récepteur à l’IL 7 sont impliquées dans les LAL-T (Leucémies aigues lymphoblastiques T) L’Interleukine 7 : L’IL7 se fixe sur le récepteur IL7R, cette fixation est impliquée dans le développement des lymphocytes T (LT). Elle possède un récepteur présent sur la membrane du thymus ainsi que sur celle des LT. Les souris déficientes en IL7 et IL7R ont un blocage précoce dans le développement thymique et un nombre réduits de lymphocytes T périphériques avec des problèmes dans le développement des lymphocytes T. Chez l’homme des mutations inactivatrices de l’IL7R sont responsables d’une immunodéficience combinée sévère avec prédispositions à différentes infections car le système immunitaire n’est pas bien développé et manque de LT. Le récepteur de l’interleukine 7 : il s’agit d’un hétérodimère composé d’une sous unité Rα et d’une sous unité Rγ (deux chaines différentes IL7Rα et IL2Rγ). C’est un récepteur composé de 3 parties : extracellulaire, transmembranaire et intracellulaire à activité tyrosine kinase. Du coté intracellulaire il y a JAK1 et JAK3 qui se fixe et qui vont servir à activer une cascade de signalisation, ce sont des tyrosines kinases. Signalisation : Quand IL7 se fixe sur le récepteur il y a une modification conformationelle de ce dernier et activation des JAK et donc de la voie en intracellulaire. En synthèse : IL7→modification conformationelle du récepteur→ activation des JAK →activation des voies PI3K-AKT et STAT 5. Des anomalies ont été impliquées dans de nombreux types de cancers en particulier les cancers hématologiques. Deux équipes de chercheurs ont fait indépendamment l’hypothèse que des anomalies dans la signalisation du récepteur à l’IL7 pourrait être impliqué dans les LAL-T. On va donc chercher à comparer les séquences des gènes qui codent pour le récepteur de l’interleukine 7 chez des personnes normales puis chez des patients atteints de LAL-T. Pour faire cela, on va tout d’abord effectuer une amplification de la séquence d’ADN puis faire le séquençage des différents gènes. I. La PCR : Polymerase Chain Reaction 1- Objectif La PCR est une technique d’amplification in vitro d’un fragment d’ADN (matrice). On obtient à partir d’un gène donné des millions d’exemplaires qui pourront ensuite être séquencés puis étudiés. A quoi sert le PCR ? En recherche : -amplification de l’ADN pour clonage -screening d’animaux transgéniques/clones bactéries -amplification de gènes pour séquençage Sanger (pas détaillé) En clinique : -amplification de gène pour séquençage de Sanger -screener différentes mutations (screening de biopsie)

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2-

Principe et étapes La PCR est une technique qui nécessite deux amorces (sens (5’→3’) et anti sens (3’→5’)), des dNTP (désoxyribonucléotides tri phosphate), une ADN polymérase thermostable (Taq polymerase). La PCR comporte 20 à 40 cycles successifs de 3 étapes : la dénaturation, l’hybridation et l’élongation. Ces 3 étapes sont répétées plusieurs fois.

1. La dénaturation : on a une séquence d’ADN soluble double brin que l’on chauffe à une température de 95° pour rompre les liaisons hydrogènes entre les deux brins. Ces derniers se séparent sans être détruits.

2. L’hybridation : Cette étape correspond à l’ajout d’amorces spécifiques (petites, environ 20

NT) complémentaires à la matrice. Ces amorces sont appelées amorces sens et anti sens car l’une va cibler le brin orienté en 5’→3’ et l’autre le brin orienté en 3’→5’. On cerne le gène d’intérêt. L’association des amorces avec les brins d’ADN dénaturés étant impossible à une température de 95°, on va donc devoir baisser la température jusqu’à la Tm (température de fusion pour laquelle 50% de la structure double brin de l’ADN est perdue qui est comprise entre 55 et 65°). Cela permet une hybridation optimale des amorces. Attention on doit rester à une température relativement élevée pour maintenir les deux brins d’ADN séparés. Si la température est trop basse l’amorce se fixera trop vite à la matrice et pourra former des mésappariements.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

A quoi sert cette technique?

En Recherche:

- amplification d’ADN pour clonage- screening d’animaux transgéniques / clones bactériens- amplification de gène pour séquençage

En Clinique:

- amplification de gène pour séquençage (recherche de mutation chez des patients)- screening de biopsie

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3. L’élongation : tout en restant à une température relativement élevée 72° pour maintenir les deux brins séparés, on ajoute une ADN polymérase thermostable (c’est à dire qu’elle fonctionne à une température élevée), avec comme cofacteur du sel de magnésium, qui pourra synthétiser les deux nouveaux brins à la suite des amorces.

Ces trois étapes constituent un cycle. Les deux copies obtenues lors du premier cycle ne suffisent pas. On va donc répéter ce cycle un certain nombre de fois afin d’obtenir des milliers de fragments. On

obtient à la fin 2n fragments avec n le nombre de cycles effectués.

Les premiers fragments obtenus sont toujours plus grands car l’ADN polymérase reste longtemps et à mesure que les cycles passent, on obtient des fragments de taille similaire qui correspondent exactement à la séquence ciblée, on parle d’amplicon.

Après cette technique on peut faire du séquençage Sanger mais on n’en parlera pas dans ce cours.

3- Résultat et interprétation : Les fragments d’ADN amplifiés sont séparés en fonction de leur taille par électrophorèse sur un gel et visualisé avec un agent intercalent BET. A l’examen il faut savoir différencier les différentes techniques, par exemple différencier un PCR d’un western blot. Astuce : on regarde sur les graphiques les échelles : bp pour PCR qui veut dire paire de base et Kda pour Western Blot qui veut dire kilo Dalton.

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II- Séquençage NGS (Nouvelle génération) 1- But Le séquençage NGS est une méthode qui permet de déterminer l’enchainement des nucléotides d’un fragment d’ADN. Cela permet de détecter des mutations. 2- Principe Séquençage d’un seul brin. Méthode : 1-fragmentation de l’ADN génomique et dénaturation 2-ligation d’adaptateur à chaque extrémité de chaque fragment D’ADN. 3-hybridation sur une flow cell (lame de verre) via les adaptateurs 4-amplification par pont, formation de cluster 5- le séquençage :

• les 4dNTP couplés à un fluorochrome (qui bloque l’élongation) s’incorpore à la suite d’une amorce qui s’hybride à l’adaptateur

• lavage (car les dNTP sont toujours mis en excès) • prise d’une image • élimination du fluorochrome • répétition du cycle 150 à 300 fois

6- alignement et analyse des données grâce aux ordinateurs. 3- Interprétation : Chaque image à chaque cycle détermine la séquence de chaque cluster. Ceci nous permet d’avoir une séquence complémentaire du fragment d’ADN que l’on cherche à séquencer. Dans un premier temps il faut préparer des librairies. Au début on a de l’ADN génomique (du patient), on va le fragmenter et le dénaturer (chauffer pour séparer les deux brins). On va rajouter à chaque petits bouts d’ADN fragmentés et de chaque coté des adaptateurs qui seront utiles par la suite. On a une étape de ligation par une enzyme (une ligase) qui accroche les adaptateurs sur l’ADN fragmentés → la librairie est prête pour le séquençage. On va séquencer le génome en entier. On a une lame de verre (flow cell) où sont greffées des amorces. On fait passer notre préparation de librairie sur cette lame, les adaptateurs vont s’hybrider aux amorces greffées sur la lame de verre. Ceci permet d’amplifier les fragments d’ADN par PCR. Une fois les fragments hybridés à la flow cell via les adaptateurs ils vont s’amplifier par ponts. D’abord il y a une hybridation (possible car la dénaturation a été faite au moment de la préparation des librairies), puis élongation. Après tout cela on recommence un nouveau cycle (dénaturation, hybridation et élongation). Cette amplification va permettre de créer plusieurs cluster chacun

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correspondant à une seule séquence amplifiée � Chaque cluster contient plusieurs copies d’une seule séquence simple brin. On a généré les clusters et on va passer au séquençage. Sur la lame, on va disposer les 4dNTP couplés à un fluorochrome. On a une amorce, une polymérase et des nucléotides. Au fur et à mesure les nucléotides vont s’intégrer, le groupement fluorescent empêche qu’il y ait un autre nucléotide qui s’accroche derrière. A chaque étape il y aura qu’un seul nucléotide qui va s’intégrer. 1- ajout des 4dNT couplés à un fluorochrome : -incorporation à la suite de l’adaptateur -le fluorochrome bloque l’extension 2- lavage pour éliminer les nucléotides en excès. 3- photo de la flow cell. 4- réaction de clivage du fluorochrome bloquant l’extension. 5- on refait les 4 premières étapes 150 à 300 fois : on séquence donc des fragments de 150 à 300 paires de bases (car il y a seulement un nucléotide intégrer à chaque cycle). Suite à cela, on va utiliser des ordinateurs qui vont pendre les séquences déterminées et qui vont les comparer avec le génome de référence. L’ordinateur regarde à quel endroit du génome de référence, la séquence déterminée ressemble le plus. Ceci permet de savoir pour quel gène code le fragment d’ADN qu’on a séquencé.

But: déterminer l’enchaînement des nucléotides d’un fragment d’ADN.

Permet de détecter les mutations.

Principe:- Fragmentation de l’ADN génomique et dénaturation- Ligation d’adaptateurs à chaque extrémité

- hybridation sur une flow cell via les adaptateurs

- Formation de cluster (Amplification par pont)

- séquençage- les 4 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) couplés à un fluorochrome

(qui bloque l’élongation) s’incorpore à la suite d’une amorce quis’hybride à l’adaptateur

- Lavage- prise d’une image- élimination du fluorochrome

- alignement et analyse des données

Interprétation:

chaque image à chaque cycle détermine la séquence dechaque cluster.Comparaison avec séquence de référence

Séquençage par NGS

Séquençage d’un seul brin

300 cycles

Flowcell

Amplification par pont

séquençage

1

2

3

4

5

6

12

3

4

5

6

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4- Séquençage de l’exome (l’ensemble des exons) Les exons représentent la partie codante du génome qui représente à 1.5 à 2% du génome. 1) Préparation de la librairie pour avoir seulement des exons

• fragmentation et dénaturation de l’ADN (génome entier), ajout des adaptateurs par une transposase (enzyme qui coupe l’ADN et qui met des adaptateurs en même temps)

• ajout d’ARN biotinylé complémentaires de la séquence recherchée (ici : exons) • hybridation de l’ARN biotinylé sur nos séquences génomiques cibles dénaturées • ajout des billes magnétiques recouvertes de streptavidine (qui se fixe sur l’ARN biotinylé) • sélection des séquences génomiques d’intérêt par capture des billes magnétiques • élimination des ARNs

2) séquençage NGS (que les exons) Exemple : Recherche de gènes mutés dans les LAL-T Les méthodes utilisées : PCR et séquençage NGS Echantillons : ADN génomique extrait de cellules leucémiques de patients atteints de LAL-T (sang, moelle osseuse) Ces patients avec une LAL-T présentent des mutations dans le gène codant pour IL7R dont une mutation ponctuelle (dans environ 10% des LAL-T) de A (Alanine)→T (Thymine), par conséquent cela change l’AA (acide aminé) de la protéine de Sérine → Cystéine et une petite insertion/délétion. On suppose que IL7R est impliqué dans la tumorogénèse dans les LAL-T. Pour toutes les mutations identifiées il n’y a pas de modification du cadre de lecture. Elles se font dans le domaine transmembranaire Est ce que le récepteur muté est il normalement exprimé à la surface des cellules ? On prend des cellules transfectées avec IL7R WT (Wild Type → pas de mutation dans le récepteur) et avec IL7R muté. On analyse l’expression membranaire du récepteur par cytométrie de flux. On effectue une cytométrie de flux sur cellules non transfectées. Le graphique obtenu montre la présence de marqueurs de LB et l’absence de marqueurs de IL7R. On effectue une cytométrie de flux sur des cellules transfectées les premières avec IL7R WT et le deuxième avec IL7R muté. Dans les deux cas on obtient un graphique montrant la présence d’IL7R. On en déduit que IL7R muté se trouve bien à la membrane des cellules III- Cytométrie en flux 1-But Etude de l’expression de protéines à l’échelle cellulaire.

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2-Etape Dans notre exemple on souhaite mettre en évidence un récepteur :

• marquage des cellules par les anticorps couplés à des fluorochromes. • lecture de la fluorescence des cellules une par une dans le cytomètre en flux. • comptage des cellules fluorescentes. • mesure de la taille et de la structure des cellules (identifier différents types cellulaires d’un

échantillon). • Co marquage de différentes protéines (fluorochromes différents).

→ tout se fait en même temps par le cytomètre qui utilise un laser et des miroirs afin de mesurer la taille et la granulosité des cellules qui passent une par une devant le laser. Il excite les fluorochromes qui permettront l’indentification. 3- Interprétation

• quantification de l’intensité de fluorescence corrélée au taux d’expression de la protéine • pourcentage de cellules positives par rapport à la population cellulaire totale • 5000 cellules comptées au minimum pour les statistiques

4- Variantes Tri cellulaire possible : cellules marquées récoltées une par une dans des tubes collecteurs grâce à des aimants. Exemple : nombre de LTCD4 /LTCD8 chez patients HIV → en faisant passer les cellules une par une devant le laser, on obtient deux lignées de cellules différentes en fonctions des marqueurs de surface. La quantification de l’intensité de fluorescence permet de voir le niveau d’expression de la protéine fixée par l’anticorps fluorescent (expression d’une protéine plus importante sur des cellules cancéreuses donc fluorescence plus forte).

Cytométrie en flux (CMF)

Interprétation:- Quantification de l’intensité de fluorescence, corrélée au taux d’expression de la protéine- % cellules positives par rapport à la population cellulaire totale

- 5000 cellules comptées minimum pour les statistiques

Variante:- Tri cellulaire possible (cellules marquées récoltées une par une dans tubes collecteurs)

But: Etude de l’expression de protéines à l’échelle cellulaire

Etapes:- Marquage des cellules par des anticorps couplés à des fluorochromes- lecture de la fluorescence des cellules une par une dans le cytomètre en flux- Comptage des cellules fluorescentes- mesure de la taille et de la structure des cellules (identifier différents types cellulaires d’un échantillon) - Co-marquages de différentes protéines (fluorochromes différents)

Tout se fait en même temps par le cytomètre

Analyse 2 fluos

CD4

CD8

Analyse taille-structure

Taille

structurefluorescence

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Est ce que la mutation sur IL7R entraine un problème de prolifération des cellules ayant IL7R muté ? Dans un milieu nous avons les cellules IL7R WT et les cellules IL7R muté. En présence IL3 toutes les cellules prolifèrent de la même façon. En présence de IL7 les cellules mutées prolifèrent plus que les cellules WT. En absence de cytokines les cellules mutées prolifèrent quand même et les cellules WT ne prolifèrent plus puisqu’elles ne sont pas activées. La mutation avec ou sans cytokines est responsable d’une prolifération augmentée → SURACTIVATION DU RÉCEPTEUR

IV- La SDS Page et le Western Blot (WB) 1-But - SDS Page : séparation des protéines totales de cellules ou de tissus en fonction de leur poids moléculaire. - WB : détection d’une protéine spécifique au milieu d’un mélange de protéine. 2- Préparation des échantillons

• extraction des protéines, lyse cellulaire. • addition de SDS (c’est un sel qui va se fixer sur les protéines et les rendre négatives, elles

migrent donc du pôle – au pôle + sur le gel d’électrophorèse) et agent réducteur DTT ou βME (coupe les ponts disulfures qui se forment au niveau des Cystéine). Chauffage à 100° (pour permettre la dénaturation de leurs chaines polypeptidiques) → on obtient une protéine sous sa forme primaire, les protéines vont alors migrer selon leurs tailles.

3- Dépôt des protéines sur gel

• électrophorèse sur gel poly acrylamide qui forme des pores dans lesquels les protéines vont être ralenties : les petites protéines migrent plus loin.

• transfert des protéines sur une membrane de nitro cellulose. • Incubation avec des anticorps spécifiques couplés à une enzyme ou à un fluorochrome qui

atteste de la présence de la protéine d’intérêt. • détection de la protéine d’intérêt.

4- Résultat et interprétation

• Présence ou absence d’une protéine d’intérêt. • Recherche de la phosphorylation ou non des protéines → dans ce cas on utilise des anticorps

qui vont se fixer spécifiquement sur les sites de phosphorylations

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Retour à notre exemple initial : on analyse par WB la phosphorylation des protéines de signalisation des cellules transfectées par IL7R WT ou muté. -Pour les cellules avec un récepteur normal WT :

• en l’absence d’IL-7, Jack 1 n’est pas phosphorylé. Stat 5 présent / non phosphorylé, de même pour Akt

• En présence d’IL-7, Jack 1, Stats 5 et AKT sont présents et phosphorylés. -Pour les cellules transfectées avec le récepteur muté :

• Avec IL-7 : la voie de signalisation est active, jack 1, Stats 5 et Akt sont phosphorylés • Sans IL-7 : la voie de signalisation est active, jack 1, Stats 5 et Akt sont phosphorylés

On en conclut que lorsqu’il est muté, le récepteur à IL-7 est dans une conformation active. On avait mis en évidence lors de l’analyse de la séquence d’acides nucléiques puis d’acides aminés, de nombreuses insertions contenant systématiquement une cystéine. Cette cystéine peut être à l’origine de la formation de ponts disulfure. -On ajoute du DTT, une molécule qui permet de réduire les ponts disulfures.

• Pour le récepteur normal, qu’on soit en présence ou en absence de DTT, le poids moléculaire est identique.

• Pour le récepteur muté en absence de DTT, on observe deux bandes (64 et 97 kDA) qui correspondent au récepteur dimérisé car les chaines polypeptidiques sont associées par un pont disulfure qui a pu se faire à cause de la cystéine anormalement présente.

• Pour le récepteur muté en présence de DTT, il y a dissociation des deux chaînes peptidiques, on se retrouve donc avec un récepteur normal.

SDS-PAGE/Western blotBut: - SDS-PAGE= séparation des protéines totales de cellules ou de tissus en fonction de leur poids moléculaire

- Western Blot =détection d’une protéine spécifique au milieu du mélange de protéines

SDS-PAGE = Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electophoresis

Résultat et interprétation:•Présence/absence d’une protéine d’intérêt•Modifications post-traductionnelles

• Ex: phospho-protéine

Electrophorèse sur gel Poly-Acrylamide

Transfert sur membrane de nitrocellulose

Détection de la protéine d’intérêt

Dépôt des protéines sur gel

-

+

Petits PM

Grands PM

Incubation anticorps spécifique

Phospho-prot X (Thr75)

Phospho-prot X (Thr34)

Prot X non phosphorylée

Préparation des échantillons:- extraction des protéines- Addition de SDS + agent réducteur (DTT ou EME) et chauffage à 100°C

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Le DTT en détruisant le pont disulfure formé par les cystéines supprime la conformation dimérique du récepteur et le désactive. Il permet donc l’inhibition de la voie de signalisation. De plus on a réalisé une expérience au cours de laquelle on remplace la cystéine par une sérine. En présence ou non de DTT, l’IL7R avec une sérine à la place d’une cystéine est moins dimérisé donc moins actif. => La dimérisation du récepteur muté et l’activation des voies de signalisation dépend de la présence d’un résidu cystéine. Synthèse : -cystéine introduite par des mutations -ponts disulfures entre deux molécules d’IL7R -homodimérisation du récepteur -activation constitutive de la voie de signalisation en aval -hyperprolifération et survie cellulaire Application thérapeutique : utiliser des inhibiteurs de JAK/STAT → diminution de la phosphorylation des protéines impliquées dans la voie de signalisation et donc diminution de la prolifération des cellules.