Une methode de planification experimentale appliquee aux cultures de tissus vegetaux. Exemple de la canne a sucre (Saccharum sp.)

ROSE GALZY Ltrbornioire tie Rec~1rer.clre.s tle Itr Choire tic GBrrC/iqrrc e / Microhiologie, Cer1ir.c ele Rcclrcrclrcs Agrorrorrticl~ies

tic, Morl/prIlic,r, P1trc.c) Vitrltr, 34060 Morl/pellier, Frtrr1c.e

R e p le 10 avril 1979

SAUVAIRE. D., et R. GALZY. 1980. Une methode de planification experimentale appliquee aux cultures de tissus vegetaux. Exemple de la canne sucre ( S N C . C . / I N ~ I ~ ~ T Z sp.). Can. J . Bot. 58: 264-269.

Des racines et des parties terminales de tiges sont prelevees sur des boutures de canne sucre (Srrccllrrrrrr~r sp., clone Q 75) cultivees it1 c;i/ro. L'influence de la lumiere, de I'acide 2,4- dichlorophenoxyacetique et de la 6-benzyl-aminop~~rine sur I'initiation et la croissance des cals est etudiee. Une premiere selection des facteurs est effectuee par un plan factoriel h deux niveaux. La presence de lumiere inhibe fortement la formation des cals. Les experiences suivantes s e deroulent donc a I'obscurite. L'optimisation des concentrations en substances de croissance se fait au moyen de plans centres composes selon la methode de Box et Wilson. Des modkles mathematiques sont etablis. Ils permettent le calcul des concentrations optimales theoriques. Aucune diffusion de composes phenoliques dans le milieu n'a etC observee. Des plantes ont pu 6tre regenerees par transfert des cals d'origine caulinaire sur un milieu pauvre en auxine.

S A U V A I R E , D., and R. GALZY. 1980. Une methode de planification experimentale appliquee aux cultures de tissus vegetaux. Exemple de la canne a sucre (Socchtrt~rr~r sp.). Can. J . Bot. 58: 264-269.

Fragments of roots and shoot tips were taken from sugarcane (Srrcchtrrirrrr sp., clone Q 75) plants propagated it1 c;i/ro. The effects of light. 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 6-benzyl- aminopurine on initiation and growth of calli were observed. These factors were first studied at two levels in an experiment based on a factorial design. Light appears to inhibit callus formation. Thus, the next experiments were carried out in the dark. Optimization of the concentrations of growth substances was attained using a more complete factorial plan, according to Box and Wilson's method. Mathematical models were established and used in the calculation of the most favourable combinations of these growth substances. The diffusion of phenolic compounds in the media never occurred. Neoformation of plants was obtained by transferring calli of stem origin to a medium with a low concentration of auxin.

Introduction La multiplication est assuree par le tallage et la L~ mise au point d3L,ne techniqLle de c u l t u r e ill separation des differentes talles lors des re-

vitrO presente deux aspects essentiels: le choix piquages. Ces plantes vont nous servir de materiel d'un materiel de depart favorable et I1optimisation de depart pour des experiences sur I'initiation et la des conditions de culture. N~~~ avons essay& de cr0iSSaa"ce de cals. Deux types d'explantats SerOnt precisel- ces deux points en etudiant ]'initiation de compares: des fragments racinaires et des parties cals chez la canne a sucre. terminales de tiges.

La culture ill vitro de tissus de canne sucre a Fisher (6) f i ~ t le premier a demontrer l'interct debUte en 1961 a H ~ ~ ~ , 15). ~ ~ ~ ~ ~ f ~ i ~ , qu'il y a a combiner I'etude de plusieurs facteurs

plusieurs problkmes tels que la desinfection des dans une mcme experience dite factorielle. De tels

explantats (91, ou llexsudation par les tissus en plans factoriels ont ete peu utilises dans le cas des cul ture de substances colorees (8, 12) sent encore cultures de tissus vegetaux in vitro. Citons ma1 resolus. toutefois les travaux de De Fossard et coll. notam-

N~~~ avons deja presente (18) une methode ment sur le tabac (5) et l'eucalyptus (4), et de Vuil-

d'obtention de plantes entikres de canne a sucre ill 1mI-Ie et Deshayes sur le mai's (21). Les premiers

c.trO par developpement de bourgeons axillaires. preconisent un rassemblement des facteurs du milieu en quatre groupes qu'ils etudient a trois

'Auteur a qui toute correspondance doit i t r e adressee. niveaux, afin de deceler la combinaison optimale.

0008-4026/80/020264-06$0 1 .OO/O @I980 National Research Council of CanadaIConseil national de recherches du Canada

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Les seconds procedent a Line etude a deux niveaux qui leur permet de degager I'effet de chaque facteur ainsi que la nature des interactions.

Nous avons choisi la methode des plans centres composes selon Box et Wilson (I) . Celle-ci im- plique deux etapes. Une premiere selection des facteurs influenqant la reponse est effectuee I'aide d'un plan factoriel B deux niveaux. Par la suite, le plan centre compose lui-mime doit permettre d'obtenir un modele du fonctionnement q~iantitatif du systeme et de determiner les optima. Les vari- ables sont alors etudiees B cinq niveaux.

Cette methode de planification experimentale permet tout en minimisant la perte d'information de reduire considerablement le nombre de com- binaisons a etudies. Pour quatre variables, par exemple, 31 combinaisons seront testees par la methode de Box et Wilson. Un plan factoriel com- plet j4 impliquerait quant a lui l'etude de 625 points experimentaux.

Dans ce ti-avail nous nous sommes limites a

culture dans le cas des tiges et apres 50 jours dans le cas des racines. La callogenese est en effet b e a ~ ~ c o u p p l ~ ~ s rapide dans le premier cas. Les valeurs ainsi obtenues (v) sont tr-ansformees pour I 'ltude matheniatique en > I ' = 100 arcsin-.

La croissance des cals d'origine racinaire est appreciee par pesee apres 50 jours de culture. Les resultats sont exprimes en milligrammes de poids frais.

Chaque resultat eorrespond B la moyenne de I5 mesures.

Mt;thotlologit, r.r~~t;rit?rt~trttrlr La premere etape consiste h selectionner au nioyen d'un plan

factoriel a deux niveaux les variables experinientales influensant la l tponse etudiee. Ce plan pcrmet d'obtenir les effets des differents facteurs et de leurs interactions.

Lcs 11 variables quantitatives et continues les plus influentes ( X I , XZ. . . .X,,) sont ensuite etudiees de f a ~ o n plus precise par un plan centre compose. Elles sont alors expkrirnentees h cinq niveaux codes ( -a ) , (-1). (0). (+I) . ( + a ) . Ce plan derive du plan ;I deux niveaux et se compose de trois parties: (tr) Ic plan factoriel 2" (nivcaux codes (-1) et (+I ) ) ; (/I) 211 points axiaux (niveaux codes (-a) et ( f a ) ) ; (t.) 11, points centraux (niveau code (0)). La valeura cst fonction du nombre de variables. Elle est calculee selon un critkre d e rotabilite du plan. Les tr, repiti- tions du point central permettent d'ameliorer la precision et de calculer I'erreur exoerimentale.

I'etude de trois facteurs qui Semblent, d'apres la Le Tableau 1 montre la structure d'un tel plan pour I'etude de

litterature, jouer un r61e important. L~ presence deux facteurs. Le developpement de la matrice plan met en evidence les interactions et les effets de second ordre. Les d'une auxine est necessaire B I'initiation de cals. combinaisons I a correspondent au plan 22, Les

L'acide 2,4-dichlorophenoxyacetique (2,4-D) est points axiaux sont representts parles combinaisons 5 h 8. icia = souvent utilise pour les cultures de tissus de mono- 1.414. La repetition du point central cst assuree par les coni-

cotyledones telles que le riz ( I 1) ou le mais (19). binaix)ns9g1 13. Ce plan permet la representation par un rnodkle matheniatique

Cette semble l a plus efficace dans le de la fonctionnelle liant rep~)nsc ( Y ) aux ~ ; ~ r i a b [ ~ s de la canne sucre (8). Depuis les travaux de Skoog expirimentales (X,, XZ. . . . X,,). Dans un but de simplification. et Miller (20) on connait I'impostance de I'interac- on suppose que cette fonction pcut Ptre modGIisle p:u- une tion auxine-cytokinine. Nous avons d'etu- courbe ou une surface courbe d e second degre pour un espace

die,. la 6 benzil-aminopurine (~ -BAP) . ~ l i ~ f l ~ ~ ~ ~ ~ englobant I'extremum. Lc mod&le choisi est donc une equation quadratique de forme generale: de la lumiere sur I'initiation de cals de mono-

cotyledones est assez ma1 connue. Suivant les auteurs les cultures sont conduites a I'obscurite Y = (1, + 1 a i X i + 1 a i i x i 2 (lo), ou a la lumiere en eclairement continu (2) ou i = I i= 1

non (12). Nous avons teste l'absence ou la presence " - I de lumiere. + 1 a i j x i x j + E

i=1 j=i+1

Materiel et methodes Mott;rirl r t t?rt;t/rot/r tie clrit~rrc,

A partir de plantes de canne 5 sucre du clone Q 75 cultivees en conditions steriles (18). deux types d'explantats sont utilises: ((1) des fragments de racines; (b ) des parties terminales de tiges comprenant le bourgeon apical.

Le milieu de base comprend: la solution minerale de Murashige et Skoog (13). du saccharose 30g/L, de la glycine 2 mg/L, la solution de vitamines preconisee par R. Galzy (7) et de la gelose 8 g/L. L e pH est ajuste 5.6. Les cultures se font en boites de Petri, B une temperature de 28°C. Selon les experi- ences, des concentrations variables de 2.4-D et de 6-BAP sont ajoutees a ce milieu. De plus les cultures sont maintenues a I'obscurite (situation A) ou en presence de lumiere de type "lumiere du jour de luxe" (situation B). L'intensite lumineuse est alors de 4000 Ix environ durant 14 h parjour.

L'intensite de I'initiation est mesuree par le pourcentage d'explantats ayant initie au moins un cal apr t s 15 jours de

dans laquelle r r , represente la reponse moyenne; tr , , (Iii , (I,,, les differents coefficients; E , I'erreur experimentale.

L'adequation du modkle aux resultats experimentaux est testee par une analyse de variance au seuil P = 0.05. La signification de chaque coefficient se fait par un test t. Les coefficients significatifs au seuil P = 0.10 sont soulignts dans les modkles.

Une representation graphique en coordonnees X,X, des courbes de reponses constantes est effectuee. Ces courbes sont etablies d 'aprts le modtle. Pour plus de clarte. les reponses sont indiquees sur les courbes en valeurs non transforrnees.

Les valeurs optimales theoriques des differents facteurs sont obtenues en differentiant I'equation quadratique par rapport a chacun des Xi. puis en calculant les solutions pour lesquelles ces derivees s'annulent. Seules les valeurs contenues dans I'espace etudik peuvent Ptre retenues.

L e calcul des modkles, leur analyse statistique et les courbes de reponses constantes ont ete obtenus sur ordinateur.

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TABLEAU 1. Matrice d'un plan centre compose a deux facteurs X l et X Z , et son developpement

NumCro corn binaison

Matrice plan Developpement de la matrice plan

Constante

TABLEAU 2. Influence du 2,4-D, de la 6-BAP et de la lumiere sur la callogenese de fragments racinaires. Analyse de la variance des differents effets

Facteurs Resultats Effets Somme Degres des de Carre Fb

X I XZ x3 Y ( % ) Y'O Nature Valeur carres liberte moyen observe

Resultats Mise etl kvicletlcr dr l ' i t~fluet~ce cles trois fcrcteurs

etut1ic;s L'influence du 2,4-D (X,), de la 6-BAP (X,) et de

la lurniere (X,) sur l'initiation de cals a partir de racines est etudiee selon un plan a deux niveaux (Tableau 2). Ceux-ci correspondent aux concen- trations 0.5 et 3.0 rng/L pour le 2.4-D; 0.1 et 0.3 rng/L pour la 6-BAP; et pour la lurniere aux situations (A) et (B) definies precedernrnent. Les effets principaux (codes x,, x,, x,) et les interac- tions (codees x,-x2, x, - x,, x2 - x,, x , - x2 - x,) sont calcules d'apres la rnethode citee par Sanglier (17) (Tableau 2). L'analyse de variance perrnet de verifier l'influence des effets rnajeurs par rapport a ceux de faible importance regroupes en une source de variation residuelle (3).

La I~lrniere et l'interaction 2,4-D-6-BAP ont une

concentrations utilisees et des resultats obtenus dans l'experience precedente. Les concentrations en 2,4-D (X,) sont donc centrees autour de 3 rng/L. Pour la 6-BAP (XJ, elles sont centrees sur une valeur inferieure a 0.1 rng/L afin de dirninuer les influences negatives de cette cytokinine et de l'in- teraction 2.4-D-6-BAP observees precedernrnent. Les garnrnes de concentrations etudiees sont in- diquees sur les Figs 1 et 2. La structure du plan est identique a celle du Tableau 1.

Les cals obtenus ont l'aspect de petites masses cornpactes. 11s apparaissent tout le long de la racine apres 20-30 jours de culture. La presence de Ie- sions sur la racine sernble favoriser leur initiation.

Les resultats rnesures apres 50 jours de culture (Tableau 3) ont perrnis d'etablir les rnodeles sui- vants pour I'initiation Y, et la croissance YB des cals.

influence forternent inhibitrice sur I'initiation des y A = 12,48 + 20.03 X, - 18.29 X2 - 7.27 cals. De plus le 2.4-D et la 6-BAP ont des effets - -

- 4.17 X2' opposes et syrnetriques. Les experiences suivantes vont donc se derouler a l'obscurite. L'action des YB= 156.00 + 23.07 XI - 3 3 X2 - 23.75 X I 2

substances de croissance va &re etudiee de facon - 22.00 X2' - 14.75 XIX2

plus precise au rnoyen de plans centres composes. La verification par 17analyse stat is t ique de It~iticitiotl cle culs ci pcit.tit. tle t.cicitzes l'adequation de ces rnodeles (Tableau 4) perrnet

L'espace experimental est choisi en fonction des d'effectuer une representation graphique du

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6 B A P ( rng/~)

FIG. 1. Co~~rbes de reponses constantes obtenues avec le modele Y:,.

FIG. 2. Courbes de reponses constantes obtenues avec le modele Y,*.

phenomlne (Figs 1 et 2) et de calculer les valeurs theoriques optimales.

L'intensite maximale (100%) d'initiation des cals n'est pas atteinte dans l'espace etudie. Les condi- tions necessaires a une bonne croissance des cals sont mieux definies. La reponse maximale theorique est obtenue avec 7.4 mglL de 2,4-D et 9.3 x mg/L de 6-BAP.

La combinaison theorique o~ t ima le pour la croissance permet d'atteindre 97 k 6% d'initiation

TABLEAU 3. Initiation et croissance de cals a partir de racines

Initiation Croissance Numtro

combinaison yA(z) Y'A" ~ ~ ( m g )

1 60.0 88.6 118 2 100.0 157.1 203 3 20.0 46.4 70 4 80.0 110.7 96 5 60.0 88.6 71 6 78.0 108.3 123 7 90.0 124.9 148 8 56.0 84.6 53 9 90.0 124.9 132

10 60.0 88.6 174 11 70.0 99.1 136 12 90.0 124.9 188 13 90.0 124.9 150

Y',, = 100 arcsin m. de cals. Ce milieu "sub optimal" constituera notre milieu d'initation de cals a partir de racines.

Illitiation cle cals 2 pcrrtir cle pcrrties ter1?7incrles cle tiges

Un nouveau plan centre compose est effectue avec cet autre type d'explantat. Les concentrations etudiees sont comprises entre 3 et 10 mg/L pour le 2,4-D (XI) et entre Oet 0.1 mg/L pour la 6-BAP(X2).

L'initiation de cals a partir de parties terminales de tiges se fait tres rapidement. Les premiers cals sont visibles apres 5 jours de culture. 11s apparais- sent sur la section de la tige et plus rarement sur la section des gaines foliaires. Comme pour les racines, il n'y a pas eu de diffusion de substances colorees dans le milieu de culture.

L'intensite de l'initiation bc.) est mesuree apres 15 jours de culture (Tableau 5). Le modele Y,. est obtenu et sa signification etablie au seuil P = 0.05 (Tableau 4).

La combinaison optimale theorique (7.0 mg/L de 2,4-D et 5.7 x mg/L de 6 BAP) se trouve bien dans l'espace experimental (Fig. 3). Elle permet une initiation theorique de cals sur 93 $. 1% des explantats en 15 jours.

Discussion Annlyse cles rc;sultcrts

Les concentrations optimales en substances de croissance pour l'initiation de cals a partirdes deux types d'explantats choisis sont assez proches. Toutefois des differences ont pu &re observees. ( ( 1 )

L'initiation de cals est beaucoup plus rapide dans le cas des extremites de tiges. (b) La capacite de neoformation d'organes des cals obtenus a ete

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TABLEAU 4. Analyse de variance des modtles mathimatiques

Source de Somme DegrCs CarrC F F(0.95) Modtle variation des carrCs de libertt moyen observC thCorique

Y A ExpliquCe 6325.738 4 1581.435 RCsiduelle 2724.017 8 340.502 4 .64 3 .84

Y B ExpliquCe 22043.109 5 4408.621 RCsiduelle 3648.556 7 521 ,222 8.46 3.97

y c Expliqute 3096.110 5 619.222 Rtsiduelle 78 .223 5 15.645 39.58 5.05

TABLEAU 5. Initiation decals & partir de tiges

Initiation NumCro

combinaison YC(%) Y'C"

1 6 7 . 0 95 .9 2 83.0 114.6 3 4 7 . 0 75 .5 4 60.0 88 .6 5 82 .4 113.8 6 89.0 123.3 7 82.3 113.7 8 65.0 93.8 9 92.0 128.4

10 93.0 '130.3 11 87.0 120.2

y'c = 100 arcsin m.

comparee sur un milieu pauvre en 2,4-D. Les cals d'origine racinaire n'ont regenere que des racines. Par contre, les cals d'origine caulinaire ont permis l'obtention de nombreuses tiges, qui, une fois isolees, ont pu s'enraciner et &re multipliees selon la methode de bouturage iiz vitro.

Soulignons enfin que I'on n'a pas observe d'ex- sudation de substances colorees dans les milieux de culture. On peut penser que ce comportement est lie a I'origine des explantats. Ceux-ci proviennent en effet de plantes cultivees in vitro de faSon pro- longee. Ce mode de culture peut entrainer diverses modifications du metabolisme. On a demontre, par exemple, chez la pomme, que les composes phenoliques contenus dans les cals formes iiz vitro different par leur quantite et leur nature de ceux que I'on trouve dans les tissus d'origine (16).

Critiques de la mkthode La methodologie experimentale utilisee permet

une approche globale, efficace et non biaisee d'un systtme a multiples variables quantitatives con- tinues. Toutefois il existe certains inconvenients lies au modele mathematique. (a) Le choix d'un modele simple implique que celui-ci ne sera qu'une approximation empirique. Des relations asymp- totiques seront, par exemple, ma1 representees par

6 BAP (mg/L)

F I G . 3 . Courbes de reponses constantes obtenues avec le rnodele Y, .

un tel modele. Neanmoins son adequation aux resultats experimentaux peut etre testee par une analyse de la variance. (b) Ce modele n'est valable que dans I'espace etudie. Aucune extrapolation n'est possible. Dans le cas ou la zone optimale est situee hors du champ experimental, une recherche de cette zone par une methode telle que celle de la plus grande pente est necessaire (1, 17).

Lorsque I'on cherche mettre au point des con- ditions de culture, il est necessaire de proceder par etapes successives. (a) Une experiencefactorielle a deux niveaux doit permettre de selectionner les facteurs influents. Huit a dix facteurs peuvent i tre ainsi etudies en utilisant des plans incomplets. (6 ) Une approche de la zone de reponse maximale. (c) Un plan centre compose avec les facteurs quan- titatifs continus selectionnes, afin de determiner avec precision la combinaison optimale. On se limitera a trois a cinq facteurs influen~ant tous net- tement la reponse. Toutefois, le decoupage de I'experience en blocs incomplets permettrait d'augmenter le nombre des facteurs etudies.

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