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Université de Liège
Faculté de Médecine
Département de Médecine
Division d’Hématologie Clinique
GIGA-Research
Contribution à l’étude de la
reconstitution immunitaire après
miniallogreffe de cellules souches hématopoïétiques.
Thèse présentée par
Emilie Castermans
En vue de l’obtention du grade de
Docteur en Sciences Biomédicales
Promoteur : Prof. Y. Beguin
Co-promoteur : Dr F. Baron
Année académique 2007-2008
Je tiens à remercier le Professeur Yves Beguin de l’intérêt continu porté à ce travail ainsi qu’à
mes autres projets de recherche. Je le remercie d’avoir trouvé le temps de relire mes écrits
malgré les nombreuses obligations qui sont les siennes. Merci également de m’avoir donné
l’opportunité de présenter mes travaux lors de différents congrès (inter-) nationaux. Merci
ensuite de tous ces beaux projets, imaginés et concrétisés grâce à une dynamique enthousiaste
et contagieuse. Merci enfin de votre convivialité intra et extra muros.
Je voudrais ensuite remercier mon promoteur, Frédéric Baron. Au cours de ces années, j’ai
particulièrement apprécié sa conception d’une équipe, sa motivation et d’une façon plus large,
son lien au travail. Je le remercie de sa souplesse, de sa disponibilité sans faille et de ses
judicieux conseils scientifiques. Merci également de cette gentillesse qui le caractérise et de
cette confiance dont il a toujours fait preuve à mon égard.
Je tiens à remercier le Professeur Fillet de m’avoir accueillie et de m’avoir permis de réaliser
ma thèse de doctorat dans le Laboratoire d’Hématologie.
Merci aux membres de mon comité de thèse sur qui j’ai pu me reposer afin de guider ce
projet. Je remercie tout particulièrement le Professeur Michel Moutschen qui fut pour moi tant
un Immunologiste de talent qu’un vigoureux « défenseur de la langue française » …
Je remercie le Professeur Vincent Bours, le Docteur Marie-Paule Merville et le Docteur Alain
Chariot de m’avoir accueillie 4 années durant au sein de leur laboratoire.
Merci de tout cœur au Maître des TREC, le Docteur Rémi Cheynier, de l’aide régulièrement
apportée dans le cadre des mises au point techniques -récurrentes-. L’accomplissement de ce
travail aurait été tout autre sans ses lumineuses interventions.
Merci également au Professeur Geenen de son soutien sans faille tout au long de ces années,
source de nombreuses et fructueuses collaborations. Merci de m’avoir donné goût à la
recherche lors de l’accomplissement de mon mémoire dans votre laboratoire. Merci surtout de
votre gentillesse.
Merci au Professeur Henrotin et au Docteur Mathy, avec lesquels j’ai eu le plaisir de
collaborer. Je les remercie de leurs conseils et de m’avoir permis, toujours avec le sourire, de
réaliser de nombreuses manipulations dans leur laboratoire.
Merci à mes collaborateurs directs, avec lesquels j’ai toujours éprouvé énormément de plaisir
à travailler : Nathalie Meuris, Muriel Hannon, Stéphanie Baron, Stéphanie Corbier et Olivier
Dengis. Merci de leur aide précieuse…Merci de m’avoir éclairée au travail d’équipe….
Je remercie également les médecins, assistants, techniciens d’Hématologie Clinique sans qui
ce travail n’aurait pas été possible : les docteurs Fassotte, Bonnet, Willems, Afraoui, Matus et
Vanstraelen. Merci aux Docteurs Schaaf et Herens des analyses de cytométrie et de
chimérisme, respectivement.
Merci à Michèle Dauchot, toujours sur la brèche…
Merci aux Docteurs Greimers et Jacobs de leur aide sans faille, de leurs conseils avisés et de
leur entrain dans les mises au point de marquages et de tris cellulaire en cytométrie.
Je voudrais ensuite remercier tous les membres de mon laboratoire d’adoption, je cite de
manière non exhaustive : Cécile, Catherine, Claire, Renaud, Emilie, Pierre, Maria (Génétique
Humaine) ; Isabelle, Pierre, Anne-Françoise, Tieu-Lan, Marianne, Anne, Romain, Magali
Aurore, Catherine, Jean-Stéphane (Chimie Médicale) ; Sabine (Rhumatologie). Un merci tout
particulier à ceux qui sont devenus (bien) plus que des collègues : Chantal, Valérie, Sabine,
Marie-Alice, Christelle, Céline… Merci de tous ces moments passés ensemble, de cette
entente, de ces fous-rire qui ont fait du labo un lieu de vie au travail …
Merci ensuite aux équipes des laboratoires d’Hématologie et de Physiologie Cellulaire et
Moléculaire, que je n’ai malheureusement eu que trop peu l’occasion de côtoyer : Stéphanie,
Catherine, Alexandra, Marie, Ivano, Sophie ; Fabrice, Denis, Barbara, Rodrigue, Laurence,
Agnieszka, Cédric… Hughes (et sa souris homonyme).
Je remercie de tout cœur mes parents de m’avoir soutenue de cette manière tout au long de
mon parcours…Qu’ils continuent surtout longtemps !
Merci à Pierre de tout ce bonheur.
Ce travail n’aurait pu être mené à bien sans le soutien financier du Télévie (F.N.R.S.), de la
Fédération Belge contre le Cancer (FBC), de la Fondation Léon Frédéric (Bonjean-Oleffe), du
Centre Anti-Cancéreux près l’ULg (CAC) et des Amis de l’ULg. Je remercie ces organismes
ainsi que toutes les personnes qui m’ont aidée à récolter ces financements.
Acronymes
7-AAD 7-Amino-Actinomycin D
AICD Activation-Induced Cell Death
ADN Acide Désoxyribonucléique
ADCC Antibody-Dependent Cellular Toxicity
aGvHD acute Graft versus Host Disease
APC Allophycocyanin
ARN Acide Ribonucléique
BSA Bovine Serum Albumin
CD Cluster of Differentiation
CDR Complementarity Determining Regions
cGvHD chronic Graft versus Host Disease
CML Chronic Myeloid Leukemia
CMV Cytomegalovirus
CPA Cellule Présentatrice d’Antigène
CSA Cyclosporin A
CTL Cytotoxic T Lymphocyte
Cp Cyclophosphamide
DC Dendritic Cell
DLA Dog Leucocyte Antigen
DLI Donor Lymphocyte Infusion
dNTP Désoxyribonucléotide Tri-Phosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
DTH Delayed Type Hypersensitivity
EBV Epstein-Barr virus
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ELISpot Single-cell Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FACS Fluorescence-Activated Cell Sorting
FasL Fas-Ligand
FBS Fœtal Bovine Serum
FITC Fluorescein IsoThioCyanate
FISH Fluorescence In Situ Hybridization
Flu Fludarabine
Foxp3 Forkhead box protein P3
FSC Forward Scatter (diffusion axiale)
GAL Antilymphocytic Globulin
G-CSF Granulocyte Colony Stimulating Factor
GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor
GvH Graft versus Host
GvHD Graft versus Host Disease
GvT Graft versus Tumor
Gy Gray
HCT Hematopoietic Cell Transplantation
HPE Homeostatic Peripheral Expansion
HLA-I Human Leucocyte Antigen-I
HLA-II Human Leucocyte Antigen-II
HLA-id HLA-identique
HLA-mis HLA-mismatch
HSV Herpes Simplex Virus
IFN-γ Interferon γ
Ig Immunoglobulin
Il Interleukin
IPEX Immune dysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy and X linked
inheritance syndrome
KGF Keratinocyte Growth Factor
KIR Killer-cell Inhibitory Receptor
LAK Lymphokine Activated Killer
LB Lysogeny Broth (“Luria-Bertani broth”)
LC LightCycler
mHA minor Histocompatibility Antigen
MLR Mixed Lymphocyte Reaction
MMF Mycophenolate mofétil
MTX Methotrexate
NCR Natural Cytotoxicity Receptor
NFAT Nuclear Factor of Activated T-cells
NK Natural Killer
NK-T Natural Killer T lymphocyte
NP-40 Nonidet P40
PBL Peripheral Blood Lymphocytes
PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells
PBS Phosphate Buffered Saline
PBSC Peripheral Blood Stem Cell
PCR Polymerase Chain Reaction
PE PhycoErythrin
PerCP Peridinin Chlorophyll Protein
PHA Phyto-HémAgglutinin
pb paire de bases
PS Penicillin Streptomycin
Q-PCR Quantitative PCR
RAG-1/RAG-2 Recombination Activating Gene 1/2
RIC Reduced Intensity Conditioning
RPMI Roswell Park Memorial Institute medium
RSS Recombination Signal Sequence
RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
sjTREC signal joint T-cell Receptor Excision Circle
SCID Severe Combined Cmmunodeficiency
SSC Side Scatter (diffusion latérale)
TBI Total Body Irradiation
TLI Total Lymphoid Irradiation
TCR T-cell Receptor
TEC Thymic Epithelial Cell
TGF-β Transforming Growth Factor β
TH1 T Helper 1
TH2 T Helper 2
TNF-α Tumor Necrosis Factor α
TNF-R tumor necrosis factor receptor
TRAIL TNF Related Apoptosis Inducing Ligand
TRAILR TNF Related Apoptosis Inducing Ligand Receptor
TREC T-cell Receptor Excision Circle
TReg Regulatory T lymphocyte
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION................................................................................................................................................. 1
PARTIE 1
HEMOPATHIES MALIGNES ET GREFFES DE CELLULES SOUCHES ALLOGENIQUES
1.1.Introduction ............................................................................................................................................ 1 1.2.Effet de la greffe contre la tumeur (GvT) .............................................................................................. 4
1.2.1 Cellules impliquées .......................................................................................................................... 4 Les lymphocytes T ................................................................................................................................................ 4 Les cellules NK et NKT ........................................................................................................................................ 6 les cellules dendritiques et les macrophages.......................................................................................................... 8
1.2.2 Antigènes cibles ............................................................................................................................... 8 1.3.La maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) ........................................................................................ 9
1.3.1 La GvHD aiguë (aGvHD)................................................................................................................ 9 1.3.2 La GvHD chronique (cGVHD) .......................................................................................................10
PARTIE 2
RECONSTITUTION IMMUNITAIRE APRES GREFFE ALLOGENIQUE
2.1.Enjeux de la reconstitution immunitaire après greffe allogénique......................................................13 2.2.Reconstitution immunitaire après greffe allogénique ..........................................................................14
2.2.1 Lymphocytes NK .............................................................................................................................14 Origine ................................................................................................................................................................ 15 Cinétique de reconstitution.................................................................................................................................. 15 Impact des NK après HCT .................................................................................................................................. 15
2.2.2 Lymphocytes B ................................................................................................................................16 Origine ................................................................................................................................................................ 16 Cinétique de reconstitution.................................................................................................................................. 16 Rôle des autres sources........................................................................................................................................ 16 Impact des lymphocytes B après HCT ................................................................................................................ 17
2.2.3 Lymphocytes T ................................................................................................................................18 Origine ................................................................................................................................................................ 18 Cinétique de reconstitution.................................................................................................................................. 18 Rôle des autres sources........................................................................................................................................ 20 Impact des lymphocytes T après HCT................................................................................................................. 21
2.2.4 Populations suppressives ................................................................................................................21 T Régulatrices ..................................................................................................................................................... 21 NK-T................................................................................................................................................................... 23
2.3.Techniques d’évaluation de la reconstitution immunitaire après greffe allogénique .........................24 2.3.1 Phénotypage lymphocytaire............................................................................................................25 2.3.2 Quantification des cercles d’excision des TCR (TREC) .................................................................27
Partenaires enzymatiques (VDJ recombinase) : naissance d’un TREC............................................................... 27 Séquence des recombinaisons VDJ : diversité des TREC ................................................................................... 29
2.3.3 Diversité du répertoire TCR ...........................................................................................................29 2.3.4 Evaluation de la capacité fonctionnelle..........................................................................................30
Test de sécrétion de cytokines : ELISA/ELISpot ................................................................................................ 30 Analyses de tétramères MHC I/II: récupération de CD8+/CD4+ de spécificité antigénique particulière ............. 32
MLR: réponses T alloréactives…………………………………………………….………………………...…...32
Tests lymphoprolifératifs: réponses CD4+/CD8+ Ag spécifique.......................................................................... 34
Cytotoxicité: fonctions lytiques des NK et CD8+ ................................................................................................ 34 DTH (Delayed Type Hypersensitivity) ............................................................................................................... 34
Ig sériques : évaluation de la fonction sécrétoire B par immunisation contre le bactériphage φ X 174............... 35 2.3.5 Reconstitution immunitaire spécifique............................................................................................36
Tests lymphoproliferatifs………………………………………………………………………... ……………....36
Sécrétion d'IFN-γ………………………………………………………………………………………………...36
Tétramères………………………………………………………………………………………………………..37
2.4.Facteurs affectant la reconstitution immunitaire après HCT..............................................................37 2.4.1 Age ..................................................................................................................................................37 2.4.2 Source de cellules souches..............................................................................................................38 2.4.3 Composition du greffon...................................................................................................................39 2.4.4 Degré de compatibilité du greffon ..................................................................................................39
Familial vs non familial....................................................................................................................................... 39 Polymorphisme génétique des HLA et mHA ...................................................................................................... 40
2.4.5 Conditionnement myéloablatif ou atténué ......................................................................................40 2.4.6 Evolution clinique ...........................................................................................................................41
2.5.Expansion périphérique : association GvT/ GvHD ..............................................................................44 2.5.1 Lymphopénie postgreffe ..................................................................................................................44 2.5.2 Maintien homéostatique du pool lymphocytaire T..........................................................................45 2.5.3 Conséquences de l’HPE..................................................................................................................46
2.6.Reconstitution thymique et tolérance au soi .........................................................................................48 2.6.1 Physiologie générale du thymus .....................................................................................................48 2.6.2 Thymopoïèse après HCT.................................................................................................................49
Les cellules épithéliales thymiques (TEC) .......................................................................................................... 50 Les thymocytes.................................................................................................................................................... 50
2.6.3 Conséquences de la thymopoïèse après HCT .................................................................................51 2.7.TReg : vers un effet GvT sans GvHD ? ...................................................................................................52
2.7.1 La suppression des TReg chez la souris provoque un syndrome auto-immun ..................................52 2.7.2 Implication des TReg dans la discrimination GvT-GvHD chez l’homme .........................................53
2.8.Impact des immunosuppresseurs ..........................................................................................................56 2.8.1 Modèle canin préclinique ...............................................................................................................57 2.8.2 Impact des immunosuppresseurs sur le système immunitaire après HCT ......................................59
OBJECTIFS .........................................................................................................................................................61
MATERIEL ET METHODES............................................................................................................................63
1. PATIENTS ET DONNEURS..................................................................................................................63
2. ANALYSE DU CHIMERISME ..............................................................................................................63
3. ANALYSE CYTOMETRIQUE DE LA RECONSTITUTION LYMPHOCYTAIRE ............................63
4. SPECTRATYPING (IMMUNOSCOPE) ................................................................................................64
5. QUANTIFICATION DES SJTREC ......................................................................................................66 5.1 Standards de mesure pour la quantification des sjTREC ................................................................66
5.2 Quantification des sjTREC ..............................................................................................................66
5.2.1 Pré-PCR................................................................................................................................................... 67
5.2.2 PCR quantitative (Q-PCR) ................................................................................................................... 68
5.3. Expression des résultats ..................................................................................................................70
6. EXPANSIONS LYMPHOCYTAIRES ....................................................................................................70
7. MARQUAGE ET TRI DES TREG PAR CYTOMETRIE EN FLUX.......................................................71
8.1 Marquage ..........................................................................................................................................71 8.2 Tri .....................................................................................................................................................72
RESULTATS........................................................................................................................................................73
PARTIE EXPERIMENTALE I
DEMONSTRATION DE LA REPRISE DE LA THYMOPOIESE APRES MINIGREFFE
1.1 Suivi clinique .........................................................................................................................................73
1.1.1 Patients et donneurs........................................................................................................................73 1.1.2 Conditionnement.............................................................................................................................75 1.1.3 Collecte des PBSC et déplétion des lymphocytes CD8
+.................................................................75
1.1.4 Analyse cytométrique des PBSC……………………………………………………………….............…76 1.1.5 Gestion clinique ..............................................................................................................................76
1.1.6 Analyses statistiques .......................................................................................................................77
1.2 Analyse de la reconstitution immunitaire .............................................................................................78 1.2.1 Paramètres étudiés ........................................................................................................................76
1.2.2 Chimérisme lymphocytaire T ..........................................................................................................79 1.2.3 Reconstitution des populations lymphocytaires périphériques ......................................................79
1.2.4 Reconstitution du répertoire Vβ (immunoscope) ............................................................................83 1.2.5 Estimation de la fonction thymique.................................................................................................85 1.2.6 Analyse multivariée des facteurs affectant la reconstitution immunologique ................................89
Receveur.............................................................................................................................................................. 89 Donneur............................................................................................................................................................... 89 Composition du greffon....................................................................................................................................... 90 GvHD.................................................................................................................................................................. 90 Association entre reconstitution immunitaire, progression de la maladie et développement d’infections........... 90
1.2.7 Conclusion: la reconstitution immunitaire la première année après minigreffe………......…….….94
PARTIE EXPERIMENTALE II
RECONSTITUTION IMMUNITAIRE A LONG TERME APRES GREFFE NON MYELOABLATIVE
2.1.Suivi clinique .........................................................................................................................................97
2.1.1 Patients et donneurs........................................................................................................................97 2.1.2 Conditionnement.............................................................................................................................98 2.1.3 Collecte et analyse cytométrique des PBSC....................................................................................99 2.1.4 Gestion clinique ..............................................................................................................................99 2.1.5 Analyses statistiques .......................................................................................................................99
2.2.Analyse de la reconstitution immunitaire ...........................................................................................100 2.2.1 Paramètres étudiés .......................................................................................................................100 2.2.2 Estimation de la fonction thymique...............................................................................................101 2.2.3 Analyse multivariée des facteurs affectant la reconstitution immunologique à long terme .........105
Receveur............................................................................................................................................................ 106 Donneur............................................................................................................................................................. 106 Composition du greffon..................................................................................................................................... 106
Délai postgreffe................................................................................................................................................. 107
GvHD chronique ............................................................................................................................................... 107
2.2.4 Reprise thymique et diversité du répertoire TCR………………………………………………………108
2.2.5 Conclusion: la reconstitution immunitaire à long terme après minigreffe……………………..…..110
PARTIE EXPERIMENTALE III
RECONSTITUTION DES LYMPHOCYTES T REGULATEURS (TREG) APRES MINIGREFFE
3.1.Suivi clinique .......................................................................................................................................115
3.1.1 Patients et donneurs......................................................................................................................115 3.1.2 Conditionnement...........................................................................................................................117 3.1.3 Gestion clinique ............................................................................................................................117 3.1.4 Analyse du chimérisme .................................................................................................................117 3.1.5 Analyses statistiques .....................................................................................................................117
3.2.Analyse de la reconstitution des TReg ..................................................................................................118 3.2.1 Analyse des TReg ............................................................................................................................118 3.2.2 Facteurs prédictifs du nombre de TReg ..........................................................................................120 3.2.3 Implication des TReg dans l'évolution clinique…..…………………………………………..……121
3.2.4 Origine des TReg après greffe non myéloablative………………………….……..………...…… 122 Analyse du chimérisme ..................................................................................................................................... 122
Impact du chimérisme dans les TReg sur la survenue d’une GvHD chronique ................................................... 122 Corrélation entre taux de sjTREC et de TReg ..................................................................................................... 122
3.2.5 Conclusion: reconstitution des TReg après minigreffe……………………………………………123
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES.........................................................................................125
PARTIE 1
AMELIORER LE SUIVI DE LA RECONSTITUTION IMMUNITAIRE APRES MINIGREFFE
1.1.Thymopoïèse: ratio de TREC ..............................................................................................................125 1.2.Visualisation de l’activité thymique ....................................................................................................128 1.3. Caractérisation lymphocytaire ...........................................................................................................129
1.3.1 Phénotype .....................................................................................................................................129 1.3.2 Diversité clonale ...........................................................................................................................130
1.3.3 Analyse fonctionnelle ....................................................................................................................130
1.4. Reconstitution des lymphocytes T régulateurs (TReg) ........................................................................131
PARTIE 2
AMELIORER LA RECONSTITUTION IMMUNITAIRE APRES MINIGREFFE
2.1. Immunothérapie adoptive: lymphocytes totaux……………………………………………….……133
2.2. Immunothérapie adoptive: lymphocytes spécifiques…………………………………………….…134
REFERENCES...................................................................................................................................................137
ANNEXES…………………………………………………………………………………………………………..
ANNEXE 1: PROTOCOLE DE QUANTIFICATION DES ββββ TREC
ANNEXE 2: PUBLICATIONS
ANNEXE 3: PAPIER 1, “Evidence for neo-generation of T cells by the thymus after non-myeloablative
conditioning”.
ANNEXE 4: PAPIER 2, “Méthodes actuelles d’évaluation clinique de la fonction du thymus” (revue).
ANNEXE 5: PAPIER 3, “Applications cliniques de la mesure de la thymopoïèse” (revue).
ANNEXE 6: PAPIER 4, “Despite inhibition of hematopoietic progenitor cell growth in vitro, the tyrosine kinase
inhibitor imatinib does not impair engraftment of human CD133+ cells into NOD/SCIDββββ2mNull mice” (co-auteur).
ANNEXE 7: PAPIER 5, “Raloxifene-induced myeloma cell apoptosis: a study of NF-κκκκB inhibition and gene
expression signature” (co-auteur).
ANNEXE 8: PAPIER 6, “T-cell reconstitution after unmanipulated, CD8-depleted or CD34-selected
nonmyeloablative peripheral blood stem-cell transplantation” (co-auteur).
ANNEXE 9: PAPIER 7,"Quantification of T cell receptor rearrangement excision circles to estimate thymic
function: an important new tool for endocrine-immune physiology” (co-auteur).
INTRODUCTION
PARTIE 1
HEMOPATHIES MALIGNES ET GREFFES DE
CELLULES SOUCHES ALLOGENIQUES
-Introduction-
1
1.1 Introduction
Les greffes de cellules souches hématopoïétiques (HCT, Hematopoietic Cell
Transplantation) constituent le traitement le plus efficace de nombreuses hémopathies
malignes (cf TAB 1.1). L’éradication des cellules cancéreuses est médiée par l’association d’un
conditionnement myéloablatif et d’un conflit immunologique inhérent à l'installation des
lymphocytes T du donneur chez le receveur (Barrett 1997; Kolb, Schmid et al. 2004; Baron
and Storb 2006).
Pathologie Stade de la pathologie Allo-HCT familiale Allo-HCT non
apparentée
AML CR1
CR2, CR3, rechute précoce
Rechute avancée
R
R
D
EC
EC
NR
ALL de l’adulte CR1 (haut risque), CR2
Rechute avancée
R
D
EC
NR
CML Phase chronique
Phase avancée
Phase blastique
R
R
D
R
D
NR
Syndromes
myéloprolifératifs
(autres que CML)
EC D
Maladie de Hodgkin CR1
1ère
rechute, CR2, CR3
Réfractaire
D
EC/R
EC
NR
D
D
NHL
- Lymphoblastique CR1 (haut risque), CR2, CR3 EC D
- Grade élevé /
intermédiaire
CR1 EC EC
- Grade bas CR1
Rechute, CR2
NR
EC
NR
NR
Myélome multiple EC NR
Anémie aplastique sévère R D
Thalassémie majeure R NR
Anémie falciforme R NR
TAB 1.1 : Indications des allo-HCT -adapté de Goldman (Goldman 2000)-.R = indication routinière, EC = indication en
cours d’évaluation clinique, D = indication en développement, NR = non recommandé, AML = leucémie myéloblastique
aiguë, ALL= leucémie lymphoblastique aiguë, CML = leucémie myéloïde chronique, NHL = lymphome non-hodgkinien, CR1
= 1ère rémission complète, CR2 = 2ème rémission complète, CR3 = 3ème rémission complète. D’après les recommandations de
l’EBMT (Goldman et al, 2000).
Les leucémies, les syndromes myélodysplasiques et les lymphomes constituent les indications
majeures des greffes allogéniques (Goldman 2000). Le pronostic postgreffe dépend, entre
autres, du diagnostic, du stade de la maladie au moment de le greffe, des comorbidités
associées, du régime de conditionnement et du type de donneur (Goldman 2000). D’autres
-Introduction-
2
hémopathies telles que les anémies aplastiques sévères, les hémoglobinopathies ou certaines
immunodéficiences primaires constituent également des indications d'allogreffes (Goldman
2000).
Le greffon est principalement composé de cellules souches, de progéniteurs
hématopoïétiques, de lymphocytes T CD4+ et CD8
+, de monocytes et de cellules NK. Les
cellules souches sont responsables de la reconstitution hématologique ainsi que de la
reconstitution immunologique à long terme (> 6 mois) chez le receveur (via la voie thymo-
dépendante, cf section 2.2.3) (Atkinson 2004). Par contre, les lymphocytes T matures présents
dans le greffon assurent la reconstitution immunologique précoce (voie thymo-indépendante,
cf section 2.2.3) (Atkinson 2004), et peut-être l’effet de la greffe contre la tumeur (effet GvT,
c’est-à-dire la destruction des cellules tumorales du receveur par les cellules immunitaires du
donneur présentes dans le greffon) (Weiden, Flournoy et al. 1979; Baron, Maris et al. 2005).
Les lymphocytes T du donneur (et plus particulièrement les lymphocytes mémoires centraux
(Anderson 2008)) sont malheureusement également responsables de la maladie du greffon
contre l’hôte (GvHD, Graft versus Host Disease), une redoutable complication des allogreffes
consistant en la destruction des organes sains du receveur par les cellules immunitaires du
donneur (Blume 2004). De nombreux projets de recherche visent actuellement à améliorer
l’effet GvT tout en minimisant l’effet GvH: 1° en modifiant la composition du greffon
(déplétion des lymphocytes totaux ou uniquement alloréactifs) ; 2° en modulant
l’immunosuppression postgreffe ; 3° en infusant graduellement, après la greffe, des
lymphocytes T du donneur (DLI, Donor Lymphocyte Infusion).
Si le potentiel curatif des allogreffes est médié à la fois par le régime de conditionnement et
par la destruction des cellules malignes par les lymphocytes du donneur, la toxicité associée
aux greffes allogéniques classiques les confèrent cependant aux patients les plus jeunes
(Diaconescu, Flowers et al. 2004; Sorror, Maris et al. 2004; Tsirigotis, Bitan et al. 2006).
Malheureusement, l’âge médian des patients lors du diagnostic d’une néoplasie
hématologique est avancé, souvent situé entre 60 et 65 ans. Ces observations ont favorisé le
développement d'allogreffes précédées d’un régime de conditionnement d’intensité réduite
(RIC, Reduced Intensity Conditioning) ou d’allogreffes précédées d’un conditionnement
réellement non-myéloablatif (couramment appelées « minigreffes ») (Barrett and Savani
2006). Les minigreffes se déroulent en deux phases : 1° administration d’un régime de
conditionnement très immunosuppresseur permettant le contrôle tant de la réaction de l’hôte
contre la greffe (évitant le rejet de la greffe) que de la GvHD ; 2° éradication des cellules
tumorales du receveur par effet GvT (Baron and Beguin 2002). Par opposition, les
-Introduction-
3
conditionnements d’intensité réduite (RIC) sont composés d’agents chimiothérapeutiques
capables de contrôler la réaction de l’hôte contre la greffe, mais également d’induire un
important effet anti-tumoral. Cependant, il est généralement admis que l’éradication définitive
de la tumeur après allogreffe précédée d’un régime de conditionnement atténué est également
due à l’effet de la greffe contre la tumeur. De nombreuses recherches dans un modèle canin
ont permis à l’équipe du Professeur R. Storb (Storb, Yu et al. 1997; McSweeney,
Niederwieser et al. 2001; Niederwieser, Maris et al. 2003) de mettre au point d’une part un
régime de conditionnement combinant une faible dose d’irradiation corporelle totale (TBI, 2
Gy) et de la fludarabine, et d’autre part une immunosuppression post-greffe associant la
cyclosporine au mycophénolate mofétil (MMF). Ces associations ont été reprises par notre
équipe et utilisées dans le cadre de nos 3 études de la reconstitution immunitaire (cf infra,
section résultats). Depuis une dizaine d’années, de telles études cliniques impliquant
minigreffes et greffes précédées d’un RIC se sont multipliées, en raison des avantages
potentiels des minigreffes par rapport aux HCT classiques :
1° une diminution de la toxicité relative au traitement : les minigreffes requièrent par
définition des doses plus faibles de chimiothérapie et/ou de radiothérapie, ce qui permet de les
réaliser chez des patients plus âgés. De plus, les toxicités hépatique, rénale et pulmonaire sont
dès lors atténuées (Diaconescu, Flowers et al. 2004) ; en outre, les thrombopénie et
granulopénie entraînées par le conditionnement sont également moins sévères, conduisant à
une diminution des risques d’hémorragie et d’infections (Junghanss, Boeckh et al. 2002;
Frere, Baron et al. 2006) .
2° une diminution de l’incidence et de la sévérité de la GvHD : un régime de conditionnement
prégreffe plus léger diminue les dommages cellulaires et inflammatoires, et par conséquent la
tempête cytokinique rencontrée dans la GvHD. Cette corrélation entre le degré
d’immunosuppression et la GvHD a été élégamment démontrée dans un modèle murin par
Prigozhina et al. (Prigozhina, Gurevitch et al. 1999). Par ailleurs, l’établissement d’un
chimérisme hématopoïétique mixte constitué de cellules du donneur et du receveur a été
associé tant dans les modèles animaux que chez l’homme à un risque atténué de GvHD
(Mielcarek, Martin et al. 2003; Baron, Baker et al. 2004; Baron, Little et al. 2005). La GvHD
reste cependant la première cause de mortalité non liée à la rechute après RIC. La rechute et
les infections constituent les principales autres raisons d’échec des minigreffes.
En conclusion, les régimes d’intensité réduite permettent la guérison d’une proportion de
patients non éligibles dans le cadre des allogreffes classiques (Baron and Storb 2006).
Cependant, ce type de régime comporte certaines limitations identiques aux greffes
-Introduction-
4
classiques : rechute, GvHD et infections (Barrett and Savani 2006). Ces complications sont
favorisées soit par un déficit immunitaire (rechute, infections) ou une réaction immunitaire
exacerbée envers le receveur (GvHD) (Baron, Storer et al. 2006). L’étude de la reconstitution
du système immunitaire, et particulièrement, lymphocytaire, s’avère dès lors capitale dans le
développement futur des minigreffes.
1.2 Effet de la greffe contre la tumeur (GvT)
1.2.1 Cellules impliquées
Les lymphocytes T CD4+ et CD8
+, les lymphocytes NK et NKT, les macrophages et
les cellules dendritiques sont vraisemblablement tous impliqués dans l’effet GvT (cf TAB 1.2)
(Barrett 1997; Kolb, Schmid et al. 2004). Les contributions respectives de ces différentes
populations pourraient varier d’une tumeur à l’autre, notamment en fonction de l’expression
ou non du HLA et de la nature de l’antigène cible (Weichold et al, 1997). Les lymphocytes T
et NK jouent un rôle majeur dans l’élimination des cellules tumorales. Les structures ciblées
par les lymphocytes T pourraient être des antigènes tumoraux spécifiques ou des antigènes
mineurs d’histocompatibilité, ubiquitairement exprimés ou limités aux cellules
hématopoïétiques (Storb, Champlin et al. 2001; Grigg and Ritchie 2004). Les cellules NK
cibleraient les cellules allogéniques dépourvues de HLA I spécifique à leur KIR (groupe
alloréactif) (Kolb, Schmid et al. 2004).
Cellules effectrices Cibles
Lymphocytes T CD4+ Cellules HLAII
+ + mHA
Cellules HLAII+
+ antigène tumoral
Lymphocytes T CD8+ Cellules HLAI
+ + mHA
Cellules HLAI+ + antigène tumoral
Cellules NK Groupe alloréactif
TAB 1.2 : Composants immunitaires et effet GvT -adapté de Kolb (Kolb, Schmid et al. 2004)-.
Les lymphocytes T
Une déplétion des lymphocytes T matures du greffon réduit fortement l’effet GvT (et
augmente donc fortement le risque de rechute). Cette observation suggère que l’effet GvT
dépend principalement de l’expansion périphérique des lymphocytes T du greffon (Chen,
-Introduction-
5
Barfield et al. 2005). L’action antitumorale des lymphocytes T a également été mise en
évidence par Falkenburg et coll. chez un patient atteint de leucémie myéloïde chronique
(CML). Chez ce patient en rechute, une rémission a en effet été mise en évidence à la suite
d’une DLI (Donor Lymphocyte Infusion, administrée en vue d’augmenter l’effet GvT de la
greffe) composée de différents clones de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques de la
CML (Falkenburg, Wafelman et al. 1999). De même, les réponses antitumorales induites par
les DLI peuvent être corrélées à la présence de CTL dirigés contre HA1 et HA2, deux mHA
(minor Histocompatibility Antigens, cf section 1.2.2) spécifiques au système hématopoïétique
(Marijt, Heemskerk et al. 2003).
Cependant, les rôles respectifs des lymphocytes T CD4+ et CD8
+ dans l’effet GvT restent
encore mal définis à l’heure actuelle (Kolb, Schmid et al. 2004).
FIG 1.1: Rôles hypothétiques des différentes populations lymphocytaires (CD4+, CD8+, NK) lors d’une réaction GvT –extrait
de (Barrett 1997)-.
Les CD8
+ seraient (Barrett 1997) :
-initiatrices de la réponse allogénique via une interaction avec le complexe antigène-HLA I de
la CPA (Cellule Présentatrice d’Antigène)
-les effecteurs cytotoxiques principaux via les voies perforine/granzyme et Fas/Fas ligand
-Introduction-
6
Les CD4+ seraient (Barrett 1997) :
-les initiatrices principales de la réponse allogénique (complexe antigène-HLA II de la CPA)
-pourvues d’un effet cytotoxique : des clones de CD4+ capables de supprimer la formation de
colonies de cellules leucémiques ont été décrits in vitro (Kolb, Schmid et al. 2004).
-productrices de cytokines aux effets divers, telles que l’Il-2 et l’Il-12 pour le recrutement et
l’activation des CD8 et des NK, ou l’IFN-γ et le TNF-α pour l’inhibition des cellules
tumorales, ainsi que l’upregulation de leurs récepteurs Fas et HLA.
L’efficacité suggérée de la déplétion CD8+ en vue de séparer l’effet GvT de la GvHD
(Champlin, Jansen et al. 1991; Nimer, Giorgi et al. 1994; Giralt, Hester et al. 1995; Alyea,
Soiffer et al. 1998) suggère que les lymphocytes T CD4+ seraient bien les principaux acteurs
de l’effet GvT ou qu’ils agiraient en recrutant les lymphocytes T CD8+ chez le patient
(Ferrara, Levy et al. 1999).
Les cellules NK et NKT
Lors de greffes haploidentiques (greffes au cours desquelles donneur et receveur ne présentent
qu’un 1 haplotype HLA identique) les NK exercent une réponse allogénique vigoureuse et
contribuent à l’éradication de leucémies aigues et de lymphomes agressifs (Ruggeri, Capanni
et al. 2002).
Les cellules NK provoquent la lyse des cellules néoplasiques selon deux voies :
1) par ADCC (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity): leur récepteur FcγR (CD16)
fixe les IgG des cellules tumorales opsonisées (Delves and Roitt 2000) ;
2) via leur système spécifique de récepteurs activateurs NCRs (Natural Cytotoxicity
Receptors) et de récepteurs inhibiteurs KIR (Killer Inhibitory Receptor, cf FIG 1.2) et CD94
(Delves and Roitt 2000). Au contact d’une cellule du soi, les NK reçoivent de l’interaction de
leurs KIRs avec le HLA-I un signal négatif qui supplante le signal positif provoqué par
l’engagement des NCRs (Delves & Roitt, 2000) : la lyse n’a pas lieu. Cependant, si la cible
perd son HLA I (par exemple dans certaines tumeurs) l’engagement du NCR n’est plus
neutralisé par le signal négatif du KIR et la cellule cible est détruite par la voie
perforine/granzyme, ou par les voies alternes de la cytotoxicité (Fas/FasL, TRAIL/TRAILR,
TNF/TNFR) (Lanier, 1998;Moretta et al, 2000;Delves & Roitt, 2000).
De plus, les KIRs présentent une spécificité étroite pour des allèles HLA particuliers : HLA-C
pour p58 (p58.1 reconnaît les allèles HLA-Cw2, 4, 5 et 6 alors que les allèles HLA-Cw 1, 3, 7
et 8 se lient au récepteur p58.2), HLA-Bw4 pour P70 et HLA-A 3 et –A11 pour p140.
-Introduction-
7
Lors d’une greffe HLA identique (HLA-id), les KIRs du donneur rencontrent sur les cellules
du receveur un HLA identique à celui dont ils sont spécifiques : la lyse n’a pas lieu. Dans les
greffes haploidentiques, par contre, une inadéquation dans le couple KIR (p58) du donneur /
HLA (HLA-C) du receveur peut être observée, et générer une population de cellules NK
spécifiquement dirigées contre les cellules du receveur. Ces cellules sont capables de lyser les
cellules hématopoïétiques du receveur, sans occasionner de GvHD aiguë (Ruggeri, Capanni et
al. 2002). Lors de certaines greffes haploidentiques, les NK alloréactifs facilitent également la
prise de greffe via l’élimination de cellules hématopoïétiques du receveur (Kolb, Schmid et al.
2004). De plus, ils peuvent prolonger la destruction des cellules dendritiques du receveur,
diminuant par là même l’incidence de GvHD (Ruggeri, Capanni et al. 2002).
FIG 1.2 : Récepteurs inhibiteurs de la cellule NK. Les récepteurs activateurs du NK reconnaissent les ligands de la cellule
cible, mais la transduction de leur signal est ensuite inhibée par les récepteurs inhibiteurs qui reconnaissent les molécules du
HLA-I. Le résultat final est que les NK ne lysent pas les cellules dont elles reconnaissent le HLA-I. Par contre, si une
infection virale entrave l’expression de ce dernier, le récepteur inhibiteur du NK, non engagé, ne peut s’opposer aux signaux
activateurs : la cible est lysée et diverses cytokines sécrétées -extrait de (Abbas A. 2005)-.
A côté de leur activité cytotoxique, les cellules NK sécrètent également de nombreuses
cytokines. Cette activité est importante dans le cadre des HCT : la GvHD pourrait être
modulée par l’INF-γ, le TNF-α, le TGF-β ; le GM-CSF et l’Il-3 favorisent par ailleurs la prise
de la greffe (Klingemann, 2000).
Cousines des cellules NK, les cellules NKT sont CD3+ comme les lymphocytes T et
expriment concomitamment un TCR spécifique Vα24+ et un marqueur NK, le CD161. Une
sous-population de cellules NKT originaires de la moelle osseuse provoque une réaction de
type GvT en lysant les cellules leucémiques par les voies Fas-FasL et granzyme/perforine.
Ces cellules ne paraissent en outre pas occasionner la GvHD, et pourraient même la prévenir
(Lowsky, Takahashi et al. 2005).
-Introduction-
8
Les cellules dendritiques et les macrophages
Les cellules dendritiques, macrophages et cytokines sont des modulateurs de l’effet GvT. En
outre, le développement d’une réponse GvT par les lymphocytes T requiert une présentation
efficace des antigènes ainsi que l’envoi de signaux de costimulation par les cellules
présentatrices d’antigènes (CPA) (Kolb, Schmid et al. 2004). Les cellules T
immunocompétentes du donneur peuvent reconnaître les complexes HLA-antigènes présentés
par
-les CPA du donneur (reconnaissance indirecte) (Abbas A. 2005),
-les CPA du receveur (réaction croisée de la reconnaissance directe). Une étude récente dans
un modèle murin a mis en évidence la contribution des CPA du receveur dans la survenue
d’un effet GvT sans GvHD sévère après DLI, démontrant de la sorte l’importance du maintien
d’un état de chimérisme mixte plutôt que complet (Xia, Truitt et al. 2006). De plus, dans
certaines pathologies telles que la leucémie myéloïde chronique, des CPA du receveur
peuvent aussi dériver du clone leucémique (cellules dendritiques dans ce cas précis). Ces CPA
seraient également capables d’induire la formation de CTL (Chen, Regn et al. 2000; Kolb,
Schmid et al. 2004) (Abbas A. 2005). L’augmentation de la reconnaissance directe dans ce
cas pourrait expliquer les meilleures réponses observées après DLI dans les CML que dans les
leucémies lymphoïdes (Kolb, Schmid et al. 2004). A l’heure actuelle, le rôle exact de ces
cellules dendritiques dérivées des cellules tumorales dans l’induction de l’effet GvT n’a
cependant pas encore été clairement établi.
1.2.2 Antigènes cibles
Si les antigènes cibles restent pour la plupart inconnus à l’heure actuelle, différents arguments
semblent indiquer le rôle primordial des antigènes mineurs d’histocompatibilité (Falkenburg,
Marijt et al. 2002; Heemskerk, Hoogeboom et al. 2003; Marijt, Heemskerk et al. 2003;
Riddell, Bleakley et al. 2006; de Witte, Toebes et al. 2007) :
1° le risque de rechute augmente drastiquement en cas de greffe syngénique (i.e. greffe entre
jumeaux vrais) par rapport aux greffes allogéniques (Horowitz, Gale et al. 1990)
2° le caractère hautement immunogène des mHA permettrait une activation des T du donneur,
provoquant de la sorte GvT et/ou GvHD, malgré les immunosuppresseurs administrés en vue
de prévenir la GvHD.
-Introduction-
9
3° la plupart des clones de T spécifiques des mHA présentent une haute affinité antigénique.
La probabilité de reconnaissance des complexes HLA-mHA sur des cellules tumorales dont le
HLA peut être diminué est ainsi accrue.
4° les réponses T contre les mHA impliquent les lymphocytes CD4+ et CD8
+ et sont
fréquemment dirigées vers de multiples déterminants antigéniques. Ce large spectre de
reconnaissance peut dès lors prévenir la croissance de cellules tumorales qui auraient perdu ou
réduit l’expression d’un de leurs antigènes.
En outre, un modèle simple de réponses allospécifiques aux mHA pourrait expliquer la
relation entre GvT et GvHD en fonction de l’expression tissulaire du/des mHA impliqué(s) :
la reconnaissance d’un mHA sélectivement exprimé par les cellules hématopoïétiques, y
compris les cellules tumorales, induirait un effet GvT sans GvHD ; celle d’un mHA largement
exprimé (cellules hématopoïétiques et épithéliales), une GvHD ou une association GvT+GvH
(Dickinson, Wang et al. 2002; Riddell, Bleakley et al. 2006).
Cependant, il n’est pas exclu que des antigènes tumoraux (Ben Bosch et al, 1995;Bocchia et
al, 1996;Osman et al, 1999) ou des antigènes de différenciation surexprimés, tels que WT-1
(Wilms’Tumor 1) ou Pr3 (Protéinase 3) (Molldrem, Clave et al. 1997; Clave, Molldrem et al.
1999; Molldrem, Lee et al. 2000; Van Driessche, Gao et al. 2005) servent également de cible
dans certains cas. Leur existence contribuerait ainsi aux réactions GvT observées en l’absence
de GvHD (Atkinson 2004).
1.3 La maladie du greffon contre l’hôte (GvHD)
La GvHD demeure à l’heure actuelle une limitation importante au succès des allogreffes.
L’appellation GvHD regroupe 2 syndromes distincts : la GvHD aiguë (aGvHD) et la GvHD
chronique (cGvHD). Ces deux pathologies différent par leur vitesse d’apparition, leur
symptomatologie, leur étiologie mais semblent néanmoins étroitement associées.
1.3.1 La GvHD aiguë (aGvHD)
La GvHD aiguë survient le plus souvent durant les cent premiers jours consécutifs à la greffe,
et est caractérisée par une apoptose des cellules épithéliales cutanées, hépatiques (épithélium
biliaire), et du tractus gastro-intestinal (Abbas A. 2005). Les manifestations cliniques
comprennent éruption cutanée, hépatite et/ou atteinte intestinale (diarrhée, crampes
-Introduction-
10
abdominales, iléus ou perforation intestinale). La GvHD aiguë et ses complications sont
responsables de 10 à 30% des décès consécutifs à une greffe allogénique.
On pense généralement que l’aGvHD est la conséquence de l’expansion périphérique des
lymphocytes T présents dans le greffon (voie thymo-indépendante) puisque la déplétion en
lymphocytes T du greffon en réduit drastiquement l’incidence. De plus, des expériences
muries suggèrent un rôle primordial des lymphocytes centraux mémoires (Anderson 2008).
1.3.2 La GvHD chronique (cGVHD)
La GvHD chronique survient à partir de 100 jours post HCT et peut affecter n’importe quel
organe. Le tableau histologique est caractérisé par une fibrose et une atrophie sans mort
cellulaire aiguë (Abbas A. 2005), mais pouvant mener à un dysfonctionnement complet de
l’organe cible. Les organes les plus fréquemment atteints sont la peau, les muqueuses
(principalement orale), les glandes lacrymales et le foie. La GvHD chronique, limitée ou
extensive (cf classification TAB 1.3), apparaît approximativement chez 50% des patients.
La cause de la cGvHD reste non élucidée à l’heure actuelle. Cependant, son occurrence est en
recrudescence depuis l’utilisation des cellules souches du sang périphérique à la place de
moelle osseuse classique (Korbling and Anderlini 2001; Przepiorka, Anderlini et al. 2001) :
une méta analyse a en effet permis de démontrer que l’incidence de cGvHD était plus élevée
de 66% lors de l’utilisation de cellules souches mobilisées (Cutler, Giri et al. 2001). Parmi les
autres facteurs de risque : un épisode préalable de GvHD aiguë (bien que les deux
phénomènes ne soient pas systématiquement associés) (Amrolia, Muccioli-Casadei et al.
2003; Kim, Sachs et al. 2003; Michalek, Collins et al. 2003), des disparités au niveau des
HLA et mHA (Remberger, Kumlien et al. 2002) ou un âge avancé (Carlens, Ringden et al.
1998).
La pathophysiologie de la cGvHD reste à ce jour mal connue, mais semble, comme dans la
GvHD aiguë, impliquer les lymphocytes T matures du greffon. Les modèles animaux actuels
semblent indiquer en premier lieu les lymphocytes de type TH2(1)
. Chez l’homme cependant,
les deux populations de lymphocytes auxiliaires TH1(2)
et TH2 semblent impliquées au cours
de ces réactions allogéniques (Reinherz, Parkman et al. 1979). D’autre part, les caractères
cliniques de la cGvHD sont proches de certaines maladies auto-immunes. Or, des études
(1)
Lymphocytes T effecteurs spécialisés dans l’élimination des pathogènes extracellulaires par l’activation de
l’immunité humorale. (2)
Lymphocytes T effecteurs spécialisés dans l’élimination des pathogènes intracellulaires par l’activation de
l’immunité cellulaire.
-Introduction-
11
expérimentales et cliniques semblent indiquer l’apparition, lors de cGvHD, d’une atrophie
thymique, d’une déplétion lymphocytaire et d’une perte de la fonction sécrétoire de
l’épithélium thymique (Atkinson, Incefy et al. 1982; Weinberg, Blazar et al. 2001). Ainsi, une
thymopoïèse aberrante résultant en une absence de destruction des clones autoréactifs pourrait
se mettre en place.
Classification de la GvHD chronique
GvHD limitée :
- lésions orales associées à une biopsie cutanée ou labiale positive, sans autre manifestation de cGvHD
- dysfonctionnement hépatique modéré associé à une biopsie cutanée ou labiale positive, sans autre
manifestation de cGvHD
- plaques papulosquameuses (n<6), rash maculopapulaire ou lichénoïde impliquant <20% de la SCT,
dépigmentation impliquant <20% de la SCT, ou érythème impliquant <50% de la SCT associé à une
biopsie cutanée positive, sans autre manifestation de cGvHD
- sécheresse oculaire associée à une biopsie cutanée ou labiale positive, sans autre manifestation de
cGvHD
- lésions vaginales ou vulvaires associées à une biopsie positive, sans autre manifestation de cGvHD
GvHD extensive :
-implication d’au moins 2 organes accompagnée de signes de cGvHD et d’une biopsie positive
-scores de performance clinique <60%, perte de poids >15%, infections récurrentes en association avec
une biopsie positive
-lésions cutanées supérieures à celles définies dans la cGvHD limitée, confirmées par biopsies
-sclérodermie
-onycholyse ou onychodystrophie accompagnée d’une manifestation de cGvHD repérée dans un organe
-diminution de la motricité du poignet ou de la cheville
- contractures
-bronchiolite oblitérante
-biopsie ou tests fonctionnels hépatiques positifs, en association avec une cGvHD repérée dans un organe
-biopsie gastro-intestinale positive
-fasciite ou sérosite
TAB 1.3 : Classification des GvHD chroniques d’après l’équipe de Seattle (Lee, Vogelsang et al. 2003; Horwitz and Sullivan
2006).
Par ailleurs, la présence d’autoanticorps a également été rapportée dans différents modèles
expérimentaux et cliniques (Horwitz and Sullivan 2006) : 11 à 62% des patients atteints de
cGvHD possèdent des anticorps anti-muscle lisse, anti-cytosquelette ou antinucléaires.
-Introduction-
12
Cependant, l’éventuel rôle pathogénique de tels anticorps dans la cGVHD reste à l’heure
actuelle non établi. D’un point de vue clinique, une diminution des taux de rechutes est
observée chez les patients atteints de cGvHD (Weiden, Sullivan et al. 1981). Cependant, la
cGvHD ainsi que ses traitements (cyclosporine, prednisone) entraînent un état de profonde
immunodéficience. Les décès rencontrés lors de cGVHD extensives sont dès lors
habituellement issus de complications infectieuses. Ainsi, la combinaison des effets positifs et
négatifs de la cGvHD la rend, selon les cas (notamment en fonction du diagnostic posé),
souhaitable ou non.
PARTIE 2
RECONSTITUTION IMMUNITAIRE APRES GREFFE
ALLOGENIQUE
-Introduction-
13
2.1 Enjeux de la reconstitution immunitaire après greffe allogénique
Après allogreffe, l’intégralité des patients développe une immunodéficience profonde
consécutive :
1° au régime de conditionnement prégreffe,
2° à la lyse des cellules T résiduelles du receveur par les T allogéniques du donneur
3° aux traitements immunosuppresseurs après greffe (Blume 2004).
Les immunités cellulaire et humorale s’en trouvent profondément affectées. Or, le rôle du
système immunitaire est capital pour prévenir les trois principales complications des
allogreffes: la rechute, la GvHD et les infections :
1) la rechute
L’effet GvT (cf section 1.2) est une composante importante de l’efficacité des HCT, et est
même le seul mécanisme antitumoral dans le cas particulier des minigreffes (Baron and
Sandmaier 2005).
2) la GvHD
Comme mentionné précédemment, la GvHD aiguë est la conséquence directe de l’action des
lymphocytes T matures du donneur à l’encontre des organes du receveur. Les mécanismes
impliqués dans la cGvHD sont moins clairement établis. Des hypothèses récentes avancent
également que la GvHD tant aiguë que chronique pourraient être favorisées par un déficit des
lymphocytes T régulateurs (Miura, Thoburn et al. 2004; Zorn, Kim et al. 2005).
3) les infections opportunistes
Les infections opportunistes sont une conséquence directe du délai de la reconstitution
immunitaire après greffe ainsi que de l’immunosuppression médicamenteuse administrée
comme prophylaxie de la GvHD. Les pathogènes impliqués dans ces infections sont
essentiellement les bactéries (par exemple, le pneumocoque), le virus d’Epstein-Barr (EBV),
le cytomégalovirus (CMV), le virus de l’herpès (HSV), le virus varicelle/zona (VZV), les
adénovirus, le P. carinii et les champignons. Le développement de désordres
lymphoprolifératifs consécutifs à une infection par EBV est un exemple particulièrement
frappant d’infection opportuniste associée à l’immunodéficience postgreffe. Plusieurs études
ont corrélé la reconstitution immunitaire globale ou spécifique d’un agent infectieux (par
exemple du CMV) au risque d’infection après la greffe (Hakki, Riddell et al. 2003).
-Introduction-
14
2.2 Reconstitution immunitaire après greffe allogénique
FIG 2.1: Reconstitution immunitaire après allogreffe de moelle myéloablative -adapté de (Revillard 2001)-. A gauche, deux
lignes du temps représentant la cinétique de la reconstitution des populations lymphocytaires (en haut) et les périodes au
cours desquelles surviennent les principales infections opportunistes (en bas). A droite, la cinétique de reconstitution chiffrée
(TBI: irradiation corporelle totale ; Cp: cyclophosphamide ; Flu: fludarabine ; GAL: globulines antilymphocytaires ; MTX:
méthotrexate ; CSA: cyclosporine A ; N: neutrophiles ; Pl: plaquettes ; HSV : Herpes simplex virus ; CMV :
Cytomégalovirus ; EBV : Epstein-Barr virus ; adéno : adénovirus ; VZV : Varicelle-Zona virus).
Les différents partenaires de la reconstitution immunitaire sont présentés par ordre de
récupération (cf FIG 2.1).
2.2.1 Lymphocytes NK
Moins étudiée auparavant que celle des lymphocytes T CD4+ et CD8
+ (cf infra), la
reconstitution des lymphocytes NK après greffe suscite actuellement un grand intérêt grâce
aux récents progrès accomplis dans la compréhension de leurs récepteurs et grâce à leur
implication dans l’activité GvT (Ruggeri, Capanni et al. 2002; Nguyen, Dhedin et al. 2005;
Peggs 2006).
-Introduction-
15
Origine
La reconstitution de l’immunité innée précède celle du système adaptatif : les cellules NK
circulantes différenciées à partir des progéniteurs du greffon rejoignent déjà les valeurs
normales 1 mois après allogreffe (Nguyen, Dhedin et al. 2005).
Cinétique de reconstitution
La plupart des études ont mis en évidence une normalisation précoce des NK, voire même un
effet rebond, quelque soit le type de greffe, la source de cellules souches, l’âge du patient ou
la survenue de GvHD (Peggs 2006). La reconstitution des NK CD56bright
CD16dim
(productrices de cytokines mais présentant une faible cytotoxicité naturelle) précède celle des
CD56dim
(faibles productrices de cytokines mais activités cytotoxique, ADCC et LAK
élevées) (Peggs 2006). Par ailleurs, des tests in vitro (NK+ K562, lignée tumorale sensible à
la lyse par les NK) ont démontré le caractère pleinement fonctionnel des NK après greffe
(Atkinson 2004). La reconstitution du répertoire KIR est graduelle, et débute 6 mois à 1 an
après HCT, contrastant ainsi avec la rapide cinétique de reconstitution de la population NK
globale (Shilling, McQueen et al. 2003).
Impact des NK après HCT
Les cellules NK :
1° contribuent à la défense précoce contre les infections virales ; leur reconstitution est
d’ailleurs accélérée en cas d’infection à CMV (Atkinson 2004)
2° matures du greffon répondent à l’absence du HLA I autologue sur les cellules du receveur
(greffes non HLA identiques) et peuvent entraîner une réaction GvT : l’inoculation de
cellules NK humaines activées par l’IL-2 chez des souris SCID porteuses de cellules
leucémiques humaines K562 permet l’élimination de ces dernières (Xun et al, 1995) ; une
autre étude murine a montré que le transfert adoptif de NK activés après allogreffe induisait
un effet GvT puissant et diminuait l’importance de la GvHD (probablement par sécrétion de
TGF-β) (Asai et al, 1998). Des études cliniques ont également démontré la participation des
NK aux réponses allogéniques, particulièrement dans les greffes haploidentiques (Ruggeri,
Capanni et al. 2002; Atkinson 2004; Nguyen, Dhedin et al. 2005). Il semble en effet que les
lymphocytes NK du donneur pourraient exercer leur lyse allogénique en présence
d'incompatibilités du HLA reconnues par leurs récepteurs KIR, avec pour effet une
destruction de l'hématopoïèse du receveur, y compris des cellules malignes et, ceci de façon
-Introduction-
16
surprenante, en épargnant les autres tissus c'est-à-dire sans manifestation de GvH. Les cellules
NK ont ainsi été impliquées dans la médiation de l’activité GvT dans différents scenarii
cliniques, notamment dans les leucémies myéloïdes aigues lors de greffes haploidentiques
(Ruggeri, Capanni et al. 2002).
2.2.2 Lymphocytes B
Origine
Les lymphocytes B rencontrés après HCT proviennent essentiellement de la maturation des
cellules souches et progéniteurs du donneur. Ils présentent dès lors un phénotype
essentiellement naïf les premiers mois postgreffe.
Cinétique de reconstitution
Immédiatement après HCT, les progéniteurs issus du greffon s’implantent dans la moelle
osseuse et commencent leur différenciation. Les cellules B expriment essentiellement le
précurseur antigénique précoce CD10, puis durant la première année, les marqueurs CD1c,
CD5, CD23 et CD38, et les Ig membranaires IgM et IgD. Ce phénotype correspond à celui
des lymphocytes B de cordon ombilical ou de nouveau-né. Ensuite, en l’absence de GvHD, le
phénotype B mature (CD19+ CD20
+) apparaît 3 à 6 mois après HCT. Les taux d’Ig sériques
sont généralement réduits après greffe allogénique, puis augmentent graduellement: la
normalisation des IgM survient en premier lieu (2-6 mois), suivie de celle des Ig (3-18 mois),
puis de celle des Ig (6-36 mois). L’analyse des répertoires des chaînes lourdes des BCR révèle
une oligoclonalité des IgM au cours des premiers mois postgreffe, avec retour à la norme dans
les 4 à 6 mois. Plus tardivement reconstruit, le répertoire des IgG reste restreint durant plus de
9 mois. Cependant, la reconstitution des clones lymphocytaires B reste précoce et contraste
avec celle, tardive, des lymphocytes T : cette dissemblance pourrait refléter la production
continue de cellules B (en comparaison avec le déclin de l’activité thymique) durant la vie
adulte. Les taux augmentent ensuite jusqu’à devenir supranormaux 1 à 2 ans après greffe
(Atkinson 2004).
Rôle des autres sources
Les plasmocytes et lymphocytes B quiescents du receveur résistent partiellement à la plupart
des régimes de conditionnement, ce qui explique, durant les six premiers mois postgreffe, un
-Introduction-
17
pattern d’anticorps corrélé à celui du receveur prégreffe (Blume 2004). Occasionnellement,
lors d’une greffe présentant une incompatibilité sanguine ABO, la persistance d’anticorps
anti-A (plus rarement, anti-B) peut inhiber l’implantation des progéniteurs érythroïdes du
donneur chez le receveur et provoquer une érythroblastopénie (Benjamin, Connors et al.
1998). Cette dernière peut persister plusieurs mois après HCT. Dans le cas particulier des
greffes non myéloablatives, la persistance plus longue de lymphocytes B du receveur semble
augmenter le risque d’érythroblastopénie persistante (Malfuson, Hicheri et al. 2007).
Impact des lymphocytes B après HCT
Les GvHD aiguë et chronique sont toutes deux associées à une reconstitution B retardée. Par
ailleurs, l’émergence de réponses lymphocytaires B après greffe ne peut être envisagée sans
coopération étroite avec les lymphocytes CD4+ et des CPA, eux-mêmes affectés en cas de
GvHD (Avigan, Pirofski et al. 2001). Les lymphocytes B ont été impliqués dans la pathogénie
de la GvHD chronique (Patriarca, Skert et al. 2006), et un traitement par Rituximab (un
anticorps monoclonal humain anti-CD20) s’est révélé efficace chez certains patients
présentant une GvHD chronique réfractaire (Ratanatharathorn, Ayash et al. 2003; Canninga-
van Dijk, van der Straaten et al. 2004).
Après HCT, les lymphocytes B du donneur, au même titre que les lymphocytes T,
reconnaissent des antigènes mineurs d’histocompatibilité spécifiques du receveur, au contact
desquels une sécrétion active d’anticorps est amorcée (Miklos, Kim et al. 2004; Miklos, Kim
et al. 2005). Ce phénomène a été démontré au moyen d’un modèle de greffe impliquant un
donneur féminin et un receveur masculin. Le receveur présente dans ce cas une série de mHA
inconnus du donneur, car codés par des gènes situés sur le chromosome Y (nommés antigènes
H-Y). La présence d’anticorps anti-antigènes H-Y chez le receveur après HCT a été associée à
la survenue de cGvHD et à la maintenance des rémissions (Miklos, Kim et al. 2005).
Une déficience de l’immunité protectrice humorale envers les pathogènes viraux et bactériens
est observée après greffe. En effet, l’impact d’une HCT sur les Ig se manifeste par : 1°
diminution des Ig circulantes ; 2° changements de classe d’Ig altérés ; 3° perte de la
complexité des réarrangements des gènes des Ig (Peggs and Mackinnon 2004). Dans certains
cas, des Ig sont injectées aux patients greffés car ils sont souvent incapables de produire des
anticorps contre des antigènes polysaccharidiques rencontrés chez les bactéries encapsulées
du tractus respiratoire telles que S. pneumoniae ou H. influenzae (Avigan, Pirofski et al.
2001). Des études de vaccinations des donneurs contre des agents infectieux ou même
-Introduction-
18
tumoraux (Molrine, Antin et al. 2003; Parkkali, Kayhty et al. 2007) ont été menées. La
différenciation après greffe des progéniteurs du donneur permettrait ainsi une normalisation
subséquente des taux d’Ig qui pourraient dès lors assurer une immunité spécifique du
donneur, y compris un transfert passif de l’immunité mémoire (Peggs and Mackinnon 2004;
Peggs 2006).
2.2.3 Lymphocytes T
Origine
Les premiers mois après HCT, la majorité des lymphocytes T sont originaires de l’expansion
périphérique des lymphocytes T matures du greffon, et présentent par conséquent un
phénotype mémoire. Un certain nombre de lymphocytes T naïfs proviennent également de
l’expansion des lymphocytes T naïfs présents dans le greffon, étant donné qu’il existe une
corrélation entre le nombre de T naïfs greffés et leur concentration sanguine au jour 100 après
HCT. Dans un second temps, la prise des précurseurs et le réenclenchement de la fonction
thymique permettent la libération de lymphocytes T naïfs supplémentaires.
Cinétique de reconstitution
Une profonde déficience en lymphocytes T apparaît précocement après HCT. La
reconstitution du pool lymphocytaire T s’organise ensuite à partir de trois sources (cf infra) :
1° lymphocytes T résiduels du receveur,
2° lymphocytes T matures du greffon,
3° lymphocytes T naïfs issus de la différenciation intrathymique des cellules souches et
progéniteurs du donneur chez le receveur.
Les points 2 et 3 constituent respectivement les voies thymo-indépendante et thymo-
dépendante de reconstitution lymphocytaire T. Ils seront abordés en détail dans les chapitres
2.5 et 2.6. Schématiquement, la voie thymo-indépendante constitue la source majeure de
lymphocytes T les 3-6 premiers mois consécutifs à la greffe (Baron, Schaaf-Lafontaine et al.
2003; Atkinson 2004), puis, chez les jeunes patients, la voie thymo-dépendante prend le relai.
Les facteurs modulant la reconstitution T seront ensuite envisagés dans la section 2.4.
• Voie thymo-indépendante
La voie thymo-indépendante est généralement plus efficace dans la population CD8+ que
CD4+, ce qui entraîne par conséquent une récupération plus rapide de la population CD8
+
-Introduction-
19
après HCT (Mackall, Fleisher et al. 1997). Le phénotype des lymphocytes T générés par
expansion périphérique est généralement de type mémoire, bien que les lymphocytes T CD4+
naïfs puissent également subir une certaine expansion périphérique tout en maintenant leur
phénotype naïf (Storek, Dawson et al. 2003). De même, le fréquent phénotype
CD11b+/CD28/CD57
+ implique que de nombreuses cellules T périphériques pourraient être
activées (à la suite du premier contact antigénique), anergiques, ou encore suppressives
(Atkinson 2004).
• Voie thymo-dépendante
FIG 2.2: Voies de la reconstitution lymphocytaire T après HCT allogénique. La voie thymo-indépendante assure l’effet GvT
tandis que la voie thymo-dépendante assure la reconstitution immunitaire à long terme.
Pendant longtemps, le thymus est resté une « boîte noire » considérée comme inaccessible à
l’exploration clinique, et cette inaccessibilité était renforcée par la conception erronée que le
thymus n’exerçait plus d’activité significative au-delà de la puberté. Dans la voie thymo-
dépendante, les cellules souches et les précurseurs lymphoïdes du donneur colonisent la
-Introduction-
20
moelle du receveur et donnent naissance à des pré-lymphocytes T qui migrent ensuite vers le
thymus dans lequel ils subissent leur différenciation (cf section 2.6.1) (Atkinson 2004).
L’intervention de cette voie au cours de la reconstitution T a été démontrée plus rapide chez
les patients jeunes que chez les patients âgés en raison de l’atrophie thymique induite par
l’âge (Storek, Joseph et al. 2001). De plus, chez les adultes, la reconstitution du pool de CD4+
naïves est extrêmement lente, et semble dépendre étroitement du thymus (Novitzky and
Davison 2001; Kalina, Lu et al. 2005; Dallas, Varnum-Finney et al. 2007).
Marqueurs des lymphocytes T fraîchement issus du thymus, les T-Cell Receptor Excision
Circles (ou TREC, cf section 2.3.2) ont permis une meilleure compréhension de la cinétique
de reconstitution des populations T après HCT (Douek, Vescio et al. 2000). Ainsi, on constate
une augmentation des lymphocytes T matures (augmentation des lymphocytes T sans
augmentation (voire même avec diminution) parallèle du nombre de TREC)) pendant les trois
premiers mois après la greffe, confirmant ainsi que la phase initiale de la reconstitution
immunitaire est bien due à la prolifération des lymphocytes T matures contenus dans le
greffon (Hochberg, Chillemi et al. 2001). La néogenèse T (mise en évidence par une
augmentation du nombre de TREC concomitante à l’augmentation du nombre de lymphocytes
T) ne devient significative qu’après 6 mois suivant la greffe chez les jeunes adultes
(Hochberg, Chillemi et al. 2001). Elle est plus précoce chez les enfants, et nettement plus
tardive (voire absente ?) chez les adultes plus âgés. Enfin, une étude a suggéré que le taux
élevé de TREC chez le patient avant la greffe serait associé à une meilleure survie après
allogreffe (Clave, Rocha et al. 2005).
Rôle des autres sources
Directement après allogreffe myéloablative, il ne persiste généralement que très peu de
lymphocytes T du receveur à la suite du régime de conditionnement. Les greffes non
myéloablatives sont moins lympho-ablatives et permettent la persistance d’un nombre
significatif de lymphocytes T résiduels du receveur (Baron, Baker et al. 2004). Une réaction
allogénique se met dès lors en place avec les lymphocytes T du donneur prenant
progressivement la place des lymphocytes T du receveur. Les analyses de chimérisme
évaluent cette compétition.
La persistance de lymphocytes du receveur après conditionnement myéloablatif a été associée
à une augmentation du risque de rejet de la greffe, et à une diminution du risque de GvHD.
Des observations similaires ont été réalisées dans le cadre des minigreffes. De plus, il a été
démontré que le maintien de lymphocytes résiduels du receveur offrait une certaine protection
-Introduction-
21
contre les infections virales (particulièrement le CMV) les premiers mois suivant une
minigreffe.
Impact des lymphocytes T après HCT
Les lymphocytes T constituent les médiateurs des effets GvT, GvH (cf la première partie de
cette introduction) et antiviral. Leur importance est capitale dans la reconstitution
immunitaire postgreffe. Ces points seront abordés en détail dans les sections 2.5.3 et 2.6.3.
2.2.4 Populations suppressives
L’étude de ces populations a littéralement explosé ces dernières années, avec l’espoir sous-
jacent de découvrir parmi elles une population capable de discriminer les effets GvT et GvH
chez l’homme.
T Régulatrices
Les cellules T Régulatrices (TReg) contrôlent les réactions immunitaires et induisent la
tolérance périphérique. Les TReg sont principalement générées dans le thymus, (mais aussi
dans les organes lymphoïdes périphériques) où elles rencontrent les antigènes du soi. Lors de
la sélection négative, les lymphocytes T immatures qui reconnaissent avec une haute avidité
les antigènes présentés par les CPA sont éliminés (cf section 2.6.1) (Abbas A. 2005).
Pourtant, certaines cellules autoréactives ne subissent pas d’apoptose mais se différencient en
TReg (cf FIG 2.3). Elles quittent alors le thymus et inhibent les réponses envers les antigènes du
soi en périphérie. Le mécanisme d’action des TReg n’est pas clairement établi à l’heure
actuelle.
Les TReg pourraient inhiber l’activation des lymphocytes T (cf FIG 2.4) par contact direct (des
lymphocytes ou des CPA) par des mécanismes non encore complètement élucidés. D’un autre
côté, certaines études semblent indiquer une inhibition par voie cytokinique de la prolifération
et de la différenciation cellulaires des lymphocytes activés (Abbas A. 2005). Les cytokines
immunosuppressives impliquées seraient l’Il-10 et le TGF-β. Le TGF-β est un inhibiteur de la
prolifération lymphocytaire B et T, et de l’activation des macrophages. L’Il-10 inhibe les CPA
et l’activation des macrophages également ; elle constitue de plus un antagoniste des
cytokines activatrices des macrophages (IFN-γ) (Abbas A. 2005).
Dans le cadre particulier des HCT, les TReg peuvent, par contact direct, supprimer les réponses
CD4 et CD8 spécifiques d’auto- ou d’allo-antigènes (Rezvani, Mielke et al. 2006; Rieger,
-Introduction-
22
Loddenkemper et al. 2006). Définies initialement par leur fonction, le phénotype de cette
population est longtemps demeuré imprécis. En 1995, Sakaguchi et al. ont mis en évidence
une fraction de CD4+ nécessaire au contrôle de cellules alloréactives in vivo ; ces cellules
étaient caractérisées par une intense expression membranaire de la chaîne α du récepteur à
l’Il-2, le CD25.
FIG. 2.3: Tolérance centrale. Dans le thymus, la reconnaissance d’un antigène du soi par un précurseur lymphocytaire
entraine soit l’apoptose (sélection négative) soit la différenciation en cellule T régulatrice -extrait de (Abbas A. 2005)-.
FIG. 2.4 : Mécanismes hypothétiques d’inhibition de la réaction TH1 par les TReg. Une CPA présente l’antigène aux
lymphocytes T naïfs et sécrète de l’Il-12, favorisant ainsi la différenciation des cellules naïves en effectrices de type TH1. Ces
TH1 sécrètent de l’IFN-γ, permettant l’activation des macrophages lors de la phase effectrice de la réponse. Les TReg seraient
capables d’inhiber les T classiques impliquées dans ces processus soit par voie directe contact-dépendante, soit par voie
indirecte via sécrétion de cytokines immunosuppressives -extrait de (Abbas A. 2005)-.
-Introduction-
23
Cette coexpression CD4+CD25
+, longtemps considérée comme le phénotype de référence des
cellules régulatrices, existe également sur les cellules auxiliaires CD4+ activées (Rezvani,
Mielke et al. 2006). De nombreuses équipes ont ainsi évalué les associations entre GvHD,
GvT, reconstitution immunitaire et taux de TReg (cf section 2.7). Les résultats se sont révélés
discordants, peut-être en raison des rôles antinomiques joués par les CD4+ activées et les TReg
après HCT (Clark, Gregg et al. 2004; Sanchez, Casano et al. 2004; Stanzani, Martins et al.
2004).
L’identification du facteur de transcription Foxp3, dont l’expression est intimement corrélée à
la fonction régulatrice, s’est révélée critique pour scinder ces deux populations cellulaires
(Shevach 2002; Fontenot, Gavin et al. 2003; Hori, Nomura et al. 2003). Foxp3 est un gène
régulateur clé requis pour le développement et l’activité fonctionnelle des cellules TReg
(Fontenot, Gavin et al. 2003; Hori, Nomura et al. 2003; Khattri, Cox et al. 2003; Borsellino,
Kleinewietfeld et al. 2007). Les premières études concernant la reconstitution des TReg Foxp3+
après HCT indiquent que leurs capacités fonctionnelles ne semblent pas altérées après greffe,
même en cas de cGvHD (Hess 2006). Une expansion cellulaire significative a également été
mise en évidence dans la population CD4+Foxp3
+ précocement (moins de 100 jours) après
transplantation (Rezvani, Mielke et al. 2006; Mielke, Rezvani et al. 2007).
NKT
Les cellules NKT constituent une petite sous-population de cellules T immunorégulatrices
(Brigl and Brenner 2004; Kronenberg 2005) qui modulent les réponses adaptatives et innées
via sécrétion de cytokines polarisantes TH1 (IFN-γ) ou TH2 (IL-4, IL-5, IL-10, and IL-13)
(Gumperz, Miyake et al. 2002; Lee, Benlagha et al. 2002; Brigl and Brenner 2004; Haraguchi,
Takahashi et al. 2005). Les cellules NKT expriment un TCR invariant caractéristique,
composé d’une chaîne α constante Vα24Jα18 chez l’homme (Dellabona, Padovan et al. 1994;
Leite-de-Moraes, Lisbonne et al. 2002) appariée à un set biaisé de chaines β
(préférentiellement Vβ11 chez l'homme). Certaines NKT sont restreintes au CD1d (Brigl and
Brenner 2004; Kronenberg 2005), une molécule semblable au HLA, généralement exprimée
par les cellules présentatrices professionnelles ou par des cellules épithéliales (Blumberg,
Terhorst et al. 1991; Exley, Garcia et al. 2000). Les NKT pourraient jouer un rôle important
lors des greffes dans les réactions d’auto-immunité, les infections, l’immunité antitumorale
(Haraguchi, Takahashi et al. 2005) et la tolérance aux allo- et xénogreffes.
Ainsi, les NKT peuvent prévenir la survenue de GvHD aiguë chez la souris sans affecter
l’effet GvT (Lowsky, Takahashi et al. 2005). Chez l’homme, une étude de Lowsky et al.
-Introduction-
24
(Lowsky, Takahashi et al. 2005) a mis en évidence une forte diminution des GvHD aigues de
grade II-IV chez les patients soumis à un conditionnement de type TLI (Total Lymphoid
Irradiation) +ATG (Anti-Thymocyte Globulin). Or, ce conditionnement, comme démontré
chez la souris, préserve les NKT du receveur et augmente donc leur fréquence par rapport aux
autres lymphocytes. Ces NKT favoriseraient la production d’Il-4 par les CD4+ du donneur et
diminueraient leur prolifération face à des antigènes allogéniques lors de réactions
lymphocytaires mixtes (polarisation TH2). Inversement, le nombre de NKT semble diminué
chez les patients atteints de GvHD aiguë et de cGvHD extensive après HCT (Haraguchi,
Takahashi et al. 2004).
Par ailleurs, les cellules NKT semblent également impliquées dans l’immunité spécifique
contre le CMV. En effet, les hôtes immunocompétents contrôlent initialement le CMV par
l’immunité innée, grâce aux molécules CD1d et aux NKT. Les CD1d et les NKT pourraient
dès lors être impliqués dans la protection envers les effets myélosuppresseurs du CMV, et le
transfert adoptif de NKT pourrait contrer cet effet. Cette hypothèse a été expérimentée
récemment dans une étude portant sur différents types de souris KO (pour CD1d ou NKT)
(Broxmeyer, Dent et al. 2007) ; les cellules NKT, et probablement le CD1d, semblaient
impliqués dans la protection des progéniteurs contre les effets du CMV murin. De plus, le
transfert adoptif de NKT remédiait à la myélosuppression induite par le CMV.
2.3 Techniques d’évaluation de la reconstitution immunitaire après greffe allogénique
Quatre techniques importantes permettent aujourd’hui un suivi rapproché de la reconstitution
du système immunitaire après allogreffe: 1° analyse par cytométrie en flux des phénotypes
(CD) lymphocytaires et de leur capacité à sécréter des cytokines; 2° mesure par PCR
quantitative du taux des cercles d’excision du TCR (TREC) présents dans les lymphocytes T
sanguins ; 3° évaluation de la diversité du répertoire du TCR des lymphocytes T
périphériques ; 4° estimation de la capacité fonctionnelle des lymphocytes T. Par ailleurs, la
reconstitution T spécifique à certains pathogènes, tels le CMV ou l’HSV, fait l’objet de suivi
particulier.
-Introduction-
25
2.3.1 Phénotypage lymphocytaire
La cytométrie en flux est l’outil le plus fréquemment employé dans l’évaluation de la
reconstitution immunitaire après greffe. Les discriminations entre sous-populations
lymphocytaires après HCT sont habituellement obtenues par le marquages des antigènes
membranaires suivants (Atkinson 2004) :
• Lymphocytes T totaux CD3+
• Lymphocytes T auxiliaires CD3+ CD4
+
• Lymphocytes T cytotoxiques CD3+
CD8+
• Lymphocytes T auxiliaires naïfs CD3+ CD4
+ CD45RA
+
• Lymphocytes T auxiliaires mémoires CD3+ CD4
+ CD45RO
+
• Lymphocytes NK CD3- CD56
+
(avec selon leur degré de maturation et leurs capacités fonctionnelles, des cellules
CD56dim
CD16bright
et CD56bright
CD16 dim/neg
(Cooley, Xiao et al. 2007)).
• Lymphocytes B CD19+
(ou CD20+, ou Ig de surface)
Les progrès récents dans la cytométrie de flux ont permis de définir beaucoup plus
précisément ces phénotypes, et favorisé notamment la ségrégation entre lymphocytes naïfs et
mémoires dans la population CD8+. En effet, une discrimination basée exclusivement sur
l’expression de l’isoforme du CD45 a été pointée comme non fiable, étant donné que la
population CD8+CD45RA
+ contient des cellules partageant certaines caractéristiques
phénotypiques avec les cellules activées au cours du premier contact antigénique : faible
expression du CD62L (Roederer, Dubs et al. 1995) associée à une haute expression du
CD11a/CD18 (Okumura, Fujii et al. 1993). De plus, une fraction des cellules CD45RA+
présente une diminution d’expression du CD27 (Hintzen, de Jong et al. 1993), une
caractéristique considérée comme symptomatique d’une stimulation antigénique persistante in
vivo (De Jong, Brouwer et al. 1992). In fine, le phénotype de surface des lymphocytes T naïfs
cytotoxiques se définit actuellement comme CD8+ CD11a
low.
Parmi les marqueurs récents, citons encore (Storek, Witherspoon et al. 1995; Peggs and
Mackinnon 2004) :
• le CD62 Ligand (CD62L)
-Introduction-
26
• le CD31 (ou Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1, PECAM-1) (Kimmig,
Przybylski et al. 2002; Duszczyszyn, Beck et al. 2006)
• le CD103 (intégrine αE) (McFarland, Douek et al. 2000; Staton, Johnston et al. 2004)
Le CD62L (L-sélectine) est un marqueur lymphocytaire important impliqué dans le
« homing » et le développement des lymphocytes T. Les cellules T naïves quiescentes sont
CD62L+, et l’interaction du CD62L avec ses ligands, un groupe de molécules répertoriées
comme les « addressines des ganglions périphériques » (PNAd, Peripheral Node Addressin),
est cruciale pour le passage des cellules T dans les ganglions lymphatiques à travers les
veinules à endothélium élevé (Butcher and Picker 1996). Le CD62L permet en outre la
discrimination de 2 populations de CD8+ mémoires (et peut-être aussi de CD4
+ mémoires), les
cellules mémoires centrales (CD62L+) et les cellules mémoires effectrices (CD62L
-) (Chao
2008), et n’est donc pas exclusivement réservé aux cellules naïves comme on le pensait
auparavant.
La glycoprotéine CD31 (ou Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1, PECAM-1) est un
antigène de différenciation exprimé par les lymphocytes CD4+ fraîchement émigrés du
thymus (Kimmig, Przybylski et al. 2002; Duszczyszyn, Beck et al. 2006). Le CD31 disparaît
des CD4+ naïves périphériques lorsqu’elles sont engagées dans des processus de prolifération;
les TREC (T-cell Receptor Excision Circle, vide infra) sont d’ailleurs abondants dans les
cellules CD45RA+ CD31
+ mais difficilement détectés dans les CD45RA
+ CD31
- (Kimmig,
Przybylski et al. 2002). Cette perte d’expression du CD31 n’a cependant pas été démontrée à
ce jour dans les lymphocytes T CD8+
(Duszczyszyn, Beck et al. 2006).
Bien que le marqueur CD103 (intégrine αE) soit surtout connu en tant que marqueur des T
mémoires circulantes associés aux muqueuses (Ling, Dulphy et al. 2007), il est également
exprimé sur une sous-population de CD8+ naïves périphériques (CD8
+, CD103
+, CD45RO
−,
CD62Lbright
, CD27bright
, CD11adim
, CD95dim
). Ces lymphocytes naïfs CD8+ CD103
+ présentent
des taux de TREC élevés qui déclinent avec l’âge (McFarland, Douek et al. 2000; Staton,
Johnston et al. 2004).
Il est communément admis que le pourcentage de cellules T naïves est proche de celui des
cellules T ayant quitté récemment le thymus. Par cytométrie en flux, il est donc possible
d’obtenir une première évaluation du pourcentage des RTE (Recent Thymic Emigrants) dans
la population T périphérique.
-Introduction-
27
2.3.2 Quantification des cercles d’excision des TCR (TREC)
Les TCR (T-cell Receptor) sont des protéines dimères qui appartiennent à la superfamille des
immunoglobulines et qui sont codées par quatre gènes différents (α, β, δ et γ). Nonante-cinq
pourcents des cellules T périphériques expriment un TCR de type αβ, tandis que 5% environ
expriment un TCR de type δγ. Ces quatre gènes sont à la base de l’énorme diversité des
lymphocytes T. Cette diversité est générée au cours de leur différenciation dans le thymus. La
partie variable amino-terminale des TCR, responsable de la reconnaissance de l’antigène, est
codée par une combinaison des segments géniques « variable (V) », « diversité (D) » et
« jonction (J) » pour les chaînes ß et δ, et par une combinaison des segments V et J pour les
chaînes α et γ. Un quatrième segment « constant (C) » encode les domaines constants du
TCR. Le réarrangement des segments géniques encodant la partie variable des TCR, à
l’origine de la diversité du répertoire des cellules T, se produit essentiellement dans le thymus
et est catalysée par l’action de deux enzymes, RAG-1 et RAG-2 (Recombination Activating
Gene 1 et 2) (Abbas A. 2005). Il s’agit d’un processus complexe, la recombinaison
somatique, représentée à la FIG 2.5.
Partenaires enzymatiques (VDJ recombinase) : naissance d’un TREC
Tous les segments V, D et J sont entourés de séquences RSS (Recombination Signal
Sequence, cf FIG. 2.6). Les RSS homologues spécifiques sont formées de 2 séquences
conservées séparées par un « spacer ». La séquence conservée adjacente à l’ADN codant est
un heptamère palindromique, l’autre un nonamère. Lors des réarrangements, le complexe
enzymatique RAG1-RAG2 reconnaît et clive l’ADN entre le segment codant et l’heptamère
au niveau de 2 segments de gènes (Abbas A. 2005). Les RAG induisent la formation
d’« épingles à cheveux » aux extrémités codantes de l’ADN. Dans un second temps, les
différentes enzymes de la voie NHEJ (Non Homologous End Joining Pathway) provoquent le
clivage de ces « épingles à cheveux » et la soudure des extrémités codantes. Parmi ces
enzymes, on retrouve les protéines Ku, DNA PKcs, la nucléase Artémis, et le complexe
XRCC4-DNA ligase IV (Ma, Pannicke et al. 2002; Niewolik, Pannicke et al. 2006). Après
ligation des extrémités codantes, l’ADN recombiné sera transcrit et traduit. Par ailleurs, au
cours de ces processus enzymatiques, un fragment d’ADN se retrouve excisé de l’ADN
génomique. Ses extrémités se lient: épisomique, circularisé, il devient un TREC, cercle
-Introduction-
28
d’excision du TCR (Douek, McFarland et al. 1998). Présents dans les thymocytes et les
lymphocytes T matures, les TREC ne semblent pas présenter de rôle spécifique.
FIG. 2.5 : Recombinaison somatique. Extrait de (Janeway C), explications dans le texte.
FIG 2.6 : Sites d’action des enzymes RAG et Artémis lors de la formation des TREC (Al-Harthi, Marchetti et al. 2000).
-Introduction-
29
Séquence des recombinaisons VDJ : diversité des TREC
Les recombinaisons VDJ ont lieu dans un ordre systématique (cf FIG. 2.5) et engendrent, tout
au long de la maturation intrathymique des précurseurs de lymphocytes T, l’excision de
fragments d’ADN.
� Réarrangements du gène β:
-Dβ-Jβ: génération de βTREC
-Vβ-Dβ-Jβ: génération de βTREC
-Synthèse de la chaîne peptidique β (expression cytoplasmique)
-Expression membranaire de la chaîne β, associée à un substitut de chaîne α de 33 kDa,
pTα, issue de la transcription du gène α sans réarrangements préalables.
� Réarrangements du gène α
- excision du gène δ, situé au sein du locus α: génération du sjTREC
- Dα-Jα: génération d’αTREC
- Expression membranaire des chaînes α et β
Selon leur étape de conception, on distingue ainsi différents types de TREC, dont les plus
connus sont le sjTREC et les 13 βTREC. Ces TREC sont présents dans les lymphocytes T
matures qui quittent le thymus et ne seront pas dupliqués lors des divisions cellulaires
subséquentes puisqu’en dehors de l’appareil chromosomique. Par PCR quantitative, il est
possible de mesurer la concentration des TREC sanguins par rapport à 105 lymphocytes T
circulants. On considère actuellement la mesure des sjTREC comme le biomarqueur de
référence de la thymopoïèse. Cependant, en cas d’apoptose accrue ou d’expansion
périphérique exacerbée des lymphocytes T matures, des taux artificiellement bas de sjTREC
peuvent être mesurés malgré une activité thymique normale.
2.3.3 Diversité du répertoire TCR
L’analyse de la diversité clonale des lymphocytes T périphériques permet (O'Keefe, Risitano
et al. 2004) : 1° de déterminer la compétence du système immunitaire après greffe, puisqu’une
large diversité est synonyme de réponses efficaces à des stimuli variés ; 2° de détecter une
réponse immunitaire en cours, reflétée par une dominance mono ou oligoclonale. Une analyse
du répertoire TCR peut être réalisée par cytométrie en flux (non abordée dans cet ouvrage) ou
détection moléculaire (Atkinson 2004).
-Introduction-
30
La partie variable de la chaîne α du TCR possède trois domaines hypervariables ou
Complimentarity Determining Regions (CDR), tandis que la chaîne β en compte quatre
(Janeway C; Abbas A. 2005). Les CDR3 des chaînes α et β jouent un rôle clef dans la
définition de la reconnaissance antigénique et sont générés par d’intenses réarrangements des
segments V, D et J puis par insertion/ délétion au hasard de nucléotides de jonction. Au final,
des produits de tailles hétérogènes assurent à chaque lymphocyte T un TCR unique. Le
spectratyping (immunoscope) évalue la diversité du répertoire T à tout moment par l’examen
du polymorphisme de longueur du CDR3 dans une population lymphocytaire (Wu, Chillemi
et al. 2000; Revillard 2001). Une analyse similaire évalue la diversité des CDR3 des chaînes
lourdes des Ig dans les lymphocytes B (Weller, Braun et al. 2004).
Les individus sains présentent un répertoire TCR hautement diversifié avec une distribution
gaussienne d’approximativement 8 fragments au sein de chaque famille de CDR3 (Wu,
Chillemi et al. 2000). Après greffe allogénique, une contraction du pool de lymphocytes T et
une réduction de la diversité des TCR sont clairement associés à une immunodéficience
clinique (O'Keefe C, Sobecks et al. 2004). La reconstitution du système immunitaire est
souvent caractérisée par l’émergence de populations de cellules T mono- ou oligoclonales
reflétant des réponses immunitaires spécifiques envers un antigène en particulier : antigènes
allogéniques (GvHD et GvT), antigènes viraux tels que CMV ou EBV. La diversité clonale
des lymphocytes B périphériques est réduite après greffe allogénique, mais la reconstitution
rapide de l’immunoscope contraste avec celle des cellules T. Cette différence pourrait refléter
la synthèse continue de lymphocytes B rencontrée tout au long de la vie, par comparaison
avec le déclin de la fonction thymique chez l’adulte (Peggs and Mackinnon 2004).
2.3.4 Evaluation de la capacité fonctionnelle
L’analyse des fonctions lymphocytaires permet d'apprécier la persistance à plus long terme
d'un déficit immunitaire. Ces tests évaluent si des populations normales en nombre et en
phénotype présentent bien une fonction immunitaire intacte.
Test de sécrétion de cytokines : ELISA/ELISpot
Ces tests permettent la quantification des cytokines constitutives ou induites in vitro, ainsi que
l’énumération de populations sécrétrices. La modulation de différentes cytokines dans le
microenvironnement joue un rôle important dans l’occurrence et la sévérité des réponses
-Introduction-
31
immunitaires. De nombreuses cytokines pourraient être impliquées dans le développement de
la GvHD (Antin and Ferrara 1992; Ferrara 1998) : l’Il-1, le TNF-α, l’IFN-γ, l’Il-15, l’Il-6 ; la
fraction soluble du récepteur à l’Il-2 (sIl-2R, augmentée en cas de GvHD ou
d’infection) (Foley, Couban et al. 1998; Grimm, Zeller et al. 1998).
Les techniques les plus utilisées sont le marquage intracytoplasmique et l’ELIspot (single-cell
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). Dans ces protocoles, l’activation et la différenciation
des cellules T ont lieu in vivo, tandis que la synthèse cytokinique est mesurée in vitro. Par
contre, l’expression de cytokines par les lymphocytes T spécifiques d’un antigène particulier
peut être obtenue par une combinaison avec la méthode des tétramères (cf ci-dessous). Lors
d’un ELISpot (cf FIG. 2.7), les cellules T fraichement isolées sont cultivées sur un tapis
d’anticorps spécifiques de la cytokine d’intérêt. Les cellules T individuelles sécrètent des
cytokines qui se lient aux anticorps et forment des « spot », qui seront visualisés par
adjonction d’un second anticorps couplé à la peroxydase. Le nombre de spots révèle le
nombre de cellules T sécrétrices.
FIG 2.7: ELISpot. Explications dans le texte.
-Introduction-
32
Analyses de tétramères MHC I/II : récupération de CD8+/CD4+ de spécificité
antigénique particulière
Les tétramères permettent d’identifier les lymphocytes T dont le TCR reconnaît un complexe
Ag-HLA particulier (cf FIG 2.8). Des molécules HLA sont associées à un peptide (issu par
exemple d’une protéine virale) d’une part, à la biotine d’autre part. Ce complexe interagit
avec la streptavidine, elle-même complexée à un fluorochrome (FITC). La stœchiométrie est
de 4 molécules de biotine pour 1 de streptavidine, assurant de la sorte une avidité suffisante
du complexe vis-à-vis des TCR. En raison de sa nature, cette application est limitée aux
produits des allèles les plus fréquents dans la population.
FIG 2.8: Technique des tétramères. (A) Chaque sous-unité du tétramère est formée de la fraction extracellulaire d’un HLA
(ici, de classe I) associée à un peptide et à une molécule de biotine. (B) La streptavidine, groupée au FITC, unit ces
monomères. (C) Les tétramères lient les TCR des lymphocytes spécifiques à leur peptide, permettant de la sorte leur
identification dans une population polyclonale (D)-adapté de (Revillard 2001)-.
MLR : réponses T alloréactives
Les MLR (Mixed Lymphocyte Reaction) constituent le modèle le plus souvent employé in
vitro dans le but de reproduire les réactions allogéniques (cf FIG 2.9). Au cours de cette
réaction, les cellules stimulatrices sont cultivées 1 semaine au côté de lymphocytes T CD4+ et
-Introduction-
33
CD8+ allogéniques. La MLR permet l’activation par reconnaissance directe des CD4
+
alloréactifs, leur transformation et leur expansion clonale. Les CD8+
reconnaissant des HLA-I
allogéniques prolifèrent également. Les cellules stimulatrices peuvent se présenter sous forme
de monocytes/macrophages, de cellules dendritiques et surtout, de lymphocytes B. Des
lymphocytes T CD8+ alloréactifs se différencient ensuite en cellules cytotoxiques spécifiques
des Ag HLA de classe I des cellules stimulatrices. Avant toute stimulation in vivo, la
fréquence des cellules T alloréactives est de 1 à 5%. La réaction lymphocytaire mixte entraîne
ainsi la différenciation de cellules effectrices cytotoxiques, dont l’activité peut être mesurée
par un test de cytotoxicité (cf ci-dessous). Cependant, les MLR sont typiquement négatives
lorsque les cellules effectrices et stimulatrices sont HLA-identiques. En d’autres termes, les
mHA ne sont pas suffisants pour induire une réponse dans les MLR in vitro.
FIG 2.9: MLR (Mixed Lymphocyte Reaction), adapté de (Revillard 2001). Les cellules simulatrices allogéniques sont
cultivées 1 semaine aux côtés de lymphocytes CD4+ et CD8+ (cf schéma) et provoquent:
1) J0-J1 : l’activation des CD4+ accompagnée d’une sécrétion d’Il-2 autocrine et paracrine ; l’activation des CD8+,
accompagnée d’une sécrétion d’Il-2 et d’une différenciation en CD8+cytotoxiques matures (T8c),
2) J2-J6 : l’expansion clonale des CD4+ et des CD8+ activés,
3) J6 : l’arrêt de la prolifération à la suite de la destruction des cellules stimulatrices par les CD8+.
-Introduction-
34
Tests lymphoprolifératifs : réponses CD4+/CD8+ Ag spécifiques
En fonction de la catégorie lymphocytaire étudiée, les RLM peuvent être analysées par test
lymphoprolifératif (CD4+ et CD8
+), par test de sécrétion de cytokine(s), ou par test de
cytotoxicité (CD8+). Les tests lymphoprolifératifs sont basés sur l’incorporation de
3H dans
les noyaux de cellules en mitose. Les cellules simulatrices sont irradiées au préalable afin
d’éviter une contamination du signal par des mitoses non lymphocytaires.
Cytotoxicité : fonctions lytiques des NK et CD8+
La fonction cytotoxique peut être évaluée après 6 jours de MLR grâce à une mesure de la lyse
de cellules cibles marquées au 51
Cr. Après 4 heures de coculture, le 51
Cr libéré dans le milieu
à la suite de la destruction des cibles par les lymphocytes CD8+ permet de calculer l’indice
cytotoxique. Un contrôle de la lyse non spécifique médiée par les cellules NK est souvent
réalisé au moyen d’une coculture de contrôle avec la lignée K562.
DTH
La DTH (Delayed Type Hypersensitivity) est essentiellement utilisée dans le cadre
d’immunisations, afin de tester in vivo l’induction d’une réponse T spécifique consécutive à
une exposition antigénique (Massaia, Borrione et al. 1999). Elle est basée sur la
reconnaissance locale par les lymphocytes CD4+ et CD8
+ d’antigènes contre lesquels l’hôte a
été préalablement immunisé (Nestle, Alijagic et al. 1998; Massaia, Borrione et al. 1999).
FIG 2.10 : Exemple de DTH (Delayed Type Hypersensitivity Reaction, réaction d’hypersensibilité retardée), adapté de
(Abbas 2005). Cas particulier de la réaction à la tuberculine. Les réactions de type DTH sont essentiellement menées par les
cellules T.
-Introduction-
35
Ig sériques : évaluation de la fonction sécrétoire B par immunisation contre le
bactériophage φφφφ X 174
Le bactériophage φ X 174 est un néo-antigène qui ne provoque pas de toxicité lors de son
administration intraveineuse chez l’homme (Ochs, Davis et al. 1971). Chez un volontaire sain,
il induit une réponse classique des anticorps (cf FIG 2.11) : immunité mémoire, amplification
des titres d’immunoglobulines, et changement de classe lors d’une seconde immunisation
(IgM�IgG) (Ochs, Davis et al. 1971). Une immunité fonctionnelle compétente des CPA,
lymphocytes T et lymphocytes B est requise pour une réponse Ig optimale envers ce néo-
antigène. C’est pourquoi l’immunisation par bactériophage a été abondamment utilisée dans
le suivi des états d’immunodéficience primaire (Ochs, Buckley et al. 1992), secondaire
(Bernstein, Ochs et al. 1985) ou après HCT (Witherspoon, Noel et al. 1978; Witherspoon,
Sullivan et al. 1988; Andrews, Winkler et al. 1997). Ainsi, chez le singe, des réponses
immunologiques efficaces envers le bactériophage ont été démontrées à la suite d’une greffe
allogénique de CD34+
purifiées, démontrant de la sorte une large reconstitution des répertoires
lymphocytaires T et B (Andrews, Winkler et al. 1997).
FIG 2.11: Sécrétion in vivo d’anticorps spécifiques du phage φ X 174 chez le volontaire sain (partie supérieure, n=12) et chez
3 patients atteints d’agammaglobulinémie liée à l’X (partie inférieure) -extrait de (Nonoyama, Tsukada et al. 1998)-.
-Introduction-
36
2.3.5 Reconstitution immunitaire spécifique
Le contrôle immunitaire des infections virales persistantes (famille de l’herpès : HSV, CMV)
requiert une réponse coordonnée de différentes populations cellulaires : les CD4+
(coordinateurs des effecteurs), les CD8+ (effecteurs principaux), les lymphocytes B (Polic,
Hengel et al. 1998). Le CMV est présent sous forme latente chez environ 50% de la
population adulte, le HSV-I chez 90%. La plupart des individus sains présentent une
population de lymphocytes CD8+ mémoires spécifiques du CMV. Cependant, sous l’influence
de facteurs viraux ou endogènes, ces CD8+ mémoires peuvent devenir effecteurs (Gamadia,
Rentenaar et al. 2001). Dans les 2 cas de figure, l’infection reste généralement
asymptomatique et un équilibre est atteint. Chez le greffé, l’emploi d’immunosuppresseurs
peut rompre cet équilibre et entraîner une infection. Des tests phénotypiques et fonctionnels
permettent une estimation de la population lymphocytaire spécifique du CMV ou de l’HSV
après greffe :
Tests lymphoprolifératifs
La prolifération lymphocytaire peut être mesurée à la suite d’une incubation en présence d’un
lysat de CMV ou d’une solution d’antigène CMV-pp65, suivie d’un test d’incorporation de
3H.
Sécrétion d’IFN-γγγγ
La sécrétion d’IFN-γ est évaluée après culture d’un échantillon de sang complet au contact
d’un lysat de CMV. Elle reflète la capacité des lymphocytes CD4+ et CD8
+ à synthétiser
l’IFN-γ au contact de phagocytes ayant incorporé les peptides du CMV. Le sang total est dans
un premier temps incubé en présence
-d’anticorps anti-CD28 et anti-CD49d, qui permettent l’augmentation de la production de
cytokines lors de courtes incubations (<12h) avec des antigènes peptidiques
-de lysat de CMV, de SEB (Staphylococcal Enterotoxin B, contrôle positif) ou de milieu
(contrôle négatif)
-de bréfeldine A(1)
(1)
Métabolite fongique qui induit une inhibition rapide du transport protéique entre le réticulum endoplasmique
(RE) et l'appareil de Golgi, la disparition de l'appareil de Golgi et la redistribution des protéines golgiennes
vers le RE. La bréfeldine A perturbe très fortement les structures membranaires et bloque le trafic intracellulaire
dans toutes les cellules eucaryotes.
-Introduction-
37
La sécrétion d’IFN-γ est ensuite mesurée par cytométrie, la plupart du temps par marquage
intracellulaire, et combinée aux CD4/CD8 et CD69 (marqueur précoce d’activation exprimé
préalablement à la sécrétion de cytokines après stimulation antigénique).
Tétramères
Dans le cas du CMV, des tétramères HLA-A2.1, HLA-A2.4 ou HLA-B7 sont chargés au
moyen d’un peptide dérivé du CMV-pp65 (Gamadia, Rentenaar et al. 2001; Mohty, Mohty et
al. 2004). L’incubation au contact des tétramères peut être suivie d’une analyse de cytométrie,
complétée par le marquage des populations lymphocytaires suivantes : CD8, CD45RA,
CD27/CD28 (récepteurs de costimulation), KIRs (dont le NK-B1 qui interagit avec le HLA-B
(Lanier, Gumperz et al. 1995)). Le phénotype effecteur peut également être mis en évidence
par les marquages de la perforine, du granzyme B, du 2B4 (ou CD244, récepteur nécessaire à
l’activation des CD8+ mémoires et des NK (Nakajima and Colonna 2000)) ou de cytokines
intracellulaires (IFN-γ). Ces dernières peuvent également être mises en évidence par ELISpot.
2.4 Facteurs affectant la reconstitution immunitaire après HCT
L’influence de multiples facteurs sur la cinétique et la diversité de la reconstitution
immunitaire a été démontrée au cours de nombreuses études cliniques (cf TAB 2.1, page
suivante). La majorité de ces études concerne la récupération des lymphocytes T lors
d’allogreffes myéloablatives. Egalement évaluée, la vitesse de reconstitution des lymphocytes
B totaux semble corrélée au nombre de T auxiliaires mémoires CD4+CD45RO
+ (Avigan,
Pirofski et al. 2001) ainsi qu’à l’absence de GvHD (Atkinson 2004). En revanche, un manque
de données relatives à la récupération fonctionnelle de l’immunité innée persiste encore à
l’heure actuelle (Peggs 2006).
2.4.1 Age
- Plusieurs études ont mis en évidence une corrélation inverse entre l’activité thymique et
l’âge du receveur (cf TAB 1.5).
- Une corrélation inverse entre le taux de lymphocytes CD4+ naïfs et l’âge du donneur a
également été démontrée (Baron, Storer et al. 2006).
-Introduction-
38
Facteurs affectant la reconstitution immunitaire après HCT
Age du patient et du donneur
Source de cellules souches (moelle osseuse vs PBSC vs sang de cordon)
Composition du greffon (déplétion ou non des lymphocytes T du greffon)
Degré de compatibilité du greffon (familial ou non, polymorphisme génétique des HLA et mHA)
Conditionnement myéloablatif ou atténué
Evolution clinique (GvHD, infections)
TAB 2.1: Explications dans le texte.
2.4.2 Source de cellules souches
- Les greffons composés de cellules souches mobilisées (PBSC) contiennent environ 10 fois
plus de lymphocytes T que les greffons de moelle osseuse. Les concentrations en cellules T
chez le receveur sont dès lors supérieures à la suite d’une greffe de cellules souches
mobilisées (Storek, Dawson et al. 2001). De plus, un nombre supérieur de lymphocytes T
auxiliaires CMV-spécifiques est observé après greffe chez les patients ayant reçu des PBSC
par rapport aux receveurs de moelle osseuse.
- In vivo, l’exposition de CD4+ au G-CSF, un facteur de croissance utilisé dans la mobilisation
des cellules souches, provoque l’acquisition par certains lymphocytes de propriétés
caractéristiques des cellules T suppressives de type I (1)
: 1° un profil d’expression cytokinique
inhabituel (Il-10++
TGF-B1+ Il-2
low/- Il-4
low/-) ; 2° une capacité à supprimer les proliférations
induites par les antigènes de manière contact indépendante (Peggs 2006).
- Les cellules souches mobilisées contiennent également jusqu’à dix fois plus de lymphocytes
B ainsi qu’une expression accrue des marqueurs d’activation cellulaire (Tayebi, Kuttler et al.
2001; Tayebi, Tiberghien et al. 2001). La reconstitution du pool lymphocytaire B serait
cependant peu affectée par ces dissemblances (Storek, Dawson et al. 2001).
- Les cellules souches mobilisées incluent enfin plus de monocytes ; or ces derniers peuvent
présenter une activité immunosuppressive via sécrétion de médiateurs solubles non
spécifiques tels que l’Il-10. Par ailleurs, les cellules dendritiques de type 2 sont aussi plus
fréquentes dans les cellules souches mobilisées, et provoquent l’activation de lymphocytes de
type TH2 (Peggs 2006).
(1) T suppressives distinctes des TReg, originaires d’une conversion périphérique de lymphocytes T naïfs ou
mémoires et assurant la tolérance vis-à-vis des antigènes de l’environnement (par opposition aux antigènes du
soi dans le cas des TReg).
-Introduction-
39
2.4.3 Composition du greffon
- Dans le but de diminuer l’incidence des GvHD postgreffe, différents protocoles impliquant
des déplétions lymphocytaires du greffon ont été testés (Alyea, Weller et al. 2001; Soiffer,
Alyea et al. 2002; Baron, Schaaf-Lafontaine et al. 2003). Cependant, les lymphocytes T
matures du greffon constituent la principale source de lymphocytes T les premiers mois après
HCT. Une déplétion lymphocytaire T compromet ainsi significativement la reconstitution
immunitaire précoce après HCT entrainant avec elle rechutes et infections (Peggs 2006). Les
CD4+ sont fréquemment rapportés comme la population dont la reconstitution est la plus
altérée par les déplétions de greffons.
- Le Campath® (alemtuzumab) est un anticorps monoclonal humanisé (IgG1) dirigé contre
l’antigène CD52 exprimé sur les cellules lymphoïdes et sur les cellules de la lignée
monocytaire. Il est utilisé dans le cadre de déplétions lymphocytaires T in vivo, manipulations
associées à des taux très faibles de GvHD aigues et chroniques, et avec une faible mortalité
précoce liée à la greffe (Chakraverty, Peggs et al. 2002). Cependant, il présente certains effets
indésirables : 1° un retard de la reconstitution immunitaire (lymphocytes T, surtout dans les
greffes non myéloablatives (Morris, Rebello et al. 2003; Lundin, Porwit-MacDonald et al.
2004)) ; 2° une augmentation de l’incidence des infections virales (Chakrabarti, Mackinnon et
al. 2002) ; 3° une augmentation importante de la fréquence des rechutes (Peggs 2004;
Crawley, Lalancette et al. 2005).
2.4.4 Degré de compatibilité du greffon
Familial vs non familial
Les gènes encodant les HLA I et II sont fortement liés, et se transmettent sous forme
d’haplotypes révélant peu de recombinaisons. Il existe donc 25% de chances que deux
membres d’une même fratrie aient hérité du même haplotype paternel et du même haplotype
maternel, et soient par conséquent HLA-identiques. Il est également possible de trouver un
donneur HLA identique hors du cercle familial. Dans ce cas cependant, d’autres
polymorphismes sont très souvent présents sur le HLA. De plus, les loci des mHA sont
dispersés dans l’entièreté du génome, et leur diversité est également moindre au sein d’une
même famille. Le choix d’un donneur non familial augmente par conséquent les disparités,
donc les alloréactions (GvHD, rejet), et entrave ainsi la reconstitution T.
-Introduction-
40
Polymorphisme génétique des HLA et mHA
Le polymorphisme génétique est à l’origine de disparités du répertoire peptidique présenté par
les molécules du HLA et les antigènes mineurs d’histocompatibilité (cf supra). La
reconstitution thymo-indépendante est influencée par de telles rencontres antigéniques et peut
induire des expansions clonales massives, entrainant GvHD et/ou effet GvT. La reconstitution
immunitaire spécifique d’antigènes particuliers tels que le CMV sera envisagée dans la
section 2.5.3.
2.4.5 Conditionnement myéloablatif ou atténué
Les protocoles d’allogreffe classiques induisent des perturbations profondes et durables des
réponses immunitaires; les minigreffes et greffes RIC (Reduced Intensity Conditioning)
remplacent les myélosuppresseurs par des immunosuppresseurs, moins agressifs.
Les effets d’un conditionnement non myéloablatif d’intensité très faible (TBI de 2Gy +/-
fludarabine suivie d’une immunosuppression postgreffe associant CSA et MMF) ont été
évalués par une étude de Maris et al. en 2003. Théoriquement, ce type de traitement devrait
mener à une reconstitution immunitaire plus efficace et diminuer les risques d’infections
opportunistes, en raison :
1° du faible risque de neutropénie sévère, et par conséquent d’infection bactérienne ou
fongique (McSweeney, Niederwieser et al. 2001);
2° du maintien de l’intégrité des barrières muqueuse et dermique associé à une diminution
du risque de translocation bactérienne vers les tissus mous et le sang ;
3° de la survie d’une fraction des cellules T du receveur (chimérisme mixte) qui
contribuent à l’immunité cellulaire contre les complications infectieuses (McSweeney,
Niederwieser et al. 2001; Junghanss, Boeckh et al. 2002).
Les bénéfices des conditionnements non myéloablatifs se sont révélés présents dans la
reconstitution immunitaire à court terme, (Junghanss, Boeckh et al. 2002; Junghanss, Marr et
al. 2002; Maris, Boeckh et al. 2003) étant donné que les receveurs d’une greffe non
myéloablative présentent des taux de CD4+ naïves et de lymphocytes anti-CMV supérieurs à
ceux des patients ayant reçu une greffe myéloablative. Ainsi, les complications infectieuses
semblent moins fréquentes les 3 premiers mois après greffe non myéloablative. Cependant,
les patients ayant reçu une greffe non myéloablative présentent 1 an après la greffe des taux
de lymphocytes T naïfs inférieurs à ceux ayant bénéficié d’une greffe myéloablative (Maris,
Boeckh et al. 2003).
-Introduction-
41
2.4.6 Evolution clinique
D’une manière générale, toutes les complications susceptibles d’influencer négativement la
fonction thymique (Weinberg, Blazar et al. 2001; Hazenberg, Otto et al. 2002; Lewin, Heller
et al. 2002; Storek, Joseph et al. 2002), entravent la reconstitution T (cf FIG 2.12).
FIG 2.12: Altération du répertoire TCR post HCT. La voie thymo-dépendante génère une population T polyclonale, dont le
nombre de TCR distincts peut avoisiner 107 au sein de la population T naïve, et 105 dans la population mémoire. L’intégrité
de ce répertoire assure une compétitivité des réponses immunitaires adaptatives. Or, après HCT, la chimiothérapie et la
GvHD peuvent être à l’origine de détériorations thymiques ainsi que d’apoptoses dans la population T mémoire, et
restreindre de la sorte drastiquement le répertoire TCR. Le thymus altéré et le répertoire amoindri constituent des cibles
d’action thérapeutique -extrait de (Komanduri 2002)-.
Après HCT, le thymus constitue à la fois une source de lymphocytes T, mais également un
organe cible des réponses T alloréactives. Chez le chien comme chez l’homme, la
reconstitution des cellules T naïves est altérée en cas de GvHD (Storek, Witherspoon et al.
1995). Des études post mortem chez l’homme ont mis en évidence une détérioration des
cellules épithéliales thymiques chez les patients atteints de GvHD (Muller-Hermelink, Sale et
-Introduction-
42
al. 1987). Ces données ont été enrichies par des études murines au cours desquelles une
destruction des cellules épithéliales, de la jonction cortico-médullaire et des corpuscules de
Hassal étaient associées à la GvHD (Lapp, Wechsler et al. 1974; Seemayer, Lapp et al. 1977).
Ce double potentiel thymique laisse place à une importante question : la GvHD génère-t-elle
les altérations thymiques ou le thymus altéré engendre-t-il la GvHD ? Les deux affirmations
sont probablement vraies, conduisant de la sorte à un processus auto-entretenu.
Fidèles marqueurs de la thymopoïèse, les TREC sont ainsi diminués en cas de GvHD et
d’infections, probablement à la fois en raison d’altérations thymiques et d’expansions
périphériques amplifiées. Inversement, l’incidence de GvHD après greffe de cellules souches
est significativement réduite chez les patients pédiatriques par rapport aux adultes, qui
présentent une activité thymique moins intense (Eisner and August 1995).
Une insuffisance thymique après HCT pourrait provoquer des altérations des sélections
négative et positive, entraînant de la sorte une synthèse de lymphocytes capables de
reconnaître les antigènes du soi du receveur, favorisant ainsi des réactions de type GvT et/ou
GvHD. A l’inverse, un thymus sain après HCT devrait favoriser la maturation de lymphocytes
dérivés du donneur avec un potentiel diminué anti-receveur minimum.
Cliniquement, les patients atteints de GvHD décèdent fréquemment à la suite d’infections
opportunistes (qui sont plus fréquentes en cas de répertoire TCR altéré, cf FIG 2.12) (Storek,
Gooley et al. 1997). Ils présentent par ailleurs également des manifestations auto-immunes
qui pourraient être associées à des sélections intrathymiques déficientes (Desbarats and Lapp
1993).
Page suivante, deux tableaux résumant les différentes associations établies à ce jour entre les
taux de TREC et différents paramètres immunitaires, cliniques ou relatifs aux conditions de
transplantation. Ainsi, une étude a suggéré que l’analyse du taux de TREC chez le receveur
avant la greffe pouvait prédire la reconstitution immunitaire postgreffe, impliquant que la
vitesse de reconstitution immunitaire après greffe dépendrait de l’activité thymique pré-greffe
chez le receveur (Chen, Barfield et al. 2005). De plus, différents articles ont mis en évidence
une corrélation entre le taux de lymphocytes T CD4+ naïfs et le taux de TREC après la greffe
(Douek, Vescio et al. 2000; Storek, Joseph et al. 2002). D’ailleurs, les principaux facteurs
associés à une fonction thymique déficiente (taux de TREC faibles) sont similaires à ceux
précédemment associés à des taux amoindris de lymphocytes T CD4+ naïfs. Parmi ceux-ci :
un âge avancé du receveur, la survenue d’une GvHD chronique, et une déplétion en
lymphocytes T du greffon (Douek, Vescio et al. 2000).
-Introduction-
43
Facteurs affectant les concentrations
de TREC après HCT
Références
Age du receveur
(Savage, Bleesing et al. 2001; Storek, Joseph et al. 2001;
Lewin, Heller et al. 2002; Storek, Joseph et al. 2002; Fallen,
McGreavey et al. 2003)
Taux de TREC prégreffe du
receveur
(Chen, Barfield et al. 2005)
Composition du greffon (déplétions) (Lewin, Heller et al. 2002; Fallen, McGreavey et al. 2003)
GvHD chronique (Weinberg, Blazar et al. 2001; Douek 2002; Hazenberg,
Otto et al. 2002; Lewin, Heller et al. 2002; Talvensaari,
Clave et al. 2002; Fallen, McGreavey et al. 2003; Poulin,
Sylvestre et al. 2003; Jimenez, Martinez et al. 2006)
TAB 2.2: Facteurs influençant les concentrations sanguines de TREC après HCT.
Facteurs corrélés aux taux de
TREC
Références
Survie globale (TREC prégreffe) (Svaldi, Lanthaler et al. 2003; Clave, Rocha et al. 2005)
Infections bactériennes sévères,
infections à CMV (TREC prégreffe,
corrélation inverse)
(Svaldi, Lanthaler et al. 2003; Clave, Rocha et al. 2005)
Infections opportunistes (TREC
postgreffe, corrélation inverse)
(Hazenberg, Otto et al. 2002; Lewin, Heller et al. 2002;
Jimenez, Martinez et al. 2006)
Lymphocytes T naïfs postgreffe
(TREC postgreffe)
(Douek, Vescio et al. 2000; Weinberg, Blazar et al. 2001;
Douek 2002; Storek, Joseph et al. 2002; Cavazzana-Calvo,
Carlier et al. 2007)
TAB 2.3: Facteurs corrélés aux concentrations sanguines de TREC pré ou post HCT.
La GvHD n’affecte pas exclusivement la voie thymo-dépendante après HCT : la voie extra-
thymique est également touchée (cf sections 2.5.3 et 2.6.2) (Peggs and Mackinnon 2004). La
GvHD s’accompagne en effet d’une augmentation de la susceptibilité lymphocytaire T à
l’AICD (Activation-Induced Cell Death) (Lin, Tseng et al. 2000; Peggs and Mackinnon
2004). Le tableau 2.4 présente les résultats obtenus par Lin et al. en 2000 ; les taux d’apoptose
observés parmi les lymphocytes T périphériques de 51 patients et 12 volontaires sains se sont
révélés supérieurs chez les patients greffés. Les lymphocytes activés (HLA-DR+), les CD4
+ et
-Introduction-
44
les CD8+
semblaient particulièrement touchés, tandis que les CD56+ restaient relativement
résistants. La tendance des CD4+ à l’apoptose était accrue chez les patients atteints de GvHD
aiguë de grade II-IV (33.9 ± 11.3%) par rapport aux stades 0-I (14.6 ± 6.5%, P<0.05). La
fréquence des apoptoses parmi les CD4+
était par ailleurs positivement corrélée à des
concentrations sanguines amoindries de CD4+. Ces observations suggèrent que l’activation
des cellules T in vivo, activation probablement due aux alloantigènes, prédisposerait les
cellules à une apoptose spontanée. Ce phénomène serait associé à la lymphopénie rencontrée
après HCT, et par conséquent à la cinétique de la reconstitution immunitaire post HCT. Les
GvHD aiguës et chroniques retardent également la reconstitution lymphocytaire B. Les
mécanismes précis restent obscurs mais pourraient impliquer des cytokines, des effets « graft
vs stroma » et des traitements anti-GVHD (Peggs 2006).
J19-J23 post HCT J365 post HCT VS
Apoptoses spontanées (%) 30.4 ± 12.5%
P<0.05%
9.7 ± 2.8%
P<0.05%
4 ± 1.5%
TAB 2.4: Augmentation des niveaux d’apoptoses lymphocytaires T spontanées chez 51 receveurs de HCT par rapport à un
groupe de volontaires sains (VS). Les pourcentages d’apoptoses spontanées sont mesurés sur les lymphocytes CD3+sanguins.
2.5 Expansion périphérique : association GvT/ GvHD
2.5.1 Lymphopénie postgreffe
Après HCT, une lymphopénie T s’installe systématiquement, résultant des effets conjugués
1° du régime de conditionnement, qui détruit les lymphocytes T de l’hôte,
2° de la réduction de la thymopoïèse (Roux, Helg et al. 1996; Dulude, Brochu et al. 1997;
Roux, Dumont-Girard et al. 2000), également engendrée par le conditionnement,
3° d’une augmentation des apoptoses périphériques des lymphocytes T matures (Heitger, Neu
et al. 1997; Hochberg, Chillemi et al. 2001; Storek, Joseph et al. 2002).
Ce dernier point est particulièrement problématique chez les patients âgés, dont la fonction
thymique altérée doit être contrebalancée par l’expansion des T matures du donneur pour
assurer une défense immunitaire fonctionnelle. D’une façon générale, la redondance du
répertoire lymphocytaire T assure une immunité compétente en cas de déclin modéré du
nombre de cellules T. En revanche, une déplétion sévère telle que celle observée après HCT
s’accompagne d’une morbidité et d’une mortalité importantes dues aux infections
opportunistes.
-Introduction-
45
2.5.2 Maintien homéostatique du pool lymphocytaire T
La toxicité rencontrée dans le cadre des HCT (conditionnement, GvHD,
immunosuppresseurs), associée à une fonction thymique décroissante avec l’âge, limite
souvent les capacités régénératrices thymiques. C’est pourquoi, les premiers temps après
HCT, l’expansion homéostatique des cellules T matures périphériques (HPE, Homeostatic
Peripheral Expansion) du greffon constitue la source majeure de régénération lymphocytaire
T (Peggs 2006), expliquant de la sorte la prédominance du phénotype mémoire à ce stade.
Le maintien d’une population cellulaire par contrôle homéostatique a été suggéré dans un
modèle murin : des cellules T transplantées dans un hôte lymphopénique prolifèrent
rapidement et intensément, mais seulement parcimonieusement dans un hôte présentant une
population lymphocytaire normale (Peggs 2006). Ainsi, dans le cadre d’une déplétion aiguë
en lymphocytes T, plusieurs mécanismes se mettent en place en périphérie afin de reconstituer
le « pool » lymphocytaire T :
1° une réponse T exacerbée envers un antigène connu,
2° le recrutement de lymphocytes T naïfs présentant un seuil d’activation du TCR abaissé :
une prolifération en réponse à des ligands de faible affinité ou du soi (Ernst, Lee et al. 1999;
Goldrath and Bevan 1999) est dès lors inductible. Ce processus nécessite à la fois
l’engagement de complexes peptides-HLA et la présence d’Il-7 (Schluns, Kieper et al. 2000).
A l’heure actuelle, le degré d’importance du contact antigénique et la nature de (des)
(l’)antigène(s) impliqué(s) restent flous (Kieper, Troy et al. 2005). Les antigènes mineurs
d’histocompatibilité, des antigènes dérivés de la tumeur, et les multiples épitopes des agents
infectieux pourraient être à l’origine de ces expansions clonales.
Les cytokines (Il-7 et Il-15) et les molécules du HLA constituent les signaux de survie
majeurs des lymphocytes T naïfs et mémoires identifiés à ce jour (Jameson 2002; McKinlay,
Radford et al. 2007). L’Il-7 est un facteur de survie critique pour les lymphocytes T naïfs. Les
taux élevés d’Il-7 observés chez des hôtes déficients en cellules T provoquent l’expansion des
cellules T naïves. Ces taux d’Il-7 circulante pourraient expliquer la différence de magnitude
d’expansion dans les hôtes lymphopéniques vs normaux (Fry and Mackall 2001). L’Il-15
influence essentiellement la survie des lymphocytes mémoires CD8+ (Zhang, Sun et al. 1998;
Judge, Zhang et al. 2002).
-Introduction-
46
2.5.3 Conséquences de l’HPE
Contrairement à la thymopoïèse, l’HPE ne restaure souvent pas complètement les taux de
lymphocytes T, et l’expansion sélective des cellules T réactives est à l’origine d’une
diminution de la diversité du répertoire TCR (Verfuerth, Peggs et al. 2000; Klein, Patel et al.
2001). En effet, la polyclonalité périphérique dépend des spécificités de TCR disponibles
avant expansion et des combinaisons peptide-HLA à la source des expansions (Mackall, Bare
et al. 1996; Roux, Helg et al. 1996). De plus, l’efficacité de l’HPE des CD8+ est plus
importante que celle des CD4+ : les patients lymphopéniques récupèrent relativement
rapidement des taux normaux de CD8+, tout en conservant une lymphopénie CD4
+ (Mackall,
Fleisher et al. 1997). Les lymphocytes T matures du greffon assurent ainsi la reconstitution
immunologique précoce (Atkinson 2004), et peut-être l’effet de la greffe contre la tumeur
(GvT) (Weiden, Flournoy et al. 1979; Baron, Maris et al. 2005). Cependant, n’ayant pas subi
leur sélection négative dans le thymus du receveur, ces produits d’expansions périphériques
sont susceptibles de provoquer une GvHD (clones auto-immuns) (Blume 2004; Solomon,
Mielke et al. 2005; Deeg 2007).
Or, la lymphopénie postgreffe est encore aggravée en cas de GvHD. Outre son impact sur la
thymopoïèse (cf supra), la GvHD réduit donc également l’expansion périphérique des cellules
T matures du greffon (Dulude, Roy et al. 1999). Une étude murine récente a démontré que les
altérations du microenvironnement créées lors d’une GvHD (peut-être via déficience en
cytokines ou diminution des contacts avec le HLA) pourraient être responsables de cette
incapacité (Gorski, Chen et al. 2007). En effet, le transfert de lymphocytes T issus de souris
lymphopéniques atteintes de GvHD chez des souris thymectomisées exemptes de GvHD
rétablissait la capacité d’expansion lymphocytaire. De plus, une normalisation du ratio
CD4+/CD8
+ et une reconstitution du répertoire TCR étaient observées dans l’hôte secondaire.
La régénération périphérique des CD4+ serait donc plus affectée en cas de GvHD que celle
des CD8+
(Gorski, Chen et al. 2007). L’altération fonctionnelle constatée dans la GvHD
semblerait ainsi due au milieu et non à une altération intrinsèque des lymphocytes T. L’Il-7,
présente en grandes quantités chez des souris atteintes de GvHD, ne semble cependant pas
impliquée (Gendelman, Hecht et al. 2004). Une déficience en Il-15 non plus, étant donné que
cette cytokine ne semble pas requise pour la survie des CD4+ mémoires. Certaines recherches
récentes se focalisent sur des défauts d’interactions lymphocyte T-HLA (Gorski, Chen et al.
2007).
-Introduction-
47
Les données concernant la reconstitution des lymphocytes TReg Foxp3+ dans un
environnement lymphopénique restent peu nombreuses. Malgré leur plus grande sensibilité à
l’apoptose et le fait qu’elles n’expriment pas le CD127, une expansion homéostatique
préférentielle des TReg CD4+CD25
+ durant la phase lymphopénique de la reconstitution
immunitaire, et une thymopoïèse renouvelée de CD4+CD25
+ ARNmFoxp3
+ ont été observées
après autogreffe (Bosco, Agenes et al. 2006; de Kleer, Vastert et al. 2006). Un modèle murin
a mis en évidence l’intervention des TReg CD25+Foxp3 CD4
+ durant la HPE post-
lymphopénique par induction d’anergie clonale dans la population CD4+ (Vanasek,
Nandiwada et al. 2006). La progression des CD4+ à travers le cycle cellulaire, induite par une
interaction antigénique in vivo, est ainsi supprimée par les TReg selon un mécanisme
moléculaire non élucidé.
Le défaut de protection rencontré à l’égard de certains virus (e.g. CMV) les deux premiers
mois post HCT pourrait, au moins partiellement, être expliqué par une déficience quantitative
des CD8+ spécifiques (Rauser, Einsele et al. 2004). Entre 3 et 6 mois postgreffe, le nombre de
cellules T spécifiques du virus revient à la norme, excepté pour les patients qui développent
l’infection ou n’hébergent pas le virus (e.g. patients séronégatifs pour le CMV). Les patients
allogreffés arborant une antigénémie leucocytaire pp65 peuvent présenter des taux de CD8+
spécifiques au CMV normaux ou supranormaux s’ils ne développent pas l’infection ; dans le
cas contraire, les CD8+ restent fréquemment indétectables (Atkinson 2004). Les lymphocytes
CD8+ du greffon et leurs descendants peuvent persister chez le receveur durant des années,
même en l’absence de leur antigène spécifique ou de CD4+ spécifiques de cet antigène ; ces
conditions de maintien pourraient cependant affecter le nombre ou la fonction des CD8+
jusqu’à un niveau insuffisant pour le contrôle de l’infection.
L’aspect fonctionnel de ces lymphocytes T après HCT a fait l’objet de diverses études (cf
section 2.3.4). In vitro, face à un stimulus polyclonal, la réponse des CD4+ précoces
postgreffe est subnormale; plus tardivement (peut-être en fonction de la survenue d’une
GvHD chronique), cette réponse peut soit revenir à la norme, soit rester subnormale. Des
anomalies fonctionnelles des lymphocytes T présentent également une forte corrélation avec
leur apparition (e.g. défauts de transduction du signal ou production réduite de TNF-α par
des CD8+ activées spécifiques du CMV (Blume 2004)). Des tests d’hypersensibilité retardée
(cf section 2.3.4) ont également mis en évidence le développement d’anergie face à des
antigènes précédemment rencontrés (Atkinson 2004).
-Introduction-
48
2.6 Reconstitution thymique et tolérance au soi
Si les HPE peuvent dans un premier temps restaurer les taux de lymphocytes T circulants, la
reconstitution thymo-dépendante est une source importante de nouvelles spécificités
antigéniques (Peggs 2006).
2.6.1 Physiologie générale du thymus
Le rôle fondamental du thymus dans l’instauration de la tolérance centrale au soi comprend,
d’une part, la délétion des clones T autoréactifs générés au cours de la recombinaison
aléatoire des segments de gènes codant pour les parties variables du TCR (sélection négative)
et, d’autre part, la génération de cellules T régulatrices (TReg) spécifiques d’antigènes du soi
exprimés dans le thymus (cf section 2.2.4). La puissance tolérogène du thymus s’illustre par le
fait que, parmi 100 précurseurs T ayant migré dans le thymus, seulement 2 à 5 cellules T
matures naïves, à la fois compétentes et tolérantes, seront exportées en périphérie. Le
répertoire périphérique possède en outre deux caractéristiques majeures. D’une part, la
reconnaissance d’un antigène du non soi (infectieux ou tumoral) par un lymphocyte T est
restreinte par le complexe majeur d’histocompatibilité (HLA), ce qui signifie que chaque
cellule T ne réagit à un antigène que si et seulement si ce dernier est présenté par une
molécule du HLA du soi (HLA-I pour les cellules T CD8+, HLA-II pour les cellules T CD4
+).
D’autre part, le répertoire T est essentiellement tolérant au soi : dans leur grande majorité, les
cellules T de chaque individu sont incapables de répondre à un antigène du soi présenté par le
HLA de cet individu. La différenciation des lymphocytes T dans le thymus comprend
plusieurs étapes :
1) la migration dans le thymus des précurseurs T originaires du foie fœtal puis de la moelle
osseuse est guidée par l’intervention de cytokines ;
2) les précurseurs T pénètrent dans le thymus au niveau de la jonction cortico-médullaire, puis
gagnent immédiatement la zone corticale externe sous-capsulaire où ils prolifèrent
intensément pour former des lymphoblastes T ;
3) au cours de leur trajet du cortex vers la médullaire et au contact des cellules du parenchyme
thymique (TEC du cortex et de la médullaire, macrophages et DC de la jonction cortico-
médullaire et de la médullaire), les lymphoblastes T expriment des marqueurs membranaires
tels que le CD4 et CD8, et réarrangent au hasard les segments géniques du TCR (cf section
2.3.2). Lorsque les thymocytes doublement positifs CD4+ CD8
+ expriment leur TCR, la
-Introduction-
49
rencontre avec les complexes antigène-HLA des TEC provoque l’apoptose des thymocytes ne
présentant pas d’affinité pour ces complexes. Ce processus constitue la sélection positive des
cellules T, et assure la spécificité des TCR envers le HLA du soi (Abbas A. 2005) ;
4) la recombinaison génétique aléatoire est aussi responsable de la génération de TCR
d’affinité élevée pour certains antigènes du soi présentés par les HLA des CPA thymiques.
Lors de la sélection négative (cf FIG 2.13), les cellules CD4+
et CD8+
exprimant
respectivement un TCR de haute affinité pour les antigènes du soi présentés par le HLA-II ou
le HLA-I sont éliminées par apoptose.
Le résultat net de ces processus de sélection est que le répertoire des lymphocytes T à la sortie
du thymus est restreint au HLA du soi et tolérant à la plupart des antigènes autologues.
FIG 2.13: Sélection négative -extrait de (Abbas A. 2005)-. Les thymocytes dont le TCR présente une forte affinité ou avidité
pour le complexe antigène du soi-HLA des CPA thymiques meurent par apoptose.
2.6.2 Thymopoïèse après HCT
Comme la moelle osseuse, le microenvironnement thymique procure des signaux variés
essentiels à la différenciation des thymocytes dérivés du système hématopoïétique.
Réciproquement, la maturation du microenvironnement thymique requiert la présence de
lymphocytes T en cours de différenciation (Atkinson 2004).
-Introduction-
50
Les cellules épithéliales thymiques (TEC)
Les cellules épithéliales thymiques sont endommagées par les régimes de conditionnement
prégreffe. Des études murines ont en effet montré un déclin du nombre de TEC après
irradiation (Chung, Barbara-Burnham et al. 2001): une diminution dose-dépendante des TEC
est observée 5 jours plus tard, suivie d’une repopulation et d’une normalisation des taux après
1 mois environ. Ce déclin est en outre accompagné d’une chute des taux intrathymiques de
transcrits d’Il-7 (originaire des TEC et responsable de la prolifération, de la survie et de la
différenciation des thymocytes double négatifs). Parallèlement, la progression de maturation
des thymocytes est également inhibée d’une manière dose-dépendante. Ces résultats indiquent
que l’endommagement des TEC pourrait constituer l’un des mécanismes d’inhibition de la
thymopoïèse après HCT et entraîner des conséquences sévères sur la maturation T, la
sélection du répertoire et l’exportation des lymphocytes T. Certaines études suggèrent
également que l’administration de KGF (Keratinocyte Growth Factor) avant ou pendant le
régime de conditionnement permettrait de protéger les TEC et améliorerait la reconstitution
immunitaire après greffe (Min, Taylor et al. 2002; Rossi, Blazar et al. 2002; Wils and
Cornelissen 2005).
A côté des détériorations liées au conditionnement, la survenue d’une GvHD peut aussi
endommager l’architecture intrathymique, probablement par altération directe des TEC
(Rossi, Blazar et al. 2002; Hauri-Hohl, Keller et al. 2007). Il y a 20 ans, Lapp et Seemayer
étaient déjà parvenus à mettre en évidence des infiltrats lymphocytaires T alloréactifs dans le
thymus de souris atteintes de GvHD. Par la suite, la GvHD aiguë a été associée à une
production intrathymique de facteurs proinflammatoires (granzyme B, protéines MIP) et à une
destruction de la distinction entre zones corticale et médullaire. De plus, les TEC expriment
des taux anormalement élevés de molécules de costimulation (CD80) en cas de GvHD, ce qui
pourrait favoriser leur destruction.
Les thymocytes
Les souris tgε26 sont immunodéficientes suite à l’expression du transgène CD3ε. Ces souris
présentent une maturation intrathymique défective des prothymocytes au-delà du stade I
CD44+ CD25
+. Dans de telles souris, la distinction cortico-médullaire ne se développe jamais.
Cependant, l’introduction d’un transgène de la cycline D1, sous le contrôle d’un promoteur
spécifique des cellules épithéliales, rétablit la fonction des tgε26 (Klug, Crouch et al. 2000),
ce qui suggère que le défaut des tgε26 serait situé dans l’incapacité des TEC ou de leurs
-Introduction-
51
précurseurs à proliférer en l’absence de signaux issus des thymocytes normaux. Ces données
indiquent que les progéniteurs lymphoïdes devraient réguler le développement et le
microenvironnement spécialisé du thymus. Or, les régimes de conditionnement prégreffe
détruisent en général la plupart des thymocytes. De plus, les régimes immunosuppresseurs
postgreffe pourraient également être impliqués dans l’altération thymique : la cyclosporine
par exemple accélère l’involution thymique chez le rat. Le manque de thymocytes observé
immédiatement après HCT à la suite du régime de conditionnement ou de l’administration
d’immunosuppresseurs pourrait ainsi être partiellement responsable des dommages du
microenvironnement thymique. Par ailleurs, les dommages causés lors de la GvHD aiguë
interfèrent avec la progression des thymocytes dans le cycle cellulaire (Krenger, Rossi et al.
2000).
2.6.3 Conséquences de la thymopoïèse après HCT
Les lymphocytes issus de la différenciation des cellules souches chez l’hôte assurent la
reconstitution immunologique à long terme, sans GvHD et associés à un répertoire TCR
diversifié puisqu’issus de la maturation intrathymique. La qualité de la reconstitution thymo-
dépendanteprésente un impact clinique important car une certaine immunodéficience peut
persister malgré un nombre de lymphocytes T normaux après HCT si un répertoire important
de TCR n’est pas généré. Ainsi, des niveaux de TREC bas en postgreffe ont été associés à une
augmentation du risque d’infections opportunistes (Lewin, Heller et al. 2002). Cependant, un
éventuel lien causal TREC bas/infections opportunistes reste hypothétique à l’heure actuelle
en raison du biais induit par la GvHD, elle-même associée à une diminution des taux de
TREC et à une augmentation des infections.
Des études à très long terme (20 à 30 ans après HCT) ont mis en évidence une immunité
normale chez les patients greffés : les taux des monocytes, des NK, des cellules B, des
cellules T CD4+ et CD8
+ des patients ne différaient pas de ceux de leurs donneurs respectifs.
Cependant, une persistance de taux restreints de lymphocytes T CD4+ TREC
+ était visible
chez des patients adultes plus de 5 ans après HCT (Storek, Joseph et al. 2001), suggérant ainsi
que l’insuffisance thymique rencontrée après greffe pourrait ne pas être complètement
réversible. Cet effet n’est pas visible au sein de la population CD8+
TREC+, ce qui reste à
l’heure actuelle inexpliqué ; chez la souris, une lymphopoïèse extra-thymique CD8+ (mais non
CD4+) a été bien documentée (Hayashi, Toki et al. 1997; Mackall and Gress 1997). Dès lors,
une hypothèse pourrait être que ces sites, supposés chez l’homme, ne seraient peut-être pas
-Introduction-
52
altérés par la greffe, ou pourraient récupérer pleinement leurs capacités 20 ans après greffe,
contrairement au thymus.
2.7 TReg : vers un effet GvT sans GvHD ?
2.7.1 La suppression des TReg chez la souris provoque un syndrome auto-
immun
Chez la souris, l’élimination des TReg entraîne une prolifération des lymphocytes classiques
non régulateurs et la destruction auto-immune de nombreux tissus. Les premiers modèles
(Sakaguchi, Sakaguchi et al. 1995) ont utilisé des greffons déplétés en cellules CD4+ CD25
+.
L’inoculation de ces cellules à des souris athymiques (nude) provoquait des symptômes auto-
immuns tels que thyroïdite, gastrite, insulite, glomérulonéphrite, polyarthrite. Certaines souris
développaient également une GvHD. Cette évolution néfaste pouvait être contrecarrée par un
transfert de CD4+CD25
+ purifiées.
La mutation Scurfy provoque chez la souris une perte de fonction du gène Foxp3, essentiel au
développement et à la maintenance des TReg CD4+ naturelles (Ochs, Ziegler et al. 2005). Les
souris Scurfy développent une intense prolifération lymphocytaire T CD4+, caractérisée par
une infiltration ganglionnaire, splénique, hépatique et cutanée (Godfrey, Wilkinson et al.
1991). Les lymphocytes T CD4+ de ces souris sont hypersensibles à la stimulation de leur
TCR et sécrètent des taux très élevés de cytokines (parmi lesquelles l’Il-2, -4, -5, -10, -13,
IFN-γ, GM-CSF, TNF-α) (Kanangat, Blair et al. 1996; Wildin, Smyk-Pearson et al.
2002). Les souris scurfy meurent précocement vers l’âge de 4 semaines des suites de leur
syndrome auto-immun.
Chez l’homme, le déficit en TReg par mutation du gène Foxp3 provoque une pathologie
également létale appelée IPEX (Immune dysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy, and
X-linked inheritance). Cette mutation entraîne l’activation inappropriée de cellules
immunitaires dans de nombreux organes dont le tractus intestinal. Elle se traduit par une
entéropathie auto-immune, un diabète de type 1, une thyroïdite auto-immune, une anémie
hémolytique auto-immune et diverses lésions cutanées, de l’eczéma, une dermatite
ichtyosiforme, ou psoriasique, voire une calvitie totale et cause généralement la mort des
enfants atteints dans les 3 premières années (Sherman 2006). Les dysfonctionnements de
nombre ou de fonction des TReg ont également été impliqués dans certaines maladies auto-
immunes telles que le diabète de type 1 ou le WAS (Wiskott-Aldrich Syndrome) (Kukreja,
-Introduction-
53
Cost et al. 2002; Humblet-Baron, Sather et al. 2007). C’est pourquoi les TReg constituent des
cibles de choix dans la recherche de traitements dirigés contre ces différentes pathologies.
Le rôle des TReg ne s’arrête cependant pas là : ils pourraient également jouer un rôle crucial en
transplantation et en cancérologie, et particulièrement au cours des allogreffes de cellules
souches hématopoïétiques dans les hémopathies malignes.
2.7.2 Implication des TReg dans la discrimination GvT-GvHD chez l’homme
Chez la souris, le rôle clé joué par les lymphocytes T régulateurs (donnés à très fortes doses)
dans la prévention de la GvHD aiguë a été mis en évidence dans un modèle de greffes non
HLA-identiques (Edinger, Hoffmann et al. 2003). Cet effet anti-GvHD n’était en outre pas
accompagné de suppression de l’effet GvT. Chez l’homme, les résultats concernant la relation
TReg/GvHD sont restés très contradictoires (cf quelques exemples tableau 2.5), en raison de la
difficulté d’identification formelle des TReg.
L’avènement de Foxp3 permet à l’heure actuelle d’étudier plus précisément le rôle des TReg
après transplantation. Certaines études préliminaires associant l’expression de Foxp3 et des
marqueurs membranaires CD4 et CD25 indiquent un risque de GvHD inversement
proportionnel au nombre de TReg présents chez le receveur (Miura, Thoburn et al. 2004; Zorn,
Kim et al. 2005; Rezvani, Mielke et al. 2006). Plus précisément, des taux sanguins ou
tissulaires élevés de lymphocytes Foxp3+ ont été associés à une diminution de la GvHD aiguë
(Miura, Thoburn et al. 2004; Rezvani, Mielke et al. 2006; Rieger, Loddenkemper et al. 2006).
De plus, la fréquence des CD4+Foxp3
+ dans les lymphocytes T du donneur peut prédire
l’incidence de GvHD chez le receveur après une HCT HLA-identique (Rezvani, Mielke et al.
2006). Enfin, une diminution de moitié des taux de lymphocytes CD4+CD25
+Foxp3
+ a été
mise en évidence chez des patients atteints de cGvHD (Zorn, Kim et al. 2005). Les capacités
suppressives de ces TReg restaient cependant identiques à celles de patients greffés mais
exempts de GvHD. La raison de cette réduction de fréquence pourrait provenir d’une activité
thymique altérée par la greffe. La figure 2.14 corrobore les informations ci-dessus en
représentant les taux de transcrits relatifs de Foxp3 chez des patients atteints de GvHD aiguë
et chronique. Cependant, d’autres études ne sont pas parvenues à confirmer cette association
(Meignin, Peffault de Latour et al. 2005).
De plus, une étude réalisée chez des patients ayant reçu une allogreffe comme traitement
d’une leucémie myéloïde chronique a démontré une corrélation significative entre le nombre
de TReg et le risque de rechute (Nadal, Garin et al. 2007). Les TReg, plus nombreux chez les
-Introduction-
54
greffés que chez les volontaires sains ou les patients nouvellement diagnostiqués, présentaient
également une activité immunosuppressive supérieure in vitro.
Référence Population Marqueurs de
TReg
Conclusions
Clark et al.
(2004)
Allo-HCT (étude rétrospective)
cGvHD N=17
pas de cGvHD N=23
NA de CD4+CD25high
Activité
fonctionnelle
Elévation des CD4+CD25high chez les
patients atteints de cGvHD
Activité suppressive normale des TReg chez
les patients atteints de cGvHD
Miura et al.
(2004)
Allo-HCT (étude rétrospective)
GvHD N=28; pas de GvHD N=8
cGvHD N=4; pas de cGvHD
N=2;
Auto-HCT (étude rétrospective)
Auto-GvHD N=16; pas de
GvHD N=23
Expression de
FOXP3 dans les
PBMC
Diminution de FOXP3 dans les PBMC
corrélée à la sévérité des GvHD aiguë et
chronique
Les patients sans cGvHD récupèrent une
expression de Foxp3 normale après HCT
Sanchez et al.
(2004)
Allo-HCT (étude rétrospective)
cGvHD avant traitement N=8;
cGvHD traitée N=27; pas de
cGvHD N=29
NA de CD4+CD25high
%CD4+CD134+/CD4
+CD25high
Elévation des CD4+CD25high chez les
patients atteints de cGvHD
%CD4+CD134+/CD4+CD25high augmenté
chez les patients atteints de cGvHD
Meignin et al.
(2005)
Allo-HCT (étude prospective)
cGvHD N=20
pas de cGvHD N=11
NA de CD4+CD25high
Ratio CD25high/CD4+
Expression de
FOXP3 dans les
CD4+CD25high
purifiées
Lymphopénie des CD4+ postgreffe
Taux comparables de CD4+CD25high chez
les patients présentant ou non une cGvHD
Expression similaire de FOXP3 dans la
population CD4+CD25high chez les patients
avec ou sans cGvHD
Zorn et al.
(2005)
Allo-HCT (étude rétrospective)
cGvHD N=30
pas de cGvHD N=27
volontaires sains N=26
%CD4+CD25+ totales
dans les PBL
Expression de
FOXP3 dans les PBL
Activité
fonctionnelle
Diminution du %CD4+CD25total/PBL chez
les patients atteints de cGvHD
Diminution des taux de FOXP3 dans les
PBL de patients atteints de cGvHD
Les TReg des patients atteints de cGvHD
exercent une suppression normale
TAB 2.5: Différentes études précurseurs ont abouti à des résultats hétéroclites concernant l’implication potentielle des TReg
dans la GvHD, faute de marqueur spécifique ; adapté de (Zorn 2006). PBL=Peripheral Blood Lymphocytes ; NA=nombre
absolu ; auto-GvHD : GvHD autologue (l’administration de CSA à la suite d’une autogreffe peut paradoxalement entraîner
un syndrome systémique auto-immun dont les manifestations sont comparables à ceux d’une GvHD allogénique. Ce
syndrome d’auto-agression est appelé GvHD autologue et présente une activité anti-tumorale significative qui semble médiée
par les cellules T autoréactives (Hess, Horwitz et al. 1985; Hess, Bright et al. 1997)).
-Introduction-
55
FIG 2.14 : Les niveaux d’expression de Foxp3 sont corrélés avec le grade de la GvHD aiguë et le stade de la GvHD
chronique -extrait de (Hess 2006)-.
Par ailleurs, afin de se rapprocher au mieux des conditions cliniques de greffe, les altérations
potentielles de l’efficacité des TReg par les traitements immunosuppresseurs in vivo ont
également été étudiées. Dans un modèle murin, des greffes concomitantes de T classiques et
de T régulatrices ont été associées à l’inoculation intrapéritonéale d’un immunosuppresseur
(cyclosporine A, rapamycine ou mycophélonate mofetil) (Zeiser, Nguyen et al. 2006).
L’activité régulatrice, mesurée par bioluminescence, était inversement proportionnelle à la
prolifération des lymphocytes T classiques marqués chez la souris. Des 3 molécules testées,
seule la cyclosporine A inhibait significativement les TReg in vivo, avec pour conséquence une
prolifération importante des T classiques, une augmentation de la sévérité des GvHD et, in
fine, une diminution de la survie. Une autre étude a également mis en évidence in vitro
l’expansion, sans altération de fonction, des TReg murines (CD4+CD25
+Foxp3
+) lors d’une
exposition à la rapamycine (Battaglia, Stabilini et al. 2005). En conclusion, un traitement
combinatoire rapamycine/mycophénolate mofétil pourrait préserver la fonctionnalité des TReg
dans la GvHD, et ne semble par ailleurs pas altérer l’effet GVT médié par les cellules T
classiques.
Les premiers résultats obtenus chez l’homme ont conduit une équipe clinique (Edinger,
Regensburg) à entreprendre une étude prospective afin de vérifier l’absence de toxicité des
infusions de TReg après HCT (Braaten 2007). Les patients choisis sont particulièrement à
risque de développer une GvHD. Chaque donneur fournit à la fois le greffon et les TReg. Les
infusions de TReg ne sont toutefois pas pures afin de faciliter la prise du greffon; cette
méthodologie pourrait toutefois enclencher une réponse immunitaire plutôt que de la
supprimer, car les cellules T classiques tendent à s’activer lorsqu’elles rencontrent des
antigènes étrangers. Les résultats de ces travaux, non publiés à l’heure actuelle, devraient
moduler et affiner les recherches sur les TReg dans différents champs d’études.
-Introduction-
56
Parallèlement, certains débats restent ouverts, concernant par exemple l’étendue d’expression
de Foxp3 (Morgan, van Bilsen et al. 2005; Roncador, Brown et al. 2005), sa combinaison
phénotypique potentielle avec le CD127, ou même la pertinence de la quantification
périphérique des TReg. Ainsi, de récentes études indiquent que l’absence d’expression du
CD127 (récepteur de l’interleukine 7) définirait plus précisément les TReg (Liu, Putnam et al.
2006; Seddiki, Santner-Nanan et al. 2006). Aucune étude concernant les greffes de cellules
souches, et plus particulièrement la GvHD, n’a été publiée à l’heure actuelle à l’aide du
CD127. D’autre part, des études murines ont démontré que la majorité des TReg étaient
localisées, non dans le sang, mais dans les tissus périphériques ou les ganglions. Etant donné
que la présence des TReg dans le sang périphérique ne reflète pas nécessairement leur présence
au sein des organes cibles de la GvHD, les conclusions extrapolables à partir des découvertes
mentionnées ci-dessus restent limitées. C’est pourquoi le nombre de TReg et de CD8+ infiltrés
dans la muqueuse intestinale, ainsi que leur ratio, ont été récemment étudié par
immunohistochimie après HCT (Rieger, Loddenkemper et al. 2006). Le rapport Foxp3+/CD8
+
était augmenté chez les patients greffés sans signe histologique de GvHD aiguë ou chronique
par rapport à des volontaires sains. Le potentiel d’expansion des TReg semble donc maintenu
après HCT. En cas d’infection virale (colite ou diverticulite à CMV), les Foxp3+ et les CD8
+
augmentaient concomitamment. En cas de GvHD, aiguë ou chronique, le ratio restait
semblable à celui observé chez les contrôles sains, indiquant par là une absence de
surexpression des TReg.
2.8 Impact des immunosuppresseurs
Les immunosuppresseurs administrés en postgreffe ont pour but de détruire ou d’inhiber la
fonction des lymphocytes T responsables :
1) du rejet : l’administration postgreffe de méthotrexate, de mycophénolate mofétil ou des
analogues des purines, par exemple, diminue le risque de rejet en interférant avec les cellules
résiduelles du receveur rescapées du conditionnement prégreffe.
2) de la GvHD: les GvHD aiguë et chronique sont traitées de manière prophylactique par une
immunosuppression intense.
L’apparition ou non d’une GvHD est influencée par le choix du (des) immunosuppresseur(s)
postgreffe et par le régime de conditionnement prégreffe.
Nous envisagerons dans ce chapitre les immunosuppresseurs les plus courants et les
conséquences de leur administration post HCT.
-Introduction-
57
Molécule Mécanisme d’action
Méthotrexate (MTX) Empêche la prolifération lymphocytaire T par inhibition de la dihydrofolate
réductase indispensable à la synthèse des purines
Cyclosporine (CSA)
Tacrolimus (FK-506)
Inhibe la production de cytokines par le lymphocyte T en empêchant l’activation
du facteur de transcription NFAT
Azathioprine Inhibe la prolifération des précurseurs lymphocytaires
Mycophénolate Mofétil
(MMF)
Inhibe la prolifération lymphocytaire par inhibition de la synthèse de guanine
Rapamycine Inhibe la prolifération lymphocytaire par inhibition de la signalisation par l’Il-2
(mTOR inhibitor)
Corticostéroïdes Diminuent l’inflammation par inhibition de la sécrétion de cytokines par les
macrophages
Anticorps monoclonal
anti-CD3
Elimine les lymphocytes T par liaison au CD3 et augmente la phagocytose ou la
lyse médiée par le complément
Anticorps anti-récepteur à
l’Il-2
Inhibe la prolifération lymphocytaire T par inhibition de la liaison de l’Il-2 sur son
récepteur
CTLA4-Ig Inhibe l’activation T en bloquant le costimulateur B7 sur les CPA et empêchant de
la sorte sa liaison avec le récepteur lymphocytaire CD28 (expérimental)
Anti-CD40 ligand Inhibe l’activation macrophagique et endothéliale en bloquant le CD40-L
lymphocytaire et empêchant de la sorte sa liaison au CD40 macrophagique
(expérimental)
TAB 2.6: Les immunossuppresseurs sont utilisés en postgreffe afin de contrer les effets néfastes de la GvHD et/ou du rejet.
NFAT= Nuclear Factor of Activated T-cells; CTLA4-Ig= Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4-Ig.
2.8.1 Modèle canin préclinique
Le chien est utilisé comme modèle animal dans les greffes allogéniques en raison de son
importante diversité génétique. Grâce à lui, en 1968, le groupe de Seattle a démontré le rôle
crucial de la compatibilité HLA entre le donneur et le receveur (Epstein, Storb et al. 1968;
Storb, Rudolph et al. 1971). Ce modèle a également permis de tester l’efficacité des différents
immunosuppresseurs.
L’action immunosuppressive de différentes molécules dans la prévention de la GvHD a été
estimée dans un modèle d’allogreffe de moelle de chien DLA (Dog Leucocyte Antigen)-
compatible ou DLA-incompatible non apparenté. Dans un premier temps, les chiens subissent
une irradiation létale (9.2 Gy), puis sont greffés au moyen d’un mélange de cellules
médullaires et de sang périphérique concentré. Cette combinaison, grâce à sa richesse en
-Introduction-
58
lymphocytes T, assure la prise du greffon et le développement quasi systématique d’une
GvHD hyper aiguë et fatale (Storb and Deeg 1986). L’efficacité de différents
immunosuppresseurs (MTX, CSA, FK-506, azathioprine, déoxyspergualine, 6-
mercaptopurine, succinylacétone) ou de leurs combinaisons (MTX+CSA, MTX+FK506) se
reflète dans le délai d’apparition de la GvHD et la prolongation de la survie (Deeg, Storb et al.
1982; Storb, Raff et al. 1993).
Le premier agent testé fut le MTX en 1967 (Storb, Epstein et al. 1967). Le MTX est un
inhibiteur de la dihydrofolate réductase indispensable à la synthèse des purines.
L’administration de MTX à des chiens irradiés et greffés avec des cellules périphériques de
chien allogénique retardait la survenue de la GvHD, et par là même, prolongeait la survie des
animaux.
En 1982 l’administration combinée de MTX et de CSA (Deeg, Storb et al. 1982) a permis le
maintien de survivants à long terme, ce qui n’avait pas été observé jusque là chez les
receveurs de MTX ou de CSA en monothérapie. La CSA bloque la croissance Il-2 dépendante
ainsi que la différenciation des lymphocytes T.
Un autre immunosuppresseur d’origine fongique présente un mode d’action apparenté à celui
de la ciclosporine : le tacrolimus (FK-506) (Kim and Perfect 1989; Spencer, Goa et al.
1997). En 1993, des greffes DLA non identiques ont été réalisées afin d’évaluer l’efficacité du
FK-506, seul ou en association avec le MTX. Les chiens receveurs de FK-506 survécurent
plus longtemps que les contrôles sans immunosuppression, mais pas significativement plus
que ceux ayant reçu uniquement du MTX ou de la CSA (Storb, Raff et al. 1993). Par contre,
la moitié des chiens (5/10) ayant reçu la combinaison MTX+ FK-506 devinrent des survivants
à long terme, devançant de la sorte les résultats des monothérapies et rejoignant ceux obtenus
avec la combinaison MTX+CSA.
En 1998, le MMF, un autre anti-métabolite inhibiteur de la synthèse des purines, a été testé
sur des chiens DLA non compatibles, seul ou associé à la CSA (Yu, Seidel et al. 1998). La
figure 2.15 regroupe les données d’Yu avec d’autres issues d’études historiques. Les chiens
n’ayant reçu que du MMF ou une association MMF+CSA survivent significativement plus
longtemps que sans immunosuppresseurs (P=0.04 et P<0.001, respectivement) (Wagner and
Storb 1996). On note également une suggestion de prolongation de la survie avec
l’association MMF+CSA par rapport à MTX+CSA (P=0.078). En conclusion, le MMF est
efficace pour retarder, voire empêcher, l’apparition de GvHD et prolonger la survie de chiens
ayant subi une greffe non apparentée présentant des disparités de DLA. Administré en
combinaison avec la CSA, il permet une survie à long terme d’un peu plus de 50% des chiens.
-Introduction-
59
FIG 2.15: Survie de beagles ayant subi une greffe DLA-non identique après irradiation à 9.2Gy. Le régime
immunosuppresseur pouvait être absent ou consister en MMF, CSA, MTX+CSA ou MMF+CSA –extrait de (Yu, Seidel et al.
1998)-.
2.8.2 Impact des immunosuppresseurs sur le système immunitaire après HCT
Les altérations du système immunitaire imputables à la GvHD d’une part, et aux traitements
immunosuppresseurs d’autre part, sont difficiles à discriminer. La CSA et les corticostéroïdes
ont été les immunosuppresseurs les plus étudiés. Si l’impact délétère de ces derniers sur le
thymus a été largement démontré, les effets potentiellement néfastes des autres
immunosuppresseurs sur le système immunitaire après HCT restent vagues à l’heure actuelle.
Bien que les corticostéroïdes soient les premiers immunosuppresseurs utilisés lors des
greffes, ils constituent les agents les moins sélectifs et affectent ainsi de nombreuses lignées
leucocytaires, comprenant les lymphocytes B et T, mais aussi les macrophages, les
polynucléaires et les monocytes (Duncan and Wilkes 2005). Chez le rat, la CSA accélère
l’involution thymique (Beschorner and Armas 1991). La CSA inhibe la différenciation des
thymocytes doubles-positifs en thymocytes CD3+ simples positifs (Jenkins, Schwartz et al.
1988). L’administration de CSA chez le rat non transplanté réduit le nombre de thymocytes
corticaux immatures, déplète les thymocytes CD4+CD8
- et CD4
-CD8
+ de la médullaire et
provoque la libération d’une vague de RTE (Jenkins, Schwartz et al. 1988; Zadeh and
Goldschneider 1993). Les effets combinés des dommages thymiques occasionnés par la
GvHD et la CSA peuvent entraver les processus des sélections positive et négative (Blume
2004). Des défauts lors de la sélection positive résultent en une réduction de la fréquence des
lymphocytes T matures spécifiques d’antigènes exogènes. Des défauts dans la sélection
-Introduction-
60
négative contribuent à une augmentation de la fréquence de lymphocytes T autoréactifs
impliqués dans la pathogenèse de la cGvHD. Par ailleurs, étant donné que le principal site
d’action de la CSA se situe au niveau des lymphocytes T, quasiment aucun retentissement sur
les lymphocytes B, les macrophages, les neutrophiles ou les cellules NK n’a pu être observé
(Kim and Perfect 1989; Spencer, Goa et al. 1997).
-
OBJECTIFS
-
-Objectifs-
61
L’objectif de ce travail est d’explorer la reconstitution du système immunitaire dans le
cadre des greffes non myéloablatives de cellules souches hématopoïétiques.
1. Les greffes allogéniques consécutives à un conditionnement non myéloablatif
(minigreffes) ou d’intensité réduite (RIC) sont utilisées de plus en plus fréquemment chez
des patients trop âgés (jusque 75 ans) pour tolérer une greffe myéloablative (Sorror, Maris
et al. 2004).
D’autre part, après greffe myéloablative, la régénération lymphocytaire T par voie thymo-
dépendante est considérée comme minimale durant les 6 premiers mois. Les lymphocytes
T périphériques rencontrés au cours de cette période proviendraient essentiellement de
l’expansion des T matures présentes dans le greffon (Storek, Dawson et al. 2003). Ensuite,
la thymopoïèse semble reprendre et jouer un rôle important, au moins chez les patients les
plus jeunes, comme démontré dans diverses études par la quantification des sjTREC
(Douek, Vescio et al. 2000; Hochberg, Chillemi et al. 2001; Weinberg, Blazar et al. 2001;
Lewin, Heller et al. 2002; Jimenez, Martinez et al. 2006). La question d’une éventuelle
reprise de la thymopoïèse après greffe non myéloablative se pose dès lors. Est-elle
envisageable chez ces patients âgés, ou la récupération immunitaire proviendrait-elle
exclusivement de l’expansion périphérique des lymphocytes T du greffon?
Dans la première partie de ce travail, nous avons évalué la reconstitution immunitaire de
50 patients après HCT allogénique non myéloablative. Parmi ces patients, 28 ont reçu un
greffon non manipulé et 22, un greffon ayant subi une déplétion lymphocytaire CD8+ en
tant que prophylaxie de la GvHD. La reconstitution des différentes populations
lymphocytaires a été suivie par analyse phénotypique tout au long de la première année
postgreffe. La polyclonalité des lymphocytes T périphériques a également été évaluée à 4
reprises entre le jour 40 et 1 an après greffe. Les taux de sjTREC ont été comparés dans
les 2 groupes 100 jours et 1 an après greffe afin de mettre en évidence les processus
impliqués dans la récupération lymphocytaire T entre ces deux dates.
2. Dans la seconde partie, nous nous sommes intéressés à la reconstitution immunitaire
à long terme après greffe non myéloablative. Les phénotypes lymphocytaires et la
thymopoïèse ont été évalués entre 1 et 6.5 ans après HCT. L’approche est similaire à celle
adoptée dans la première partie : d’une part, suivi de la thymopoïèse, et d’autre part,
identification des facteurs susceptibles de l’influencer.
-Objectifs-
62
3. Dans la troisième partie, nous avons étudié l’implication des TReg dans l’évolution
clinique des patients greffés puisqu’ils pourraient présenter un effet répresseur dans la
GvHD. D’une part, nous avons tenté d’établir les facteurs potentiellement prédictifs d’un
nombre élevé de TReg et d’autre part, l’incidence de la GvHD chronique en fonction des
taux de TReg (CD4+Foxp3
+) au J100. Le triple marquage CD4
+ CD25
+ CD127
low/- a été
employé pour purifier les TReg par FACS afin d’analyser leur chimérisme. Enfin, la
question d’une éventuelle corrélation entre les taux de TREC et de TReg a été posée afin de
déterminer l’origine, thymique ou périphérique, des TReg du donneur au J100.
MATERIEL ET
METHODES
-Matériel et Méthodes-
63
1. PATIENTS ET DONNEURS
Les informations relatives aux patients, aux donneurs et à la gestion clinique (régimes de
conditionnement et de prophylaxie, catégorie de greffon) seront détaillées dans les sections
résultats propres à chaque étude.
2. ANALYSE DU CHIMERISME
Le chimérisme des lymphocytes T a été évalué par le Dr Herens et Jean-François
Vanbellinghen (service de Génétique Humaine) aux jours 28, 60, 100, 180 et 365 après HCT :
1) par FISH (détection des chromosomes X et Y pour les couples donneur/receveur de sexe
opposé) ;
2) par PCR multiplex sur des régions microsatellites polymorphiques (pour les couples
donneur/receveur de même sexe).
La sélection des lymphocytes T CD3+ a été réalisée au moyen du kit d’enrichissement
RosetteSep (StemCell Technologies, Grenoble, France). Le rejet du greffon a été défini
comme la présence de <5% de lymphocytes T du donneur après HCT, comme précédemment
décrit (McSweeney, Niederwieser et al. 2001; Baron, Maris et al. 2005; Hakim, Memon et al.
2005; Baron and Sandmaier 2006).
3. ANALYSE CYTOMETRIQUE DE LA RECONSTITUTION
LYMPHOCYTAIRE
Les analyses phénotypiques des différentes sous-populations lymphocytaires après HCT ont
été accomplies par le laboratoire d’Hématologie et d’Immunohématologie, sous la direction
du Dr Schaaf et du Prof. Gothot. Les globules blancs périphériques ont été analysés aux jours
28, 42, 60, 80, 100, 120, 180 et 365 au moyen d’un quadruple marquage membranaire. Les
populations suivantes ont été analysées : lymphocytes T CD3+, lymphocytes CD4,
lymphocytes CD8, lymphocytes CD4 naïfs CD4+CD45RA
high, lymphocytes CD4 mémoires
CD4+CD45RO
+, lymphocytes NK CD56
+ et lymphocytes B CD19
+. Le pourcentage de
-Matériel et Méthodes-
64
cellules positives a été défini par dot plot sur population nucléée totale. Le pourcentage de
cellules positives du contrôle isotypique a été soustrait du pourcentage de cellules
positivement marquées. Les nombres absolus des sous-populations lymphocytaires ont ensuite
été calculés en multipliant les pourcentages observés par le nombre absolu de cellules
nucléées. L’acquisition des données a été réalisée avec le logiciel Cellquest (Becton-
Dickinson).
4. SPECTRATYPING (IMMUNOSCOPE)
Cette méthode se base sur la diversité associée aux réarrangements V-D-J (cf sections 2.3.2 et
2.3.3 de l’introduction) et à l’action de la désoxynucléotidyl transférase terminale.
FIG 1 : Immunoscope: principes, étapes, interprétation des spectres.
L’analyse du polymorphisme de la région CDR3 de Vβ a été réalisée aux jours 40, 100, 180
(sur populations CD4+ et CD8
+ isolées), et 365 à partir d’ARN extrait des PBMC (Tripure,
Roche). Après transcription inverse de 2 µg d’ARN (1st Strand cDNA Synthesis Kit for RT-
PCR, Roche), chaque cDNA a subi une amplification par PCR multiplex au moyen de 24
-Matériel et Méthodes-
65
amorces spécifiques de sous-familles de Vβ (Vβ1-Vβ24) et d’une amorce constante Cβ
conjuguée à la sonde fluorescente 6-FAM (Genevee, Diu et al. 1992) (Applied Biosystems,
Lennik, Belgium). Les conditions de PCR et séquences des amorces sont rassemblées dans les
tableaux 1 et 2. Les cycles d’amplification ont été menés comme suit (les étapes 2 à 4 ont été
répétées 30 fois): 1) 10 min -95°C ; 2) 30 sec -95°C ; 3) 30 sec -60°C ; 4) 2 min -72°C ; 5) 10
min -72°C.
Une électrophorèse sur séquenceur d’ADN automatique (Genetic Analyser ABI3100,
Applied Biosystems, Foster City, CA) a ensuite permis de visualiser la fréquence ainsi que la
distribution des tailles des amplicons fluorescents. Les données ont été analysées au moyen du
GeneScan-500 software (Perkin Elmer Cetus Instruments, Emeryville, CA). La complexité de
chaque sous-famille Vβ a été évaluée par le nombre de pics espacés d’intervalles de 3
nucléotides dans chaque sous-famille. La somme des pics de toutes les sous-familles constitue
le score Vβ, dont nous avons défini les valeurs limites hautes et basses respectivement par les
percentiles 3 et 97 obtenus lors de l’analyse de 6 volontaires sains.
Vββββ Séquence Vββββ Séquence
Vβ1 CCG CAC AAC AGT TCC CTG ACT TGC Vβ13 CAC TGC GGT GTA CCC AGG ATA TGA
Vβ2 GGC CAC ATA CGA GCA AGG CGT CGA Vβ14 GGG CTC GGC TTA AGG CAG ACC TAC
Vβ3 CGC TTC TCC CGG ATT CTG GAG TCC Vβ15 CAG GCA CAG GCT AAA TTC TCC CTG
Vβ4 TTC CCA TCA GCC GCC CAA ACC TAA Vβ16 GCC TGC AGA ACT GGA GGA TTC TGG
Vβ5 AGC TCT GAG CTG AAT GTG AAC GCC Vβ17 CTG CTG AAT TTC CCA AAG AGG GCC
Vβ6 TCT CAG GTG TGA TCC AAA TTC GGG Vβ18 TGC CCC AGA ATC TCT CAG CCT CCA
Vβ7 CCT GAA TGC CCC AAC AGC TCT CTC Vβ19 TCC TCT CAC TGT GAC ATC GGC CCA
Vβ8 CCA TGA TGC GGG GAC TGG AGT TGC Vβ20 CAG CTC TGA GGT GCC CCA GA
Vβ9 TTC CCT GGA GCT TGG TGA CTC TGC Vβ21 TCC AAC CTG CAA GGC TTG ACG ACT
Vβ10 CCA CGG AGT CAG GGG ACA CAG CAC Vβ22 AAG TGA TCT TGC GCT GTG TCC CCA
Vβ11 TGC CAG GCC CTC ACA TAC CTC TCA Vβ23 GCA GGG TCC AGG TCA GGA CCC CCA
Vβ12 TGT CAC CAG ACT GGG AAC CAC CAC Vβ24 CCC AGT TTG GAA AGC CAG TGA CCC
Cβ6 FAM CGG GCT GCT CCT TGA GGG GCT GCG
TAB 2 : Séquences des amorces de la PCR multiplex de l’immunoscope (Genevee, Diu et al. 1992). Cβ6 est couplé à la
sonde fluorescente FAM (carboxyfluorescéine).
-Matériel et Méthodes-
66
Réactifs Concentration finale (50µL)
AmpliTaq DNA Polymerase Buffer 10X 1X
MgCl2 25mM 2 mM
Amorces VB OUT sens 10 µM 1µM
Amorce CB-6FAM antisens 10 µM 1µM
DNTPs 2.5 mM 200 µM
AmpliTaq DNA Polymerase 5UI/µL 2,5 UI
H2O
TAB 1 : Conditions de la PCR de l’immunoscope. Le volume final est de 50 µL dont 5µL d’échantillon (ajustable selon la
concentration de cDNA). Chaque échantillon a subi 24 PCR (l’amorce Cβ 6 FAM reste constante).
5. QUANTIFICATION DES SJTREC
5.1 Standards de mesure pour la quantification des TREC
Les courbes standard utilisées lors des quantifications ont été réalisées à partir d’un plasmide
comprenant 1 insert sjTREC et un insert CD3γ . Ce plasmide nous a été gracieusement fourni
par le Docteur R. Cheynier (Unité de Rétrovirologie Moléculaire, Institut Pasteur, Paris).
Après amplification via transformation d’E. Coli DH5α et extraction par lyse alcaline
(Maxiprep, Qiagen), la qualité et la spécificité du DNA obtenu ont été vérifiées par PCR (voir
technique ci-dessous) suivie d’une migration des amplicons sur gel d’agarose à 2%. Les
éventuelles contaminations de l’ADN ont été vérifiées par examen de la courbe d’absorbance
A260/A280 au Nanodrop ND1000 (Isogen, Sint-Pieters Leeuw, Belgium). Le plasmide a été
dosé en triplicate selon le protocole complet de quantification des échantillons (cf ci-dessous)
par rapport à un plasmide de concentration connue.
5.2 Quantification des sjTREC
Brièvement, les PBMC décongelées ont été lysées 30 minutes à 56°C avec un tampon
composé de Tween-20 (0,05%), NP-40 (0,05%) et de Protéinase K (100µg/ml). La lyse a été
stoppée par une incubation de 15 minutes à 99°C.
-Matériel et Méthodes-
67
Chaque échantillon a ensuite subi deux amplifications consécutives (cf FIG 2):
1) Pré-PCR : PCR classique, multiplex, permettant l’amplification concomitante des
séquences sjTREC et CD3γ au moyen des amorces externes sjTREC out 3’/5’ et CD3
out 3’/5’.
2) LC-PCR : PCR quantitative, nichée (réalisée au moyen d’amorces internes sjTREC in
5’/3’ou CD3γ in3’/5’) sur les amplicons formés lors de la pré-PCR.
FIG 2 : Quantification des sjTREC. Deux amplicons, un sj et un CD3, synthétisés au cours d’une première PCR
multiplex, sont ensuite amplifiés lors de deux expériences successives de PCR en temps réel.
5.2.1 Pré-PCR
Les conditions de pré-PCR et les séquences des amorces externes sont rassemblées dans
les tableaux 3 et 4, respectivement. Le nombre de cycles a été fixé lors d’une expérience
indépendante afin d’amplifier au maximum les sjTREC tout évitant l’atteinte de la phase
« plateau » de la PCR CD3γ , ceci afin de respecter la proportionnalité entre les deux types
d'amplicons (courbe de linéarité). Les cycles d’amplification ont été menés comme
-Matériel et Méthodes-
68
suit (les étapes 2 à 4 ont été répétées 22 fois): 1° 10 min -95°C ; 2° 30 sec -95°C ; 3° 30
sec -60°C ; 4° 2 min -72°C ; 5° 7 min -72°C.
Réactifs Concentration finale (100µL)
Go Taq Flexi buffer 5x (Promega, Leiden,
The Netherlands)
1X
MgCl2 25 mM 3.5 mM
Amorce CD3γ 3’ OUT (100 µM) 1µM
Amorce CD3γ 5’ OUT (100 µM) 1µM
Amorce sjTREC 3’ OUT (100 µM) 1µM
Amorce sjTREC 5’ OUT (100 µM) 1µM
DNTPs 2.5 mM 100 µM
Go Taq Flexi DNA polymerase, 5UI/µl
(Promega, Leiden, The Netherlands)
1.5 UI
H2O
TAB 3 : Conditions de la PCR multiplex sjTREC. Le volume final est de 100 µL dont 10µL d’échantillon.
Amorce externe Séquence
CD3γ 3’ OUT CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT
CD3γ 5’ OUT ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG
sjTREC 3’ OUT ACT CAC TTT TCC GAG GCT GA
sjTREC 5’ OUT CTC TCC TAT CTC TGC TCT GAA
TAB 4: Séquences des amorces de la PCR multiplex sjTREC.
5.2.2 PCR quantitative (Q-PCR)
Chaque produit de pré-PCR a été quantifié en sjTREC et en CD3γ au cours de 2 expériences
de Q-PCR distinctes. Tous les échantillons ont été dosés au cours de 3 expériences différentes
(soit, 6 Q-PCR au total par échantillon). Les amplicons de pré-PCR ont été préalablement
-Matériel et Méthodes-
69
dilués dix fois, puis amplifiés suivant les conditions reprises dans le tableau 3. Les séquences
des sondes d’hybridation et des amorces internes sont présentées dans le tableau 4.
Réactifs Concentration finale (14µL)
Jumpstart TaqReady Mix quantitative PCR 2X
(Sigma, Bornem, Belgique)
0,8x
MgCl2 25mM 1.8 mM
Amorce CD3γ 3’ IN / TREC 3’ IN (100 µM) 1.8 µM
Amorce CD3γ 5’ IN / TREC 5’ IN (100 µM) 1.8 µM
Sonde CD3/ sjTREC P1 (4 µM) 70 nM
Sonde CD3/ sjTREC P2 (4 µM) 140 nM
Go Taq Flexi DNA polymerase, 5 UI/µl 1 UI
H2O
TAB 5 : Conditions de la PCR quantitative sj. Le volume final est de 14 µL dont 5.55 µl d’échantillon. *Les amorces sjTREC
3’IN et sjTREC 5’IN sont remplacées par les amorces CD3γ 3’ IN et CD3γ 5’ IN lors de la PCR quantitative CD3. Les
sondes P1 et P2 sont également modifiées.
Amorce interne Séquence
CD3γ 3’ IN CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A
CD3γ 5’ IN GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T
sjTREC 3’ IN GTG CTG GCA TCA GAG TGT GT
sjTREC 5’ IN CCT CTG TCA ACA AAG GTG AT
Sonde Séquence
CD3 P1 GGC TGA AGG TTA GGG ATA CCA ATA TTC CTG TCT C--FITC
CD3 P2 LC Red705-CTA GTG ATG GGC TCT TCC CTT GAG CCC TTC--PH
SJ P1 AAT AAG TTC AGC CCT CCA TGT CAC ACT--FITC
SJ P2 LC Red640-TGT TTT CCA TCC TGG GGA GTG TTT CA--PH
TAB 6 : Séquences des amorces et des sondes de la PCR quantitative sj. Les couples de sondes CD3 ou sj sont employés
avec les amorces CD3 IN ou sj IN, respectivement. Les sondes P1 sont couplées au fluorochrome FITC, la sonde
sjTREC P2 au LC-Red 640 et la sonde CD3 P2 au LC-Red 705. Les extrémités 3’ des sondes P2 sont phosphorylées
afin de bloquer l’action de la polymérase.
-Matériel et Méthodes-
70
Les conditions de cycles ont été menées comme suit (les étapes 2 à 4 ont été répétées 40 fois):
1° 1 min -95°C; 2° 1 sec -94°C ; 3° 5 sec -60°C ; 4° 15 sec -72°C. Les émissions de
fluorescence par FRET (Förster Resonance Energy Transfer) ont été mesurées après chaque
étape d’hybridation. Le caractère niché de cette PCR quantitative lui confère une sensibilité
élevée (détection d’une copie de TREC par PCR) sans pour autant en compromettre la
spécificité grâce à l’utilisation de sondes d’hybridation.
5.3 Expression des résultats
Les résultats ont été dans un premier temps exprimés en nombre absolu de TREC par 105
PBMC : comme chaque PBMC contient deux copies du gène de la chaîne CD3γ,
sjTREC/105 PBMC = (sjTREC/CD3γ)*2 10
5
Cependant, étant donné que les sjTREC sont uniquement présents dans les lymphocytes et
que la composition des PBMC peut être variable, les concentrations de sjTREC par µl de sang
ont été calculées via la formule
sjTREC/µl sang = (sjTREC/ 105 PBMC * PBMC/µl) /100
où PBMC/µl = leucocytes /µl * (%lympho + %mono)/100.
6. EXPANSIONS LYMPHOCYTAIRES
Les lymphocytes T de 5 cordons ombilicaux ont été isolés par Ficoll (Amersham, Roosendaal,
The Netherlands) suivi d’une déplétion des populations cellulaires mononucléées non T
(Lymphokwik, Ingen, Rungis, France). Les lymphocytes T ont ensuite été cultivés 18 à 26
jours à la concentration de 2 106 cellules/ml, dans du RPMI 1640 (Lonza, Petit-Rechain,
Belgique) 10% FBS (Lonza), 1% PS (Lonza) contenant 100 UI/ml d’Il-2 (Proleukin, Novartis,
Vilvoorde, Belgique) 1µg/ml de PHA (Sigma, Bornem, Belgique), et 1 bille anti-CD3 anti-
CD28/lymphocyte T (Invitrogen, Merelbeke, Belgique). Tous les deux jours, les cellules ont
été comptées (Horiba-ABX Diagnostics, Montpellier, France), et 5 106 d’entre elles ont été
congelées pour les quantifications de TREC. La culture de chaque cordon a été arrêtée à
-Matériel et Méthodes-
71
l’atteinte d’une expansion de 3 Log. Au J0 et lors du dernier comptage, 4 106 de cellules ont
été récoltées pour l’analyse de la prolifération par cytométrie en flux (voir ci-dessous).
7. MARQUAGE ET TRI DES TREG PAR CYTOMETRIE EN FLUX
Dans le cadre de l’analyse des TReg, les cellules destinées au tri ont subi trois marquages
extracellulaires: CD4, CD25 et CD127 (cf TAB 7). L’anticorps anti-CD4 utilisé était combiné
au fluorochrome FITC (clone RPA-T4, eBioscience, Halle-Zoersel, Belgique), l’anti-CD25 à
la PE (clone BC96, eBioscience, Halle-Zoersel, Belgique) et l’anti-CD127, biotinylé (clone
RDR5, eBioscience, Halle-Zoersel, Belgique) puis combiné à de la streptavidine conjuguée à
l’APC (Invitrogen, Merelbeke, Belgique). Les cellules destinées au marquage FACS ont été
incubées avec 4 anticorps: l’anticorps anti-CD4 conjugué au PerCP (clone SK3, BD
Bioscience, San Jose, Etats-Unis), l’anti-CD25-PE, l’anti-CD127-Biotine-streptavidine-APC
et l’anti Foxp3-Alexa Fluor (clone 206-D, Biolegend, Am Uden, Pays-Bas). Les marquages et
analyses des TReg ont été réalisés par le Dr Humblet-Baron.
Marquage Tri phénotypique
CD4 PerCP (clone SK3***)
CD4 FITC (clone RPA-T4*)
CD25 PE (clone BC96*)
CD127 biotine (clone RDR5*) + streptavidine-APC**
Foxp3-Alexa Fluor 488 (clone 206-D****)
TAB 7: Fluorochromes employés pour le marquage et tri des TReg.* eBioscience, Halle-Zoersel, Belgique ;** Invitrogen,
Merelbeke, Belgique ;*** BD Bioscience, San Jose, Etats-Unis ;**** Biolegend, AmUden, Pays-Bas
8.1 Marquage
Les PBMC récoltées au J100 après HCT ont été décongelées et resuspendues dans du PBS
(Lonza, Petit-Rechain, Belgique) 3% FBS (Lonza) à une concentration de 106 cellules/50 µl.
Un contrôle négatif global (PBS 3% FBS sans cellules) ainsi que des contrôles négatifs
propres à chaque anticorps (IgG1) ont été réalisés. Les anticorps anti-CD4 PerCP, anti-CD25
PE et anti-CD127 biotine ont été ajoutés dans un premier temps, puis, après incubation et
-Matériel et Méthodes-
72
lavage, la streptavidine-APC, uniquement dans le tube contenant le CD127 biotinylé (cf TAB
7). Après 15 minutes d’incubation, les cellules ont été fixées (Fix Buffer, Biolegend, Am
Uden, Pays-Bas) et perméabilisées (solution PERM Biolegend, Am Uden, Pays-Bas).
L’anticorps intranucléaire FoxP3 Alexa Fluor 488 et son contrôle ont été déposés dans les
tubes d’échantillons ainsi que dans les contrôles positifs correspondants. Après 30 minutes
d’incubation, deux lavages au PBS 3% FBS ont clôturé ce protocole. Les cellules ont alors été
analysées sur un FACSCanto (BD Biosciences) et les données traitées avec le logiciel FlowJo
(Tree Star Inc.).
8.2 Tri
Le marquage membranaire a été réalisé au moyen des anticorps anti-CD4 FITC, anti-CD25
PE et anti-CD127 biotine de la même façon. Les contrôles négatifs utilisés pour le tri et le
marquage étaient communs excepté ceux du CD4-PerCP et du Foxp3. Les cellules destinées
au tri n’ont cependant pas subi de marquage intranucléaire anti-Foxp3 (cf TAB 7). Les cellules
ont été triées sur un FACSVantage SE (BD Biosciences) par le Dr Jacobs conformément au
protocole du Dr Humblet-Baron afin de récolter les cellules CD4+CD25
+CD127
low/-. Le
chimérisme de cette population a ensuite été analysé par le Dr Herens et Jean-François
Vanbellinghen (service de Génétique Humaine).
RESULTATS
PARTIE EXPERIMENTALE I
DEMONSTRATION DE LA REPRISE DE LA
THYMOPOIESE APRES GREFFE NON
MYELOABLATIVE
-Résultats, partie I-
73
DEMONSTRATION DE LA REPRISE DE LA THYMOPOIESE APRES
GREFFE NON MYELOABLATIVE
Au cours de ce premier article, nous avons étudié la reconstitution immunitaire de 50 patients
receveurs de greffes allogéniques non myéloablatives réalisées avec ou sans déplétion
lymphocytaire CD8+ du greffon.
1.1 Suivi clinique
1.1.1 Patients et donneurs
Les cinquante-trois patients inclus dans cette étude ont été randomisés dans le but de recevoir
des cellules souches mobilisées (PBSC) non manipulées (n=28, groupe PBSC) ou déplétées
en lymphocytes T CD8+ (n=25, groupe CD8
-). Trois patients randomisés dans le groupe CD8
-
ont néanmoins reçu un greffon non manipulé en raison des faibles quantités de cellules CD34+
collectées avant la procédure de sélection. Ces patients ont été exclus des analyses. Les
caractéristiques des 50 patients restants, ainsi qu’un bref examen des événements cliniques
consécutifs à leur HCT, sont résumés dans le tableau 1.1. L’âge médian des receveurs était de
57 ans (range : 36 à 69 ans). Quarante-huit patients étaient atteints d’un cancer
hématologique, et 2 d’un carcinome rénal métastatique. Dix-neuf patients ont reçu des PBSC
d’un donneur apparenté HLA-identique, 1 de son fils présentant 1 disparité HLA, et 30 d’un
donneur non apparenté (présentant un 10/10 HLA-allele-match (n=14) ou un mismatch HLA
(HLA-mis, n=16)). Les patients du groupe PBSC ont reçu une médiane de 4.5 (0.8-20.2) x 106
CD34+/kg, 314 (80-631) x10
6 lymphocytes CD3
+/kg, et 130 (43-272) x10
6 lymphocytes
CD8+/kg. A la suite de la procédure de sélection, les patients du groupe CD8
- ont reçu une
médiane de 3.7 (0.7-12.2) x106
CD34+/kg (P=0.2), 110 (56-239) x10
6 lymphocytes CD3
+/kg
(P<0.0001), et 4.2 (0.4-33.7) x106 lymphocytes CD8
+/kg (P<0.0001), respectivement. La
procédure de déplétion des lymphocytes CD8+ a respectivement permis d’ôter 0.4 (range, 0.2-
0.5) log et 1.3 (range, 0.6-2.4) log des lymphocytes CD3+ et CD8
+ du greffon. Les cellules
CD34+
ont pu être récupérées à 72% (range, 28-100%), et les CD4+, à 71% (range, 41-88%).
Etant donné l’incidence des rejets et des phénomènes de rechutes/progressions sur l’ensemble
des réactions immunitaires, les patients ont été exclus des analyses le jour de la déclaration de
ces manifestations. Cette étude a été approuvée par le Comité d’Ethique de l’Université de
Liège et tous les patients ont signé un formulaire de consentement éclairé.
-Résultats, partie I-
74
PBSC non
manipulées (n=28)
PBSC depletées en
CD8+ (n=22)
P-value
Age médian des receveurs (range), années 57 (41-65) 57 (36-69) NS
Age médian des donneurs (range), années 40 (18-70) 45 (27-67) NS
Donneurs
Donneur apparenté HLA-id 11 8 NS
Donneur apparenté non HLA-id 1 0 NS
Donneur non apparenté 10/10 HLA allele-match 8 6 NS
Donneur non apparenté présentant un mismatch
HLA (HLA-mis)
8 8 NS
Diagnostics, nombre de patients
Leucémie myéloïde aiguë 3 0
Syndrome myélodysplasique ou
désordre myéloproliferatif
7 9
Leucémie myéloïde chronique 0 2
Lymphome 8 6
Leucémie lymphocytique chronique 1 4
Myélome multiple 7 1
Carcinome rénal 2 0
Conditionnement
2 Gy TBI 7 5
2 Gy TBI + fludarabine (90 mg/m²) 21 17
Nombre médian de cellules infusées (range), x106/kg
Cellules CD34+ 4.2 (0.8-20.2) 3.7 (0.7-12.2) 0.21
Lymphocytes T CD3+ 319 (80-631) 110 (56-239) <0.0001
Lymphocytes T CD4+ 180 (38-406) 94 (57-220) 0.0003
Lymphocytes T CD8+ 130 (43-272) 4.2 (0.4-33.7) <0.0001
GvHD aiguë, nombre de patients
Grade II 7 7 NS
Grade III 1 1 NS
Grade IV 4 0 0.06
GvHD chronique, nombre de patients 9 4 NS
Rejet, nombre de patients 0 7 0.001
Survie globale à 2 ans, % 59 53 NS
TAB 1 .1 : Caractéristiques des patients, paramètres des HCT et occurrence d’événements cliniques.
-Résultats, partie I-
75
1.1.2 Conditionnement
Le régime de conditionnement consistait en une irradiation corporelle totale de 2 Gy au jour 0
avec (n=38, 3 x 30 mg/m² aux jours -4, -3 et -2) ou sans fludarabine (n=12, donneur familial
avec faible risque de rejet). L’immunosuppression postgreffe consistait en une association de
cyclosporine (CSA) et de mycophénolate mofétil (MMF). La CSA a été administrée à dose
intégrale du jour -1 au jour 120, diminuée graduellement et arrêtée au J180 chez les receveurs
de greffes familiales. Les receveurs de greffes non apparentées ont reçu une dose complète de
CSA jusqu’au jour 180, puis cette dernière a été diminuée graduellement jusqu’à 1 an. Le
MMF a été administré du jour -1 au jour 28 chez les patients ayant reçu une greffe de donneur
familial, et du jour -1 au jour 40 en cas de greffe non familiale. La durée de la prophylaxie en
CSA a été étendue chez les patients souffrant de GvHD.
FIG 1.1 : Etude de la reconstitution immunitaire la première année post-HCT : randomisation, conditionnement et
prophylaxie anti-GvHD. Flu : fludarabine.
1.1.3 Collecte des PBSC et déplétion des lymphocytes CD8+
Pour les patients ayant un donneur familial, du G-CSF humain recombinant a été administré
aux donneurs à raison de 10 µg/kg du jour -5 au jour 0. La collecte des PBSC a été réalisée
aux jours -1 et 0 au moyen d’un séparateur de cellules sanguines à flux continu (CS3000+,
Baxter-Fenwall Laboratories, Deerfield, IL, or Cobe Spectra, Lakewood, CO). Pour les
-Résultats, partie I-
76
patients ayant un donneur non-familial, les PBSC ont été collectées conformément au NMDP
(National Marrow Donor Program). La déplétion des lymphocytes CD8+ a été effectuée grâce
à un système de microparticules à haute densité couplées à un anticorps monoclonal CD8
d’Eligix (CD8-HDM, Biotransplant Inc, Charlestown, MA, USA) selon les recommandations
du fabriquant.
1.1.4 Analyse cytométrique des PBSC
Des aliquots de PBSC avant et après déplétion CD8+ ont été incubés 20 minutes à 4°C avec
des anticorps monoclonaux anti-CD34, CD3, CD4, CD19, CD8 , CD56 ou IgG non
spécifiques isotype-matched, tous conjugués au FITC ou à la PE (BD Biosciences,
Erembodegem, Belgium). Les cellules ont ensuite été lavées et fixées. Un total de 1 x 105
cellules/condition a été analysé avec un FACSCalibur (BD). Le pourcentage de cellules
positives a été défini par dot plot sur population nucléée totale. Le pourcentage de cellules
positives du contrôle isotypique a été soustrait du pourcentage de cellules positivement
marquées. L’acquisition des données a été réalisée avec le logiciel Cellquest (BD).
1.1.5 Gestion clinique
Des administrations de G-CSF (5 µg/kg/jour) ont été réalisées chez les patients présentant un
taux de granulocytes inférieurs à 1.0 x 109/L. Le diagnostic et l'évaluation de la GvHD aiguë
ont été établis selon des critères internationaux (Blume 2004). Le traitement de la GvHD
aiguë consistait habituellement en une administration de prednisolone 2 mg/kg/jour, avec
décroissance des doses à partir de 14 jours. La GvHD chronique extensive a été généralement
traitée par alternance de prednisolone et de CSA. L’acyclovir (400 mg 3 fois/jour oralement),
une solution orale d’itraconazole sirop (200 mg 2 fois/jour) et de la pentamidine en aérosol
(300 mg/15 jours) ont été généralement utilisés comme traitement prophylactique des
infections (Frere, Baron et al. 2006). La réactivation du cytomégalovirus (CMV) a été
monitorée par une PCR hebdomadaire jusqu'au jour 100 et toutes les 2 à 4 semaines ensuite.
Les patients positifs ont reçu un traitement prophylactique par ganciclovir durant un minimum
de 4 semaines (généralement jusqu'au jour 100). L'évolution de la pathologie a été étudiée aux
jours 40, 100, 180 et 365 après HCT.
-Résultats, partie I-
77
1.1.6 Analyses statistiques
Le test de l’analyse de la variance, niveau 2 (ANOVA2), avec la manipulation du greffon et le
temps pour variables, a été employé pour comparer la reconstitution de la population T et
l’évolution du chimérisme T chez les receveurs de greffons non manipulés vs CD8-. Une
transformation logarithmique des données a précédé ces analyses. Le test de Mann Whitney a
été utilisé pour comparer la composition du greffon, la diversité du répertoire du TCR et les
taux de sjTREC chez les receveurs non manipulés vs CD8-. Le test des rangs par paires de
Wilcoxon a été utilisé pour comparer la diversité du répertoire Vβ, les niveaux de sjTREC et
de cellules T CD3+ aux jours 40 et 100 après HCT avec les valeurs obtenues pour les mêmes
patients 1 an après transplantation. Le test de corrélation de Spearman a été utilisé pour
évaluer les associations entre la composition du greffon et les taux des sous-populations de
cellules T et de TREC après HCT d’une part, et entre l’âge du donneur ou du patient et les
niveaux de sjTREC après HCT d’autre part. La probabilité de progression de la maladie et
d’infection sévère (définie comme sepsie, infection à CMV ou infection fongique invasive) du
jour 100 au jour 365 en comparaison avec la reconstitution immunitaire au J100 après HCT a
été estimée par le test de Kaplan-Meier. Ces analyses statistiques ont été réalisées avec le
logiciel Graphpad Prism (Graphpad Software, San Diego, CA).
Pour expliquer la variation d'une variable dépendante par l'action de plusieurs variables
explicatives, nous avons utilisé la régression linéaire multivariée, qui consiste en une
généralisation, à p variables explicatives, de la régression linéaire simple. Ces analyses ont été
réalisées par le Docteur Seidel (Département d’Informatique Médicale et de Biostatistique).
Ainsi, pour déterminer les facteurs affectant les taux de CD3+, CD4
+ naïves et CD8
+ aux jours
100, 180 et 365 après HCT, ainsi que les concentrations de sjTREC aux jours 100 et 365 après
HCT, des modèles de régressions linéaires multivariées réalisées pour les différentes
populations T et pour les sjTREC à chaque point temporel ont été créés avec le SAS Reg
procedure (SAS Institute, Cary, NC, USA) au moyen d’une « forward stepwise selection ».
Les modèles sélectionnés ont ensuite été réajustés en utilisant tous les patients (certains
avaient été exclus dans la « stepwise selection » en raison de valeurs manquantes pour les
variables non retenues dans le modèle final). Les facteurs ci-après ont été examinés:
1) type de donneur (apparenté HLA-id vs non apparenté 10/10 HLA-allele-match vs non
apparenté présentant une disparité HLA),
2) âge du receveur,
3) âge du donneur,
-Résultats, partie I-
78
3) contenu du greffon en CD3+ (en CD8
+ pour la reconstitution des T CD8
+, enCD3
+ et
CD34+ pour les concentrations en sjTREC),
4) apparition de GvHD aiguë et chronique.
Une transformation logarithmique des réponses a été utilisée dans tous les modèles. Le seuil
de signification a été placé à 0.05.
1.2 Analyse de la reconstitution immunitaire
1.2.1 Paramètres étudiés
Dans ce premier article, le chimérisme et la reconstitution des différentes populations
lymphocytaires ont été mesurés au terme de 8 échéances temporelles (J28, J42, J60, J80, J100,
J120, J180, J365) au cours de la première année postgreffe (cf FIG 1.2). La diversité du
répertoire TCR des lymphocytes T périphériques a été analysée aux jours 42, 100 et 365 sur
population lymphocytaire totale, et au jour 180 sur populations purifiées CD4+ et CD8
+. Les
taux de sjTREC ont été comparés dans les 2 groupes 100 jours et 1 an après greffe.
FIG 1.2 : Paramètres immunitaires étudiés au cours de la première année postgreffe chez 50 patients receveurs d’allogreffes
non myéloablatives déplétées (n=22) ou non (n=28) en CD8+.
-Résultats, partie I-
79
1.2.2 Chimérisme lymphocytaire T
La valeur médiane du chimérisme dans le groupe PBSC versus CD8- atteignait 71 versus 51%
(P=0.1), 73 versus 65% (P=0.5), 75 versus 70% (P=0.23), 75 versus 70% (P=0.3), et 89
versus 81% (P=0.4) aux jours 28, 42, 100, 180 et 365, respectivement.
La combinaison de ces données a pu être analysée au moyen d’une ANOVA2, avec pour
résultat une diminution significative des taux de chimérisme dans le groupe CD8- par rapport
au groupe PBSC (P=0.01) (cf FIG 1.3).
0 60 120 180 240 300 3600
20
40
60
80
100
P=0.0137
Jours après HCT
Ce
llu
les
du
do
nn
eu
r (%
)
FIG 1.3. Valeurs médianes du chimérisme donneur lymphocytaire T chez les receveurs de PBSC (trait bleu continu) ou de
PBSC CD8- (trait mauve pointillé) après HCT non myéloablative. Les barres d’erreur indiquent les percentiles 25 et 75.
1.2.3 Reconstitution des populations lymphocytaires périphériques
La reconstitution des sous-populations lymphocytaires périphériques a été analysée par
ANOVA2 dans les 2 groupes de patients. A la suite de la greffe, parallèlement à
l’augmentation des lymphocytes T CD3+ originaires du donneur (cf FIG 1.4), les populations
de lymphocytes CD3+ totaux, CD4
+, CD8
+ et CD4 mémoires (CD4
+CD45RO
+) étaient
presque complètement reconstituées au J365 (cf FIG 1.5-1.8). La déplétion des lymphocytes
CD8+ n’a pas significativement affecté la reconstitution des populations CD3
+, CD4
+,
CD4+CD45RA
+ ou CD4
+CD45RO
+. Par contre, elle a significativement réduit l’efficacité de
reconstitution des compartiments CD8+
(P<0.0001) et CD56+
(P=0.01) (cf FIG 1.6 et 1.10).
De plus, l’expansion des lymphocytes T CD3+du donneur a été ralentie par la déplétion des
CD8+
(P=0.06). Une corrélation a également été mise en évidence entre le nombre de
lymphocytes T CD3+ présents dans le greffon et les concentrations sanguines de CD3
+ aux
-Résultats, partie I-
80
jours 28 (Spearman R=0.39, P=0.02) et 100 (Spearman R=0.39, P=0.04) après HCT, mais pas
au jour 180, ni au J365.
Lymphocytes CD3+ du donneur
0 60 120 180 240 300 360100
1000
P=0.06
Jours après HCT
Cellule
s/µ
L
FIG 1.4 : Valeurs médianes du nombre absolu de cellules T CD3+ originaires du donneur chez les receveurs de
PBSC (trait bleu continu) ou de PBSC CD8- (trait mauve pointillé) après HCT non myéloablative. Les barres
d’erreur indiquent les percentiles 25 et 75. Les lignes horizontales représentent les percentiles 3 et 97 de 30
volontaires sains.
Lymphocytes CD3+
0 60 120 180 240 300 360100
1000
NS
Jours après HCT
Cellule
s/µ
L
FIG 1.5 : Valeurs médianes du nombre absolu de cellules T CD3+ totales chez les receveurs de PBSC (trait bleu
continu) ou de PBSC CD8- (trait mauve pointillé) après HCT non myéloablative. Les barres d’erreur indiquent
les percentiles 25 et 75. Les lignes horizontales représentent les percentiles 3 et 97 de 30 volontaires sains.
-Résultats, partie I-
81
Lymphocytes CD8+
0 60 120 180 240 300 36010
100
1000
10000
P=0.0004
Jours après HCT
Cellule
s/µ
L
FIG 1.6 : Valeurs médianes du nombre absolu de cellules CD8+ chez les receveurs de PBSC (trait bleu continu) ou
de PBSC CD8- (trait mauve pointillé) après HCT non myéloablative. Les barres d’erreur indiquent les
percentiles 25 et 75. Les lignes horizontales représentent les percentiles 3 et 97 de 30 volontaires sains.
Lymphocytes CD4+
0 60 120 180 240 300 360100
1000
NS
Jours après HCT
Cellule
s/µ
L
FIG 1.7 : Valeurs médianes du nombre absolu de cellules CD4+ chez les receveurs de PBSC (trait bleu continu) ou
de PBSC CD8- (trait mauve pointillé) après HCT non myéloablative. Les barres d’erreur indiquent les
percentiles 25 et 75. Les lignes horizontales représentent les percentiles 3 et 97 de 30 volontaires sains.
-Résultats, partie I-
82
Lymphocytes CD4+ CD45RO+
0 60 120 180 240 300 36010
100
1000
NS
Jours après HCT
Cellule
s/µ
L
FIG 1.8 : Valeurs médianes du nombre absolu de cellules CD8+ chez les receveurs de PBSC (trait bleu continu) ou
de PBSC CD8- (trait mauve pointillé) après HCT non myéloablative. Les barres d’erreur indiquent les
percentiles 25 et 75. Les lignes horizontales représentent les percentiles 3 et 97 de 30 volontaires sains.
Lymphocytes CD4+ CD45RA
+
0 60 120 180 240 300 36010
100
1000
NS
Jours après HCT
Cellule
s/µ
L
FIG 1.9 : Valeurs médianes du nombre absolu de cellules CD4+CD45 RA+ chez les receveurs de PBSC (trait bleu
continu) ou de PBSC CD8- (trait mauve pointillé) après HCT non myéloablative. Les barres d’erreur indiquent
les percentiles 25 et 75. Les lignes horizontales représentent les percentiles 3 et 97 de 30 volontaires sains.
-Résultats, partie I-
83
Lymphocytes CD56+
0 60 120 180 240 300 36010
100
1000
P=0.03
Jours après HCT
Cellule
s/µ
L
FIG 1.10 : Valeurs médianes du nombre absolu de cellules CD56+ chez les receveurs de PBSC (trait bleu continu)
ou de PBSC CD8- (trait mauve pointillé) après HCT non myéloablative. Les barres d’erreur indiquent les
percentiles 25 et 75. Les lignes horizontales représentent les percentiles 3 et 97 de 30 volontaires sains.
1.2.4 Reconstitution du répertoire Vββββ (immunoscope)
La polyclonalité du répertoire lymphocytaire T a été évaluée par immunoscope dans les 2
groupes de patients aux jours 40, 100, 180 et 1 an après HCT. La diversité globale du
répertoire lymphocytaire T a été calculée en additionnant le nombre de pics présents dans
chacune des 24 familles de TCRVβ comme précédemment décrit (Genevee, Diu et al. 1992),
et comparée au score obtenu chez 5 volontaires sains. Au J40 après HCT, la diversité du
répertoire était légèrement réduite chez les receveurs de PBSC et de PBSC CD8-, par rapport
aux volontaires sains (les scores TCRVβ moyens ± SD étaient de 186 ± 5 pics chez les
contrôles versus 166 ± 31 pics chez les patients greffés (P=0.09)). De plus, malgré une
augmentation du nombre de lymphocytes T circulants durant la première année après greffe,
la diversité du TCR a continué à chuter dans les 2 groupes de patients (scores TCRVβ moyens
± SD: 158 ± 40 pics (P=0.04 en comparaison aux volontaires sains), et 151 ± 40 pics (P=0.02
en comparaison aux volontaires sains) aux jours 100 et 365, respectivement, pour tous les
patients (cf FIG 1.11).
Malgré d’importantes différences dans le nombre de cellules CD8+ greffées, la diversité du
score Vβ s’est révélée similaire dans les groupes PBSC et CD8- lors de chaque
évaluation (P=0.68, P=0.93, et P=0.34 aux jours 40, 100 et 365 après HCT, respectivement).
-Résultats, partie I-
84
Contrôles J40 J100 J36550
100
150
200
250
P=0.09P=0.04
P=0.02
P=0.04
FIG 1.11: Répertoire TCRVβ de la totalité des patients greffés (groupe PBSC + groupe CD8-) aux jours 40, 100 et 365 après
HCT (contrôles=5 volontaires sains). Les résultats sont exprimés en nombre de pics Vβ.
A
B
FIG 1.12 : A) Répertoire TCRVβ au J100 de la totalité des patients (box blanc), des patients inclus dans le groupe PBSC ou
dans le groupe CD8-, ainsi que des receveurs de greffe familiale (MRD), non familiale 10/10 HLA allele-match (HLA-id-
URD), ou non familiale HLA-mis (MM-URD). B) Répertoire TCRVβ au J365 chez les patients ayant développé ou non une
cGvHD.
-Résultats, partie I-
85
De plus, au jour 180, les scores Vβ au sein des populations CD4+ et CD8
+ ne différaient pas
chez les receveurs de PBSC (134 ± 56 et 152 ± 65 pics, respectivement) ou de PBSC CD8-
(112 ± 73 (P=0.4) et 157 ± 35 (P=0.8) pics, respectivement). Enfin, comme représenté dans la
figure 1.12A-B, ni la manipulation du greffon, ni la relation patient-donneur, ni l’occurrence
de GvHD chronique n’ont affecté significativement les scores Vβ, malgré la suggestion d’une
moindre diversité du répertoire chez les patients présentant une GvHD (P=0.19).
L’observation d’une diminution de la diversité des TCR au fil des mois suggère qu’une
première phase de reconstitution pourrait être due à l’expansion périphérique des cellules T
matures contenues dans le greffon, expansion suivie d’une déplétion de ces cellules le long de
la première année après greffe, menant ainsi à une restriction de la diversité du répertoire
TCR. Par ailleurs, cette réduction du répertoire périphérique des lymphocytes T est
accompagnée d’une augmentation des taux de lymphocytes T circulants, suggérant de la sorte
l’existence d’une autre source de lymphocytes T.
1.2.5 Estimation de la fonction thymique
Dans le but d’analyser la contribution de la voie thymo-dépendante dans la reconstitution
lymphocytaire T globale après HCT, nous avons quantifié les fréquences de sjTREC
(sjTREC/105PBMC) ainsi que leurs concentrations (sjTREC/ml) dans les 2 groupes de
patients aux jours 100 et 1 an après HCT. Au jour 100 (cf FIG 1.13), les fréquences et
concentrations en sjTREC étaient significativement supérieures chez les patients du groupe
PBSC par rapport à ceux du groupe CD8- (fréquence médiane des sjTREC= 67 (range: 1-580)
et 10 (range: 1-120) sjTREC/105 cellules dans les bras PBSC et CD8
-, respectivement
(P=0.003); concentration médiane des sjTREC= 391 (range: 9-5614) et 149 (range: 5-1495)
sjTREC/ml, respectivement (P=0.008)). Par contre, les 2 groupes présentaient une fréquence
et une concentration similaires en sjTREC 1 an après la greffe (fréquence médiane des
sjTREC= 107 (range: 3-492) et 47 (range: 1-167) sjTREC/105 cellules; concentration médiane
des sjTREC= 697 (range: 25-2136) et 1022 (range: 129-22927) sjTREC/ml dans les groupes
PBSC et CD8-, respectivement).
Une corrélation inverse entre la concentration en sjTREC et l’âge a également été notée dans
les 2 groupes 1 an après HCT (R=-0.64, P=0.0187 et R=-0.57; P=0.2 pour le groupe PBSC et
le groupe CD8-, respectivement; figure 1.14; R=-0.57 et P=0.008 lors du rassemblement des 2
groupes). Une telle corrélation, absente au J100, suggère qu’une production de novo de
-Résultats, partie I-
86
lymphocytes T par le thymus pourrait être un paramètre important pour la formation
d’émigrants thymiques récents (RTE) chez les greffés 1 an après HCT.
FIG 1.13: Fonction thymique 100 jours après greffe non myéloablative. Fréquence (à gauche) et concentration (à droite) des
sjTREC parmi les receveurs de greffons non manipulés (PBSC) ou déplétés des CD8+ (CD8-) au jour 100 après HCT.
FIG 1.14: Fonction thymique après greffe non myéloablative. Les cercles bleus indiquent les données concernant les patients
du groupe PBSC, les cercles mauves celles du groupe CD8-. Corrélation entre la concentration en sjTREC et l’âge du patient
1 an après HCT (R=-0.57 et P=0.008 quand les 2 groupes de patients sont analysés simultanément).
-Résultats, partie I-
87
Dans le but de vérifier de façon directe l’existence d’une génération de cellules T par voie
thymo-dépendante entre le J100 et 1 an après HCT, nous avons comparé les concentrations en
sjTREC et les taux de lymphocytes CD3+ au jour 100 et au jour 365 dans un groupe de 40
patients pour lesquels les différentes données étaient disponibles aux 2 dates (cf FIG 1.15,
actualisation des données du papier 1). Dans cette cohorte, l’âge médian était de 56 ans
(range, 36-70). Les concentrations en sjTREC et les taux de lymphocytes CD3+ augmentaient
parallèlement entre le J100 et le J365 (P=0.006 et P=0.022, respectivement) (cf FIG 1.15). De
plus, une corrélation inverse significative entre l’âge du receveur et l’augmentation des
sjTREC du J100 au J365 a été mise en évidence (Spearman R=-0.39, P=0.047).
SJ TR
EC J
100
SJ TR
EC 1
an
CD3
J100
CD3
1 an
0.1
1
10
100
1000
10000
100000
0.1
1
10
100
1000
10000
P=0.006 P=0.022
sj T
RE
C/m
lC
D3
/µl
FIG 1.15: Concentration médiane en sjTREC et taux de lymphocytes CD3+ aux jours 100 et 365 après HCT dans un groupe
de 40 patients dont les sjTREC ont pu être mesurés aux 2 dates. L’âge médian des patients de cette cohorte était de 56 ans
(range, 36-70).
La répartition en trois groupes en fonction de l’âge (moins de 50 ans, 50-60 ans, plus de 60
ans, cf FIG 1.16) a permis également de visualiser la reprise de l’activité thymique. Seul le
groupe le plus jeune montrait une différence significative à la fois des taux de sjTREC et des
taux de CD3+ entre le J100 et 1 an après transplantation. L’analyse d’un nombre plus élevé de
patients pourrait permettre la mise en évidence d’une récupération des taux de CD3+, qui,
accompagnée d’une augmentation ou d’une stagnation des taux de sjTREC, démontrerait une
activité thymique.
-Résultats, partie I-
88
J100 1 an J100 1 an0.1
1
10
100
1000
10000
100000
1
10
100
1000
10000
Moins de 50 ans
P=0.004 P=0.012
SJ T
RE
C/m
lC
D3/µ
l
J100 1 an J100 1 an0.1
1
10
100
1000
10000
100000
0.1
1
10
100
1000
10000
50-60 ansP=0.019 P=0.356
SJ T
RE
C/m
lC
D3/µ
l
J100 only >60
J100 1 an J100 1 an10
100
1000
10000
Plus de 60 ans
10
100
1000
10000P=0.25P=0.625
SJ T
RE
C/m
lC
D3/µ
l
FIG 1.16: Evolution des concentrations en sjTREC et en CD3+ entre le J100 et le J365 en fonction de l’âge du receveur.
-Résultats, partie I-
89
1.2.6 Analyse multivariée des facteurs affectant la reconstitution
immunologique (TAB 1.2)
Population cellulaire Jours post HCT Facteur(s) associé(s) à des populations cellulaires élevées
100 Quantités importantes de CD3+dans le greffon
† (P=0.010)
Absence de GvHD aiguë de grade II-IV (P=0.021)
Lymphocytes CD3+
365 Donneur jeune† (P=0.017)
Lymphocytes CD4+ naïfs 365 Receveur jeune
† (P=0.021)
100 Quantités importantes de CD8+dans le greffon
† (P=0.001)
Absence de GvHD aiguë de grade II-IV (P=0.049)
180 Quantités importantes de CD8+dans le greffon
† (P=0.036)
Lymphocytes CD8+
365 Donneur jeune† (P=0.015)
sjTREC 365 Donneur non apparenté 10/10 HLA allele-match (P=0.029)
Absence de GvHD chronique (P<0.0001)
Quantités importantes de CD3+dans le greffon
† (P=0.002)
TAB 1.2 : Analyse multivariée des facteurs affectant la reconstitution immunitaire après greffe non myéloablative. L’impact
des facteurs potentiels suivants a été examiné: type de donneur (apparenté HLA-identique vs non apparenté 10/10 HLA
allele-match vs non apparenté HLA-mis), âge du receveur, âge du donneur, contenu du greffon en CD3+(en CD8+ pour les
taux de CD8+, et en CD3+ et CD34+ pour la concentration en sjTREC), présence de GvHD aiguë et chronique. †variable
linéaire continue.
Receveur
Un âge avancé du patient a été associé à des taux inférieurs de lymphocytes CD4+ naïfs au
J365 après HCT (P=0.02).
Donneur
Un âge avancé du donneur a été associé à des taux faibles de lymphocytes T CD3+ (P=0.02)
et CD8+ (P=0.02) au J365 après HCT. L’utilisation d’un donneur non apparenté 10/10 HLA
allele-match a été associé à des concentrations en sjTREC élevées au J365 après HCT
(P=0.03) (cf FIG 1.17).
-Résultats, partie I-
90
FIG 1.17 : Concentration en sjTREC 1 an après HCT en fonction du type de greffe: familiale (MRD), non familiale 10/10
HLA allele-match (HLA-id-URD) ou non familiale présentant une disparité HLA (MM-URD).
Composition du greffon
Des doses importantes de lymphocytes T CD3+ dans le greffon ont été associées à des
concentrations sanguines élevées de CD3+ 100 jours après HCT (P=0.01). Une telle
association n’est pas apparue aux J180 et J365 après greffe. Les taux de CD3+ présents dans le
greffon ont également été associés à des concentrations en sjTREC élevées après HCT
(P=0.002). Les quantités de CD8+ transplantées ont été associées à des taux élevés de cellules
CD8+ 100 (P=0.001) et 180 jours (P=0.04) après HCT. Une telle association n’était pas
présente 1 an après HCT. Aucune association entre le nombre de cellules souches CD34+
greffées et les concentrations en sjTREC aux jours 100 et 365 après HCT n’a pu être établie.
GvHD
L’apparition d’une GvHD aiguë de grade II-IV a été corrélée à des taux faibles de
lymphocytes CD3+ (P=0.02) et CD8
+ (P=0.049) après HCT. La survenue de GvHD
chronique a été associée à des concentrations faibles en sjTREC 1 an après HCT (P<0.001)
(cf FIG 1.18).
Association entre reconstitution immunitaire, progression de la maladie et
développement d’infections
Aucune association significative n’a été notée entre l’occurrence d’une infection sévère
(définie en terme de sepsies, infection à CMV ou infection fongique invasive) du jour 100 à 1
an après HCT et des taux de sjTREC (cf FIG 1.19A page suivante), de CD3+ (cf FIG 1.19B)
-Résultats, partie I-
91
ou de CD4+CD45RA
+ (cf FIG 1.19C) au jour 100 après greffe supérieurs ou inférieurs à la
médiane.
D’une façon similaire, aucune association significative n’a été rencontrée entre l’incidence de
la progression tumorale du jour 100 à 1 an après HCT et des taux de sjTREC (figure 1.20A),
de CD3+ (figure 1.20B) ou de CD4
+CD45RA
+ (figure 1.20C) au jour 100 après greffe
supérieurs ou inférieurs à la médiane.
FIG 1.18 : Concentration en sjTREC 1 an après HCT chez des patients atteints (cGvHD+) ou non (cGvHD-) de cGvHD.
-Résultats, partie I-
92
A
B
C
FIG 1.19 : Probabilité (Kaplan-Meier) de développer une infection sévère du jour 100 ou jour 365 après HCT chez des
patients dont la concentration en sjTREC (A), en lymphocytes CD3+ (B), et en CD4+CD45RA+ (C) était inférieure (trait
continu) ou supérieure (trait pointillé) à la médiane.
-Résultats, partie I-
93
A
B
C
FIG 1.20 : Probabilité (Kaplan-Meier) de progression tumorale du jour 100 ou jour 365 après HCT chez des patients dont la
concentration en sjTREC (A), en lymphocytes CD3+ (B), et en CD4+CD45RA+ (C) était inférieure (trait continu) ou
supérieure (trait pointillé) à la médiane.
-Résultats, partie I-
94
1.2.7 Conclusion : la reconstitution immunitaire la première année après
minigreffe
Chez les patients d’âge avancé soignés par greffe non myéloablative, la question d’une
éventuelle restauration de l’activité thymique au cours de la reconstitution immunitaire est
restée longtemps en suspens.
Dans la première partie de ce travail, nous avons évalué la reconstitution du système
immunitaire de 50 patients à la suite d’une greffe allogénique non myéloablative. Cette étude
a été réalisée dans le cadre d’un protocole prospectif randomisé destiné à mesurer l’impact de
la déplétion lymphocytaire CD8+ du greffon sur le risque de développer une GvHD chez des
patients inéligibles pour une greffe myéloablative. Nous avons démontré que la reconstitution
immunitaire pouvait être divisée en deux phases majeures. Les 3 premiers mois après greffe,
la repopulation lymphocytaire est en grande partie engendrée par l’expansion des cellules T
matures présentes dans le greffon. Cependant, il n’est pas impossible qu’une production
thymique de novo puisse également jouer un rôle durant cette période. Par contre, à la suite de
cette phase précoce, le thymus semble devenir une source importante des cellules T
circulantes chez le greffé, en tous cas chez les patients âgés de moins de 60 ans.
Une forte corrélation a en effet été mise en évidence entre la composition du greffon et les
concentrations sanguines de lymphocytes T CD3+ et CD8
+ au jour 100, démontrant que la
reconstitution immunitaire était principalement menée par les expansions périphériques des
cellules T matures présentes dans le greffon juste après la HCT. Ces observations confirment
celles de précédentes études réalisées chez de plus jeunes patients après greffe myéloablative
(Atkinson 2004). Parmi ces études, Hochberg et al. ont mis en évidence des taux de sjTREC
amoindris les 3 premiers mois après greffe de moelle allogénique myéloablative chez l’adulte
(âge médian, 42 ans) (Hochberg, Chillemi et al. 2001). Par ailleurs, il a été démontré que les
patients receveurs de greffes déplétées en cellules T présentent des taux inférieurs de cellules
T naïves (Martinez, Urbano-Ispizua et al. 1999) et de sjTREC (Lewin, Heller et al. 2002) les
premiers mois après conditionnement myéloablatif par rapport aux receveurs de greffes non
manipulées. En outre, les taux de cellules T naïves au J100 après greffe myéloablative sont
fortement corrélés au nombre de cellules T naïves contenues dans le greffon (Storek, Dawson
et al. 2003). Similairement, après greffe non myéloablative, le nombre de cellules TREC
positives diminue graduellement durant les 6 premiers mois consécutifs à la greffe, suggérant
par là que le principal mécanisme de reconstitution lymphocytaire T précoce pourrait être
thymo-indépendant (Bahceci, Epperson et al. 2003). Finalement, une autre étude a suggéré
-Résultats, partie I-
95
que la composition du greffon était le facteur principal influençant la reconstitution
immunitaire les 6 premiers mois après HCT non myéloablative (Baron, Schaaf-Lafontaine et
al. 2003).
Cependant, nos données ont mis en évidence le rôle majeur de la néogénération thymo-
dépendante dans la reconstitution des lymphocytes T circulants 1 an après HCT. Cette
importante contribution thymique après greffe non myéloablative semble plutôt surprenante,
étant donné que cette stratégie de greffe est principalement proposée aux patients âgés : dans
cette étude, 50% des patients avaient plus de 57 ans, et 25%, plus de 63 ans. Bien que les
concentrations en sjTREC 1 an après HCT aient été corrélées à l’âge du patient dans l’analyse
univariée,
-l’absence de GvHD chronique,
-un nombre de lymphocytes T élevés dans le greffon,
-et le choix d’un donneur non apparenté HLA-id
constituaient les 3 facteurs affectant la concentration en sjTREC 1 an après HCT lors de
l’analyse multivariée. Ces données confirment les observations réalisées précédemment chez
de plus jeunes patients receveurs de greffes allogéniques myéloablatives, observations au
cours desquelles la composition du greffon (Lewin, Heller et al. 2002), l’âge du receveur
(Lewin, Heller et al. 2002; Storek, Joseph et al. 2002), et l’absence de GvHD chronique
(Weinberg, Blazar et al. 2001; Lewin, Heller et al. 2002; Jimenez, Martinez et al. 2006)
constituaient les facteurs majeurs affectant la fonction thymique la première année post HCT
(Lewin, Heller et al. 2002; Storek, Joseph et al. 2002).
Comme discuté dans l’introduction, l’impact négatif de la cGvHD sur la fonction thymique
pourrait s’expliquer à la fois 1) par la destruction directe de l’épithélium thymique du
receveur au cours de la GvHD et 2) par l’impact néfaste des immunosuppresseurs administrés
consécutivement à son apparition (Dulude, Roy et al. 1999; Hauri-Hohl, Keller et al. 2007).
Ensuite, l’association démontrée entre la richesse du greffon en CD3+ et les hautes
concentrations en sjTREC après greffe pourrait provenir à la fois du nombre important de
sjTREC présents dans le greffon, mais aussi d’un taux de mitoses lymphocytaires
périphériques amoindri (et donc d’une moindre dilution des sjTREC) chez les receveurs d’un
greffon riche en CD3+. Enfin, la relation taux de sjTREC/compatibilité HLA entre donneur et
receveur, qui a présenté des résultats contradictoires au cours de nos deux études, ne pourrait
être résolue que par l’analyse d’un plus grand nombre de patients.
Par ailleurs, notre étude a montré que le répertoire lymphocytaire T restait relativement
diversifié les premiers mois après HCT, pour devenir ensuite plus restreint à 1 an. Tandis que
-Résultats, partie I-
96
le répertoire Vβ relativement complexe observé après HCT pourrait être partiellement dû à la
persistance de lymphocytes T du receveur (Maris, Boeckh et al. 2003; Baron, Baker et al.
2004), le répertoire plus limité observé à 1 an pourrait provenir d’une éradication graduelle
des cellules T résiduelles du receveur par les cellules T du donneur (Maris, Boeckh et al.
2003; Baron, Baker et al. 2004) ou de l’apoptose des cellules T matures du greffon à la suite
d’expansions massives. Par ailleurs, étant donné que le répertoire TCR ne peut distinguer une
perte de lymphocytes T d’une expansion clonale préférentielle, le répertoire restreint observé
à 1 an pourrait être la conséquence d’expansions clonales massives de clones mémoires
spécifiques du CMV ou de la GvHD par exemple (Hakki, Riddell et al. 2003)
En résumé, ces premiers résultats suggèrent qu’alors que la reconstitution immunitaire était
principalement due aux expansions périphériques de cellules matures du greffon les 3
premiers mois après greffe non myéloablative, la néoproduction thymique semble jouer un
rôle important au cours de la reconstitution immunitaire à long terme chez les patients greffés.
PARTIE EXPERIMENTALE II
RECONSTITUTION IMMUNITAIRE A LONG
TERME APRES GREFFE NON MYELOABLATIVE
