Université Dr Moulay Tahar de Saida Faculté des Sciences &Technologies Département de Biologie

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Interaction protéine -ligand Interaction protéine -ligand caractérisation des sites de caractérisation des sites de

fixation.fixation.

Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI 11


Introduction :La quantification des sites de fixation d'un ligand sur une protéine nécessite en général la mesure de la concentration de ligand lié à la protéine à l'équilibre thermodynamique.C'est ce que sera envisagé dans ce chapitre.

I- Rappel théorique :•Protéine à un site de fixation :La fixation à l'équilibre d'un ligand sur une protéine qui possède un site de fixation pour ce ligand est régie par un équilibre thermodynamique :

K1 P + L :::::::::::::::::: P-L [P][L]/[P-L] = K-1/K1 = Kd K-1

[P] = concentration de la protéine libre,[L] = concentration de ligand libre,[P-L] = concentration de la protéine complexée.

Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Ces 3 concentrations étant définies lorsque l'équilibre thermodynamique est réalisé. En utilisant la relation de conservation de la protéine ([Pt] = [P] + [P-L]); on en déduit que [P-L]

dépend de [Pt], de Kd et de la concentration de ligand libre selon une loi hyperbolique :

[P-L] = [Pt] x ([L]/Kd+[L])

On parle alors d'une saturation Michaelienne (par analogie avec l'équation de Michaelis donné pour la vitesse d'une réaction enzymatique).

L'expression de [P-L] : complexe formé, est constituée de deux termes indépendants :

•[Pt] = concentration totale de la protéine

• ([L]/Kd+[L]) : ne dépend que du rapport [L]/Kd qui varie entre 0 et 1, et renseigne sur le degré de saturation de la protéine, on l'appelle la fonction de

saturation Ÿ. Sa valeur est égale à 0,5 (demi-saturation) quand la [L] libre ([L]0,5) est égale à Kd.


Remarque:

Lorsque l'on est présence d'un équilibre plus complexe (la protéine libre ou la protéine complexée pouvant exister sous différentes formes en équilibre les unes

avec les autres); la fonction de saturation présente une expression similaire, mais le terme Kd, qui correspond toujours à [L]0,5 , représente alors la constante

d'équilibre apparente que l'on peut définir entre le ligand libre, la somme des différentes espèces de protéine libre et la somme des différentes espèces

complexées au ligand :

Kd = (Σ[protéine libre])x[L libre]/Σ[protéine complexée] (équation de départ)


•Protéines à plusieurs sites de fixation pour un ligand :

Si une protéine possède plusieurs sites de fixation pour un ligand, ces sites peuvent être indépendants (la fixation du ligand sur un site étant indépendante de l'état de

saturation des autres sites ) ou dépendants.

a) Sites indépendants et équivalents :Si une protéine possède n sites de fixation équivalents, la relation d'équilibre est

vérifiée au niveau des sites : [sites libres ][L]/[sites occupés] = Kd

Kd = constante de dissociation microscopique ou intrinsèque.

En faisant intervenir la concentration des sites totaux, qui est égale à n fois la concentration de la protéine :

[sites occupés] = [sites totaux] x [L]/(Kd+[L]) = n[Pt]x [L]/(Kd+[L]) = n [Pt] Ÿ.


La concentration de ligand lié est égale à la concentration de sites occupés. Elle augmente avec la concentration de ligand libre selon une loi hyperbolique pour

atteindre une valeur limite quand tous les sites sont occupés :

[ligand lié] = [ligand lié]max . [L]/([Kd+[L]).

[ligand lié] et [ligand lié]max sont souvent appelées B et Bmax respectivement (B vient de l'anglais "bound" qui signifie lié) :

B = Bmax . [L]/(Kd+[L]).

La fonction de saturation de l'ensemble des sites est égale à la fonction de saturation de chacun des sites. On définit aussi V, le nombre moyen de

sites occupés par protéine : V = [sites occupés]/[Pt] = n [L]/(Kd+[L]) = n ý.


c) Fixations spécifiques et non spécifiques :

Une fixation non spécifique est observée en général lorsque l'on étudie la fixation de ligands sur des préparations membraneuse, est définie comme une

fixation sur des sites très nombreux mais de très mauvaises affinité pour le ligand. Elle s'oppose à la fixation spécifique, qui a lieu sur un nombre limité de sites et

avec une bien meilleure affinité.La constante de dissociation des sites non spécifiques est très grande devant la

concentration de ligand libre utilisée. Avec cette approximation, la concentration du ligand aux sites non spécifiques est proportionnelle à la concentration de ligand

libre utilisé, avec le facteur de proportionnalité Knon spécifique.

Lorsque l'on est en présence de fixation non spécifique et de fixation spécifique sur une seule classe de sites, la courbe de la concentration de ligand lié en fonction de la concentration de ligand libre est la somme d'une droite et d'une hyperbole :

[ligand lié] = Bmax [L]/(Kd+[L]) + Knon spécifique [L].


•L'évaluation de la fixation non spécifique se fait le plus souvent en utilisant, outre le ligand radioactif* qui se fixe avec une bonne affinité sur les sites

spécifiques étudiés, un ligand non radioactif qui lui, aussi, se fixe avec une bonne affinité sur les sites spécifiques et avec une très mauvaise affinité sur les

sites non spécifiques.Lorsqu'il est utilisé en large excès devant le ligand radioactif, son effet

inhibiteur compétitif se manifeste seulement vis-à-vis des sites spécifiques. Protéine + [Δ*] [Δ] en large excès …………. mesure la fixation non

spécifique par la R*.

•Lorsque le ligand R* (Δ*) est utilisé seul, la fixation observée est égale à l'ensemble de fixation spécifique et non spécifique : on l'appelle fixation

totale.


Expériences de saturation de la liaison à l'équilibre - Notions de Kd et de Bmax : Principe:

Il s'agit de mesurer la liaison spécifique à l'équilibre, lors de l'incubation de concentrations croissantes de ligand radioactif (par ex. : 10-12 à 10-5 M), avec une quantité fixe de récepteur (par exemple : 100000 cellules entières exprimant des

récepteurs, ou bien 10 ng d'unepréparationdemembranescellulaires

•Lorsque la fixation de ligand R* est mesurée en présence du compétiteur non R* (Δ) en excès, la fixation spécifique du ligand R* devient négligeable à cause de

l'effet de compétition (on dit que le ligand compétiteur "déplace" le ligand R*). La fixation du ligand R* que l'on mesure est alors égale à la seule fixation non

spécifique. Fixation spécifique = fixation totale - fixation non spécifique


II Analyse des données expérimentales :

Lorsque les concentrations de ligand lié sont connues pour différentes concentrations de ligand libre, l'analyse mathématique permet de mettre en

évidence que l'on est en présence d'une ou plusieurs lois hyperboliques (et donc que l'interaction implique l'existence d'un ou de plusieurs équilibres ) et de

déterminer le nombre de sites de fixation et leurs constantes de dissociation.

Le nombre de sites de fixation se déduit de la concentration maximale de ligand que l'on peut lier (tous les sites étant alors occupés).

Si [Pt] = la concentration de protéine, est connue, on peut déterminer n, le nombre de sites de fixation par molécule de protéine. Mais on peut aussi bien déterminer

un nombre de sites par cellule, ou de moles de ligand lié par mg de protéine.


1) Sites équivalents :La concentration de ligand lié suit une loi hyperbolique en fonction de la

concentration de ligand libre. Plusieurs méthodes d'analyse des hyperboles existent.

Les méthodes de linéarisation permettent de vérifier graphiquement que l'on est en présence d'une simple hyperbole, et de déterminer les paramètres qui la

caractérisent.

Les deux représentations les plus couramment utilisées ont été décrites initialement pour lineariser l'expression de ([ligand lié]/[Pt]) en fonction de [L] :- Représentation de Klotz : 1/V = 1/n +(1/n Kd/[L]).-Représentation de Scatchard : V/[L] = n/Kd - V/Kd.

Tout paramètre proportionnel à V peut être utilisé dans ces représentations, la signification des intersections avec les axes des abscisses et des ordonnées étant modifiée. En particulier, on utilise souvent la représentation de " Scatchard" pour linéariser l'équation de [ligand lié ]en fonction de [L] :

[ligand lié]/[L] = [ligand lié]max/Kd - [ligand lié]/Kd.


2) Sites indépendants et non équivalents :

La représentation de Scatchard n'est plus linéaire, et il est très difficile de déterminer les valeurs de Bmaxi et de Kdi par des méthodes graphiques.

Le principe d'une telle analyse peut se résumer ainsi : pour une concentration donnée de ligand libre, le ligand lié est la somme du ligand lié à chaque classe de

sites.

Dans la représentation de Scatchard, les données correspondent à la fixation sur une classe de sites s'alignent sur une droite caractéristique de la linéarisation de l'hyperbole. L'ensemble des points correspondent à une même concentration de

ligand libre [L] et à différentes valeurs de [ligand lié] s'alignent, quant à eux, sur une droite passant par l'origine et de pente 1/[L]; déterminer à partir d'une

représentation de Scatchard non linéaire, les paramètres de fixation sur chaque classe de sites consiste donc à définir les droites correspondent à chacune de ces

classes qui permettent de retrouver la courbe originale lorsque l'on calcule, pour chaque concentration de ligand libre, la somme des concentrations de ligand lié à

chaque classe de sites.


Incubation ligand radioactif (L*) avec le récepteur R (par ex sur des mb)• Séparation : on élimine le marqueur libre par filtration• Mesure radioactivité du marqueur lié

binding »Principe :Marquer les récepteurs par un ligand radioactif et étudier la cinétique de la réaction ligand - récepteur en suivant la quantité de ligand radioactif fixé.Réalisé sur des préparations subcellulaires (par ex. les membranes).


Méthode de « binding »on mesure la fixation totale :spécifique = sur le récepteurnon spécifique = sur d’autres composants membranairesOn utilise un ligand froid en excès qui bloque l’accès aux sites spécifiques - mais pas aux non spécifiques - pour le ligand marqué :


Figure1 :représentation de la liaison en fonction de la concentration initiale en ligand

Détermination de la fixation spécifique par méthode de saturation :1. Préparation riche en récepteurs + radioligand en concentration croissante :liaison totale2. Préparation riche en récepteurs + ligand froid en surcharge + radioligand enconcentration croissante : liaison non spécifique3. On déduit la liaison spécifique


Figure 2 : représentation de la liaison spécifique en fonction du log de la concentration initiale en ligand.

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[RL] = [RL*] = concentration de radioligand lié de manière spécifique •[L] = [L*] = concentration de radioligand libre.

Ainsi, la représentation de [RL] (axe des ordonnées, y) en fonction de [L] (axe des abcisses, x) est une hyperbole

Figure 3 : [RL] = f ( [L] )


QuantifificationRelation de Scatchard : permet une détermination plus précise de KD et BmaxOrdonnée : ligand lié (L*R) / ligand libre (L*) Abscisse : ligand lié (L*R)KD = (L*x (Bmax - L*R))/L*RL*R = (L*x (Bmax - L*R))/ KD en développant et en simplifiant :L*R = (Bmax x L*) / (L*+ KD) en réarrangeant :L*R / L* = (-1 / KD) L*R + (Bmax / KD)soit lié / libre = (-1 / KD) lié + (Bmax / KD) Y = ax + b

Figure 4: Représentation selon Scatchard : B/F = f (B).

Unités :•Axe des x et des y : même unité : cpm ; nombre de sites / cellule ; fmol / mg de protéines. •Le Kd s'exprime en M (mol / l), souvent en nM ou pM. •Le Bmax s'exprime en nombre de sites de liaison/cellule ou en fmol/mg de protéines.


Expériences de déplacement de la liaison à l'équilibre - Notions d'IC50 et de Ki :

Principe :

C'est la mesure de la liaison spécifique à l'équilibre, d'une concentration donnée (en général égale au Kd) en ligand radiomarqué en présence d'une concentration variable et croissante de ligand froid (par ex. : 10-12 à 10-5 M). Le ligand froid entre en compétition avec le ligand radioactif pour sa liaison au récepteur, c'est pourquoi on peut parler de compétition de la liaison à l'équilibre •Cette technique permet de démontrer qu'un ligand froid, se lie à un récepteur. •d'étudier la liaison d'un ligand de faible affinité pour un récepteur (il est plus facile de disposer d'un ligand froid en grande quantité, que d'un ligand radiomarqué)


Figure 5: Représentation de la liaison totale en fonction du log de la concentration en ligand compétiteur froid.

Axe des y : cpm ; nombre de sites / cellule ; fmol / mg de protéines. NB : la liaison totale n'est pas égale au Bmax car la concentration en radioligand n'est pas saturante.


Expériences de compétition de la liaison, à l'équilibre ( IC50 , Ki ) :

Figure 6: Représentation de la liaison spécifique en fonction du log de la concentration en ligand compétiteur froid.

•100 % : liaison spécifique en l'absence de compétiteur froid. •50 % : concentration en compétiteur froid qui déplace 50 % de la liaison

spécifique en ligand radiomarqué ( = IC50). •0 % : liaison spécifique en présence d'un excès de compétiteur froid.


Equation de Cheng et Prusoff :

Cheng et Prusoff ont déterminé en 1973 la relation qu'il existe entre le Kd, le Ki et l'IC50

•Ki = constante de dissociation à l'équilibre pour le compétiteur froid.•Kd = constante de dissociation à l'équilibre pour le ligand radiomarqué (affinité).

•[L] = [L*] = concentration de radioligand libre. Kd représente donc bien la concentration en compétiteur froid qui se lie à 50

% des sites récepteurs


III- Approches expérimentales :

•Mesure des concentrations de ligand lié et de ligand libre :La concentration des sites de fixation demande en général la mesure des

concentrations de ligand lié et de ligand libre. Plusieurs approches expérimentales sont possibles: elles utilisent en général la séparation physique

du ligand libre et du ligand lié à la protéine.Ainsi lorsque l'on étudie la fixation d'un ligand sur des protéines

membraneuse, on peut centrifuger (ou filtrer) le mélange. Le ligand libre se retrouve dans le surnageant (ou le filtrat), le ligand lié dans le culot (ou le

filtre).Si l'on travaille avec des protéines solubles, et que l'on étudie la fixation de

petits ligands, on peut utiliser la filtration sur tamis moléculaire ou la dialyse à l'équilibre.

•La filtration sur une colonne de tamis moléculaire utilise les différences de migration des grosses molécules (la protéine avec ou sans ligand lié) et des

petites molécules (le ligand libre).


•Dans le cas de la dialyse à l'équilibre, le ligand libre est capable de diffuser librement à travers la membrane de dialyse, alors que ligand lié à la protéine

ne peut pas traverser la membrane. Une variante de cette méthode est la mesure de la vitesse de dialyse à travers une membrane: cette vitesse est

proportionnelle à la [ligand libre ] dans la chambre de dialyse.

•La détermination de la [ligand lié] et de [ligand libre] peut se faire indirectement, en étudiant un paramètre expérimental qui varie lorsque le

ligand passe de l'état libre à l'état lié.

Exemple: la fluorescence d'un coenzyme libre peut être comparée à la fluorescence de ce coenzyme lorsqu'il est en présence d'une concentration saturante d'apoenzyme. Connaissant ces deux paramètres, on peut, pour

différentes concentrations d'apoenzyme calculer la concentration de coenzyme libre et de coenzyme lié.

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