Année Universitaire 2007-2008

UNIVERSITE TOULOUSE III- PAUL SABATIER

THESE

En vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE

Délivré par l’Université Toulouse III- Paul Sabatier

Discipline: Pharmacie Clinique

Présentée et soutenue

Par

Tarek Mohamed Mohamed MOUSTAFA

Le 23 Octobre 2007

Microencapsulation de cellules chromaffines bovines dans le traitement des

douleurs chroniques rebelles : Etude de faisabilité in vitro et in vivo DIRECTEUR DE THESE: Pr. Brigitte SALLERIN

(Professeur de pharmacie clinique)

Co-DIRECTUR DE THESE: Dr. Sophie GIROD-FULLANA

JURY

Monsieur le Professeur Yves LAZORTHES Président

Monsieur le Professeur Hatem FESSI Rapporteur

Madame le Professeur Marie-Claude SAUX Rapporteur

Madame le Professeur Brigitte SALLERIN Directeur de thèse

Laboratoire de Thérapie Cellulaire et Génique des Douleurs Chroniques (EA 3039) Faculté de Médecine Toulouse Rangueil

133 route de Narbonne-31062 Toulouse Cedex

i

Je dédie ce travail,

A l’esprit de ma mère.

A ma femme qui m’a beaucoup soutenu toutes ses années.

A mes enfants Omar, Samya et Mohamed.

A mon père, mes frères et mes sœurs.

A tous mes amis égyptiens et français.

A tout le monde dans le laboratoire de thérapie cellulaire, d’histologie

et de pharmacie galénique. Un grand merci pour votre aide précieuse, votre gentillesse

et votre patience sans limite, ce travail est le vôtre….

ii

REMERCIEMENTS

A la fin de ce travail, je tiens à exprimer ma plus profonde reconnaissance à:

Monsieur le Professeur YEVES. LAZORTHES, vous m’avez fait l’immense honneur de m’accepter en doctorat d’université dans votre laboratoire il y a quatre ans. Je vous remercie pour votre soutien et vos précieux conseils qui m’ont apporté motivation et encouragement durant la préparation de cette thèse. Monsieur, veuillez trouver dans ce travail l’expression de ma plus profonde reconnaissance et de mon plus profond respect.

Madame le Professeur Brigitte SALLERIN qui a dirigé et suivi ces travaux de

recherche. Je vous remercie pour votre aide précieuse, votre gentillesse, votre patience et votre soutien durant ces nombreuses années. Je vous remercie d’avoir accepté de diriger ce travail, soyez assurée de tout mon respect et ma reconnaissance.

Madame le Docteur Sophie GIROD FULLANA qui a également dirigé et suivi ces

travaux. Je vous remercie chaleureusement de tout l’aide que vous avez apporté et de m’avoir permis d’acquérir de nombreuses connaissances scientifiques dans le domaine de la pharmacie galénique. Veuillez trouver ici le témoignage de ma gratitude.

Monsieur le Professeur F. RODRIGUEZ, vous m’avez accueilli au sein de votre laboratoire à plusieurs reprises et je vous remercie sincèrement. Durant ce travail j’ai pu apprécier votre gentillesse, votre humanité et vos conseils avisés. Veuillez trouver ici l’assurance de ma respectueuse admiration. Je remercie également le Professeur H. FESSI et le Professeur MC SAUX pour leur gentillesse et pour m’avoir fait l’honneur d’évaluer ce travail en qualité de rapporteurs. Je vous exprime ma plus haute considération. Je tiens à exprimer mes remerciements à Mme le Docteur S. JOZAN, à Mme le Docteur L. WEISS, à Mme le docteur S. CHATELIN, à Mme le Docteur R. LI et à Monsieur le Docteur JC. SOL pour leur aide et leur soutien constant et amical tout au long de ces années. Toute ma profonde gratitude à Mme F. TORTOSA qui n’a cessé de m’aider et me soutenir pendant ma recherche. Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à Monsieur le Professeur J. JOACHIM qui n’a pas cessé à m’aider pendant mon séjour en France. Bien sûr, sont associés à ces remerciements tous les autres membres du laboratoire de thérapie cellulaire, d’histologie et de pharmacie galénique, notamment, mon cher ami Robert, Viviane, Brigitte, Renan, , Sandrine et Sabine qui n’ont cessé de m’encourager et me soutenir pendant mon séjour en France. J’exprime également ma profonde gratitude à Monsieur B. PAYRE et ma profonde reconnaissance aux membres de l’abattoir à Montauban qui nous ont fourni les glandes surrénales. Merci enfin à mes amis, notamment Dr. Talal ELSAATY, Dr. Hany GAMAL, Dr. Mohamed GADELRAB, Dr. Hisham KOTB, Nour-ELDIN, M et Mme EL-ARABY et aux Commissions d’Education et de Financement d’Egypte qui, ont financé mes études en France, ainsi qu’au bureau culturel de l’ambassade égyptienne à Paris.

iii

SOMMAIRE

1

SOMMAIRE p 1

RESUME p 4 INTRODUCTION p 6

RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE p 9

1 -La glande surrénale p 10

1.1- Rappel anatomique et histologique

1.2- les messagers biologiques

1.3- les produits sécrétés et les mécanismes de sécrétion

2- Stratégie de greffe des cellules chromaffines p 16

3-Le concept d’immuno-isolement et le biomatériau p 19

4- Macroencapsulation versus microencapsulation p 21

5- Alginate et encapsulation p 25

MATÉRIEL ET METHODES p 30

1- Culture et caractérisation des cellules chromaffines bovines in vitro p 31

1.1- Isolement et purification des cellules chromaffines bovines p 31

1.2- Immuno-cytochimie p 34

2- Microencapsulation des cellules chromaffines bovines p 35

-Principe de formation des microcapsules p 35

-Microencapsulation en utilisant une seringue équipée d’une aiguille de 600 µm p 37

-Microencapsulation en utilisant un encapsulateur équipée d’une buse de 300 µm p 37

3- Etude physicochimique des microcapsules p 39

A- Observation en microscopie optique p 39

B- Observation en microscopie électronique à balayage p 39

C- Estimation de la répartition granulométrique des microcapsules p 39

D- Test de résistance mécanique des microcapsules p 39 *Texturométrie (Capsules fabriquées à l’aide d’une seringue et une aiguille de 600 µm) *Passage des capsules via cathéter et manchons de différentes tailles

(Capsules fabriquées à l’aide d’un encapsulateur et une buse de 300 µm)

E- Etude de la perméabilité membranaire (Spectroscopie UV/Visible) p 41

4- Etude in vitro des cellules encapsulées et adhérentes p 42

A- Observation de la viabilité cellulaire en microscopie confocale p 42

B- Western Blot p 42

C- Immuno-histochimie p 43

D- Dosage des catécholamines par HPLC p 44

5- Etude in vivo p 45

5.1- Animaux p 45

5.2- Greffe des cellules microencapsulées et des microcapsules vides p 45

5.2.1-Greffe au niveau lombaire

5.2.2-Greffe au niveau cervical

5.3- Perfusion intra-cardiaque et fixation des animaux p 46

5.4- Prélèvement de la moelle épinière p 46

5.5- Préparation des coupes histologiques

2

5.6- Etude immunohistochimique: p 47

Observation de la viabilité des cellules microencapsulées implantées chez le rat p 47

RESULTATS p 48

1- Caractérisation des cellules chromaffines bovines in vitro p 49

1.1- Aspect morphologique des cellules chromaffines bovines en culture p 49

1.2- Mise en évidence de la tyrosine hydroxlase (TH) et de la met-enképhaline p 50

2-Faisabilité de l’encapsulation des cellules chromaffines bovines dans des capsules APA p 51

2.1- Caractéristiques physicochimiques des microcapsules p 51

A- Observations microscopiques p 51

B- Stabilité et résistance mécanique p 52

C- Perméabilité membranaire p 53

2.2-Viabilité et fonctionnalité des cellules encapsulées in vitro p 55

A- Viabilité cellulaire p 55

B- Immuno-détection de la tyrosine hydroxlase (TH) p 57

C- Mise en évidence de la tyrosine hydroxlase p 58

D- Sécrétion des catécholamines p 59

3- Faisabilité de l’implantation intra-thécale de cellules chromaffines bovine encapsulées

dans des microcapsules de petite taille p 61

3.1- Caractéristiques physicochimiques des microcapsules p 61

A- Aspect morphologique p 61

B- Répartition granulométrique des microcapsules p 62

C- Résistance mécanique p 63

3.2-Viabilité et fonctionnalité des cellules encapsulées in vitro p 66

A- Viabilité cellulaire p 66

B- Immuno-détection de la tyrosine hydroxlase (TH) p 67

C- Mise en évidence des marqueurs de cellules chromaffines p 68

3.3- Etude in vivo p 69

A- Observation macroscopique et microscopique p 69

B- Réactions vis-à-vis des microcapsules p 69

C- Viabilité et fonctionnalité des cellules microencapsulées implantées p 71

DISCUSSION p 72

CONCLUSION ET PERSPECTIVES p 83

BIBLIOGRAPHIE p 87

PUBLICATION p 100

3

RESUME

4

Malgré les avancées réalisées ces dernières années concernant la connaissance des mécanismes physiopathologiques des douleurs neuropathiques, celles-ci demeurent difficiles à traiter. Ceci souligne l’intérêt potentiel d’une approche biologique telle que la greffe intra-thécale (I.Th) des cellules chromaffines médullo-surrénaliennes qui sécrètent des substances aux propriétés analgésiques. Néanmoins, les transplants xénogéniques dégénèrent rapidement dans le système nerveux central (SNC) si un traitement immunosuppresseur de court terme n’est pas mis en route. Dans ce contexte, la technique d’immuno-isolement via l’encapsulation cellulaire a été proposée.

Dans ce travail, nous rapportons l’isolement, la purification et l’encapsulation des

cellules chromaffines bovines. Après une phase de choix de type d’encapsulation et de mise au point des conditions d’encapsulation de ces cellules dans des microcapsules de type alginate /poly-L-lysine/ alginate (APA), nous avons validé la faisabilité de l’utilisation d’une telle technique et d’une telle formulation pour ce type de cellules. Pour cela nous avons réalisé une étude avec deux tailles différentes de microcapsules (diamètre moyen de 1,2 mm et de 600 µm), ceci afin d’évaluer les caractéristiques physicochimiques des microcapsules : stabilité dans le temps, résistance mécanique et perméabilité membranaire.

Nous avons mené une étude in vitro visant à évaluer d’une part la viabilité des

cellules chromaffines encapsulées et d’autre part leur fonctionnalité par analyse de l’expression de la tyrosine hydroxlase, de la met-enképhaline et de la dopamine-ß-hydroxlase et par évaluation cinétique des sécrétions de catécholamines. Enfin, une étude in vivo a été effectuée en implantant les cellules encapsulées dans les microcapsules de petite taille pour évaluer la faisabilité de l’implantation, la viabilité des cellules microencapsulées et la réponse immunitaire de l’hôte vis-à-vis de ces microcapsules.

Les paramètres de fabrication que nous avons utilisé dans le cadre de

l’encapsulation des cellules chromaffines permettent d’obtenir des microcapsules sphériques, stables dans le temps et résistantes aux pressions subies lors de l’implantation in vivo. Elles présentent une membrane semi-perméable qui représente une barrière vis-à-vis du système immunitaire. En parallèle, l’étude in vitro sur les cellules microencapsulées montre que ces cellules gardent leur viabilité et leur fonctionnalité au cours de l’étude en exprimant tous les marqueurs étudiés. Une sécrétion basale et stimulée de catécholamines est également observée.

L’étude in vivo effectuée chez le rat montre que les cellules chromaffines

microencapsulées maintiennent leur viabilité et leur fonctionnalité trois semaines après leur implantation en exprimant la tyrosine hydroxlase et la met-enképhaline. De plus, cette étude montre également que l’hôte ne développe pas de réaction inflammatoire vis-à-vis des microcapsules.

En conclusion la microencapsulation des cellules chromaffines bovine dans

des microcapsules formées de système alginate/PLL/alginate (APA) n’altère en rien leur viabilité, leur fonctionnalité et leur intégrité pharmacologique. Ainsi ces cellules microencapsulées pourraient être implantées pour des applications in vivo sans traitement immunosuppresseur. Cette technique semble prometteuse, cependant d’autres investigations seraient encore nécessaires (étude pré-clinique plus large, utilisation d’autre polymère,…..) avant de les utiliser en clinique humaine.

5

INTRODUCTION

6

Les avancées pharmacologiques réalisées au cours de ces dernières années (formes

galéniques à libération prolongée de morphine, nouveaux agonistes opioïdes) ont

considérablement amélioré la prise en charge des douleurs chroniques, notamment d’origine

cancéreuse. Dans la majorité des cas, ces douleurs répondent bien aux traitements classiques

tels que la morphine systémique (Schug et al. 1992). Cependant, les limites actuelles de ce

traitement (tolérance, survenue d’effets secondaires indésirables), représentent toujours un

challenge face à cette stratégie thérapeutique. Par contre, les douleurs neuropathiques

d’origine périphérique et/ou centrale qui sont des syndromes douloureux hétérogènes

constituent encore un véritable problème de santé publique par leur fréquence et leurs

conséquences médico-sociales. Bien que les douleurs neuropathiques aient bénéficié ces

dernières années d’une meilleure compréhension de leurs mécanismes physiopathologiques,

elles sont en règle générale réfractaires aux analgésiques habituels. Les anti-inflammatoires

non stéroïdiens (AINS) et les opioїdes sont beaucoup moins efficaces dans le traitement de

ces douleurs et doivent être administrés aux doses plus élevées et par des voies plus invasives

(intra-thécale) pour montrer une efficacité thérapeutique (Kennedy 2007). L’efficacité de

médicaments spécifiques (antidépresseurs, antiépileptiques de nouvelle génération,

antagonistes des récepteurs NMDA…) a été vérifiée par des essais contrôlés notamment dans

certaines neuropathies périphériques. Cependant, un bon nombre de ces douleurs ne sont pas

soulagées, soit en raison de l’apparition d’effets indésirables qui conduisent à l’arrêt du

traitement, soit en raison d’une pharmaco-résistance (Sindrup et Jensen 1999 ; Jensen et

Baron 2003).

Ceci a conduit notre laboratoire à centrer sa stratégie de recherche vers la prise en

charge des douleurs neuropathiques par la thérapie cellulaire avec ses différents aspects. Le

concept de thérapie cellulaire dans le traitement de la douleur a été initié et développé par une

équipe américaine (Sagen et al.1986a, b). Des études pré-cliniques ont démontré que les

greffes médullo-surrénaliennes dans l’espace sous-arachnoïdien (I-Th) de modèles animaux

de douleur aigue ou chronique induisaient une analgésie significative (Sagen et al. 1986a, b).

Différentes études cliniques préliminaires non contrôlées ont confirmé cet effet analgésique

durable en corrélation avec une libération de met-enképhaline et de catécholamines dans le

liquide cérébro-spinal (LCS), après allogreffe humaine de patients cancéreux en phase

terminale (Sagen et al. 1993 ; Winnie et al. 1993 ; Lazorthes et al. 1995).

Ces deux types de substances agissent directement sur les récepteurs opioїdes et α-

adrénergiques au niveau de la jonction radiculo-médullaire et réduisent de façon indépendante

et synergique la transmission du message nociceptif au niveau spinal (Sagen et al. 1991).

7

Plusieurs corrélations ont pu être obtenues, notamment entre le niveau de Met-

enképhaline sécrétée dans le LCS et l’effet analgésique et entre le volume de tissu transplanté

(Lazorthes et al. 1995).

Notre équipe a également effectué une étude clinique de Phase II (Lazorthes et al.

2000a). Cette étude a concerné 15 patients adultes atteints de cancer à un stade terminal,

souffrant de douleurs irréductibles, non contrôlées par la morphine systémique. Les résultats

obtenus ont confirmé que cette approche permettait de diminuer la quantité de morphine

utilisée et d’augmenter de façon durable l’efficacité analgésique. Mais cette étude a souligné

les limites de ce protocole : lourdeur de la préparation du greffon et pénurie de dons

d’organes. Afin de s’affranchir des limites liées aux allogreffes, la stratégie de notre

laboratoire s’est orientée vers l’utilisation des cellules chromaffines xénogéniques, provenant

d’un bétail consommable (bovin ou porc) qui rendrait la technique de transplantation I-Th de

cellules chromaffines plus facilement utilisable dans le traitement des douleurs chroniques

rebelles (Czech et sagen 1995).

Malgré le privilège immunologique du SNC, les transplants xénogéniques

dégénèrent rapidement dans le SNC si un traitement immunosuppresseur de courte durée n’est

pas mis en place (Ortega et al. 1992). Cependant, les effets indésirables et la toxicité à long

terme de la ciclosporine A suscitent de sérieuses réserves vis-à-vis d’une telle stratégie

thérapeutique. Le concept d’immuno-isolement, par encapsulation cellulaire, représente une

solution alternative au traitement immunosuppressif.

En 2004, une collaboration entre le laboratoire de « Thérapie Cellulaire et

Douleur » et le laboratoire du GEFSOD EA 2631 nous a permis de développer un projet de

microencapsulation de cellules chromaffines bovines (CCB) dans des microcapsules

d’alginate/PLL/alginate (APA). Le peu d’études concernant la microencapsulation de cellules

chromaffines et son effet sur les cellules encapsulées nous a conduit à fixer les objectifs

suivants :

- Objectif principal: valider la faisabilité de la technique de microencapsulation de

cellules chromaffines bovines dans le cadre de la thérapie cellulaire des douleurs

chroniques rebelles.

- Objectif secondaire: étudier la viabilité et la fonctionnalité de ces cellules

microencapsulées in vitro et in vivo chez le rat, et évaluer le réaction inflammatoire vis-

à-vis des microcapsules implantées.

Si nos résultats s’avéraient encourageants, nous pourrions appliquer cette

technologie à d’autres types cellulaires en thérapie.

8

RAPPEL

BIBLIOGRAPHIQUE

9

1 -La Glande Surrénale

1.1- Rappels anatomique et histologique

Les glandes surrénales sont des glandes endocrines situées le long de la partie

supérieure du bord interne du rein. Au nombre de deux, l’une droite et l’autre gauche, elles

ont en commun leur structure et leur situation à l’intérieur de la loge rénale (Bouchet et

Cuilleret 1991). Chaque glande est enveloppée d’une fine capsule fibreuse, faite d’un tissu de

soutien logé dans une atmosphère graisseuse. Elles pèsent de 4 à 6 g chez l’homme. La

surrénale est irriguée par trois groupes d’artères qui forment un plexus dans la capsule de la

glande, la médulla est irriguée par de petites artères, et elle est innervée par le nerf

splanchnique. Il s’agit de fibres sympathiques préganglionnaires, elles sont généralement

cholinergiques (Pocock et Richard 2004).

Figure (1) : Représentation schématique de la glande médullosurrénales

Du point de vue histologique, les glandes surrénales adultes sont composées

essentiellement de deux régions: la corticosurrénale périphérique et la médullosurrénale

centrale. Chez les mammifères, on observe de la superficie jusqu’au centre de la glande, les

couches suivantes :

A- Une capsule conjonctive, faite de fibroblastes et de fibres de collagène.

B- Le cortex, comprenant trois zones :

- la zone glomérulaire, à l’origine de la sécrétion des hormones minéralocorticoïde.

- la zone fasciculée, composée de travée de cellules très riches en lipides.

-la zone réticulée où les cellules sont organisées en travées autour des capillaires plexi-

formes.

10

C- La médulla, constituée de cordons richement vascularisés au sein desquels on observe

deux types de cellules chromaffines : les cellules libérant de l’adrénaline et les cellules

libérant de la noradrénaline.

L’importance de chaque type cellulaire dans la médullosurrénale dépend de

l’espèce et de l’âge de l’animal, la quantité de cellules sécrétant de l’adrénaline augmente

avec l’âge. Certaines espèces animales comme le hamster, ne possèdent que des cellules à

adrénaline alors que la glande de bœuf contient seulement 20 à 40 % de cellules à

noradrénaline. Chez l’homme, les cellules à adrénaline sont plus nombreuses (95 %), les

cellules à noradrénaline ne constituent que de petits îlots isolés (Benchimol et Cantin 1977). Il

faut noter qu’il existe un troisième type de cellules chromaffines nommé SGC "Small granule

chromaffin ou cellules chromaffines à petites granulations" dans la médullosurrénale. Ces

cellules ont été observées uniquement chez l’animal, d’abord chez les vertébrés inférieurs

(oiseaux, reptiles), puis ultérieurement chez divers mammifères (Tischler et De Lellis 1988).

Elles sont caractérisées par leurs granules de petite taille ressemblant à des vésicules

synaptiques (Kobayashi et al. 1978).

CapsuleZone glomérulée

Zone fasciculéeZone réticulée

Plexus capsulaire

Médullaire Veine centrale de la médullaire

Figure (2) : Schéma représentant les différentes zones et la vascularisation de la glande surrénale (D’après Wheater 1979).

11

1.2- Les messagers biologiques des cellules chromaffines

Chez les mammifères, plus de vingt neuropeptides différents ont été mis en

évidence dans les cellules chromaffines. Des molécules biologiquement actives ont été

colocalisées dans les granules chromaffines, comme par exemple le calcitonin gene related

peptide (CGRP), le neuropeptide Y, l’adrénaline et la noradrénaline, les chromogranines, la

substance P, la somatostatine, le peptide vaso-actif intestinal (VIP), les facteurs de croissance,

les interleukines, la galanine et la sérotonine (Saito et al. 1984 ; Kurmato et al. 1985 ; Kondo

1985 ; Laslop et al. 1989 ; Holfe et al. 1991; Holst et al. 1991 ; Unsicker et Stögbauer 1992 ;

Anderson et al. 1992).

La sécrétion de ces messagers biologiques à partir des granules chromaffines peut

être induite par stimulation des fibres préganglionnaires du nerf splanchnique ou stimulation

des récepteurs nicotiniques présents sur la membrane cytoplasmique cellulaire. Les messagers

seraient libérés dans l’espace extracellulaire et leur action pourrait s’exercer sur les cellules

chromaffines dont ils proviennent (sécrétion autocrine), sur les cellules voisines (sécrétion

paracrine) ou sur des cellules encore plus éloignées atteintes après leur passage dans la

circulation générale. De plus, la membrane du granule chromaffine est remarquable par le

grand nombre de protéines différentes qu’elle contient. Les techniques électrophorétiques

indiquent la présence de plus de 40 polypeptides différents (Abbs et Phillips 1980). Parmi les

fonctions assurées par ces protéines, certaines sont spécifiques des granules chromaffines.

Par exemple, la protéine majeure de la membrane granulaire est une enzyme de la

chaîne de synthèse des catécholamines, la dopamine–β-hydroxylase (DβH). On trouve

également une pompe à proton fournissant l’énergie nécessaire à l’accumulation et au

transport des catécholamines. Dans la matrice du granule, on trouve par ordre d’importance

des catécholamines, de l’ATP et d’autres nucléotides, de l’acide ascorbique et des ions

calcium en grande concentration (Benchimol et al. 1977). Les catécholamines et l’ATP sont

concentrées dans le granule grâce à l’énergie fournie par un gradient électrochimique formé

par l’ATPase membranaire. De plus, le granule chromaffine contient différentes protéines

dont la DβH, ainsi que toute une famille de protéines acides, les chromogranines, et un certain

nombre de peptides tel que les enképhalines et leurs précurseurs (Carmicheal et Winkler

1985).

1.3 -Les produits sécrétés et les mécanismes de sécrétion

Les produits de sécrétion peuvent être classés en trois grandes catégories : les

amines biogènes, les neuropeptides et les facteurs de croissance. Des molécules associées aux

granules de sécrétion, telles que les chromogranines, pourraient également être libérées avec

ces substances (Holfe et al. 1991).

12

La présence de peptides opioïdes a été mainte fois signalée dans la surrénale des

mammifères (rat, bovin) y compris chez l’homme, mais d’importantes différences

interspécifiques concernant leur distribution ont été mises en évidence (Pelto-Huikko 1989).

Il a été montré que, près d’un quart des cellules chromaffines du rat seraient

enképhalinergiques (Kondo 1985). Cet auteur rapporte une localisation également distribuée

entre les cellules adrénergiques et noradrénergiques (Kondo 1985). Les cellules chromaffines

contiennent des peptides de type opiacés (Denis et al. 1982). Il a été également démontré que

le principal site de stockage des enképhalines se situe dans les granules des cellules

chromaffines. Ces peptides opiacés sont libérés en même temps que les catécholamines,

lorsque les cellules sont stimulées (Viveros et Wilson 1983).

Les cellules chromaffines sont catécholaminergiques. Elles synthétisent toutes de

la noradrénaline et de la dopamine ; la majorité d’entre elles possèdent de la

phényléthanolamine-N-méthyl-transferase (PNMT) et synthétisent de l’adrénaline. La

présence de PNMT permet de distinguer les cellules chromaffines adrénergiques des cellules

noradrénergiques. Il existe des différences interspécifiques quant à la nature des cellules

chromaffines de l’adulte. Chez le cobaye et le lapin toutes les cellules sont noradrénergiques,

par contre, chez l’homme seulement 5 % des cellules sont noradrénergiques (Benchimol et

Cantin 1977). Les catécholamines et l’ATP sont concentrées dans le granule grâce à l’énergie

fournie par un gradient électrochimique formé par l’ATPase membranaire. Cette protéine

accumule des protons dans le granule chromaffine en hydrolysant l’ATP. Cette accumulation

acidifie fortement l’intérieur du granule créant ainsi un gradient électrochimique, c’est-à-dire

un gradient de pH et une différence de potentiel membranaire.

La synthèse des catécholamines au sein des cellules chromaffines se compose de

quatre étapes principales, la première étape concerne la transformation de la tyrosine en

dihydroxy phényle alanine (DOPA) par l’enzyme cytoplasmique, la tyrosine hydroxlase (TH)

qui représente l’enzyme limitante de la biosynthèse des catécholamines endogènes. La TH ne

se trouve qu’au niveau des neurones catécholaminergiques et des cellules chromaffines des

glandes surrénales. La TH est une enzyme saturable, son activité est modulée à court terme

par phosphorylation, assurée par la protéine kinase A, et par diverses protéines en réponse au

"Nerve Growth Factor"(NGF), au neuropeptides VIP et à la substance P. A long terme,

l’expression de la TH est aussi régulée négativement par la disponibilité en noradrénaline ou

en adrénaline (régulation de la transcription du gène de la TH) (Nagatsu et Stjarne 1998). La

deuxième étape, également cytoplasmique, concerne la décarboxylation de la DOPA en

dopamine par la DOPA décarboxylase.

13

La dopamine cytosolique est ensuite concentrée dans les granules de stockage par

l’intermédiaire de transporteurs vésiculaires commun à toutes les monoamines, le VMAT-1 et

2 (vesicular monoamine transporter). L’énergie nécessaire à ces transports est issue du

fonctionnement de l’ATPase vésiculaire ou V-ATPase. C’est une H+-ATPase qui assure un

courant entrant de protons, permettant l’entrée des neuromédiateurs dans les vésicules par le

transporteur vésiculaire.

Figure (3) : Schéma représentant la biosynthèse des catécholamines au sein de la cellule chromaffine.

La troisième étape a lieu à l’intérieur du compartiment granulaire et consiste en

une β-hydroxylation de la dopamine en noradrénaline par la dopamine-β-hydroxlase (DβH).

L’enzyme s’y trouve en partie, sous forme libre et en partie sous forme liée à la membrane

granulaire. L’étape finale consiste en une N-méthylation de la noradrénaline en adrénaline par

l’enzyme, phényléthanolamine-N-méthyl transférase (PNMT), enzyme cytoplasmique des

cellules chromaffines. La noradrénaline doit donc auparavant quitter les granules de stockage

(par diffusion) selon ce gradient de concentration et rejoindre le cytoplasme. L’adrénaline

cytosolique est ensuite concentrée dans les granules de stockage par les transporteurs

vésiculaires.

14

La cellule chromaffine stimulée libère ses produits de sécrétion par exocytose.

L’aspect morphologique ultrastructural de ce mécanisme est actuellement bien connu, il s’agit

d’une fusion de la membrane du granule avec la membrane plasmique, permettant la

continuité entre l’espace intra-vésiculaire et l’espace extracellulaire et donc le passage des

produits vers la circulation sanguine (Bader et al. 2002). La sécrétion est contrôlée par

différents types de récepteurs (cholinergiques, opiacés et adrénergiques) et par les canaux

ioniques. La cellule chromaffine possède des récepteurs nicotiniques et muscariniques.

L’activation des récepteurs nicotiniques produit une entrée de calcium du milieu

extracellulaire vers le cytoplasme de la cellule (Kao et Schneider 1986). Ceci induit la

libération des catécholamines stockées, ainsi qu’une augmentation du taux d’adénosine mono

phosphate cyclique (AMP) qui provoque une synthèse accrue des produits de sécrétion (Eiden

et al. 1984). Le rôle des récepteurs muscariniques est plus complexe car il dépend des espèces

animales étudiées. Certains auteurs parlent d’un rôle activateur, d’autres d’un rôle inhibiteur

(Kilpatrick et al. 1980). Elles possèdent également au niveau de la membrane plasmique des

récepteurs aux opiacés spécifiques qui auraient un rôle modulateur du niveau des récepteurs

nicotiniques (Castanas et al. 1984).

Plusieurs équipes ont ainsi pu montrer que certains peptides comme la dynorphine,

la β-endorphine et les enképhalines inhibent la sécrétion induite par la nicotine ou

l’acétylcholine dans les cellules chromaffine en culture (Livett et Boska 1984). Certaines

études mettent en évidence la présence de récepteurs α et β adrénergiques au niveau de la

membrane plasmique des cellules chromaffines. Il semblerait que les récepteurs de type α

inhibent la sécrétion des catécholamines en réponse à l’acétylcholine, alors que les récepteurs

de type β auraient un effet stimulant (Greenberg et Zinder 1982 ; Sakurai et al. 1983).

L’activation du récepteur nicotinique par l’acétylcholine provoque l’ouverture

d’un canal associé à l’entrée de calcium et de sodium dans la cellule. Ceci entraîne alors une

dépolarisation de la membrane plasmique et l’ouverture de deux types de canaux voltage

dépendant (canal sodium et canal calcium). L’élévation de la concentration intracellulaire de

calcium déclenche les mécanismes de sécrétion et active un canal potassium. Ce canal

potassium, en permettant la sortie du potassium intracellulaire, repolarise la membrane

plasmique et entraîne la fermeture des canaux voltage dépendants (Marty 1981). Le potentiel

de repos de la cellule est maintenue par une ATPase Na/K dépendante. Enfin, il faut encore

noter la présence, au niveau de la membrane plasmique, d’un canal chlore couplé à un

récepteur de type GABAergique (Bormann et Clapham 1985). Ces courants chlores activés

par le GABA sont hyperpolarisants et peuvent, de ce fait, avoir un effet inhibiteur sur la

sécrétion des catécholamines induite par l’acétylcholine.

15

2- Stratégie de greffe des cellules chromaffines

Le principe est de transplanter des cellules chromaffines dans l’espace sous-

arachnoïdien péri-médullaire pour qu’elles se comportent comme de véritables mini pompes

biologiques (Czech et Sagen 1995), en libérant de manière continue dans le système nerveux

central des substances neuroactives analgésiques telles que des peptides opioïdes et des

catécholamines (Wilson et al. 1982).

Figure (4) : Schéma représentant la stratégie de greffe des Cellules chromaffines dans l’espace sous arachnoïdien.

Ces produits agiraient de façon indépendante, mais également synergique au

niveau des récepteurs opioïdes et α-adrénergiques de la jonction radiculo-médulaire en

bloquant la transmission du message nociceptif. Ces cellules, par l’intermédiaire de leurs

récepteurs nicotiniques, pourraient être stimulées de manière à accroître la libération de ces

neuropeptides aux propriétés analgésiques (Sagen et Pappas 1986 ; Sagen et Kemmler 1989 ;

Sagen et al. 1991 ; Yakash et Malmberg 1994). Les cellules chromaffines sécrètent également

de nombreux facteurs neurotrophiques, impliqués dans l’hyperexcitabilité et la survie des

neurones de la corne postérieure lors de lésions périphériques nerveuse ou inflammatoire

(Coupland 1989 ; Unsicker 1993).

16

Différentes études pré-cliniques ont apporté des nouvelles données supportant

l’utilisation de la greffe de cellules chromaffines comme une thérapie potentiellement efficace

dans le traitement de la douleur chronique (Sagen et al. 1990 ; Czech et Sagen 1995 ; Wang et

Sagen 1995 ; Yu et al. 1998a, b; Sol et al. 2004). Dans plusieurs modèles de douleur aiguë ou

chronique, les greffes de tissu médullosurrénalien ont induit chez l’animal, une analgésie

durable sans neurotoxicité ni phénomènes de tolérance (Wang et Sagen 1995). Ces études ont

montré que la transplantation de cellules chromaffines dans l’espace sous-arachnoïdien, peut

considérablement réduire la sensibilité à la douleur dans des modèles expérimentaux de

douleur chronique bien établis tels que le rat arthritique (Sagen et al. 1986 et 1991 ; Wang et

Sagen 1995). Il a été également montré que l’effet analgésique est dû à la libération

simultanée de catécholamines et de peptides opioïdes (Sagen et Kemmler 1989 ; Sagen et

Pappas 1990 ; Sagen et al. 1991).

Ces bases expérimentales ont permis d’envisager différents essais cliniques

d’allogreffe chez des patients présentant des douleurs chroniques. La première application de

ces propriétés cellulaires des cellules chromaffines pour contrôler des douleurs cancéreuses

chez l’homme a été rapportée par Vaquero (Vaquero et al. 1989).

Les résultats de cette étude initiale incluant deux patients avec un suivi limité (16

jours à 4 semaines), ont été considérés comme transitoires et non satisfaisants. Dans la

seconde série de 5 patients correspondant à l’étude préliminaire de l’Université de l’Illinois,

les résultats étaient plus significatifs avec une amélioration des scores de la douleur et une

réduction de la consommation de morphine chez quatre des patients (Sagen et al.1993 ;

Winnie et al. 1993).

Ces succès ont initié d’autres études cliniques prometteuses (Lazorthes et al.

2000a). La procédure d’allogreffe de cellules chromaffines humaines bien que très

prometteuse dans le traitement des douleurs cancéreuses essentiellement, présente des limites

qui excluent leur généralisation. Afin d’obtenir une efficacité analgésique post-greffe, il est

impératif que le tissu médullosurrénalien prélevé conserve des qualités fonctionnelles et soit

en en quantité suffisante. Ceci nous amène au problème de faible disponibilité de tissu

humain (dons d’organes) et par conséquent à l’approvisionnement en tissu médullosurrénalien

transplantable. L’utilisation de sources cellulaires alternatives telles que les cellules

chromaffines xénogéniques provenant du bétail consommable (bovin ou porc), rendrait la

technique de transplantation intra-thécale de cellules chromaffines largement utilisable dans le

traitement des douleurs chroniques rebelles (Czeck et al. 1995 ; Hentall et Sagen 2000).

17

Depuis les travaux initiaux de Sagen en 1986 (Sagen et al. 1986a, b), les cellules

chromaffines bovines représentent le modèle le plus souvent utilisé en thérapie cellulaire de la

douleur. Les cellules chromaffines bovines bien caractérisées en culture, présentent l’avantage

de pouvoir être facilement isolées et purifiées à partir de glandes animales, et sont aussi

capables de survivre pendant des périodes très prolongées dans le système nerveux central du

rat après un traitement court immunosuppresseur (Sagen et al. 1990).

Les études pré-cliniques, utilisant les cellules xénogéniques bovines, ont

cependant donné des résultats contradictoires. Les premières études ont montré que les

cellules en suspension greffées dans l’espace intra-thécal du rat, produisaient une activité

analgésique durable aussi bien dans des modèles de nociception (douleur aiguë) que dans des

douleurs neuropathiques (Hama et Sagen 1994 ; Sagen et Pappas 1987 ; Sagen et Pappas

1988). Ces résultats ont été récemment remis en question par quelques équipes. En effet, ces

équipes n’ont pas retrouvé d’activité analgésique chez le rat après greffe intra-thécale des

cellules allogéniques ou xénogéniques bovines dans des modèles de douleur aiguë et subaiguë

(Linder et al. 2000 ; Gulwadi et al. 2002).

Malgré le privilège immunologique du système nerveux central (Winder et

Brundin 1988), les transplants xénogéniques dégénèrent rapidement dans le SNC (Tkakzuk et

al. 2000) si un traitement immunosuppresseur de courte durée n’est pas mis en place (Ortega

et al. 1992). Mais, les effets indésirables, notamment digestifs, et la toxicité à long terme de la

ciclosporine (hépatotoxicité, néphrotoxicité,…) suscitent de sérieuse réserves vis-à-vis d’une

telle stratégie thérapeutique, tandis que les risques de rejet immunitaire demeure en outre

importants. D’où l’idée d’apposer un immuno-isolement sous forme d’une membrane

enveloppant les cellules, c’est-à-dire la bio-encapsulation (Lim et Sun 1980).

18

3- Le concept d’immuno-isolement et le biomatériau Afin d’éviter le traitement immunosuppresseur, la technique d’encapsulation des

cellules vivantes a été proposée (Lim et Sun 1980). Les capsules sont formées à partir d’un ou

plusieurs polymère(s) biocompatible(s) composant une membrane semi-perméable qui permet

une diffusion dans les deux sens de substances de faible poids moléculaire telles que les

nutriments, les électrolytes, l’oxygène et les facteurs neurotrophiques de l’hôte. En même

temps les membranes jouent le rôle de barrière vis-à-vis des molécules de gros poids

moléculaire telles que les immunoglobulines, les facteurs lytiques du complément ou les

cellules du système immunitaire (Lim et Sun 1980 ; Aebischer et al. 1988 ; Basta et al. 2004).

Figure (5) : Concept d’immuno-isolement (D’après American Society of Pain : ASP). Bien évidement en plus de ce concept d’immuno-isolement, il est nécessaire que

les biomatériaux qui permettront l’encapsulation cellulaire soient biocompatibles, tolérés, non

toxique et non carcinogène (Thomas 1993 ; De Vos et al. 1993 ; Li 1998). Un biomatériau est

un matériau inerte, susceptible d’être implanté chez l’homme ou en tout cas d’être exposé à

ses fluides biologiques (Peronneau 1981). Les biomatériaux sont des polymères, des

céramiques, des matériaux naturels. La biocompatibilité d’un biomatériau est définie par sa

capacité d’interagir avec l’organisme hôte, entraînant une réponse appropriée de ce dernier

dans une application spécifique (William 1987). Les biomatériaux doivent répondre à des

normes précises pour une application définie. Ces normes rendent compte des réactions entre

le biomatériau et les tissus et sont définies par l’Association Française de Normalisation

(AFNOR). Leur vérification implique la réalisation d’études concernant la toxicité sur culture

cellulaire, l’irritation de la peau, l’implantation à long terme (tolérance), la carcinogène, la

compatibilité sanguine et la sécurité (test des pyrogènes).

19

La réaction de l’organisme à la présence d’une capsule (polymère) se traduit par la

formation d’une coque fibreuse qui modifie la cinétique des échanges entre les deux et peut

provoquer l’échec de la greffe (De Vos et al. 2002 ; Darrabie et al. 2005). La biocompatibilité

d’un biomatériau est évaluée par les caractéristiques de cette coque fibreuse qui entoure la

membrane de la capsule : elle est composée de macrophages, de lymphocytes, de fibroblastes,

de cellules géantes multinuclées (Okada et al. 1997, Strand et al. 2001). ). Egalement, il a été

montré que des facteurs d’adhésion cellulaire et de nombreuses protéines tels que la

fibronectine, la transferrine et les protéines du complément adhérent à la surface des

microcapsules implantées en provoquant leur dégradation protéolytique (Van Raamsdonk et

al. 2002). Ces protéines sont capables de s’adsorber sur un polymère par de multiples

interactions selon son caractère hydrophobe ou hydrophile, c’est-à-dire selon la polarité

positive ou négative de la surface de la membrane (Andrade et Hlady 1986). Dans la figure 6

est schématisé de telle interaction.

Figure (6) : Représentation schématique de l’interaction protéine/surface (D’après Andrade 1986).

En effet, l’adsorption de l’albumine et du fibrinogène au niveau des différentes

membranes polymériques augmente avec le caractère hydrophobe des surfaces membranaires.

Par contre, l’adsorption protéique sur une surface hydrophile est considérablement diminuée.

Les propriétés hydrophiles des membranes artificielles conditionnent l’absence d’adhésion

cellulaire et la biocompatibilité membranaire (Andrade et Hlady 1986).

20

4- Macroencapsulation versus Microencapsulation Durant ces dernières années les techniques d’encapsulation cellulaire ont été bien

établies du fait que les polymères sont mieux connus en terme de composition, de réactivité et

de pureté après extraction (Uludag et al. 2000). Dans le cadre de l’encapsulation de cellules

mammifères, on peut distinguer d’une part les macrosystèmes et d’autre part les

microsystèmes. Les techniques de macroencapsulation incluent l’encapsulation en fibre

creuse et en large feuillet "large flatt-sheet". Celles de microencapsulation reposent sur des

procédés de gélification thermo-réversible ou ionotropique, de polymérisation interfaciale, de

coacervation ou d’interaction entre polyélectrolytes de charges opposées (Uludag et al.

2000).

* La macroencapsulation

Les macrosystèmes prennent le plus souvent l’aspect de fibres creuses, d’une taille

comprise entre 0,5-1,5 mm de diamètre et d’une longueur comprise entre 1-10 cm (Li 1998).

La taille de ces macrosystèmes dépend des conditions de fabrication, elle est conçue en

fonction des applications particulières (Tresco 1992). Ainsi, les macrosystèmes développés

par l’équipe de Joseph sont des fibres creuses de 5 cm de long et de 900 µm de diamètre

externe (Joseph et al.1994). Ils peuvent en fonction de leur volume contenir plusieurs millions

de cellules (Aebischer et al. 1991 ; Joseph et al. 1994 ; Date et al. 2000 ; Broadhead et al

2002). C’est pour cette raison qu’il est nécessaire d’en implanter très peu (souvent un seul), ce

qui représente un attrait considérable. Ces dispositifs sont composés d’une membrane semi-

perméable sélective et d’une matrice interne où se trouvent les cellules comme il est présenté

dans la figure 7. Les membranes des macrosystèmes sont sous forme de fibres creuses

préformées, stérilisées, remplies par un orifice avec les cellules, puis fermées à l’aide d’une

colle (Buchser 1996).

Figure (7) : Immuno- isolement sous la forme d’une fibre creuse (D’après Li 1998).

21

* La membrane est typiquement formulée avec des polymères synthétiques,

insolubles dans l’eau tel que le copolymère de polyacrylonitrile et de chlorure de polyvinyle

(PAN/PVC) (Hymer et al. 1981 ; Jaeger et al.1992 ; Gentile et al. 1995 ; Broadhead et al.

2002).

* Le choix de la matrice interne dépend du type cellulaire à encapsuler. Dans

leur environnement natif, les cellules vivent dans un réseau complexe de protéines

extracellulaires et de molécules polysaccharidiques nommée matrice extracellulaire (ECM)

qui ont un rôle complexe et dynamique dans les fonctions cellulaires.

Les deux rôles majeurs de cette matrice interne sont :

- un rôle mécanique, elle immobilise les cellules, ce qui permet une distribution homogène

dans toute la fibre creuse ;

- un rôle biologique : elle stimule les cellules à sécréter leur propre ECM, régule leur

prolifération cellulaire, et leur fonctions sécrétoires et maintient les cellules dans un

phénotype différencié (Sagen et al. 1999). Les matrices internes sont le plus souvent des

hydrogels à base d’alginate de sodium, de collagène, de chitosan ou d’agarose (Iwata et

al.1992 ; Li 1998 ; Uludag et al. 2000 ; Kumar et al. 2000 ; Agnihortri et al. 2004).

Des études relativement récentes ont démontré l’efficacité des systèmes immuno-

isolants sous la forme de fibre creuse, contenant des cellules chromaffines xénogéniques. Tout

d’abord, le groupe de Sagen (suite aux nombreuses implantations de cellules chromaffines

dans l’espace sous arachnoїdien) a réitéré ses expériences avec des cellules chromaffines

bovines encapsulées dans des fibres creuses en PAN/PVC. Chaque rat a reçu entre 2 et 6

millions de cellules chromaffines bovines encapsulées. Deux semaines après la greffe, les

résultats obtenus ont été encourageants : ces implants ont pu réduire la sensation douloureuse

sur un modèle de douleur aiguё (Sagen et al. 1993).

En 1998, Yu et ses collègues ont initiés deux études sur des rats dans un modèle de

douleur neuropathique. Dans la première, ce sont 1 X 105 cellules chromaffines bovines

(CCB) qui ont été implantées (Yu et al. 1998a). Dans la seconde, ce sont 2,5 X 105 cellules

chromaffines qui ont été encapsulées dans une fibre creuse à matrice interne à base d’alginate

de sodium (Yu et al. 1998b). Dans la première étude, peu de cellules ont survécu cinq

semaines après la greffe. En revanche, dans le deuxième cas 60 % à 80 % des cellules

encapsulées étaient toujours viables deux mois après l’implantation. La membrane de ces

macrosystèmes a certainement protéges les cellules chromaffines vis-à-vis de la réaction

immunitaire de l’hôte (Yu et al. 1998b). Cependant dans les deux cas, une analgésie durable

n’a pas être obtenue au niveau des tests réalisés, ceci en raison du nombre insuffisant de

cellules implantées (Yu et al. 1998).

22

D’autres études ont été réalisées sur un animal de taille plus proche de l’humain, le

mouton. 2 x 107 CCB encapsulées dans une fibre creuse en PAN/PVC furent implantées dans

l’espace sous arachnoїdien. Cette étude a démontré que ces CCB encapsulées pouvaient

survivre et rester fonctionnelles sans traitement immunosuppresseur, pendant une durée allant

jusqu’à 8 semaines (Josef et al. 1994). Des études similaires, toujours sur le mouton ont

permis d’affirmer le concept d’immuno-isolement et la survie des cellules implantées (Kaplan

et al. 1996). Un article récent (Winn et Emerich 2005) rapporte une expérience du même type,

sur le même animal où 2,2 x 106 CCB ont été encapsulées dans une fibre creuse. Au bout de 6

semaines, après l’explantation des CCB encapsulées, le taux de noradrénaline et de met-

enképhaline avait augmenté dans le liquide cérébro-spinal (LCS) (Winn et Emerich 2005).

Les implants ont été bien tolérés, mais aucun test permettant d’évaluer l’effet analgésique des

cellules chromaffines bovines implantées n’a été réalisé dans ce travail.

Une étude clinique pilote a été initiée, impliquant des patients cancéreux au stade

terminal souffrant de douleurs rebelles (Aebischer et al. 1994). Ces patients ont reçu 2 x 106

de CCB encapsulées par l’intermédiaire d’une fibre creuse d’un diamètre de 1 mm et d’une

longueur de 5 cm. La membrane de la fibre creuse, réalisée en PAN/PVC, avait une surface

lisse et la matrice interne était constituée d’alginate de sodium. L’implantation de ces fibres

creuses dans l’espace sous arachnoїdien reste délicate et relativement invasive.

Dans l’expérience rapportée, elles sont été retirées au bout de 3 mois pour le

contrôle et le traitement a été interrompu (Aebischer et al. 1994). Un autre essai clinique de

phase I (Buchser et al. 1996) concernant 15 patients cancéreux en phase terminale montre que

certains de ces patients ont gardé en place leurs implants près d’une année, d’autres ont pu

réduire l’apport morphinique. Ces résultats montrent que les cellules implantées sécrètent des

substances analgésiques (Buchser et al. 1996). Cependant, cette sécrétion n’est pas toujours

corrélée à un effet analgésique, peut être pour des raisons de quantité insuffisante de cellules

implantées. L’équipe de Linder a également implanté 1 x 105 CCB encapsulées dans des

fibres creuses au niveau des ventricules cérébraux des rats sur un modèle de douleur

neurogène et dans l’espace sous arachnoїdien de rats sur un modèle de douleur subaiguё sans

retrouver aucun effet analgésique significatif (Linder et al. 2000).

Au vu des résultats obtenus par les différentes équipes, l’encapsulation de cellules

chromaffines dans des fibres creuses répond aux pré-requis de biocomptabilité, d’immuno-

isolement et de permi-sélectivité nécessaires à l’utilisation de tels systèmes. Cependant, ces

implants présentent un certain nombre de désavantages dont leur surface de diffusion limitée.

De ce fait, le relargage des principes actifs et la survie à long terme des cellules restent à

optimiser (Emerich et al. 1992).

23

Le modèle de la microencapsulation semble être, de par son principe, un système

plus adapté à un maintien des échanges transmembranaires de nutriments et de substances

biologiquement actives proches de ceux observés dans les conditions physiologiques en

permettant une meilleure viabilité de cellules encapsulées (Emerich et al. 1992 ; Uludag et al.

2000).

*Le microencapsulation

Ce terme est employé pour désigner une encapsulation dans des particules de

dimensions allant de 0,3 à 1,5 mm (Uludag et al 2000). On parle de microsphères lorsqu’il

s’agit de particules pleines et de microcapsules lorsqu’elles sont constituées d’un cœur et une

membrane. Lorsque le cœur de la microcapsule est liquide, on parle alors de microcapsules

creuses. En comparaison avec les macrosystèmes, elles possèdent différents avantages :

- elles sont résistantes du fait de leur taille et leur forme sphérique et peuvent subir des

contraintes relativement élevées avant de se rompre.

- elles ont également un meilleur rapport volume/surface permettant une meilleure diffusion

de molécules à bas poids moléculaire au travers de la membrane. Cependant, dans un but

d’efficacité, leur volume interne plus petit impose d’en implanter un plus grand nombre ou de

remplir les microcapsules par un grand nombre de cellules (Li 1998 ; Uludag et al. 2000).

Un grand nombre d’études ont été réalisées avec les cellules de la lignée PC12

dérivée d’un phéochromocytome de rat (Winn et al. 1991 ; Mercier et al. 2001). En revanche,

il existe très peu d’études disponibles concernant les cellules chromaffines microencapsulées

dans le traitement des douleurs chroniques rebelles.

Deux études récentes ont été initiées avec des cellules chromaffines bovines

microencapsulées dans un système d’alginate-PLL-alginate (Kim et al. 2004 ; Jeon et al.

2006). Ces cellules chromaffines microencapsulées (2,5 x 105) ont été implantées dans

l’espace sous arachnoïdien de rats, présentant un modèle de douleur neurogène. Un mois

après l’implantation, ces cellules chromaffines microencapsulées possèderaient des propriétés

analgésiques dans ce modèle.

24

5- Alginate et encapsulation Des polymères synthétiques ou naturels présentant la propriété de former des

hydrogels sont utilisés dans l’encapsulation de cellules vivantes (Li 1998 ; Uludag et al.

2000 ; Kumar et al. 2000 ; Agnihortri et al. 2004). Le polymère le plus couramment employé

dans le domaine d’encapsulation des cellules vivantes est l’alginate de sodium en raison

notamment de son absence de toxicité, et de sa dispersion aisée dans l’eau en formant une

solution visqueuse. Les alginates sont des molécules issues d’algues marines. Ils peuvent

facilement être purifiés sans perte de leur composition moléculaire. Au cours de ces dernières

années, plusieurs techniques de purification d’alginate (filtration, précipitation et extraction)

ont été décrites (Klock et al. 1994 ; De Vos et al. 1997 ; Bünger et al. 2003). Pour

l’encapsulation cellulaire la pureté de l’alginate doit être mise en considération : plus

l’alginate est pur, plus les microcapsules sont stables, lisses et par conséquence

biocompatibles (Klock et al. 1994 ; De vos et al. 1997 ; Juste et al. 2005).

Figure (8): Structure chimique (a) de l’acide mannuronique et de l’acide guluronique ; (b) de l’alginate.

D’un point de vue chimique (figure 8), les alginates sont des polysaccharides

constitués d’enchaînements linéaires de résidus d’acides β-D-mannuroniques (M) et d’acides

α-L-guluroniques (G) liés en 1-4 selon des proportions et des arrangement variables (Haug et

Larsen 1962 ; Smidsrod et Haug 1968). Des séquences homopolymériques de résidus D-

mannuroniques (blocs M-M) et des séquences similaires de résidus guluroniques (blocs G-G),

sont séparées par des séquence mixtes (blocs M-G).

25

L’alginate est un polysaccharide chargé négativement, il gélifie en présence d’ions

divalents tels que le Ca+2 et le Ba+2 (Clark et Ross-Murphy 1987). La gélification de l’alginate

de sodium en présence d’ions divalents se fait selon le modèle de la « boite à œufs » (Grant

et al. 1973). Généralement, le sel de cation divalent le plus souvent utilisé pour la gélification

de l’alginate est le chlorure de calcium qui est très soluble dans l’eau et qui offre une bonne

disponibilité des ions calcium. Il a été montré que 90 % des ions sodium contenus dans une

solution d’alginate de sodium peuvent être facilement déplacés par des ions calciques (Seely

et Hart 1974). L’alginate de sodium se transforme alors en alginate de calcium qui gélifie.

Figure (9) : Gélification de l’alginate par les ions calcium et le modèle en boite à œufs

Les propriétés des microsphères d’alginate dépendent du type d’ion divalent, du

rapport acide mannuronique/acide guluronique de l’alginate ; ainsi que de sa masse

moléculaire et de sa concentration (Clark et Ross-Murphy 1987 ; Martinensen et al. 1989 ;

Stokke et al. 1997 ; Stabler et al. 2001).

* Influence du type d’ion divalent

En effet, l’affinité des alginates pour les différents ions est variable:

Ils peuvent être classés dans l’ordre décroissant suivant leur affinité :

Pb+2 = Cd+2 > Ba+2 > Ca+2 = Sr+2 >> Mg+2 (Seely and Hart 1974).

* Influence de la composition chimique de l’alginate :

Haug et Smidsrod, ont montré en 1965 que l’affinité pour l’ion calcium varie avec

les types d’alginates. Les alginates riches en acide guluronique ont une affinité supérieure à

ceux riches en acide mannuronique. Les blocs G-G sont caractérisés par la formation d’une

liaison sélective et forte avec les ions calcium (Rokstad et al. 2003). En revanche, les autres

types de blocs ont une sélectivité moindre pour le calcium, et n’établissent pas de liaison forte

avec cet ion (Smidsrod 1972).

26

En 2006, une étude évaluant l’influence de différents blocs sur l’affinité de

l’alginate pour les différents ions a été effectuée. Les résultats de cette étude montrent que

les ions Ca+2 ont une affinité plus spécifique pour les blocs G et MG, que les ions Ba+2 pour

les blocs G et M ou les ions Sr+2 pour les blocs G (MØrch et al 2006).

* Influence de la masse moléculaire de l’alginate et de sa concentration :

La sphéricité des microcapsules est fonction de la viscosité de la suspension de la

solution d’alginate qui à son tour dépend de la concentration en alginate et de sa masse

moléculaire (Lim et Sun 1980 ; Lim et Moss 1981).

La gélification de l’alginate en présence d’ions divalents permet d’envisager la

préparation de microsphères par gélification ionotropique selon un mode simple et rapide et

sans traitement chimique agressif pour les cellules à encapsuler qui conservent alors une

bonne viabilité (Seely et Hart 1974 ; Smidsord et Skjak-Braek 1990 ; Klock et al. 1994).

Cependant, cette technique de préparation n’est pas compatible avec tous les milieux de

culture : en présence d’ions complexant le calcium tels que les phosphates une liquéfaction

des microcapsules a été observée (Levy et Poncelet 1994). Cet inconvénient peut

éventuellement être contourné par un traitement ultérieur des billes. Une autre possibilité est

la formation d’une couche extérieure formée d’un polycation (polyélectrolyte) de charge

opposée à l’alginate (via une association ionique entre les deux) ; elle représente le moyen le

plus facile et le plus utilisé pour former des microcapsules stables.

En 1980, l’équipe de Lim et Sun aux Etats Unis, proposait le recouvrement des

billes d’alginate avec un polycation de charge opposée à l’alginate, la poly-L-lysine (PLL),

qui déplace le calcium à la surface des microsphères, forme une complexe d’alginate-PLL

plus stable et crée ainsi une membrane rigide semi-perméable (Lim et Sun 1980).

Depuis, la PLL a parfois été incriminée lors de réactions immunitaires de l’hôte

(Vandenbossche et al. 1993 a, b ; Strand et al. 2001, 2002 ; De vos et al. 2002 ; Juste et al.

2005). En fait, l’interaction ionique entre l’alginate et la PLL dépend de la composition

chimique de l’alginate. Puisque les ions Ca+2 ont une affinité plus spécifique aux blocs G,

l’association ionique entre les alginates à forte teneur en acide mannuronique et la PLL est

plus forte que celle des alginates riches en acide guluronique. Dans ce dernier cas, il existerait

alors une association incomplète entre la PLL et l’alginate à forte teneur en acide guluronique.

Ce serait les charges positives résiduelles de la PLL non associées qui attireraient et

stimuleraient les cellules responsables de la réponse immunitaire (Vandenbossche et al. 1993 ;

Strand et al. 2001).

27

L’ajout d’une couche extérieure supplémentaire d’alginate en surface des

microcapsules diminuerait la réaction immunitaire de l’hôte (Thu et al 1996 ; De Vos et al.

1997). Le système alginate-PLL-alginate (APA) est donc considéré comme étant le complexe

de choix pour l’encapsulation de cellules vivantes et pour des applications in vivo (Stang et al.

1993 ; Thu et al.1996 ; Kendall et al 2001 ; Yoshioka et al. 2003; De vos et al. 1996, 2002 et

2003 ; Kim et al. 2004 ; Bünger et al. 2005 ; Jeon et al. 2006).

Plusieurs facteurs conditionnent la porosité et la solidité de la membrane complexe

APA : le poids moléculaire de PLL, la concentration en PLL et le temps de contact entre

l’alginate et PLL (Goosen et al. 1985 ; King et al. 1987 ; Martinsen et al .1989 et 1992 ; Thu

et al. 1996 ; Vandenbossche et al. 1993 ; Leblond et al. 1996 ; De vos et al. 1997 ; Dusseault

et al. 2005).

En 1996, Thu lors de son étude sur l’interaction entre l’alginate et les polycations

a montré que l’association ionique entre l’alginate et la PLL augmente avec la concentration

en PLL, le temps de contact entre l’alginate et PLL et varie en fonction du poids moléculaire

de la PLL. Selon cette étude, le poids moléculaire idéal de la PLL pour former une membrane

stable serait égal à 18 kDa (Thu et al. 1996). D’autres auteurs ont montré qu’une PLL à 0,1 %

de poids moléculaire de 22 kDa et un temps de réaction alginate/PLL égal à 10 minutes

étaient suffisants pour obtenir une membrane de propriété immuno-protective contre les

immunoglobulines (King et al.1987; Vandenbossche et al.1993).

Dans l’étude de Goosen, au cours de la microencapsulation d’îlots de langerhans,

la concentration en PLL était égale à 0.05 %, son poids moléculaire de 17 kDa et son temps

de contact avec l’alginate était entre 6 et 8 min. Cette étude a montré que ces conditions

opératoires permettaient d’obtenir des capsules parfaitement sphériques, stables et

imperméables aux immunoglobulines (Goosen et al.1985). Si le temps de réaction entre

alginate et PLL est augmenté au-delà de 40 min, la membrane des microcapsules est plus

épaisse et compacte. Leur résistance mécanique augmente avec le temps de contact

l’alginate/PLL et la concentration en PLL, au détriment de la perméabilité membranaire (King

et al.1987). Par contre, une étude plus récente montre qu’un temps de contact entre l’alginate

et la PLL entre 6 min et 20 min ne provoque pas de changement au niveau de la porosité des

microcapsules (Darrabie et al. 2005).

Une autre modification possible du procédé d’encapsulation cellulaire est la

liquéfaction du cœur (alginate-calcium) de la microcapsule par l’ajout d’un séquestrant du

calcium tels que le citrate de sodium ou l’éthylène glycol-bis (ß-aminoethyl éther) N,N,Ń,Ń-

acide tetra-acétique (Goosen et al. 1985 ; Fritschy et al. 1991).

28

Le remplacement de cation divalent (calcium) par le cation monovalent (sodium)

pourrait permettre aux cellules encapsulées une meilleure croissance (Lim et Sun 1980 ; Lim

et Moss 1981 ; Goosen et al. 1985 ; Darrabie et al. 2001).

1- Microsphère d'alginate

2- Adsorption de polycationmicrocapsule

3- Ajout d'un séquestrant du calcium microcapsule creuse

Figure (10) : Les différentes modalités de préparation de microparticules avec de l’alginate

L’ensemble de ces données montre que plusieurs paramètres fixent les conditions

et les étapes de fabrication susceptibles d’influencer la stabilité, la perméabilité des

microcapsules et par la même leur devenir in vivo de ces microcapsules. Une modification

apparemment mineure du procédé d’encapsulation peut avoir une influence directe sur les

caractères physicochimiques des microcapsules et par conséquence, sur la réponse de l’hôte

contre les capsules et ainsi, sur le devenir des microcapsules (Uludag et al. 2000).

Dans le cadre d’une encapsulation en vue de thérapie cellulaire, l’objectif est

d’obtenir des microcapsules sphériques, résistantes et biocompatibles et de garder les cellules

vivantes et fonctionnelles au sein de la capsule en les protégeant d’un rejet par l’hôte. Pour

cela, nous avons testé la faisabilité de l’utilisation de microcapsules creuses d’APA pour

l’encapsulation de cellules chromaffines bovines en nous intéressant plus particulièrement aux

caractéristiques plysico-chimiques des microcapsules, à la viabilité et à la fonctionnalité

cellulaire, avant d’envisager une implantation in vivo chez le rat.

29

MATÉRIEL

ET METHODES

30

1- Culture et caractérisation des cellules chromaffines bovines in vitro 1.1- Isolement et purification des cellules chromaffines bovines

* Produits utilisés:

- Chlorure de sodium (Sigma, S-7653)

- Chlorure de potassium (Sigma, P-9541)

- Bicarbonate de sodium (Sigma, S-8875)

-HEPES (Sigma, H-7523)

- DGlucose (Sigma, G-7528)

-Collagénase A (Roche, 10103586001)

- Serum albumine bovine fraction V (Sigma, A-9418)

-Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F12 (DMEM/F12, Gibco, 31330-038)

- Sérum de veau foetal (Sigma, F-3297)

-5 fluoro5-déoxyuridine (Sigma, F-8791)

-CytosineΒdarabinoside (Sigma, C-1768)

-Streptomycine 10000 µg/ml / Pénicilline 10000 U/ml (Gibco, 15140-122)

-Fungisone 250 µg / ml (Gibco, 15290-026).

- L-Glutamine (Gibco, 25030-024).

- Bleu Trypan 0.4 % (Gibco, 15250-061)

*Tampons:

-Tampon Locke 10 X [NaCl 1,54 M ; KCl 56 mM; DGlucose 56 mM ; NaHco3 36 mM ;

HEPES 50 mM dans 1 litre d’eau milli-Q (pH = 7,2 à 20 °C)]

- Tampon Locke 1X

- Solution enzymatique à pH 7,2 composée de collagénase A (0,125 %), de sérum albumine

bovine fraction V (0,5%), du tampon Locke 10 X mis en solution dans l’eau de Volvic.

* Aux abattoirs

Les glandes surrénales sont prélevées aux abattoirs de la ville de Montauban sur

des animaux (veaux âgés de 6 mois), propres à la consommation. Le prélèvement est effectué

dans un délai de 20 minutes après l’abattage de l’animal. Les glandes sont ensuite récupérées

pour le transport (maximum 2 heures) dans une solution tampon Locke 1X à 4°C à pH 7,2

supplémentée en antibiotiques [Pénicilline (100 UI/ml)/Streptomycine (100 µg/ml) et

Fungisone 2.5 µg/ml].

31

* Au laboratoire

L’isolement des cellules chromaffines est effectué en appliquant la technique de

Bader et Bruce (Bader et al. 1981 ; Bruce 1984). Au laboratoire, les glandes surrénales sont

isolées de leur environnement graisseux puis rincées avec du Locke 1X, à 37°C, afin

d’éliminer le plasma et les érythrocytes contenus dans les nombreux vaisseaux

médullosurrénaliens. Après avoir réalisé plusieurs incisions dans le cortex à l’aide d’une lame

de bistouri, les glandes surrénales bovines sont canulées, perfusées à contre-courant par la

veine surrénale centrale puis lavées en circuit ouvert à l’aide d’une pompe péristaltique

pendant 15 minutes (débit = 7 ml/min).

12

3

4

5

6 7

8

9

10

11

1- A. surrénale sup. 7- V. surrénale 2- A. phrénique inf. 8- Plexus artériel sous-capsulaire3- Aorte 9- Cortex4- Réseau capillaire 10- Médulla5- A. surrénale moyenne 11- A. surrénale inf.6- A. rénale

A

Figure (11): Schéma représentant une glande surrénale et son système de vascularisation (A): le lavage des glandes surrénales et la digestion de la médullosurrénale se fait via le système de vascularisation veineux à contre courant par la veine surrénale centrale (flèche). (B) exemple de glande surrénale dégraissée (C) : exemple de canulation pour rincer et digérer des glandes surrénales bovines.

32

L’isolement des cellules chromaffines a été réalisé après digestion de la

médullosurrénale par une solution enzymatique de collagénase A (0,125 %). Les glandes

surrénales bovines sont perfusées avec la solution enzymatique en utilisant une pompe

péristaltique en circuit fermé (20 ml/ glande, débit 7 ml/min), pendant 1 heure au bain-marie à

37°C.

D

Figure

les glande

la partie

solution L

passée su

que les ré

centrifuge

Locke 1X

à 20°C a

cellulaire

par la mé

cellules/2

sérum de

µg/ml de

% humidi

Tuyaux de pompe Péristaltique

Glandes surrénales

(11 D): Le rinçage et la digestion des glande

Pour séparer la médullosurrénale du c

s sont disposées dans une boîte en ver

médullaire ramollie est récupérée. La

ocke 1X, puis dissociée légèrement au

r un tamis nylon de 217 µm afin d’élim

sidus fibreux. La suspension cellulaire

r pendant 10 minutes à 70g à 20° C

, puis passés sur un tamis nylon de 82

fin d’éliminer les globules rouges. A

est repris dans du Locke 1X pour effect

La numération et la viabilité cellulai

thode d’exclusion au bleu trypan. Les

ml) dans le milieu DMEM/F12 1:1 com

veau foetal, 10 µM de cytosineΒdarabin

streptomycine, 100 UI/ml de pénicilline

té). Le milieu de culture a été renouvel

33

Tampon Lock

Milieu deculture

s surrénales à l’aide de la pompe péristaltique.

ortex afin d’isoler les cellules chromaffines,

re stérile, ouvertes sur toute leur longueur et

purée de médulla est rincée par 5 ml de

scalpel. A la fin de cette étape, la purée est

iner les agrégats tissulaires non digérés ainsi

obtenue est répartie dans des tubes et mise à

. Les culots cellulaires sont repris dans du

µm et centrifugés pendant 10 minutes à 70 g

près avoir aspirer le surnageant, le culot

uer le comptage cellulaire.

re sont déterminées sur cellule de Malassez

cellules sont cultivées (0,5 x 106 et 1 x 106

plémenté avec 4 mM de glutamine, 10 % de

oside, 10 µM de 5 fluoro5-déoxyuridine, 100

à 37°C dans une étuve à CO2 (5 % CO2 / 95

é tous les quatre jours.

1.2- Immuno-cytochimie

La fonctionnalité cellulaire a été observée en marquant, en fluorescence, la

tyrosine hydroxylase (TH) et la met-enképhaline (ME). L’immunomarquage a été réalisé

selon la technique décrite par Bader (Bader et al. 1983, 2002).

Les cellules chromaffines sont ensemencées sur des lames traitées (Labtek II,

Polylabo, 4 chambres/lame) à une densité de 5 x 105 cellules/chambre. Les cellules sont fixées

pendant 15 minutes avec du Paraformaldéhyde 4% (PFA, Sigma) dans une solution tampon

phosphate 0,1 M, puis perméabilisées pendant 10 minutes avec du PFA 4% contenant 0,1 %

de triton X 100 (Sigma), à température ambiante.

Après rinçage au PBS, les sites aspécifiques sont saturés avec du PBS contenant

3% de BSA et 10 % de sérum de chèvre (Sigma) pendant 45 minutes. Les cellules sont

ensuite mises à incuber avec l’anticorps primaire, dilués dans du PBS (Phosphate Buffered

Saline) contenant 3% de BSA, pendant 45 minutes à 37°C : l’anticorps monoclonal anti-TH

(souris, Sigma) est dilué au 1/400ème, l’anticorps polyclonal anti-met-enképhaline (lapin,

Sigma) est dilué au 1/500ème.

En parallèle, des puits témoins sont recouverts uniquement de PBS contenant 3 %

de BSA. Après plusieurs rinçages au PBS, les cellules sont mises à incuber avec les anticorps

secondaires, dilués au 1/2000ème dans du PBS contenant 3 % BSA, pendant 45 minutes à

37°C.

L’anticorps secondaire anti-souris est couplé à la cyanine 3 (fluorescence rouge) et

l’anticorps secondaire anti-lapin est couplé à la cyanine 2 (fluorescence verte). Ces

fluorochromes sont excités respectivement par des lasers hélium/néon à λ exc.= 543 nm et

argon à λ exc.= 488 nm.

Après plusieurs rinçages au PBS, les cellules sont mises à incuber avec du DAPI

(4,6-Diamidino-2-Phenylindole) à 0,2 µg/ml, pendant 15 minutes à 37°C afin de marquer

tous les noyaux des cellules. Après rinçage avec du PBS puis de l’eau distillée, les lames sont

montées au Moviol (Calbiochem) et analysées.

34

2-Microencapsulation des cellules chromaffines bovines (CCB) 2.1- Matériels utilisés:

-Alginate de sodium de viscosité intermédiaire (Sigma-Aldrich; No A-2033; Lot 111K0005)

PM = 150 kDa

Viscosité = 2960 cps à 25°C pour une solution aqueuse à 2%

Ratio M/G = 0.96 (évalué par spectroscopie infrarouge)

-Poly-L-Lysine hydrobromide (PM= 30, 2 kDa, Sigma Aldrich; No 25988-63-0; Lot

071K5120)

-HEPES (PM de 260, 29: Sigma-Aldrich; No 278-169-7; Lot 092K5431)

-Chlorure de sodium (PM de 58, 44; Sigma-Aldrich; No 231-598-3; Lot 32K1228)

-Chlorure de calcium (PM de 147; Sigma-Aldrich; No C5080; Lot 038K0037)

-Citrate de sodium (PM de 294; Sigma-Aldrich; No 200-675-3; Lot 062K0017)

2.2- Tampons:

-Tampon 1 (T 1) :

(12,5 mM HEPES et 150 mM Na Cl à pH 7,4)

-Tampon 2 (T 2):

(12,5 mM HEPES et 68 mM de chlorure de calcium à pH 7,4)

-Tampon citrate (55 mM citrate de sodium dans T1 à pH 7,4) 2.3- Formation des microcapsules

2.3.1-Principe de formation des microcapsules

A- Formation des microsphères d’alginate Les microcapsules ont été fabriquées, en utilisant la méthode de Goosen avec

quelques modifications (Goosen et al. 1985) selon le schéma présenté dans la figure 12. Afin

d’obtenir une solution d’alginate à 1,5 % p/v, l’alginate de sodium a été dispersé à 2000

tours/minute pendant 30 minutes dans un tampon T1. Les cellules chromaffines ont ensuite été

mélangées avec cette solution d’alginate. Les billes sont produites simplement en laissant

tomber goutte à goutte la solution d’alginate à 1,5 % contenant les cellules à encapsuler dans

une solution T2, pendant 20 minutes sous agitation magnétique modérée (500 rpm). L’alginate

de sodium se transforme en alginate de calcium qui gélifie. Les billes sont récupérées et

rincées avec 50 ml du T1.

35

B- Formation d’une membrane

Les microsphères sont ensuite incubées avec une solution de poly-L-lysine à 0,1 %

dans du T1, pendant 15 minutes sous agitation magnétique modérée. Les billes sont

récupérées et lavées dans une solution T1, pendant 5 minutes sous agitation magnétique

modérée.

C- Neutralisation des charges positives présentés sur la membrane alginate-PLL

Les billes sont incubées dans une solution diluée d’alginate de sodium à 0,1 % p/v,

pendant 10 minutes sous agitation magnétique modérée. L’alginate qui est chargé

négativement, neutralise les éventuelles charges positives à la surface des microcapsules.

Ensuite, les billes sont récupérées et lavées dans une solution T1 pendant 5 minutes sous

agitation magnétique modérée.

D- Liquéfaction du cœur des microcapsules

Le cœur des microcapsules est liquéfie par incubation de celles-ci dans du T3,

pendant 10 minutes. Puis, les billes sont récupérées et lavées dans une solution T1 pendant 5

minutes sous agitation magnétique modérée.

PAROI (ALGINATE POLY-L-LYSINE)MICROCAPSULES A MILIEU INTERNE LIQUIDE

TRAITEMENT A LA POLY-L- LYSINE

TRAITEMENT AU CITRATE DE SODIUM

CHLORURE DE CALCIUM

CHLORURE DE CALCIUM

CELLULES VIVANTES

CELLULES VIVANTES

EXTRUSION

CELLULES VIVANTES +ALGINATE DE SODIUM

ALGINATE DE SODIUM

MICROSPHERES D'ALGINATE DE CALCIUM

CELLULES VIVANTES

Figure (12) : Encapsulation de cellules chromaffines par la méthode de gélification ionique (D’après Villar 1996).

36

2.3.2-Microencapsulation des CCB en utilisant une seringue équipée d’une

aiguille de diamètre égal à 0.6 mm

Cette étude a été menée sur des microcapsules réalisées à l’aide d’une seringue de

50 ml équipée d’une aiguille de diamètre égal à 0.6 mm. La concentration en cellules de la

solution d’alginate de sodium de départ était de 3,75 x 106 cellules/ml. En fin de préparation,

les microcapsules sont ensemencées à raison de 1 x 106 cellules/8 capsules/puits sur des

plaques 12 puits.

2.3.3-Microencapsulation des CCB en utilisant un encapsulateur équipé d’une

buse de 300 µm

L’encapsulation a été réalisé en appliquant la méthodologie préalablement décrite.

Les cellules chromaffines, suspendues dans l’alginate à une concentration de 3 x 106

cellules/ml sont poussées via un pousse seringue dans un encapsulateur IE5OR Inotech

(figure 13) équipé d’une buse de 300 µm (fréquence 750, vitesse 393, voltage 2,14 V).

Les cellules encapsulées sont alors ensemencées en fonction du poids à raison de

0,249 g/puits et de 0,498 g/puits (équivalent respectivement à 0,5 x 106 et 1 x 106

cellules/puits) sur des plaques 12 puits.

37

1

23

4

56

7

89

10

1112

M Waste

Suspension cellulaire

S

Figure (13) : Schéma de l’encapsulateur IE 50R (Inotech). Légende 1 : Seringue et suspension cellulaire dans l’alginate 8 : Générateur 2 : Embout seringue 9 : Paramétrage de la fréquence 3 : Oscilloscope 10 : Stroboscope 4 : Buse vibrante 11 : Filtre 5 : Anneau chargé 12 : Enceinte de récupération des microcapsules 6 : Bécher réactionnel M : Agitateur 7 : Panier récupérateur des déchets S : Pousse seringue

38

3- Etude physicochimiques des microcapsules

A- Observation en microscopie optique

Les microcapsules conservées dans du T1 ou du milieu de culture ont été

observées régulièrement en microscopie optique (Olympus CK 40) afin de vérifier le maintien

de l’intégrité de leur membrane au cours du temps. De plus, le diamètre moyen des

microcapsules a été déterminé par analyse d’images.

B- Observation en microscopie électronique à balayage (MEB)

L’analyse de la surface et de la section transversale des microcapsules sèches a été

réalisée avec un microscope électronique à balayage (Leo 435 VP). Les échantillons sont

montés sur une porte échantillon en aluminium avec de l’adhésif, puis métallisés avec de

l’argent. Les spécimens sont observés à 15 kilovolts de voltage d’accélération.

C- Estimation de la répartition granulométrique des microcapsules

La répartition granulométrique des microcapsules fabriquées à l’aide d’un

encapsulateur équipé d’une buse de 300 µm a été déterminée par microscopie optique, par

diffraction de la lumière et par tamisage. Les mesures en diffraction de la lumière ont été

réalisées en T1 sur un appareil Coulter. Pour les mesures par tamisage, les tamis sont pesés

avant le passage des microcapsules, puis les microcapsules sont passées successivement au

travers de tamis de tailles décroissantes (710 µm, 500 µm et 315 µm). On détermine le poids

des capsules récupérées sur chaque tamis et on obtient ainsi une idée de la répartition

granulométrique des microcapsules obtenues.

D- Test de résistance mécanique des microcapsules

*Texturométrie

La résistance mécanique des microcapsules (fabriquées à l’aide d’une seringue 50

ml et d’une aiguille de diamètre de 0,6 mm) incubées dans le milieu de culture et celle des

microcapsules incubées dans du T1 à 37°C, a été déterminée, en utilisant un texturomètre TA-

XT2 (Stable Microsystèms, UK), muni d’un piston cylindrique en plexiglas, de 20 mm de

diamètre et de 314,16 mm2 de surface de contact. Le piston s’est déplacé verticalement de

haut en bas à vitesse constante et prédéfinie (0.5mm / seconde). La résistance mécanique a été

déterminée en mesurant la force nécessaire au piston pour comprimer les microcapsules par

déplacement de ce piston sur une distance égale à un tiers de leur diamètre.

39

Pendant que le piston a déformé les microcapsules, le capteur de force a mesuré et

enregistré la force nécessaire au déplacement à la vitesse demandée. Ceci a permis de tracer la

courbe (force (g) versus déplacement ou temps).

L’intégrité des microcapsules à l’issue du test a été déterminée par une observation

microscopique. Les résultats sont exprimés sous forme de force en gramme. Cinq mesures

indépendantes ont été réalisées.

* Passage des microcapsules via cathéter et manchons de différentes tailles

La résistance mécanique des microcapsules fabriquées à l’aide d’un encapsulateur

et d’une buse de 300 µm est déterminée en testant leur passage via un cathéter polyéthylène

ou via des manchons de différentes tailles (figure 14), ceci permet également de choisir le

moyen le plus convenable pour les implanter chez le rat lors de l’étude in vivo.

Manchon de cathéter 20 G

Micropipette

F

1,2

co

so

in

di

se

m

Cathéter en

Seringue 1 ml

polyéthylène (Ø int. 760 µm)

igure (14) : Cathéter et ma

Un cathéter pla

2 mm) est lié au cathét

rps du cathéter métalliq

dium stérile à 0.9 % est

Un autre essai a

terne de 1,3 mm et diam

amètre externe de 1,3mm

Les microcaps

ringue contenant 0.5

icrocapsules par le cathé

Cathéter métalliqu

(Ø int. 1,1 mm)

nchons util

stique en

er métalli

ue 18G, p

abouchée

été effec

ètre exte

).

ules sont

ml de c

ter en po

e 18 G

Corps de cathéter

cathéter 18 G (Ø int. 1,3 mm)

Seringue 1 m

isés pour tester la résistance mécanique des mi

injection chez le rat.

polyéthylène (diamètre interne de 760

que 18G. Entre 20 et 30 microcapsules s

uis une seringue de 1 ml contenant 0.5 m

au corps de ce cathéter métallique.

tué en utilisant les manchons des cathéte

rne de 1,5 mm) et 20G (diamètre inter

alors mises dans les corps de ces man

hlorure de sodium y est abouchée.

lyéthylène et par les différents manchons

40

Corps de

Manchon de

mancho

l

crocapsules avant

µm et externe de

ont mises dans le

l de chlorure de

rs 18G (diamètre

ne de 1,1 mm et

chons, puis une

Le passage des

est alors testé.

Les microcapsules sont déposées sur des lames en verre puis observées avec une

loupe Olympus SZ-PT. Le nombre de capsules intactes et de capsules déformées est alors

compté. Les mêmes tests sont réalisés sur le même nombre des microcapsules contenant des

cellules.

E- Etude de la perméabilité membranaire (Spectroscopie UV/Visible)

Afin d’estimer le seuil de coupure en masse moléculaire de la membrane des

microcapsules, leur perméabilité vis-à-vis de molécules standards ayant des caractères

physicochimiques bien établis a été mesurée.

Il s’agit de la vitamine B12 (PM 1355 Da ; Rayon de Stoke 7,7 Å, Sigma

Chemical Co.), de l’alpha lactalbumine (PM 14,2 kDa ; Rayon de Stoke 20 Å, Sigma

Chemical Co.) et de la sérum albumine bovine (PM 67 kDa ; Rayon de Stoke 35 Å, Sigma

Chemical Co.).

Des microcapsules fraîchement préparées ont été incubées dans 50 ml de solution

concentrée en vitamine B12 (1 mg/ml) ou en alpha lactalbumine (6,2 mg/ml) ou en sérum

albumine bovine (83 mg/ml) pendant 16 heures à 25°C. Les microcapsules chargées en

molécule standard sont transférées dans du T1.

Des prélèvements ont été réalisés dans le tampon à intervalles réguliers pendant

24h. En cas de l’alpha lactalbumine et de la sérum albumine bovine, ces prélèvements sont

ensuite incubés avec l’acide bicinchoninique (BC assay protein quantification kit, Uptima

Interchim UP) pendant 2 heures à la température ambiante. Enfin, les solutés présents dans

ces prélèvements ont été dosés au spectrophotomètre U.V./Visible (spectophotometer 930,

Uvikon) à 361 nm (pour la vitamine B12) ou à 562 nm (pour l’alpha lactalbumine et la sérum

albumine bovine).

La concentration a été déterminée à l’aide de droites d’étalonnage. Les résultats

sont exprimés en concentration relative moyenne Ct/C0, où C0 est la concentration de départ

au sein des microcapsules, déterminée après rupture des microcapsules et Ct est la

concentration en soluté libéré au temps t.

41

4-Etude in vitro des cellules encapsulées et adhérentes Une étude in vitro est réalisée afin d’évaluer la viabilité et la fonctionnalité des

cellules encapsulées par rapport à celles adhérentes en culture.

A- Observation de la viabilité cellulaire en microscopie confocale

A différents jours de culture, les cellules encapsulées et les cellules adhérentes

sont lavées deux fois avec du PBS (Gibco), puis incubées en présence de marqueurs [2 µM

d’Ethidium (Sigma, E-1359) et 1 µM de Calcéine AM (Sigma, C-1903) dans une solution du

PBS/medium 1:1)] pendant 30 minutes à 37°C. La calcéine AM [calcéine (aceto-methyl)

ester] est un dérivé de calcéine qui devient fluorescente par l’hydrolyse en raison de la

transformation de calcéine AM en calcéine. Ce dérivé se distingue par sa capacité de traverser

la membrane cellulaire des cellules vivantes. Donc, il peut être utilisé pour évaluer la viabilité

cellulaire.

Au sein des cellules vivantes, l’AM-calcéine hydrolysé par une estérase ATP-

dépendante non spécifique présente dans le cytoplasme des cellules vivantes, se transforme en

calcéine (dérivé fluorescent). En microscopie confocale, un laser Argon est utilisé pour

exciter la calcéine (λexc=488 nm), la viabilité cellulaire est indiquée par l’émission d’une

fluorescence verte (émise entre 505-530 nm).

De plus, l’éthidium réagit avec l’acide nucléique. N’étant pas capable de traverser

la membrane cellulaire des cellules vivantes, mais traverse uniquement celle des cellules

mortes. Il peut alors être utilisé comme marqueur de la mortalité cellulaire. Sur les cellules

mortes, l’éthidium chélate et colore l’acide nucléique par une interaction covalente en formant

un complexe éthidium-acide nucléique, ce qui peut être mis en évidence par excitation avec

un laser He-Ne à 543 nm. La mortalité cellulaire est alors indiquée par l’émission d’une

fluorescence rouge (longueur d’onde supérieure à 650 nm).

En utilisant un microscope confocal (Zeiss 510), les microcapsules sont observées

et une section optique de 24,3 µm est prise.

B- Western Blot

Les cellules adhérentes sont ensemencées à raison 1 x 106 cellules/puits sur des

plaques 12 puits, tandis que les cellules encapsulées dans les microcapsules de grande taille

sont ensemencées à raison de 1 x 106 cellules/8 capsules/puits. Après rinçage deux fois avec

du PBS stérile (Gibco), les cellules et les microcapsules sont reprises dans 0,5 ml de PBS et

centrifugées pendant 5 minutes à 15000 rpm à 4°C.

42

Après avoir enlever les surnageants, les cellules et les microcapsules sont reprises

dans un volume adapté de tampon de lyse hypotonique en présence d’inhibiteur de protéase.

Les cellules adhérentes et les cellules encapsulées sont vortexées et soniquées.

Les lysats protéiques obtenus sont dosés par la technique du Bradford, puis

conservés à moins 80°C. A différents jours de culture, ils sont repris dans un volume adapté

de tampon de Laemmli 1X préparé extemporanément [Lemmli Sample Buffer 2X (Sigma) :

Tris-HCl 1M pH 6,8 ; Glycérol 100% ; Sodium Dodecyl Sulfate 10% ; β-mercaptoéthanol ;

bleu de bromophenol].

Après dénaturation des échantillons, les lysats protéiques (50 µg de protéine totale)

sont séparés sur un gel de Polyacrylamide à 10 % en présence de SDS (SDS, Bio-Rad ;

polyacrylamid, Bio-Rad) Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane PVDF

(Polyvinylidene difluoride, Amersham Pharmacia Biotech) pendant 2 heures à 4 °C.

Après saturation de la membrane avec 10% du lait dans un tampon de PBS + 0,1

% Tween 20, elle est hybridée avec l’anticorps monoclonal anti-TH (1/5000ème). Puis, la

membrane est incubée avec l’anticorps secondaire anti-souris couplé à la peroxydase

(1/10,000ème). La révélation des bandes immunoréactives se fait par chimiluminescence en

utilisant le réactif ECL (Enhanced ChemiLuminescence, Amersham Pharmacia Biotech).

La membrane est mise à incuber avec l’anticorps polyclonal anti-actine (l’actine

est utilisée comme sonde constante afin de valider et de comparer les résultats obtenus). Les

signales obtenus sont intégrés et quantifiés (Syngen Gene Tools Intergration Analysis

Software). Le rapport TH/actine a été calculé afin de comparer les niveaux d’expression de la

TH au cours du temps pour les cellules microencapsulées et pour les cellules adhérentes.

C- Immuno-histochimie

Les cellules microencapsulées sont lavées avec du PBS, puis fixées dans du formol

à 4 % toute la nuit à 4°C dans des tubes Falcon. Puis, elles sont déshydratées dans des bains

successifs de concentration croissante d’alcool et deux bains d’acétone. Les microcapsules

sont imprégnées dans la paraffine à 56°C au minimum 2 heures avant la confection des blocs.

Les coupes réalisées au microtome sont de 5 µm d’épaisseur et étalées sur lames gold plus.

Les coupes sont laissées à sécher toute la nuit à température ambiante. Puis, les lames sont

déparaffinées à 56°C au minimum 20 minutes puis réhydratées par des bains successifs de

xylène (3 bains x 3 min), d’acétone, d’alcool à de concentration décroissante et enfin dans de

l’eau distillée plusieurs fois.

43

La réactivation antigénique est effectuée en passant les lames aux micro-ondes

dans un tampon citrate à pH 6 (2 min x 2 fois à 800 W). L’activité peroxydase endogène est

bloquée par 3 % d’eau oxygénée (H2O2, Dako kit) et les sites non spécifiques sont saturés par

une solution du PBS / lait 0,4 % pendant 20 minutes. Les lames sont ensuite mises à incuber

avec l’anticorps primaires anti-TH 1/5000ème (souris) ou anti-met-enképhaline1/500ème (lapin)

ou anti- (DβH) 1/1000ème (lapin) pendant 1 heure à température ambiante. Après plusieurs

rinçages au PBS, les lames sont mises à incuber avec l’anticorps secondaire pendant 15

minutes (biotinylated anti-souris, anti-lapin, anti-chèvre immunoglobulines: Dako kit). Les

lames sont lavées plusieurs fois avec du PBS, puis incubées avec de la streptavidine

peroxydase pendant 10 minutes. La révélation du marquage se fait par une solution

chromogène du DAB (3,3-diaminobenzidine, Dako kit).

Les lames sont mises à incuber avec la solution DAB-substrat chromogène

pendant 1 minute à l’abri de la lumière et les noyaux sont contre-colorés à l’Hématoxyline de

Harris. Les lames sont finalement montées avec de l’Eukitt (SaKura), puis observées.

D- Dosage de catécholamines par HPLC

Les cellules adhérentes sont ensemencées à raison de 1 x 106 cellules/puits sur des

plaques 12 puits, tandis que les cellules encapsulées sont ensemencées à raison de 1 x 106

cellules/8 capsules/puits. La mesure de la sécrétion des catécholamines est effectuée à l’état

basal et après stimulation par 50 µM de nicotine à différent jours de culture sur les cellules

adhérentes et encapsulées après incubation dans 600 µl d’HBSS (Hank’s Balanced Salt

Solution, Gibco), pendant 1 heure à 37°C. Les surnageants de sécrétion sont immédiatement

stockés dans de l’azote liquide.

Les échantillons sont décongelés à la date adéquate et introduit dans le passeur

d’échantillons. La surface du pic inconnu est comparée aux surfaces des standards à l’aide

d’une gamme étalon : Noradrénaline (NE-HCl ; FW de 337,29 g/mol, Sigma) ; Adrénaline

(FW de 333,3 g/mol, Sigma) ; Dopamine (FW de 189,6 g/mol, Sigma).

Les dosages sont effectués selon la technique décrite précédemment (Mercier et

al., 2001) sur un système LCEC composé d’une pompe à débit non pulsé (Waters 610, débit 1

ml/min), d’un injecteur automatique TSP AS 100 XR (injection de 50 µl par échantillon),

d’une colonne phase inverse C 18 (granulométrie 5 µm, longueur 150 mm) maintenue à +

30°C, d’un détecteur électrochimique modèle 464 (électrode de travail en carbone vitreux,

électrode de référence Ag/AgCl) et d’un logiciel intégrateur ICS.

44

5- Etude in vivo Une étude préliminaire de greffe de cellules chromaffines microencapsulées

fabriquées à l’aide de l’encapsulateur et de microcapsules vides (diamètre de microcapsules

compris entre 500 et 710 µm) a été effectuée sur 8 rats.

5.1- Animaux

Toutes les études ont été réalisées sur des rats mâles adultes albinos de la lignée

Sprague-Dawley, provenant du centre d’élevage Janvier (France), pesant entre 225 et 250

grammes à leur arrivée. Les animaux sont placés dans des cages par groupe de 2 à 3, une

semaine avant le début de l’expérience. La nourriture et l’eau sont disponibles à volonté. Au

sein de l’animalerie, une température thermostatée entre18 et 22°C est maintenue. Les

recommandations du comité d’éthique de l’Association Internationale pour l’Etude de la

douleur (IASP) ont été respectées au cours des expériences (Zimmermann 1983).

Pour les études in vivo les animaux sont divisés en 4 groupes : I- Rats greffés dans l’espace I-Th lombaire avec des cellules chromaffines microencapsulées (n=2).

II- Rats greffés dans l’espace I-Th cervical avec des cellules chromaffines microencapsulées (n=2).

III- Rats greffés dans l’espace I-Th lombaire (n=1) et cervical (n=1) avec des microcapsules vides

IV- SHAMS : Rats opérés aux niveaux lombaire et cervicale sans injection de microcapsules (n=2).

- La moitié de rats sera sacrifiée 21 jours post-implantation (Groupe A)

- L’autre moitié sera sacrifiée 30 jours post-implantation (Groupe B)

5.2- Greffe des cellules Chromaffines microencapsulées et des microcapsules vides

Les procédures chirurgicales d’implantation intra-thécale ont été effectuées en

condition d’asepsie stricte sur des animaux anesthésiés par injection intrapéritonéale du

Thiopental 50 mg/kg.

5.2.1- Greffe au niveau lombaire

Les implantations intra-thécale de microcapsules sont effectuées via une

laminectomie lombaire réalisée selon la technique décrite initialement par Sagen (Sagen et al.

1986b). Après anesthésie, les rats sont rasés au niveau de la région lombaire.

Après une préparation cutanée classique avec de la Bétadine dermique, la peau est

incisée sur 3 cm au scalpel. Les insertions musculaires para-vertébrales sont incisées et

détachées le long de l’axe vertébral de façon bilatérale afin de dégager les processus épineux

et articulaires des vertèbres lombaires sur les trois étages L1, L2 et L3. Les processus épineux

des trois vertèbres sont alors coupés aux ciseaux courbes. Les étapes suivantes sont réalisées

sous microscope. La partie corticale lamaire est enlevée dans un premier temps à la fraise

carbone jusqu’à atteindre le ligament jaune puis la fraise diamantée est utilisée à l’approche

de la dure mère.

45

Les derniers fragments osseux retirés, la dure-mère et la membrane arachnoïdienne

sont ouverts sur 2 à 3 mm à l’aide d’une fine aiguille 22G. Les microcapsules remplies de

cellules chromaffines et les microcapsules vides d’un diamètre compris entre 500 et 710 µm

sont implantées selon les procédures suivantes :

Entre 20 et 30 microcapsules sont mises dans le corps de manchons d’un cathéter

20G, puis une seringue de 1 ml contenant 0.5 ml de chlorure de sodium stérile à 0.9 % y est

abouchée. Le manchon est au préalable biseauté puis enfoncé au travers de la dure mère et de

l’arachnoïde, puis glissé sur 2 cm dans l’espace sous-arachnoïdien vers la partie rostrale. Les

capsules sont alors lentement injectées via le manchon dans l’espace intra-thécal autour de la

moelle épinière lombaire. Après injection complète le cathéter est laissé en place quelques

minutes afin d’éviter un reflux au travers de l’ouverture durale, puis il est retiré lentement. Le

tissu musculaire est refermé au fil résorbable 4/0 et la peau est refermée au fil non résorbable.

Les rats sont placés en salle de réveil.

5.2.2- Greffe au niveau cervical

Les microcapsules ont été implantées chirurgicalement au niveau de la grande

cisterne cérébelleuse sur trois rats anesthésiés par voie intrapéritonéale par du Thiopental 50

mg/kg (Abott). Après désinfection à la Bétadine dermique à 10 %, on réalise une incision

cutanée de 3 cm centrée sur la région cervico-occipitale. Les muscles sont progressivement

écartés pour dégager la membrane occipito-atloidïenne. Celle-ci est ensuite ouverte sur 3 mm

à l’aide d’une aiguille 22G et 20-30 microcapsules sont transférées dans la cisterne au contact

de la partie postérieure du tronc cérébral par la technique décrite précédemment. Enfin les

muscles et la peau sont suturés.

5.3- Perfusion intra-cardiaque et fixation des animaux

Trois et quatre semaines après implantation (respectivement Groupe A et B), les

rats sont anesthésiés par injection intra péritonéale (Thiopental 50 mg/kg). Une sterno-

laparotomie médiane a été réalisée pour permettre la perfusion intra-cardiaque (canulation du

ventricule gauche et ouverture simultanée de l’oreillette droite). Les tissus sont d’abord lavés

avec 300 ml de chlorure de sodium (0.9%) dans du tampon phosphate 0,1 M contenant de

l’héparine (5000 U.I/L) puis fixés avec 500 ml de solution de paraformaldéhyde à 4% dans du

tampon phosphate 0.1 M pH 7,2.

5.4- Prélèvement de la moelle épinière

Sous hotte chimique, le rat est placé en position ventrale sur du papier absorbant,

puis la peau est incisée et l’axe vertébral dégagé sur toute sa longueur cervico-dorso-lombaire.

46

Une laminectomie réalisée à l’aide d’une pince gouge permet d’extraire l’axe

médullaire sans lésion tissulaire. A l’aide d’un scalpel, la moelle a été nettoyée des nerfs

rachidiens puis incubée dans des fioles contenant du formol à 4%.

Anesthésie Matériel chirurgical Cathéter

Perfusion intra-cardiaque Prélèvement de la moelle La moelle

Figure (15) : Etapes chirurgicales lors de l’implantation des microcapsules et lors du prélèvement de la

moelle épinière pour la localisation histologique des microcapsules.

5.5- Préparation des coupes histologiques

La préparation des coupes histologiques a été réalisée selon le même protocole

déjà décrit lors de l’étude immuno-histochimique des cellules encapsulées en culture (cf. voir

protocole immuno-histochimie des cellules microencapsulées en culture). Les lames sont

ensuite colorées à l’Hémalun et à l’Orange G, puis elles sont montées avec l’Eukitt. Quand les

capsules sont repérées sur une lame colorée et numérotée, sur ce même ruban, deux coupes

avant et deux coupes après à 5 µm sont prélevées sur des lames gold plus pour l’étude

immunohistochimique.

5.6- Etude immuno-histochimique sur la viabilité des cellules microencapsulées

implantées chez le rat

L’immuno-marquage s’effectue selon le protocole déjà décrit en utilisant les

anticorps primaires anti-TH 1/5000ème (souris) ou anti-met-enképhaline 1/500ème (lapin) (cf.

voir protocole immuno-histochimie des cellules microencapsulées en culture).

47

RESULTATS

48

Les cellules chromaffines bovines (CCB) ont été utilisées dans ce travail en raison

de la facilité d’isolement des ces cellules à partir des glandes surrénales bovines. De plus,

elles présentent l’avantage de pouvoir être isolées en grande quantité, avec une bonne

viabilité, la culture de ce type cellulaire était bien maîtrisée dans notre équipe.

1- Caractérisation des cellules chromaffines bovines in vitro 1.1- Aspect morphologique des cellules chromaffines bovines en culture

L’isolement et la purification des cellules chromaffines à partir des glandes

bovines ont été réalisés selon la technique décrite précédemment par Bader (Bader et al.

1981 ; Bader et al. 2000). Nous avons obtenu des cellules bien dissociées viables à 90 %, ceci

avec un rendement de 1 à 1,5 x 107 cellules par glande.

Comme on peut le voir sur la figure 16, ces cellules in vitro ont un aspect de

cellules étalées et adhérentes au support de culture en formant des amas cellulaires dès le 3ème

jour de culture.

La culture apparaît hétérogène et l’on note la présence d’autres types cellulaires

autres que les cellules chromaffines (fibroblastes, ….).

FIBROBLASTE

CCB

Figure (16) : Aspect morphologique des cellules chromaffines bovinejours après l’isolement et la mise en culture de ces cellules , elles apparaisssupport de culture en formant des amas cellulaires. La culture apparaît hétcultre la présence d’autre types cellulaires (fibroblastes,….). Photograpmicroscope à contraste de phase au grossissement 200.

49

200 X

s en culture (CCB). Trois ent étalées et adhérentes au érogène et l’on note dans la hie réalisée à l’aide d’un

1.2- Mise en évidence de la tyrosine hydroxylase (TH) et de la met-enképhaline (ME)

Une observation qualitative de la fonctionnalité des cellules chromaffines bovines

adhérentes au troisième jour de culture a été effectuée en marquant en fluorescence, la

tyrosine hydroxylase (TH) et la met-enképhaline (ME ).

On observe un marquage positif et intense au niveau cytoplasmique pour la TH

(rouge) et au niveau péri-nucléaire pour la met-enképhaline (verte) (figure 17 B et C).

Ces résultats montrent que les cellules chromaffines bovines sont viables et

fonctionnelles au troisième jour de culture.

Le contre coloration des noyaux cellulaires avec du DAPI (bleu) permet de mettre

en évidence toutes les cellules présentes dans la culture. Il montre que la culture apparaît

hétérogène et l’on note la présence d’autres types cellulaires autres que les cellules

chromaffines (cellules non marquées par la TH ou la ME) (figure 17 B et C).

B

Figure (17): Immuno-marquAu troisième jour de culture deun marquage positif et intense pour la met-enképhaline (vertetémoin négatif, l’anticorps prim

ME

age de la tyrosine hs cellules chromaffi

au niveau cytoplasm). Les noyaux celluaire a été omis. Gro

5

TH

TémoinTémoin

ydroxlase (TH)nes bovines adhéique pour la TH laires sont contrssissement (X 10

0

C

A

et de la met-enképrentes, on observe en(rouge) et au niveau e colorés au DAPI (00).

haline (ME). fluorescence péri-nucléaire bleu). Pour le

2-Faisabilité de l’encapsulation des cellules chromaffines bovines (CCB)

dans des microcapsules d’APA Afin d’évaluer la faisabilité d’encapsulation de CCB, des microcapsules de grande

taille plus facilement observables ont tout d’abord été réalisées. Les cellules chromaffines ont

été encapsulées à l’aide d’une seringue de 50 ml équipée d’une aiguille de 0.6 mm. Après

encapsulation des cellules chromaffines dans des microcapsules de type alginate/poly-L-

lysine/alginate (APA), nous avons étudié la faisabilité de l’utilisation d’une telle formulation

pour ce type de cellules. Pour cela, nous avons mené des études visant à évaluer d’une part les

caractéristiques physicochimiques de ces microcapsules et d’autre part la viabilité et la

fonctionnalité des cellules encapsulées.

2.1- Caractéristiques physicochimiques des microcapsules

A- Observation microscopique

MICROCAPSULE

Figure (18): Cellules chromaffines bovines microencapsulées (CCB) une semaine après la mise en culture. La microcapsule est sphérique et sa surface intacte correspond à la membrane complexe d’alginate/PLL. Photographie réalisée en microscopie optique Olympus CK 40 au grossissement 200.

Les microcapsules ont été observées en microscopie optique afin de vérifier si

elles subissent des changements morphologiques au cours du temps. Une semaine après

l’encapsulation et la mise en culture, la majorité de ces microcapsules apparaissent

sphériques, elles ne s’agglomèrent pas entre elles et leur surface correspond à la membrane

complexe d’alginate-PLL-alginate (figure 18). Le diamètre moyen des microcapsules est égal

à 1,2 mm. Les cellules semblent distribuées dans les microcapsules de façon homogène.

51

Des microcapsules vides et intactes ont été séchées à l’air, puis observées en

microscopie électronique à balayage à faible grossissement X 60 (figure19).

Les microcapsules n’apparaissent plus sphériques, mais aplaties avec une surface

très irrégulière. Après avoir séché, certaines d’entre elles sont cassées. Elles ont de plus

l’aspect d’une coquille plus ou moins recroquevillée sur elle-même, qui correspond à la

membrane complexe des microcapsules.

M

Figure (19): Microcapsules vides apbalayage. Les microcapsules n’apparaisirrégulière. Après séchage, elles ont l’aspmême qui correspond à la membrane cd’alginate-PLL-alginate). Photographie réau grossissement 60.

B- Stabilité et résistance m

Les microcapsules fabriqué

été conservées dans le T1 à 37° C et

culture à la même température. A d

maintien de l’intégrité membranaire d

De plus leur résistance mécanique a

mécanique maximale (en g) requise

diamètre.

L’observation microscopiq

tampon1(tampon de fabrication) com

l’étude (44 jours).

Capsule

rès séchage observées en microscopie électronique à sent plus sphériques, mais aplaties avec une surface très ect d’une coquille vide plus ou moins recroquevillée sur elle omplexe d’alginate-PLL-alginate (M: membrane complexe alisée en microscopie électronique à balayage (Leo 435 VP)

écanique

es sont séparées en deux groupes : le premier groupe a

le deuxième groupe a été conservées dans le milieu de

es temps réguliers (J0, J4, J9, J16, J23, J30, J37, J44), le

es microcapsules a été vérifiée en microscopie optique.

été déterminée par Texturométrie en mesurant la force

pour les comprimer jusqu’à atteindre un tiers de leur

ue montre que les microcapsules restent stables dans le

me dans le milieu de culture pour toute la durée de

52

Au cours du temps, bien qu’on note une diminution de la résistance mécanique

des microcapsules incubées dans les milieu de culture (tampon utilisé) et dans le tampon1

(tampon de fabrication), la résistance mécanique des microcapsules incubées dans le milieu de

culture reste supérieure mais de manière non significative à celle des capsules conservées

dans le tampon de fabrication (figure 20).

0

10

20

30

40

50

60

70

J0 J,75 J1 J4 J7 J11 J14 J21 J25 J32 J39 J44

Temps en jours

Forc

e m

esur

ée (g

) au

max

imum

d'

enfo

ncem

et d

u pi

ston

Mcrocapsules incubées dans le tampon 1Microcapsules incubées dans le milieu de culture

Figure (20): Résistance mécanique des microcapsules vides incubées à 37 °C dans le milieu de culture et dans le tampon1. Les données sont exprimées en force mécanique maximale (en g) requise pour comprimer les microcapsules jusqu’à atteindre un tiers de leur diamètre. Ces résultats représentent les moyennes de la force mécanique (g) ± écart-type de cinq expériences indépendantes.

Les résultats de cette étude montrent que quelques soient les conditions

d’incubation, les microcapsules restent stables et supportent la force appliquée sans rupture.

De plus, ces résultats permettent d’affirmer que les microcapsules conservées dans le milieu

de culture sont plus stables et résistantes que celles conservées dans le tampon1 (figure 20).

C- Perméabilité membranaire

Afin d’évaluer la capacité de la membrane des microcapsules à permettre la diffusion

des substances bio-actives et en même temps à protéger les cellules encapsulées contre le système

immunitaire, une étude évaluant la perméabilité membranaire des microcapsules vis-à-vis de

molécules standards ayant des caractères physicochimiques bien établis a été effectuée.

53

Dans notre étude, trois molécules ont été choisies selon leurs masse moléculaire:

BSA (PM 67 kDa), α-lactalbumine (PM 14,2 kDa) et vitamine B12 (PM 1355 Da).

Les résultats sont exprimés en concentration relative moyenne Ct/C0 où C0 est la

concentration en molécule standard dans les microcapsules au temps zéro (évaluée après

rupture de la membrane des microcapsules) et Ct est celle de soluté libéré au temps t.

Ct/C

0

Temps (heures)

Figure (21) : Cinétique de diffusion des molécules standards à travers la membrane au cours du temps. Les résultats ont été exprimés en concentration relative Ct/C0 (C 0 est la concentration contenue dans les microcapsules au temps zéro évaluée après rupture des microcapsules ; Ct la concentration de la molécule standard libérée au temps t. Chaque résultat représente la moyenne de quatre observations indépendantes ± écart-type. Vitamine B12 (●), α-lactalbumine (○).

Au cours de l’étude (24 h), la vitamine B12 et l’alpha lactalbumine diffusent

librement au travers de la membrane (figure 21). Par contre, la porosité de la membrane n’a

pas permis de charger les microcapsules en BSA. La concentration de cette dernière au cours

du temps de l’étude est donc restée stable et en limite de détection de notre technique de

dosage, sans doute en raison d’une très faible proportion de BSA adsorbée en surface des

microcapsules lors de l’étape de chargement. Ces résultats montrent que les microcapsules

présentent une membrane ayant un seuil de coupure supérieur à 14,2 kDa et inférieur à 67

kDa, ce qui permet la diffusion des substances de faible poids moléculaires telles que les

substances neuroactives et empêche celle de substances de gros poids moléculaires telles que

les immunoglobulines.

54

2.2- Viabilité et fonctionnalité des cellules encapsulées in vitro

A- Viabilité cellulaire

Les cellules adhérentes et encapsulées ont été maintenues en culture jusqu’à 44

jours et une étude comparative de leur viabilité a été réalisée par double marquage en

fluorescence. Puis, les cellules ont été observées en microscopie confocale à balayage laser. A

l’aide de ces techniques nous avons évalué l’influence de l’encapsulation sur la survie

cellulaire.

Les cellules encapsulées sont observées aux jours 4, 15, 23, 30, 37 et 44. Quatre

jours après l'encapsulation, les cellules encapsulées gardent entièrement leur viabilité, comme

indiqué par la fluorescence verte (figure 23 B).

Quelques cellules mortes, colorées en rouge sont observées en périphérie des

microcapsules (figure 22). Elles correspondent vraisemblablement à des cellules

emprisonnées dans le complexe d’alginate-PLL formé pendant l’étape d’élaboration de la

membrane. Au jour 23 les cellules encapsulées sont toujours viables et nombreuses

(fluorescence verte brillante). Quant aux cellules adhérentes, elles sont encore viables, mais

leur nombre est inférieur à celui des cellules encapsulées (figure 23A).

Du jour 30 au jour 44, bien que les cellules encapsulées vivantes soient encore

nombreuses, le nombre de cellules mortes augmente, notamment à J37 et à J44 (figure 23B).

Pour les cellules adhérentes, le nombre de cellules vivantes a fortement diminué, la

fluorescence devient difficilement détectable à partir de J30 en raison de la mortalité cellulaire

(figure 23A). De plus, les cellules mortes se détachent plus facilement de leur support de

culture lors des changements du milieu de culture et des étapes de rinçage après l’ajout des

marqueurs. Ceci pourrait expliquer la forte diminution du nombre des cellules adhérentes

viables et l’absence de fluorescence rouge à J30 et à J37. Toutes les cellules adhérentes

détectables sont mortes à J44 (figure 23A).

Figure (22) : Observation du bord des microcapsules marquées en florescence.

55

A BJ4

J15

J23

J30

J37

J44

Figure (23) Viabilité cellulaire des cellules chromaffines bovines adhérentes (A) et encapsulées (B) observée en microscopie confocale à différents jours de culture. Les photos représentent l’aspect d’une section optique de 24,3 µm. La viabilité cellulaire a été montrée par l’émission d’une fluorescence verte provoquée par la transformation de la calcéine AM en calcéine par une estérase ATP- dépendante caractéristique des cellules vivantes. La mortalité cellulaire quant à elle est indiquée par l’émission d’une fluorescence rouge déclenchée par la liaison d’éthidium homodimer aux acides nucléiques des cellules mortes. Échelle 200 µm.

Figure (23) Viabilité cellulaire des cellules chromaffines bovines adhérentes (A) et encapsulées (B) observée en microscopie confocale à différents jours de culture. Les photos représentent l’aspect d’une section optique de 24,3 µm. La viabilité cellulaire a été montrée par l’émission d’une fluorescence verte provoquée par la transformation de la calcéine AM en calcéine par une estérase ATP- dépendante caractéristique des cellules vivantes. La mortalité cellulaire quant à elle est indiquée par l’émission d’une fluorescence rouge déclenchée par la liaison d’éthidium homodimer aux acides nucléiques des cellules mortes. Échelle 200 µm.

56

B- Immuno-détection de la tyrosine hydroxlase (TH)

L’expression de la tyrosine hydroxlase (TH : enzyme clé dans la synthèse des

catécholamines) a été analysée par la technique de Western Blot pour les cellules adhérentes

et encapsulées au cours du temps (J1 J4, J9, J16, J23, J30). Sur la figure 24, on observe une seule

bande à 55 kDa correspondant à la TH. La TH est fortement exprimée dans les cellules

adhérentes et dans les cellules encapsulées et son expression est quasiment stable au cours de

l’étude et jusqu’à J30.

A- CCB en culture

Figure (24) encapsulées lysées et 50 µ

A

les cellules

ont été intég

significative

cellules adh

90 kDa

TH (55 kDa)

Actine (42 kDa)

J1 J4 J9 J16 J23 J30

36.2 kDa

51.2 kDa

B- CCB encapsulées

90

J1 J4 J9 J16 J23 J30 90 kDa

51.2 kDa

36.2 kDa

: Evaluation de l’expression de la TH dans les cellules adhér(B). Aux différents intervalles, les cellules adhérentes et encapg de protéine totale a été analysé en Western Blot en utilisant l’a

fin de comparer le niveau d’expression de la TH pour les

adhérentes, les bandes correspondantes à la TH et à l’actin

rées et le ratio TH/actine est alors calculé pour chaque grou

n’est observée pour l’expression de la TH entre les cell

érentes (figure 25).

57

TH (55 kDa)

e

u

Actine (42 kDa)

entes (A) et les cellules sulées ont été soniquées, nticorps anti-TH.

cellules encapsulées et

(protéine ubiquitaire)

pe. Aucune différence

les encapsulées et les

0

1

2

3

4

5

J1 J4 J9 J16 J23 J30

Jours en culture

Rat

io T

H/A

ctin

e

CCB adhérentesCCB encapsulées

Figure (25) : Semi-quantification relative de l’expression de la TH dans les cellules adhérentes et les cellules encapsulées. Ces résultats représentent les moyennes ± écart-type de trois expériences indépendantes.

C- Mise en évidence de la tyrosine hydroxlase

L’expression de la tyrosine hydroxlase dans les cellules microencapsulées a

également étudiée 37 jours post-encapsulation par une étude immuno-histochimique.

Sur la figure 26, on observe un marquage positif et cytoplasmique pour la TH.

Ces résultats confirment que les cellules Chromaffines bovines encapsulées sont viables et

fonctionnelles 37 jours post-encapsulation en exprimant spécifiquement la TH.

n 7

Figureencapantigéncytopl

Témoi

(26): Expression de la TH dans les cesulation. L’immuno-marquage est fait suique. Il a été effectué avec l’anticorps

asmique pour la TH. Pour le témoin, l’antico

5

TH à J 3

llules chromaffines encapsulées 37 jours post-r des coupes en paraffines après réactivation

anti-TH en montrant un marquage positif et rps primaire a été omis au grossissement 1000.

8

D- Sécrétion des catécholamines

Afin d’évaluer la fonctionnalité des cellules adhérentes et encapsulées, nous avons

mesuré les taux des catécholamines sécrétées par HPLC. Cette sécrétion a été évaluée à

différents jours de culture à l’état basal et stimulé par la nicotine comme il est présenté dans

la figure 27 A et B.

Dans le cas des cellules adhérentes, les taux de sécrétion basale des

catécholamines augmentent de J1 à J4, puis diminuent progressivement jusqu’à J30. Après ce

jour les catécholamines ne sont plus détectées. Les cellules sont mortes comme l’a montré

l’étude de la viabilité par microscopie confocale. Ces cellules montrent également le même

profil de sécrétion des catécholamines en réponse à une stimulation nicotinique (maximum à

J4), mais les taux de des catécholamines sécrétées sont élevés par rapport aux taux de

catécholamines sécrétées en état basal (figure 27 A).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 4 9 16 23 30 44

Jours en culture

Cat

écho

lam

ines

(µg/

106

cellu

les)

A CCB

CCB + Nicotine

Figure (27 A) : Sécrétion des catécholamines par les cellules chromaffines bovines adhérentes. Les catécholamines sécrétées par les cellules adhérentes ont été mesurées par HPLC à J1, J4, J9, J16, J23, J30 et J44 après isolement cellulaire et mise en culture, selon les conditions définies dans le matériel et méthodes. Les données sont exprimées en µg/106 cellules après une heure d’incubation dans un tampon HBSS en condition basale ou après stimulation par nicotine (50 µM). Ces résultats représentent les moyennes ± SE de deux expériences indépendantes.

Pour les cellules encapsulées, le taux basal maximum de sécrétion se trouve à J1,

mais il diminue à partir de J4 pour se stabiliser à partir de J16 et jusqu’ à J44. Aux différents

temps examinés, on observe une augmentation de la sécrétion de catécholamines en réponse à

la stimulation nicotinique. Le taux maximum se trouve à J4.

59

Puis, le taux des catécholamines sécrétées commence à diminuer à partir de J9

pour se stabiliser à partir de J16, en montrant le même profil de sécrétion basale (figure 27 B).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 4 9 16 23 37 44Jours en culture

Cat

écho

lam

ines

(µg/

106 ce

lls) CCB encapsulées + Nicotine

CCB encapsulées

B

Figure (27 B) : Sécrétion des catécholamines par les cellules chromaffines bovines encapsulées. Les catécholamines sécrétées par les cellules encapsulées en culture ont été mesurées par HPLC à J1, J4, J9, J16, J23, J37 et J44 après isolement cellulaire et mise en culture, selon les conditions définies dans le matériel et méthodes. Les données sont exprimées en µg/106 cellules après une heure d’incubation dans un tampon HBSS, en condition basale ou après stimulation par nicotine (50 µM). Ces résultats représentent les moyennes ± SE de deux expériences indépendantes.

En utilisant le test T de Student, la comparaison des taux de catécholamines

sécrétées à l’état basal et stimulé de J1 à J 23 par les cellules adhérentes et les cellules

encapsulées n’a pas mis en évidence de différence significative entre les deux groupes aux

jours 1, 9, 16 et 23. Cependant au jour 4, on note une différence significative entre les deux

groupes, les taux de sécrétion basal et stimulé des catécholamines pour les cellules

encapsulées sont inférieurs à ceux des cellules adhérentes (p<0.01).

Le teste ANOVA effectué sur les données obtenues des cellules adhérentes et

encapsulées, stimulées avec la nicotine ou non montre une influence significative de trois

facteurs étudiés (jours après isolement, stimulation nicotinique et microencapsulation).

L’ensemble de ces résultats montre que, pour les cellules encapsulées et

adhérentes, une sécrétion basale et stimulée de catécholamines est observée. Ces sécrétions

tendent à baisser au cours du temps en raison de la diminution du nombre de cellules vivantes.

Seules les cellules encapsulées continuent à sécréter des catécholamines et à répondre à la

stimulation nicotinique après 30 jours.

60

3- Faisabilité de l’implantation intra-thécale de CCB encapsulées dans des

microcapsules de petite taille

Pour être implantées chez le rat, les microcapsules doivent présenter un diamètre

inférieur à 750 µm afin de passer à travers le cathéter utilisé pour l’implantation. Un

encapsulateur équipé d’une buse de 300 µm a donc été utilisé pour préparer des microcapsules

APA. Les microcapsules ainsi obtenues ont été caractérisées en terme de morphologie,

répartition granulométrique et résistance mécanique, avant de réaliser une étude préliminaire

d’implantation chez le rat.

3.1-Caractéristiques physicochimiques des microcapsules

A- Aspect morphologique

L’observation en microscopie inversée (figure 29) effectuée sept jours après

l’encapsulation et la mise en culture des cellules chromaffines montre que les microcapsules

sont majoritairement sphériques, leur surface est intègre et correspond à la membrane

complexe d’alginate-PLL-alginate. L’observation microscopique montre également que les

cellules semblent être distribuées de façon homogène dans les microcapsules. L’aspect

morphologique des microcapsules est resté identique au cours de l’étude (35 jours). Aucune

contamination n’a été observée.

Figure (29) : Aspect morphologique d’une mbovine (CCB) sept jours après l’encapsulatioforme sphérique, leur surface, intacte, corresponLes cellules sont distribuées dans les microcapmicroscope inversé au grossissement 100.

CCB

MEMBRANE

icrocapsule contenant des cellules chromaffines n et la mise en culture. Les microcapsules sont de d à la membrane complexe d’alginate/PLL/alginate. sules de façon homogène. Photographie réalisée au

61

B- Répartition granulométrique des microcapsules

Afin de déterminer la répartition granulométrique des microcapsules produites à

l’aide de l’encapsulateur équipé d’une buse de 300 µm, différentes techniques ont été testées.

Les microcapsules ont été étudiées par microscopie optique, diffraction de la lumière et

tamisage. La diamètre moyen (D max) observé en microscopie optique est de 700 µm en

moyenne. Les résultats obtenus pas diffraction de la lumière donnent un diamètre moyen en

surface des particules D [3,2] de 414 µm, une moyenne en volume de 760 µm et un indice de

polydispersité de 0,64.

Afin de se rapprocher le plus possible des dimensions réelles des microcapsules

devant passer dans le cathéter, la technique du tamisage a aussi été testée pour déterminer la

répartition granulométrique des microcapsules et sélectionner celles susceptibles de subir le

passage au travers d’un cathéter pour injecter chez le rat. Les microcapsules sont tamisées par

passages successifs au travers de tamis de tailles décroissantes. Le poids de ces tamis avant et

après passage des microcapsules ayant été déterminé, le pourcentage de microcapsules

récupérées sur le tamis de 710 µm est de 18,46 % ± 2,75% ; celui des capsules récupérées sur

le tamis de 500 µm est de 77,16 % ± 4,01% et enfin celui des capsules récupérées sur le tamis

de 315 µm est de 4,13 % ± 1,56 % (figure 30).

0

20

40

60

80

100

315-500 µm 500-710 µm > 710 µm

Taille moyenne

pour

cent

age

de c

apsu

les

Figure (30): Répartition granulométrique des microcapsules de petit taille. La répartition granulométrique des microcapsules a été estimée par tamisage, elles sont tamisées successivement à travers des tamis de tailles décroissantes, pesés avant et après le passage des microcapsules. Les résultats représentent les moyennes de trois expériences indépendantes ± écart-type.

62

Ces résultats permettent de conclure que la majorité des microcapsules fabriquées

ont un diamètre (D tamis) compris entre 500 et 710 µm. La répartition des diamètres mesurés

peut s’expliquer par l’augmentation passagère de la vitesse de fabrication des microcapsules

appliquée occasionnellement en cours de fabrication pour éviter l’obstruction de la buse par

des agrégats cellulaires.

Ces derniers résultats montrent qu’il est possible de récupérer une quantité

suffisante de microcapsules pour envisager un cathéter ou des manchons de diamètre interne

allant de 760 à 1300 µm pour une implantation des microcapsules vides ou chargées en

cellules chromaffines chez le rat par voie intra-thécale.

C- Résistance mécanique

Pour être implantées chez le rat, les microcapsules auront à subir des contraintes

mécaniques non négligeables. Il est donc important de tester leur résistance mécanique avant

implantation. La résistance mécanique des microcapsules est déterminée en testant leur

passage au travers d’un cathéter en polyéthylène et des manchons de cathéters de tailles

variables (figure 31). Après passage de microcapsules, le nombre de capsules intactes et de

capsules déformées est alors compté. Ceci permet également de choisir le moyen le plus

convenable pour les implanter. Le nombre de microcapsules déformées est considéré comme

une indication du stress subi par les microcapsules à l’injection. Une membrane déformée sera

fragilisée et pourrait ultérieurement présenter des risques de rupture accrus après implantation

d’où la nécessité d’utiliser le procédé d’injection limitant au maximum ce phénomène.

B C A

Figure (31): Aspect morpholo iqtaille variable et dans un cathéttravers de manchon du cathéter 1travers de manchon du cathéters 2travers de cathéter en polyéthylèneSZ-PT au grossissement 60 X.

C

ue des microcapsules après leur passage dans des manchons de

g er en polyéthylène. (A) représen8 G (diamètre interne 1,3 mm), 0 G (diamètre interne 1,1 mm) et (diamètre interne 760 µm). Photo

63

te les microcapsules passées au (B) représente celles passées au (C) représente celles passées au s prises avec une loupe Olympus

Pour les capsules vides, les résultats présentés sur la figure 32A montrent que

- lors du passages de 30 capsules via le manchon du cathéter 18G (diamètre interne de

1,3 mm), 63,3 % ± 5,4 % de ces capsules sont récupérées intactes,

- lors du passages de 30 capsules via le manchon du cathéter 20G (diamètre interne de

1,1 mm), 56,7 % ± 3,8 % de ces capsules sont récupérées intactes,

- enfin lors du passages de 30 capsules via le cathéter en polyéthylène (diamètre interne

de 760 µm), 33,3 % ± 7,2 % de ces capsules sont récupérées intactes.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pour

cent

age

de c

apsu

les

inta

ctes

et d

efor

mée

s

Capsules intactesCapsules deformées

%

Figure (32 A) : Intégrmicrocapsules sont papolyéthylène. Le nomrésistance mécanique ereprésentent les moyen

Dans le ca

(30 capsules) sont pas

présentés sur la figu

intacte après leur pas

récupérées intactes a

des capsules sont réc

63,3

A

Manchon ducathéter 18 G c

%

%

ité des microcapsules vissées dans des manchonbre des microcapsules pt de choisir le moyen le pnes ± écart-type de quatre

s des capsules chargées en

sées via les manchons

re 32B montrent que,

sages via le manchon d

près leur passages via l

upérées intactes après le

56,7

Manchon duathéter 20 G p

%

des lors de l’étude de las de cathéters 18 et 20assées et leur état est élus adéquat pour les inje expériences indépendant

cellules chromaffines, le

et via le cathéter en p

66,7 % ± 2,4 % des

u cathéter 18G, 60 % ±

e manchon du cathéter

ur passage via le cathé

64

33,3

13,3 16,7 %

Catolyét

résista G et valué

cter chees.

même

olyéthy

capsule

6,2 %

20G e

ter en p

16,7 %

héterhylène

nce mécanique. Les dans un cathéter en afin d’apprécier leur z le rat. Ces résultats

nombre des capsules

lène. Le résultats

s sont récupérées

des capsules sont

t 36,7 % ± 5,4 %

olyéthylène.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pour

cent

age

de c

apsu

les

inta

ctes

et d

efor

mée

s

Capsules intactes B

Figure (32 B) la résistance met dans un cathd’apprécier leurat. Ces résulta

Bi

montre une m

n’a pas pu êt

quant à lui n’

conserver l’i

manchon du c

(respectiveme

pression indu

manchon. De

32A et B mo

mécanique de

Mc

Capsules deformées

%

: Intéécan

éter er résists repr

en qu

eilleu

re util

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ntégri

athét

nt ca

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plus,

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66,7

anchon duathéter 18 G

Mc

%

%

grité des microcapsules cique. Les microcapsules son polyéthylène. Le nombretance mécanique et de choésentent les moyennes ± éc

e le passage des microc

re conservation de l’aspe

isé en raison de son trop

pu être utilisé car son d

té des microcapsules. C

er 20G. En effet entre 56

psules vides et capsule

t conservent leur intégr

l’analyse statistique (Stu

qu’il n’y a pas de diffé

rocapsules vides et celle

60

anchon duathéter 20 G p

%

hargées en cellules chromnt passées dans des manch des microcapsules passéeisir le moyen le plus adéqart-type de quatre expérie

apsules au travers du

ct morphologique des m

gros diamètre externe.

iamètre interne est trop

hez le rat il sera don

,7 % ± 3,8 % et 60 % ±

s contenant des cellu

ité morphologique lors

dent T Test) des résulta

rence statistique signif

des microcapsules charg

65

36,7

13, 3 13, 3 %

Catolyét

affineons des et leuuat pounces in

manch

icroca

Le ca

petit

c néc

6,2 %

les) so

de le

ts prés

icative

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13, 3 %

héterhylène

s lors de l’étude de cathéters 18 et 20 G r état est évalué afin r les injecter chez le

dépendantes.

on de cathéter 18G

psules, ce manchon

théter polyéthylène

et ne permet pas de

essaire d’utiliser le

des microcapsules

nt résistantes à la

ur passage dans ce

entés dans la figure

entre la résistance

cellules.

3.2-Viabilité et fonctionnalité des cellules encapsulées in vitro

A- Viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire a également été étudiée sur les microcapsules de petite taille.

Les cellules encapsulées ont été maintenues en culture jusqu’au jour 35 et leur viabilité a été

évaluée par double marquage en fluorescence et observation en microscopie confocale. Les

cellules encapsulées ont été observées aux jours 15 et 35 (figure 33).

La section optique de 50 µm montre que les cellules sont réparties de façon

homogène dans les microcapsules. On note de fluorescence rouge autour des microcapsules,

liée aux cellules mortes emprisonnées dans le complexe d’alginate-PLL formé pendant l’étape

d’élaboration de la membrane. En plus, des cellules vivantes (verte) et des amas cellulaires

(jaunes) sont observés. Les cellules colorées en jaune correspondent vraisemblablement à des

amas cellulaires composés de cellules mortes et vivantes.

Au jour 15, les cellules encapsulées sont majoritairement viables (fluorescence

verte). Des cellules mortes, colorées en rouge sont observées en périphérie des microcapsules,

quelques unes se trouvent au centre.

Au jour 35, la proportion verte/rouge (vivantes/mortes) semble stable, indiquant

une viabilité maintenue des cellules encapsulées sur cette durée de l’étude.

5

Fmopcdc

J15

igure icrosc

ptique rovoquaractéri’une fellules

J1

(33) : Viabilité cellulaire des cellules opie confocale à différents jours de cultude 50 µm. La viabilité cellulaire a été ée par la transformation de la calcéine Astique des cellules vivantes. La mortalité luorescence rouge déclenchée par la liaisonmortes. Échelle 100 µm.

6

J35

chromaffines bovines encapsulées observée en

re. Les photos représentent l’aspect d’une section montrée par l’émission d’une fluorescence verte M en calcéine par une estérase ATP- dépendante cellulaire quant à elle est indiquée par l’émission d’éthidium homodimer aux acides nucléiques des

6

B- Immuno-détection de la tyrosine hydroxlase

Nous avons analysé l’expression de la tyrosine hydroxlase dans les cellules

encapsulées dans les microcapsules de petite taille, en utilisant la technique du Western Blot

aux jours 4, 16, 23 et 35.

On observe une seule bande à 55 kDa correspondant à la TH. La TH est fortement

exprimée dans les cellules encapsulées et son expression est quasiment stable du jour 4 au

jour 23, et qui semble diminuer ensuite (figure 34).

J4 J16 J23 J3590 kDa

51.2 kDa

36.2 kDa

TH (55 kDa)

Actine (42 kDa)

Ratio TH/actine3.64 3.61 3.57 3.05

Figure (34) : Evaluation de l’expression de la TH au cours du temps. Aux jours indiqués l’expression de la TH est mise en évidence en Western-Blot. Les cellules encapsulées sont soniquées lysées et 50 µg de protéine totale a été analysé pour l’expression de la TH en utilisant l’anticorps anti-TH. Une Semi-quantification a été réalisée par rapport à l’expression de l’actine prise comme contrôle interne. Ces résultats représentent les moyennes ± écart-type de trois expériences indépendantes.

67

C- Mise en évidence des marqueurs de cellules chromaffines

La fonctionnalité des cellules encapsulées dans les microcapsules de petite taille a

été déterminée par la mise en évidence de la TH, de la met enképhaline (ME) et de la DβH.

Les résultats présentés dans la figure 35 concernant l’étude immuno-histochimique

montrent que les cellules chromaffines bovines encapsulées sont viables et fonctionnelles 35

jours post-encapsulation. Elles expriment encore la TH, la met-enképhaline (ME) et la DβH.

Ceci montre également que les cellules chromaffines sont catécholaminergiques et sécrètent

des substances aux propriétés analgésiques.

n

Figumicrréacchroprim

Témoi

re (35) : Mise en évidence des marqueurs docapsules de petite taille. L’immuno-marqua

tivation antigénique. Un marquage positif pourmaffines est observé 35 jours post-encapsulationaire a été omis Pour le témoin, l’anticorps prima

68

DßH

TH

ME

e cellules chromaffines encapsulége est fait sur des coupes en par les trois protéines caractéristiques et mise en culture. Pour le témoinire a été omis. Grossissement (X 500

J35

J35 J35

es dans les affine après de cellules , l’anticorps ).

3.3- Etude in vivo

Les implantations intra-thécale de microcapsules (entre 20 et 30 microcapsules)

sont effectuées au niveau lombaire et cervical, puis les rats sont sacrifiés trois et quatre

semaines post-implantation afin de prélever les moelles pour des études microscopiques et

histologiques.

A- Observation macroscopique et microscopique

Trois semaines et un mois après implantation les rats sont sacrifiés. Après

prélèvement de la moelle, une observation macroscopique a été effectuée afin de localiser les

microcapsules. Les microcapsules devraient apparaître au niveau du site d’implantation

(moelle lombaire ou cervicale). Elles sont en contact étroit avec le tissu médullaire.

Une observation microscopique est réalisée après inclusion des prélèvements en

paraffine, coupes au microtome et coloration à l’Hémalun et à l’Orange G. L’observation

microscopique des coupes montre que sur la moelle des rats greffés au niveau lombaire, des

microcapsules se trouvent adhérentes aux tissus (figure 36B). Par contre, les capsules greffées

au niveau cervical sont situées autour de la moelle et à coté cervelet (figure 36A). De plus, la

coloration montre que les noyaux cellulaires sont bien définis, ceci démontre que les cellules

encapsules implantées sont viables trois semaines post-implantation (figure 36A).

B- Réaction vis-à-vis des microcapsules

L’observation microscopique de la moelle épinière colorée à l’Hémalun et à

l’Orange G (3 semaines et un mois après implantation) n’a pas mis en évidence de réaction

inflammatoire vis-à-vis des microcapsules. On n’observe pas à ce stade la présence d’infiltrat

lymphocytaire (figure 36A et B).

Bien que ces résultats préliminaires montrent l’absence de réponse immunitaire

vis-à-vis des microcapsules, d’autres investigations sont nécessaires pour confirmer ces

résultats.

69

Capsule

500 X

Capsule

500 X

B

Capsule

Figure (36) : Observation microscopique de la moelle épinière après coloration à l’Hémalun et à l’Orange G. Nous observons des microcapsules sur les coupes et une absence d’infiltrat lymphocytaire autour des microcapsules. Les photos ont été prises en microscopie optique (Leitz Dialux 20). (A) capsule contenant des cellules greffée au niveau de la moelle cervicale, (B) capsule vide greffée au niveau de la moelle lombaire.

70

80 X

A Cervelet

Cellules Chromaffines

Cellules Chromaffines

Moelle lombaire

Viabilité et fonctionnalité des cellules microencapsulées implantées chez le rat

Bien que l’on retrouve difficilement les microcapsules sur les coupes histologiques

de moelle épinière en raison de leur perte lors de l’implantation et des étapes expérimentales

histologiques (déshydrations, réhydrations, réactivation antigénique à micro-onde, rinçage

plusieurs fois, ….), les cellules chromaffines retrouvées sur ces coupes sont viables et

fonctionnelles trois semaines après leur implantation chez le rat en exprimant la tyrosine

hydroxlase (TH) et la met-enképhaline (ME).

60 X 60 X

CCB

CAPSULE

1000 X

1

Figure (37) Mise en évidence in vaprès la greffe, les rats sont sacrifiincluses en paraffine. Les moelles loG (HO). Des coupes sont faites pbovine (CCB) trouvées sur ces coupeen montrant un marquage positif ma

Cervelet

B

HO

1000 X CCB

HO

TH

000 X

ivo des cellules chromaffines bovines és et perfusés avec du PFA, les moelmbaires et cervicales sont coupées, colorour l’étude immuno-histochimique (IHs sont fonctionnelles trois semaines aprèis faible pour la TH et pour la ME.

71

Cervelet

CC

IHC

ME

encapsulées. Trois semaines les sont disséquées, fixées et ées à l’Hémalun et à l’Orange C), les cellules chromaffines s leur implantation chez le rat

DISCUSSION

72

Les douleurs neuropathiques demeurent un problème majeur de santé publique.

Sur le plan clinique, ces douleurs sont résistantes aux analgésiques habituels et représentent

un véritable challenge thérapeutique (Kennedy 2007). Ces douleurs, qui surviennent en

l’absence de stimulation douloureuse, sont fréquentes (1 % de la population et représentent 30

à 40 % des consultations dans les Centres d’Evaluation et de Traitement de la Douleur "Etude

TRIDENT réalisée par Novartis, 2001". Actuellement on estime que même les thérapies les

plus sophistiquées apportent un effet analgésique bon ou modéré chez moins de 30 % des

patients atteints de douleurs chroniques rebelles d’origine non maligne (Jensen 2005).

Les stratégies actuelles du traitement des douleurs neuropathiques reposent sur des

mécanismes découverts récemment. Deux approches essentielles sont en développement :

l’approche pharmacologique avec de nouvelles molécules basées sur les mécanismes

moléculaires des douleurs neuropathiques (antagoniste du glutamate et agonistes GABA) et la

thérapie cellulaire afin de restaurer l’ensemble des fonctions nerveuses.

Deux approches différentes ont été réalisées dans la thérapie cellulaire des

douleurs chroniques (Czech et Sagen 1995). La première consiste à transplanter dans l’espace

intra-thécal des morceaux de tissu médullo-surrénalien allogénique. Celle-ci a donné des

résultats prometteurs dans plusieurs essais cliniques et a été proposée comme une alternative

au traitement des douleurs cancéreuses rebelles (Winnie et al. 1993 ; Lazorthes et al. 2000a).

De plus, cette technique a permis de vérifier la faisabilité, l’innocuité et l’efficacité potentielle

du concept mais elle reste inutilisable en clinique humaine du fait du faible nombre de dons

d’organes et de la lourdeur de préparation du greffon (Czech et Sagen 1995 ; Lazorthes et al.

2000b).

La deuxième approche est l’utilisation de sources cellulaires alternatives telles que

les cellules chromaffines xénogéniques provenant de bétail consommable. Celle-ci pourrait

permettre une extension de la technique en évitant les problèmes d’approvisionnement

tissulaire rencontré dans l’allogreffe. Plusieurs travaux ont montré que les cellules

chromaffines bovines pouvaient être utilisées dans la thérapie cellulaire des douleurs

chroniques. Elles présentent l’avantage de pouvoir être isolées en grande quantité, avec une

bonne viabilité et surtout de pouvoir être purifiées afin d’obtenir des suspensions contenant

entre 70 à 95 % de cellules chromaffines. De plus, les xénogreffes de cellules chromaffines se

comportent comme des systèmes implantables, en libérant de manière continue dans le SNC

des substances aux propriétés analgésiques telles que les catécholamines et les enképhalines

(Wilson et al. 1982).

73

Malgré le privilège immunologique du système nerveux central, il semble que les

transplants xénogéniques dégénèrent rapidement si un traitement immunosuppresseur n’est

pas mis en route, au moins à court terme (Ortega et al. 1992). Or, les effets indésirables,

notamment digestifs, et la toxicité à long terme de la ciclosporine A suscitent de sérieuses

réserves vis-à-vis d’une telle stratégie thérapeutique immunosuppressive.

La technique d’immuno-isolement pourrait être une alternative pour implanter les

cellules vivantes dans le système nerveux central. Il s’agit de la bio-encapsulation. Les

capsules protègent les cellules encapsulées par l’édification à leur périphérie d’une membrane

permi-sélective qui permet une diffusion dans les deux sens de substances de faible poids

moléculaire telles que les sécrétions cellulaires bio-actives, les nutriments, les électrolytes,

l’oxygène et les facteurs neurotrophiques de l’hôte. De plus, elle joue le rôle de barrière vis-à-

vis des molécules de gros poids moléculaire telles que les immunoglobulines et/ou des

facteurs du complément (Lim et Sun 1980 ; Aebischer et al. 1988).

Mais la mise en œuvre de cette membrane ne doit pas nuire à la viabilité et à la

fonctionnalité des cellules encapsulées. Les matériaux constitutifs de la membrane doivent

donc être biocompatibles, à la fois pour les cellules à encapsuler et pour l’hôte (De Vos et al.

1993 ; Li 1998). Enfin, la structure ainsi conçue doit être suffisamment stable pour conserver

ses propriétés physicochimiques et pour obtenir un effet thérapeutique efficace (Li 1998 ;

Uludag et al. 2000).

Les premières études pré-cliniques et cliniques concernant l’utilisation des cellules

chromaffines encapsulées dans le traitement des douleurs chroniques ont été réalisées en

implantant des macrosystèmes (Aebischer et al. 1994 ; Joseph et al. 1994 ; Buchser et al.

1996 ; Linder et al. 2000 ; Winn et Emerich 2005). D’autres ont été effectuées en implantant

des microcapsules (Kim et al 2004; Jeon et al. 2006). Au niveau du choix macroencapsulation

versus microencapsulation, les avis sont très controversés : certains auteurs préfèrent un seul

implant qui grâce à sa taille peut contenir un grand nombre de cellules (Joseph et al. 1994 ;

Date et al. 2000 ; Broadhead et al. 2002) ; d’autres préfèrent les microcapsules qui permettent

une meilleure diffusion au travers la membrane et une meilleure viabilité cellulaire

accompagnée d’une facilité d’implantation grâce à leur petit diamètre (Uludag et al. 2000 ;

Kim et al 2004 ; Jeon et al. 2006).

En fait, les encapsulations cellulaires sont assez récentes dans le traitement de la

douleur, il existe très peu d’études disponibles concernant les cellules chromaffines

microencapsulées dans ce domaine.

74

Dans notre laboratoire, nous avons développé une technique d’encapsulation des

cellules chromaffines dans des microcapsules d’alginate-PLL-alginate (APA). Ce système est

considéré comme étant le complexe de choix spécialement pour des applications in vivo

(Goosen et al. 1985 ; Stang et al. 1993 ; De vos et al. 2003 ; Yoshioka et al. 2003 ; Bünger et

al. 2005), d’autant plus que durant la dernière décennie beaucoup de progrès ont été réalisés

dans la connaissance du polymère et de l’influence du procédé de préparation sur les

propriétés des microcapsules d’APA résultantes (King et al. 1987 ; Thu et al. 1996 ; De vos et

al. 1997). Les techniques d’encapsulation se sont modernisées (Uludag et al. 2000 ; Orive et

al. 2003 ; Darrabie et al. 2005 ; Dufrane et al. 2006 ; Jeon et al. 2006), des automates ont été

mis au point et sont désormais commercialisés, rendant la préparation des microcapsules plus

simple, plus rapide et plus reproductible.

Notre travail a débuté par l’isolement, la culture et la caractérisation de cellules

chromaffines bovines. Le nombre de cellules isolées à partir des glandes bovines était estimé

à 1-1,5 x 107 / glande. L’isolement de cellules chromaffines dépend avant tout de l’efficacité

de la digestion enzymatique de la médullosurrénale. Celle-ci est fonction du temps de

digestion, de la concentration en collagénase ainsi que de facteurs humains tels que la

technique de dissociation et la technique de perfusion des glandes. Après l’isolement, la

viabilité cellulaire a été appréciée par la méthode d’exclusion au trypan bleu en montrant 10

% de cellules mortes. Ces résultats sont en accord avec les résultats déjà obtenus dans notre

laboratoire (Sol et al. 2004).

La culture apparaît hétérogène, on note la présence d’autres types cellulaires telles

que des cellules fibroblastiques, des cellules endothéliales et des cellules corticales en raison

d’une purification incomplète. Cependant, il a été suggéré que la présence des cellules

corticales en co-culture avec les cellules chromaffines contribue à améliorer leur viabilité et

l’activité des cellules chromaffines en recréant en quelque sorte leur microenvironnement

physiologique et en améliorant ainsi la survie des greffes in vivo (Sagen et al. 1991 ;

Vizzardelli et al. 2001). L’étude immuno-cytochimique montre également que les cellules

chromaffines bovines sont catécholaminergiques (expriment la TH) et contiennent des

substances aux propriétés analgésiques (la met-enképhaline).

Ces résultats sont corrélés avec ceux de la littérature (Livett et al.1981) et déjà

obtenus dans notre laboratoire (Sol et al. 2004).

75

La microencapsulation de cellules chromaffines dans les microcapsules

d’alginate/PLL/alginate (APA) a été réalisée selon la technique décrite par Goosen avec

quelques modifications (Goosen et al. 1985). L’immobilisation des cellules vivantes dans des

microcapsules d’alginate présente l’avantage d’être une technique simple et facile (Downing

et al. 1980 ; Uludag et al. 2000).

L’alginate choisi est sous forme de sel de sodium et présente une viscosité égale à

2960 cps à 25°C en solution aqueuse à 2%. Cette caractéristique permet d’envisager le

passage dans un encapsulateur équipé de buses allant de 800 µm à 200 µm, et d’obtenir des

microsphères bien formées et résistantes en présence de chlorure de calcium. L’alginate choisi

présente un rapport M/G de 0.96, car les alginates riches en acide mannuronique (M)

interagissent rapidement et facilement avec les polycations en donnant des capsules ayant des

membranes plus stables (De Vos et al. 1997). De plus, les microcapsules formées avec ce type

d’alginate sont biocompatibles in vivo (Duvivier-Kali et al. 2001).

La technique de préchargement utilisée présente des avantages comparativement à

celle de post-chargement (moindre risque de contamination, fort taux d’encapsulation de 3

millions cellules/ml d’alginate). Les cellules sont mélangées avec une solution d’alginate de

sodium à 1,5 % p/v. Dans le cas d’encapsulation de cellules vivantes, la mise en solution de

l’alginate de sodium est réalisée dans une solution de tampon 1. Le pH joue bien évidemment

un rôle fondamental dans l’encapsulation cellulaire, les cellules vivantes étant très sensibles à

ses variations. Des conditions très acides ou très basiques entraînent une mortalité cellulaire

importante (Livett 1984). Afin d’améliorer la viabilité cellulaire, nous avons tamponné toutes

les solution à pH 7,4. La gélification d’alginate de sodium a été effectuée avec 68 mM de

chlorure de calcium. La membrane a été formée par incubation avec 0.1% de Poly-L-lysine

(PM de 30,2 kDa) pendant 15 min. Il en résulte une membrane rigide, permanente et stable.

Les billes ont subi ensuite un traitement par une solution de citrate à 55 mM pendant 10 min

pour liquéfier le cœur interne. Au regard de la littérature, cela permet aux cellules encapsulées

une meilleure croissance (Lim et Sun 1980 ; Lim et Moss 1981 ; Goosen et al. 1985).

Enfin les microcapsules ont été incubées avec une solution diluée d’alginate pour

neutraliser les charges positives de la PLL non associées qui représentent un facteur principal

de la bioincomptabilité des microcapsules produites (Strand et al. 2001 ; De Vos et al. 2002).

Tous ces paramètres fixent les conditions et les étapes de fabrication susceptibles

d’influencer la stabilité, la perméabilité des microcapsules et par la même le devenir in vivo

de ces microcapsules.

76

Une modification apparemment mineure du procédé d’encapsulation peut avoir

une influence directe sur les caractéristiques physicochimiques des microcapsules et par

conséquence sur la réponse de l’hôte contre ces capsules et ainsi, sur leur devenir des

microcapsules (Uludag et al. 2000).

De fait, les paramètres mentionnés ci-dessus sont rarement documentés même

dans des études récentes (Kim et al. 2004 ; Jeon et al 2006). Dans ce contexte, nous avons

validé la faisabilité de l’encapsulation des cellules chromaffines dans des microcapsules APA

par une étude physicochimiques des caractéristiques des microcapsules et par une étude in

vitro et in vivo de la viabilité et la fonctionnalité des cellules chromaffines microencapsulées.

Le diamètre moyen des microcapsules obtenues avec une seringue de 50 ml

équipée d’une aiguille de 0.6 mm est d’environ 1,2 mm et celui des microcapsules obtenues

avec un microencapsulateur équipée d’une buse de 300 µm est à l’ordre de 600 µm.

Les microcapsules sont stables dans le milieu de culture et dans le tampon 1 au

cours du temps, en effet aucune dégradation ni modification structurale n’a été observée.

Notre procédé de préparation a produit des microcapsules non agglomérées et majoritairement

sphériques. Après avoir séché des microcapsules intègres, l’observation en microscopie

électronique à balayage nous a permis de visualiser leur membrane. Cette observation

microscopique montre que les microcapsules sont creuses, formées par une membrane

complexe d'APA entourant un cœur liquéfié.

L’étude de la perméabilité s’avère essentielle dans la connaissance des paramètres

de bio encapsulation (Li 1998 ; Colton et al. 1991 ; Uludag et al. 2000). Les caractéristiques

physicochimiques des microcapsules et leur perméabilité modifient le transfert de différentes

substances de poids moléculaire et de structure variables de part et d’autre des microcapsules.

Ces mêmes paramètres peuvent conditionner le cinétique de diffusion des neuromédiateurs a

visée analgésique. Nous avons utilisé des molécules présentant des poids moléculaires

différents : vitamine B12 (PM 1355 Da), α-lactalbumine (PM 14,2 kDa) et BSA (PM 67

kDa). Au cours de l’étude, seules la vitamine B12 et l’alpha lactalbumine diffusent librement

par la membrane. L’alpha lactalbumine diffuse plus lentement en raison de son poids

moléculaire plus élevé. Dans ce cas, le nutriments, comme le glucose (PM de 186 Da),

l’oxygène, les facteurs neurotrophiques devraient pouvoir diffuser librement à travers la

membrane, garantissant une bonne survie cellulaire. Parallèlement, les produits de sécrétion

des cellules chromaffines tels que l’adrénaline (PM 183,2 Da), la noradrénaline (PM 169,2

Da), la dopamine (PM 189,6 Da) et la met-enképhaline (PM 573 Da) devraient pouvoir

diffuser dans le milieu extérieur en provoquant un effet thérapeutique.

77

Par contre, la membrane a totalement empêché la diffusion de la BSA, ceci montre

que la membrane représente une barrière vis-à-vis des molécules de gros poids moléculaire

égal ou supérieur à celui de la BSA telles que les immunoglobulines (PM 150 kDa) et les

facteurs du complément (PM 220 kDa).

Les résultats montrent que les microcapsules présentent une membrane semi-

perméable ayant un seuil de coupure supérieur à 14,2 kDa et inférieur à 67 kDa, ce qui

protège les cellules contre le système immunitaire de l’hôte.

Les microcapsules conservées dans le milieu de culture et dans le tampon de

fabrication (tampon1: HEPES + NaCl pH 7.4) restent résistantes à la compression au cours du

temps, les microcapsules conservées dans le milieu de culture présentant une résistance

supérieure mais non significative à celles conservées dans le tampon de fabrication. Ceci

pourrait s’expliquer par la force ionique et par la composition plus complexe du milieu de

culture. Dans le cas des microcapsules APA de petite taille, le test de passage via le manchon

d’un cathéter 20G montre que les microcapsules résistent à une injection. 56,7 % ± 3,8 % et

60 % ± 6,2 % (respectivement microcapsules vides et microcapsules chargées en cellules)

d’entre elles sont non déformées après injection, ce qui est d’un bon pronostic pour une

implantation ultérieure.

Ce résultant est très important dans les applications pré-cliniques car lors de

l’implantation des cellules microencapsulées, les microcapsules devront subir de contraintes

mécaniques importantes.

L’ensemble de ces résultats montre que la technique et les paramètres utilisés ont

permis d’obtenir des microcapsules sphériques, stables au cours du temps et résistantes. Leur

membrane permi-sélective pourrait protéger les cellules encapsulées contre le système

immunitaire de l’hôte. Ces caractères physico-chimiques répondent aux critères requis dans le

cadre d’encapsulation cellulaire. Cependant, les paramètres que nous avons utilisés sont

rarement documentés même dans les études les plus récentes (Kim et al. 2004 ; Jeon et al

2006). Nous ne pouvons donc pas comparer nos résultats avec ceux présentés dans la

littérature.

L’étude in vitro sur les cellules encapsulées et adhérentes en culture évaluant la

viabilité cellulaire montre qu’au delà de J30, les cellules adhérentes ne sont plus viables. Par

contre, la viabilité des cellules chromaffines encapsulées dans les microcapsules d’APA est

maintenue au cours du temps et ce jusqu’à la fin de l’étude, soit respectivement 44 jours post

encapsulation pour les cellules encapsulées dans des microcapsules de grosse taille et 35 jours

pour celles encapsulées dans des microcapsules de petite taille. Dans les deux cas, quelques

cellules mortes sont observées dès le début en périphérie des microcapsules.

78

Il semblerait qu’elles correspondent à des cellules emprisonnées dans le complexe

d’APA lors de l'étape de formation de la membrane.

Ces résultats permettent de conclure que la viabilité des cellules chromaffines

bovines n’est pas compromise par l’encapsulation. De plus, ils montrent le besoin, pour ces

cellules d'une matrice ou d’un support pour maintenir leur survie. En effet, plusieurs auteurs

ont montré que l'addition d'une matrice ou l’ajout d’un polymère tel que l'alginate ou le

collagène lors du procédé de bio-encapsulation fournit aux cellules dépendantes d’un support,

le substrat nécessaire pour leur adhérence et leur viabilité (Zielinski et Aebischer 1994 ; Date

et al. 1997 ; Decosterd et al. 1998).

Les matrices internes le plus souvent utilisées dans le cadre d’encapsulation

cellulaire sont des hydrogels à base d’alginate, de collagène, de chitosane, d’agarose, de PVA

ou d’acide poly lactique glycolique «PLGA» (Saporta et al. 1997 ; Borolongan et al. 1998 ;

Elcin et al. 1998 ; Elcin et al. 2003). Duplan et ses collègues ont rapporté une relation directe

et significative entre l’adhérence des tissus médullaires chromaffines durant leur culture et

leur niveau de sécrétion de catécholamines (Duplan et al. 2000). Il a été montré par d’autres

auteurs que l’adhérence des cellules chromaffines aux parois des capsules améliore leur survie

et leur fonctionnalité. Leur immobilisation dans une matrice interne stimulerait ces cellules

pour sécréter leur propre matrice extracellulaire et améliorerait, de ce fait, leur survie et leurs

fonctions sécrétoires (Cherskey et al. 1996 ; Borlongan et al. 1998; Sagen et al.1999).

La fonctionnalité des cellules chromaffines a été mise en évidence par l’expression

de la TH en Western Blot. Au cours de l’étude, les cellules encapsulées dans les

microcapsules de grosse taille montrent une forte expression de la TH qui reste stable et

semblable à celle des cellules adhérentes. Dans le cas de cellules encapsulées dans les

microcapsules de petite taille, on observe aussi une expression de la TH au cours de l’étude.

On peut noter une diminution de cette expression à J35 vraisemblablement en raison de la

diminution de la viabilité cellulaire et/ou la fonctionnalité cellulaire.

Ces observations permettent de conclure que les cellules chromaffines

microencapsulées sont capables de synthétiser et d’exprimer la TH de façon similaire à celle

des cellules adhérentes. Ces résultats sont en accord avec les résultats déjà réalisés dans notre

équipe concernant la capacité des cellules chromaffines bovines à exprimer la TH in vitro (Sol

et al. 2004).

La fonctionnalité des cellules chromaffines microencapsulées a été affirmée par la

mise en évidence des marqueurs caractéristiques des cellules chromaffines.

79

Les cellules chromaffines bovines encapsulées dans les microcapsules de grosse

taille sont viables et fonctionnelles 37 jours post-encapsulation et mise en culture, ceci en

exprimant spécifiquement la TH.

Egalement les cellules encapsulées dans les microcapsules de petite taille, qui sont

encore viables sont fonctionnelles 35 jours post-encapsulation en exprimant la TH, la DβH et

la met-enképhaline (ME). Ces résultats sont en accord avec les résultats déjà montrés dans la

littérature et par notre équipe concernant la caractérisation des cellules chromaffines en

culture (Duplan et al. 200 ; Sol et al. 2004).

La fonctionnalité des cellules microencapsulées et a été réalisée par une étude

cinétique de la sécrétion des catécholamines. En comparant la sécrétion des catécholamines

des cellules encapsulées (microcapsules de grosse taille) à celle des cellules adhérentes, seules

les cellules encapsulées sont capables de garder leur capacité à sécréter les catécholamines

après J30 et jusqu’à J44. Il semblerait que les capsules favorisent la survie cellulaire. Le profil

de sécrétion des cellules encapsulées est le même que celui des cellules adhérentes, on

n’observe pas de différence statistique significative [sauf à J4 (p<0.01)]. Il a été démontré que

l'environnement des cellules peut modifier leur capacité sécrétoire, ceci d'une manière

imprévisible (Sagen et Ortega 1994; Uludag et al. 2000).

Ces résultats sont en accord avec ceux de la littérature montrant la capacité des

cellules chromaffines bovines à sécréter des catécholamines et à répondre à une stimulation

nicotinique in vitro (Livett 1981 ; Wilson et al 1982 ; Aebischer et al. 1991; Sol et al. 2004).

L’ensemble de ces études in vitro (microscopie confocale, Western Blot, immuno-

histochimie et dosage des catécholamines) montre que l’encapsulation de cellules

chromaffines dans des microcapsules formées du système APA n’altère ni leur fonctions ni

leur viabilité.

Des études antérieures concernant l’efficacité analgésique des cellules encapsulées

et la réponse immunitaire de l’hôte contre les capsules implantées montrent des résultats

controversés (Aebischer et al. 1991 ; Yu et al. 1998b ; Linder et al. 2000 ; Kim et al. 2004 ;

Win et Emerich 2005 ; Jeon et al. 2006).

Alors, deux études in vitro et in vivo ont été effectuées pour évaluer la viabilité et

la fonctionnalité des cellules chromaffines bovines microencapsulées dans les deux

conditions. L’étude in vivo avait de plus l’avantage de permettre une évaluation de le réaction

inflammatoire provoquée chez l’hôte contre les microcapsules, la viabilité et la fonctionnalité

des cellules microencapsulées in vivo. L’observation microscopique de la moelle épinière

trois semaines et un mois après l’implantation a permis de montrer l’absence de réaction

inflammatoire vis-à-vis des microcapsules implantées chez le rat.

80

Nos résultats sont en contradiction avec ceux d’Aebischer. Cet auteur a rapporté

une réponse immunitaire vis-à-vis des microcapsules formées du système APA lors de leur

implantation chez le rat par une voie intraventriculaire (Aebischer et al. 1991).

En revanche, nos résultats préliminaires semblent être en accord avec ceux de Kim

et Jeon qui ont noté une réaction inflammatoire très négligeable vis-à-vis des microcapsules

formées d’un système de APA lors de leur implantation dans l’espace sous arachnoїdien du

rat (Kim et al. 2004 ; Jeon et al. 2006). De plus, Ponce a montré que les microcapsules

formées d’alginate/PLL et implantées dans l’espace intrapéritonéal sont moins immunogènes

que celles formées d’alginate/Poly-L-Ornithine (PLO) et d’alginate/Poly-D-lysine (PDL)

(Ponce et al. 2006). Ceci confirme nos résultats et en même temps justifie notre choix pour la

PLL. Mais, Dufrane a rapporté que le site d’implantation peut être avoir une influence sur la

biocomptabilité des capsules implantées (Dufrane et al. 2006).

Bien que l’on retrouve difficilement les microcapsules sur les coupes histologiques

de moelle épinière en raison de leur perte lors de l’implantation et des étapes expérimentales

histologiques (déshydrations, réhydrations par plusieurs bains, réactivation antigénique à

micro-onde, rinçage plusieurs fois, ….), les cellules chromaffines retrouvées sur ces coupes

sont viables et fonctionnelles trois semaines après leur implantation chez le rat en exprimant

la tyrosine hydroxlase (TH) et la met-enképhaline (ME).

Ces résultats sont en accord avec les résultats montré par l’équipe de Yu et celle

d’Aebischer. La première équipe a noté que 60 % des cellules chromaffines encapsulées

montre un marquage positif pour la TH, 8 semaines après implantation (Yu et al. 1998 b). La

deuxième a montré que 4 semaines post-implantation chez le rat, les cellules chromaffines

microencapsulées sont immuno-positives pour la TH et la DßH (Aebischer et al. 1991).

Bien que des tests différents ont été utilisés par l’équipe de Kim et Jeon, nos

résultats sont en accord avec ceux de cette équipe. La viabilité et la fonctionnalité cellulaires

des cellules chromaffines encapsulées implantées chez le rat ont été montrées de façon

indirecte par une obtention d’un effet analgésique dans le cas de douleurs neuropathiques

(Kim et al. 2004 ; Jeon et al. 2006).

L’ensemble de nos résultats montre que la microencapsulation des cellules

chromaffines dans des microcapsules formées par le système alginate/PLL/alginate n’altère

en rien leur viabilité, leur fonctionnalité et leur intégrité pharmacologique. Ainsi ces cellules

microencapsulées dans le système d’alginate-PLL- alginate (APA) pourraient être implantées

lors d’applications in vivo en gardant leur viabilité et leur fonctionnalité et sans utiliser du

traitement immunosuppresseur.

81

Cependant, l’absence de réponse immunitaire de l’hôte vis-à-vis des

microcapsules n’empêche pas d’autres investigations qui semblent être indispensables pour

confirmer ou non cette hypothèse. Une étude pré clinique plus large et ainsi qu’une évaluation

de la réaction inflammatoire au niveau périphérique et central sont encore nécessaires.

82

CONCLUSION

ET PERSPECTIVES

83

Les douleurs neuropathiques représentent un problème majeur de santé publique.

Actuellement, on estime que même les thérapies les plus sophistiquées n’apportent qu’une

activité analgésique bonne ou modérée chez moins de 30 % des patients atteints de douleurs

chroniques rebelles d’origine non maligne (Jensen 2005). Les xénogreffes de cellules

chromaffines pour le traitement des douleurs rebelles possèdent les avantages des systèmes

implantables en libérant de manière continue dans le SNC des substances aux propriétés

analgésiques (Wilson et al. 1982). Néanmoins, les transplants xénogéniques dégénèrent

rapidement dans le SNC du rat si un traitement immunosuppresseur n’est pas mis en route

(Ortega et al.1992). Aussi le concept d’immuno-isolement via l’encapsulation cellulaire a été

développé (Lim et Sun 1980). Depuis ses premières mises en application, l'efficacité de

l'implantation de cellules encapsulées dans le traitement de la douleur demeure néanmoins

controversée car certaines études ont donné lieu à des résultats contradictoires (Aebischer et

al. 1991 ; Yu et al. 1998b ; Linder et al. 2000 et 2003 ; Kim et al. 2004 ; Win et Emerich

2005 ; Jeon et al. 2006) sans doute en raison d'une connaissance imparfaite de l'influence des

conditions opératoires et de l'effet- dose nécessaires. Les efforts de recherche dans la thérapie

cellulaire de la douleur s'orientent donc maintenant dans ce sens.

Au niveau du choix macroencapsulation versus microencapsulation, les

microcapsules semblent être la forme préférentielle car elles permettent une meilleure

diffusion des substances neuroactives au travers de leur membrane. L’alginate s’avère être le

polymère le plus souvent utilisé pour la encapsulation de cellules vivantes et fait l’objet de

nombreuses études ces dernières années (Orive et al. 2003 ; Darrabie et al. 2005 ; Dufrane et

al. 2006). Néanmoins, très peu d'entre elles concernent la thérapie de la douleur. Seules deux

études récentes ont été initiées avec des cellules chromaffines bovines microencapsulées dans

un système d’alginate-PLL-alginate (Kim et al. 2004 ; Jeon et al. 2006) et semblent donner de

bons résultats. Malheureusement, les conditions opératoires de préparation des microcapsules

n'y sont que très peu documentées, alors qu’il est maintenant reconnu qu'un très grand nombre

de facteurs peuvent avoir une influence importante sur les caractéristiques physicochimiques

des capsules, sur la viabilité cellulaire et ainsi, sur la devenir de la greffe (Lim et Moss, 1981 ;

Martinsen et al. 1989 ; Thu et al. 1996 ; De Vos et al. 1997 ; Uludag et al. 2000).

Dans ce contexte, nous avons encapsulé des cellules chromaffines bovines dans

des microcapsules creuses d’APA préparées selon des conditions opératoires bien définies.

Nous avons validé la faisabilité de l’utilisation d’une telle formulation pour ce type

de cellules en évaluant les caractéristiques physicochimiques des microcapsules et l’influence

de l’encapsulation sur la survie et la fonctionnalité cellulaire.

84

Les microcapsules produites sont sphériques et présentent un diamètre moyen de

1,2 mm (grosses microcapsules) ou de 600 µm (petites microcapsules) selon le mode de

préparation utilisé. Les tests réalisés montrent qu’elles sont suffisamment résistantes à la

compression et à l’injection pour pouvoir envisager une implantation par voie intra-thécale

chez le rat. Ces microcapsules présentent une membrane semi-perméable qui permet la

diffusion des nutriments et en même temps protège les cellules contre les réactions du

système immunitaire.

Nous avons également démontré que les cellules microencapsulées dans ce

système d’APA maintiennent leur viabilité et leur fonctionnalité in vitro et in vivo au cours

de l’étude en exprimant tous les marqueurs caractéristiques des cellules chromaffines et en

montrant une sécrétion basale et stimulée des catécholamines semblable à celle des cellules

adhérentes. Il semble que l’encapsulation favorise la survie cellulaire.

De plus l’implantation intra-thécales de ces microcapsules (vides et chargées en

cellules) a permis de montrer que l’hôte ne développe pas de réaction inflammatoire vis-à-vis

des microcapsules implantées.

En bref la microencapsulation des cellules chromaffines dans des microcapsules

formées par le APA n’altère en rien leur viabilité, leur fonctionnalité et leur intégrité

pharmacologique. Ainsi, ces cellules encapsulées dans cette formulation pourraient être

implantées lors d’applications in vivo sans l’utilisation d’immunosuppresseur. Cependant,

d’autres investigations semblent être nécessaires pour infirmer ou non ce dernier résultat.

Au niveau de la formulation, nos perspectives s’orienteraient alors :

- vers un contrôle approfondi des paramètres expérimentaux de réalisation des microcapsules

(notamment l’influence de différentes tailles de microcapsules et de différentes concentrations

en cellules sur la viabilité et la fonctionnalité cellulaire), et

- vers l’utilisation d’autres polymères tels que le chitosan, polymère d’origine naturelle qui

semble présenter des propriétés de biocomptabilité et biodégradabilité intéressantes (Kumar

2000 ; Agnihotri et al 2004).

La mise au point de nouvelles formulations associant chitosan et alginate

permettrait d’augmenter l’adhésivité des microcapsules. Sur ces formulations, des tests

physico-chimiques et des études in vitro et in vivo similaires à ceux réalisés sur les

microcapsules APA seront réalisés afin de choisir la meilleure formulation pour la survie

cellulaire.

85

Au niveau clinique, une étude pré-clinique plus approfondie et plus large est

nécessaire afin de confirmer nos résultats préliminaires et évaluer la viabilité des cellules

microencapsulées implantées au long terme, le niveau de la met-enképhaline dans le liquide

cérébro-spinal, l’efficacité analgésique de ces cellules encapsulées sur un modèle animal de

douleurs neuropathiques et la réaction inflammatoire vis-à-vis des microcapsules au niveau

périphérique et central.

En terme de sécurité des xénogreffes de cellules chromaffines, nous avons utilisé

les cellules chromaffines bovines comme modèle de référence dans le cadre de

microencapsulation cellulaire et d’implantation chez le rat. L’utilisation de cellules

chromaffines bovines en clinique humaine semble devoir être écartée en Europe du fait des

risques de transmission du prion. Le porc semble représenter l’animal incontournable, ce

modèle a été validé dans notre laboratoire (Sol et al. 2004). Ce principe n’est que relatif car

l’espèce porcine transmet de nombreux organismes infectieux. La technique de

microencapsulation devra s’orienter vers d’autres types cellulaires utilisés en thérapie afin de

bénéficier de cette encapsulation. Dans notre laboratoire, une autre équipe oriente sa stratégie

vers l’utilisation de cellules médullo-surrénaliennes fœtales humaines (cellules

progéntitrices). L’isolement et la caractérisation de ces cellules ont été réalisés sur des fœtus

provenant d’interruption volontaire de grossesse, réalisée entre la 9ème et la 12ème semaine

d’aménorrhée. Les études in vitro de phénotypage cellulaire ont montré qu’il s’agit de cellules

adrénergiques exprimant à ce stade précoce de développement la TH, la DβH et la met-

enképhaline.

La thérapie cellulaire représente une alternative intéressante dans la prise en

charge de nombreuses pathologies. Nos résultats encourageants concernant la

microencapsulation de cellules chromaffines montrent qu’une telle technique permettrait de

contourner un certain nombre de problèmes liés à cette thérapie (réaction immunitaire, survie

cellulaire limitée).

86

BIBLIOGRAPHIE

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PUBLICATION

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MOUSTAFA T., GIROD S., TORTOSA F., LI R., SOL JC., RODRRIGUEZ F., BASTIDE R., LAZORTHES Y., and SALLERIN B. Viability and fonctionnality of bovine chromaffin cells encapsulated into alginate-PLL microcapsules with a liquifed inner core. Cell Transplantation, 2006, 15, 121-133.

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AUTHOR: Tarek Mohamed Mohamed MOUSTAFA

TITLE: MICRENCAPSULATED BOVINE CHROMAFFIN CELLS IN THE

MANAGEMENT OF CHRONIC INTRACTABLE PAIN: FEASIBILITY

STUDTY IN VITRO AND IN VIVO

DIRECTOR OF THESIS: Prof. Brigitte SALLERIN (Professor of Clinical Pharmacy)

CITY AND DATE OF DISCUSSION OF THESIS: Toulouse 23 October 2007

ABSTRACT: Adrenal medullary chromaffin cells secrete a combination of pain reducing

neuroactive substances including catecholamine and opioid peptides that alleviate both acute and chronic pain not only in several animal models but also in some clinical applications. But, the xenografts can not maintain their survival in central nervous system for a long period without the implication of immunosuppressive drug. In this context, the concept of immune-isolation by cell encapsulation seems to have a great interest in the field of cell therapy in order to protect the transplant from the host’s immune system. In the present study, we report the viability and functionality of bovine chromaffin cells (BCC) encapsulated in microcapsules of alginate/poly-L-lysine/alginate (APA) with a liquefied inner core both in vitro and in vivo in rats. The microencapsulation of BCC not only allows the cells to keep their viability and functionality but also to retain their pharmacological integrity as indicated by expression of tyrosine hydroxlase, met-enkephalin and secretion of catecholamine. The in vivo study concerning the implantation of both microencapsulated chromaffin cells and empty microcapsule in the central nervous system of rats aimed to evaluate the cellular viability and functionality of microencapsulated cells and to determine the host reaction against the implanted microcapsules. This study showed that the microencapsulated cells maintain their viability and their functionality three weeks after implantation in sub-arachnoid space of rats. In addition, this study gave us an account very interesting concerning the absence of immunological response against the implanted microcapsules. This approach may offer a useful potential for cell transplantation in the management of many clinical problems including intractable pain and degenerative diseases. However, other investigations are still necessary before application of this strategy in human clinics.

KEY WORDS: Cell therapy, Xenograft, Chromaffin cells, Chronic intractable pain, Pain

therapy, Cell encapsulation and alginate, Cell viability, Cell functionality, Capsules with inner liquifid core, MOUSTAFA et al..

DISCPLINE (speciality): Clinical Pharmacy

Laboratory EA 3039 «Cell and gene therapy of chronic intractable pain»

Toulouse Rangueil 133 route of Narbonne-31062 Toulouse Cedex

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AUTEUR: Tarek Mohamed Mohamed MOUSTAFA

TITRE: MICROENCAPSULATION DE CELLULES CHROMAFFINES BOVINES DANS

LE TRAITEMENT DES DOULEURS CHRONIQUES REBELLES: ETUDE DE

FAISABILITE IN VITRO ET IN VIVO

DIRECTEUR DE THSE : Pr. B. SALLERIN (Professeur de pharmacie clinique)

LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : Toulouse le 23 Octobre 2007

RESUME: Le principe de thérapie cellulaire des douleurs chroniques rebelles est de transplanter

dans l’espace sous-arachnoïdien des cellules chromaffines pour qu’elles se comportent comme un véritable mini pompes en libérant de manière continue des substances neuroactives telles que les catécholamines et les peptides opioïdes. Mais les transplants xénogéniques dégénèrent progressivement si un traitement immunosuppresseur n’est pas mis en route. Le concept d’immuno-isolement a été proposé pour éviter le traitement immunosuppresseur. Dans ce travail, nous rapportons la microencapsulation des cellules chromaffines bovines (CCB) dans des microcapsules de type alginate/poly-L-lysine/alginate (APA). Nous avons validé la faisabilité de l’utilisation de cette technique et d’une telle formulation pour ce type de cellules. Nous avons mené des études visant à évaluer d’une part les caractéristiques physicochimiques des microcapsules fabriquées et d’autre part la viabilité et la fonctionnalité des cellules chromaffines encapsulées in vitro et in vivo chez le rat. Ainsi la réponse immunitaire de l’hôte vis-à-vis de ces microcapsules implantées chez le rat a été évaluée. Les paramètres de fabrication que nous avons utilisé dans le cadre de l’encapsulation des cellules chromaffines permettent d’obtenir des microcapsules sphériques, stables, résistantes et présentent une membrane semi-perméable. L’étude in vitro montre que ces cellules gardent leur viabilité et leur fonctionnalité au cours de l’étude en exprimant tous les marqueurs étudiés. Une sécrétion basale et stimulée de catécholamines est également observée. L’étude in vivo effectuée chez le rat montre que les cellules chromaffines microencapsulées maintiennent leur viabilité et leur fonctionnalité trois semaines après leur implantation. De plus, cette étude montre également que l’hôte ne développe pas de réaction inflammatoire vis-à-vis des microcapsules. Cependant d’autres investigations seraient encore nécessaires avant l’utilisation de cette stratégie thérapeutique en clinique humaine.

MOTS-CLES: Thérapie cellulaire, Xénogreffe, Douleur, Cellules chromaffines bovines,

Alginate encapsulation, Viabilité cellulaire, Fonctionnalité cellulaire, Microcapsules creuses, MOUSTAFAet al.

DISCIPLINE: Pharmacie Clinique

Laboratoire EA 3039

«Thérapie Cellulaire et Génique des Douleurs Chroniques» Faculté de Médecine Toulouse Rangueil

133 route de Narbonne-31062 Toulouse Cedex

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