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FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d’analyse I-MET-LFSAL-025B Dosage de l’histamine dans des échantillons de poissons par HPLC-UV Techniek Technique HPLC-Fluorimétrie Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Poissons Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaptation 04/02/2010

VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION...ppm). Technicien : keyart Luc Justesse (différence relative) : 100*(226-234.5)/226 = 3.8 % Pesée Résultat en ppm Result. Corr. Rend

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    VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION

    Analysemethode Méthode d’analyse

    I-MET-LFSAL-025B Dosage de l’histamine dans des échantillons de poissons par HPLC-UV

    Techniek Technique

    HPLC-Fluorimétrie

    Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices

    Poissons

    Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaptation

    04/02/2010

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    • Résumé des critères de performance :

    Justesse : §4 (pages 4 et 5) dossier de validation du 04/02/2010 (édition 1).

    Rendement: §6 (page 7), dossier de validation du 04/02/20010 (édition 1).

    Répétabilité et reproductibilité intra-laboratoire, §5 (page 6), dossier de validation du 04/02/2010 (édition 1).

    LOD & LOQ : §8 (page 8 et 9) : 25 ppm (LOD) & 50 ppm (LOQ)

    • La validation répond aux exigences de la procédure LAB 00 P180

    • Le laboratoire qui veut appliquer cette méthode doit démontrer que les critères ci-dessous soient remplis pour les combinaisons matrices/paramètres :

    Justesse : max 10 % relatif pour des résultats corrigés sur le

    rendement dans la gamme 100-400 ppm Rendement: max 20 % relatif dans la gamme 50-400 ppm LOD & LOQ : §8 (page 8 et 9) : 25 ppm (LOD) & 50 ppm (LOQ) Reproductibilité intra-laboratoire : doit satisfaire à l’équation

    d’Horwitz

    • Historique de validation:

    Edition Révision par/date Motif de la révision Modifications 1 M. Evrard / 06-2012 Adaptation au

    nouveau template Adaptation au nouveau template du dossier de validation du 04/02 2010 avec annexe photos

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    LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 1/9

    VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d’analyse

    I-MET-LFSAL-025B Dosage de l’histamine dans des échantillons de poissons par HPLC-UV

    Techniek Technique

    HPLC-FLUO

    Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices

    Poissons

    Type validatie Type de validation

    Totale

    Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction)

    Ir MARC EVRARD, chef de section

    Opgesteld door Rédaction par

    Evrard Marc 04/02/2010

    Handtekeningen - Signatures: Sé

    Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction)

    C. Haudestaine / L. Keyaert /Y. Bouamar Experts techniques

    Periode van validatie Période de validation

    Start - Début: 11/01/2010 Einde - Fin: 04/02/210 Adaptation du dossier de validation au template : juin 2012

    Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par

    Ir Marc Evrard Chef de section

    Handtekeningen - Signatures: Sé

    Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P 00 180.

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    LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 2/9

    Dossier de Validation des histamines dans les poissons riches en histidine par HPLC-UV.

    L’histamine est une amine biogène produite après la mort du poisson sous l’action de certaines bactéries. Ces bactéries produisent une enzyme qui va transformer l’histidine – acide aminé présent à forte teneur dans certains poissons – en histamine. L’histidine peut se trouver sous forme libre mais aussi sous forme liée dans les pigments tels que l’hémoglobine et la myoglobine.

    Les microorganismes responsables de la formation de l’histamine se développent principalement à des températures supérieures à 7-10°C dans les ouïes et les viscères du poisson. Cependant, de récentes recherches ont montré que certaines bactéries productrices d’histamine étaient actives entre 0 et 5°C. Les conditions nécessaires à la formation de l’histamine sont :

    • Présence en quantité élevée d’histidine libre • Présence en nombre important des bactéries produisant l’histidine décarboxylase Une validation principale a été réalisée sur un mélange de sardines, de thons et de maquereaux à l’huile (égouttés) en même proportion massique. Les différents poissons ont été mélangés, aliquotés en tubes falcon et congelés. Les essais sur la matrice principale se sont fait à l’aide d’ajouts dosés d’histamine à 50-100-200 % de la norme Bien que similaires, deux autres matrices ont été testées afin de tester la répétabilité et le rendement d’extraction sur ces matrices ; les deux matrices secondaires sont :

    - thon frais + maquereau frais + sardines fraîches en même proportions massiques - anchois saumurés.

    Les essais sur les matrices secondaires se sont fait à l’aide d’ajouts dosés d’histamine à 50-100-200 % de la norme sur les poissons frais et 25-50-100 % de la norme pour les poissons saumurés Sur la validation principale, les paramètres pris en compte sont :

    - la linéarité - l’exactitude (rendement, gamme de 50 à 400 ppm) et la justesse (échantillon Fapas, gamme de

    120 à 340 ppm) - la précision (répétabilité et reproductibilité intralaboratoire à 50-100-200 % des normes). - La sélectivité, spécificité

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    LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 3/9

    1. Normes dans les poissons n=9, c=2 : m=100 mg/kg et M= 200 mg/kg (pour produits de la pêche fabriqués à partir d’espèces de poissons associés à une grande quantité d’histidine : voir Règlement 2073/2005, annexe1, chapitre 1 : 1.25) n=9, c=2 : m=200 mg/kg et M= 400 mg/kg (pour produits de la pêche ayant subi un traitement de maturation aux enzymes dans la saumure, fabriqués à partir d’espèces de poissons associés à une grande quantité d’histidine : voir Règlement 2073/2005, annexe1, chapitre 1 : 1.26.). Mais la maturation enzymatique est exceptionnelle dans le cas de conserves de poissons.

    2. La linéarité

    Le modèle linéaire sur une gamme de 35 à 550 µg/g en 5 points a été retenu. Les critères concernant la linéarité sont les suivants :

    - Un coefficient de détermination >= 0.99 ; - La gamme de concentration de la droite dans la validation comme en routine doit couvrir les

    valeurs des pics détectés ; des dilutions des extraits finaux sont, le cas échéant, effectués. - Un écart maximum de chaque point

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    LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 4/9

    3.2. La sélectivité.

    La détection en UV étant non sélective (dans le cas de l’histamine, pas de critère DAD probants), un contrôle (DBG) à été ajouté afin de garantir une « sélectivité » sur base du temps de rétention relatif de l’histamine par rapport à ce DBG. Il faut observer dans le chromatogramme 2 pics correspondants au pic de l’histamine et un standard de référence chromatographique (DBG) entre 5 et 15 minutes ; les temps de rétentions absolus de l’histamine et du DBG peuvent varier en fonction de la vie de colonne et de petites différences de compositions dans le tampon d’élution mais la différence des temps de rétentions relatifs de 2 injections (entre l’échantillon et la vérification la plus proche) d’histamine (par rapport au DBG) ne devra pas excéder 5 % selon la formule :

    %5100_

    _

    1

    1 ≤×−RtRt

    RtRt

    vérifDBG

    vérifhista

    DBG

    hista

    Tous les chromatogrammes de la validation respectent le critère de la formule ci-dessus. A noter également, que dans le cas de la vérification de la justesse (sur échantillons Fapas, cf ci-dessous), ces mêmes échantillons, en plus du caractère quantitatif, ont tous été confirmés qualitativement en ELISA (MET-LFSAL-025) en contrôle 3ième ligne (cf § 4)..

    4. La justesse

    Pour avoir une idee de la justesse de la méthode, 3 échantillons Fapas répétés 8 fois dans des conditions de répétabilité. Ces échantillons ont été séléctionnés pour parcourir au maximum la gamme d’étalonnage. A vu des résultat ci-dessous, l’écart maximum entre la valeur estimée et la valeur vraie est de maximum 3.8 % ce qui est grandement acceptable et en tout cas prouve que la méthode HPLC est plus juste que la méthode Elisa..

    A) Valeur cible (check vwa 418) : 123 ppm résultat corrigé sur le rendement : 120.2 ppm (Elisa : 106.2 ppm). Technicien : Y. Bouamar

    Justesse (différence relative) : 100*(123-120.16)/123 = 2.3 %

          Pesée  Résultat en ppm  Result. Corr. Rend BlancMatrice2‐1  1  5,0039  2,41 

    DopéMatrice2‐100ppm  2  5,0116  102,053  102,90  CHECK 09050085‐1  3  5,0195  124,01  120,51 

     09050085‐2  4  5,0412  124,01  120,52  09050085‐3  5  5,0115  123,01  119,54  09050085‐4  6  5,0244  124,36  120,85  09050085‐5  7  5,0332  125,27  121,74  09050085‐6  8  5,0125  123,10  119,63  09050085‐7  9  5,0139  123,04  119,57  09050085‐8  10  5,0203  122,36  118,91 

    123,64 120,16

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    LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 5/9

    B) Valeur cible (fapas 2757) : 226 ppm résultat corrigé sur le rendement : 234.5 ppm (Elisa : 244.8 ppm). Technicien : keyart Luc

    Justesse (différence relative) : 100*(226-234.5)/226 = 3.8 %

          Pesée  Résultat en ppm  Result. Corr. Rend 

    BlancMatrice2‐1  1  5,0071  0,00 

    DopéMatrice2‐200ppm  2  5,0177  199,39  100,05 

    FAPAS 09270677‐1  3  5,0371  230,60  230,48 

    FAPAS 09270677‐2  4  5,0143  228,77  228,66 

    FAPAS 09270677‐3  5  5,0134  229,78  229,66 

    FAPAS 09270677‐4  6  5,033  241,96  241,84 

    FAPAS 09270677‐5  7  5,0048  236,96  236,84 

    FAPAS 09270677‐6  8  5,0136  241,27  241,15 

    FAPAS 09270677‐7  9  5,016  235,22  235,10 

    FAPAS 09270677‐8  10  5,0249  232,43  232,31 

    234,62 234,50

    C) Valeur cible (fapas 2760) : 342 ppm résultat corrigé sur le rendement : 341.87 ppm (Elisa : 360 ppm). Technicien : Bouamar Y.

    Justesse (différence relative): 100*(342-341.87)/342 = 0.04 %

          Pesée  Résultat en ppm  Result. Corr. Rend BlancMatrice2‐1  1  5,0071  0,00 

    DopéMatrice2‐200ppm  2  5,0177  199,39  100,05 FAPAS 09221484‐1  3  5,0197  340,27  340,09 FAPAS 09221484‐2  4  5,035  343,68  343,51 FAPAS 09221484‐3  5  5,0386  342,80  342,63 FAPAS 09221484‐4  6  5,0144  341,47  341,30 FAPAS 09221484‐5  7  5,0344  342,61  342,44 FAPAS 09221484‐6  8  5,0473  343,89  343,72 FAPAS 09221484‐7  9  5,0355  341,77  341,59 FAPAS 09221484‐8  10  5,0074  339,83  339,66 

    342,04 341,87

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    LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 6/9

    5. Répétabilité et reproductibilité intralaboratoire.

    5.1 Validation principale (thons, maquereaux, sardine à l’huile). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Concentration

    du dopage (ppm)

    Répétabilité r (2.8XSr) ppm

    Reproductibilité R (2.8XSr) ppm

    CVr(%) n=12

    CVr max2/3 CVHorwitz

    CVR (%) n=12

    CVRmax CVHorwitz

    Histamine

    50 2.70 5.08 1.86 5.92 3.50 8.88 100 3.00 12.98 1.07 5.33 4.64 7.99 200 16.19 17.47 2.88 4.80 3.11 7.21 400 28.21 28.21 2.56 4.32 2.56 6.49

    Toutes les RSD de répétabilité et de reproductibilité intra-laboratoire (respectivement < 3 et 5 %) satisfont à l’équation de Horwitz.

    5.2 Validation secondaire sur répétabilité (thons, maquereaux, sardine au naturel). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Concentration

    du dopage (ppm)

    Répétabilité r (2.8XSr) ppm

    CVr(%) n=4

    CVr max2/3 CVHorwitz

    Histamine

    50 1.13 0.82 5.92 100 2.43 0.89 5.33 200 7.29 1.30 4.80 400 12.76 1.14 4.32

    Toutes les RSDr (respectivement < 1.30) satisfont à l’équation de Horwitz.

    5.3 Validation secondaire sur répétabilité (anchois saumurés). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Concentration

    du dopage (ppm)

    Répétabilité r (2.8XSr) ppm

    CVr(%) n=4

    CVr max2/3 CVHorwitz

    Histamine

    50 2.25 1.71 5.92 100 2.72 1.10 5.33 200 10.44 2.07 4.80 400 1.85 0.17 4.32

    Toutes les RSDr (respectivement < 1.71) satisfont à l’équation de Horwitz. Pour chaque concentration, les matrices de la validation secondaire présentent des RSDr inférieures ou égales à celles de la validation principale. Il est dès lors de moindre importance d’investiguer la reproductibilité sur ces matrices secondaires. Les critères de répétabilité et de reproductilité de la validation principale leur seront aplliqués

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    LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 7/9

    6. Exactitude (rendement de l’extraction)

    6.1 Validation principale (thons, maquereaux, sardine à l’huile). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert

    Concentration du dopage (ppm), n=12

    Concentration calculée en ppm

    Rendement (%)

    Histamine

    49.78 51.73 103.9 99.45 99.94 100.5 199.32 200.80 100.7 398.74 393.98 98.8

    6.2 Validation secondaire sur répétabilité (thons, maquereaux, sardine au naturel). Techniciens :

    Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Concentration

    du dopage (ppm), n=4

    Concentration calculée en ppm

    Rendement (%)

    Histamine

    49.78 49.62 99.7 99.62 97.58 98.0 199.44 200.81 100.7 397.26 399.00 100.4

    6.3 Validation secondaire sur répétabilité (anchois saumurés). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl.

    Haudestaine ; L. Keyaert Concentration

    du dopage (ppm), n=4

    Concentration calculée en ppm

    Rendement (%)

    Histamine

    49.75 47.12 94.7 99.72 87.81 88.1 199.17 179.85 90.3 396.60 382.38 96.4 498.71 477.09 95.7

    En routine, les résultats sont rendus corrigés sur le rendement de l’échantillon de contrôle Fapas (par rapport à sa valeur de référence soit +/- 20 %) ou à défaut d’un Blanc dopé à 100 ppm.

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    LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 8/9

    7. Modélisation de l’incertitude de mesure relative (k=2)

    L’incertitude est calculée pour des résultats corrigés sur le rendement (pas d’incertitude sur le biais) 50 ppm 7% 100 ppm 9.2 % 200 ppm 6.2 % 400 ppm 5.1 % La gamme d’intérêt (selon les normes) varie de 100 à 400 ppm. Elle est ici modélisée de 100 à 400 ppm linéairement point par point et ce pour une interprétation plus simple.

    y = ‐0,03x + 12,2

    y = ‐0,0055x + 7,3

    0

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    8

    9

    10

    0 100 200 300 400 500

    série1

    série2

    Linéaire (série1)

    Linéaire (série2)

    Y= incertitude relative (%)X = concentration en µg/g)

    8. Limite de détection et de quantification

    Dans la matrice la plus difficile d’un point de vue rendement d’extraction (anchois saumurés), le rapport S/B multiplié par 5 correspond à une teneur d’environ 25-30 ppm. Les pics sont parfaitement détectables à cette teneur mais une chute significative des rendements est constaté. Ci dessous les résultats pour un dopage à 30 ppm sur des anchois saumurés et à 25 ppm sur du thon, maquereaux et sardines à l’huile ; dans cette matrice, à 25 ppm, les rendements restent dans la moyenne de la validation (proche de 100 %). Comme les matrices, en routine, peuvent-être variables et que nous faisons une correction sur le rendement, nous prenons une sécurité et fixons la LOD à 25 ppm (environ 5*S/B) et la LOQ à 50 ppm (la teneur la plus basse inclue dans notre validation). Ces valeurs restent confortables étant donné que la norme la plus basse est à 100 ppm et que nous acceptons une variation de 20 % sur les rendements d’extractions

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    LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 9/9

    Techniciens : Bouamar Y, Haudestaine Cl.

    thon, maquereaux, sardines à l'huile

    Colonne1 Colonne2 Colonne3 Colonne4 Colonne5 Colonne6Pesée Résultat en ppm Valeur cible fct pesée Rendement %

    BlancMatrice2‐1 1 5,0039 2,41 2,182DopéMatrice2‐25ppm‐1 3 5,0017 24,65 24,99 98,62DopéMatrice2‐25ppm‐2 4 5,0214 25,37 24,89 101,91DopéMatrice2‐25ppm‐3 5 5,0173 25,26 24,91 101,39DopéMatrice2‐25ppm‐4 6 5,0019 25,65 24,99 102,65DopéMatrice2‐25ppm‐5 7 5,0092 24,69 24,95 98,94DopéMatrice2‐25ppm‐6 8 5,0214 24,69 24,89 99,19DopéMatrice2‐25ppm‐7 9 5,0169 24,40 24,92 97,94DopéMatrice2‐25ppm‐8 10 5,009 25,41 24,96 101,82

    Anchois saumurés

    Colonne1 Colonne2 Colonne3 Colonne4 Colonne5 Colonne6 Colonne62Pesée Résultat en ppm Valeur cible fct pesée Valeur sans blanc Rendement %

    BlancMatrice4‐1 1 5,0039 7,91  DopéMatrice4‐30ppm‐1 3 5,0017 29,23 29,99 21,32 71,08DopéMatrice4‐30ppm‐2 4 5,0214 28,88 29,87 20,97 70,21DopéMatrice4‐30ppm‐3 5 5,0173 28,72 29,90 20,81 69,61DopéMatrice4‐30ppm‐4 6 5,0019 29,49 29,99 21,58 71,97DopéMatrice4‐30ppm‐5 7 5,0092 28,80 29,94 20,89 69,76DopéMatrice4‐30ppm‐6 8 5,0214 29,38 29,87 21,47 71,89

    9. Stabilité/robustesse.

    La présente validation et méthode repose sur la publication suivante : Validation and comparison of analytical methods for the determination of histamine in tuna fish samples, A.L. Cinquina, F. Longo, A. Cali, L. De Santis, R Baccelliere, R. Cozzani; Journal of Chromatography A, 1032 (2004), 79-85. Dans cette publication repose une étude de robustesse ayant conduit au choix des paramètres utilisés en routine.

  • MET‐LFSAL 025B Annexe photos

    AFSCA‐LFSAL

  • Préparation de la phase mobile (MeoH:tampon phosphate + ion pairé)

  • Préparation de la séquence HPLC

  • Exemple de séquence HPLC

  • Préparation des points d’étalonnage à partir de la solution mère

  • Scellage des bouchons

  • Vortexer

  • Mise en vial des points d’étalonnage

  • Numérotation des vials

  • Préparation des échantillons

  • Mixer

  • Pesée

  • Ajout d’HClO4

  • Vortexer

  • Centrifuger à 4°C

  • Récupération du surnageant (répéter l’extraction 3X)

  • Ajout de DBG dans chaque échantillon

  • Mise au trait

  • Filtration sur PTFE et mise en vial

  • Mise des vials dans l’autosampler

  • Séparation chromatographique (DBG & histamine)

    DGBHISTA

  • Echantillon conforme (pic de DBG et absence d’histamine)

    DBG

    I-MET-LFSAL-025B-validation_histamines_HPLCHistamineMET-LFSAL 025B �Annexe photosPréparation de la phase mobile (MeoH:tampon phosphate + ion pairé)Préparation de la séquence HPLCExemple de séquence HPLCPréparation des points d’étalonnage à partir de la solution mèreScellage des bouchonsVortexerMise en vial des points d’étalonnageDiapositive numéro 9Numérotation des vialsPréparation des échantillonsMixerPeséeAjout d’HClO4VortexerCentrifuger à 4°CRécupération du surnageant (répéter l’extraction 3X)Ajout de DBG dans chaque échantillonDiapositive numéro 19Mise au traitFiltration sur PTFE et mise en vialDiapositive numéro 22Mise des vials dans l’autosamplerSéparation chromatographique (DBG & histamine)Echantillon conforme (pic de DBG et absence d’histamine)