VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION · Dénombrement de la flore mésophile aérobie totale par la méthode TEMPO (I-MET-048b) (AFNOR BIO 12/15 – 09/05)

FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAGx SECTIE - SECTION: Microbiologie

VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthodes d’analyse

Dénombrement des E. coli par la méthode TEMPO (I-MET-046c) (AFNOR BIO 12/13 – 02/05) Dénombrement des Enterobacteriaceae par la méthode TEMPO (I-MET-047c) (AFNOR BIO 12/21 – 12/06) Dénombrement des staphylocoques coagulase positive par la méthode TEMPO (I-MET-038c) (AFNOR BIO 12/28 – 04/10) Dénombrement de la flore mésophile aérobie totale par la méthode TEMPO (I-MET-048b) (AFNOR BIO 12/15 – 09/05)

Techniek Technique TEMPO

Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices

- Produits destinés à la consommation humaine (Catégories 1, 2, 3 et 4 (suivant la norme ISO 19036))

Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaptation

09/01/2014


• Résumé des critères de performance : Matrices de la

catégorie 1 Matrices de la catégorie 2

Matrices de la catégorie 3

Matrices de la catégorie 4

Répétabilité (log ufc/g ou ml)

0,56 0,48 0,22 0,50

Ecart type de reproductibilité (log ufc/g ou ml)

0,43 0,23 0,23 0,21

Incertitude de mesure (reproductibilité) (log ufc/g ou ml)

0,86 0,46 0,61 0,41

• La validation répond aux exigences de la procédure LAB 00 P180

• Le laboratoire qui veut appliquer cette méthode doit démontrer que les critères ci-dessous soient remplis pour les combinaisons matrices/paramètres : Participation à un test interlaboratoire et obtention de résultats corrects. Obtention d’une répétabilité de 0,5 log et une reproductibilité de 1,0 log.

• Historique de validation :

Edition Révision par/date Motif de la révision Modifications

1 MC Wilem / 01-2014 Adaptation au nouveau template et à la nouvelle procédure de validation (P180)

Adaptation au nouveau template du dossier de validation du 07.09.2011, ajout de résultats de tests interlaboratoires, annexe photos.


VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthodes d’analyse

Dénombrement des E. coli par la méthode TEMPO (I-MET-046c) (AFNOR BIO 12/13 – 02/05) Dénombrement des Enterobacteriaceae par la méthode TEMPO (I-MET-047c) (AFNOR BIO 12/21 – 12/06) Dénombrement des staphylocoques coagulase positive par la méthode TEMPO (I-MET-038c) (AFNOR BIO 12/28 – 04/10) Dénombrement de la flore mésophile aérobie totale par la méthode TEMPO (I-MET-048b) (AFNOR BIO 12/15 – 09/05)

Techniek Technique TEMPO

Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices

- Produits destinés à la consommation humaine (Catégories 1, 2, 3 et 4 (suivant la norme ISO 19036))

Type validatie Type de validation

Vérification

Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction)

MC Wilem Responsable section microbiologie LFSAGx

Opgesteld door Rédaction par

MC Wilem Responsable section microbiologie Date: 09/01/2014

Handtekeningen - Signatures: Sé

Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction)

Collaborateurs de la section microbiologie LFSAGx A. Georges, A. Mandiki, F. Marlier, M. Martin, S. Petit, B. Polderman, C.Schauwers et MC Wilem

Periode van validatie Période de validation

Ce dossier de validation a été clôturé le 07/09/2011

Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par

A. Dubois Responsable Qualité LFSAGx Date : 13/01/2014

Handtekeningen - Signatures: Sé

Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P 00 180.

LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 1/16


VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION ................................................................................. 1

SAMENVATTING VALIDATIEGEGEVENS – RÉSUMÉ DES DONNÉES DE VALIDATION........................ 3

1 INTRODUCTION ....................................................................................................................................... 5

2 VALIDATION ............................................................................................................................................ 5

2.1 ANALYSE D’ÉCHANTILLONS EN PARALLÈLE SUIVANT LES MÉTHODES TEMPO TVC ET ISO 4833 .......................... 5 2.2 REPRODUCTIBILITÉ, RÉPÉTABILITÉ, INCERTITUDE DE MESURE ........................................................................ 6 2.3 TESTS INTERLABORATOIRES ....................................................................................................................... 8 2.4 JUSTESSE – ANALYSE D’UN ÉCHANTILLON CERTIFIÉ ...................................................................................... 9 2.5 VALIDATION DE LA RÉFRIGÉRATION .......................................................................................................... 12

3 CONCLUSIONS ....................................................................................................................................... 13

4 ANNEXES ................................................................................................................................................ 14



Samenvatting validatiegegevens – Résumé des données de validation Matrices / paramètres de validation / critères Matrices :

Produits destinés à la consommation humaine (Catégories 1, 2, 3 et 4 (suivant la norme ISO 19036))

Paramètres de validation : - Répétabilité - Reproductibilité / incertitude de mesure - Justesse ou justesse relative Critères Répétabilité

Type de matrice

Répétabilité (log ufc/g ou ml )

E. coli I 0,28 II 0,22

III 0,25 IV 0,42

Entérobactéries I 0,28 II 0,44 III 0,28

IV 0,36

Staphylocoques coagulase + I 0,28

II 0,48 III 0,42 IV 0,40

Flore mésophile aérobie totale

I 0,56 II 0,48 III 0,22

IV 0,50



Ecart type de reproductibilité, incertitude de mesure (reproductibilité)

Type de matrice

Ecart type de reproductibilité

(log ufc/g ou ml)

Incertitude de mesure

(log ufc/g ou ml) E. coli I 0,13 0,25

II 0,13 0,27 III 0,13 0,25

IV 0,14 0,27

Entérobactéries I 0,13 0,26

II 0,19 0,39 III 0,31 0,62 IV 0,27 0,53

Staphylocoques coagulase + I 0,13 0,26 II 0,33 0,66 III 0,18 0,36

IV 0,25 0,51


I 0,43 0,86

II 0,23 0,46 III 0,23 0,61 IV 0,21 0,41

Justesse : Matrice I : La justesse a été établie sur base d’analyse d’échantillons certifiés

Ecart maximum en valeur absolue avec le résultat attendu

E. coli 0.2 log Entérobactéries 0.2 log

Staphylocoques coagulase + 0.2 log Flore mésophile aérobie totale 0.3 log Autres matrices : : La justesse a été établie sur base des z-scores conformes obtenus lors des tests interlaboratoires.



1 Introduction Ce dossier présente la validation interne des méthodes de dénombrement des E. coli, des entérobactéries, des staphylocoques coagulase positive et de la flore mésophile aérobie totale par la technique TEMPO.

2 Validation 2.1 Analyse d’échantillons en parallèle suivant les méthodes TEMPO et les

normes ISO correspondantes Sont considérés comme concordants, les résultats d’un échantillon analysé suivant la méthode TEMPO et suivant la norme ISO correspondante ne présentant pas une différence de plus de 1 log.

2.1.1 Echantillons naturellement contaminés

Microorganismes Nombre d’analyses réalisées % résultats concordants

E. coli 185 99,5%

Entérobactéries 129 95,3%

Staphylocoques coagulase + 123 92,7%

Flore mésophile aérobie totale 148 90,5%*

*Les résultats non concordants pour la flore mésophile aérobie totale concernent principalement les

analyses de swabs. La validation de ce type de matrice fera l’objet d’analyses complémentaires.

Les résultats de type ‘ISO : <100 ufc/g – TEMPO : 150 ufc/g’ n’ont pas été pris en compte.

Le détail des résultats peut être consulté en annexe 1.

2.1.2 Echantillons artificiellement contaminés

Microorganismes Nombre d’analyses réalisées % résultats concordants

E. coli 128 100%

Entérobactéries 128 99,2%

Staphylocoques coagulase + 128 100%

Flore mésophile aérobie totale 78 100%

Le détail des résultats peut être consulté en annexe 2.



2.2 Reproductibilité, répétabilité, incertitude de mesure

Les valeurs ont été obtenues sur des échantillons artificiellement contaminés. Pour couvrir tous les types de denrées alimentaires, les matrices ont été réparties suivant les 4 catégories définies dans la norme ISO 19036 : Catégorie I : liquides et poudres (lait, lait en poudre, …) Catégorie II : mélanges de solides (viande hachée, crème, glaces, …) Catégorie III : petits et très petits solides (salade, crevettes, légumes rapés, noisettes hachées, aliments pour bétail, …) Catégorie IV : autres solides (viande non hachée, fromage, …)

2.2.1 Reproductibilité, incertitude de mesure

Type de matrice

Ecart type de reproductibilité

(log ufc/g ou ml)

Incertitude de mesure

(log ufc/g ou ml)

E. coli I 0,13 0,25 II 0,13 0,27 III 0,13 0,25

IV 0,14 0,27


II 0,19 0,39 III 0,31 0,62 IV 0,27 0,53

Staphylocoques coagulase + I 0,13 0,26 II 0,33 0,66

III 0,18 0,36 IV 0,25 0,51


I 0,43 0,86

II 0,23 0,46 III 0,23 0,61 IV 0,21 0,41

Cf. Tableaux annexe 3.

Ces tableaux et ces résultats sont évolutifs. Ils seront complétés par des résultats obtenus lors de l’analyses d’échantillons naturellement contaminés



2.2.2 Répétabilité

Type de matrice Ecart type de répétabilité

(log ufc/g ou ml)

Répétabilité (log ufc/g ou ml)

E. coli I 0,10 0,28 II 0,08 0,22 III 0,09 0,25

IV 0,15 0,42


II 0,16 0,44 III 0,10 0,28 IV 0,13 0,36

Staphylocoques coagulase + I 0,10 0,28 II 0,17 0,48 III 0,15 0,42

IV 0,14 0,40


I 0,20 0,56

II 0,17 0,48 III 0,08 0,22 IV 0,18 0,50

Pour la matrice I, la répétabilité a été établie sur base d’analyse d’échantillons certifiés (cf. annexe 4). Pour les matrices II, III et IV, la répétabilité a été calculée conformément à la norme ISO 5725. Les tableaux présentant les tests de Grubbs et de Cochran peuvent être consultés dans l’annexe 4.



2.3 Tests interlaboratoires

Le laboratoire a participé à au moins un test interlaboratoire pour chaque microorganisme pouvant être recherché par la méthode TEMPO. Le détail des résultats obtenus est présenté dans l’annexe 5. SLV Suède mars 2011 : 3 analystes ont effectué chacun toutes les analyses

E. coli Entérobactéries Flore mésophile aérobie totale

Analyste

1 Analyste

2 Analyste

3 Analyste

1 Analyste

2 Analyste

3 Analyste

1 Analyste

2 Analyste

3

11131283 -0.05 0.95 0.53 0.72 0.44 0.22 0.75 0.00 -0.72 11131285 * * * 1.00 2.25 1.08 1.00 2.56 2.56

Octobre 2011

E. coli Entérobactéries

z-scores * / 0.23 / 0.16 1.20 / 0.62 / -0.62 *Absence du microorganisme dans l’ échantillon

CECALait

Mai 2011 (lait) Mars 2012 (fromage)

E. coli 2.05 / -0.09 / 1.38 / 1.66 / 0.95 1,64 / 0,55 / 2,05 / -0,08 / 0,44 Staphylocoques coagulase + -1,48 / -0.46 / 0.38 / -2.87 / * -2,15 / -1,14 / -0,99 / 0,41 / * Entérobactéries / 1,16 / 0,74 / 0,38 / 1,43 / 1,35


/ 2,23 / 1,80 / 1,59 / 1,70 / -0,03

*Absence du microorganisme dans l’ échantillon

BIPEA - Viande

z-scores

Mai 2011 Octobre 2011 Février 2012 E . coli 0,19 0,13 1,38 Entérobactéries 0,24 -0,50 -0,09

Staphylocoques coagulase + -0,03 -1,48 -0,45 Flore mésophile aérobie totale 0,02 -0,24 1,31



2.4 Justesse – Analyse d’un échantillon certifié Matrice I : Mode opératoire : l’échantillon certifié a été analysé 6 fois par un même analyste et 1 fois par 6 analystes différents.

a. E. coli

Echantillon certifié Cécalait lot ETG L ST/EC 04/11 Les résultats obtenus doivent être compris entre 2,87et 3,71 log ufc/ml (3,29 ± 2,8 x 0,15)

Analyste Résultats (ufc/ml)

Résultats (log ufc/ml)

AM 1 1800 3,3 AM 2 2100 3,3 AM 3 2000 3,3

AM 4 2100 3,3 AM 5 3700 3,6 AM 6 2400 3,4

AG 3400 3,5 CS 2100 3,3 BP 3100 3,5

FM 3400 3,5 SP 2900 3,5 Moyenne 2600 3,4

L’ensemble des valeurs individuelles et la moyenne des valeurs du laboratoire sont comprises entre les valeurs limites du certificat de l’échantillon. Ecart maximum en valeur absolue avec le résultat attendu : 0,2 log.



b. Enterobacteriaceae




AM 1 1900 3,3 AM 2 3100 3,5 AM 3 1900 3,3

AM 4 2300 3,4 AM 5 3700 3,6 AM 6 3400 3,5

AG 2100 3,3 CS 4100 3,6 BP 4100 3,6 FM 4500 3,7

SP 4100 3,6 MCW 1800 3,3 Moyenne 3100 3,5




c. Staphylocoques coagulase +




AM 1 1200 3,1 AM 2 1300 3,1 AM 3 1300 3,1

AM 4 1100 3,0 AM 5 830 2,9 AM 6 1100 3,0

AG 1200 3,1 CS 900 3,0 FM 1700 3,2 SP 1300 3,1

MCW 730 2,9 Moyenne 1200 3,0




d. Flore mésophile aérobie totale

Echantillon certifié Cécalait lot ETG LGT 04/11 Les résultats obtenus doivent être compris entre 4,87et 5,29 log ufc/ml (5,08 ± 2,8 x 0,076)



AM 1 150000 5,2 AM 2 78000 4,9 AM 3 60000 4,8

AM 4 250000 5,4 AM 5 110000 5,0 AM 6 110000 5,0

AG 110000 5,0 CS 74000 4,9 BP 120000 5,1 FM 210000 5,3

SP 170000 5,2 MCW 150000 5,2 Moyenne 130000 5,1


Pour toutes les matrices, la justesse a été prouvée par l’obtention de bons résultats lors de la participation à des tests interlaboratoires. 2.5 Validation de la réfrigération Mode opératoire : les échantillons artificiellement contaminés analysés pour déterminer l’incertitude de mesure ont également servi à la validation de la réfrigération. Les lectures des cartes TEMPO ont été effectuées en fin d’incubation et après 24 et 48h de réfrigération à 2°C. Le tableau suivant reprend les observations qui ont pu être tirées des tests de réfrigération sur l’ensemble des matrices en fonction des différents microorganismes. Le détail des résultats peut-être consulté en annexe 6.



Après 24h de réfrigération : Nombre de

données Résultats

acceptables (%) Résultats non

acceptables (%) Remarques

E. coli 128 100 0

Entérobactéries 111 97,3 2,7 Les valeurs non

acceptables concernent 3 échantillons de la matrice II

Staphylocoques coagulase +

128 100 0


123 100 0

Après 48h de réfrigération : Nombre de

données Résultats

acceptables (%) Résultats non

acceptables (%) Remarques

E. coli 116 100 0

Entérobactéries 99 96 4

Les valeurs non acceptables concernent 3 éch. de la matrice II et 1

éch. de la matrice IV

Staphylocoques coagulase +

116 96,6 3,4

Les valeurs non acceptables concernent 2 éch. de la matrice II et 2

éch. de la matrice IV Flore mésophile aérobie totale

114 100 0

Résultats acceptables : résultats compris dans les limites de répétabilité pour la matrice.

3 Conclusions Les données obtenues lors de la validation interne des méthodes de dénombrement des E. coli, des entérobactéries, des staphylocoques coagulase + et de la flore mésophile aérobie totale par la technique TEMPO permettent l’implémentation de ces méthodes au laboratoire.



4 Annexes

- Annexe 1 : Analyse d’échantillons naturellement contaminés : détails des résultats. Ces données peuvent être consultées au laboratoire.

- Annexe 2 : Analyse d’échantillons artificiellement contaminés : détails des résultats. Ces données peuvent être consultées au laboratoire.

- Annexe 3 : Reproductibilité, incertitude de mesure : Tableaux des résultats. Ces données peuvent être consultées au laboratoire.

- Annexe 4 : Calcul de la répétabilité. Ces données peuvent être consultées au laboratoire.

- Annexe 5 : Tests interlaboratoires : détails des résultats. Ces données peuvent être consultées au laboratoire.

- Annexe 6 : Tests de réfrigération : détails des résultats. Ces données peuvent être consultées au laboratoire.

- Annexe photos



Annexe photos TEMPO filler : Station de préparation des cartes TEMPO

Encodage des données dans l’appareil TEMPO (n° d’échantillon, dilution, …)



TEMPO reader : Lecture des cartes TEMPO après incubation


Documents

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