Drug and Alcohol Dependence. 10 (1982) 1 I 1 12-l III

VALIDITE DE LA METHODE D’ALCOOLISATION PAR VOIE PULMONAIRE DANS LES ETUDES DU SYNDROME ALCOOLIQUE CHEZ LE RAT

Les probl6mes de l’utilisation de la mdthode d’alcoolisation par voie pulmonaire ont $2 &udi& chez le rat. Cette m&hode d’alcoolisation con- tinue permet d’obtenir rapidement une intoxication profonde. AprGs 3 semaines, les animaux prksentent des atteintes mktaboliques et font un syndrome de sevrage.

Le contr6le nutritionnel est ohtenu en ajustant la croissance d’un lot d’animaux (animaux “pair-weight”) i celle des rats alcoolis6s.

11 est montr6 que le s6jour prolong6 dans 1’atmosphGre riche en kthanol ne provoque pas d’altkration pulmonaire: les constituants et la structure histologique pulmonaires ne sont pas modifi&. La mesure des diff&ents paramstres sanguins (pH, pressions partielles art&-ielles en O2 et C02, taux d’h&moglobine...) traduisent l’absence d’atteinte de la fonction respiratoire. 1,‘alcoolisation par voie pulmonajre apparait clonr comme un moditle adapt6 a l’ktude de divers aspects de l’alcoolisme.

Summary

Alcohol intoxication by the pulmonary route was studied in the rat. This method of continuous alcoholization quickly leads to deep intoxica- tion. After 3 weeks the animals showed met,abolic alterations and a st,rong withdrawal syndrome.

Nutritional control was obtained by adjusting the growth of a group of animals (pair-weight animals) with that of the alcoholic rats.

It was shown that prolonged periods in an atmosphere rich in ethanol did not cause any alteration of the lungs: neither the constituents nor the histological structure of the lungs were modified. Measurement of the various blood parameters (pH, arterial 0, and CO2 partial pressures, level of haemoglobin, etc.) showed the absence of adverse respiratory effects. This inhalation procedure would therefore seem to be a model which is well adapted to the study of various aspects of alcoholism. -. - .-_-__--___

O376-8716/82/0000-0000/$02.75 13 Elsevier Sequoia/Printed in The Nethrrlands

112

Introduction

Contrairement a l’homme, les animaux ne consomment pas spontane- ment des quantites d’ethanol suffisantes pour s’intoxiquer; on considere qu’ils refusent d’absorber plus d’alcool qu’ils ne sont capables d’en oxyder, et ceci constitue un obstacle aux etudes experimentales de l’alcoolisme. Pour le surmonter, diverses methodes ont ete utilisees. Les unes associent l’alcool a l’alimentation ou a la boisson et laissent ainsi a l’animal la faculte de regler sa propre consommation: ethanol dans l’eau de boisson, regime semi-liquide alcoolise [ 11, creation d’un comportement polydipsique 121. Dans d’autres, au contraire, c’est l’experimentateur qui a le controle total de la dose et de la duree d’administration: intubation orale [ 31, perfusion intraveineuse [ 41, implantation sous-cutanee d’un tube permeable a l’alcool [ 51, alcoolisation par voie pulmonaire. A ce sujet, en 1971, Goldstein et Pal [6] decrirent pour la premiere fois le developpement d’une dependance a l’alcool chez des souris ayant v&u plusieurs jours en atmosphere alcoolisee. Roach et al. [ 71, puis le Bourhis [ 81, Ferko et Bobyock [ 91, et plus recemment Morgan et al. [lo], obtinrent des rats fortement intoxiquds par inhalation de vapeurs d’alcool durant 7 h 30 jours.

L’utilisation de cette methode d’alcoolisation pose cependant certains problemes qui restent peu abordes: par exemple la restriction de la prise alimentaire chez les animaux fortement alcoolises permet-elle d’etudier avec ce modele l’effet propre de l’ethanol? De meme, si cette technique permet effectivement de developper tolerance, dependance et diverses atteintes me- taboliques, ne provoque-t’elle pas, par ailleurs, une atteinte pulmonaire et respiratoire susceptible d’interferer avec les effets specifiques de l’ethanol?

Le present travail tente done de repondre a ces questions par l’etablis- sement d’un bon controle nutritionnel, par la mesure de signes metaboliques et comportementaux ainsi que par la recherche de l’impact sur la structure et la fonction pulmonaires.

Materiel et methodes

Les experiences ont 4th realisees sur des rats males Sprague-Dawley, d’un poids moyen de 210 g.

In toxica tion alcoolique Elle a lieu dans une enceinte de 144 1 similaire a celle d&rite par

Goldstein [ 111. L’air, filtrk et s&he, penetre dans l’enceinte au debit de 12 litres/mn apres passage dans un flacon thermostat6 dans lequel l’ethanol est evapore. L’ethanol est apporte par gravite; son debit est regle par une vanne a aiguille de precision, associee i un debitmetre a bille (Brooks), pour obtenir la concentration en vapeurs d’alcool desiree a l’interieur de l’en- ceinte. La teneur est progressivement amenee de 15 h 26 mg d’alcool par litre d’air en 22 jours.

113

Les animaux places dans cette enceinte (lot A) ont libre acces a la nourriture et a la boisson. Deux autres lots sont places en atmosphere nor- male: l’un (lot T) est constitue d’animaux qui reCoivent nourriture et boisson ad libitum; l’autre (lot P) regroupe des animaux qui reqoivent journaliere- ment une quantite de nourriture telle que leur croissance soit identique a celle des rats alcoolises (animaux “pair-weight”).

Quotidiennement, la prise de nourriture et de boisson ainsi que le poids des animaux des 3 groupes sont releves.

Mesure de l’kthanol et de l’acc?taldkhyde sanguins Ces mesures sont realisees episodiquement sur les animaux alcoolisks de

faGon a suivre leur niveau d’impregnation; le sang est p&eve sur citrate de sodium (0.13 M) au niveau du sinus rdtro-orbital de l’oeil. Le sang est dilue dans un tampon phosphate pH 7,2 isotonique (Na*HPO,: 109 mM; NaH*PO,: 27 mM), contenant de l’isopropanol (0,52 PM) utilise comme standard in- terne et de la semicarbazide (6 mM); cette semicarbazide a pour role de deplacer l’acetaldehyde des complexes qu’elle forme, en particulier avec l’hemoglobine. et de la stabiliser sous forme de derive semicarbazone [ 121. Apres separation des globules rouges par centrifugation, le plasma est traite a l’acide perchlorique (1 N final) qui lib&e l’acetaldehyde et precipite les proteines. Apres centrifugation et elimination du culot, l’ethanol et l’acetal- dehyde sont determines sur l’espace de tete par chromatographie en phase gazeuse (Porapak Q 100 - 120 mesh a 130 “C avec detection a ionisation de flamme) [ 131.

Observation du syndrome de sevrage A la fin de la periode d’alcoolisation, 10 animaux sont retires de l’en-

ceinte et places en atmosphere normale sans bruit ni lumiere vive. 11 sont observes pendant 20 heures afin de suivre le developpement du syndrome de sevrage; toutes les heures, les signes spontanes d’hyperexitabilite [ 141 sont notes et quantifies de 0 a 2 selon l’ihtensite: tremblements, extension des membres, rigidite de la queue. Ensuite, les cris au toucher sont notes et l’intensite des convulsions induites par le soulevement des animaux sont appreciees selon l’echelle Qtablie par Goldstein Ill].

Pour toutes les heures, les notes obtenues par chaque rat sont addition- rides et le score moyen est calcule.

LGtermination des parame’tres san,guins, hkpatiques et pulmonaires Apres 22 jours d’alcoolisation, les numerations globulaires, le taux

d’hemoglobine et 20 parametres plasmatiques (SMAC Technicon) ont ete determines; en outre, des echantillons de sang arteriel ont et.4 p&eves sur heparine a l’abri de l’air afin de determiner le pH sanguin et les pressions partielles d’O,? et de CO* (I L Meter 213).

Le foie et le poumon entiers sont preleves et peses; un echantillon d’un gramme de ces organes est homogenkisk avec un appareil de Potter dans 9 volumes de NaCl 0,15 M. Differentes mesures ont alors et& effect&es: pro-

114

teines [ 151, glycerol des triglycerides [ 161, phospholipides [ 171, cholesterol [ 181, acide desoxyribonucleique [ 191 et acide ribonucleique [ 201.

Parallelement, 5 animaux de chaque groupe sont anesthesies au pento- barbital sodique et recoivent par voie veineuse 0,l mg de carbone colloidal par kg de poids corporel pour permettre un marquage des macrophages. Les animaux sont sacrifies 40 minutes apres ce traitement puis le poumon est rapidement preleve et fixe dans du liquide de Bouin. Les coupes sont colo- rees par un melange hemalun-cosine pour observation microscopique.

Analyses statistiques Les don&es experimentales sont traitees par analyse de variance [ 211.

Les tableaux de resultats presentent les moyennes et leurs erreurs types, le F global avec la signification statistique et la decomposition orthogonale des effets: le lot “alcool” est compare aux deux lots controles P et T (effet alcool), puis ces deux lots controles sont compares entre eux (effet restric- tion alimentaire).

Resultats

L’augmentation de la teneur d’alcool dans l’atmosphere permet d’ob- tenir des taux d’alcool et d’acetaldehyde sanguins eleves a partir de la deuxieme moitie de l’experimentation (Fig. 1). C’est durant la derniere semaine d’intoxication que la mortalite est observee: elle est de l’ordre de 10%. Cette intoxication prolongee est accompagnee d’une perte importante de poids et d’une diminution de la prise alimentaire par rapport aux temoins T (Fig. 2). Pour obtenir un ralentissement analogue de la croissance chez des animaux non exposes a l’ethanol (lot P), il faut limiter leur consommation de nourriture solide qui reste cependant superieure de 35% a la quantite libre- ment consommee par les animaux alcoolises (Fig. 2). Cette difference traduit une utilisation fonctionnelle des calories d’origine alcoolique. L’evolution

26. 0 c3

5 10 15 20

TEMPS I Jours i

Fig. 1. Evolution de la teneur en ethanol dans I’enceinte d’alcoolisation; alcool et a&tat- dbhyde sanguins pendant I’expGrimentation. Moyennes k erreur type (n = 10).

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*

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Fig. 2. Evolution pond&ale et consommation alimentaire journali&-e des 3 lots d’animaux pendant la pPriode d’expkrimentation (n = 10).

de l’ensemble des reactions spontanees et induites qui refletent le syndrome de sevrage est presentee sur la Fig. 3. Les scores les plus eleves sont obtenus 11 heures apres la sortie des animaux de l’enceinte alcoolisee. Une certaine hyperexitabilite persiste a la 39’“” heure.

Le Tableau 1 recapitule les principaux parametres hepatiques et san- guins etudies. Le traitement a l’alcool pendant 22 jours provoque dans le foie une steatose a base de triglycerides sans modification significative du taux de cholesterol et de phospholipides ni de la masse hdpatique rapportee au poids corporel; seule la difference d’apport calorique a un effet sur ce dernier parametre. L’atteinte hepatique due a l’alcool est confirmee par une forte augmentation de l’alanine aminotransferase (ALAT), et de l’aspartate aminotransferase (ASAT) circulantes. Au niveau plasmatique, il n’y a pas de modification du taux de lipides ni de celui de l’uree, mais le taux d’albumine est superieur chez les animaux alcoolises. Les autres parametres mesures

116

* 5 10 15 20 39

Sewage HEURES

Fig. 3. Quantification du syndrome de sevrage i l’alcool. Pour chaque rat sont not& les signes spontank d’hyperexitabilitk, les cris au toucher et les convulsions induites par la manipulation. Chaque point repkente le score total moyen et son erreur type.

n’apportent pas de renseignements specifiques et ne sont pas report& sur le tableau.

L’analyse biochimique des constituants du poumon (Tableau 2) indique une augmentation des proteines totales (de I’ordre de 10%) et de certains parametres lipidiques chez les animaux alcoolises mais les teneurs en RNA et DNA ne sont pas modifiees; le poids de l’organe est egalement constant.

La mesure des parametres hematologiques (Tableau 3) indique une augmentation du volume globulaire moyen chez les rats alcoolises, signe de l’impregnation ethylique; les autres resultats erythrocytaires (numeration, rapport hematrocrite, taux d’hemoglobine) ne sont pas perturb&; le pH et les gaz du sang (Tableau 4) ont des valeurs normales [ 221 et aucune modifi- cation significative n’est relevee; tout ceci traduit l’absence d’etat anoxique ou d’acidose respiratoire consecutif i la modification de l’atmosphere dans laquelle vivent les animaux alcoolises.

L’observation histologique des coupes de poumons provenant des rats alcoolises n’a pas montrk de fibrose, de plages hemorragiques ni de modifi- cations structurales des alveoles. L’impregnation au carbone colloi’dal ne revele pas de proliferation des macrophages pulmonaires (Fig. 4).

Discussion

Comme l’ont ecrit Deitrich et MC Clear-n [ 231, “il n’existe actuellement aucun modele animal de l’alcoolisme humain et il n’en existera jamais. Cependant, il n’est pas mauvais que nous puissions obtenir differentes facettes de l’alcoolisme et les etudier en detail”.

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119

TABLEAU 3

Effet de l’alcoolisation par voie pulmonaire sur differents parametres hematologiques

Nombre Hematocrite Volume Hemoglo- Nombre de d’hematies % du sang globulaire bine leucocytes millions/mm3 total moyen g/l00 ml I mm3

IJ3

Animaux 8,27 * 0,156 temoins (T) n=8

Animaux 9,18 + 0,220 “pair weight” n = 8

(P)

Animaux 8,25 + 0,271 alcoolises (A) II = 8

F global 5,85**

Effet alcool NS

(T + P) versus A

Effet restric- ?** tion alimen- taire T versus P

47 * 0,7 57 + 1,l n=8 n=8

51 t 1,2 n=8

56 k 0,9 n=8

20,56 * 0,379 n = 10

20,Ol f 0,516 n = 10

12650+1143 n = 10

10930 f 883 n = 10

50 * 1,2 n=8

3,36Ns

NS

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3,23Ns

NS

10488 + 776 II = 8

1,43NS

NS

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5,01*

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NS NS NS NS

Signification statistique: * : p < 0,05; **: p < 0,Ol; NS: non significatif.

TABLEAU 4

Effet de l’alcoolisation par voie pulmonaire sur le pH sanguin et les gas du sang (pressions partielles arterielles en O2 et CO*). Valeur des bicarbonates plasmatiques par application des equations d’Henderson - Hasselbach

pH sanguin Pa 02 mm Hg

Pa CO* mm Hg

Bicarbonates mEq. lee’

Animaux temoins (T) n = 10

Animaux “pair weight” (P) n=9

Animaux alcoolises (A) ,I = 12

F global

Effet alcool (T + P) versus A

Effet restriction alimentaire T versus P

7,28 +0,019

7,24 f0,019

7,29 *0,028

81 +5,1

69 *5,4

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NS

1,2oNS 1,05NS 0,06Ns

NS NS NS

NS NS NS NS

NS: non significatif.

120

121

L’alcoolisation par voie pulmonaire est un modele qui permet de recreer chez l’animal une tolerance et une dependance a l’alcool: la tolerance se ma- nifeste par la necessite d’augmenter regulierement la teneur en alcool de l’atmosphere si l’on veut maintenir chez les animaux une alcoolemie sou- tenue. La dependance physique a l’alcool se traduit par des signes d’hyper- exitabilitd qui atteignent leur paroxysme 11 heures apres le sevrage. Ce resultat est en accord avec celui de Ferko et Bobyock [9] qui observent les plus importantes convulsions induites 10 heures apres la sortie de l’enceinte. pour une alcoolemie moyenne des rats en debut de sevrage de 65 mM. Avec cette methode d’alcoolisation, la dose d’alcool circulante pour chaque animal est like aux variations du coefficient d’ethyl-oxydation et de la ventilation pulmonaire. Pour stabiliser les alcoolemies obtenues et diminuer la mortalite, Goldstein et Pal [ 111 reduisirent la teneur en alcool de l’atmosphere mais injecterent journalierement du pyrazole qui inhibe le metabolisme de l’etha- nol. Dans notre cas, le processus progressif, etale sur trois semaines, permet de diminuer cette variabilite individuelle; de plus, le taux de mortalite ob- serve ne rend pas necessaire l’emploi du pyrazole, qui peut interferer avec les effets de l’alcool car c’est un hepatotoxique [24] et il exerce une action directe sur le systeme nerveux central [ 251.

Toutes les methodes d’alcoolisation chronique qui provoquent des alcoolemies &levees s’accompagnent d’une perte de poids des animaux trait&s et d’une diminution de la prise alimentaire. L’appariement par le poids permet de tenir compte de cette restriction alimentaire tout en ayant un equilibre du regime solide identique chez les alcoolises et les non alcoolises, l’apport alcoolique &ant, comme dans l’alcoolisme humain, un surplus calorique. Les differences observees tant au point de vue metabolique que comportemental sont dues a un effet propre de l’ethanol et non a des varia- tions des differents constituants du regime.

L’administration chronique d’ethanol par diverses voies provoque un certain nombre de modifications metaboliques [ 261. Dans cette etude au tours de laquelle l’alcool penetre dans l’organisme par l’epithelium alveo- laire, on retrouve un certain nombre de ces alterations: la plus importante est une stdatose hepatique avec un taux eleve de triglycerides. L’augmentation des taux d’ASAT et d’ALAT plasmatiques refletent egalement l’hepatotoxi- cite de l’ethanol provoquee par l’intoxication chronique a l’alcool [ 271.

Apres avoir v&if% que la technique d’alcoolisation par voie pulmonaire permettait d’obtenir des animaux fortement intoxiques, presentant des signes de dependance physique a la sortie de l’enceinte et des atteintes metaboliques, nous avons recherche les modifications kventuelles de la fonc- tion pulmonaire pouvant etre provoqukes par le sejour dans une atmosphere riche en vapeurs d’alcool.

Le travail effectue chez l’homme par Lester et Greenberg [28] montre que 10 a 20 mg/litre d’ethanol dans l’air provoque une toux et un picot- tement des yeux. Ces signes disparaissent entre 5 et 10 minutes. Trente mg d’ethanol par litre d’air peuvent etre toleres mais au-dessus de 40 mg/l, l’atmosphere est intolerable meme pour de courtes periodes.

122

Les animaux ayant sejourne 22 jours en atmosphere alcoolisee (de 15 i 25 mg/l) ne presentent aucune anomalie histologique au niveau pulmonaire. Parmi les constituants pulmonaires, les phospholipidcs et surtout les tri- glycerides sont significativement plus elevds chez les animaux soumis aux vapeurs d’ethanol; Liau et al. [ 291 decrivent egalement une augmentation de la teneur totale en lipides pulmonaires et notamment de certains cons- tituants (triglycerides, certains phospholipides mais pas le cholesterol) chez des animaux recevant un regime semi-liquide pendant 7 semaines; la modi- fication observee ici, apres inhalation d’ethanol, ne semble done pas etre due a un effet de contact des vapeurs d’ethanol mais a un effet general de l’alcool.

Les images histologiques obtenues et l’absence de signes d’anoxie caracterisee chez les animaux alcoolisds dans nos conditions permettent de noter l’absence d’une atteinte de la fonction respiratoire; aussi, l’oxygena- tion tissulaire, en particulier dans le foie et le cerveau, est-elle normale si bien que la technique n’apporte pas de restrictions aux effets metaboliques (rapports NADH/NAD, lactate/pyruvate) et comportementaux dus a l’alcool.

La plupart des objections faites a ce type d’intoxication 1301 semblent done pouvoir etre levees: pas de necessite de traitement pharmacologique complementaire, controle nutritionnel adequat dans les conditions extremes d’intoxication, integrite de la fonction respiratoire malgre la voie inhabituelle d’administration. 11 reste l’inconvenient que l’experimentateur ne peut connaitre la dose effectivement absorb&e.

Cette methode d’alcoolisation permanente, caractdrisee par des altera- tions metaboliques et comportementales est un modele adapt6 a l’etude de divers aspects de l’alcoolisme et plus particulierement a l’etude de la tole- rance et de la ddpendance physique.

Remerciements

Les auteurs remercient le laboratoire de Biologie cellulaire (Prof. Hollande) de l’universite Paul Sabatier, le laboratoire de Biochimie II (Prof. Thouvenot) et le service d’exploration fonctionnelle respiratoire (Prof. Garrigues) du centre hospitalier regional de Toulouse Purpan pour l’aide specifique apportee h ce travail: interpretation histologique, parametres cliniques, analyse des gaz du sang.

Ce travail a fait l’objet d’une subvention du Haut Comite d’Etude et d’brformation sur 1’Alcoolisme.

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