Vérification des performances d’une méthode selon le SH FORM 44 : application à la coloration de Gram

ACCRÉDITATION EN BACTÉRIOLOGIE

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014 - N°461 // 37

article reçu le 19 décembre, accepté le 26 février 2014.

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RÉSUMÉ

La coloration de Gram qu’elle se fasse manuellement ou grâce à un colo-rateur est une étape incontournable mais aussi critique en bactériologie qui contribue à la fois au diagnostic clinique et à l’orientation thérapeutique. Il s’agit d’une méthode en portée A de type qualitatif.L’objectif de ce travail est de contribuer à répondre aux exigences de la norme ISO 15189 en termes de vérification des performances, d’harmoni-sation des pratiques professionnelles et d’évaluation des compétences en respectant le formalisme du document SH FORM 44. L’analyse des risques est décisive qu’elle se fasse selon la méthode des 5 M ou par l’analyse des modes de défaillance, de leurs effets et de leur criticité et doit aboutir à la mise en place de moyens cohérents de maîtrise adaptés à sa propre pratique. Sur site, l’étude des performances a consisté à évaluer la conta-mination entre échantillons (n = 12, le bac de coloration et le carrousel du colorateur ne permettant pas de réaliser plus de 12 colorations de Gram simultanées) et à comparer la coloration manuelle versus la coloration automatisée sur système PREVI Color de bioMérieux, sur 20 échantil-lons de contrôles. Les critères d’acceptabilité ont porté sur la coloration (Gram positif, Gram négatif) et la morphologie observée (bacille ou cocci) de 4 souches de référence connues de la Collection de l’Institut Pasteur.En pratique, si la compétence de l’utilisateur reste un point crucial à maî-triser, le biologiste doit aussi pleinement s’impliquer, les normes n’étant pas toujours adaptées, les recommandations des sociétés savantes et la bibliographie restant rares.

Coloration de Gram – vérification sur site/validation des méthodes – SH FORM 44 – norme ISO 15189 – accréditation – gestion des risques.

Hélène Astier-Théfennea,*, Audrey Wolfa, Chrystelle Darlesa, Éric Garnotela

Vérification des performances d’une méthode selon le SH FORM 44 : application à la coloration de Gram

ti l l 19 dé b té l 26 fé i 2014

a Laboratoire de biologieHôpital d’Instruction des Armées Laveran34, bd Laveran – CS 5000413384 Marseille cedex 13

* [email protected]

SUMMARYVerification assessment of Gram staining according

to SH FORM 44

Gram staining manually made or in a automated way is an inescapable but also critical stage in bacteriology which contributes at the same time to the clinical dia-gnosis and to the therapeutic orientation. It is about a qualitative method in impact A.The aim of this work is to contribute to meet the requirements of the standard ISO 15189 in terms of performances’check, harmonization of the profes-sional practises and evaluation of the skills/know-how by respecting the formalism of SH FORM 44. The risks’analysis is decisive that it makes accor-ding to the 5 M method or by the analysis of the failure modes, their effects and their criticality and has to end in the implementation of coherent means of control adapted to its own practice. On-site, the study of the performances consisted in estimating the contamination between samples (n=12, the stain dish and the carousel of the automated staining system allowing to realize no more than 12 Gram staining simultaneously) and to compare the manual Gram staining versus automated on system PREVI Color de BioMérieux, on 20 samples of controls. The cri-teria of acceptability concerned the staining (positive Gram, negative Gram) and the observed morphology (bacillus or cocci) of 4 reference bacteria known for the Collection of Institut Pasteur.In practice, if the competence of the user stays a crucial point to be mastered, the biologist so completely has to get involved, the recommendations of the standards, the learned societies and the bibliography not being very numerous still and adapted to the microbiology.

Gram staining – Verification assessment – SH FORM 44 – standard ISO 15189 – accreditation – risk management.

1. Introduction

La vérification sur site/validation des méthodes en biologie médicale est une des exigences de la norme NF EN ISO 15189 [1]. En effet, dans le paragraphe 5.5, il est indiqué « Les méthodes et les procédures sélectionnées doivent être évaluées et donner des résultats satisfaisants avant

d’être utilisées pour les analyses médicales. ». De plus (paragraphe 5.3), « Il doit être démontré (lors de l’instal-lation et au cours de l’utilisation courante) que le matériel est capable d’atteindre les performances requises et qu’il est conforme aux spécifications se rapportant aux analyses concernées ».Les méthodes dites reconnues (dispositifs médicaux de diagnostic in vitro marqués CE ou méthodes « fournisseur »), sont a priori validées dans leur domaine d’application

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et le laboratoire doit, pour ses méthodes, vérifier qu’elles sont utilisées dans leur domaine d’application, qu’elles corres-pondent aux besoins de ses clients (patients/prescripteurs) et qu’elles sont maîtrisées au sein du laboratoire (« vérifica-tion de méthodes – portée A »). En revanche, le laboratoire doit caractériser les critères de qualité de la méthode et la valider (« validation de méthode-portée B ») dès lors qu’il ne s’agit pas d’une méthode reconnue ou que celle-ci est employée hors de son domaine d’application (modification de la prise d’essai ou de la matrice/milieu biologique,…).L’objectif est donc de vérifier la mise en application

d’une méthode dans son environnement propre et de démontrer que la méthode fonctionne correctement dans les conditions opératoires du laboratoire et qu’elle donne des résultats sûrs et fiables pour les patients et les cliniciens, beaucoup de facteurs pouvant affecter ses performances (conditions d’expédition et de stockage des réactifs, conditions ambiantes locales, compétence de l’utilisateur notamment pour les méthodes manuelles…).En bactériologie, les conditions ne sont pas forcément simples car il y a beaucoup de méthodes manuelles, les échantillons de contrôles sont parfois absents, les critères de performance ne sont pas forcément aussi bien défi-nis que pour des méthodes automatisées quantitatives : l’analyse des risques devient alors une étape décisive. Le biologiste a un rôle majeur à jouer. La vérification de la coloration de Gram, technique incontournable en bac-tériologie, est présentée dans cet article. C’est une étape essentielle mais aussi un point critique en bactériologie. Qui n’a pas hésité en lisant un Gram d’une hémoculture ? Qui ne s’est pas trompé dans ce diagnostic ?

2. Quelles sont les informations

pertinentes à connaître

au préalable ?

L’étape de vérification/validation sur site doit être précédée d’une étape préparatoire, véritable travail d’expertise réalisé par le biologiste ou un opérateur habilité. La catégorisation de la méthode est indispensable de façon à appliquer la méthode de validation prévue. Dans un premier temps, il faut définir le type de flexi-

bilité de la méthode (SH REF 08, [2]).- Méthodes « fournisseur » (portée flexible standard A),

dites adoptées, avec uniquement une vérification de performances sur site.

- Méthodes adaptées ou développées en interne (portée flexible étendue B), avec une validation de méthode.

Il est préférable d’adopter chaque fois que cela est pos-sible des méthodes en portée A. Cela peut paraître simple, mais dans le cas de méthodes manuelles, cela ne se limite pas à l’utilisation de réactifs marqués CE ; de plus, le mar-quage CE correspond à une conformité des produits aux directives et à une autorisation de mise sur le marché qui ne correspond pas forcément à un gage de qualité [3]. Il convient aussi de vérifier qu’en pratique la méthode respecte scrupuleusement les informations figurant sur la notice du fabricant. Puis dans un second temps, il faut connaître le type de

méthodes (quantitatif ou qualitatif, manuel ou automatisé).

- Les méthodes de type quantitatif fournissent un résultat chiffré. Sont également assimilés au type quantitatif, les examens fournissant un résultat de type qualitatif, extra-polé à partir de la mesure d’un signal continu quantifiable, avec interprétation par rapport à un seuil.

- Les méthodes de type qualitatif fournissent un résultat qui n’apporte pas d’information sur la quantité de l’analyte (cellule ou organisme) mais seulement sur sa présence ou son absence (positif/négatif) ou l’identification de la caractéristique recherchée. On classe dans cette catégorie les examens où aucune mesure d’une donnée quantifiable n’est déterminée en continu et ceux dont le résultat est obtenu par l’observation de la réaction, par comparaison avec des témoins positif et négatif notamment.

La coloration de Gram en mode (c’est la méthode) manuelle ou automatisée sur le système PREVI Color Gram (bio-Mérieux) est une méthode en portée A de type qualitatif. Dans ce cas, la « validation » correspond à une vérification des performances annoncées par le fabricant et souhaitées par le laboratoire en mode manuel ou du couple automate-réactif, lors de la mise en application dans le laboratoire. Il faut aussi donner le principe de la méthode (technique

de coloration) car cela est abordé dans le SH FORM 44 [4] ainsi que le SH INF 50 [5].

3. Vérification sur site

(portée flexible A) : les étapes

La validation des méthodes en portée A est réduite à une vérification sur site pour s’assurer que les performances annoncées et souhaitées sont atteintes dans les condi-tions de travail du laboratoire. Elle comprend une phase initiale, avant sa mise en œuvre effective en routine et une phase de vérification continue et de confirmation des performances, dans le cadre du fonctionnement normal et quotidien du laboratoire.

3.1. Vérification des performances

3.1.1. Détermination des critères de performance pertinents à établir et choix des limites d’acceptabilitéLe choix des critères de performances (spécificité, sen-sibilité…) et limites d’acceptabilité (seuils) pour une méthode donnée doit se faire PRÉALABLEMENT à l’étude expérimentale. Il doit refléter l’état de l’art et la pertinence clinique sans oublier le bon sens et l’expé-rience. Il peut s’appuyer sur des recommandations de sociétés savantes, de groupes de travail, de confé-rences de consensus, de publications scientifiques, sur des valeurs limites utilisées pour la gestion du contrôle interne de qualité (CIQ), sur des résultats de campagnes de comparaisons inter laboratoire,… et sera confronté aux données du fournisseur.Des recommandations sur le choix des critères de per-formance sont établies dans le SH GT 04 [6] et figurent dans le tableau I. En bactériologie cependant, il convient de bien réfléchir au protocole expérimental pour vérifier ces critères de performance. Les critères d’acceptabilité devront être choisis sans jamais perdre de vue l’impact clinique du résultat.



(retard pour le rendu des résultats, mauvais choix de l’anti-biothérapie probabiliste).

3.1.2. Étude des risquesL’étude des risques devant aboutir à identifier les risques pour les maîtriser est une étape décisive notamment pour les méthodes manuelles et qualitatives, particulièrement en bactériologie.L’étude de risques peut se faire selon différentes approches. La méthode 5 M (ou diagramme de cause à effet ou dia-

gramme d’Ishikawa) est une méthode permettant d’analyser des situations en se basant sur 5 critères. Elle facilite ainsi l’identification des dangers associés à l’analyse sans rien oublier. Les causes produisant un effet sont classées en 5 familles nommées les 5 M (figure 1).- Matières : en pratique, il s’agit de l’échantillon primaire

(urine, sang, liquides de ponction…), des récipients utilisés (tubes, pot à ECBU…), des additifs (acide borique….), des cultures, des réactifs, des contrôles de qualité.

D’après ces recommandations, on voit que la vérifica-

tion bibliographique critique prend toute son importance. Le dossier de validation/vérification peut renvoyer à d’autres documents (bibliographie, notices fournisseurs, documents internes au laboratoire, etc.), correctement référencés et accessibles. Inversement, la vérification expérimentale sur site en

portée A est plus réduite et s’appuie fortement sur l’étude des performances mais aussi sur des études de risques ou encore sur la compétence et la qualification des opérateurs. Parmi les critères de performance, il est recommandé de vérifier sur site, la contamination entre échantillons (s’il y a lieu) et la comparaison avec une méthode déjà utilisée au laboratoire si possible (avec des échantillons de contrôle ou des échantillons de sérothèque ou d’un autre utilisateur de la même technique). La réalisation des vérifications expérimentales doit se faire selon un protocole établi par le laboratoire avec des critères d’acceptabilité définis et pourra s’appuyer sur la Fiche Type QUALITATIF (Portée A, SH FORM 44, [4]). Elle doit aboutir à une conclusion et une décision quant à la validation opérationnelle de la technique, au regard des spécifications initialement fixées. En pratique, une fois le protocole établi, il convient de préparer les conditions nécessaires à la réalisation de la méthode : période de validation et opérateur à définir, para-métrage de la méthode si besoin, acquisition des réactifs nécessaires, réalisation d’une sérothèque ou acquisition des contrôles pour la comparaison…Pour la coloration de Gram, il nous a paru important de vérifier la contamination entre échantillons car en géné-ral plusieurs spécimens sont colorés en même temps et d’effectuer une comparaison entre les deux méthodes utilisées en routine au laboratoire, coloration manuelle et automatisée.Une contamination inter échantillons peut aboutir à un dia-gnostic erroné et à une mauvaise orientation thérapeutique. Les critères d’acceptabilité ont porté sur la coloration

des bactéries (Gram positif ou négatif) et la morphologie observée (bacille ou cocci) sur des souches de référence de coloration et morphologie connues. En effet, la nature du Gram et la morphologie observée ont à la fois des impacts techniques (choix des milieux à ensemencer, choix des méthodes d’identification utilisées, choix de l’antibiogramme à réaliser) et des conséquences cliniques

Tableau I – Recommandations sur la vérification/validation

d’une méthode d’analyse qualitative selon le SH GTA 04.

Paramètres à vérifier

et/ou à connaîtreBibliographie

Vérification sur site

Portée de type A

Validation

Portée de type B

Spécificité analytique Oui Non Oui

Sensibilité diagnostique Oui Non Oui

Contamination entre échantillons (s’il y a lieu) Oui Oui Oui

Stabilité des réactifs (après ouverture, embarqués) Oui Non Oui

Robustesse Oui Non Oui

Comparaison avec méthode de référence Oui Non Oui (si existe)

Comparaison avec méthode déjà utilisée au laboratoire Oui (si existe) Oui (si possible) Oui

Le dossier doit conclure sur l’avis d’aptitude de la méthode ou du système analytique (en cas de dépassement des spécifications choisies a priori par le laboratoire, celui-ci justifie l’acceptation des écarts pour pouvoir conclure à l’aptitude de la méthode et l’enregistre).

Figure 1 – Étude des risques selon la méthode 5 M

(ou diagramme de cause à effet ou diagramme d’Ishikawa).


évaluer leur criticité en réalisant une AMDEC. L’objectif est de maîtriser tous les risques (via les procédures et modes opératoires sur les phases analytiques mais aussi pré- et post-analytiques, la maîtrise métrologique, la formation et l’habilitation du personnel…) et éventuellement de mettre en place des indicateurs sur les risques de criticité élevée. En bactériologie, la stratégie de mise en place des CIQ peut se baser sur cette approche.Pour la coloration de Gram, la gravité est importante (3) car une mauvaise coloration peut avoir une incidence à la fois sur le diagnostic, le traitement ou l’épidémiologie. La fréquence a été estimée à 2 avec la technique auto-matisée et à 3 avec la technique manuelle avec un risque notamment à l’étape de décoloration. La détectabilité a été fixée à 2 avec les deux méthodes. L’indice de gravité est donc de 18 pour la coloration de Gram manuelle et de 12 pour la technique automatisée. Dans les deux cas, cet indice est élevé. Il a influencé notre stratégie de mise en place des CIQ (quotidien pour l’automate et à chaque coloration manuelle) afin de maîtriser à la fois les réactifs et le processus, et de détecter rapidement une anomalie. Il a également renforcé l’importance d’assurer un maintien continu des compétences en faisant participer le maximum de personnels aux programmes d’évaluations externes de la qualité. Une étude de risques de la coloration de Gram est présentée dans le tableau II.

3.2 Confirmation des performances en pratique quotidiennePour maîtriser une technique, l’utilisation, la gestion et le suivi de contrôles internes de qualité et d’évaluations externes de qualité (EEQ) sont indispensables. Le labora-toire pourra s’appuyer sur le Guide technique abordant la gestion des contrôles qualité (SH GTA 06, [8]).Il importe donc de mettre en place des CIQ dont la nature, la fréquence de passage, les critères d’acceptabilité et la conduite à tenir en cas d’anomalie doivent être définis. Ils doivent permettre de repérer rapidement toute anomalie et de mettre en place des actions correctives immédiates.Par ailleurs, il convient de s’abonner à des programmes d’évaluation externe. Différents sont disponibles avec une fréquence de passage de 3 à 4 fois dans l’année le plus souvent, dédiés à la coloration de Gram (Gram Bacterial staining direct chez Labquality) ou faisant appel à coloration de Gram dans le cadre d’une identification bactérienne (Centre toulousain pour le contrôle de qualité en biologie clinique, Association de biologie praticienne, Biologie prospective, Bactérionet…). Ils permettent le suivi de la méthode mais aussi des utilisateurs et le maintien des compétences.

4. Le dossier de validation/

vérification selon le SH FORM 44

La constitution du dossier de validation est une étape décisive.

4.1. Description de la méthodePour un analyte ou un mesurande, elle doit définir le prin-cipe de la mesure et la méthode de mesure, préciser si

- Milieu : c’est le lieu de travail et notamment son amé-nagement et son organisation, environnement physique, éclairage, bruit, conditions ambiantes requises pour réa-liser une manipulation (ex : température, hygrométrie,…).

- Méthodes : ce sont les instructions, manuels, procédures, modes opératoires, flux d’informations…

- Main-d’œuvre : les ressources humaines, les qualifications du personnel, la formation, l’aptitude sont des données essentielles. Pour mener à bien une analyse, il convient d’avoir du personnel qualifié, formé, évalué et habilité. C’est d’ailleurs l’objet de tout un chapitre (paragraphe 5.1) du SH REF 02 [7].

- Matériel : il est constitué des machines, équipements, automates, et de leur maintenance…

Le choix, les règles d’utilisation, les contrôles, la main-tenance, les exigences métrologiques et notamment les paramètres critiques, les exigences informatiques spé-cifiques s’il y a lieu doivent être définis. En pratique, une procédure d’utilisation, de contrôle et de maintenance du matériel doit être rédigée et prise en compte par le technicien du poste. Une autre approche de l’analyse des risques est

l’AMDEC (analyse des modes de défaillance, de leurs effets et de leur criticité). Elle consiste à évaluer la criti-cité (pertinence et gravité) des risques. C’est un outil de sûreté de fonctionnement et de gestion de la qualité. La réalisation d’une AMDEC s’intègre avant dans l’analyse globale du système. En effet, celle-ci permet d’identifier les fonctions, les contraintes d’utilisation et d’environne-ment, les paramètres critiques à mettre sous contrôle et de définir ainsi le périmètre sur lequel l’AMDEC doit être réalisée. On identifie ensuite de manière systématique les modes de défaillance possibles liés à l’analyse. On peut se baser sur l’expérience acquise ou sur des référentiels. Pour chaque mode de défaillance, on déterminera :- sa (ses) cause(s) ;- sa fréquence (F), cotée de la façon suivante : 1 pour une

fréquence de 0 à 1 fois par an, 2 pour une fréquence de 2 à 3 fois par an et 3 pour une fréquence supérieure à 3 fois par an ;

- ses effets ;- son impact et sa sévérité (indice de gravité G) sur le pro-

cessus analytique et ses incidences sur le diagnostic, le traitement ou l’épidémiologie : 1 pour aucune incidence, 2 pour une incidence probable et 3 pour une incidence certaine ;

- les mesures mises en place pour détecter la défaillance ;- la probabilité de détecter l’anomalie au cours du proces-

sus analytique incluant la phase pré et post-analytique (indice de détection D) : 1 pour une anomalie détectable au cours du processus analytique, 2 pour une anomalie dont la détection peut être possible et 3 pour une ano-malie non détectable au cours du processus analytique.

Le produit des différents paramètres, indice de fréquence, indice de gravité et indice de détection, donne l’indice de criticité (IC) : IC = F X G X D. La priorité sera alors de maîtriser les effets qui ont le plus haut niveau de criticité. À chaque laboratoire d’établir ce seuil en fonction de sa spécificité biologique et clinique. Les deux approches peuvent être complémentaires :

identifier les risques selon la méthode des 5 M puis



Tableau II – Étude des risques de la coloration de Gram selon la méthode 5 M.

Risques Points critiques à maîtriser Modalités de maîtrise

Matières

Allongement des délais de rendu des résultats, augmentation du risque patient : échantillons primaires non conformes (modalités de prélèvement, récipients, additifs, délais de transport…)

Conditions de prélèvement et d’acheminement des prélèvements bactériologiques (sang, LCR prélèvements pulmonaires, urines, selles…)

Guide des examens de biologie médicale Transport et réception des examens de biologie

Rendu de résultats erronés : altération des milieux de culture, mauvais isolement des souches pathogènes

Contamination des milieux de culture lors de l’ensemencement à J0 Conservation des géloses

Respect de la documentation interne Conditions de conservations conformes aux recommandations fournisseur Test de fertilité (par des souches de contrôle) Métrologie des enceintes de stockage des réactifs et surveillance des températures

Absence de réactifs ou réactifs périmés Réactifs altérés Rendu de résultats erronés Allongement des délais de rendu des résultats, augmentation du risque patient : mauvaise orientation pour l’identification et l’antibiogramme

Gestion des commandes Condition de conservation des réactifs (température, humidité)

Procédure de gestion des commandes Vérification à réception et de la date de péremption à l’installation Certificats de conformité Métrologie des conditions ambiantes et système de surveillance des températures

Méthode

Rendu de résultats erronés : ensemencement non-conforme

Choix des milieux de culture Qualité de l’ensemencement

Connaissance et respect de la documentation interne (utilisation et maintenance du colorateur de Gram, coloration de Gram manuelle, procédure de gestion des CIQ) Fiches techniques du fournisseur (bioMérieux) disponibles au poste Compétence du personnel Résultats des contrôles de qualité internes Audits de la paillasse de bactériologie

Coloration non homogène, difficile à lire : difficulté d’interprétation, allongement des délais de rendu des résultats, augmentation du risque patient

Pré-étalement des lames

Difficulté d’interprétation : lecture du Gram difficile Allongement des délais de rendu des résultats, augmentation du risque patient Rendu de résultats non-valides

Technique de coloration

Main-

d’œuvre

Rendu de résultats erronés : mauvais pre-étalement des lames, technique de coloration incorrecte, méconnaissance du fonctionnement et de la maintenance du colorateur, mauvaise lecture du Gram, mauvaise gestion des CIQ

Compétence du personnel Fiche de poste Formation interne et externe Connaissances et respect des MO et procédures Évaluation et habilitation Résultats des contrôles de qualité internes et externes Audits de la paillasse de bactériologie

Milieu

Non respect des conditions ambiantes requises

T° de fonctionnement et humidité, éclairage

Climatisation de la pièce Surveillance des conditions environnementales (température, hygrométrie) Organisation des locaux

Rendu de résultats erronés : mauvais isolement des souches pathogènes Non respect des conditions de santé et de sécurité du personnel du laboratoire

Contamination des milieux de culture lors de l’ensemencement à J0 Protection de l‘opérateur

Travail sous PSM Maintenance annuelle du PSM Bionettoyage des paillasses et contrôle de surface Application des précautions standards Audit des bonnes pratiques professionnelles

Matériel

Rendu de résultats erronés : technique de coloration incorrecte Difficulté d’interprétation : lecture du Gram difficile Rendu de résultats erronés : mauvais isolement des souches pathogènes

Maintenance Exigences métrologiques : rotation du carrousel Intégrité du matériel de lecture : microscope Contamination des milieux ensemencés par le matériel d’ensemencement (oëse, pipette)

Procédure de maintenance connue du technicien Vérification métrologique de la rotation du carrousel Entretien et suivi métrologique de l’oculaire Résultats des contrôles de qualité (souche ATCC, CQN, CIL) Essai à blanc


les réactifs sont marqués CE ou pas, ce qui influence la nature de la portée flexible (obligatoirement B s’ils ne sont pas marqués CE) et donner le codage du contrôle national de qualité, s’il y a lieu.

4.1.1. Application à la coloration de Gram manuelle [9]

4.1.1.1. Principe

La coloration de Gram est basée sur l’affinité tinctoriale différente des bactéries à certains colorants due à la consti-tution de leur paroi. Cette coloration permet aussi d’observer la morphologie des bactéries (formes allongées pour les bacilles et arrondies pour les cocci).Le principe de la technique est le suivant : le cristal violet oxalaté colore la paroi de toutes les bactéries en violet, le lugol est un mordant qui fixe le violet, l’alcool acétone décolore les bactéries qui ont une membrane perméable à l’alcool, la fuschine colore en rose les bactéries déco-lorées par l’alcool, ainsi, les bactéries Gram négatif sont colorées en rose et les bactéries Gram positif en violet.

4.1.1.2. Méthode de mesure

Les lames préétalées sont colorées manuellement à l’aide de réactifs prêts à l’emploi.

4.1.2. Application à la coloration de Gram automatisée sur le système PREVI Color Gram [10]

4.1.2.1. Principe

Les lames préétalées sont disposées dans un carrousel et sont soumises à une rotation. Chaque réactif est associé à une buse de vaporisation qui permet de délivrer la quan-tité adéquate (gestion de la consommation de colorant). Les réactifs sont alors pulvérisés séquentiellement sur les lames : coloration au cristal violet (buse C), lavage des lames à l’eau distillée (buse D), coloration à l’iode (buse B), lavage des lames à l’eau distillée (buse D), décolora-tion et contre coloration simultanées des lames (buse A) à la safranine/méthanol, séchage des lames par rotation.

4.1.2.2. Méthode de mesure

Automatisation de la coloration de Gram via une pul-vérisation en spray des colorants sur des lames pré-étalées permettant d’obtenir des résultats rapides et standardisés.

4.2. Mise en œuvreLa mise en œuvre de la vérification impose l’existence au préalable d’une procédure générale de vérification/valida-tion de méthode précisant la démarche du laboratoire et les données expérimentales établies sur site dans le cas d’une portée de type A et/ou de type B ainsi que d’une procédure de gestion de la portée flexible listant l’ensemble des opérations à réaliser pour maîtriser le processus lors d’un changement de méthode ou de réactif ne faisant pas intervenir de compétence nouvelle. Les références de ces deux procédures seront précisées.Le ou les opérateurs qui mettront en œuvre la vérification doivent être habilités et nommément désignés.La période d’évaluation doit être fixée. Elle implique la dis-ponibilité de l’opérateur souvent un technicien mais aussi

de la personne qui va exploiter les résultats, en général un biologiste. En effet, il importe d’analyser les résultats au fur et à mesure car il est plus simple d’effectuer en temps réel l’étude des discordances, d’analyser leur cause et de revoir si besoin le protocole, les critères d’acceptabilité voire la méthode.À l’issue, la vérification doit aboutir à une autorisation d’utilisation de la méthode dont la date sera renseignée ainsi que le nom de la personne qui a autorisé la mise en service, un biologiste en général.

4.3. Maîtrise des risques Concernant le type d’échantillon, il peut s’agir d’échantil-

lon primaire c’est-à-dire de prélèvements bactériologiques (sang, LCR, prélèvements pulmonaires, urines, selles…) ou de cultures. Il importe alors que la phase préanaly-tique soit maîtrisée avec l’existence d’une procédure sur les conditions de prélèvement, d’acheminement préci-sant notamment les délais de transport et de réception. Les références de ces procédures seront précisées. Pour le prétraitement de l’échantillon, le point critique

à maîtriser est le préétalement des lames que la coloration de Gram se fasse manuellement ou à l’aide du colorateur car il conditionne à la fois la coloration et la lisibilité de la lecture. Ce point pourra être intégré dans les modes opératoires correspondants sur la coloration de Gram manuelle et sur l’utilisation du colorateur. Main-d’œuvre

La compétence de l’utilisateur est un point crucial à maîtriser surtout pour les méthodes manuelles et particulièrement pour la coloration de Gram. L’étape de décoloration est particulièrement décisive. Qui n’a pas un jour trop déco-loré un Gram par manque d’expérience ou car certaines bactéries se décolorent plus facilement que d’autres ?Il importe en premier lieu que la méthode à maîtriser soit intégrée dans les fiches de poste des personnes concer-nées, que les modes opératoires de la technique ou de l’utilisation de l’appareil soient écrits et connus de tous, la prise en compte des documents devant être tracée.Le personnel doit aussi être formé, évalué puis habilité. L’habilitation est le fer de lance de l’accréditation. En effet, c’est par cette démarche que le laboratoire reconnaît l’apti-tude d’un individu à assurer une fonction, à tenir un poste ou effectuer des tâches suite à une évaluation : c’est une reconnaissance de la compétence. Une procédure et des grilles d’habilitation doivent exister et être référencées dans le système documentaire et dans le dossier de chaque per-sonnel. Cette compétence doit être réévaluée périodique-ment et maintenue en continu. La participation à des essais interlaboratoires y contribue. La réalisation de contrôles de qualité avec des critères d’acceptabilité et la conduite à tenir en cas d’anomalie ainsi que la maintenance préventive des appareils contribuent aussi à maîtriser les risques. Les conditions ambiantes requises (ex : température,

hygrométrie,…) Elles sont précisées dans les fiches techniques des fabri-cants des réactifs et de l’automate. Il s’agit le plus sou-vent de maîtriser la température ambiante de la pièce. Cela impose de disposer d’une climatisation de la pièce, d’une sonde de relevés des températures et d’un système de surveillance attestant que la technique a été mise en



œuvre dans les conditions de température requise. L’idéal est de disposer d’un système centralisé d’enregistrement des températures pour suivre en continu la température de la pièce ou de mettre en place un document d’enre-gistrement où est tracée au minimum quotidiennement la vérification de la température de la sonde. Pour la colora-tion de Gram, la température requise est comprise entre 15 à 30 °C pour le colorateur et entre 15 et 25 °C pour la technique manuelle.Des contraintes sur l’hygrométrie peuvent être aussi pré-cisées et nécessiteraient l’utilisation d’un hygromètre. En fonction du taux d’humidité maximum annoncé par le fabricant (pour le colorateur de Gram, taux d’humidité maximum fixé à 80 %), de l’organisation des locaux, de l’existence d’une climatisation qui génère à la fois une stabilité thermique et hygrométrique, cette mesure s’avère cependant plus ou moins indispensable. Pour le colorateur de Gram par exemple, le taux d’humidité maximum est fixé à 80 %. Notre pièce technique étant située en zone tempérée, correctement ventilée, climatisée, sans trace d’humidité, ni écoulement, nous avons estimé que le taux maximum ne risquait pas d’être atteint. C’est typiquement ce type d’analyse qui doit être effectué dans l’AMDEC. Référence du réactif (référence fournisseur, version)

Il convient de disposer des réactifs adéquats, en quantité suffisante, non détériorés lors du transport, non périmés à l’installation ainsi que des certificats de conformité et fiches techniques correspondants. La maîtrise de ces points cri-tiques passe par une procédure de gestion des commandes, par une vérification de l’état des réactifs et de leur date de péremption à réception et au moment de l’installation. Les certificats de conformité et fiches techniques sont en général disponibles sur les sites internet des fabricants. Ils peuvent être imprimés et présents au poste dans un clas-seur ou gérés de manière informatique, rattachés au réactif dans le logiciel de commande par exemple. Une procédure de gestion des versions doit être mise en place. Matériau de référence

Il s’agit de souches de référence connues qui peuvent provenir de l’American type culture collection (ATCC), de la Collection de l’Institut Pasteur (CIP) ou éventuellement d’autres souches caractérisées dont le phénotype est connu (« souchothèque »). Ces souches permettent de réaliser l’éva-luation des performances et sont aussi utilisées comme CIQ.Dans notre cas, l’évaluation des performances et notam-ment le contrôle de qualité des réactifs et de la méthode de coloration est réalisée à partir de souches de référence aux caractéristiques morphologiques bien connues (tableau III) provenant du CRBIP (Centre de ressources biologiques de l’Institut Pasteur, certifié ISO 9001 pour l’acquisition, la produc-tion, la conservation et distribution de matériels biologiques).

Les certificats et les caractéristiques de chaque souche (fiche catalogue), imprimées à partir du site ([email protected]) sont conservés dans le dossier de validation. Le choix de ces souches a tenu compte d’une part des espèces les plus fréquemment rencontrées dans notre pratique courante (E. coli et S. aureus) et de l’affinité tinctoriale variable de certaines bactéries à la coloration de Gram en intégrant une souche dite « Gram faible » ou « Gram variable » (C. striatum).Nous avons estimé qu’il était important de décrire la pré-paration des lames de contrôle qui figure en annexe du dossier de validation.- Mise en culture des souches bactériennes lyophilisées

Dès réception, les souches lyophilisées sont conservées à 4 °C et à l’abri de la lumière. Elles sont fournies dans des ampoules sous vide et utilisées selon la procédure suivante : sous PSM, désinfecter l’extérieur de l’ampoule avec un coton imbibé d’alcool puis casser l’ampoule, réhydrater le lyophilisat avec 200 μL de bouillon cœur cervelle prélevé à l’aide d’une pipette à embout stérile, ensemencer la suspension obtenue sur milieu gélosé approprié en respectant les conditions de culture men-tionnées dans le tableau III.

- Réalisation des lames de contrôlePour chaque souche de référence, le même technicien res-ponsable de la vérification préparera 15 lames de contrôle : mettre 3 mL de solution saline dans un tube à hémolyse stérile, prélever une ou plusieurs colonies à l’aide d’une anse stérile, la plonger dans la solution saline et la tourner plusieurs fois afin d’obtenir une suspension bactérienne homogène, à l’aide d’un densitomètre ajuster à 0,5 McF (+/- 10 %) avec de la solution saline, déposer 20 μL de suspension bactérienne au centre des 15 lames et étaler de manière circulaire de façon à réaliser un frottis mince. Équipements

L’équipement doit être conforme aux exigences de perfor-mances spécifiées par le fabricant initialement et de manière continue et être en bon état de fonctionnement, afin de garantir la qualité des analyses et des services rendus, ainsi que la sécurité du personnel qui l’utilise. L’équipement doit être maîtrisé et inventorié avec un dossier du matériel à jour, géré en général par le référent matériel du laboratoire. Des procédures doivent décrire les maintenances préventives et des enregistrements doivent apporter la preuve de leur réalisation. La continuité du service doit être garantie en cas de pannes avec une gestion de l’activité analytique en mode dégradé. En pratique, en cas de panne du colo-rateur de Gram, une coloration manuelle sera effectuée.Il importe aussi de vérifier si l’équipement a des exigences métrologiques particulières. L’organisation de la métrologie dans le laboratoire ne doit pas se limiter à la métrologie

Tableau III – Caractéristiques des matériaux de contrôle utilisés

pour l’évaluation des performances de la coloration de Gram.

Nom de l’espèce Code CIP Morphologie Milieu Conditions d’incubation Durée

Escherichia coli 7624 Bacille Gram négatif TSA Aérobie, 30 °C 24 heures

Corynebacterium striatum 8115 Bacille Gram positif TSA Aérobie, 37 °C 24 heures

Staphylococcus aureus 7625 Cocci Gram positif TSA Aérobie, 37 °C 24 heures

Neisseria gonorrhoeae 7918 Cocci Gram négatif Chocolat Polyvitex 5 % CO2, 37 °C 24 heures


Tableau IV – Étude de la contamination inter-échantillons de la coloration de Gram manuelle.

Date : Opérateur :

Contrôle Critères d’acceptabilité Résultat

Lame d’E. coli 1 Bacille Gram négatif Conforme Non conforme

Lame négative 1 Absence de micro-organisme Conforme Non conforme

Lame de S. aureus 1 Cocci Gram positif Conforme Non conforme










Conclusion : Absence de contamination inter-échantillons Visa du biologiste :

Conforme

Non conforme

des instruments de mesure (thermomètres, pipettes de mesures, balances) mais doit aussi intégrer la vérification des équipements connexes aux automates (centrifugeuses, enceintes thermiques, chronomètres…). En pratique, c’est le responsable métrologie qui doit réaliser ou faire réaliser les raccordements métrologiques nécessaires, assurer la traçabilité de l’enregistrement des étalonnages ou véri-fications ainsi que le statut de l’instrument de mesures identifié. L’ensemble des mesures et documents peut être regroupé dans le dossier du matériel. Pour le colorateur de Gram, le point critique à maîtriser et à vérifier est la rotation du carrousel.Enfin, il ne faut pas oublier dans la partie équipement, les exi-gences informatiques spécifiques. Des précautions doivent être prises pour protéger l’intégrité et la confidentialité des données de patients sous format électronique. L’accès aux programmes doit être limité pour éviter l’altération ou la destruction de données par des personnes non autorisées. Chaque utilisateur doit pouvoir se connecter avec son propre login et un mot de passe ayant un niveau de sécurité adapté et en fonction de l’utilisateur et de son habilitation, différents niveaux d’accès peuvent être mis en place.

4.4. Évaluation des performances

4.4.1. ContaminationLes phénomènes de contamination peuvent affecter les échantillons à analyser (contamination inter-échantillons) lorsque plusieurs sont analysés simultanément ou les réactifs (contamination inter-réactifs). Contamination inter-échantillons

- Protocole expérimentalLe principe est le même que la coloration se fasse en méthode mode manuel ou automatisé.L’absence de contamination croisée de la coloration de

Gram sera évaluée par le même technicien dans une même série de coloration de 12 lames de contrôle :- 4 lames de contrôle positives (P1) d’E. coli,- 4 lames de contrôle positives (P2) de S. aureus,- 4 lames de contrôle négatives (N1) réalisées en dépo-

sant au centre d’une lame 20 μL d’eau stérile ouverte extemporanément.

En pratique, le bac de coloration (ne permettant pas de réaliser plus de 12 colorations de Gram manuelle simul-tanée) sera chargé de manière à alterner les échantillons positifs et négatifs selon la séquence suivante : P1N1P2 P1N1P2 P1N1P2 P1N1P2. Pour la technique automati-sée, le carrousel sera chargé selon la même séquence.Par rapport aux recommandations du SH GTA04 nous n‘avons pu faire 30 mesures en raison de la taille du bac de coloration et nous avons préféré privilégier l’alternance des séquences plutôt que d’analyser 3 fois consécutive-ment le même échantillon. Par ailleurs, nous avons choisi deux contrôles positifs différents pour évaluer l’impact d’une bactérie à Gram positif et d’une à Gram négatif d’où le choix de la séquence P1N1P2 P1N1P2 P1N1P2 P1N1P2 plutôt que P1P1P1 N1N1N1 P2P2P2 N1N1N1.

- Critères d’acceptabilité et résultatsLa lecture des lames se fait au microscope à l’immer-sion (x1000).Les lames de contrôle d’E. coli doivent fournir une colo-ration et une morphologie de bacille Gram négatif (visua-lisation de bacilles roses à rouges).Les lames de contrôle de S. aureus doivent fournir une coloration et une morphologie de cocci Gram positif (visualisation de cocci en amas violets).Les lames de contrôle réalisées avec de l’eau stérile ne doivent fournir aucune coloration.Les résultats de chaque lecture doivent être notés, sous forme de tableau par exemple (tableau IV).



Contamination inter réactifs

Il n’apparaît pas pertinent d’étudier spécifiquement la contamination inter réactifs.Le phénomène de contamination inter réactifs peut se produire sur un analyseur lorsque le système de distri-bution est commun à tous les réactifs. Avec le système PREVI Color Gram, chaque réactif est associé à une buse de vaporisation indépendante.Par ailleurs, une contamination éventuelle se traduirait :par une mauvaise coloration vérifiée tout au long de la validation et confirmée par la concordance des résultats ;par la présence de micro-organismes vérifiée lors de l’étude de contamination inter échantillons sur les lames de contrôle négatives.

4.4.2. Comparaison de méthodesPour comparer les résultats d’une méthode Y (à tester) avec ceux d’une méthode X (utilisée au laboratoire ou prise comme référence), on analyse des échantillons représentatifs de la population de patients rencontrée en pratique courante. Pour le Gram, il faut donc des bactéries à coloration Gram positif et Gram négatif, de morphologie variée, cocci et bacilles.Ces échantillons, frais de préférence, sont ana-lysés en simple par les 2 techniques, dans un délai le plus court possible. Les résultats sont examinés au fur et à mesure et une étude de concordance, à savoir résultat identique selon les critères d’acceptabilité quelle que que soit la technique utilisée, est réalisée pour exploi-ter les résultats. L’analyse des discordances (écart entre les deux méthodes), interprétation et justification, doit se faire en continu et le % de discordance entre les deux techniques, à ne pas dépasser, doit aussi être fixé. Protocole expérimental

Les performances de la coloration sur le sys-tème automatisé PREVI Color Gram seront comparées aux performances de la colora-tion de Gram manuelle. La corrélation entre les 2 techniques est évaluée sur une journée, en passant en parallèle par le même techni-cien, 20 lames de contrôle sur le système PREVI Color Gram et 20 lames en colora-tion manuelle : 5 lames de chacune de ces 4 espèces, E. coli, C. striatum, S. aureus, N. gonorrhoeae.Afin de disposer d’un échantillonnage varié et représentatif, de travailler sur des échantillons frais et que les échantillons soient le plus pos-sible similaires entre les deux méthodes (avec l’impact le plus faible possible du pré étalement des lames), nous avons décidé de travailler sur des lames de contrôles et non sur des prélève-ments de patients. Les 20 lames pour chacune des techniques ont été passées en 3 séries dif-férentes (7, 7 et 6), ce qui est le plus proche du nombre de colorations lancées simultanément en pratique courante et du nombre de séries pratiquées quotidiennement.

Critères d’acceptabilité et résultats

La lecture des lames se fait au microscope à l’immersion (x1000) : bacilles roses à rouges pour E. coli, bacille en massue violets (figure 2) pour C. striatum, cocci en amas violets pour S. aureus, cocci roses à rouges (figure 2) pour N. gonorrhoeae.Les résultats de chaque lecture doivent être notés, sous forme de tableau par exemple (tableau V).À l’issue, l’évaluation des critères des performances doit aboutir à une décision de conformité ou non de la méthode évaluée.

5. Conclusion

Plus qu’une exigence de la norme NF EN ISO 15189, l’objectif de la vérification sur site/validation des méthodes en biologie médicale est une garantie d’obtenir des résul-tats sûrs et fiables pour les patients et les cliniciens dans

Figure 2 – Coloration de Gram de différentes bactéries

Neisseria gonorrhoeae (a) et Corynebacterium striatum (b).


Références[1] Document Afnor, NF EN ISO 15189. Laboratoires d’analyses de biologie médicale – Exigences particulières concernant la qualité et la compétence. Décembre 2012.[2] Document Cofrac, SH REF 08. Expression et évaluation des portées d’accréditation. Révision 01 - mars 2012.[3] P. Frybourg. Certification et management de la qualité : un atout stra-tégique. Edition Arnaud Franel, Mars 2006.[4] Document Cofrac, SH FORM 44. Fiche type qualitatif, Vérification (portée A)/ validation (portée B) d’une méthode de biologie médicale. Révision 00 - Avril 2011.[5] Document Cofrac, Portées-types d’accréditation : SH INF 50. Révision 01 - Janvier 2014.

[6] Document Cofrac, SH GTA 04. Guide technique d’accréditation de vérification (portée A)/ validation (portée B) des méthodes en biologie médicale. Révision 00 - Avril 2011.[7] Document Cofrac, SH REF 02. Recueil des exigences spécifiques pour l’accréditation des laboratoires de biologie médicale. Révision 04 - Octobre 2013.[8] Document Cofrac, SH GTA 06. Guide technique d’accréditation : contrôle de qualité en biologie médicale. Révision 00 - Juin 2012.[9] Denis F, Ploy MC, Martin C, Bingen E, Quentin R. Bactériologie médicale, techniques usuelles. Éditions Elsevier/Masson, novembre 2007.[10] BioMérieux. Manuel d’utilisation du Previ Color Gram. Mars 2009.

l’environnement propre du laboratoire et à ce titre, le bio-logiste doit se sentir particulièrement impliqué.Si l’étude des critères de performance est incontournable, l’analyse des risques doit permettre de mettre en place des moyens cohérents de maîtrise adaptés à sa propre pratique. Cette étape est particulièrement importante pour les méthodes manuelles fréquentes en microbiologie où interviennent de nombreux facteurs de variabilité. Ce n’est pas non plus la plus facile à réaliser et les recom-

mandations des fournisseurs, des normes, des sociétés savantes et la bibliographie ne sont pas toujours adaptées à la microbiologie et aux attentes des biologistes. Dans ce contexte, il importe à chacun de réfléchir mais aussi de partager le fruit de ses réflexions dans une marche en avant collective.

Déclaration d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de

conflits d’intérêts en relation avec cet article.

Tableau V – Comparaison de méthodes : coloration de Gram automatisée

sur le système PREVI Color Gram (bioMérieux) versus coloration manuelle.

Date : Opérateur :

MéthodeE. coli

Bacille Gram négatif

C. striatumBacille Gram positif

S. aureusCocci Gram positif

N. gonorrhoeaeCocci Gram négatif

Coloration

automatisée

Lame 1 Conforme Non conforme




















Coloration

manuelle





















Conclusion : Absence de contamination inter-échantillons Visa du biologiste :

Conforme

Non conforme

Documents

Vérification des performances d’une méthode selon le SH FORM 44 : application à la coloration de Gram