FGSM2 – Formation Générale aux Soins Médicaux de niveau 2 MED 302 – Bases moléculaires et cellulaires des pathologiesDr V. Dalstein– 20/10/2020 Ugo NOEL/Simon BOYOT Correcteur : Jacob Ayoubi

APV6 : Cellules souches et différenciation

Définitions et propriétéLe concept des cellules souches touche à des questions fondamentales du vivant, il doit répondre à ces questions :

Comment, à partir d’une seule cellule œuf primitive, peut-on former des tissus et un organisme complet avec des milliards de cellules et plus de 300 types de cellulaires différents ?

Comment les tissus se renouvellent-ils ?

Définition fonctionnelle (Selon leur propriétés)

Potentiel de prolifération illimité et capacité d’auto-renouvellement Potentiel de différenciation en 1 ou plus types cellulaires spécialisées en réponse

à des stimuli appropriés. Ce ne sont propriétés potentielles : les cellules souches ne se divisent pas

continuellement même si elles en ont le potentiel. Quand elles se différencient elles perdent leur propriété de cellule souche. C’est leur capacité de différenciation qui en fait des cellules souches

Différentiation des cellules souches

Le zygote (œuf fécondé) devient au gré des divisions primitives un blastocyste : on y trouve des cellules souches embryonnaires.

Tout le tissu qui forme l’embryon jusqu’au stade blastocyste est constitué de cellules souches embryonnaires.

Dès qu’on dépasse ce stade les cellules souches sont appelées cellules souches adultes (CSA). Le mot adulte est résumé : on est juste plus dans l’embryon.

A partir du stade fœtus : cellules souches adultes. Dans l’organisme de l’enfant, on a aussi des CSA : c’est un abus de langage.

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Types de cellules souches

Cellules souches embryonnaires ES (embryonic stem) : prolifèrent et génèrent les tissus

Cellules souches des tissus adultes : Somatique (tous les tissus) ou Germinal (spermatozoïdes et ovocytes). Les somatiques contribuent à l’homéostasie tissulaire (maintenir un pool de cellules constant) en participant au renouvellement physiologique et éventuellement à la régénération tissulaire en cas de lésion (évidemment chez un enfant en croissance elles contribuent à la croissance des tissus)

Potentiel de diffferen-ciation

Les cellules souches sont présentes à tous les stades du développement embryonnaire, chez le fœtus et chez l’individu adulte.

Possibilité de se différencier en …

Exemple Potentiel dedifférenciatio

n

TotipotentesToutes les cellules de l’embryon + annexes (placenta, cordon ombilical, poche amniotique). Seules capables de donner un embryon qui donnera un enfant.

Cellules embryonnaires jusqu’au 3ème jour de l’embryon, stades trèsprimitifs uniquement

PluripotentesTous les types cellulaires y compris cellules germinales. Ne peuvent pas donner organisme entier (pas les annexes)

Cellules souches embryonnaires (CSE)

MultipotentesCapable de se différencier en un nombre limité de type cellulaire ayant une même origine embryonnaire (les 3 feuillets)

Cellules souches adultes (CSA)

Unipotentes Un seul type cellulaire

Au niveau de la peau

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Cellules souches embryonnaires

Histoire :Première mise en culture des cellules souches embryonnaires de souris (in vitro) : 1981mES = murine Embryonic Stem Cells = Cellules Souches Embryonnaires de sourisOn est parti d’un embryon de souris au stade blastocyste et on a récupéré le

bouton embryonnaire (masse cellulaire interne). On l’a isolé, et on l’a mis en culture sur un tapis de cellules nourricières (obligatoire pour maintenir cellules souches en culture).Les cellules embryonnaires ne peuvent pas être cultivées comme des cellules tumorales (juste sur du plastique), on a besoin d’un environnement extracellulaire très particulier : les cellules nourricières.

On va être capable de faire des repiquages (passages), « diluer » les cellules et les distribuer en culture pour les multiplier.

On obtient des lignées de CSE.Découverte révolutionnaire : Démonstration du potentiel prolifératif illimité des cellules souches

embryonnaires Premières lignées cellulaires non tumorales (on ne savait le faire que sur les

cellules tumorales)

Test pour prouver le potentiel des cellules :

On a les cellules A à tester, on va faire deux types de test avec ces cellules (que l’on suppose être des cellules souches) :

Test in vitro :

- Mise en culture sur un tapis de cellules nourricières- Reconstitution d’un environnement tissulaire de façon à permettre leur culture et leur différenciation (cytokines, facteurs de croissances)- En 5 à 10 semaines, on est capables d’obtenir des cellules différenciées- Analyse des cellules grâce à des marqueurs spécifiques des types cellulaires et

de leurs fonctions.Test in vivo :

- Réimplantation des ES dans un modèle murin- Vérification, après 2 à 6 mois, de la différenciation et recherche du fond

génétique des cellules de départ

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Si ces tests sont positifs, on peut dire que les cellules qu’on avait au départ étaient bien des cellules souches

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Réimplantation de cellules embryonnaires (ES) dans un blastocyste et une souris porteuse :

In vivo : on réimplante les ES supposées dans un blastocyste lui-même réimplanté dans une souris porteuse.

On prend le bouton embryonnaire (masse cellulaire interne) et on le met en culture pour amplifier le nombre de cellules. On transfère cette masse cultivée dans un autre embryon au stade blastocyste.On aura une masse cellulaire interne qui sera composée d’un mélange de 2 types de cellules embryonnaires : le fond génétique des cellules en culture et celui de l’embryon dans lequel on rajoute les cellules.On intègre cet embryon modifié dans l’utérus d’une souris porteuse.→ Obtention d’un souriceau chimère : tous ses tissus ont deux origines génétiques. Ex : poil en patchwork quand embryons initiaux de couleur différente

On observe la présence de cellules qu’on a réimplantées dans tous les types de tissus, dans les 3 feuillets embryonnaires : cela prouve la pluripotence (capacité de donner naissance à tous les types cellulaires).

Injection des cellules souches dans une souris adulte en sous-cutané ou dans la capsule rénale (test in vivo) :

Souris immunotolérantes (sinon le SI se débarrasserait des cellules étrangères)

Formation d’un tératome : tumeur hétérogène contenant différents types cellulaires différenciées représentatifs des 3 feuillets embryonnaires.

On va retrouver une partie de la tumeur avec, par exemple, une différenciation : en cartilage, une partie peut s’être différenciée en tube neuroépithélial (ectoderme), en glandes(endoderme), en tissu adipeux (mésoderme)… Tout cela provient des cellules embryonnaires injectées.

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Test de différenciation in vitro :

On récupère les cellules du blastocyte qu’on met en culture avec des facteurs (cytokines etc).

On arrive à obtenir une différenciation en cellules pancréatiques, hématopoïétiques, cardiomyocytes, neurones, hépatocytes…Cette différenciation reste complexe car il faut le bon cocktail de facteurs.•Prouve la PLURIPOTENCE

Perspective de culture de mES :

La mise en culture de mES ouvre une voie de recherche

importante depuis 20 ans : souris transgéniques. En faisant une

manipulation génétique, on va :

- Insérer un gène (souris knock in)- Ou bien invalider un gène (souris knock out)

Permet d’étudier le rôle des gènes (par exemple pour l’embryogénèse), l’importance ou non du gène et de faire des modèles animaux pour des tas de processus physiopathologiques.

Ici, on incorpore un gène qui code pour une protéine qui donne une coloration bleue : la β-galactosidase (protéine de bactérie). On obtient un embryon chimère.

Intérêt : visualiser la migration des feuillets pendant embryogénèse, permet de faire progresser les connaissances sur l’embryogénèse

On a commencé sur les souris, mais nécessité de tester sur l’humain.

1998 : première mise en culture de cellules souches embryonnaires humaines.

Cela pose des problèmes éthiques que ne posent pas les embryons de souris car cela nécessite la destruction des embryons pour récupérer masse cellulaire interne au stade blastocyste. Il y a eu une forte opposition et un battage médiatique car l’isolement des cellules souches humaines aboutit à la destruction de l’embryon.→ Embryons obtenus à partir de FIV et qui ne font pas objet d’un projet parental (embryons surnuméraires) : nécessite le consentement préalable.Le débat s’accentue en raison de la limite éthique, « on ne doit pas produire des embryons uniquement pour la recherche » : beaucoup de craintes mais très encadré, nécessite des autorisations, visites, contrôles… Ainsi les craintes portent sur :

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Risque de production d’embryons pour la recherche Risque de dons d’ovule et trafics potentiels rémunérés, marchandisation. Perspective de clonage

Différents types de clonage : Clonage reproductif : création d’un nouvel organisme strictement identique au

donneur.

On part d’un œuf fécondé dont on va retirer le noyau . On récupère ensuite le noyau d’une cellule somatique et on le met dans l’œuf. La réimplantation du blastocyste dans utérus d’une mère porteuse donne naissance à un enfant. Premier clonage reproductif : brebis Dolly (1997) qui est le premier mammifère cloné à partir d’une cellule adulte. Le clonage reproductif humain a peu d’intérêt et non acceptable éthiquement. Il y a encore beaucoup d’échecs et de nombreuses malformations a la suite de clonage , la technique n’est pas parfaitement maitrisé.

Cette technique présente néanmoins de nombreux échec et de nombreuse malformation.

Clonage thérapeutique : cherche à obtenir CSA en vue de mener des recherches et éventuellement application en thérapie.

2004 : production de cellules souches humaines à partir d’embryons générés par transfert nucléaire somatique.Les étapes sont les mêmes jusqu’au blastocyste mais on récupère les cellules souches au lieu de les implanter. Au lieu de réimplanter le blastocyste dans l’utérus d’une mère porteuse on va récupérer le bouton embryonnaire et on va mettre les cellules en culture et on obtiendra après plusieurs passages une lignée de cellules souches. On pourra éventuellement les différencier dans un type cellulaire particulier pour l’application en thérapie ou en recherche.

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Réglementation des recherches :

Le tableau n’est pas à jour (2010), mais il montre que la réglementation est très différente selon les pays, les pays anglo-saxons sont plus ouverts que la France. Pour utiliser des lignées cellulaires existantes il faut forcément passer par l’utilisation d’embryons surnuméraires.

Clonage thérapeutique

Création d’embryons à des fins de recherche

Utilisationd’embryons surnuméraires de FIV

Utilisation de lignées ES existantes

UK Oui Oui Oui OuiUSA ? Oui Oui OuiAllemagne

Non Non Non Oui

France Non Non Non OuiBelgique Non Non Oui Oui

Test de la fonctionnalité et de la potentialité des cellules souches humaines :

2 tests :

Formation de tératomes1 dans des souris immunodéficientes (évite problème de rejet)

Différenciation in vitro

On en a conclu que les cellules embryonnaires humaines sont pluripotentes

Les cellules souches adultes

CaractéristiqueGénéral :

Les cellules souches adultes sont difficiles à localiser dans les tissus car on manque de marqueurs, de morphologie reconnaissable pour les identifier.Contrairement aux cellules différenciées, elles sont souvent isolées avec un environnement appelé niche de plusieurs cellules différenciées (1 cellule souche pour 200 ou 2000 cellules différenciées).Aujourd’hui, des cellules souches ont été identifiées dans bon nombre de tissus adultes : moelle osseuse, épiderme, intestin, os, pancréas, foie, muscle lisse, muscle strié, cerveau, …Elles sont probablement présentes dans tous les tissus.Elles contribuent à l’homéostasie des tissus en participant à leur renouvellement et à leur régénération.

Composition d’une niche :

Les cellules souches adultes ont besoin d’un microenvironnement particulier : niche (fonctionnelle). Cet environnement permet :

- De maintenir un caractère indifférencié- D’être isolé par rapport aux facteurs de différenciation présent dans les

tissus.Cette niche n’a pas de définition anatomique mais fonctionnelle (la plupart du temps sauf dans certains tissus). Sa nature et sa composition varient d’un tissu à un autre.

Composition :- Cellules souches elles-mêmes + cellules de soutien + matrice

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extracellulaire, permet : Contacts cellules-cellules Contacts cellules-MEC (rôle important des intégrines dans le nichage)

- Facteurs solubles (facteurs de croissance)

Niche également influencée par des facteurs plus distants (signaux hormonaux, messages nerveux, …)

L’ensemble de ces facteurs permet de contrôler la prolifération, la migration et la différenciation des cellules souches.

Exemple : les cellules souches du follicule pileux :

La niche du follicule pileux a une définition anatomique.Les cellules souches du follicule pileux sont situées en dessous de la glande sébacée.Les cheveux repoussent grâce aux cellules souches capables de renouveler un cheveu qui serait tombé. Si on regarde la niche à la loupe, on retrouve :

- Des cellules dermiques (en vert)- Les cellules souches (en rouge)- La matrice extracellulaire- Des facteurs solubles- Des interactions :

Cellules dermiques de soutiens- cellules souches Avec la matrice

On a un gradient local de facteurs sécrétés (TGF β et WNT) soit par les cellules souches soit par les cellules de soutien. Les cellules souches vont être ancrées sur la matrice extracellulaire grâce aux intégrines.

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Division des cellules souches adultes :

Les cellules souches adultes sont capables d’effectuer deux types de divisions : Les divisions asymétriques au sein de la niche assurent : L’auto-

renouvèlement des cellules souches et la génération de progéniteurs (ce ne sont plus des cellules souches mais sont encore très indifférenciées) qui quittent la niche pour s’engager dans un lignage spécifique. Ainsi cette division permet de maintenir un pool constant de cellules souches.

La division symétrique classique : une cellule souche se divise en deux cellules filles qui vont être des cellules souches elles-mêmes (permet d’augmenter le pool de cellules souches). Il peut y avoir certains stimuli qui vont conduire à une augmentation du pool de cellules souches pour un besoin particulier.

Division symétrique : une cellule reçoit un stimulus et se divise en deux cellules filles avec un patrimoine génétique identique à la cellule mère.

Division asymétrique : donne naissance à deux cellules filles strictement identiques au niveau du génome mais leur devenir va être différent. Une des cellules filles va finalement remplacer la cellule mère et l’autre va sortir de la niche, devenir un progéniteur et s’engager dans une voie de différenciation.

Schéma : les deux futures cellules filles sont toujours ancrées dans la matrice extracellulaire via des intégrines. Cet ancrage va être rompu permettant à la cellule de se détacher, de quitter la niche et de suivre un « destin » différent : elle ne sera plus cellule souche et va commencer à s’engager dans une voie de différenciation pour devenir un progéniteur qui va être capable de se diviser de façon très importante. Les cellules issues de cette multiplication vont être capable de se différencier pour assurer

une fonction donnée dans un tissu

Le potentiel de prolifération est proportionnel au potentiel de différenciation :- Une cellule indifférenciée a un fort potentiel de prolifération mais n’a pas de

fonction particulière autre que celle de contribuer à l’homéostasie- Une cellule très différenciée n’est plus capable de proliférer, elle a

une fonction donnée (cellule adipeuse pour stocker les lipides, cellule musculaire pour faire la contraction, une cellule rénale pour faire la filtration, cellule épithéliale pour faire barrière à un endroit

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donné de l’organisme, …) Le potentiel de prolifération/différenciation est inversement proportionnel à l’état de différenciation.

Les cellules souches adultes : actives ou quiescentes

Paradoxe : les cellules souches adultes ont un potentiel de prolifération très important mais dans certains tissus elles prolifèrent très peu ou pas du tout.Elles sont maintenues quiescentes dans la niche grâce aux signaux jusqu’au moment où la composition de la niche change et où elles vont recevoir un signal qui les pousse à se diviser.Signaux activateurs : modification des paramètres de la niche :

- Facteurs solubles (voie endocrine, paracrine, autocrine).- Modification des interactions cellules-cellules.- Modification des interactions cellule-matrice extracellulaire.

Activation des cellules souches :

Le signal prolifératif :- Stimule la division cellulaire- Génère un compartiment d’amplification transitoire qui est

composé de cellules progénitrices (qu’on appelle aussi cellule d’amplification transitoire).

Ces progéniteurs ont un potentiel de prolifération (rapidité à se diviser) plus important que les cellules souches mais limité dans le temps, ce qui va permettre de générer un pool de cellules important à partir d’une quantité faible de cellules souches.

La cellule qui s’engage dans une voie de différenciation prolifère pour augmenter le nombre de cellules progénitrices qui vont pouvoir se différencier.Ce mécanisme permet donc d’obtenir un grand nombre de cellules différenciées à partir d’une seule cellule souche tout en conservant le même nombre de cellule souche.Dans les tissus à renouvellement rapide comme la peau et l’intestin, les cellules souches sont constamment en division. Les progéniteurs sont très nombreux (facilement identifiables) et sont situés dans un compartiment tissulaire précis.

Exemple : intestin L’intestin est constitué de villosités et de cryptes. Les cellules souches sont quasiment au fond de la crypte (en rouge).Il y a une division d’une cellule souche en deux cellules filles : celle qui

est le plus vers la surface va commencer à migrer et va pousser les autres cellules vers la surface de la villosité. Plus la migration est vers le haut, plus il y aura de différenciation, tout en bas : cellules souches.

Le long de la villosité on a les cellules différenciées et tout en haut on a les 121

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cellules qui vont mourir, desquamer, se séparer. Les cellules immatures sont tout au fond, elles se divisent et permettent le renouvellement de l’ensemble des cellules de l’épithélium intestinal.Les cellules du compartiment d’amplification transitoire sont dans la crypte et se divisent en toutes les cellules différenciées de l’épithélium intestinal (cellule entérocytes, entéroendocrines, Goblet, …)Dans l’intestin, on a une localisation morphologique très précise des cellules souches, des cellules du compartiment d’amplification transitoire et des cellules différenciées.

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Exemple : peauDans la peau (épithélium pluristratifié, malpighien kératinisé) les cellules souches sont au niveau de la couche basale. On retrouve une cellule souche (kératinocyte souche) parmi quelques cellules basales.Il n’y a pas de différence morphologique entre les cellules souches et les progéniteurs.Les cellules du compartiment d’amplification transitoire vont se diviser et vont commencer à se différencier. Elle se divise et donne naissance à une progénitrice qui renouvèle la cellule souche initiale. Il n’y a pas de différence morphologique entre les cellules souche et les progéniteurs, donc on n’est pas capable de les identifier.On a une différenciation morphologique dans la couche épineuse puis dans la couche granuleuse et enfin dans la couche cornée. Elles vont donc migrer vers la surface de l’épithélium puis desquamer sachant que les cornéocytes n’ont plus de noyau (ce sont des cellules mortes).

3 grands groupes de tissus adultes :

1er groupe : renouvellement cellulaire élevé et potentiel de régénération élevé (régénération en réponse à une lésion).

- Cellule sanguine- Épithélium digestif- Épiderme

Les cellules souches se divisent et les tissus sont renouvelés en permanence mais sont aussi capable de faire face à de grosses lésions et de régénérer de grosses pertes tissulaires.

2ème groupe : renouvellement cellulaire faible et potentiel régénératif élevé face à une lésion

- Le tissu hépatique, à renouvellement cellulaire faible, est capable de redonner un foie complet assez rapidement après une greffe d’un petit fragment de foie.

3ème groupe : renouvellement cellulaire faible et potentiel régénératif faible- Concernant la moelle épinière, il doit y avoir probablement des cellules

souches mais pour une raison qu’on ne connait pas ces cellules souches ne sont pas capables de se remettre en division et ne régénèrent pas.

Au total : la contribution des cellules souches à l’homéostasie et à la réparation tissulaire est sans problème pour les deux premiers groupes et beaucoup plus compliquée sur le troisième groupe.

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Plasticité des cellules souches adultes

Les cellules souches adultes sont considérées comme multipotente.Une cellule souche est engagée dans un programme de différenciation tissulaire spécifique et peut donc donner naissance à des cellules différenciées et matures d’un autre tissu que le tissu initial. Dans certaines conditions de microenvironnement, on s’est rendu compte que ces cellules sont capables de différents phénomènes :

- La transdifférenciation : différentiation en un autre type cellulaire- La dédifférenciation : fait de devenir plus immature, moins différenciée, c’est-

à-dire de faire le processus à l’envers.

Dans un tissu donné, on a une cellule souche multipotente qui est capable :

De se différencier en cellule mature de type 1

De se dédifférencier : elle redevient pluripotente puis migre dans un autre tissu où elle se redifférencie en cellule souche multipotente de type 2 pour se différencier en cellules matures de type 2.

De faire de la transdifférenciation : au lieu de donner des cellules matures de type 1 elle va donner directement des cellules matures de type 2 si elle est soumise au bon microenvironnement (elle migre dans un environnement différent).

Exemples de plasticité cellulaire :

Transformation des cellules du cerveau en cellules sanguines ; transformation des cellules sanguines en cellules du cerveau…On a joué avec ces croisements pour montrer la plasticité des cellules.

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Cellules souches mésenchymateuses

Cellules souches neuronales

Cellules souches musculaires

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Conclusion : L’isolement et l’identification des cellules souches représentent une avancée scientifique considérable pour la compréhension des mécanismes fondamentaux du vivant.Il y a eu une progression des connaissances en physiopathologie et en physiologie grâce aux modèles cellulaires très performants.C’est la partie fondamentale qui permet de comprendre comment fonctionnent nos tissus, nos cellules avec un impact énorme sur la connaissance en embryogenèse.Les cellules souches ont des applications cliniques et thérapeutiques potentielles nombreuses : enjeu social, politique, économique éthique et bien sur médical.Attention aux faux espoirs : il reste encore beaucoup d’inconnu et on est encore au début de l’exploitation des cellules souches pour des applications cliniques.

Autres perspectives : cellules souches et cancer Théorie : les cellules souches seraient à l’origine des cellules tumorales (Cancer Stem Cells= CSC)Cette théorie n’est pas encore complétement acceptée, mais on a de plus en plus d’arguments.Les cellules souches sont à l’origine de cancer lorsqu’elles sont la cible de modifications de l’ADN (cellules cancéreuses résistent aux traitements).De nombreux traitements ciblent les cellules en division mais si la cellule souche s’est mise en quiescence elle n’est pas inquiétée par le traitement en question et peut donc se réactiver et se remettre à proliférer à distance dans le temps et dans l’espace puis redonner une tumeur secondaire.

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Annales :

20191/A propos des cellules souches embryonnaires, cocher la ou les réponse(s) exacte(s) :A - elles sont très différenciéesB - elles sont présentes dans tous les tissus embryonnairesC - elles peuvent se diviser de façon symétriqueD - elles peuvent se diviser de façon asymétriqueE - elles sont à l’origine de certains types cellulaires de l’organisme

2/A propos des cellules souches adultes, cocher la ou les réponse(s) exacte(s) :

A - elles sont très différenciéesB - elles sont présentes dans les tissus embryonnairesC - elles sont localisées dans un environnement particulier appelé nicheD - elles peuvent se diviser activement dans certains tissus adultesE - elles peuvent être quiescentes dans certains tissus adultes

3/A propos du clonage thérapeutique, cocher la ou les réponse(s) exacte(s) :

A - il a pour objectif d’obtenir des cellules souches embryonnaires à des fins de rechercheB - il nécessite l’énucléation d’un spermatozoïdeC - il repose sur le transfert d’un noyau de cellule somatique dans un ovocyte énuclééD - il nécessite la destruction d’un embryon au stade blastocysteE - il nécessite le transfert d’un embryon dans l’utérus d’une mère porteuse

Reponses :

1) BCD

2) CDE

3) ACD

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