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Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU
MASTER EN INGENIERIE DE L'EAU ET DE L'ENVIRONNEMENT
OPTION : EAU ET ASSAINISSEMENT
------------------------------------------------------------------
Présenté et soutenu publiquement le [Date] par
ALI OUMAROU BANOBA Khadidia
Travaux dirigés par
Dr Hela KAROUI, Enseignante Chercheure à 2iE
Dr Harinaivo A. ANDRIANISA, Enseignant Chercheur à 2iE
Mme Christine Lovasoa RAZANAMAHANDRY, Doctorante à 2iE
Jury d’évaluation du stage :
Président : Prénom NOM
Membres et correcteurs : Prénom NOM
Prénom NOM
Prénom NOM Promotion [2016/2017
Isolation et caractérisation des espèces bactériennes
dégradeurs du cyanure : cas des sites d’orpaillage de
Zougnazagmiline et Galgouli au Burkina Faso
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
i ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
CITATIONS
Celui qui aime la correction aime la science; celui qui hait la réprimande est stupide.
La maison ne repose pas sur la fondation, mais sur la femme.
Ne mesure le travail qu’une fois la journée terminée, et l’ouvrage accompli.
Ce que nous faisons pour nous même disparaît avec nous. Ce que nous faisons pour les autres
et le monde par les écrits est immortel et demeure.
A la fin, ce ne sont pas les années écoulées de notre vie qui comptent, mais la vie qui a
inondée ces années.
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
ii ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
DEDICACES
Je dédie ce travail
A mon père ALI OUMAROU BANOBA, ainsi qu’à ma mère Mme BANOBA
Rahamatou Souley, pour leur soutien illimité, leur confiance et pour tous les efforts qu’ils
ont fournis pour l’accomplissement de ce travail.
A mes frères et sœurs : Ibrahim, Banoba Abdoul Kabir, Ismaël, Mariama, Aïchatou et
Roumanatou qui n’ont cessé de m’encourager et de me témoigner leur amour.
A ma très chère marraine Cathérine Noyer pour son soutien et ses conseils.
A tous mes amis de 2iE, qui sont devenus ma famille et qui ont rendu mon séjour
agréable.
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
iii ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé au Laboratoire Eau, Dépollution, Ecosystème et Santé (LEDES) du 2iE
Je tiens à remercier tout particulièrement
➢ Pr. Hamma YACOUBA, Directeur de la recherche et Dr Yacouba KONATE,
Directeur du laboratoire Eau, Dépollution, Ecosystème et Santé (LEDES) pour
m’avoir permis d’intégrer l’équipe de recherche.
➢ Dr. Hela KAROUI, Enseignante-chercheure pour sa disponibilité, ses conseils, son
implication et son dévouement à la réussite de cette étude.
➢ Dr. Anderson ANDRIANISA, Enseignant-chercheur qui n’a ménagé aucun effort
pour m’appuyer à tous les niveaux pendant ma période de stage.
➢ Mme Christine RAZANAMAHANDRY, doctorante, pour sa disponibilité, son
encadrement et ses conseils.
➢ Messieurs Noel TINDOURE et Hema SOUHAMAI, pour leur appui technique au
LEDES.
➢ Mr Boukary SAWADOGO et Dr Seyram SOSSOU pour leur soutien et leurs
conseils.
➢ Abdoul Wahab NOUHOU MOUSSA et Haoua MAHAMANE ZAKARI pour leur
aide à la réalisation de ce document.
➢ A tous ceux qui m’ont soutenu de près ou de loin mais dont leurs noms ne figurent pas
sur cette liste.
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
iv ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
RESUME
Au Burkina Faso, le cyanure est abusivement utilisé dans l’orpaillage ; ce qui entraine une
détérioration de l’environnement. La bioremédiation se retrouve comme étant un moyen
efficace de dépolluer les sites contaminés. Des récentes études ont montré la présence d’un
consortium de bactéries, extrait des sites d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli,
capables de dégrader une concentration de cyanure de 60mg/l avec un abattement supérieur à
95%.
Le but de notre travail est d’identifier les espèces bactériennes qui composent ce consortium.
Ainsi, cinq formes de colonies ont été isolées à savoir les formes circulaire, irrégulière,
fusiforme, punctiforme et rhizoïde. Les méthodes d’identification microbiologiques ont
permis d’identifier au total quatre espèces dont Pseudomonas sp, Klebsiella pneumoniae,
Klebsiella oxytoca et Staphylococcus sp. La même espèce peut avoir plusieurs formes de
colonies. Les méthodes d’identification moléculaires ont permis de situer le poids moléculaire
des bactéries, qui est compris entre 250 et 500 paires de bases.
Mots Clés :
1 - bioremédiation
2 - cyanure
3 - bactéries
4 - isolation
5 – identification
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
v ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
ABSTRACT
In Burkina Faso, cyanide is abused in gold panning; this situation resultes in environmental
degradation. Bioremediation is an effective means of decontaminating contaminated sites.
Recent studies have shown the presence of a consortium’s bacteria extracted from the gold-
mining sites of Zougnazagmiline and Galgouli, capable to degrade a cyanide concentration of
60mg / L with an allowance of more than 95%.
the objective of our work is to identify the bacterial species that make up this consortium.
Thus, five forms of colonies were isolated, namely circular, irregular, fusiform, punctiform
and rhizoid. Microbiological identification methods identified a total of four species,
including Pseudomonas spp, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca and Staphylococcus
spp. The same species may have several forms of colonies. Molecular identification methods
allowed us to locate the molecular weight of the bacteria, which is between 250 and 500 base
pairs.
Key words:
1 - Bioremediation
2 - cyanide
3 - bacteria
4 - isolation
5 – identification
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
vi ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
LISTE DES ABREVIATIONS
ADN: acide désoxyribonucléique
Al(SO4)2,12H2O: Aluminium Sulfate Dodécahydrate
API: appareillage et procédés d’identification
ARN: acide ribonucléique
COSO4,7H2O: sulfate de Cobalt, heptahydraté
CuSO4: Sulfate de cuivre
Echn: échantillon
FeSO4,7H2O : Iron (II) Sulfate Heptahydrate
HCN: Cyanure d’Hydrogène (Acide cyanhydrique)
HCO3: hydrogéno-carbonate
H2O: molécule d’eau
KCN: Cyanure de Potassium
K2HPO4: Di-potassium Hydrogen Phosphate
KOH: hydroxyde de potassium
LEDES: Laboratoire Eau, Dépollution, Écosystème et Santé
mg/L: milligramme par litre
MgSO4,7H2O: sulfate de Magnésium, heptahydraté
mm: millimètre
mM: millimol
mn: minute
MnSO4,7H2O: Manganèse (II) Sulfate Monohydrate
MSM: Solution Minérale Minimale
NaCl: chlorure de sodium
NaCN: cyanure de sodium
NaH2PO4,H2O: Sodium Dihydrogen Orthophosphate Monohydrate
Na2MoO42-,2H2O: Sodium Molybdate Dihydrate
NaNO3: nitrate de sodium
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
vii ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
NaOH: hydroxyde de sodium
NH3: ammoniac
NH4+ : ion ammonium
(NH4))2SO4: Ammonium Sulfate
O2: dioxygène
Pa: pascal
PCR: réaction de polymérisation en chaîne
pH: potentiel hydrogène
ppm: partie par million
S.P: saison pluvieuse
S.S: saison sèche
ZnSO4, 7H2O: Zinc Sulfate Heptahydrate
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
viii ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
Sommaire
CITATIONS ......................................................................................................................... i
Dédicaces ......................................................................................................................... ii
REMERCIEMENTS ............................................................................................................. iii
Résumé ............................................................................................................................ iv
ABSTRACT ......................................................................................................................... v
liste des abréviations ........................................................................................................ vi
LISTE DES TABLEAUX ..........................................................................................................x
Liste des figures ................................................................................................................ xi
Introduction ..................................................................................................................... 1
I. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE .................................................................................... 2
I.1. Généralités du cyanure ....................................................................................................... 2
I.2. Les bactéries dégradeurs du cyanure ................................................................................... 3
I.2.2. Biodégradation du cyanure : cas des sites d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli .. 3
I.2.3. Différents types de bactéries dégradeurs du cyanure ........................................................ 4
I.2.4. Efficacité des bactéries ......................................................................................................... 5
I.3. Isolation des bactéries ........................................................................................................ 5
I.3.1. Définition .............................................................................................................................. 5
I.3.2. Méthodes d’isolation ............................................................................................................ 5
I.3.3. Avantages et limites ............................................................................................................. 6
I.4: Identification des bactéries ................................................................................................. 6
I.4.1. Définition .............................................................................................................................. 6
I.4.2. Méthodes d’identification .................................................................................................... 7
I.4.3. Avantages et limites ............................................................................................................. 9
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
ix ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
II. MATERIEL ET METHODES ......................................................................................... 11
II.1. LOCALISATION ET ECHANTILLONNAGE ............................................................................. 11
II.2. ISOLATION DES BACTERIES ............................................................................................... 11
II.2.1. Préparation du milieu de culture ...................................................................................... 12
II.2.2. Ajustement du pH .............................................................................................................. 12
II.2.3. Ensemencement des bactéries .......................................................................................... 13
II.2.4. Repiquage des bactéries dans le milieu nutritif ............................................................... 13
II.3. TEST DE BIODEGRADABILITE ............................................................................................ 14
II.4. IDENTIFICATION DES BACTERIES ....................................................................................... 14
II.4.1. Caractérisation morphologique ........................................................................................ 15
II.4.2. Caractérisation culturale ................................................................................................... 15
II.4.3. Caractérisation biochimique ............................................................................................. 16
II.4.4. Caractérisation moléculaire .............................................................................................. 20
III. RESULTATS ET DISCUSSION ...................................................................................... 23
III.1. ISOLATION DES BACTERIES .............................................................................................. 23
III.2. IDENTIFICATION DES BACTERIES ...................................................................................... 23
III.2.1. Caractérisation morphologique ....................................................................................... 23
III.2.2. Test de biodégradabilité ................................................................................................... 26
III.2.3. Caractérisation culturale .................................................................................................. 27
III.2.4. Caractèrisation biochimique ............................................................................................ 30
III.2.5. Caractérisation moléculaire ............................................................................................. 35
IV. CONCLUSION ....................................................................................................... 39
V. RECOMMANDATIONS /PERSPECTIVES ..................................................................... 40
Bibliographie .................................................................................................................. 41
Annexe : quelques matériel et appareils utilisés .............................................................. 44
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
x ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
LISTE DES TABLEAUX
TABLEAU 1: ECHANTILLONS ...................................................................................................... 11
TABLEAU 2: RESULTATS ATTENDUS DES DIFFERENTS TESTS ...................................................... 19
TABLEAU 3: RECAPITULATIF DES CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES ................................. 25
TABLEAU 4: ABATTEMENT DU CYANURE .................................................................................. 26
TABLEAU 5: CARACTERISATION CULTURALE ............................................................................. 28
TABLEAU 6: CARACTERISTIQUES CULTURALES ET BACTERIES CORRESPONDANTES ................... 29
TABLEAU 7: RESULTATS TESTS BIOCHIMIQUES .......................................................................... 32
TABLEAU 8: ESPECES PROBABLES AUX TESTS BIOCHIMIQUES .................................................... 33
TABLEAU 9: RECAPITULATIF DES DIFFERENTS TESTS D'IDENTIFICATIONS MICROBIOLOGIQUES .. 34
TABLEAU 10: RECAPITULATIF DES ESPECES BACTERIENNES DEGRADEURS DU CYANURE ........... 35
TABLEAU 11: COEFFICIENTS ADN/ARN ET ADN/PROTEINES .................................................. 37
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
xi ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
LISTE DES FIGURES
FIGURE 1: METHODE D'ISOLATION DES BACTERIES DEGRADEURS DU CYANURE ..................................................... 14
FIGURE 2: FORME DES COLONIES ............................................................................................................................ 23
FIGURE 3: FORME MICROSCOPIQUE DES BACTERIES ............................................................................................... 24
FIGURE 4: ASPECT TEST D'INDOLE .......................................................................................................................... 30
FIGURE 5: ASPECT TEST DE PHENYLALANINE ......................................................................................................... 30
FIGURE 6: ASPECT TEST D'UREASE ......................................................................................................................... 31
FIGURE 7: TEST DE CITRATE DE SIMMONS .............................................................................................................. 31
FIGURE 8: ASPECT ADN EXTRAIT .......................................................................................................................... 38
FIGURE 9: RESULTAT AMPLIFICATION .................................................................................................................... 38
FIGURE 10: ASPECT KIT D'EXTRACTION .................................................................................................................. 44
FIGURE 11: APPAREIL D'AMPLIFICATION PAR PCR ................................................................................................. 44
FIGURE 12: APPAREIL ELECTROPHORESE ............................................................................................................... 44
FIGURE 13: APPAREIL PHOTO DOC-PRINT X ........................................................................................................ 45
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
1 ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
INTRODUCTION
le cyanure est un composé chimique utilisé dans plusieurs activités dont entre autres
l’extraction de minerais, le traitement des métaux, les procédés photographiques, la
fabrication de caoutchouc synthétique, les synthèses chimiques, la fabrication de plastiques,
les procédés de laboratoire, etc….
Au Burkina Faso, le secteur aurifère occupe une place importante. On estime environ 800
sites d’orpaillage dont seulement 200 sites sont légaux. L’orpaillage constitue de ce fait un
secteur très important de l’économie nationale. Afin d’avoir une grande quantité des minerais
extraits, les orpailleurs utilisent des produits chimiques tels que le cyanure et le mercure.
Toutefois, le non-respect des doses de cyanure recommandées entraine beaucoup de
dommages aussi bien sur la santé des populations exposées que sur l’environnement,
notamment les ressources en eau et le sol. Le cyanure est un poison mortel pour les êtres
vivants et un polluant néfaste pour l’environnement (Botz et al, 2005). La pollution par le
cyanure est observée sur la majorité des sites d’orpaillage car il contamine aussi bien les
ressources en eaux que les sols des bassins versants de ces sites. Au Burkina Faso, les études
pour dépolluer les sols et les eaux cyanurés sont encore inexistantes (MMCE, 2011). Des
techniques de traitements chimiques existent mais elles ne sont pas à portée de main des pays
en voie de développement car elles sont très onéreuses (Botz et al, 2005). Plusieurs
microorganismes ont été étudiés ces dernières années et ont été classés comme bactéries
capables de dégrader le cyanure (Akcil et Mudder, 2003).
Peu d’études ont été menées sur les bactéries présentes in situ capables de dégrader le
cyanure. Une étude menée par Sawadogo N. (2015) a porté sur la biodégradation du cyanure
en utilisant des bactéries prélevées sur le site pour dégrader le cyanure. Par la suite, Ibrahima
Agoumo (2017) a travaillé sur les conditions optimales (pH, température et nutriments)
auxquelles ces bactéries dégradent le cyanure. Ces deux études, ont montré qu’un
consortium de bactéries est capable de dégrader le cyanure avec une bonne efficacité de 95%
au minimum, dans un milieu spécifique et à différents pH. C’est à la suite de ces travaux que
s’inscrit le notre qui a pour objectif général d’identifier les espèces bactériennes constituant ce
consortium. Il s’agit plus spécifiquement de :
❖ Isoler ce consortium issu des échantillons d’eau et du sol des sites d’orpaillage
❖ Identifier les différentes espèces bactériennes présentes dans ce consortium
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
2 ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
I. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I.1. GENERALITES DU CYANURE
Le cyanure existe sous 3 formes: le cyanure libre, les cyanures simples et les cyanures
complexes.
D’après l’agence canadienne de protection de l’environnement (1991), le cyanure est
commercialement utilisé pour l’électroplaçage, l’extraction de minerais, le traitement des
métaux, les procédés photographiques, la fabrication de caoutchouc synthétique, les synthèses
chimiques, la fabrication de plastiques, le contrôle de pesticides, le débourrage des peaux, les
procédés de laboratoire et la fabrication de colorants et pigments.
Le cyanure est utilisé pour les gîtes d’or primaires. Le principe de cette technique repose sur
la propriété du cyanure de se complexer et de rendre soluble l’or (Moisan and Blanchard,
2013). En général, 0,3 à 0,5g de cyanure sont nécessaires pour une tonne de minerai, mais
dans la pratique, plus précisement sur les sites d’orpaillages de Zougnazagmiline au Burkina
Faso, les orpailleurs utilisent 300 à 2000g de cyanure par tonne de minerai pour une
extraction plus efficace (Roamba, 2014).
Cette utilisation abusive du cyanure représente des risques élevés sur la santé comme sur
l’environnement. En effet, plusieurs études menées ont montré que le cyanure peut être
introduit dans le corps humain par inhalation, ingestion et adsorption. Les doses mortelles
pour les adultes sont de 1 à 3 mg/kg de poids corporel si ingérées, de 100 à 300 mg/L si
inhalées et de 100 mg/kg de poids corporel si elles sont adsorbées.
((Agence française de sécurité sanitaire des produits de santé, 2010), Potivichayanon et
Kitleartpornpairoat (2010)).
Meech (1985) et Yeboah (2008) ont montré que le cyanure peut être toxique pour les
poissons et ont révélé que les activités minières ont entraîné une dégradation des terres
menant à la disponibilité de terres limitées pour la production alimentaire locale et d'autres
fins agricoles dans certaines localités.
Face à cette situation, plusieurs traitements sont envisagés en vue de diminuer la toxicité du
cyanure en le transformant en un autre composé moins toxique.
Les traitements physico-chimiques du cyanure fonctionnent sur le principe de conversion du
cyanure en composés moins toxiques par réaction d’oxydation. Cette dernière regroupe les
techniques telles que la destruction par chloration alcaline, par le péroxyde d’hydrogène, par
le charbon actif, le sulfure d’oxygène, l’oxydation par l’ozone et la catalyse par le peroxyde
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
3 ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
d’hydrogène (Moisan M. and Blanchard F., 2013). Cependant, les inconvénients majeurs de
ces traitements sont les coûts d'investissement élevés, le matériel spécialisé et des exigences
d’entretien; d’où le recours aux traitements biologiques (Bioremédiation) qui sont plus
économiques et plus efficaces.
Plusieurs auteurs ont défini la bioremédiation du cyanure comme étant la dégradation du
cyanure par les bactéries, les algues ou les champignons ((Vavasseur, 2014), Santos et al.
(2013))
La biodégradation bactérienne présente des avantages considérables, car les bactéries sont
plus facilement manipulables aux niveaux biochimique et génétique (Huertas et al., 2010).
I.2. LES BACTERIES DEGRADEURS DU CYANURE
I.2.1. Définition
Les bactéries ont besoin de nutriments pour croitre dont entre autres le carbone, l’oxygène,
l’azote, le souffre et le phosphore (Prescott et al., 2003).
Le traitement biologique du cyanure utilise la capacité naturelle des bactéries pour convertir
les cyanures libres et les complexes métalliques en bicarbonate et en ammonium.
Les bactéries ont pour principal rôle de dégrader le cyanure en l’utilisant uniquement le
carbone ou l’azote ou les deux à la fois et sont capables de produire l’ammonium comme
sous produit.
(Moisan M. and Blanchard F., 2013).
2KCN + 4H2O + O2 → 2K+ + 2HCO3- + 2NH3
I.2.2. Biodégradation du cyanure : cas des sites d’orpaillage de
Zougnazagmiline et Galgouli
Des études au sein du Laboratoire Eau, Dépollution, Ecosystème et Santé (LEDES) ont déjà
porté sur la dégradation du cyanure par les bactéries prélevées sur les sites d’orpaillage.
La première étude est celle de Sawadogo N. (2015). Elle a pu isoler un consortium de
bactéries aussi bien des échantillons d’eau que de sol capables de dégrader le cyanure en
l’utilisant comme seule source de carbone et d’azote. Le test de biodégradation a montré une
efficacité de 98% à un pH=9.5 et à une concentration de cyanure de 60mg/L quelque soit les
nutriments. Elle a également montré que la dose létale pour ces bactéries était de 100mg/L.
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
4 ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
La seconde étude fut celle de Ibrahima Agoumo (2017) qui a isolée le même consortium de
bactéries et a montré qu’à différentes valeurs du pH (5 ; 7,5 ; 9,5 ; 10,5), il y avait une
biodégradation du cyanure avec un taux d’abattement minimal de 95,5% ; Le pH optimal de
dégradation du cyanure (jusqu’à 98%) était 9,5. Elle a aussi montré qu’en présence comme en
l’absence de nutriments, la dégradation du cyanure était efficace. Le glucose et l’ammonium
étaient les deux nutriments pour lesquels la dégradation était optimale, avec un abattement de
100 % et 99,8% respectivement.
I.2.3. Différents types de bactéries dégradeurs du cyanure
Certaines bactéries sont capables d’utiliser le cyanure à plusieurs fins.
L’Agrobacterium tumefaciens SUTS 1 est une bactérie qui dégrade non seulement le cyanure
libre et total, mais l’utilise comme source de carbone. (Potivichayanon et Kitleartpornpairoat,
2010).
Plusieurs bactéries sont capables d’utiliser le cyanure comme seule source de carbone et
d’azote. C’est le cas des espèces comme Pseudomonas, Brucella et Ochrobacterum. (Parmar.
P et al., 2012).
Une étude menée par Huertas et al. (2010) a montré que des bactéries comme Alcaligenes
spp., Arthrobacter spp., Burkhoderia cepacia, Bacillus pumilus, Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344
sont responsables de la dégradation du cyanure, avec l’ammonium comme sous produits.
Les bactéries peuvent également être utilisées pour la biodégradation sur membrane. D’après
Kowalska et al. (1998), les bactéries comme Agrobacterium radiobacter, Staphylococcus
seiuri et Pseudomonas diminuta ont donné un résultat positif sur la biodégradation du cyanure
sur membrane d’ultrafiltration.
Chien-Sao et al. (1996), Daniel et Olapaggan (1989) ont étudié la dégradation du cyanure par
les bactéries Pseudomonas fluorescens et ont prouvé que ces bactéries étaient capables de
croître en milieu cyanuré en produisant du dioxyde de carbone et de l’ammonium.
Dix souches bactériennes ont fait l’objet d’une étude par Silva-Avalos et al. (1990). Toutes les
souches ont pu croître dans des échantillons de sols, d’eaux usées et de boues de vidange
contenant du cyanure. De ces dix (10) souches, sept (7) étaient des Pseudomonas et les trois
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
d’orpaillage de Zougnazagmiline et Galgouli
5 ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
(3) autres des Klebsiella.
L’espèce bactérienne Bacillus sp a également été rapportée comme une bactérie présentant
des bonnes capacités à dégrader le cyanure contenu dans des eaux usées (Chou-Fei et al.,
2014).
Les espèces bactériennes comme Bacillus pumilus, Pseudomonas fluorescens et
Pseudomonas stutzeri ont une bonne efficacité de dégradation du cyanure (Meyer, 2010).
Les espèces comme Klebsiella spp, Acidovorax spp et Achromobacter xylosoxidans sont
aussi capables de dégrader le cyanure (Quan zhe xue et al., 2005).
I.2.4. Efficacité des bactéries
Les espéces Pseudomonas sont plus efficaces que les Brucella et Ochrobacterum quant à la
dégradation du cyanure (Parmar et al., 2012).
L’efficience des bactéries sur la biodégradation sur membrane est fortement liée à la pression.
Avec une pression optimum de 105Pa, on a obtenu une dégradation du cyanure par les
Agrobacterium radiobacter, Staphylococcus seiuri et Pseudomonas diminuta avec un taux de
20.3% (Kowalska et al., 1998).
Les bactéries comme Bacillus sp sont capables de dégrader jusqu’à 200mg/L d’une
concentration de cyanure à un pH optimum de 10.3 avec une efficacité de 96.69% pendant
une durée de 72heures (Chou-Fei Wu et al., 2014).
Pseudomonas fluorescens est capable de dégrader jusqu’à 79% de 400mg/l d’une solution
cyanurée à un pH acide égal à 5 (Meyer, 2010).
I.3. ISOLATION DES BACTERIES
I.3.1. Définition
L’isolation est utilisée en microbiologie comme première phase de classification des
bactéries. Afin de connaitre une information sur la taxonomie des bactéries, il suffit de les
cultiver dans un milieu spécifique. Le type du milieu détermine la présence ou non du type de
bactérie recherché. Il permet d’avoir des cultures pures d’une espèce bactérienne (Prescott et
al., 2003).
I.3.2. Méthodes d’isolation
Il existe plusieurs méthodes d’isolation des bactéries. Keynaud et Franche (1986), Amer et al.
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
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6 ALI OUMAROU BANOBA Khadidia promotion 2016-2017
(2013) ont travaillé sur l’isolation des cyanobactéries. Ils ont montré qu’on peut isoler les
cyanobactéries dans le milieu BG-11, constitué de plusieurs nutriments dont le sulfate de
cuivre, le nitrate de sodium, le sulfate de magnésium, solidifié avec de l’Agar en cas de
nécessité.
François et al. (2011) ont également montré que des bactéries dégradeurs du mercure et de
l’arsenic peuvent être isolées par la méthode de dilutions successives, suivie de la fixation sur
la gélose.
Quant à Parmar et al. (2012), ils ont étudié les bactéries dégradeurs du cyanure dans des
échantillons de sols. La méthode d’isolation utilisée consiste à inoculer les bactéries par la
méthode des stries sur un milieu de gélose Bushnell-Haas, où le cyanure de potassium (KCN),
à une concentration de 23mg/L, est la principale source de carbone et d’azote pour les
bactéries.
Une autre méthode, utilisée par (Meyer, 2010), le milieu “Luria-Bertani” ou milieu “LB”
consiste à inoculer les bactéries dans un milieu composé de plusieurs nutriments, dont 4 à 10
mM de cyanure de sodium (NaCN) comme seule source de carbone et d’azote pour les
bactéries.
I.3.3. Avantages et limites
L’isolation, si elle est bien réalisée, permet d’obtenir des colonies isolées, donc des cultures
pures d’une espèce bactérienne. Ce qui représente une facilité pour la phase de
caractérisation.
En outre, cette technique est limitée car elle exige l’utilisation des milieux de culture, hors
que environ 90% des bactéries ne sont pas cultivables. (Pina et Raynaud, 2003) et (Prescott et
al., 2003)
I.4: CARACTERISATION DES BACTERIES
I.4.1. Définition
La microbiologie permet l’identification et la classification des microorganismes afin
d’appréhender leur diversité. Elle repose sur des techniques appelées “techniques de
recherche” basées sur l’identification et la classification des microorganismes, éventuellement
inconnus.
L’identification consiste à placer un individu particulier dans un taxon connu. La souche
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inconnue est comparée à des espèces déjà décrites (souches types) et le nom de l’espèce la
plus similaire est proposé. La définition actuelle de l’identification ne comprend plus la
comparaison de propriétés biochimiques mais prend en compte l’identification globale de
l’ADN avec une homologie supérieure à 70%. (Pina et Raynaud, 2003).
L’identification est le côté pratique de la taxinomie; elle consiste à déterminer qu’un isolat
particulier appartient à un taxon connu (Prescott et al., 2003).
I.4.2. Méthodes d’identification
Les techniques d’identification mises à la dispositions des microbiologistes ne cessent de
croître.
a) L’Agence Allemande de Protection de l’Environnement (AAPE)
L'Agence allemande de protection de l'environnement a approuvé deux méthodes
d’identification des bactéries E.coli et coliformes pour l’eau potable:
La méthode ISO 9308-1 dans laquelle on a la formation d’acide à partir du lactose.
Elle constitue la méthode de référence de l’ordonnance allemande sur l’eau
potable de 2001.
Le système Colilert-18 ou la méthode du nombre le plus probable basée sur les
substrats o-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside (ONPG) et 4-methylumbelliferyl-
b-glucuronide (MUG). cette méthode est capable de fournir les résultats de E-coli
dans l’eau potable dans une durée de 18h.
b) Le système API ou Appareillage et Procédé d’Identification:
Le système API est une version miniaturisée et standardisée des techniques biochimiques
conventionnelles pour l’identification des bactéries. Lorqu’une suspension bactérienne de
densité convenable est répartie dans les différentes alvéoles qui composent la microgalerie
(contenant de substrats déshydratés), les métabolites produits durant la période d’incubation
se traduisent par des changements de couleur spontanés ou révélés par addition de réactifs.
Elle permet l’identification d’une centaine de bacilles à Gram négatif dont les
Entérobactéries. Elle comprend 20 tests biochimiques (Kampfer et al., 2008).
c) Méthodes microbiologiques et moléculaires
Selon Prescott et al. (2003), il existe deux méthodes d’identification des bactéries, à savoir la
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méthode microbiologique (morphologie, culturale et biochimique) et la méthode génétique ou
moléculaire, basée sur l’ADN.
(1) Les méthodes microbiologiques
Les caractéristiques morphologiques donnent les caractères
microscopiques des bactéries. Le microscope optique est un outil très important qui
permet d’avoir la forme, la couleur, la mobilité et le mode de regroupement des
bactéries.
Les caractéristiques biochimiques et culturales sont très utiles car elles sont
directement en relation avec la nature et l’activité des enzymes microbiennes et des
protéines de transport. Elles donnent une comparaison indirecte des génomes. On
distingue une multitude de tests biochimiques dont le test d’indole, le test de
phénylalanine, le test d’uréase, le test de citrate de simmons, etc…
Pour la caractérisation culturale, plusieurs milieux de culture peuvent être utilisés
comme le Cetrimide Agar, le MacConkey’s Agar, le Nutrient Agar, le Blood Agar,
etc…
Ces méthodes ont également été utilisées par Parmar et al. (2012), afin d’identifier l’espèce
bactérienne capable de dégrader le cyanure.
(2) Les méthodes de biologie moléculaire
Elle se base sur l’étude des protéines et des acides nucléiques. La comparaison de ces derniers
fournit une information considérable sur les parentés véritables.
Elle comprend au minimum trois phases à savoir la phase d’extraction de l’ADN, la phase de
vérification de la pureté de l’ADN et la phase d’amplification ou PCR.
La phase d’extraction
Elle consiste à extraire l’ADN de la bactérie dans une solution donnée. Elle se fait le plus
souvent à l’aide de kit commercial. Plusieurs auteurs dont Ouédraogo (2013), Djigma (2011),
Doumbia et al. (2013), Quan zhe xue et al., (2005) ont utilisé des kits commerciaux comme «
DNA-Sorb-B » de SACACE biotechnologie ® » et « INSTANT Virus DNA Kit »
d’analytkjena® bio, The Promega Cat # A1125 DNA purification kit solutions, “Fast DNA
Spin Kit for Soil” pour faire une extraction d’ADN. Le protocole d’extraction est fourni par le
fabriquant. Les avantages et limites des kits dépendent des fournisseurs, mais la majorité des
kits permettent une extraction rapide de l’ADN et prêt pour la PCR.
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La phase de purification
Après la phase d’extraction, un contrôle de pureté de l’ADN s’avère nécessaire.
C’est ainsi que Kersanté (2004) a utilisé le Biophotomètre Eppendorf afin de vérifier l’ADN
extrait des échantillons de sol. Les rapports ADN/ARN, ADN/Protéines et la concentrations
de l’ADN sont fournis.
La phase PCR ( Réaction de polymérisation en chaine):
Elle est basée sur l’amplification de l’ADN bactérienne.
Le principe de ce test est basé sur l’amplification de l’ADN à l’aide du thermocycleur. Il
comprend 96 puits, ce qui permet de lancer plusieurs échantillons en même temps. Il est
constitué d’une suite de plus de 30 cycles généralement. A la fin de l’amplification, le résultat
est lu par électrophorèse sur gel d’agarose (Djigma, 2011) et (Béré, 2010).
Meyer (2010) a montré que l’espèce Bacillus sp, capable de dégrader le cyanure peut avoir
jusqu’à huit (8) familles différentes, qu’on peut distinguer en fonction du nombre de paire de
bases. Bacillus thuringiensis possède le plus grand nombre qui est de 5.2 Méga paires de
bases.
Ouédraogo (2013) a travaillé sur les virus impliqués dans les infections congénitales et a
montré que la méthode par PCR permettait d’identifier et caractériser les dits virus.
La méthode d’identification par PCR a également été utilisée par Doumbia et al. (2013), afin
de caractériser le virus de l’hépatite B.
Quan Zhe Xue et al. (2005) a utilisé aussi la méthode d’identification par PCR afin de
caractériser les bactéries capables de biodégrader le cyanure libre et totale dans des eaux
usées.
I.4.3. Avantages et limites
a. Les galéries API
Là où les techniques classiques nécessitaient une à trois semaines, les gammes miniaturisées
des API permettent l’obtention des résultats sous 18 à 72 heures. Elles permettent, en outre,
l’identification d’environ 800 bactéries et levures, ce qui couvre pratiquement l’ensemble des
micro-organismes pathogènes de ce type (Kampfer et al., 2008).
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Les galeries API, miniaturisées et standardisées, ont l’avantage de standardiser les caractères
biochimiques recherchés pour améliorer la reproductibilité interlaboratoire en éliminant le
choix subjectif des tests « importants » pour la caractérisation, elles limitent la variabilité
technique (utilisation de système de distribution possible). Leur utilisation est simple.
Comme inconvénients, les galeries API ont une probabilité d'obtention d'un code ne
correspondant à aucune référence suite aux tests miniaturisés. D’une manière générale, le taux
d’erreur des galeries varie entre 5 et 20% selon les galeries considérées, comprenant les
identifications incorrectes (1-15%) ou les identifications non concluantes (3-5%).
(Pina and Raynaud, 2003)
b. Les méthodes microbiologiques ou méthodes classiques
Elles donnent les caractéres utiles à la classification et l’identification des bactéries. la
morphologie est facile à étudier et à analyser. Ainsi, une similitude morphologique est une
bonne indication d’une parenté phylogénique. Mais, le microscope optique a une limite de
résolution d’environ 0.2m, ce qui réduit son utilité en ce qui concerne les structures et les
micro-organismes plus pétits.
Les caractéres microbiologiques présentent des fois une insuffisance sur la caractérisation
d’une espèce microbienne.
((Pina et Raynaud, 2003), ( Prescott et al., 2003), (Parmar et al., 2012))
c. Les techniques de biologie moléculaire
Elles ont bouleversé l’identification des bactéries, notamment par leur capacité de détection
des bactéries dont la culture au laboratoire est impossible, fastidieuse ou lente.
L’avènement de la biologie moléculaire permet une approche génotypique rapide et
complémentaire pour l’identification bactérienne. il est souvent préférable de réaliser une
PCR universelle à partir de colonies isolées sur milieux de culture pour identifier avec
certitude le germe.
Les limites de la PCR est qu’elle est réservée à quelques souches seulement car elle
représente un investissement non négligeable en matériel et réactifs.
(Pina et Raynaud, 2003)
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II. MATERIEL ET METHODES
II.1. LOCALISATION ET ECHANTILLONNAGE
Le travail a été effectué sur des échantillons provenant de deux sites d’orpaillage à savoir
Galgouli au Sud et Zougnazagmiline au Nord du Burkina Faso. Ces sites ont été identifiés par
Roamba (2014) et Kouassi (2015).
Pendant la durée de mon stage (Novembre 2016-Mai 2017), il n’y a pas eu de campagne
d’échantillonnage. Pour ce travail, nous avons donc utilisé des échantillons des deux sites
provenant des campagnes d’échantillonnage précédentes, notamment celles de Sawadogo N.
qui a eu lieu en 2015 et celle de Ibrahima Agoumo qui a eu lieu en 2016. Le tableau 1 nous
montre les différents échantillons sur lesquels nous avons travaillé.
Tableau 1: échantillons
Site saison Nature échantillon campagne
Zougna
zagmiline
pluvieuse sol 2016
sèche sol 2016
eau 2016
Galgouli pluvieuse sol 2015
sèche sol 2016
eau 2016
II.2. ISOLATION DES BACTERIES
Des analyses ont été faites sur des échantillons d’eaux et de sols provenant des sites
d’orpaillage afin d’en isoler les bactéries dégradeurs du cyanure. Ainsi un milieu de culture,
spécifique à ce type de bactéries, composé d’agar noble, de sels minéraux et de cyanure
comme seule source de carbone et d’azote, a été préparé (Razanamahandry et al., 2016).
La concentration de cyanure était de 23 mg/L car cette concentration se situe dans la
fourchette de valeur (23 à 50 mg/L) qu’une bactérie doit pouvoir dégrader pour que la
biodégradation du cyanure soit efficace (INERIS, 2011). En vue d’isoler le maximum de
familles de bactéries dégradeurs du cyanure, la concentration du cyanure utilisée a été
minimalisée à 23mg/L. Le milieu ainsi composé, est autoclavé à 121°C pour la préparation et
la stérilisation. Le pH est ensuite ajusté à 9,5 pour éviter la volatilisation du cyanure sous
forme de HCN. Ce milieu est ensuite coulé dans des boites de pétris dans lesquelles seront
ensemencées les échantillons. Cette étape est appelée ensemencement. (IBRAHIMA
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AGOUMO, 2017)
On peut récapituler le processus de cette isolation en cinq (5) étapes qui sont la préparation du
milieu de culture, l’ajustement du pH l’ensemencement des bactéries, la préparation du
bouillon nutritif et le repiquage des bactéries dans le milieu nutritif.
II.2.1. Préparation du milieu de culture
Un milieu tampon de deux différents mélanges à base de sels minéraux MSMA et MSMB a été
utilisé pour la culture des bactéries dégradeurs du cyanure. En effet, le MSMA est un milieu
comprenant des sources d’azote, de phosphore et des oligo-éléments alors que le MSMB
contient les métaux traces. Les deux milieux constituant le MSM (Solution Minérale
Minimale) sont le plus souvent utilisés en assainissement et gestion de site (Howard, 1995).
Notons que l’eau utilisée pour la préparation du milieu de culture était l’eau ultra-pure.
Dans des fioles de 100 mL, différentes quantités des composés permettant d’obtenir le
MSMA, milieu sélectif avec les sels suivants ont été utilisés: 0,88 g (NaH2PO4, H2O), 2,26 g
(K2HPO4), 2,05 g [(NH4)2SO4], 0,052 g (MgSO4, 7H2O) et 1 g (NaNO3).
Le MSMB, constitué de métaux traces a été par contre préparé dans une fiole unique de 100
mL. Il a été fait de: 29,03 mg (CoSO4, 7H2O), 47,43 mg [Al(SO4)2, 12H2O], 15,96 mg
(CuSO4), 28,75 mg (ZnSO4, 7H2O), 278,01 mg (FeSO4, 7H2O), 169,02 mg (MnSO4, H2O) et
48,39 mg (Na2MoO42-, 2H2O).
Dans une fiole de 1 L d’eau ultra-pure, les volumes des sels du MSMA utilisés étaient: 9,6 mL
(NaH2PO4, H2O) +19,49 mL (K2HPO4) +12,49 mL [(NH4)2SO4] +0,59 mL (MgSO4,
7H2O)+17,69 mL (NaNO3). Ce mélange a été complété avec 1 mL du MSMB et 20 g d’Agar-
agar technique puis agité et homogénéisé pendant 4-5 minutes sur une plaque chauffante. Une
fois homogénéisé, le milieu sera autoclavé à 121°C pendant au moins 3 h puis refroidi à une
température d’environ 50 °C avant l’ajustement de son pH.
II.2.2. Ajustement du pH
L’ajustement du pH se fait en milieu stérile sous la hotte ventilée « Telstar Bio II A». Il
consiste à noter le pH initial du milieu de culture, ajouter des gouttes de NaOH de
concentration 10N pour l’élever à 8,5 puis ajouter 100mL d’une solution de cyanure de
potassium KCN de concentration 23 mg/L pour le rehausser à 8,7. Enfin les gouttes de NaOH
seront une fois de plus ajoutées pour amener le pH final à 9,5. Il est à noter que l’ajout des
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gouttes de NaOH permet de stabiliser le cyanure et éviter sa volatilisation.
Dans le cadre de notre expérience, le pH initial de notre milieu de culture est égal à 6,97.
Après ajout des gouttes de NaOH à l’aide d’un embout de 100 μL, le pH est passé à 8,40 et
s’est élevé à 8,44 quand le cyanure de potassium de concentration C = 23 mg/L a été ajouté au
milieu. Enfin, les gouttes de NaOH ont porté le pH à 9,12 et le milieu a été coulé dans des
boites de Pétri qui seront ensemencées 24h plus tard.
II.2.3. Ensemencement des bactéries
Pour l’ensemencement, on a procédé à la température ambiante, en milieu stérile sous la hotte
« Flow Fast V ». Les ances de platine, préalablement stérilisées dans le stérilisateur « Stéri
Max, WLD-TEC » à très haute température, sont refroidies quelques minutes, avant
d’effectuer l’ensemencement sur les boites de pétri en faisant des stries serrés sur la première
moitié de la boite, et des stries larges sur la seconde moitié.
Après ensemencement, les boites de pétri sont induites pour incubation dans l’étuve
« MEMMERT » à 28°C pendant quinze (15) jours. Cela nous donne plusieurs colonies de
forme différente, pouvant correspondre à des espèces bactériennes.
II.2.4. Repiquage des bactéries dans le milieu nutritif
Du bouillon nutritif, « Nutrient Broth » a été préparé avec de l’eau distillée, et stérilisé à
121°C pendant 15min à l’autoclave. Après refroidissement, ce bouillon est reparti dans des
tubes à essai stériles (2/3 du volume) puis à l’aide des pipettes Pasteur, il faut racler chaque
colonie selon la forme obtenue sur la boite de pétri après ensemencement, puis agiter dans le
tube à essai contenant le bouillon nutritif. Les tubes sont ensuite incubés à 30°C pendant 24h.
Un fond trouble indique un bon développement des bactéries. Les tubes sont conservés à 4°C.
C’est ce bouillon contenant les bactéries qui sera utilisé dans la suite des manipulations.
Les différentes étapes sont résumées dans la figure 1 Ci-dessous
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Figure 1: méthode d'isolation des bactéries dégradeurs du cyanure
II.3. TEST DE BIODEGRADATION
Ce test a pour but de percevoir la capacité des bactéries à dégrader une concentration de 60
mg/L de cyanure en 24 heures. Pour cela, on a mesuré la concentration de cyanure à un temps
initial t0=0 et à un temps final tf=24h.
La concentration du cyanure a été mesurée grâce au multi paramètre, possédant une électrode
spécifique pour l’ion cyanure, qui a été préalablement calibrée avec 3 solutions étalons de
cyanure de concentrations respectives 10, 50, et 100 mg/L.
L’abattement du cyanure a été déterminé avec la formule :
Formule abattement
η= ((Ci-Cf)/Ci)*100
Ci=concentration initiale du cyanure =60mg/L
Cf=concentration finale du cyanure
II.4. CARACTERISATION DES BACTERIES
Elle consiste à identifier les familles auxquelles appartiennent les bactéries isolées.
Les méthodes microbiologiques recommandent plusieurs tests pour l’identification des
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bactéries. Mais en raison de la non-disponibilité de certains réactifs, on n’a pas pu effectuer
tous les tests.
Il faut noter que c’est la première fois, au LEDES, dans le cadre de notre étude que ces
différentes techniques d’identification ont été effectuées.
II.4.1. Caractérisation morphologique
La forme des colonies a été déterminée à l’œil nu sur la boite de pétri des bactéries isolées.
Le microscope optique a permis d’observer la forme (coque ou bacille), le mode de
regroupement (en bicoques ou en chainette), la couleur et la mobilité des bactéries.
Le test de gram est surtout utilisé dans la taxonomie. Il permet avec la reconnaissance de la
morphologie et le mode de regroupement des bactéries, de renseigner sur l’ordre dont fait
partie les bactéries étudiées. Les bactéries présentent toutes une paroi, constituée de
substance, la muréine ou peptidoglycane. Chez les bactéries Gram-, il n’y a qu’une seule ou
au plus deux couches de peptidoglycane tandis que les bactéries Gram+ en possèdent
plusieurs.
Pour ce faire, on racle une colonie bactérienne à l’aide d’une pipette Pasteur qu’on dépose sur
une lame. On y ajoute quelques gouttes de solution d’hydroxyde de potassium (KOH) 3%.
Après mélange, l’aspect gluant indique que les bactéries sont à Gram-.
II.4.2. Caractérisation culturale
Elle permet d’identifier les souches bactériennes capables de se développer dans certains
milieux spécifiques. Au total, six milieux de cultures ont fait l’objet de test sur les bactéries.
✓ Mac Conkey Agar: c’est un milieu sélectif pour les bactéries Gram-. Il permet de
différencier les bactéries capables de fermenter le lactose, par rapport à celles qui ne le
sont pas. Il permet aussi de détecter les membres de la famille des enterobacteriaceae et
les Pseudomonas Spp.
Les colonies sont de couleur rose ou rouge brique pour les bactéries positives au test, et de
couleur claire ou incolore pour celles qui sont négatives.
Les bactéries capables de fermenter ou pas le lactose sont consignées dans le Tableau 2
✓ Cetrimide Agar: Il est principalement utilisé pour l'isolement sélectif et l'identification
présomptive de Pseudomonas aeruginosa.
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Il est également utilisé pour déterminer la capacité d'un organisme à produire de la
fluorescéine et de la pyocyanine
✓ Blood Agar: La gélose au sang se compose d'une base contenant une source de protéines
(par exemple le tryptone), de la digestion des protéines de soja, du chlorure de sodium
(NaCl), de l'agar et du sang de mouton à 5%.
Blood Agar (BA) est un milieu enrichi utilisé pour cultiver les bactéries qui ne poussent pas
facilement. Ces bactéries sont appelées «fastidieuses» comme ils exigent un environnement
nutritionnel spécial, enrichi par rapport aux bactéries de routine. C'est aussi un milieu
différentiel permettant la détection d'hémolyse (destruction des RBC) par des toxines
cytolytiques sécrétées par certaines bactéries, telles que certaines souches de Bacillus,
Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus et Aerococcus.
Après le test, les résultats attendus sont consignés dans le tableau 2.
✓ Deoxycholat Agar: c’est un milieu sélectif pour l’isolement de Salmonella Spp et de
Shigella Spp. En outre, le milieu a été formulé pour augmenter la fréquence de croissance
des pathogènes les plus fastidieuse, qui dans d'autres formulations ont souvent échoué à
croître en raison de l'inclusion d'inhibiteurs trop toxiques.
✓ Pseudomonas Selective Agar: c’est un milieu qui permet d’identifier la présence des
Pseudomonas Spp.
✓ Nutrient Agar: c’est un milieu nutritif à usage général utilisé pour la culture et la
croissance d'une large gamme de bactéries non fastidieuses. Il contient de nombreux
nutriments nécessaires à la croissance bactérienne.
Il est fréquemment utilisé pour l'isolement et la purification des cultures.
II.4.3. Caractérisation biochimique
Les méthodes microbiologiques d’identification recommandent plusieurs tests. Mais vu la
non-disponibilité de certains réactifs, nous avons pu effectuer les cinq tests suivants:
a. Test de sucre
Trois sucres dont le glucose, le maltose et le sucrose ont fait l’objet de test sur les bactéries.
Ces sucres permettent de connaître la capacité des bactéries à assimiler d’autres nutriments.
Sont qualifiées de hétérotrophes, les bactéries capables d’utiliser ces sucres comme source de
carbone et d’azote.
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b. Test d’indole
Il permet d’évaluer la capacité des bactéries à transformer l'acide aminé tryptophane en indole
et l'acide pyruvique en utilisant la tryptophanase comme enzyme. Les réactifs utilisés sont le
bouillon tryptone et le Kovac.
La bactérie à tester est inoculée dans un bouillon typtone avant d’être incubée pendant une
nuit à 37°C. On ajoute quelques gouttes de réactif de Kovac. Ne pas secouer le tube et
observer le résultat.
L’apparition d’un anneau rouge indique un résultat positif, et l’incolore indique le résultat
négatif.
Le tableau 2 indique les résultats attendus à l’issu du test.
c. Test de phénylalanine
Il permet d’identifier les espèces capables de produire de l’acide pyruvique à partir de la
désamination de la phénylalanine par activité enzymatique.
Il faut inoculer la bactérie à tester dans le milieu « phénylalanine agar », et incuber à 37°C
pendant 24 heures. On ajoute après 4 à 5 gouttes d’une solution de chlorure ferrique (FeCl3)
10%. L’apparition immédiate d’une intense couleur verte indique la présence de l’acide
phénylpyruvique.
Les résultats attendus sont dans le tableau 2 ci-contre.
d) Test d’uréase
Il est effectué afin d’évaluer la capacité des bactéries à hydrolyser l’urée, avec comme
enzyme l’uréase. Le milieu est composé de 20g d’urée, 5g de chlorure de sodium, 2g de
phosphate de monopotassium, 1g de peptone, 1g de dextrose, 0.012g de rouge de phénol et
15g de Agar. Pour préparer le milieu, il faut dissoudre tous les ingrédients dans 1litre (1L)
d’eau distillée et porter à l’ébullition sur une plaque chauffante, sous agitation. Répartir
ensuite le milieu ainsi préparé dans des boites de pétri. Une fois le milieu solidifié, inoculer
les bactéries sur le milieu et incuber à 35°C pendant une semaine. La coloration du milieu en
rose indique un test positif. Un résultat négatif se traduit par une couleur incolore du milieu.
Les bactéries capables d’hydrolyser l’urée ou pas sont listées dans le tableau 2.
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e) Test de citrate de Simmons
Il permet de tester la capacité des bactéries à utiliser le citrate comme seule source de
carbone. Le milieu est composé de 5g de chlorure de sodium (NaCl), 2g de citrate de sodium
dihydraté, 1g de phosphate dihydrogène ammonium, 1g de dipotassium phosphate, 0,2g de
sulfate de magnésium heptahydraté, 0.08g de bleu de bromothymol et 15g d’agar technique.
Tous ces éléments sont à dissoudre dans un litre (1L) d’eau distillée, puis laisser sous
agitation sur une plaque chauffante jusqu’à ébullition du milieu. Répartir ensuite le milieu
ainsi préparé dans des boites de pétri. Une fois le milieu solidifié, inoculer les bactéries sur le
milieu et incuber à 35°C pendant 24 heures. Le changement de couleur du vert au bleu
indique un test positif. Le non-changement de couleur indique un test négatif.
Le tableau 2 indique résultats attendus au test de citrate de Simmons
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Tableau 2: résultats attendus des différents tests
Test/milieu Résultat Bactéries correspondantes
MacConkey Agar positif Citrobacter spp. Klebsiella spp Escherichia coli Serratia spp.
négatif Proteus spp Shigella spp Salmonella spp Edwardsiella spp, Hafnia spp., Morganella
spp., Providencia spp.
Blood Agar positif Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae et Neisseria spp, Bacillus, Streptococcus,
Enterococcus, Staphylococcus et Aerococcus
négatif -
Deoxycholat agar positif Salmonella spp, shigella spp
négatif -
Pseudomonas Agar positif Pseudomonas spp
négatif -
Cetrimide Agar positif Pseudomonas aeruginosa
négatif -
Glucose, maltose,
sucrose
positif Bactéries hétérotrophes
négatif Bactéries autotrophes
indole positif Klebsiella oxytoca, Citrobacter koseri, E. Coli, P. vulgaris, M. morganii et Providenica spp,
proteus spp sauf proteus mirabilis,
négatif Proteus mirabilis, Klebssiella pneumoniae, Citrobacter freundii,
phénylalanine Positif Proteus spp, Providencia spp
Négatif Escherichia coli, enterobacter aerogenes
Uréase Positif Proteus spp, Cryptococcus spp, Corynebacterium spp, Helicobacter pylori, Yersinia spp, Brucella spp,
Klebsiella spp, citrobacter spp
Négatif Providencia spp, Escherichia, Shigella, Salmonella
Citrate de Simmons Positif Salmonella enteritidis, Acidovorax delafieldii , Leminorella grimontii, Yokenella regensburgei, Proteus
rettger, Klebsiella spp, Serratia proteamaculans, Enterobacter spp, Citrobacter spp, Proteus spp,
Providencia spp
Négatif Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, Salmonella pullorum and Salmonella gallinarum,
Escherichia coli, Shigella spp, Edwardsiella spp, Yersinia pseudotuberculosis, Morganella morganii
Hafnia alvei, Leminorella richardii, Acidovorax facilis, Acidovorax temperans, klebsiella
rhinoscleromatis
(www.microbiologyinfo.com)
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II.4.4. Caractérisation moléculaire
Cette méthode est basée sur la biologie moléculaire. Il s’agit plus spécifiquement de
manipuler l’ADN des bactéries. Elle comprend quatre (4) étapes à savoir l’extraction de
l’ADN, le contrôle de la pureté, l’amplification par PCR, et l’électrophorèse.
Cette méthode permet d’identifier chaque espèce bactérienne en fonction du comportement du
matériel génétique.
a) Extraction de l’ADN
Le kit d’extraction d’ADN GENOMIC WIZARD a été utilisé en raison de sa simplicité. La
procédure d’extraction est fournie avec le Kit par le fournisseur.
Le protocole est fonction de la coloration en Gram des bactéries, selon qu’elle soit positive ou
négative.
Pour notre cas, les bactéries sont Gram négatives; les différentes étapes de l’extraction sont:
Introduire 1ml d’une solution de culture bactérienne dans un tube de 1.5mL de
microcentrifugation. Centrifuger ensuite à 13000-16000xg pendant 2 minutes pour sédimenter
les cellules. Retirer le surnageant.
On ajoute ensuite 600L de Nuclei Lysis Solution avant de pipeter doucement jusqu’à ce que
les cellules soient remises en suspension.
Nous avons par la suite incubé à 80°C dans un bain-marie pendant 5minutes pour lyser les
cellules avant de laisser refroidir à la température ambiante.
Il faut ajouter 3L de la solution de RNase au lysat cellulaire et inverser le tube 2-5 fois pour
mélanger.
On incube une seconde fois dans un bain-marie à 37°C pendant 15-60 minutes et faire
refroidir l’échantillon à la température ambiante.
Ajouter 200L de la solution de précipitation des protéines au lysat cellulaire traité par la
RNase. Vortexer vigoureusement à haute vitesse pendant 20 secondes pour mélanger la
solution de précipitation des protéines au lysat cellulaire.
Incuber l’échantillon sur la glace pendant 5 minutes et centrifuger à 13000-16000xg pendant
3 minutes.
Transférer le surnageant contenant l’ADN dans un tube de 1.5mL de microcentrifugation
propre contenant 600L d’isopropanol
Remarque: certains surnageant peut rester dans le tube d’origine contenant le culot de
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protéine. Laisser ce liquide résiduel dans le tube pour éviter de contaminer la solution d’ADN
avec la protéine précipitée.
Mélanger doucement par inversion jusqu’à ce que les brins d’ADN filiformes forment une
masse visible.
Centrifuger à 13000-16000xg pendant 2 minutes.
Verser délicatement le surnageant et vider le tube sur du papier absorbant propre. Ajouter
600L de 70% d’éthanol et inverser doucement plusieurs fois pour laver le culot d’ADN.
Centrifuger à 13000-16000xg pendant 2 minutes. Aspirer soigneusement l’éthanol.
Egoutter le tube sur du papier absorbant propre et laisser le culot sécher à l’air libre pendant
10-15 minutes.
Ajouter 100L de la solution de réhydratation d’ADN dans le tube et réhydrater l’ADN par
incubation à 65°C pendant 1 heure
Conserver l’ADN à 2-8°C
b) Contrôle de la pureté
Après extraction de l’ADN, un contrôle s’avère nécessaire pour vérifier sa pureté. Le
Biophotométre « eppendorf plus » a permis de vérifier la pureté. Pour cela, une dilution a été
effectuée; 5L d’ADN + 195L de la solution de réhydratation. Un blanc constitué
uniquement de la solution de réhydratation doit être effectué avant de commencer les
mesures. A la longieur d’onde de 160nm, l’appareil donne la concentration de l’ADN en
g/ml; il donne également les coefficients A230, A260, A280, A340, représentant respectivement
les coefficients de l’ARN, de l’ADN, des protéines et des oligo-éléments. Les rapports
ADN/protéines et ADN/ARN sont fournis par l’appareil. En biologie moléculaire, ces
rapports doivent être dans l’intervalle 1,5-2 afin de qualifier l’ADN de pure.
c) Amplification par PCR
L’amplification en chaîne par polymérase ou réaction en chaîne par polymérase (PCR)
consiste à dupliquer en grand nombre les brins d’ADN. Pour cela, un thermocycleur
« TECHNE TC-5000 » a été utilisé.
Avant d’introduire les échantillons dans le thermocycleur, on doit utiliser un micro-tube
stérile de 300 L par échantillon dans lequel on ajoute 12,5L de Master mix + 12,5L de
primer + 3L de l’ADN amplifié. C’est cet échantillon qui sera introduit dans le
thermocycleur pour amplification.
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Pour le primer, nous avons utilisé le primer universel. Son rôle permet de situer le poids
moléculaire des bactéries, et si tel est le cas, alors le primer est adapté aux bactéries. Il a deux
caractéristiques : le sens (F) est caractérisé par 1387 paires de bases et le anti-sens (R) par 930
paires de bases. La différence entre ces deux caractéristiques nous donne une idée du poids
moléculaire des bactéries.
La PCR a été paramétrée pour une dénaturation initiale de 2 mn à 94°C, suivie de 30 cycles
de 1mn à 94°C, 2mn à 50°C et à 4mn à 72°C avec une extension finale de 4mn à 72°C.
N.B: après amplification par PCR, un séquençage des brins d’ADN serait judicieux afin
de spécifier avec précision chaque espèce. Mais en raison du manque de matériel
adéquat à notre disposition, nous n’avons pas pu effectuer cette manipulation.
d) Electrophorèse sur gel d’agarose
Après amplification, l’échantillon est soumis à une électrophorèse à 15mA, sur gel d’agarose.
Ce dernier est préparé à 1% dans 0.5* TBE buffer, auquel on ajoute 5L de bromure de
titium. Cette électrophorèse permet la migration des brins d’ADN en fonction de leur poids
moléculaire à travers un champ électrique.
On a utilisé un indicateur de poids moléculaire. Il permet de lire le nombre de paires de bases
de l’ADN extrait. Nous avons également utilisé l’ADN des bactéries E-coli comme témoin
positif, afin de savoir si il y a eu amplification de l’ADN et de l’eau distillée comme témoin
négatif qui permet de détecter l’absence d’ADN.
L’appareil DOC-PRINT VX2 permet de visualiser les résultats de la migration.
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III. RESULTATS ET DISCUSSION
III.1. ISOLATION DES BACTERIES
Les résultats de nos analyses ont montré la présence des espèces bactériennes capables de
dégrader le cyanure. En effet, la présence des bactéries capables de croitre en milieu cyanuré
a été observée. Cette présence se traduit par la formation des colonies bactériennes de
plusieurs formes à savoir les formes circulaire, fusiforme, irrégulière, punctiforme et rhizoïde.
A travers ces formes, nous avons pu isolées 20 échantillons. Ces résultats complètent ceux de
Sawadogo N. (2015) qui s’est limitée à la couleur blanchâtre, luminescentes et la taille
variable des bactéries.
III.2. CARACTERISATION DES BACTERIES
III.2.1. Caractérisation morphologique
La forme des colonies a été observée à l’œil nu. Au total, Cinq (5) formes ont été observées à
savoir les formes circulaire, rhizoïde, irrégulière, punctiforme et fusiforme. La figure 2
suivante nous montre les différentes formes observées.
Nous avons pu avoir au total 20
Figure 2: forme des colonies
Après observation microscopique, les bactéries présentent sur les deux sites ont deux
formes : la forme bacille et la forme coque. Celles qui sont sous forme de coque sont
regroupées en bicoque et chaînette, et sont mobiles.
La figure 3 nous montre les observations au microscope.
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Figure 3: forme microscopique des bactéries
L’ensemble des résultats morphologiques sont consignés dans le tableau 3.
Ce tableau nous donne la forme des colonies bactériennes, la forme des bactéries après
observation microscopique, leur mode de regroupement, leur mobilité et les résultats du test
de Gram.
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Tableau 3: récapitulatif des caractéristiques morphologiques
Site Saison Nature
échantillon
Forme colonie Forme
bactérienne
Mode de regroupement Mobilité
des
bactéries
Test de
Gram
Zo
ug
na
zag
milin
e
S.P Sol circulaire Coque
Bacille
bicoque chainette + -
Rhizoïde -
S.S Sol Circulaire Coque
Bacille
Bicoque
Chainette
+ -
punctiforme
Irrégulière
fusiforme -
Eau Circulaire Coque
Bacille
Bicoque
Chainette
+ -
irrégulière
punctiforme
fusiforme
rhizoïde -
GA
LG
OU
LI
S.P Sol Circulaire Coque
Bacille
Bicoque
Chainette
+ -
fusiforme
Irrégulière -
S.S Sol Circulaire Coque
Bacille
Bicoque
Chainette
+ -
Fusiforme
Irrégulière
Punctiforme -
Eau Circulaire Coque
Bacille
Bicoque
Chainette
+ -
Punctiforme -
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III.2.2. Test de biodégradation
Chaque type de bactérie a été isolé selon la forme de la colonie. Sur nos vingt (20)
échantillons isolées, un test de biodégradabilité a été effectué pendant 24h (à un temps initial
t0 et à un temps final tf=24h). Les différents résultats consignés dans le tableau 4 nous
montre un abattement de cyanure supérieur à 99%.
On conclut que toutes les bactéries formant plusieurs colonies sont effectivement capables de
dégrader le cyanure. Ce qui confirme les travaux de SAWADOGO N. (2015).
Tableau 4: Abattement du cyanure
site saison Nature échantillon Forme colonie Abattement cyanure η
ZO
UG
NA
ZA
GM
ILIN
E
S.P Sol Circulaire 99.96
Rhizoïde 99.96
S.S Sol Circulaire 99.88
punctiforme 99.87
irrégulière 99.87
fusiforme 99.95
Eau circulaire 99.90
irrégulière 99.93
punctiforme 99.91
fusiforme 99.89
Rhizoïde 99.89
GA
LG
OU
LI
S.P Sol circulaire 99.88
fusiforme 99.87
irrégulière 99.87
S.S Sol circulaire 99.95
fusiforme 99.80
irrégulière 99.96
punctiforme 99.95
Eau circulaire 99.84
punctiforme 99.92
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III.2.3. Caractérisation culturale
Après incubation dans les six milieux de culture à savoir MacConkey agar, Nutrient agar,
Blood agar, Deoxycholat agar, Cetrimide agar et Pseudomonas selective agar, la présence des
colonies a été observée. Le résultat positif (+) indique la présence des colonies, et le résultat
négatif (-) indique l’absence des colonies. Les résultats sont consignés dans le tableau 5.
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Tableau 5: caractérisation culturale
A chaque test sur milieu de culture, correspond des espèces bactériennes selon que le
test soit positif ou négatif. En faisant le croisement des résultats du tableau 2, nous
sommes abouti aux différentes espèces susceptibles d’être présentes sur le site. Les
résultats sont consignés dans le tableau 6 ci-dessous.
site
saison Nature
échantillon
Forme
colonie
MacConkey
agar
Nutrient
agar
Blood
agar
Deoxycholat
agar
Cetrimide
agar
Pseudomonas
agar
ZO
UG
NA
ZA
GM
ILIN
E
S.P Sol Circulaire + + + + - -
Rhizoïde + + + + + +
S.S Sol Circulaire + + + + + +
Punctiforme + + + + + +
Irrégulière + + + + + +
Fusiforme + + + + + +
Eau Circulaire + + + + + +
Irrégulière + + + + + +
Punctiforme + + + + + +
Fusiforme + + + + - +
Rhizoïde + + + + + +
GA
LG
OU
LI
S.P Sol Circulaire + + + + + +
Fusiforme + + + + + +
Irrégulière + + + + + +
S.S Sol Circulaire + + + + - +
Fusiforme + - + + + +
Irrégulière + + + + + +
Punctiforme + - + + + +
Eau Circulaire + + + + + +
Punctiforme + + + + + +
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Tableau 6: caractéristiques culturales et bactéries correspondantes
site saison Nature
échantillon
Forme colonie espèces susceptibles d’être présentes
ZO
UG
NA
ZA
GM
ILIN
E
S.P Sol Circulaire Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,
staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella
Rhizoïde Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,
staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas
dont P.aeruginosa
S.S Sol Circulaire Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,
staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas
dont P. aeruginosa
punctiforme
irrégulière
fusiforme
Eau circulaire Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,
staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas
dont P. aeruginosa
irrégulière
punctiforme
fusiforme Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,
staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas
Rhizoïde Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,
staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas
dont P. aeruginosa
GA
LG
OU
LI
S.P Sol circulaire Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,
staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas
dont P. aeruginosa
fusiforme
irrégulière
S.S Sol circulaire Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,
staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas
fusiforme Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,
staphylococcus, aerococcus,shigella, salmonella, Pseudomonas
dont P. aeruginosa
irrégulière
punctiforme
Eau
circulaire Citrobacter, klebsiella, serratia, streptococcus, enterococcus,
aerococus staphylococcus, shigella, salmonella, Pseudomonas
dont P.aeruginosa
punctiforme
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30
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III.2.4. Caractèrisation biochimique
a) Test de sucre
Toutes les bactéries ont été capables de croître dans les 3 milieux sucrés à savoir le
glucose, le sucrose et le maltose. On conclut que les bactéries sont donc capables
d’utiliser d’autres sources de carbone que le dioxyde de carbone (CO2). Ce sont donc
des bactéries hétérétrophes.
b) Test d’indole
Lorsqu’il est positif, un anneau rouge se forme au sommet du tube à essai après
introduction du réactif de Kovac. Une couleur incolore s’observe lorsque le test est
négatif. La figure 4 nous montre l’aspect positif et négatif du test.
Figure 4: aspect test d'indole
c) Test de phénylalanine
Lorsqu’on ajoute quatre (4) à cinq (5) gouttes de 10% de chlorure ferrique sur une
colonie bactérienne, elle se colore en vert si le test est positif.par contre, elle reste
incolore lorsque le test est négatif. La figure 5 ci-dessous nous montre l’aspect des
résultats.
Figure 5: aspect test de phénylalanine
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31
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d) Test d’uréase
Lorsqu’il est positif, le milieu se colore en rose. Et si le test est négatif, la couleur du
milieu reste inchangée; le milieu reste beige. La figure 6 suivante nous montre
l’aspecdes résultats.
Figure 6: aspect test d'uréase
e) Test de citrate de Simmons
Les bactéries présentes sur les deux sites sont toutes capables d’utiliser le citrate comme
unique source de carbone. La figure 7 suivante nous montre l’aspect de ce test
Figure 7: test de citrate de Simmons
Le tableau 7 ci-dessous nous donne le résultat des différents tests biochimiques.
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
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32
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Tableau 7: résultats tests biochimiques
site saison Nature
échantillon
Forme
colonie
indole phénylalanine uréase Citrate de
Simmons
ZO
UG
NA
ZA
GM
ILIN
E
S.P Sol Circulaire + + + +
Rhizoïde + + - +
S.S Sol Circulaire + - - +
punctiforme + - - +
irrégulière - + + +
fusiforme + + + +
Eau circulaire + - + +
irrégulière + - + +
punctiforme + + + +
fusiforme - - + +
Rhizoïde + + + +
GA
LG
OU
LI
S.P Sol circulaire + + + +
fusiforme - + - +
irrégulière + + + +
S.S Sol circulaire + + + +
fusiforme + + + +
irrégulière + + + +
punctiforme + + - +
Eau circulaire + + + +
punctiforme + + + +
A chaque résultat de test biochimique, correspond une espèce bactérienne. Les résultats
du croisement effectué entre ces résultats et le tableau 2, des différentes espèces
bactériennes pouvant correspondre aux tests biochimiques sont consignés dans le
tableau 8.
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
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33
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Tableau 8: espèces probables aux tests biochimiques
Site saison Nature
échantillon
Forme
colonie
Espèces probables
ZO
UG
NA
ZA
GM
ILIN
E
S.P Sol Circulaire Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri
Rhizoïde Providencia, citrobacter, klebsiella,
S.S Sol Circulaire Klebsiella oxytoca, morganella, providencia,
punctiforme Klebsiella oxytoca, morganella, providencia,
irrégulière Proteus, klebsiella pneumoniae, citrobacter koseri
fusiforme Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri
Eau circulaire morganella, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri
irrégulière morganella, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri
punctiforme Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri
fusiforme Klebsiella pneumoniae, proteus mirabilis, citrobacter
freundi, morganella
Rhizoïde Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri
GA
LG
OU
LI
S.P Sol circulaire Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri
fusiforme Providencia, citrobacter, klebsiella pneumoniae
irrégulière Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri
S.S Sol circulaire Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri
fusiforme
irrégulière
punctiforme Providencia, citrobacter, klebsiella
Eau circulaire Proteus, klebsiella oxytoca, citrobacter koseri
punctiforme
En combinant les résultats des tests morphologiques, culturaux et biochimiques,
plusieurs espèces peuvent donner la même forme de colonie ; de même, la même espèce
peut se regrouper en colonie de forme différente. A partir du tableau 2, nous avons
effectué un croisement des résultats de tous les tests à savoir les tests sur milieux de
culture (tableau 6), les tests biochimiques (tableau 8). La combinaison de ce croisement
et des caractérisations morphologiques (tableau 3) nous a permis d’identifier certaines
espèces bactériennes. (voir tableau 9)
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
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Tableau 9: récapitulatif des différents tests d'identifications microbiologiques
site saison Nature
échantillon
Espèces probables
ZO
UG
NA
ZA
GM
ILIN
E
S.P Sol Klebsiella oxytoca, staphylococcus Sp, Pseudomonas Sp
S.S Sol Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
Sp, Staphylococcus Sp
Eau Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, pseudomonas
spp, staphylococcus Sp
GA
LG
OU
LI
S.P Sol Klebsiella oxytoca, klebsiella pneumoniae, pseudomonas
Sp, staphylococcus Sp
S.S Sol Klebsiella oxytoca, pseudomonas Sp, staphylococcus Sp
Eau Klebsiella oxytoca, pseudomonas Sp, staphylococcus Sp
Ces différents résultats nous montre que nous avons les mêmes espèces bactériennes
aussi bien dans les échantillons des sols que dans les eaux. Cela confirme les résultats
de Sawadogo N.(2015) qui a tirée les mêmes conclusions.
En effet, la bibliographie a montré que ces espèces identifiées et formant le consortium
de bactéries extraites des sites d’orpaillage étaient toutes capables de dégrader le
cyanure.
Klebsiella oxytoca a été montré comme bactérie capable de dégrader le cyanure contenu
dans des échantillons d’eaux usées et de sol pollué des industries minières, en présence
du glucose comme nutriment. le meilleur taux de dégradation d’une concentration de
280mg/L d’une solution de cyanure de potassium était de 50%, obtenu à un pH
optimum=7 (Avalos et al., 1990).
L’espèce klebsiella pneumoniae est une espèce très efficace dans la dégradation du
cyanure. En effet, Ingvorsen et al (1991) a travaillé sur des échantillons d’eau et de sol
industriels contaminé par le cyanure de sodium à une concentration de 245mg/l. Il a
montré que l’espèce Klebsiella pneumoniae, à un pH optimum de 7,8 dégradait jusqu’à
99% de la concentration.
L’espèce Pseudomonas est reconnue pour son pouvoir épurateur de cyanure. En effet,
Parmar et al (2012) a travaillé sur des sites industriels en Inde pollués par le cyanure ; il
a montré qu’à pH optimal =8,5, les bactéries arrivent à dégrader 80% d’une
concentration de 100mg/L de cyanure de potassium. Il a ensuite effectué les différents
tests d’identification qui ont montré que ces bactéries étaient des espèces Pseudomonas.
Isolation et identification des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure: cas des sites
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35
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Meyer (2010) a utilisé aussi les pseudomonas dans des conditions acides avec une
concentration de 400 mg/L de cyanure. Il a obtenu une rendement de dégradation de
79%, à un pH optimum=5.
L’espèce staphylococcus est également une bactérie capable de dégrader le cyanure. En
effectuant la biodégradation sur membrane d’ultrafiltration, Kowalska (1996) a obtenu
un taux d’abattement de 20,3% lorsque le pH est optimisé à 7,5.
Le tableau 10 nous donne un récapitulatif de toutes ces espèces
Tableau 10: récapitulatif des espèces bactériennes dégradeurs du cyanure
Espèce pHoptimum Abattement (%) Référence
Klebsiella oxytoca 7 50
99
Avalos (1990)
Ingvorsen et al (1991) Klebsiella pneumoniae 7.8
Pseudomonas spp 8.5
5
80
79
Parmar et al (2012)
Meyer (2010)
Staphylococcus spp 7.5 20.3 Kowalska (1996)
Toutes ces études ont montré que le pH optimum pour chaque espèce formant le
consortium est fixé et varie du milieu acide pH=5 au milieu basique pH=8,5. Ces
résultsts expliquent ceux de Ibrahima Agoumo (2017) qui a montré qu’à plusieurs
valeurs du pH (5 ; 7 ; 9,5 ; 10,5), nous avons un taux d’abattement minimal de 95%.
Après ces résultats microbiologiques, nous passons aux résultats obtenus par la biologie
moléculaire
III.2.5. Caractérisation moléculaire
a) Extraction de l’ADN
Pour tous les échantillons extraits, on a obtenu l’ADN sous forme de brins filiformes,
formant une masse blanche visible. La figure 8 ci-contre nous montre l’aspect de l’ADN
extrait.
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b) Vérification de la pureté d’ADN
Le biophotomètre a donné des coefficients A260/A230 et A260/A280 représentant
respectivement les rapports ADN/ARN et ADN/Protéines, ainsi que la concentration de
l’ADN
Pour l’ensemble des échantillons, l’ADN extrait a des valeurs ADN/ARN et
ADN/Protéines comprises entre 1.5 et 2 comme le montre le tableau 10. On conclut que
l’extraction a été bien faite puisque les différents coefficients respectent les normes de
biologie moléculaire qui exige que ces valeurs soient comprises entre 1,5 et 2.
Figure 8: aspect ADN extrait
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Tableau 11: coefficients ADN/ARN et ADN/Protéines
site Saison Forme
colonies
A260/A230 A260/A280 Concentration
μg/mL
ZO
UG
NA
ZA
GM
ILIN
E
Pluvieuse
sol
Circulaire 1.65 1.79 562.2
Rhizoïde 1.49 1.53 546.1
Sèche-
sol
Circulaire 1.75 1.89 253.7
punctiforme 1.53 1.67 374.5
irrégulière 1.57 1.72 285.6
fusiforme 1.68 1.71 148.3
Sèche-
eau
circulaire 1.68 1.71 148.3
irrégulière 1.53 1.73 815.7
punctiforme 1.72 1.81 828.1
fusiforme 1.68 1.73 594.4
Rhizoïde 1.66 1.77 336.4
GA
LG
OU
LI
Pluvieuse
sol
circulaire 1.65 1.79 951.4
fusiforme 1.73 1.84 634.6
irrégulière 1.54 1.69 620.2
Sèche-sol circulaire 1.61 1.69 789.7
fusiforme 1.70 1.87 735.7
irrégulière 1.83 1.82 668.1
punctiforme 1.98 1.86 188.1
Sèche-
eau
circulaire 1.68 1.66 298.4
punctiforme 1.69 1.77 367.6
c) Amplification et électrophorèse
Après amplification et électrophorèse, on a observé les résultats de la migration.
La figure 9 suivante nous montre les résultats de cette migration.
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Figure 9: résultat amplification
La flèche + (verte) ou numero 8 indique le contrôle positif et la flèche – (rouge) ou
numero 7 indique le contrôle négatif. Le numéro 1 indique le marqueur de poids
moléculaire. Les traces obtenues pour nos différents échantillons ont montré un
resultat similaire à la plage positif. Cela signifie que l’amplification a bien eu lieu dans
tous les échantillons.
le marqueur de poids moléculaire a pour rôle d’indiquer le poids de l’ADN. Son échelle
est donné par le fournisseur. Dans notre cas, il nous montre que l’ADN extrait de nos
bactéries a le même nombre de paire de bases, situé entre 250 et 500. Nous remarquons
que le poids pour nos bactéries est autour des 500.
Pour les caractéristiques du primer, la différence a donné 457 paires de bases. Ce qui
nous permet de conclure que le poids moléculaire des bactéries est bien situé entre 250
et 500 paires de bases, et que le primer est adapté à nos bactéries.
Vu la non possibilité d’accès aux banques de données génomiques des différentes
bactéries, nous n’avons pas pu approfondir l’interprétation de nos résultats.
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IV. CONCLUSION
La croissance de l’orpaillage au Burkina Faso entraine des dommages collatéraux sur
l’environnement comme la pollution des ressources en eaux et du sol. Des procédés
biologiques de traitement présentent une bonne alternative pour la réhabilitation par
rapport aux procédés chimiques qui sont plus couteux. Mais pour cela, il est nécessaire
de connaître les bactéries qui interviennent dans la bioremédiation.
Notre étude s’est focalisée sur l’isolation et l’identification des bactéries présentes sur
les sites capables de dégrader le cyanure.
Les bactéries contenues dans les échantillons provenant des eaux et du sol des deux
sites ont été isolées dans un milieu spécifique aux bactéries capables de dégrader le
cyanure. Plusieurs formes de colonies ont été obtenues à savoir fusiforme, circulaire,
irrégulière, punctiforme et rhizoïde. L’identification à travers les méthodes
microbiologiques et biologiques ont permis d’identifier trois familles bactériennes à
savoir les pseudomonas spp, les klebsiella spp et les staphylococcus spp.
La particularité de cette étude réside dans le fait que le consortium de bactéries capables
de dégrader le cyanure a été isolé et par la suite identifiée par rapport à la forme des
colonies. Nous avons effectué le test de biodégradabilité ; tous les 20 échantillons ont
été capables de dégrader jusqu’à 99,8% de 60 mg/L de cyanure. Les différentes
méthodes d’identification ont limité le nombre de bactéries à quatre espèces. La
bibliographie a montré le pouvoir épurateur de ces espèces.
Ces résultats pourront être utilisés par la suite, pour le séquençage de l’ADN.
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V. RECOMMANDATIONS /PERSPECTIVES
Afin de compléter cette étude, il faut identifier l’espèce la plus potentielle qui mérite
d’être favorisée pour la bioremédiation des deux sites. Cela permettrait de savoir
l’espèce qui se trouve majoritairement sur chaque site, de prédire son comportement et
de contrôler le nombre afin de respecter l’équilibre microbiologique du milieu.
De plus, une carte représentant la dispersion des bactéries est nécessaire pour
comprendre leur comportement vis-à-vis du cyanure. Pour se faire, un maillage de 100 à
250 mètres doit être effectué afin d’obtenir des résultats fiables.
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Annexe : quelques matériel et appareils utilisés
Figure 10: aspect kit d'extraction
Figure 11: appareil d'amplification par PCR
Figure 12: appareil électrophorèse