Asthme
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006 Développement d’une chimiokine d’origine eucaryote PARC : production, purification, validation
B. Legendre, G. Kervoaze, H. Vorng, A. Tsicopoulos, P. Lassalle
Introduction : L’augmentation de la prévalence des maladiesallergiques constitue un véritable problème de santé publique.Aujourd’hui, 1 français sur 5 est atteint d’allergie, dont la moitiétouche le système respiratoire.Parmi les médiateurs de l’inflammation, les chimiokines jouent unrôle important dans de nombreuses pathologies. Parmi ces chimio-kines, le PARC est secrété en réponse à des cytokines Th2 non seu-lement dès l’intrusion de l’allergène, mais aussi beaucoup plustardivement, ce qui pourrait l’inclure dans le processus pérennisantla réponse allergique.Le PARC a été découvert chez l’humain, et ne connaît pasaujourd’hui d’homologue chez d’autre espèce, son récepteur étanttoujours inconnu. En outre, il a été montré que le PARC est préfé-rentiellement exprimé au niveau pulmonaire, et est largement aug-menté dans les LBA de patients allergiques. Il a été décrit que lePARC est capable d’attirer des cellules T naïves, Th2, basophiles.Afin d’étudier au plus près les comportements de la chimiokinenaturelle, nous avons développé une chimiokine produite dans unsystème eucaryote, permettant la comparaison des fonctions biolo-giques de notre protéine avec celle commerciale (procaryote).Méthodes : Le PARC est produit par une lignée transfectée deCHO-DG44. La protéine pure est obtenue par une purificationséquentielle sur HiTrap SP, suivi d’une Gel Filtration sur unecolonne de Séphacryl S-100®. Le dosage du PARC est réalisé parELISA sandwich (R&D). La pureté est vérifiée par SDS-PAGE18%, suivi d’une révélation au nitrate d’argent. Les celluleT CD4+CD45+ (naïves) sont obtenues par purification de PBMCsur colonne MACS®. Les tests de chimiotaxie sont menés en cham-bre de Boyden.Résultats/Conclusion : Nous avons obtenu une chimiokined’origine eucaryote pure (pas de bande parasite avec le SDS-PAGE). Les premiers résultats des tests de fonctionnalité compara-tifs tendent à montrer que notre chimiokine d’origine eucaryotepossède une activité biologique in vitro similaire à celle d’origineprocaryote. Toutefois, nous notons une tendance dans la concen-tration d’efficacité maximale qui serait 10 fois inférieure à celled’origine procaryote. En effet, nous observons un maximum demigration à 10-8 mol.L-1, pour la chimiokine procaryote, contre10-9 pour notre PARC sur les T naïfs. Toutefois, il est encorenécessaire d’effectuer d’autres tests de fonctionnalité afin de confir-mer ces résultats, et de pouvoir comparer ces comportementsin vitro à ceux décrits dans la littérature.
007 Caractérisation des cellules Natural Killer humaines après migration transendothéliale
M. Barrier, L. Amniai, C. Ple, P. Marquillies, P. Lassalle, C. Duez
Introduction : Décrites à l’origine comme des cellules impliquéesdans la réponse immunitaire innée anti-tumorale et anti-bacté-rienne, les cellules Natural Killer (NK) sont également capables deréguler l’immunité acquise, notamment en produisant des cytoki-nes. Le rôle des cellules NK dans l’asthme allergique demeureméconnu. Cependant, chez les patients asthmatiques allergiques, lenombre de cellules NK2 circulantes produisant de l’IL-4 est aug-menté en comparaison des individus non allergiques. Les cellulesNK sont capables de migrer du sang vers les sites inflammatoires(poumons) ou les organes lymphoïdes secondaires.Notre objectif était d’évaluer : (1) la capacité des cellules NK, puri-fiées de donneurs allergiques ou non allergiques, à migrer au traversde l’endothélium vasculaire ; et (2) de comparer les changementsphénotypiques induits par la migration.Méthodes : Un modèle de migration transendothéliale de cellulesNK a été mis au point (conditions de culture, d’activation, concen-trations de chémoattractant, etc.). Les cellules endothéliales ont étépurifiées à partir de veine de cordon ombilical (HUVEC) et culti-vées en monocouche sur Transwell®. Les cellules NK ont été puri-fiées du sang de patients allergiques ou non allergiques à l’aide debilles magnétiques. Le phénotype des cellules NK après migration aété analysé par cytométrie en flux.Résultats : Dans un premier temps, nous avons montré que l’effi-cacité de migration trans-endothéliale des cellules NK, purifiées desujets non allergiques, est maximale quand les cellules endothélialessont préactivées avec du TNF-α et que la chimiokine SDF-1α estutilisée. De plus, la migration transendothéliale des cellules NK estLFA-1 dépendante. L’analyse phénotypique des cellules NK montreune augmentation de l’expression du CD69 ainsi que du CD86,suggérant une activation des NK, tandis que l’expression duCD107a membranaire, du CD16 et du CD54 demeure inchangée.Des analyses similaires sur des cellules purifiées de patients allergi-ques sont actuellement en cours.Conclusion : Ce travail permettra de comparer la capacité demigration et l’activation des cellules NK de donneurs allergiques ounon allergiques au travers d’un endothélium activé.
INSERM U774, Institut Pasteur, Lille, France.
Inserm U774, Biomolécules et Inflammation Pulmonaire, IFR 142, Institut Pasteur de Lille, France.
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