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Soutenue le : 24 / 06 / 2009
REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE MENTOURI CONSTANTINE
FACULTE DES SCIENCES EXACTES
DEPARTEMENT DE CHIMIE
Mmoire
Prsent pour Lobtention du diplme de Magisteren chimie organiqueoption : Substances thrapeutique dorigine naturelle
Caractrisation chimiquedes principes effet antidermatophyte des racines
dAnacyclus pyrethrum
L.
Prsente Par : sous la direction du :
Melle Hamimed Souad Dr :Belkhiri Abdelmalik
Devant le jury :
Prsident : Mr Belattar Abdelhamid Prof.Dpt de Chimie, UMC
Rapporteur : Mr Belkhiri Abdelmalik MC.Dpt de Pharmacie, UMC
Examinateurs : Melle Kabouche Zahia Prof.Dpt de Chimie, UMC
Mr Boulebda Nadji MC.Dpt de Pharmacie, UMC
N dordre :Srie :
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I
Remerciements :Mes remerciements sont d'abord au Dieu de m'avoir donner la force et le courage ncessaire
pour mener ce travail bout.
Ce mmoire n'aurait pu voir le jour sans la participation de nombreuses personnes, je vais
m'essayer trouver les mots justes pour exprimer spcifiquement mes reconnaissances tous
ceux qui ont contribus de prs ou de loin ce travail.
mon directeur de thse, Monsieur Belkhiri Abdelmalik, Docteur dEtat et Matre de
confrences au Dpartement de Pharmacie, Facult de Mdecine. Universit Mentouri
Constantine. Vous m'avez initi la recherche.V
otre orientation ma t trs bnfique
pour la ralisation de ce travail,V
otre rigueur et faon de travailler, mas permis d'tre
plus attentif et critique vis--vis de mon travail. Mercipour votre patience dans la
correction de ce mmoire.
J espre avoir t la hauteur de votre attente.
Mes remerciements vont aussi aux membres de mon jury de mmoire,
Monsieur, le ProfesseurBelattar Abdel Hamid
, Vous me faites un trs grand
honneur en acceptant de prsider ce jury ;
Mademoiselle, le Professeur Kabouche Zahia, responsable de ma promotion, recevez
ici lexpression de ma profonde gratitude. Je vous remercie vivement pour me faire
lhonneur de participer ce jury. Cest grce votre bienveillance que jai pu raliser
certaines analyses physico-chimiques.
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II
Monsieur, le Dr Boulebda Nadji, Matre de confrences, biologiste et pharmacologue
au dpartement de pharmacie de Constantine, je vous remercie pour les discussions
enrichissantes dans le domaine de la biologie, pour votre coute et votre gentillesse.
Au chef de service du laboratoire de parasitologie du Centre hospitalo-universitaire de
Constantine, le Professeur Moulahem Tayeb, quil trouve ici toute ma gratitude pour nous
avoir fournis les souches fongiques.
Au A. Lobstein, Professeur de pharmacognosie, facult de pharmacie de Strasbourg
(France), pour sa collaboration dans la ralisation des spectres de masse.
Nos remerciements vont aussi :
Monsieur Ben Abbes Badr-ezamane, responsable du laboratoire de parasitologie, pour
avoir superviser les tests dactivit antimycosique ;
Monsieur Touil Ahmed, Merci pour votre gentillesse et votre aide dans la ralisation
danalyses physico-chimiques.
Je remercie tous mes amis et camarades chimistes, Notamment Ma trs chre amie Warda,
collgue du labo, avec qui j'ai pass de trs bons moments inoubliables en ralisant ce
travail dans une ambiance damiti. Merci pour ton encouragement et ton soutien moral
depuis le jour o nos chemins se sont croiss.
Enfin,Je ne saurais oublier Monsieur Sami et Mademoiselle Wided qui ont contribu la
ralisation de ce modeste travail.
Merci tous.
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III
Ddicaces :Ce qui sont les plus chers au monde, mes parents :
mon pre, pour m'avoir soutenu moralement et matriellement jusqu' ce jour.
Pre, ce travail est le tien.
ma mre, voici l'aboutissement de tes nombreuses nuits de prires de ta
sagesse et ta gnrosit pour votre petite fille. Chre mre, ce travail est le fruit
de tes efforts.
mon frre Mohamed, le chemin est dur et encore long, il faudrait du courage
et beaucoup de chance, que dieu vous garde.
J e noublie jamais la gnrosit illimite de mes surs :
Khadidja, Houria, Warda, Nour elhouda et Hanen.
Leurs soutien moral et financier, sans lesquels je naurais pu continuer mes
tudes dans de bonnes conditions, tous simplement je voudrais leurs dire je les
aimes de tout mon cur. . . .
A mes neveux et nices :
Je vous souhaite beaucoup de chance. Jespre que vous allez suivre les pas de
votre tante, que Dieu vous protge.
Souad
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ii
Etude des mtabolites secondaires isoles de la plante.II
les Terpnoides.
III 1 Introduction.------------------------------------------------------------------------------------- 24III 2 Classification structurale et biosynthse des Triterpnes.----------------------- 24III 3
abc
Mthodes danalyses des Triterpnes :292930
Analyse par Infra Rouge (IR).----------------------------------------------------Analyse par rsonance magntique nuclaire (RMN).----------------------Analyse par spectroscopie de masse (SM).---------------------------------------
III 5 Proprits biologiques et pharmacologiques des Triterpnes.------------------- 31
les Coumarines.
III 1 Dfinition.--------------------------------------------------------------------------------------- 32III 2 les coumarines dans le rgne vgtal.-------------------------------------------------- 32III 3
IIIDiversit structurale des coumarines:
343535
35363737
3 1 Coumarines Simples.--------------------------------------------------------3 2 Coumarines Prnyles. ----------------------------------------------------3 3 Furanocoumarines (Linaires et Angulaires). --------------------3 4
IIIIII
Pyranocoumarines :33
44
12
Pyranocoumarines simples.--------------------Dipyranocoumarines.----------------------------
3 5 Coumarines ltat dimrique (Bicoumarines).-------------------3 6 Coumarines ltat trimrique (Tricoumarines).-----------------
III 4ab
Etude de la voie de Biosynthse des coumarines :3739
Biosynthse des coumarines simples. -------------------------------------------Biosynthse des furanocoumarines. ---------------------------------------------
III 5abcde
Analyse structurale des coumarines :4141414242
Fluorescence sous la lumire UV.-------------------------------------------------Spectroscopie infrarouge IR.--------------------------------------------------------Spectroscopie ultraviolette UV.----------------------------------------------------Spectroscopie de rsonance magntique nuclaire RMN.-----------------La spectromtrie de masse des coumarines.-------------------------------------
III
6 Intrt pharmacologique des coumarines.-------------------------------------------- 43
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iii
2
me
Partie : Partie Exprimentale.
I Matriel vgtal.---------------------------------------------------------------------------------- 45
II
Mthode dExtraction. ------------------------------------------------------------------------- 45III IIIIII
IIIIII
Mthodes chromatographiques :46
47484849
12
IIIIII34
Chromatographie sur couche mince (CCM) analytique.----------------Chromatographie sur colonne de gel de silice (CC) :
22
12
Fractionnement de l'extrait DCM.----------------------Fractionnement de l'extrait EtOH.---------------------
Chromatographie sur plaques prparatives.--------------------------------Ractifs de rvlation utiliss en CCM.-------------------------------------
IV Analyses microchimique didentification.----------------------------------------- 50V
VVVV
Mthodes danalyse spectroscopiques :
50505151
1234
Spectroscopie UV visible.--------------------------------------------------------Spectroscopie infrarouge (IR).-----------------------------------------------------Spectroscopie de rsonance magntique nuclaire (RMN 1H).---------Masse spectroscopique (MS).-------------------------------------------------------
VI VIVI
VIVIVIVI
Activit antidermatophyte :51
12ab
c3456
Prparation du milieu de culture.------------------------------------------------Prparation des solutions tester :
Extraits vgtau et fractions enrichies.--------------------------------Solution de rfrence.------------------------------------------------------------
Contrle.------------------------------------------------------------------------------
5252
52Prparation des plaques multi uits.--------------------------------------------Prparation de linoculant fongique.--------------------------------------------Mesure de lactivit antifongique.-----------------------------------------------Traitement statistique des donnes.---------------------------------------------
52525353
3
me
Partie : Rsultats et Discussion.
I
Obtention des extraits bruts dAnacyclus pyrethrum.------------------------------ 54II Criblage biologique prliminaire des extraits bruts.---------------------------------- 56III
IIIIII
Etude phytochimique approfondie de lextrait actif DCM :58
61
65
12
III
III
Analyses microchimique et chromatographique.---------------------------Fractionnement bio guid de l'extrait DCM :2
2
1
2a
Evaluation de lactivit antifongique des fractionsriches----------------------------------------------------------------------- Etude du Lot 4 et 5 : Purification.------------------------------------------------------
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iv
III 2
b
3a
b
b
b
Caractristiques des produits isols :
6666
67
6868
69707177
798088
1b 11b 122
b 21
b 22b 233
b 31b 32b 33b 34
Le Compos A:
Proprits physico-chimiques.----------Spectre IR.-------------------------------------
Le Compos B :
Proprits physico-chimiques.----------
Spectre UV.------------------------------------Spectre IR.-------------------------------------
Le Compos C :
Proprits physico-chimiques.----------Spectre IR.-------------------------------------Spectre RMN 1-------------------------------Spectre SM.------------------------------------
Etude du Lot 6 : Le Compos D :
a 1a 2a 3
Proprits physico-chimiques.---------------------Spectre RMN 1H.--------------------------------------Spectre SM.-----------------------------------------------
IV IV
IV
Etude phytochimique de l'extrait EtOH :
90
93939495
101
102103
103
104105106
107108108
1
2IV
IV
Examen par chromatographie en couche mince de lextraitEtOH.----------------------------------------------------------------------------------- Fractionnement de l'extrait EtOH :2 1
aEtude du Lot 6 :a 1a 2a 3a 4
Caractristiques du Compos E :
Proprits physico-chimiques.----------------------Spectre UV.---------------------------------------------Spectre IR.------------------------------------------------Spectre RMN 1H.--------------------------------------
2 2abb
b
b
Etude du Lot 10 : Examen du Lot 10 S 2.--------------------------------------- Caractristiques des produits isols du lot 10S2 : 1 Le Compos F :
b 11b 12
b 13
Proprits physico-chimiques.----------------Spectre UV.-----------------------------------------
Spectre IR.------------------------------------------- 2 Le Compos G :
b 21b 22b 23
Proprits physico-chimiques.----------------Spectre UV.-----------------------------------------Spectre IR.-------------------------------------------
3 Le Compos H :b 31b 32b 33
Proprits physico-chimiques.----------------Spectre UV.-----------------------------------------Spectre IR.-------------------------------------------
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v
Conclusion.--------------------------------------------------------------------------------------------------- 110
Rfrences Bibliographiques.---------------------------------------------------------------- 112
Annexes :
124Glossaire des termes scientifiques.-----------------------------------------------------Annexe 1 :
128Les Spectres RMN 1H des Composs identifis.---------------------------------Annexe 2 :
136Constantes physiques et donnes spectrales des composs isols.-----------Annexe 3 :
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Abrviations
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1
A.pyrethrum
ALKAM
CC
CCM
CD Cl 3
CH3COOH
CMI
COUMAR
D cont
D trait
d
d d
DCM
DMSO
EP
E
EtOAc
EtOH
F
J
H
HA
HCOOH
Hz
Hex
H2O
H2 SO4INH (%)
IPP
IR
Gem
GRISEO
M
m
Me OH
Anacyclus pyrethrum
Alkamides
Chromatographie sur colonne
Chromatographie sur Couche Mince
chloroforme deutr
acide actique
concentration minimale dinhibition
Coumarines
Diamtre de croissance dans le contrle
Diamtre de croissance dans le traitement
doublet
doublet de doublet
dichloromthane
dimthylsulfoxyde
ther de ptrole
Epidermophyton
actate dthyle
thanol
fraction
constante de couplage
proton
hydoalcoolique
acide formique
Hertz
Hexane
Eau distille
Acide sulfuriquePourcentage de linhibition du myclium
isoprnique
Infrarouge
gminal
griseofulvine
Microsporum
Multipletmthanol
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2
MHz
Moy
MS
MV
m/z
n/d
P
PAL
PHENYLP
ppm
PHYTOST
RDA
R f
RMN 1H
S
SD
T
t
TRITER
UV
max
max
A, B, C, D, E, F,
G et H.
Mga Hertz
Moyenne
Masse spectroscopique
Matire Vgtale
masse/charge dun ion
non dtermin
facteur statistique de comparaison de populations
phnylalanine ammonialyase
Phnyle propane
Partie par million
Phytostrols
Rtro Diels Alder
Rapport frontal
Rsonance Magntique Nuclaire du proton
Singulet
+/- cart type
Trichophyton
triplet
Triterpnes
Ultraviolet
Dplacement chimique
Longueur donde maximale dabsorption
Frquences dabsorption
Symbole utilis pour les composs isols
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Introduction
Gnrale
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3
Malgr les progrs raliss en mdecine au cours des dernires dcennies, notamment la disponibilit
dune gamme large de produits de sant, les traitements mdicamenteux actuels restent insuffisants face
aux maladies, telles que les infections dorigine infectieuse, bactrienne ou fongique.
Lmergence de nouvelles maladies qui affaiblissent le systme immunitaire (ex. SIDA), ainsi que
lapparition de souches microbiennes (virus, bactries, champignons), de plus en plus rsistantes aux
traitements actuels, soulignent lurgence de la recherche de nouveaux agents thrapeutiques.
Le rgne vgtal constitue une source inpuisable de nouvelles molcules utilisables directement comme
principe actif ou pouvant servir comme molcule guide pour le dveloppement de nouveaux agents
thrapeutiques. La recherche de nouveaux mdicaments dorigine naturelle action antifongique
constitue un axe important de recherche au niveau mondial. En Algrie, les maladies infectieusesdorigine bactrienne ou fongique constituent lune des pathologies, les plus rpandues dans les
statistiques des maladies dans notre pays.
Le prsent travail concerne ltude dune plante mdicinale locale, de la famille des Asteraceae, en
loccurrence lAnacyclus pyrethrum, une plante vivace commune notamment dans le tell constantinois. La
mdecine traditionnelle locale utilise les racines de cette espce mdicinale, connue sous lappellation de
Guentess , pour traiter diverses pathologies. Cette drogue vgtale est connue depuis lantiquit pourses proprits mdicinales, et surtout son efficacit contre les infections de la peau, notamment les
maladies fongiques. Lespce a fait lobjet de peu dtudes chimiques et pharmacologiques. La slection
de cette espce fait suite un travail de criblage prliminaire dans notre laboratoire, recherchant les
extraits vgtaux potentiellement antifongiques vis--vis de cultures de dermatophytes. Lextrait hydro-
alcoolique des racines dA. pyrethrumsest rvl trs active sur des cultures fongiques de Microsporum
canis, M. nanum et Trichophytum rubrum, compar la Grisofulvine, mdicament antifongique de
rfrence.
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4
Au vu de ces rsultats encourageant, la prsente tude a t initie dans le but de dterminer le profil
mtabolique de la plante et de caractriser le ou les principes responsables de leffet antifongique.
Pour ce faire, un protocole de travail a t labor (schma 1), sarticulant sur 03 principales tapes :
1 le criblage biologique dun gradient dextraits dA. pyrethrumet fractionnement bioguid des extraits
potentiellement actifs ;
2 la caractrisation phytochimique prliminaire des fractions issues des extraits actifs ;
3 la purification et dtermination structurale des molcules isoles des fractions actives
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5
Schma 1 :De la plante aux phytoconstituants bioactifs.
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6
Ce mmoire est partag en 3 parties :
La premire partie est essentiellement consacre aux donnes bibliographiques. Elle traite des
dermatophytes pathognes et des aspects botanique, chimique et pharmacologique dAnacyclus
pyrethrum. Elle abord aussi dune faon exhaustive la biosynthse, la diversit structurale, les mthodesde sparation et danalyses ainsi que les proprits pharmacologiques des triterpnes et des coumarines,
principales molcules isoles pour la premire fois dans le cadre de ce travail, partir des racines dA.
pyrethrum
La deuxime partie contient la section exprimentale. Elle dcrits le matriel et mthodes chimiques,
physico-chimiques et biologiques utiliss dans cette tude.
La troisime partie regroupe les principaux rsultats et leur discussion.
Une conclusion avec nos recommandations sur les travaux futurs, suivie de rfrences bibliographiques
ainsi quune section des annexes, clturent ce mmoire.
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1 re Partie :
tude Bibliographique.
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I Les dermatophytes.
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I 1 Introduction :
Les microorganismes fongiques pathognes constituent une srieuse menace pour lhomme. Lafrquence
des infections fongiques a augment de faon considrable au cours des dernires annes notamment dans
les pays en voie de dveloppement, sous leffet de facteurs socio-conomiques.
Les Dermatophytes constituent un groupe de champignons filamenteux adapts la kratine humaine et
animale. Chez lhomme, la peau et les phanres (ongles, cheveux, poils) sont les sites privilgis de ces
champignons (Harouna.H et al., 1993; Chabasse. D et al., 2004;Zagnoli.Aet al, 2005).
I 2 Classification des dermatophytes:
Selon leur habitat naturel, on distingue trois espces de dermatophytes (Boursiquot, J.M et al., 2002) :Les espces anthropophiles: issues exclusivement de lhomme, leur transmission est interhumaine ;
Les espceszoophiles: issues de lanimal, leur transmission lhomme ncessite un contact, direct ou
indirect, avec un animal infect.
Les espcesgophiles ou tellurique: se transmettent accidentellement lhomme, suite une blessure
tellurique.
Dun point de vue taxonomique, les dermatophytes sont reprsents par 3 genres : Epidermophyton,
Microsporum et Trichophyton. Ces microorganismes sont caractriss par la production de spores
diverses : microconidies, macroconidies, arthrospores et chlamydospores. Ils ont une affinit particulire
pour la kratine, ils attaquent la peau et les phanres indemnes (Boursiquot, J.M et al., 2002; Zagnoli, A
et al, 2005; Carballeira, N.M., 2008).
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8
Le tableau suivant prsent les principaux dermatophytes.
Tableau I 1 :Principaux dermatophytes (regroups selon leur habitat).
Espces anthropophiles Espces zoophiles Espces telluriques
GenreEpidermophyton :
Exemple :
GenreMicrosporum :M. canis
M. equinumM. nanum
M. persicolorM. praecox
Exemple :GenreMicrosporum :
M. cookei
M. fulvumM. gypseumM. praecox
GenreMicrosporum :M. ferrugineum
M. audouinii
Exemple :
Genre Trichophyton:T.concentricum
T. mentagrophytes var .interdigitale
T. rubrum
T. schoenleiniiT. soudanense
T. tonsurans
T. violaceumExemple :
Genre Trichophyton:T. equinumT. erinacel
T. gallinaeT. mentagrophytes var.
mentagrophytesT. verrucosum
Exemple :Genre Trichophyton:
T. ajelloiT. mentagrophytes var.
mentagrophytes
T. terrestre
I 3 Rpartition gographique :
La plupart des dermatophytes sont cosmopolites (ex.E. floccosum, M. canis, M. gypseum, T.
mentagrophytes). Dautres espces restent spcifiques certaines rgions du globe commeM.
ferrugineumen Asie et en Afrique (Dieng, M.T et al., 2000; Soussi , A.M et al., 2007)(voirla figure
suivante).
Epidermophyton floccosum
Microsporum canis
Microsporum audouinii
Trichophyton mentagrophytesTrichophyton rubrum
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Figure I 1 :Aire de rpartition de
A: Microsporum ferrugineum et M.langeronii
B: Trichophytum concentricum, T. soudanense, T. tonsurans et T.violaceum
I 4 Thrapeutiques des dermatophytoses :
Les antifongiques sont des molcules capables de dtruire spcifiquement les diffrents champignons
impliqus en mycologie mdicale.Contrairement au grand nombre dantibiotiques et malgr dimportants
progrs, la gamme dantifongiques disponibles reste limite un petit nombre de produits. En effet, il
nexiste ce jour que trois classes dantifongiques : les polynes, les drivs pyrimidiques et les drivs
azots (figure I 2).
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Figure I 2 :
Structures de quelques antifongiques representatifs.
Les polynes :
Le plus connu des polynes est lAmphotricine B, utilis depuis 1960 comme le chef de file des
antifongiques. Il sagit dun polyne macrolide, produit naturel dune bactrie Streptomyces nodusus.
LAmphotricine Bcomprend une chane polyhydroxyle hydrophile, associe une chane polyne
lipophile (Sylvie, C et al., 2003).
Les drivs azots :
Les drivs azots sont des substances synthtiques ayant un noyau azol contenant soit deux soit trois
atomes dazote (imidazole et triazole respectivement). La tolrance de ces traitements reste bonne, avec
seulement quelques troubles digestifs et de rares ractions cutanes (Sylvie, C et al., 2003;Zagnoli, Aet
al, 2005; Carballeira, N.M., 2008).
Les drivs pyrimidiques :
Le plus connu dentre eux est la 5-fluorocytosine (5-FC). Il sagit dun driv fluor de la pyrimidine,
substance hautement soluble dans leau, qui peut tre administre par voie orale ou veineuse.
Les dermatophytes sont regroups selon leur mode dadministration, par voie gnrale ou en usage local :
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Les molculesutilises par voie gnrale :
Les molcules usage local (les drivs azots) :
la grisofulvine, Grisofulinele bifonazole
la terbinafine, Lamisillconazole, Pvaryl
le ktoconazole, Nizorallisoconazole, Fazol
le Ktoconazole, Ktoderm
En raison des nombreux cas deffets secondaires indsirables, de contre-indications et dchec
thrapeutique reports suite lusage de nombreux antifongiques utiliss actuellement, un besoin urgent
de nouveaux agents est ncessaire. Cest dans cette optique que depuis un certain nombre danne, des
efforts ont t consentis en vue de dcouvrir de nouveaux mdicaments (voir la figure suivante). Ces
molcules ont t dveloppes pour lessentiel partir de chimie de synthse. Leur taux de succs est
par contre relativement faible, en particulier pour les mycoses invasives Aspergilluset les candidmies
(Sylvie, C et al., 2003).
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Figure I 3 :Molcules antifongiques dveloppes entre 1950 2006.
I 5 Mthodes de criblage de substances antifongiques :
Dans le cas de dcouverte dagents antibactrien et antifongique, trois tests simples sont dcrits dans la
littrature : la mthode de diffusion sur agar, la mthode de dilution et la mthode bioautographique
(Hostettmann, K et al., 1994).
I 5 1 Mthode de diffusion sur agar (boite ptri) :
Elle consiste faire diffuser dans un milieu glos un antifongique et mesurer le diamtre dinhibition. La
souche tudier est inocule sur toute la surface de la glose et entre en comptition durant lincubation
37 0C, avec leffet inhibiteur de lantifongique. Une zone dinhibition circulaire se forme pour les
concentrations inhibitrices du produit.
I 5 2 Mthode de dilution sur agar (boite multi puits) :
Le milieu de culture inocul avec le microorganisme, puis mlanger avec lchantillon test. Les cultures
sont maintenues 37 0C jusqu la croissance du matriel fongique compar avec le contrle.
Lexprience est rpte avec plusieurs dilutions de lchantillon dans le milieu de culture et avec une
dilution suprieure pour dtermin le CMI.
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I 5 3 Mthode bioautographique :
La mthode bioautographique employ pour localiser lactivit antifongique sur un chromatogramme, la
zone dinhibition est visualise avec le ractif de dtection dehydrogenase, les composs antifongiques
apparatre comme des spores colores dans le fond.
Aet B mthode bioautographiqueC mthode diffusion sur agar (boite ptri)
D mthode de dilution sur agar (boite multi puits)
Figure I 4 :
I 6 Stratgie de recherche des nouvelles substances antifongiques :
Les produits naturels, notamment dorigine vgtale, sont utiliss comme une source de diversit
molculaire dans plusieurs programmes de dcouverte de nouveaux mdicaments (Rahman, Aet al.,
2005; Steven, M.C et al., 2008).
Dans les nombreux programmes de dcouvertes de produits naturels bioactifs, dans lesquels le produit
final est soit utilis comme un mdicament ou un produit guide pour le dveloppement de nouvelle classe
de mdicament, des bio tests de criblage simples et reproductibles sont ncessaires pour les tapes de
criblage prliminaire et pour guider le processus disolement vers la molcule active.
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Le tableau suivant rassemble quelques travaux concernent lactivit antifongique des plantes.
Tableau I 2 : Quelques rfrences sur lactivit antifongique des plantes.
Rfrencesarties utilisesa familleespce
Webser, D et al.,2008
Coopoosamy,R.Met al., 2007
Cruz, M.C.S et al., 2007Giordani, R et al., 2007
Hostettmann, K et al., 2000
Liu, Met al., 2007
Liu, Met al., 2007
Liu, Met al., 2007
Liu, Met al., 2007
Diallo, D., 2000
Hostettmann, K et al., 2000
Hostettmann, K et al., 2000
Igor, P.L.B., 2003
Diallo, D., 2000
Giordani, R et al., 2007
Igor, P.L.B., 2003
Hostettmann, .Ket al., 2000
Hostettmann, Ket al., 2000
Motsei, M.L et al., 2003
Giordani, R et al., 2007Igor, P.L.B., 2003
Igor, P.L.B., 2003
Liu, Met al., 2007
Liu, Met al., 2007
Dohou, .N et al., 2004
Igor, P.L.B., 2003
Steenkamp, Vet al., 2007
Cruz, M.C.Set al., 2007
racines
Feuilles + racines
tigesparties ariennes
racines
tiges
Feuilles
Feuilles
Feuilles
racines
Feuilles
racines
racines
parties ariennes
parties ariennes
corce du tronc
racines
Feuilles
Feuilles + tiges
parties ariennesplante entire
racines
Feuilles
Feuilles
plante entire
racines
corce
tiges
Araceae
Aloeaceae
SpotaceaeAsteraceae
Verbenaceae
Combretaceae
Combretaceae
Combretaceae
Combretaceae
Ebenaceae
Umbelliferae
Leguminosae
Rutaceae
Aizoaceae
Lamiaceae
Mimosaceae
Polygalaceae
Myrsinaceae
Roseaceae
LamiaceaeFabacaea
Leguminosae
Combretaceae
Combretaceae
Thymeleaceae
Oleraceae
Rutaceae
Rhamnaceae
Acorus calamus
Aloe excelsa
Bumelia sartorum
Artemisia herba alba
Clerodendrum uncinatum
Combretum elaeagnoides
Combretum fragrans
Combretum kirkii
Combretum zeyheri
Diospyros abyssinica
Diplolophium buccinateur
Eriosema tuberosum
Fagara zanthoxyloides
Glinus oppositifolium
Origanum majorana
Parkia biglobosa
Polygala fruticosa
Rapanea melanophloeos
Rubus rigidus
Rosmarinus officinalis
Stylosanthes micronata
Swartzia madagascariensis
Terminalia brachystemma
Terminalia mollis
Thymelaea lythroides
Ximenia Americana
Zanthoxylum davyi
Ziziphus joazeiro
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II Aspects :Botanique, Chimique
et Pharmacologique de laplante.
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II 1 Aspect Botanique :
II 1 1 Famille Asteraceae :
La famille des Astraces reprsente lune des taxons les plus importants du rgne vgtale. Elle est
principalement reprsente par des espces vivaces. Les feuilles sont le plus souvent alternes, mais aussiopposes ou radiales, bractes, simples ou parfois composes (Gaussen, H et al., 1982). Les fleurs ont la
caractristique commune d'tre runies en capitules, cest--dire serres les unes aux autres (Gaussen, H
et al., 1982; Osborn, R.W et al., 1995). La famille des Astraces (Compositae) compte
approximativement 900 genres avec plus de 13000 espces (Trease, G.E et al., 1983).
II 1 2 Genre Anacyclus :
Le genreAnacyclusregroupe des espces capitules composs en principe de fleurs extrieures ligules
et de fleurs intrieures tubules (Lloyd, C.G et al., 1911). La principale particularit du genre est la
prsence dailes aplaties entourant les fruits et faisant penser des paires d'oreilles, Ce sont des plantes
annuelles, feuilles alternes embrassantes, profondment divises. La tige portant le capitule s'paissit en
dessous de celui-ci. L'involucre est form de bractes ingales, se recouvrant en partie, ne portant pas
d'appendice terminal. Le taxon Anacyclus, tel que dfini lorigine par Linn (voir classification), En
Algrie le genre Anacyclusest reprsent par deux espces, a savoire Anacyclus pyrethrum(L.) Link et
Anacyclus clavatus(Pers) (Julien, A., 1894).
II 1 3 Espce Anacyclus pyrethrum :
LespceAnacyclus pyrethrum (synonyme : Anthemis pyrethrum) a tdfinie par Linn et rvise par
Link. Sa taxonomie est dcrite dans le tableau I 3. plante trs commune des hauts plateaux et montagnes
du Tell, Il sagit dune plante de 30 cm de haut maximum, vivace par ses racines longues, paisses,
fibreuses, rudes, brunes lextrieur, blanches linterieur (Lloyd, C.G et al., 1911; Paris, R.R et al.,1971). Les tiges sont nombreuses couches sur le sol, simples ou peu rameuses. Les feuilles sont finement
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dcoupes, dlicates et alternes sont pubescentes. Les fleurs sont blanches au cur jaune ordinairement
solitaires (Paris, R.R et al., 1971).
Tableau I 3 : Taxonomie dAnacyclus pyrethrum.
DIVISION : ANGIOSPERMAEClasse : Dicotyledoneae
s/Classe : Asteridae
Ordre : Asterales
Famille : Asteraceae
s/Famille : Asteroideae
Tribe : Anthemideae
Genre : Anacyclus
Espce : Anacyclus pyrethrum (L.) Link.
Figure I 5 :Anacyclus pyrethrum L.
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Les noms communs et vernaculaires :
Nom arabe : oued el athas, agargarha, tigenthas, ignens et Guenthus
Nom franais : pyrthre d'Afrique
Nom anglais : Pellitory
II 2 Aspect Chimique :
II 2 1 Chimie du genre Anacyclus :
Le genreAnacyclusa fait lobjet de quelques investigations chimiques, signalant la prsence de nombreux
types de mtabolites secondaires, incluant des triterpnes, des strodes, des coumarines, des lignanes, despolyactylnes (alkamides) et des flavonoides. Le tableau I 4 rassemble les diffrents mtabolites
secondaires isols du genreAnacyclus.
Tableau I 4 : Quelques donnes chimiques sur le genre Anacyclus.
Espce
Organes
tudis
Molcules extraites Rfrences
Anacyclus
Clavatus
Feuilles Quatre flavonoides :Isomeric7-glucoside, Luteolin7-glucoside,
7-rhamnosylglucoside, Quercetin7-glucoside.
Harald, G.,1978
Anacyclus
cyrtolepidioides
FleursFraches
Six strodes :cholestrol, campestrol,stigmastrol, sitostrol, delta-7-stigmastroleet delta-5-ovenastroleUn htroside stroidique:
le -sitostrol-3- O--D-glucoside.Des hydrocarbures sesquiterpniques :Le -cadinne et le Valencne.Des alcools : le Nonadcan-1-ol, lEicoson-1-ol.Des ctones : la 6, 10,14-Trimthyl-pentadcan-2-one.Des esters : le (9Z, 12Z)-Octadca-9,12-dinonate de mthyle et L'Octadcanoate de
mthyle.Des acides carboxyliques : l'acideHexadcanoique et l'acide Ttradcanoique
Bergaoui, Aet al., 2006(a)
Fleurs
Des monoterpnes : 49,55% de la totalit desconstituants, le Compos majoritaire(43,81%) Est l'pinne.26 composs sesqui Terpniques :
7,9% de cette huile essentielle, le-cubebne(2,37%).
Bergaoui, Aet al., 2006(b)
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Suite du Tableau I 4 :
Anacyclus
cyrtolepidioides
Partiearienne
Deux coumarines :herniarine et 3,4 dehydroherniarine.
Benkiki, Net al., 2007
Anacyclus
pyrethrum
Feuilles
Deux flavonoides :
Flavonol5-glucoside, Diosmetin7-glucoside.
Harald, G.,
1978
Racines
Une alkamide :la Pellitorine. (le principaleconstituent prsent dansA pyrethrum)
Chaaib,K.F., 2004Sukumaran,K et al.,1995Arnason,J.Tet al., 1989Adesina,S.Ket al.,1988Crombia,L.,1954
Iso butylamide:anacycline. Arnason,J.Tet al., 1989Bohlmann,Fet al., 1973
Une srie des amides :des amidesmonosubstitues contenant - dienne-
unsaturation.
Arnason,J.Tet al., 1989Harald,G.,1978
Des polyactylnes :
Artemisia Ktone, triyne-Triene.
Divers: acide linolique, Dehydromatricar ester.
Sukumaran,K et al.,1995Arnason,J.Tet al., 1989
Harald,G.,1978Jente, Ret al., 1976
Anacyclus
radiatus
Fleurs
Des flavonoides :Isorhamnetin5-glucoside, Quercetin5-glucoside,Flavonol5-glucoside,Quercetin7-glucoside,Isomeric7-glucoside, 7-glucosides deQuercetagetine, Patuletine,Quercetagetin3-mthyle ther, Quercetagetin6, 3'-dimethylther (spinacetine).
Harald, G.,1978
Partiearienne
Deux flavonoides :Isorhamnetine, Quercetine.Une coumarine :isoscopoletine.Un triterpne : Taraxasterole.Trois strodes : sitostrol, campestrol,stigmastrol.Nouveau germacranolide : Marioline.
Gonzalez,C.F.A et al.,1985
Anacyclus
valentinusFeuilles
Trois flavonoides :
Luteolin7-glucoside, 7-rhamnosylglucoside,Quercetin7-glucoside.
Harald, G.,1978
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Figure I 6 :Structures chimiques de quelques mtabolites secondaires isoles du genre Anacyclus.
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II 2 2 Chimie dAnacyclus pyrethrum :
A loppos de la chimie des autres espces du mme genre, celle d'Anacyclus pyrethrum demeure
insuffisamment tudie. La bibliographie signale la prsence dans les racines de composs
polyactylniques(Bohlmann, F et al., 1973; Jente, R et al., 1976; Harald, G., 1978; Arnason, J.Tet al.,1989),damides (Harald, G., 1978; Arnason, J.Tet al., 1989; Sukumaran, K et al., 1995) et de lignanes
(Adesina, S.Ket al., 1988; Chaaib, K.F., 2004). Les racines accumulent surtout des alkamides (Crombia,
L., 1954; Adesina, S.Ket al., 1988; Arnason, J.Tet al.,1989;Sukumaran, K et al., 1995; Chaaib, K.F.,
2004), notamment la Pellitorine, constituent principale prsent dans les racines d'A.pyrethrum, isol en
1895parDunstan et Garnett (Adesina, S.K., 1988; Chaaib, K.F., 2004). Ces substances azots et
insatures sont associes leffet sialagogue connu depuis longtemps (Jacobson, M., 1956).
Figure I 7 :Structures chimiques de principaux mtabolites secondaires identifis chez l'espceAnacyclus pyrethrum.
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II 3 Aspects biologique et Pharmacologique :
II 3 1 Famille Asteraceae :
Les Asteraceae est une famille particulirement riche en espces mdicinales. Elle comprend notamment
des plantes utilises dans le traitement des maladies parasitaires et anti-infectieuses (Bruneton, J., 2001).Parmi, les molcules isoles et utilises en thrapeutique, on peut citer le cas de lArtemisinine, un
sesquiterpne lactone isoler de lArmoise annuelle (Artemisia annua), une espce chinoise. Cette
molcule est un antipaludique, indique dans le traitement de certaines formes de malaria.
Le tableau ci-aprs donne quelques exemples sur cette activit chez certaines espces appartenant la
famille des Asteraceae.
Tableau I 5 :Lactivit antifongique chez certaines espces dAsteraceae.
Plante source de
La molculePartie
utiliseMolcules responsables
lactivitMicroorganismes Rfrences
Artemisiaabsinthium Feuilles
et
fleurs
Huiles Essentielles :Camphore et1, 8-cineole
Jos, A.M etal., 2007Artemisia
santonicumArtemisia
spicigera
Bidens
pilosa
Feuilleset
fleurs
Huiles
essentielles
Corticum rolfsiiFusarium solaniFusarium oxysporu
Deba, F et al., 2008
Feuilles Inconnu Candida albicans Motsei, M.Let al., 2003
Blumeabalsamifera
Feuilles
Flavonoides :hyperoside
Aspergillus nigerTrichophyton
mentagrophytesCandida albicans
Jos, A.M etal., 2007
Blumeagariepina
Inconnu Cladosporiumcucumerinum
Chrysanthemum
coronariumFeuilles
Huiles Essentielles :Camphore, et -Pinne et lyratyleactate
Cichorium
intybusRacines Inconnu Les dermatophytes :
Zoophiles etanthropophiles
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Suite du Tableau I 5 :
Echinaceapurpurea
Racines Polyacetylnes,Alkamides
Candida shehata Hymete, A etal., 2005Echinops
ellenbeckiiFleurs
et
Racines
Alcalodes,Saponosides,
Phytostrols, Polyphnols etCarotnodes.
Candidaalbicans
Echinopslongisetus
Flaujasiopsis
flexuosaPartiesariennes
Inconnu Aspergillus niger Motsei, M.Let al., 2003
FlauresiaCernua
Feuilles
FlavonoidesetSesquiterpnes
Fusarium oxysporumRhizoctonia solani
Jasso, R.Det al., 2007
FlauresiaMicrophylla
Flauresia
Oxysporum
FlauresiaRetinophylla
Helichrysum
nitens
Partiesariennes
Flavones :5,7-dimethoxyflavone
Cladosporium
cucumerinum
Hostettmann, Ket al., 2000
Inulantheranuda
Acetylne :(E)-O-cetyldendranthe-menole
Cladosporiumcucumerinum
Leontodon
filiiTriterpnes :
triterpeneteroleRhizoctonia solani
Glomerelia cinguiata
Jos, A.M etal., 2007
Mutisiafriesiana
Coumarines :Scopoletine
Cladosporiumcucumerinum
Psiadialithospermifolia
Huilesessentielles
Aspergillus ochraceusCandida
pseudotropicalisFusarium moniliform
Psiadia
trinerviaFlavones :3-O- methoxylatedflavonols
Cladosporium
cucumerinumHostettmann, Ket al., 2000
PterocaulonAlopecuroides
PterocaulonBlansae
Pterocaulon
Polystachyum
Coumarines :Prenyletine,Prenyletin-mthyl-ether
Candida albicansCandida tropicalisSaccharomycescerevisae
Aspergillus flavusAspergillus fumigutusAspergillus nigerTrichoophyton rubrum
Trichoophytonmentagrophytes
Stein, A.Cet al., 2006
Senecioinaequidens
SenecioVulgaris
Inconnu Trichophytontonsurans
Jos, A.M etal., 2007
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Suite du Tableau I 5 :
Spilanthesacmella
Fleurs Alkamides :Spilanthole
Aspergillus nigerAspergillus paractitu
Sabitha, A.Ret al., 2006
Tagetesminuta Feuilles
Inconnu Candida albicans Motsei, M.Let al., 2003
Tarchonanthuscamphoratus
Huiles essentielles Candida albicans Matasyoh, J.C et al., 2007
Tithoniadiversifolia
Partiesariennes
Isocoumarines :Tithoniamarine
Microbotryumviolaceum
Chloralla fusca
Jos, A.M etal., 2007
II 3 2 Espce Anacyclus pyrethrum :
Lutilisation dAnacyclus pyrethrumest dcrite dans les pharmacopes de nombreux pays du monde. Les
racines sont inscrites la pharmacope franaise depuis 1937, pour leurs proprits sialagogues (Paris,
R.R et al., 1971).
En Algrie, linfusion des racines du pyrthre dAfrique est recommande en bain de bouche contre les
maux de dents et les problmes lis la scrtion salivaire comme sialogogue (Boulos, L., 1983;Beloued,
A., 1998). Le dcoct des racines est galement cit en friction locale en cas de paralysie des membres(Boulos, L., 1983). Les racines sont galement utilises sous forme de crme a base de graisses animales
pour traiter la goutte et la sciatique (Boulos, L., 1983). Un mlange de racines et de lait, additionn de
miel est propos comme aphrodisiaque, contre linfertilit fminine(Boulos, L., 1983). On reconnat aux
racines de pyrthre des proprits antiparasitaires et antibiotiques (Beauquesne, B.L et al., 1990; Baba
Aissa, F., 1999)
Peu dtudes dvaluation exprimental ont t effectues sur les racines dAnacyclus pyrethrum. On
signale une activit immunostimulante de la fraction riche en polysaccharides (Bendjeddou, D et al.,
2003) et une action anesthsique local des extraits aqueux et hydro alcooliques (Panchal, G.M et al.,
2001). La Pellitorine, compos connu des racines sest montr douer dactivits anesthsique local,
antibactrienne, larvicide, ainsi que insecticide (Chaaib, K.F., 2004; Molina, T.J., 1999).
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III tude desmtabolites secondaires
isoles de la plante :
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a Les Terpnoides.
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III 1 Introduction :
Dans le rgne vgtal, les terpnodes sont des mtabolites secondaires, dont le rle cologique a t
prouv, notamment dans le processus de communications et de dfense (Lamarti, A et al., 1994).
Les triterpnes, dont plus de 4000 structures sont connues, sont reprsents par plus de 40 squelettes
diffrents (Bruneton, J., 1999). Lintrt thrapeutique et lemploi industriel des triterpnes en font un
groupe de mtabolites secondaires de premire importance (Rodney, C et al., 2000; Yutaka, E et al.,
2003).
III 2 Classification structurale et biosynthse des Triterpnes:
Les triterpnes sont construits partir de plusieurs entits isoprniques, constituant une famille trs
diversifie tant au niveau structural que pharmacologique (Goodwin, T.W., 1971). Selon la nature du
noyau, ces mtabolites sont regroups en triterpnes ttracycliques (Dammaranes, Cucurbitanes,
Lanostanes) et pentacycliques (Lupanes, Ursanes, Olananes et Friedelanes) (figure I 7).
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Figure I 8 :Principaux classes des triterpnes.
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La diversit au niveau structurale des triterpnes rsulte des nombreuses conformations que peut adopter
le substrat acyclique. Pour une raction de cyclisation donne, cest lenzyme qui impose cette
conformation via tes interactions enzymes / substrat au sein du site actif (Alkins, P.Wet al., 1987; Abe,
I.M.R et al., 1993; Brown, G.D., 1998).
Par exemple, les enzymes prnyl-transfrase et terpne synthase sont responsable de la diversification des
triterpnes par deux ractions opres sur des diffrents substrats :
Lune de laddition rptitive dunit C 5, lautre de la cyclisation.
Figure I 9 : Oxydation du squalne.
(Goodwin, T.W., 1971; Alkins, P.W et al., 1987)
Cest de la conformation initiale de lpoxysqualne sur la surface de lenzyme que dpend lorientation
de la biosynthse vers strodes et les triterpnes dautre part.
1 si lpoxysqualne est maintenu dans une conformation chaise-bateau-chaise-bateau, la cyclisation
conduit un cation protostane prcurseur immdiat, par une suite de migration 1, 2 de protons et de
mthyles, des cycloartanes et des cucurbitanes (ces migration sont rendues possibles par la disposition
trans-antiparallle des protons et mthyles en C-17, C-13, C-14 et C-8).
2 si lpoxysqualne est maintenu dans une conformation chaise- chaise- chaise-bateau, la
cyclisation conduite un cation dammarane, qui peut aussi se rarrange :
soit par des migrations concertes conduisant au tirucallol et leuphol, prcurseurs des
limonodes et quassinodes.
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soit, et cest le cas le plus frquent, par formation dun cycle supplmentaire ce qui conduit aux
triterpnes pentacycliques : Olananes, Ursanes, Lupanes, Friedelanes et taraxastanes, etc., (Bruneton, J.,
1999).
Figure I 10 :Principaux cations dans la biosynthse.
(Goodwin, T.W., 1971; Alkins, P.W et al., 1987; Abe, I.M.R et al., 1993; Brown, G.D., 1998; Yutaka, E et al., 2003).
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Figure I 11 :
La voie des Olananes, Fridelines et Ursanes.
(Goodwin, T.W., 1971; Alkins, P.W et al., 1987; Abe, I.M.R et al., 1993; Brown, G.D., 1998; Yutaka, E et al., 2003).
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III 3 Mthodes danalyses des triterpnes :
Les triterpnes ont fait lobjet de plusieurs tudes consacres lanalyse structurale des triterpnes (Kuo,
Y.H et al., 2000; Thanakijicharoenpath, W et al., 2007; Andras, K et al., 2008; Chiy, R.C et al., 2008).
a Analyse par Infra - Rouge (IR) :
Le spectre Infrarouge permet de reprer les fonctions chimiques prsentes comme les groupement
ctones, alcool, acide carboxylique actate, etc. qui caractrisent la plupart des triterpnes (Dosseh, Ch
et al., 1980; Druet, D et al., 1986; Ahmed, S.Met al., 2004).
b Analyse par rsonance magntique nuclaire (RMN) :
Le spectre RMN- 1 H des triterpnes est peu spcifique. Il prsente nanmoins une srie de pics
caractristiques dans lintervalle 0,5 ppm 2 ppm, correspondant aux groupements mthyles. Le profil
(nombre, multiplicit, dplacement) permettent une orientation concernant le type et la srie du noyau
triterpnique (Hans, F.J et al., 1973; Charrouf, Z et al., 1991; Marcia, L.Net al., 1999; Asaph, A et al.,
2005;Hu, H.J et al ., 2005; Hua, S et al., 2006;Yu, Q.L et al ., 2006; Mario, J.Jet al., 1999; Andras, K
et al., 2008; Chiy, R.C et al., 2008; Igoli, J.O et al., 2008;Yuan, J.Qet al., 2008). Lexamen de la rgion
2 6 ppm indique lenvironnement auquel est soumis les protons fonctionnels (hydroxyle, double
liaison,).
Le spectre RMN-13C est plus prcieux dans la dtermination structurale des noyaux triterpniques nous
permet de bien mettre en vidence les 30 atomes de carbone qui constituent le squelette des triterpnes, et
en particulier les groupements carbonyles, acide carboxylique et alcool, par leurs dplacements chimiques
spcifiques (environ 210 ppm pour un carbonyle, 170 ppm pour un acide carboxylique et 70 ppm pour un
alcool (Marcia, L.Net al., 1999; Mario, J.Jet al., 1999).
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c Analyse par spectroscopie de masse (SM) :
En spectroscopie de masse, les fragments des triterpnes sont caractristiques, comme les pics de
fragmentation caractristiques du mcanisme de Rtro-Diels-Alder par clivage du cycle D / E et C / D
des triterpnes pentacycliques (Hans, F.J et al., 1973; Dosseh, Ch et al., 1980;Branco, A et al., 2004;
Viswanadh, G.S et al., 2006).
Schma I 1 :Exemples des fragmentations en spectromtrie
de masse des triterpnes.
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III 4 Proprits biologiques et pharmacologiques des triterpnes :
Les triterpnes sont caractriss par une diversit structurale remarquable. Cette diversit chimique se
traduit par des proprits biologiques et pharmacologiques varies et des potentialits thrapeutiques dans
les domaines les plus divers :cytostatiques, antiviraux, antiinflammatoire, antioedmateuses, cytoprotectives, imminomodulatrices,
analgsiques et antifongiques (Bruneton, J., 1999;Kazumasa, S et al., 2001;Jiri, P., 2003; Hua, S et al.,
2006; Eder, B et al ., 2008).
Lactivit lencontre des champignons est bien tablie in vitro, aussi bien lgard despces
phytophatognes, qu lencontre de divers Candida ou dermatophytes. Elle est sans doute la consquence
de la raction des triterpnes avec les strols membranaires du micro-organisme (Bruneton, J., 1999).En dehors des potentialits pharmacologiques des triterpnes, leur toxicit chez les animaux sang froid
est connue depuis lantiquit. Elle explique titre simple, les proprits piscicidales (ex. Balanites,
Zygophyllaceae) et molluscicidales (Phytolacca, Phytolaccaceae) des plantes qui les contiennent.
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b Les Coumarines.
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III 1 Dfinition :
Historiquement le nom de coumarine vient de cumaru qui est le nom dans une langue amazonienne,
de l'arbre de Tonka (Dipteryxodoratawilld., Fabaceae) dont les fves contiennent 1 3 % de coumarine.
Les coumarines ont t isoles pour la premire fois en 1820 (Bruneton, J., 1999). Elles sont prsentes en
quantits plus faibles dans plusieurs plantes comme le mlilot, la sauge sclare et lavande. On la trouveaussi dans le miel, le th vert, etc. Les coumarines sont des composs phnoliques vgtaux, portant un
noyau benzopyrone dans leur structure (Alignan, M., 2006), ils sont des 2H-1-benzopyran-2-ones que
lon peut considrer, en premire approximation, comme tant les lactones des acides 2-hydroxy-Z-
cinnamiques (Bruneton, J., 1999).
III 2 Les coumarines dans le rgne vgtal :
Les coumarines et ses drivs dont plus de 300 structures sont connues, se rpartissent dans plus de 70
familles de dicotyldones et 9 familles de Monocotyldones.Ils prsent sous forme libre ou htorosides
dans la plus part des familles de dicotyldones incluant Apiaceae, Asteraceae, Fabiaceae, Moraceae,
Rosaceae, Rubiaceae, Rutaceae et Solanaceae.le tableau suivant rassemble les principaux coumarines et
leur distribution dans le rgne vgtal.
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Tableau I 6 :
Distribution des coumarines chez certaines plantes.
Coumarines Plantes Localisation Rfrences
AesculetineAngelicine2-Angeloyl-3-isovalerylvaginateApterine
ArchangelicineArchangelineBergaptene
(-)-ByakangelicineByakangelicin-2-O-isovalerateChalepensineColumbianadineColumbianadinoxideDaphnoretineDaphnoretine methyl etherDophnorineGravelliferoneGravelliferone methyl etherGraveoloneHeraclenoleHeraclenol-2-O-isovalerateHeraclenol-2-O-senecioteHerniarine8-HydroxybergapteneImperatorine
IsobergapteneIsobyakangelicine angelateIsoimperatorine
IsooxypeucedanineIsopeulustrineIsopimpinellineIsorutarineMarmesine
Marmesinine
5-Methoxy-heraclenolisovalerateOroseloneOsthenoleOsthole(+)-OxypeucedaninePangeline
Anethum graveolensAngelica archangelicaAngelica archangelica
Aegopodium podagrariaAngelica archangelica
Levisticum officinalePeucedanum palustreAngelica archangelicaAngelica archangelicaAnethum graveolensAngelica archangelicaLevisticum officinalePeucedanum palustre
Ruta graveolensRuta graveolensAngelica archangelica
Ruta graveolensPeucedanum palustrePeucedanum palustre
Ruta graveolensRuta graveolens
Ruta graveolensRuta graveolensRuta graveolens
Anethum graveolensPetroselinum crispum
Angelica archangelica
Angelica archangelicaRuta graveolensAngelica archangelicaAngelica archangelicaPeucedanum palustreAngelica archangelica
Peucedanum palustreAngelica archangelicaPeucedanum palustreRuta graveolensPeucedanum palustrePeucedanum palustre
Angelica archangelicaRuta graveolensRuta graveolens
Ruta graveolensAngelica archangelica
Angelica archangelicaAngelica archangelicaAngelica archangelica
Angelica archangelicaRuta graveolens
fruitsfruits, feuilles et racinesracines
racinesracinesracinesracinesracinesracinesfruitsfruits, feuilles et racinesracinesracinestiges et feuillesracinesracines
racinesfruits et racinesfruitsparties ariennesracinesracinesracinesracines
parties ariennestigesracines
racinesracinesfruitsfruits, feuilles et racinesfruits et racinesracinesracinesfruits, feuilles et racinesfruits et racinestiges et racinesfruitsfruits
fruits, feuille et racinesracinesracinesracinesracines
fruits et racinesfruits et racinesfruits et racinesfruits, feuilles et racinesracines
Kostova, I., 2005Steck, W et al., 1969Mulier, M et al., 2004Sarker, S.D et al., 2005
Mulier, M et al., 2004
Shults, E.E et al., 2003Steck, W et al., 1969
Kostova, I., 2005Steck, W et al., 1969
Shults, E.E et al., 2003Livre, K. 2004
Kostova, I., 2005
Livre, K. 2004Shults, E.E et al., 2003
Kostova, I., 2005
Kostova, I., 2005
Shults,E.E et al., 2003
Steck, W et al., 1969
Steck, W et al., 1969Livre, K. 2004
Steck, W et al., 1969
Livre, K. 2004
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Suite du Tableau I 6 :
Peucedanine
PhellopterinePimpinellinePsoralene
RutacultineRutamarineScopoletineSuberenoneUmblliferone
Umbelliprenine
Xanthotoxine
XanthotoxoleXanthyletine
Peucedanum palustrePeucedanum palustreAngelica archangelicaAngelica archangelica
Angelica archangelicaRuta graveolens
Ruta graveolensRuta graveolensAnethum graveolensRuta graveolensAnethum graveolensAngelica archangelica
Livisticum officinaleRuta graveolensAnethum graveolensAngelica archangelicaPeucedanum palustre
Anethum graveolensAngelica archangelicaRuta graveolensAngelica archangelica
Ruta graveolens
fruits et racinesfruits et racinesfruitsfruitsracinestiges et racinesracinesparties ariennes + racinesfruits, feuilles et racinesracinesfruits et racinesfruits et racinesfeuilles et racinesracinesfruitsfruits et racinesfruits
fruitsfruits, feuilles et racinestiges et feuillesfruits et racinesracines
Hehn, A., 2007
Steck, W et al., 1969
Livre, K. 2004
Livre, K. 2004
Steck, W et al., 1969
Livre, K. 2004Kostova, I., 2005Steck, W et al., 1969
Kostova, I., 2005Steck, W et al., 1969Livre, K. 2004Steck, W et al., 1969Livre, K. 2004
III 3 Diversit structurale des coumarines :
La coumarine est une famille de composs, qui se forment par une substitution sur un cycle aromatique,
de ce faire et daprs la nature des substitutions, on peut classer les coumarines en :
III 3 1 Coumarines Simples :
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III 3 2 Coumarines Prnyles :
III 3 3 Furanocoumarines (Linaires et Angulaires) :
III 3 4 Pyranocoumarines :
III 3 4 1 Pyranocoumarines simple :
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III 3 4 2 Dipyranocoumarines :
La srie des Calanolides :
La srie des Inophyllums :
La srie des Cordatolides :
Les coumarines peuvent galement exister deux tats :
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III 3 5 Coumarines ltat dimrique (Bicoumarines) :
III 3 6 Coumarines ltat trimriques (Tricoumarines) :
III 4 Etude de la voie de Biosynthse des coumarines :
a Biosynthse des coumarines simples :
La formation de la phnylalanine partir de lacide chorismique implique un rarrangement de claisen
catalys par lenzyme chorismate mutase.
La conversion de la phnylalanine en acide cinnamique par la phnylalanine ammonialyase (PAL)marque lentre dans la voie des phnylpropanoides (Livre, K., 2004).
La voie exacte des coumarines partir dacides cinnamiques spcifiques est quasi inconnue, bien que la
cinnamate-2-hydroxylaseait t propose comme une tape enzymatique cl.
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Figure I 12 :Schma rcapitulatif des voies de biosynthse des coumarines simples
et lUmbllifrone.
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b Biosynthse des coumarines furanocoumarines :
La voie des furanocoumarines est prsente chez un petit nombre despces vgtales (Livre, K., 2004).
La premire tape propre de la voie de biosynthse est propose comme tant une para-hydroxylation de
lacide p-coumarique qui conduit lUmbllifrone (Bourgaud, F et al., 2006). Certains auteurs suggrent
que cette raction est catalyse par une enzyme de la famille des cytochromes P450 (C4H) (une enzyme cl dans la voie des phnylpropanoides) (Hehn, A., 2007).
La production de drivs de la 7-O-prenylUmbelliferone ne se fait que dans certaines conditions
dlicitations comme a t dcrit par Hamerski et ses collaborateurs en 1990.
Il a t dmontr que la prnylation de lUmbelliferone pour former la demethylsubrosine tait due une
activit enzymatique (Hehn, A., 2007).
Ltape suivante est la synthse de la dmethylsubrrosine par ajout dune unit isoprnique (IPP)
catalyse par la dimthylallylpyrophosphatase (Prenyltransferase).Ltape suivante conduisant la cyclisation de la dimthylsuderosine en (+) marmsine, puis sa
conversion en psoralne est prise en charge par des cytochromes P450 (Livre, K., 2004).
Lutilisation de marmsine radio marque a permis de suivre lapparition de psoralne en prsence de
NADPH (lenzyme responsable de la raction est stro slective) (Bourgaud, F et al., 2006; Hehn, A.,
2007).
Lhydroxylation en position 5 et 8 du psoralne gnre la formation de xathotoxole et de Bergaptole, cette
double hydroxylation squentielle est ncessaire pour permettre la formation du 5-8 dihyroxypsoralne,
prcurseur non methoxyl dun produit mineur de la voie de biosynthse : lisopimpinelline.
La mthylation du Bergaptole et de xathotoxole est catalyse par des mthyltransfrases, pour finalement
donner la Xanthotoxine et le Bergaptne.
La figure suivante rassemble les voies de biosynthse possible conduisant aux furano- coumarines
linaires et Angulaire.
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Figure I 13 :Schma rcapitulatif des voies de biosynthse des furanocoumarines.
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III 5 Analyse structurale des coumarines :
a Fluorescence sous la lumire UV :
Les coumarines sont caractrises par une fluorescence lUV 366 nm (Mead, J.A.R et al., 1958;Macek, K., 1972; Harbone, J.B., 1984; Wagner, H et al., 1984; Bruneton, J., 1999).Cette fluorescence est
en gnral :
Bleue pour les coumarines hydroxyles en 7 (Umbllifrone).
Pourpre pour les coumarines prnyles.
Jaune pour les furanocoumarines (Wagner, H et al., 1984).
Cette fluorescence est intensifie en chromatogramme par les vapeurs de NH3observe sous la lumire
UV, par pulvrisation du chromatogramme par le ractif de Borntrager ou lactate de plomb (Macek, K.,1972; Harbone, J.B., 1984; Wagner, H et al., 1984).
b Spectroscopie infrarouge IR :
Cette technique fournit des informations sur les groupements fonctionnels dune molcule. Pour les
coumarines :
Labsorption C=O de la lactone conjugue apparat pratiquement dans la rgion (1550-1750 cm -1)
(Prachyawarakorn, V et al., 2006; Kostova, I et al., 2007).
Labsorption OH du phnol est observe 3550 cm -1.
c Spectroscopie ultraviolette UV :
Les coumarines ont un spectre UV caractristique, fortement influenc par la nature et la position des
substituants, profondment modifi en milieu alcalin : KOH, NaOH, NaOCH3et en prsence dAlCl3.
AlCl3 forme un complexe avec les hydroxyles ports par des carbones adjacents, ce qui induit un
dplacement bathochrome (Bruneton, J., 1999).Pour la coumarine, les absorptions maximales sont prsentes dans deux bondes en 276 cm -1et 311 cm -
1. La prsence des substituants alkyls induit par des modifications des valeurs de la bande en 311cm -1
vers 325 cm-1 (Abu, E.R.A et al., 1985; Shults, E.E et al., 2003). Selon la position de OH, le dplacement
est plus au moins fort (Bruneton, J., 1999).
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d Spectroscopie de rsonance magntique nuclaire RMN :
L'allure des spectres RMN 1H des coumarines est caractristique,les protons olfiniques H-3 et H-4
apparaissent respectivement sous forme de deux doublets :
(ppm) [6,10 6,40] , [7,50 7,90] pour les coumarines simples et les furanocoumarines (Sariaslani, S.F
et al., 1983; Lalande, J et al., 2003; Tosun, A et al., 2005; Xiao, W.L et al., 2007 ; Widodo, G.P et al.,2008).
e La spectromtrie de masse des coumarines :
Les composs cycliques fortement insaturs tels que la coumarines , et mmes les ions qui ont forms
par fragmentation au niveau d'un groupement carbonyle, ont la proprit de pouvoir perdre un
groupement CO (28 uma). S'il y a plusieurs groupements CO dans une molcule, ils peuvent tre limins
les uns aprs les autres (Harbone, J.B., 1984; Lalande, J et al., 2003; Prachyawarakorn, V et al., 2006).
Schma I 1 :Exemples des fragmentations en spectromtrie
de masse des coumarines.
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III 6 Intrt pharmacologique des coumarines :
Les coumarines manifestent diverses activits biologiques, qui varient selon la substitution sur le cycle
benzopyrone (Barnard, D.L et al., 2002; Kostova, I., 2005;Sarker, S.Det al., 2005; Kostova, I et al.,
2006).
Les coumarines simples contribuent gnralement fluidifier le sang par leur activit veinotonique et
vasculoprotecteur, cest le cas de lesculoside du Marronnier dInde, ou anticoagulate du dicoumarol
produit par le Mlilot (Melilotus officinalis). Lintrt des furanocoumarines a t signal dans le cas du
traitement des spasmes nphrtiques, de langine de poitrine (khelline de lAmmi visnaga). La capacit
que possdent diverses structures furanocoumariniques provoquer une hyperpigmentation cutane
transitoire est bien connue. Ces proprits photodynamisantes sont mises profit dans le traitement des
manifestations d u vitiligo, du psoriasis et dautres affections dermatologiques. Elles peuvent aussi treutiles dans les cures de bronzage (crmes base de psoralne, Bergaptne). La visnadine, une
pyranocouamrine, est doue de proprits vasodilatatrices coronariennes et prsente comme ayant une
action favorable sur les troubles de la snescence crbrale.
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Le tableau suivant rassemble quelques exemples sur lactivit biologique des coumarines.
Tableau I 7 :Quelques exemples sur lactivit biologique des coumarines.
Lactivit Coumarines Information Rfrences
anti-inflammatoire
Angelicine
AthamantineBergaptneHerniarineImpratorineLedebouviellolePsoralneScopoletine
Cette activit dpend de la nature des
substituants des coumarines,Plusintressant, les coumarines peuventpossder des effets proinflammatoires : Le Psoralne etImpratorine une baisse dosepossdent une activit anti-inflammatoire, mais une fortedose a un effet pro inflammatoire.
Rouxel, T., 1989
Antimicrobienne
AngalicineCichoriineCiichoriine actateHerniarineUmbelliprenine
ils sont montrent que le groupehydroxyle libreen position 6 descoumarines est trs important pourlactivit antifongique ,tandis que lemme libre en position 7estimportant pour lactivitantibactrienne.
Phototoxicit
AthamantineBergaptneIsopimpinellinePeucedaninePsoralneUmbllifroneXanthotoxine
Les Psoralnes, furanocoumarinestypiques sont desphotosensibilisateurs dans la gammede 320-380 nm, une gamme ou lesacides nucliques et les protinescellulaires montrent les bandesdadsorption faible.
Crpy, M.N.,2006.
Cytotoxicit
NiffcoumarinePaepalantine
Seseline5-methoxySeselineSuberosinXanthyletineXanthoxyletine
Cette activit baser sur lessubstituant ortho-dihydroxy, enplus le groupe phnyle avoir un rletrs important dans cette activit.
Kostova, I.,2005.
Inhibiteurs de HIV
(+)-Calanolide A(-)-Calanolide BCordatolite ACordatolite BCoriandrineImperatorineSuksdorfine
Quelques coumarines inhibentdiffrents stages du cycle derplication de HIV.
Kostova, I et al.,2006.Spino, C et al.,1998.Singh, I.P et al.,2005.
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2 me Partie :
Partie Exprimentale.
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I Matriel vgtal :
Les racines d'Anacyclus pyrethrumont t obtenues de source commerciale en Avril 2007. La drogue a
t identifie grce ses caractres botaniques macro- microscopiques selon les standards. Un spcimen
de l'chantillon de rfrence se trouve dans l'herbier du laboratoire de botanique mdicale et de
pharmacognosie, du dpartement de pharmacie de l'Universit Mentouri Constantine, sous le nAPY001-
97.
II Mthode dExtraction :
Les racines dAnacyclus pyrethrum sches sont finement pulvrises dans un broyeur couteaux. La
poudre dA pyrethrum(700 g) est macre froid en contact avec lhexane (Hex) pendant 3 jours. Aprs
filtration, le solvant est limin par vaporation sous vide une temprature modre (
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III Mthodes chromatographiques :
III 1 Chromatographie sur couche mince (CCM) analytique :
Les plaques chromatographiques en couche mince analytiques ont t obtenues de source commerciale
(Merck). Elles sont constitues dune plaque daluminium recouverte dun gel de silice 60F254. Aprs leur
dveloppement, les chromatogrammes sont examins, la lumire du jour et sous lampe UV 254 et 366
nm. Elles sont rvles ensuite par les ractifs de dtection.
Tableau II 1 :Composition dessolvants pour lanalyse par CCM des extraits bruts.
Pourcentagelange du solvantextrait test
9 : 1
7 : 3
Hex / EtOAc
Hex / EtOAc
Hex
9 : 19 : 16,5 : 3,59 : 19 : 19 : 1
EP / EtOAcHex / CH2Cl2CHCl3 / ActoneCHCl3/ Me OHEtOAc / Me OHHex / EtOAc
DCM
8 : 21 : 9
Hex / EtOAcHex / EtOAc
EtOAc
6 : 46 : 4 : 1
EtOAc / Me OHEtOAc / Me OH / H2O
EtOH
8 : 28 : 2
Hex / EtOAcEtOAc / Me OH
HA
Pour lanalyse de la puret des composs isols par CCM, les systmes de solvants suivants ont t
utiliss (tableau II 2).
Tableau II 2 :
Conditions chromatographiques particulires.
Pourcentagelange du solvantomposs
9 : 1EP / EtOAcA, B et C
9 : 1100 %4 : 1
CH2Cl2/ ActoneCH2Cl2Cyclohexane / EtOAc
D
1 : 1 : 1Tolune / EP / CH3 COOH glacialE100 : 11 : 11 : 27EtOAc / HCOOH / CH3 COOH glacial / H2 OF, G et H
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III 2 Chromatographie sur colonne de gel de silice (CC) :
Les caractristiques de la colonne en verre utilise dans le fractionnement des extraits bruts DCM et
EtOH sont reportes dans le tableau II 4.
Tableau II 3 :Caractristiques de la colonne chromatographique (CC).
Diamtre de la colonne 2,5 cmHauteur de la colonne 40 cmHauteur du gel de silice dans la colonne 23 cm
Poids du gel de silice 48 g
Type de Gel de silice 60 (0.063-0.200 mm),(70-230 mesh ASTM)Fournisseur MERCK
III 2 1 Fractionnement de l'extrait DCM :
Lextrait DCM (2 g) a t fractionn par chromatographie sur une colonne de gel de silice en phase et
pression normale. Llution est ralise au moyen de lhexane dont augmente la polarit par laddition
progressive de lactate dthyle. La polarit de l'luant est ensuite augmente par l'addition graduelle du
mthanol. Llution complte de la colonne est ralise avec du mthanol pur.
Tableau II 4 :
Composition de lluant utilis dans le fractionnementpar CC de lextrait DCM.
Fractions Eluant Volume (ml)
Hexane EtOAc Me OH
F1F3 100 00 00 200F4F7 90 10 00 300F8F10 80 20 00 200F11F15 70 30 00 300F16F20 60 40 00 300F21F23 50 50 00 200
F24F26 40 60 00 200F27F33 30 70 00 400F34F38 20 80 00 300F39F43 10 90 00 300F44F46 00 100 00 300F47F53 00 90 10 200F54F59 00 50 50 200F60F62 00 10 90 100
F63F67 00 00 100 150
III 2 2 Fractionnement de l'extrait EtOH :
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Lextrait EtOH (2 g) a t fractionn sur colonne de gel de silice en phase et pression normale. Llution
est ralise au moyen de lactate dthyle dont augmente la polarit par laddition progressive de
mthanol.
Tableau II 5 :Composition de lluant utilis dans le fractionnement
par CC de lextrait EtOH.
15000100F1F71000595F8F101001090F11F141002080F15F191002575F20F231003070F24F301003565F31F37504060F38F40504555F41F44505050F45F47506040F48F50507030F51F53
1008020F54F601009010F61F6710010000F68F74
III 3 Chromatographie sur plaques prparatives :
Des plaques chromatographiques de verre (20x20cm), recouvertes de gel de silice 60F254, dpaisseur de
2 mm ont t utilises dans un but de sparation et purification. Les plaques sont prpares selon la
mthode standard (Macek, K., 1972) et actives dans une tuve 105C pendant 30 min.
Tableau II 6 :Systmes de solvants utiliss pour la CCM prparative.
Pourcentagelange du solvantot purifi
9 : 1EP / EtOAcLot 4 et 5 (pour lextraitDCM)100 %EtOAcLot 6 (pour lextraitEtOH)6 : 4EtOAc / Me OHLot 10 (pour lextraitEtOH)100 : 11 : 11 : 27EtOAc / HCOOH / CH3 COOH glacial / H2 OLot 10 S 2(pour lextraitEtOH)
Fractions
Volume (ml)
EtOAc
MeOH
Eluant
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III 4 Ractifs de rvlation utiliss en CCM :
Les ractifs chimiques didentification ont t prpars selon les mthodes standards (Macek, K., 1972;
Wagner, Het al., 1984). Les principaux ractifs de rvlation sont prsents dans le tableau II 9 suivant
:Tableau II 7 :Ractifs de rvlation en CCM utiliss.
Mtabolites secondaires
dtect
Mode opratoireactifs
Coumarines.Vaporiser une solution aqueuse dactate de plomb 5 % sur la plaque et voir directement sous la lampeUV 366 nm.
Lactate
de Plomb
Strodes, Terpneset drivs phnyle-
propane.
Solution dacide sulfurique 10 %. Aprs lapulvrisation du ractif mettre la plaque CCM
pendant une dizaine de minutes ltuve (1000
C).
Acide
sulfurique
Strodes, Terpnes,drivs phnyle-
propane etAlkamides.
Mlanger 0,5 ml d'anisaldhyde (4-mthoxybenzaldhyde) avec 10 ml d'acide actiqueglacial. Ajouter 85 ml de mthanol puis mlanger.Ajouter 5 ml d'acide sulfurique concentr, lasolution ainsi obtenue est homognise et garde 4 0C pendant toute la dure d'utilisation. Aprs lapulvrisation du ractif mettre la plaque CCMpendant une dizaine de minutes ltuve (100 0C).
Lanisaldhyde
Coumarines.10 % thanolique potassium hydroxyde (KOH).Aprs la pulvrisation du ractif voir la plaque CCM
sous la lampe UV 366 nm.
Borntrager
Alcalodes.
une solution de 0,85 g de nitrate basique de bismuthet 10 g dacide tartarique dans 40 ml deau (solutionA), une solution contenant 16 g de KI dans 40 mldeau (solution B). Mlanger 5 ml de A, 5 ml de B,100 ml deau et 20 g dacide tartarique, vaporiser lemlange sur la plaque.
Dragendorff
Strodes etTerpnes.
Une premire solution compose d'un mlange volume gale (5 ml) d'acide sulfurique et l'anhydrideactique, cette solution, on rajoute 50 ml d'thanolabsolu. La prparation est effectue froid dans dela glace. Aprs la pulvrisation du ractif mettre laplaque CCM pendant une dizaine de minutes
ltuve (1000
C).
Liebermann
Burchard
Strodes, Terpneset drivs phnyle-
propane.
mlange d'une solution thanolique d'acidesulfurique et d'une solution thanolique de vanilline 1 %. Aprs la pulvrisation du ractif mettre laplaque CCM pendant une dizaine de minutes ltuve (100 0C).
Vanilline
sulfurique
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IV Analyses microchimique didentification:
Des ractions en tube ont t utilises pour la caractrisation prliminaire des principes prsents dans les
extraits bruts. Leur prparation sest faite selon les protocoles standards dcrits dans la littrature
(Debray, M.M., 1970; Dohou, Net al., 2003;Akinlolu, A.A et al., 2006; Egwaikhide, P.A.Eet al., 2008).
Tableau II 8 :Ractions de caractrisation chimique en tubes.
Classes des Composs Mode opratoire Observation
Anthracniques
libres
A 1 ml d'extrait DCM ajouter 1 mld'ammoniaque.
la coloration rouge indiquant laprsence d'anthracniques libres.
Coumarines
Dissoudre 1 ml d'extrait DCMdans deux tubes essai, aucontenu de l'un des tubes ajouter0,5 ml de NH4OH 25 %.
Procder lobservation sous UV 366 nm.Une fluorescence intense indiquela prsence des coumarines.
Strols
et Triterpnes
Dissoudre 1 ml d'extrait DCMdans 1 ml d'anhydride actiquepuis 1 ml de chloroforme etrpartir la solution entre 2 tubes essai. A l'aide d'une pipette ajouter1 ml de H2SO4concentr au fonddu tube sans agiter.
La formation d'un anneau rougebruntre la zone de contact desdeux liquides et une colorationviolette de la couche surnageantrvlent la prsence de strols ettriterpnes.
Tanins
A 5 ml d'extrait DCM ajouter 1 mld' HCl.
en prsence de tanins il sedveloppe un prcipit rouge.
V Mthodes danalyse spectroscopiques :
V 1 Spectroscopie UV visible :
Les spectres UV des diffrents produits sont enregistrs dans le MeOH grade spectroscopie, sur un
appareil Shimadzu UV 3101 PC (Laboratoire de physique, Universit de Mentouri, Constantine).
V 2 Spectroscopie infrarouge (IR) :
Les spectres IR des diffrents produits sont enregistrs, en utilisant des pastilles de KBr, sur un appareil
de type Shimadzu FT / IR 460 (Unit danalyses physico-chimiques, dpartement Chimie, Universit de
Mentouri, Constantine).
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V 3 Spectroscopie de rsonance magntique nuclaire (RMN
1
H) :
Les spectres de rsonance magntique nuclaire, en mode 1H, sont raliss sur un appareil Brucker
250MHz (Unit danalyses physico-chimiques, dpartement Chimie, Universit de Mentouri,
Constantine). Les dplacements chimiques sont exprims en partie par million (ppm), les constantes de
couplage J sont exprimes en Hertz (Hz).
V 4 Spectromtre de masse :
Les spectres de masse des produits C et D ont t enregistrs en EI (Impact Electronique) sur un
spectromtre de masse de type Bruker Daltonics Data Analysis 3.4, (Facult de pharmacie, Universit
Louis Pasteur de Strasbourg, France, voir remerciements).
VI Activit antidermatophyte :
VI 1 Prparation du milieu de culture :
Le milieu de culture Sabrouraud glucose classique (voir le tableau II 12) est modifi par lajout de 0,4
g de chloramphnicol et 0,5 g cycloheximide par litre au milieu reconstitu. Aprs strilisation (1bars,
1200
C, 20 min) lautoclave le milieu est conserv basse temprature jusqu lutilisation.
Tableau II 9 :Composition (g/l) du milieu Sabouraud pour la culture de dermatophytes.
Constituants Teneur (g/l)
Peptone pour mycologie
Glucose
agar
10
40
15
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VI 2 Prparation des solutions tester :
a Extraits vgtaux et fractions enrichies:
Les extraits et fractions enrichies secs ont t reconstitues en solution en utilisant 70 % de mthanol dans
leau, additionne de 1% de DMSO. Les prparations vgtales ont t additionnes au milieu de culture
avec une concentration de 100 g/ml.
b Solution de rfrence :
Lantifongique tmoin, Grisofulvine, est mis en solution par dissolution de la quantit requise dans leau
distille contenant 1% de DMSO. La grisofulvine est additionne une concentration de 0,6 g/ml,
correspondant la CMI vis--vis de la souche fongique deMicrosporum canis(Larpent, J.Pet al., 1989).
c Contrle :
Le contrle est constitu par addition dune solution alcoolique 70% deau distille, additionne de 1%
de DMSO.
VI 3 Prparation des plaques multi puits :
La mthode dvaluation de lactivit antifongique a t adapte pour les besoins du criblage des extraits
et fractions des racines dAnacyclus pyrethrum. Des plaques multi puits striles, 12 puits de diamtre 2
cm, obtenues de chez IWAKI Japan, ont t utilise la place des boites ptri classiques.
VI 4 Prparation de linoculant fongique :
Linoculation des cultures est ralise sous hotte, partir de matriel fongique jeune, croissance rapide
contenant du myclium et chlamydospores. Un disque du myclium prlev sur le pourtour dune culturefongique ge de 5-8 jours est tritur dans un volume suffisant deau strile utilisant un agitateur vortex
pour librer le maximum de myclium dans le milieu. La qualit (densit et homognit) de la solution
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dinoculation est apprcie par examen sous microscope avant chaque srie linoculation. Celle-ci est
ralise sous des conditions dasepsie, par laddition dun volume dtermin de linoculant fongique au
milieu de culture. Les cultures sont maintenues 37 0 C pendant 5 8 jours, jusqu une croissance
approprie du matriel fongique.
VI 5 Mesure de lactivit antifongique :
Lactivit antifongique est ralise par comparaison du diamtre de croissance des souches, en prsence et
en absence des prparations vgtales testes, du contrle et de lantifongique tmoin (Grisofulvine). Le
diamtre de la croissance des colonies est mesur laide dun pied coulisse lectronique affichage
digitale (Velleman DCA 150, lecture aux 1/100 prs).
Le pourcentage de linhibition du myclium (INH) est calcul comme suit :
INH (%) = [(D cont D trait) / D cont] X 100
D cont : Diamtre de croissance dans le contrle.
D trait: Diamtre de croissance dans le traitement.
VI 6 Traitement statistique des donnes :
Les rsultats sont exprims sous forme de moyennes affectes de lcart type [Moy SD]. Pour ltude
statistique, les diffrents relevs ont t analyss par le test student, sur un logiciel Microcal, version 6,0
Windows (Microcalsoftware, USA).
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3 me Partie :
Rsultats et Discussion.
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Introduction
Une tude effectue auparavant sur lextrait hydroalcoolique des racines dAnacyclus pyrethruma rvl
une forte activit antifongique sur trois souches de dermatophytes tudies : Microsporum canis,
Microsporum nanumet Trichophytum rubrum.
Ce prsent travail est une continuit de ltude cite et a comme objectif de contribuer caractriser le
profil mtabolique des racines dA.pyrethrum et la nature chimique des substances intervenant dans
lactivit inhibitrice des dermatophytes.
I Obtention des extraits bruts dAnacyclus pyrethrum :
Cinq extraits bruts de polarit distincte, ont t obtenus selon le protocole dextraction dcrit en partie
exprimentale, est repris dans le schma III 1. Les extraits bruts prsentent les caractristiques
physiques reportes dans le tableau III 1.
Tableau III 1 :Caractristiques physiques des extraits bruts dA.pyrethrum.
Extraits Masse
(g)
Rapport dextraction
(masse extrait/MV)
Aspect Couleur
Hex 12,64 (1 : 55) Sirop Jaune citronDCM 16,22 (1 : 43) Rsineux Marron brillantEtOAc 04,57 (1 : 153) Rsineux Marron brillantEtOH 18,77 (1 : 37) Rsineux Marron foncHA 26,06 (1 : 27) Rsineux Marron trs foncMV : matire vgtale
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Schma III 1 :Protocole dextraction en mode gradient.
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II Criblage biologique prliminaire des extraits bruts :
Lvaluation biologique des cinq extraits bruts des racines dA. pyrethrum a t effectue selon la
procdure dcrite en partie exprimentale ( VI, page 51), en utilisant une souche de dermatophyte, le
Microsporum Canis.
Les solutions dextraits bruts de concentration 100 g / ml, sont reconstitues dans un mlange de 70% de
mthanol dans leau distill, additionn de 1% de DMSO. La croissance des colonies de dermatophyte au
contact des divers extraits est compare celle du contrle (solution dalcool + 1%DMSO) et de
lantifongique tmoin (griseofulvine, GRISEO). Le test dactivit est rpt au moins 3 fois pour chaque
traitement.
Les rsultats de cette valuation dactivit sont exprims en diamtre de croissance (tableau III 2) et enpourcentage dinhibition (tableau III 3, figure III 1)
Tableau III 2 :Effet des extraits bruts dA.pyrethrum sur les cultures de M. canis (exprim en diamtre decroissance fongique +/- cart type ou SD).
Extra