Download pdf - Rapport stage pm

Biogenèse des Signaux PeptidiquesUniversité Pierre et Marie Curie - ER3 BIOSIPE

Responsables de stage : Sandrine Cadel, Thierry Foulon

Parcours « Molécules et Cibles Thérapeutiques »Année 2009-2010

Patricia Masson

1

Recherche d’acides aminés impliqués dans la spécificité de reconnaissance du substrat et dans le mécanisme

catalytique de l’Aminopeptidase B

L’aminopeptidase B (EC 3.4.11.6)

• Enzyme monomérique : 72 kDa

• Ubiquitaire chez les vertébrés

• Zn2+-métallopeptidase

• HEXXHX18 E - Famille M1

• Enlève les résidus basiques (R, K) en NH2 terminal des peptides (Arg-enképhalines…)

• Activation par les ions chlore

• Phylogénétiquement très proche de la LTA4 hydrolase (33% identité, 48% similarité de séquence)

2

• Présente une activité résiduelle leucotriène A4 hydrolase in vitro

• Enzyme bifonctionnelle

• Protéine monomérique de 69 kDa

• Enzyme bifonctionnelle

• LTA4 Hydrolase

• Aminopeptidase (Ala, Arg, Lys, Pro, Leu)

• Famille M1 des aminopeptidases

• Activation par les ions chlore

• Structure 3D (Thunnissen et al., 2001)

La leucotriène A4 hydrolase (EC 3.3.2.6)

Modèle moléculaire de l’Aminopeptidase B

NH2

Domaine catalytique

COOH

Famille M1 des Aminopeptidases HEXXHX18E

Liaison peptidique

Mécanisme catalytique proposé pour l’activité aminopeptidase Mécanisme catalytique proposé pour l’activité aminopeptidase de la LTAde la LTA44 hydrolase hydrolase

(Tholander et al., 2008)

ObjectifsObjectifs

But : Identifier des résidus de l’Ap-B ayant un rôle dans le mécanisme enzymatique et la spécificité de reconnaissance du substrat

Mutagenèse dirigée

Alignements des séquences des aminopeptidases de la famille M1

Modèle moléculaire de l’Ap-B

7

Matériels et MéthodesMatériels et MéthodesMutagenèse dirigée

Expression et purification des protéines (HP His trap et Sephadex G100)

Test d’activité (spécificité de substrat; KM, kcat, Ki, effet des ions Cl-)

Electrophorèse et Western Blot

M

72 kDa

M

72 kDa

170kDa

95kDa

72kDa

55kDa

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25 30 35 40

D404V Colonne NiDO 535nm

Fractions

DO 535nmFractions

0,00820,02140,0360,03480,191100,549120,373130,143140,067150,035160,023170,022180,033190,015200,014210,016220,023230,006240,022260,014280,01230

0320,006340,005360,007380,00640

9

Cibles de mutagenèse dirigée

Reconnaissance et la fixation du substrat?

Mécanisme catalytique?

10

Les mutants Y228F, Y408F, Y413F et Y440F

Tyr 408

Tyr 413

Tyr 228

Tyr 440

Les mutants Y408F et Y440F

0

0,4

0,8

1,2

1,6

0 2 4 6 8 10

Y409F Effet du NaCl

DO 535nm + NaClDO 535nm - NaCl

Quantité d'enzyme (µl)0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 2 4 6 8 10

Y441F Effet du NaCl


Quantité d'enzyme (µl)

• Effet des ions chlore

Augmentation de l’activité d’un facteur 3 en présence de 150 mM NaCl

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 2 4 6 8 10

Y441F Effet du NaCl


Quantité d'enzyme (µl)

Y408F Y440F

Mutant Activité KM (µM) kcat (s-1)kcat/KM

(µM-1. s-1)

Sauvage oui 115 28 0,243

Y228F non - - -

Y413F non - - -

Y408F oui 86 4,1 0,048

Y440F oui 47,3 2,5 0,053

• Paramètres cinétiques (L-Arg β-NA)

Diminution de l’efficacité catalytique (x 5) pour les mutants Y408F et Y440F

Les mutants Y228F, Y408F, Y413F et Y440F

Arphaménine A (1 µM)

Arphaménine B (1 µM)

Bestatine (1 µM)

Sauvage100 %

Ki = 20 nM 100 %

Ki = 20 nM 100 %

Ki = 50 nM Y408F 20 % 40 % 25 %

Y440F70 %

Ki = 120 nM 94 %

Ki = 40 nM 54 %

Ki = 155 nM

• Effet des inhibiteurs

Modification du profil d’inhibition

Les mutants Y408Fet Y440F

Les mutants tyrosine : Hypothèses / ConclusionsLes mutants tyrosine : Hypothèses / Conclusions

• 2 tyrosines dont la fonction hydroxyle est 2 tyrosines dont la fonction hydroxyle est essentielle dans l’activité : essentielle dans l’activité :

•YY413413 polarise et maintient le carbonyle de la liaison peptidique clivée

•YY228228 établit une liaison hydrogène avec E300 qui lui même interagit avec

l’extrémité amino-terminale du peptide

•YY408408 Interaction π avec le groupement guanidinium ou aminé du substrat- Spécificité de substrat?

Liaison hydrogène avec la Y413

• YY440440 conservée : Rôle architectural / Attraction de molécule d’eau ???

Les mutants D403V, D405N, D405V et D406N

Gel

D403, D405 et D406

D368, D371, D373 et D375 de la LTA4 hydrolase

16

Les mutants D403V et D406N : spécificité de reconnaissance du substrat

D406ND403V

Activité majoritaire avec les substrats basiques : Arg et Lys

Elargissement de la spécificité de reconnaissance : Arg, Lys, Ala,

Pro, Leu, Tyr, Phe, His et Met

17

Les mutants D405N et D405V : spécificité de reconnaissance du substrat

Diminution d’un facteur 2 de l’activité

vis-à-vis de substrat s basiques pour le D405V

par rapport au D405N

Elargissement de la spécificité de

reconnaissance : Arg, Lys, Ala, Pro, Leu, Tyr,

Phe, His, Met

18

Les mutants D403V, D405N et D405V

WT D403V D405N D405V

L-Arg

kcat( s-1) 28 0,9 2,7 0,5

Km(µM) 115 114 136 63

kcat/Km(µM-1.s-1) 0,243

0,008(÷30)

0,020(÷12)

0,007(÷35)

L-Lys

kcat( s-1) 9 1,3 - -

Km(µM) 188 176 - -

kcat/Km(µM-1.s-1) 0,047

0,007(÷3)

- -

L-Ala

kcat( s-1)

Liaison peptique non hydrolysée

2,4 1,3

Km(µM) 401 212

kcat/Km(µM-1.s-1) 0,005 0.006

L-Pro

kcat( s-1) 1,5 -

Km(µM) 252 -

kcat/Km(µM-1.s-1) 0,005 -

19

Les mutants D405N et D405V

• Effet des ions chlore

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

D406N : % d'activité = f (Concentration en NaCl)

L-ArgL-AlaL-LeuL-LysL-ProL-HisL-PheL-MetL-Tyr

Concentration en NaCl (mM)

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

D406V : % d'activité = f ( Concentration en NaCl)

Concentration en NaCl (mM)

Augmentation d’un facteur 4 de l’activité à 200mM de NaCl vis-à-vis du

L-Arg β-NA

Effet moindre vis-à-vis du L-Arg β-Na (2X) mais plus prononcé vis-à-vis d’autres substrats : Pro, Tyr

(2X)

D405ND405V

20

Le mutant D405V


Très faible inhibition par les arphaménines A et B

contrairement à la bestatine

D405V

Les mutants aspartates : Hypothèses/Conclusions

• Liaison électrostatique entre le D405 et le groupement guanidinium de l’arginine (RAR) dans ce modèle

• Hypothèse : déstructuration de la petite hélice pour induire une orientation différente de D405 et D406 lorsque le substrat est positionné

• Effet du chlore complexe, ne semble pas lié à la charge négative du D405. Le remplacement D405V modifie cet effet.

Asp 405

Asp 403

Asp 406

• Les chaines latérales et en particulier les charges négatives de D405 et D406 sont importantes

pour la spécificité de l’Ap-B

PerspectivesPerspectivesConfirmer les résultats obtenus

Effet du chlore : paramètres cinétiques (KM, kcat) en fonction du substrat et de la mutation

Concevoir d’autres mutants:Simples: F296Y, K599G, Y408G…Doubles: F296Y/K599R; D405N/D406N, D405V/D406V …Triples: D403A/D405A/D406A….

Activité vis-à-vis de différents peptides

Informations structurales (dichroïsme circulaire, spectroscopie de fluorescence)

Structure 3D avec un inhibiteur confirmation du modèle proposé

À plus long terme : À plus long terme :

Décrypter les mécanismes catalytiques

Différences entre ApB et la LTA4 hydrolase(bifonctionnalité)

Conception d’ inhibiteurs spécifiques de chacune des activités de l’ApB Cibler pathologies

Identifier les substrats peptidiques physiologiques de l’ApB

24

MUTAGÉNÈSE POUR FAIRE UN SITE ACTIF SIMILAIREMUTAGÉNÈSE POUR FAIRE UN SITE ACTIF SIMILAIRE À CELUI DE LA LTAÀ CELUI DE LA LTA44 HYDROLASE HYDROLASE

Etude du mutant K599R

Mutant KM (µM) kcat (s-1) kcat/KM (µM-1. s-1)

Sauvage 115 28 0,243

K599R73

(÷1,6)6,5

(÷4,3)0,089(÷2,7)

• Paramètres cinétiques

Diminution de l’efficacité catalytique d’un facteur 2,7


Mutant Arphaménine A (1 µM)

Arphaménine B (1 µM)

Bestatine (1 µM)

Sauvage Ki = 20 nM Ki = 20 nM Ki = 50 nM K599R Ki = 300 nM Ki = 160 nM -

27

Liaison électrostatique entre le groupement aminé et le

carboxylate C-terminal du peptide:Arg β-NA pas d’intérêt

Effet des inhibiteurs est moindre avec le mutant K599R

Liaison électrostatique avec le E569 moins forte ??

K599

E569

R704

Le mutant K600R : Hypothèses/Conclusions