S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales
Techniques de base de la vitroculture
Vitroculture et vitrométhodes
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Aspects techniques
Organisation du laboratoire
Préparation des milieux et
stérilisation
Repiquage en conditions
stériles
Chambre de culture
Laverie
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S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Conditions de culture
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Stérilisation des explants
Ethanol Hypochlorite de sodium ou calcium Peroxyde d’hydrogène Nitrate d’argent
Protocole de stérilisation des explants végétaux
Choix del ’échantillon
1/ Ethanol 10 s2/ Ca(OCl)2 7%, 10 mn3/ 3 lavages H2O stérile
Découpage de l’explantet mise en culture
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Milieu de culture
Eau
Agents solidifiants : – agar– phytagel :
polymère d’origine bactérienne (acide glucuronique, rhamnose et glucose)
translucide !! Interférences avec la kanamycine !!
Conditions de culture
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Milieu de culture
Source de carbone
Conditions de culture
?In vitro, la majorité des cultures végétales
sont hétérotrophes
Choix de la source carbonée•Saccharose•glucose•maltose
Cas par cas : •substances de croissance
•génotype
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Milieu de culture
Éléments minéraux
Macroéléments : N,P,K, Ca, Mg, S ex : rapport NO3
- / NH4
+
Microéléments : autres oligoéléments
Conditions de culture
Utilisation de nitrate d’argent comme antagoniste de l’éthylène
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Substances de croissance
Auxines (dérivés du tryptophane) Cytokinines (dérivés de l’adénine) Gibbérellines (diterpènoïdes)
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Substances de croissance
Les auxines
Conditions de culture
Naturelle :•Acide Indole Acétique = IAA N
CH2 CO2 H
HCH2 CO2 H
Synthétiques :•Acide Naphtalène Acétique
•2,4-D (acide dichlorophenoxyacétique)
OCH2 CO2 H
Cl
Cl
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Mode de production des auxines Site de production:bourgeon apical
Diffusion des hormones- dominance apicale- stimulation de la rhizogenèse
Conditions de culture
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Au niveau cellulaire : elles stimulent l’élongation
Au niveau tissulaire : Elles stimulent la croissance racinairepour de faibles concentrations (sauf le 2,4-D)
Rôle des auxines
Elles inhibent l’élongation de la tige feuillée et le débourrement des bourgeons axillaires
Conditions de culture
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Substances de croissance
Les cytokinines– Naturelles
Isoprénoïd CK (ex: zéatine) Aromatic CK (ex: BA)
Conditions de culture
Synthétiques •Kinétine•Benzyl AdénoPurine (BAP)
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Mode de production des cytokinines
Site de production:Racines
Transport vers lessites d ’action :- levée de dominanceapicale- débourrement desbourgeons axillaires
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Au niveau cellulaire : elles stimulent la division cellulaire via l’induction de Cyclines
Au niveau tissulaire : En général, inhibition de la croissanced’apex racinaires
Induction de l’activité des méristèmes apicaux des organes aériens
Rôle des cytokinines
Surexpresseur de CYCD3Riou-Khamlichi et al., 1999 Science
Expression de CYCD3 en fonction des traitements hormonaux chez A.thaliana
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Substances de croissance
Gibbérellines (Acide gibbérellique)– Noyau ent-Kaurène (issu du geranyl-geranyl PP)
Conditions de culture
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Gibbérellines (Acide gibbérellique)– Effets complexes :
Stimulation croissance internodale, expansion des feuilles Inhibition de la croissance racinaire à la lumière Favorise au contraire la croissance racinaire à l’obscurité
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Milieu de culture
Éléments organiques divers
Acides aminés (glycine, cystéine…)
Vitamines (thiamine, acide nicotinique, acide folique…)
Mélanges organiques complexes
Antioxydants
Conditions de culture
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Comment obtenir un calet des cellules indifférenciées ?
Cellules indifférenciées
Coupure
callogenèse
S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales callogenèse
S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales callogenèse
S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales callogenèse
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S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales organogenèse
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Organogenèse
Régénération d’organes à partir d’un cal
Skoog et Miller (1957)
[Auxine]
[Cytokinine]
Callogenèse
Rhizogenèse
Cau
loge
nèse
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Méthode classique– 1 – Explants sur un milieu inducteur de cal = CIM– 2 – Transfert quelques jours plus tard sur un milieu
inducteurs de tiges feuillées = SIM– 3 – Transfert après quelques semaines sur un
milieu inducteur de racinesPour un exemple détaillé lire l’article “classique” de Valvekens et al. 1987 PNAS sur la méthode d’Agrotransformation de racines d’Arabidopsis
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