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2
Sommaire Remerciements ........................................................................................................................... 3
Liste des abréviations ................................................................................................................. 4
Résumé ....................................................................................................................................... 6
I. Introduction ......................................................................................................................... 7
1. Le cancer du sein ............................................................................................................. 7
2. NGF et ses deux récepteurs TrkA et p75NTR ................................................................... 8
3. NGF et cancer du sein ................................................................................................... 10
4. Inhibition par les kinoïdes ............................................................................................. 11
II. Un exemple de résultats obtenus avec la stratégie kinoïde ........................................... 14
1. L’immunisation IFN-K induit-elle la production d’anticorps anti‐huIFNα2b et sont-ils neutralisants ? ....................................................................................................................... 14
2. Y a-t-il activation de la mémoire immunitaire après immunisation IFN‐K ? .............. 15
3. Les anticorps induits sont-ils spécifiques de l’IFNα ? .................................................. 16
• huIFNα ....................................................................................................................... 16
• huIFNβ ....................................................................................................................... 17
• huIFNγ ....................................................................................................................... 17
4. Les anticorps induits peuvent-ils neutraliser les séra de patients atteints de SLE ? ...... 17
5. Conclusion ..................................................................................................................... 17
III. Projet de recherche ........................................................................................................ 19
1. Production des kinoïdes ................................................................................................ 19
2. Choix des peptides ........................................................................................................ 20
3. Immunisation des souris BALB/c ................................................................................. 21
4. Tests in vitro .................................................................................................................. 21
5. Tests in vivo ................................................................................................................... 23
• Xénogreffes et traitements par le kinoïde .................................................................. 23
• Analyse des effets des anticorps générés sur les xénogreffes ................................... 23
IV. Perspectives ................................................................................................................... 25
V. Références bibliographiques ......................................................................................... 26
VI. Annexes ......................................................................................................................... 29
3
Remerciements
Nous tenons tout d’abord à remercier Laurence Nieto et Rémy Poupot pour avoir
organisé et coordonné ce projet de recherche passionnant.
Nous remercions notre référent Rémy Poupot, pour nous avoir proposé un thème de
projet scientifique innovant ; en particulier, pour les échanges autour des divers aspects du
projet. Merci pour l’attention portée à nos réflexions et idées autour du projet.
Nous tenons aussi à remercier toute l’équipe pédagogique de la formation Expression
génique et protéines recombinantes pour leurs enseignements de qualité et leurs disponibilités,
et plus particulièrement Laurent Paquereau, Vincent Ecochard et Pascal Demange pour leurs
soutiens techniques et pour les réponses données à nos interrogations multiples.
Notre reconnaissance va également à Honoré Mazargui et Nathalie Doncescu de la
plate-forme de synthèse de l’IPBS ainsi qu’à Denis Hudrisier pour la pertinence de leurs
conseils.
Pour finir, nos remerciements vont aussi aux relectrices de notre rapport Loubna
Lamkharbech, Mylène Camus et Manon Durand.
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Liste des abréviations
A549 : Cellules adénocarcinome d’épithélium pulmonaire
ATCC : American Type Culture Collection BDNF : Brain Derived Neurotrophin Factor
CRD : Cystein Rich Domain
ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EMCV : Encephalomyocarditis virus
EMEM : Eagle’s Minimal Essential Medium
ERK : Extracellular signal-regulated kinase
HER2 : Human Epidermal Growth Factor Receptor-2
hu : Humain
IFN : Interféron
IFNgf : Interféron α2b humain cross-linkés seuls
IFN-K : Kinoïde interféron α2b humain
IgG : Immunoglobuline
IL : Interleukine
IPBS : Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale
KLH : Keyhole Limpet Haemocyanin
LT : Lymphocyte T
mAb : Monoclonal Antibody
MAPK : Mitogen-activated protein kinase
MCF-7 : Michigan Cancer Foundation-7
MDBK : Madin-Darby Bovine Kidney
MTS/PMS : 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)/phenazine methosulfate
NBEC : Normal Breast Epithelial Cells
NC50 : 50% de capacité de neutralisation
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NF-κB : Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
NGF : Nerve Growth Factor
NT : Neurotrophine
NTR : Neurotrophin Receptor
OPD : o-phenylènediamine dihydrochloride
p75NTR : p75 Neurotrophin Receptor
PBS : Phosphate Buffered Saline
PI3K : Phosphatidylinositol 3-Kinase
SCID : Severe combined immunodeficiency
SLE : Systemic Lupus Erythematosus
SVF : Sérum de Veau Fœtal
TGF : Transforming Growth Factor
TNF : Tumor Necrosis Factor
TNF-R : Tumor Necrosis Factor Receptor
TRAIL : Tumor-necrosis-factor Related Apoptosis Inducing Ligand
TUNEL : Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling
Trk : Tropomyosin-Related Kinase
VEGF : Vascular endothelial growth factor
VSV : Virus de la stomatite vésiculaire
6
Résumé
Alors que les cancers du sein in situ sont de nos jours bien soignés, de meilleurs
traitements restent à mettre en place pour les cancers du sein invasifs, mal soignés. Les
cellules tumorales sécrètent la neurotrophine NGF pour stimuler leur développement
(prolifération, invasion, …). Les effets de NGF sont dus à l’activation de ses deux récepteurs,
TrkA et p75NTR, qui sont surexprimés dans les cancers du sein. Ce facteur de croissance, ainsi
que ces deux récepteurs, apparaissent donc être de nouvelles cibles thérapeutiques
prometteuses pour traiter le cancer du sein.
Nous avons choisi de nous appuyer sur la technologie des kinoïdes, basée sur le
principe de l’immunisation active, dans le but de développer un traitement ciblant à la fois
NGF, TrkA et p75NTR. Le kinoïde, complexe composé du KLH, une protéine fortement
immunogène, sur lequel nos cibles protéiques seront greffées, va être reconnu par le système
immunitaire. Une forte production d’anticorps polyclonaux dirigés contre les cibles greffées
sera alors induite. Ainsi, nous projetons de produire des kinoïdes monospécifiques (ciblant
une seule de nos trois cibles) avec différentes séquences peptidiques pour chacune des trois
cibles dans le but de sélectionner in vitro les séquences pour lesquelles les anticorps générés
auront la meilleure réponse anti-tumorale. La capacité des anticorps (produits après
immunisation des souris avec le kinoïde) à inhiber les effets de NGF sur des cellules de
cancer du sein humain sera évaluée sur des cellules de cancer du sein humaines. A partir de
ces séquences, un kinoïde trispécifique sera réalisé, et l’efficacité des anticorps produits
seront testés in vitro comme précédemment mais aussi in vivo sur des souris xénogreffées
avec des cellules cancéreuses humaines.
L’objectif de ce projet est d’effectuer la preuve de concept de l’approche utilisant un
kinoïde trispécifique.
7
I. Introduction
1. Le cancer du sein
Aujourd’hui, le cancer du sein est le plus répandu chez la femme avec 400 000 décès
par an dans le monde (world cancer report, OMS, 2008). En France, c’est la première cause
de mortalité féminine par cancer. Ce cancer est caractérisé par l’apparition fréquente de
métastases pulmonaires, pleurales, hépatiques, osseuses et cérébrales (Weigelt et al, 2005).
Les métastases représentent la principale cause de mortalité. Il existe différents types de
cancers du sein, les adénocarcinomes étant les plus courants (95%). Les cancers du sein se
développent à partir des canaux (cancers canalaires) et des lobules (cancers lobulaires) de la
glande mammaire. Ils sont dits « in situ » lorsque les cellules cancéreuses sont confinées aux
canaux et lobules, et « infiltrants » lorsque les cellules cancéreuses sont présentes dans les
tissus qui les entourent. Dans ce dernier cas, les cellules malignes se propagent
éventuellement dans les ganglions situés sous les bras (ganglions axillaires) et dans
l'organisme. Le cancer du sein peut survenir aussi chez l'homme, mais il est rare (environ 200
fois moins fréquent que chez la femme).
Il existe à l’heure actuelle cinq types de traitements, seuls ou associés : la chirurgie
(mastectomie ou turectomie), la radiothérapie (curiethérapie et radiothérapie externe), la
chimiothérapie, l’hormonothérapie et le traitement ciblé.
L'hormonothérapie est destinée aux femmes ayant une tumeur du sein
hormono-sensible, définie par la présence de récepteurs aux estrogènes et/ou aux
progestérones, ce qui correspond à plus de 60% des cancers du sein. Cette thérapie permet de
bloquer l'action des œstrogènes qui favorisent la croissance des cellules cancéreuses.
Les nouvelles approches thérapeutiques se caractérisent par une action ciblée
d’anticorps thérapeutiques monoclonaux sur certains processus tumoraux avec une bonne
efficacité et une bonne tolérance. Ces dernières années, les stratégies thérapeutiques dans le
traitement du cancer du sein se sont concentrées sur la manière d’influencer le récepteur
HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor-2), dont la surexpression est associée à un
pronostic défavorable. Ce traitement d’anticorps monoclonaux anti‐HER2, trastuzumab
(Herceptin®) ou lapatinib (Tiverb®) peut être utilisé en monothérapie ou en « adjuvant » avec
une chimiothérapie. Pour les cancers du sein de mauvais pronostic qui ne sont ni sensibles au
trastuzumab (Herceptin®), ni à l'hormonothérapie et qui représentent 10 à 15% des cancers du
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sein, un traitement anti‐angiogénique qui cible spécifiquement le récepteur VEGF (Vascular
endothelial growth factor) est en essai (bevacizumab (Avastin®)).
La glande mammaire contient une multitude d’éléments qui travaillent ensemble pour
garantir son état physiologique. Les cellules mammaires s’organisent collectivement pour
autoréguler l’homéostasie du sein. A l’état cancéreux, les cellules mammaires tumorales
détournent les acteurs moléculaires qui participent à son maintien : c’est une activation des
cellules environnantes en faveur de la progression tumorale. L’évolution du cancer du sein est
soumise à l’action de facteurs régulateurs systémiques et locaux. Parmi eux, les facteurs de
croissance jouent un rôle essentiel en favorisant d’une part la croissance et la prolifération de
la tumeur, d’autre part la formation de métastases, en modulant la capacité de migration et
d’invasion des cellules cancéreuses et sur l’angiogénèse. Ces facteurs de croissance peuvent
être sécrétés par les cellules cancéreuses elles-mêmes ou par diverses cellules composant le
stroma (fibroblaste, cellules myoépithéliales, cellules immunitaires).
Parmi ces facteurs de croissance, il a été démontré depuis peu le rôle de NGF (Nerve
Growth Factor) dans le cancer du sein. En effet, les cellules cancéreuses mammaires sécrètent
du NGF qui agit de manière autocrine pour stimuler la survie des cellules cancéreuses de sein
(Dollé et al, 2003).
2. NGF et ses deux récepteurs TrkA et p75NTR
Le NGF appartient à la famille des neurotrophines (NT). Cette famille compte 3
membres en plus du NGF : BDNF (Brain Derived Neurotrophin Factor), NT3
(neurotrophine 3) et NT4/5 (neurotrophine 4/5). Les gènes des neurotrophines sont très
conservés du fait de leur provenance d’un même gène ancestral (Hallböök, 1999). De ce fait,
les protéines obtenues ont des poids moléculaires très proches (≈ 14 kDa) et leurs synthèses
nécessitent un même processus de maturation.
En effet, la traduction du gène donne naissance à un précurseur protéique, le
préproNT, qui va être séparé de son peptide signal pour donner le proNT. Ce dernier va être
clivé : la partie C‐terminale correspond à la NT mature alors que la partie N-terminale
relarguée est inactive. Le clivage peut être effectué en intracellulaire par des protéases telles
que la furine mais également, en extracellulaire, après sécrétion, par certaines
métalloprotéases ou la plasmine (Hondermarck, 2012). Les proNT pouvant être sécrétées,
elles peuvent donc avoir une activité biologique indépendante de celle de NT.
Figure 1: Structure du monomère de NGF. Les extrémités ainsi que les boucles 1 à 4 (L1 à L4) et les brins β (A, B, C et D) sont identifiés en rouge. Les cystéines et ponts disulfure sont symbolisés en gris et jaune.
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La structure de NGF révèle une forme allongée dont la partie centrale est formée de
deux paires de brins β antiparallèles. Ces brins sont reliés entre eux par les boucles
numérotées de 1 à 4. La structure du monomère est fixée par la présence de 3 ponts disulfure
qui forment un motif nommé "cystéine-knot" au niveau des parties terminales de la protéine
(figure 1) (Wiesmann & de Vos, 2001). Grâce à ce domaine riche en cystéines, NGF peut
s’homodimériser, de manière non covalente via des interactions hydrophobes, pour former un
complexe de 28 kDa qui va être reconnu par les récepteurs au NGF. Ces derniers sont au
nombre de deux : TrkA (Tropomyosin-related kinase A) et p75NTR (neurotrophin receptor).
TrkA est un récepteur à activité tyrosine kinase appartenant à la famille des
Tropomyosin-related kinases qui compte trois membres : TrkA, TrkB et TrkC. Comme pour
les neurotrophines, ces trois membres dérivent d’un gène ancestral commun (Hallböök, 1999).
De ce fait, leurs poids moléculaires sont proches (≈ 140 kDa) et leurs structures conservées.
Les récepteurs Trk sont des protéines très glycosylées à un seul domaine transmembranaire.
La partie intracellulaire présente 75% d’homologie avec les autres récepteurs à activité
tyrosine kinase du fait de la présence d’un domaine tyrosine kinase. La partie extracellulaire
est composée d’une région riche en leucines avec de part et d’autre une région riche en
cystéines. Sous jacent à ces régions, sont retrouvés deux domaines Immunoglobuline-like
(IgG‐like), IgG‐like1 et IGg‐like2 (figure 2A). C’est d’ailleurs ce dernier domaine qui permet
la fixation des neurotrophines aux Trk entrainant la dimérisation des récepteurs. Les
neutrophines, quant à elles, interagissent avec les récepteurs via deux régions. La première
« conserved patch » correspond à la zone centrale, très conservée, des neurotrophines. La
seconde, « specificity patch » correspond à la partie N-terminale des neurotrophines et c’est à
priori cette partie qui confère la spécificité de liaison de chaque NT à son récepteur
(Wiesmann et al, 1999; Wehrman et al, 2007).
L’affinité de NGF pour TrkA est de l’ordre du nanomolaire (10-9M) mais se trouve
considérablement augmentée en présence du second récepteur p75NTR (10-11M) (Wehrman et
al, 2007).
Ce second récepteur, p75NTR appartient à la famille des récepteurs TNF (Tumor
Necrosis Factor). Ces récepteurs sont liés soit à l’apoptose, soit à la survie, soit les deux en
fonction des voies de signalisations activées. Ils sont essentiellement caractérisés par la
présence de domaines riches en cystéines CRD (en général, une répétition de six cystéines).
La partie extracellulaire de p75NTR est composée de quatre domaines riches en cystéines ainsi
Figure 2A: Représentation schématique des récepteurs tyrosine kinase A, B et C (TrkA, TrkB et TrkC). Chaque récepteur est composé d'un domaine riche en leucines (II), de deux domaines riches en cystéines (I et III), de deux domaines immunoglobuline-like (IV et V), d'un domaine transmembranaire et d'un domaine intracellulaire avec un domaine tyrosine kinase.
Figure 2B : Représentation schématique du récepteur p75NTR. Le récepteur est composé dans son domaine extracellulaire de 4 régions riches en cystéines, d'un domaine transmembranaire, d'un domaine intracellulaire contenant le domaine chopper juxtamembranaire et six hélices α du domaine de mort.
10
que de sites de glycosylation. La partie intracellulaire compte quant à elle un domaine de mort
(Death Domain) composé de 6 hélices qui diffèrent de ceux des autres membres de TNF-R de
par l’orientation de la première hélice. Aussi, on retrouve le domaine Chopper, nécessaire et
suffisant pour induire la mort cellulaire (Coulson et al, 2000) (figure 2B). NGF interagit en
dimère via ses boucles 1 et 4 avec les CRD1 et 2 et via la boucle 2 avec la jonction
CRD3/CRD4 de p75NTR dimérique (He & Garcia, 2004). L’affinité de liaison de p75NTR est la
même pour toutes les neurotrophines, à savoir de l’ordre du nanomolaire.
Il a également était montré que ces deux récepteurs peuvent former des hétérodimères
avec la protéine sortiline et que le ligand de ces complexes est le proNGF (Feng et al, 2010;
Demont et al, 2012). Dans le cancer du sein, seul l’hétérodimère TrkA/sortiline est retrouvé
(Demont et al, 2012).
3. NGF et cancer du sein
Depuis une dizaine d’années, NGF et ses récepteurs TrkA et p75NTR apparaissent
comme de nouvelles cibles thérapeutiques possibles dans le cancer du sein. En effet, même si
les mécanismes moléculaires impliqués restent peu caractérisés, l’implication de ces trois
molécules dans le développement du cancer du sein a été clairement démontrée. NGF et ses
récepteurs sont surexprimés dans la plupart des cancers du sein (Dollé et al, 2003; Reis-Filho
et al, 2006; Lagadec et al, 2009) et stimulent la croissance tumorale via différentes voies
(Molloy et al, 2011; Hondermarck, 2012). Cette surexpression ne corrèle cependant avec
aucun facteur clinico-pathologique (Adriaenssens et al, 2008).
L’effet mitogénique de NGF sur les cellules cancéreuses a été décrit (Descamps et al,
1998) pour plusieurs lignées humaines de cancer du sein. Cet effet dose-dépendant est
spécifique des cellules cancéreuses puisque NGF n’induit pas la prolifération des cellules
NBEC (Normal Breast Epithelial Cells) non cancéreuses. Des expériences d’inhibition ont
montré que cet effet mitogénique est dû à l’activation de MAPK (Mitogen-activated protein
kinase) suite à l’interaction de NGF avec son récepteur TrkA. La stimulation de la
prolifération a également été démontrée in vivo chez des souris immunodéficientes SCID
(Severe Combined Immunodeficiency) xénogreffées avec des cellules de cancer du sein
humaines (Adriaenssens et al, 2008; Lagadec et al, 2009).
NGF favorise également le développement tumoral en augmentant la résistance à
l’apoptose des cellules de cancer du sein (Descamps et al, 2001; Adriaenssens et al, 2008;
Figure 3 : Les effets de NGF dans le cancer du sein. NGF stimule la croissance tumorale via sa liaison avec ses deux récepteurs TrkA et p75NTR ainsi qu’avec l’hétérodimère TrkA/sortiline.
11
Verbeke et al, 2010). Cet effet, montré à la fois in vitro et in vivo est dû à p75NTR et à la voie
NF-κB (Nuclear Factor-kappa B) activée en aval du récepteur.
La croissance tumorale dépend aussi de la vascularisation de celle-ci. L’effet
proangiogénique de NGF montré in vivo (Romon et al, 2010) se fait via TrkA qui active la
voie PI3K (Phosphatidylinositol 3-Kinase) et ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase).
De plus, NGF et TrkA sont impliqués dans la migration et la formation de métastases
de cancer du sein (Adriaenssens et al, 2008; Lagadec et al, 2009). En effet, la surexpression
de cette neurotrophine cause une augmentation du nombre de métastases, notamment au
niveau du foie, des poumons et du cerveau.
Les cellules cancéreuses sont également connues pour leur pouvoir invasif. Il a été
montré que NGF via son récepteur TrkA stimule l’invasion des cellules de cancer du sein
(Lagadec et al, 2009). La forme non mature de cette neurotrophine, proNGF, est également
capable d’augmenter le pouvoir invasif des cellules tumorales en se fixant à l’hétérodimère
TrkA/sortiline (Demont et al, 2012).
L’inhibition de NGF et de ses récepteurs a permis de montrer, à la fois in vitro sur des
cellules de cancer du sein en culture et in vivo chez des souris immunodéficientes SCID
xénogreffées avec des cellules de cancer du sein humaines, une diminution de la croissance
tumorale, de la vascularisation, de l’invasion, de la migration, de la formation de métastases
ainsi qu’une augmentation du nombre de cellules apoptotiques (Descamps et al, 1998, 2001;
Adriaenssens et al, 2008; Lagadec et al, 2009; Verbeke et al, 2010; Romon et al, 2010).
NGF et ses récepteurs sont impliqués dans de nombreux processus essentiels au
développement et à la croissance tumorale (figure 3). Du fait de leur surexpression dans la
majorité des cancers du sein, ils apparaissent comme de bonnes cibles thérapeutiques, plus
universelles que les molécules actuellement ciblées (notamment HER2). Bien que l’inhibition
de NGF dans le traitement de la douleur ait montré des effets négatifs sur les articulations
(Holmes, 2012), les expériences d’inhibition réalisées dans le cadre du cancer du sein
montrent de nombreux effets positifs prometteurs pour une thérapie ciblée anti-NGF.
4. Inhibition par les kinoïdes
Les principales stratégies d’inhibition actuellement utilisées en thérapie reposent sur
l’utilisation d’antagonistes chimiques ou peptidiques ainsi que d’anticorps monoclonaux. Ces
Figure 4: Principe de fonctionnement d’un kïnoide. Des épitopes de cytokine sont gréffés sur une glycoprotéine (KLH) pour donner un kinoïde. L’injection de ce kinoïde dans un organisme déclenche une réaction immunitaire qui génère des anticorps polyclonaux neutralisants dirigés contre les épitopes de la cytokine cible.
12
deux stratégies sont spécifiques et efficaces mais présentent certains inconvénients,
notamment la fréquence d’administration des traitements. De plus, les anticorps
monoclonaux, même humanisés peuvent, à long terme, déclencher une réponse immunitaire
anti-anticorps et donc ne plus être efficaces. Les kinoïdes, une nouvelle technologie brevetée
en 2004 par Néovacs, permettent d’inhiber la molécule d’intérêt sans les inconvénients des
stratégies classiques de traitement par anticorps monoclonal.
En effet, l’immunisation par des kinoïdes présente l’intérêt majeur de déclencher une
réponse immunitaire du patient, dirigée contre des haptènes (petites molécules ou peptides
non immunogènes isolément) greffés sur une grosse glycoprotéine très immunogène qu’est le
KLH (Keyhole Limpet Haemocyanin) (figure 4). Le second intérêt de cette stratégie est de
générer des anticorps polyclonaux qui permettent un ciblage plus efficace de la protéine cible
que les traitements à base d’anticorps monoclonaux. Jusqu'à présent, toutes les
expérimentations ont été faite dans le but de déclencher une réponse immunitaire contre des
cytokines : VEGF (Rad et al, 2007; Nair et al, 2007), IFNα (Interféron α) (Bizzini et al, 1999;
Zagury et al, 2009; Mathian et al, 2011), TNFα (Tumor Necrosis Factor α) (Le Buanec et al,
2006; Semerano et al, 2011; Assier et al, 2012), TGFβ (Transforming Growth Factor β) et
IL-13 (Interleukine-13) (Jing et al, 2012). Toutes ces études démontrent que les kinoïdes sont
bien tolérés chez la souris comme chez les patients, et produisent des anticorps polyclonaux
qui neutralisent la cytokine cible. Les résultats sont supérieurs ou égaux aux thérapies par
anticorps monoclonaux. L’immunisation par des kinoïdes entraine des effets durables qui
nécessitent deux à quatre injections contre une vingtaine d’injections par an avec les anticorps
monoclonaux. Cette immunisation active et continue permet donc de garder une expression
basale des cytokines et ainsi de diminuer les effets secondaires. De plus, le coût d’un
traitement par kïnoide est inférieur à celui des anticorps monoclonaux. Il faut signaler que
cette méthode génère une quantité significative d’anticorps anti-KLH bien que les études
publiées ne mettent pas en évidence d’effets indésirables, le KLH étant issu d’un organisme
phylogénétiquement éloigné de l’Homme.
Parmi les kinoïdes développés par la société Néovacs, les plus avancés sont ceux
dirigés contre IFNα et TNFα qui sont en phase II des essais cliniques.
Notre projet propose d’adapter cette stratégie d’immunisation par kinoïde pour traiter
le cancer du sein. Cette nouvelle thérapie pourrait présenter une alternative pour les patients
résistantes aux traitements conventionnels. Pour la première fois, nous proposons de cibler,
Figure 5 : Shéma de principe du projet. Des épitopes de NGF, p75NTR et TrkA sont gréffés sur un KLH. L’injection de ces kinoïdes dans un organisme déclenche une réaction immunitaire qui génère des anticorps polyclonaux neutralisants dirigés contre NGF, p75NTR et TrkA et bloquants les effets oncogènes des voies de signalisations de NGF.
13
avec un kinoïde trispécifique, la neurotrophine NGF ainsi que ses deux récepteurs TrkA et
p75NTR. Cette immunisation devrait donc générer des anticorps polyclonaux neutralisants
permettant de bloquer les effets des voies de signalisation de NGF à savoir : la mitogénèse, la
résistance à l’apoptose, l’angiogénèse et la formation de métastases dans les cancers du sein
(figure 5).
Après avoir présenté un article sur l’utilisation d’un kinoïde pour traiter le lupus
érythémateux disséminé (SLE) et les avantages de la technologie kinoïde, nous détaillerons
notre projet de recherche « un kinoïde trispécifique pour traiter le cancer du sein ».
Figure 6A : Production d’anticorps anti-huIFNα2b par les souris immunisées par IFN-K. 2x3 groupes de 10 souris sont immunisées par injection intra musculaire soit avec IFNgf soit avec IFN-K avec des doses de 3, 10 ou 30 μg. Un test ELISA permet de titrer la présence d’anticorps anti-huIFNα2b dans le sérum de chaque souris.
Figure 6B : Test de neutralisation des huIFNα2b par les anticorps produits après immunisation. Test de protection antiviral (VSV) par huIFNα2b sur cellules MDBK. 25 U d’huIFNα2b sont utilisées dans chaque test en solution avec différentes dilutions de sérum. Les souris sont considérées comme non réactives si le titrage de la NC50 n’est pas détectable pour la plus faible dilution de (1/500).
14
II. Un exemple de résultats obtenus avec la stratégie kinoïde
L’interféron α (IFNα) joue un rôle central dans la pathogénèse du SLE et est considéré
comme une cible pour son traitement. Cet interféron existe sous la forme de 13 sous-types
(IFNα1, 2a, 2b, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 et 21). L’article présenté ici (Mathian et al, 2011)
s’intéresse à la capacité d’induire la production d’anticorps neutralisants anti-interféron α
humain (huIFNα), chez des souris immunotolérantes pour huIFNα2b, par immunisation active
avec l’huIFNα2b-kinoïde (IFN-K).
1. L’immunisation IFNK induitelle la production d’anticorps
anti‐huIFNα2b et sontils neutralisants ?
Les expérimentations ont été effectuées sur des souris FVB/N modifiées
génétiquement pour exprimer et tolérer l'interféron α2b humain (huIFNα2b).
Les souris sont immunisées au jour 0 et au jour 21 avec des doses différentes soit
d'IFN-K (Kinoïde = huIFNα2b cross-linkés avec KLH) soit d'IFNgf (témoin = huIFNα2b
cross-linkés entre eux). Trois dosages sont testés : 3, 10 ou 30 μg pour les deux
immunisations et chaque test a été fait sur 10 souris. Les souris sont tuées au 32e jour et les
séra sont récupérés. Un test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) est effectué sur
chaque sérum pour titrer la quantité d’anticorps anti-huIFNα2b et anti-KLH. L’ELISA est
réalisé en ajoutant 100 ng par puits d’huIFNα2b ou de KLH dans du tampon PBS (Phosphate
Buffered Saline). Différentes dilutions de chaque sérum sont testées. Les anticorps sont titrés
à l’aide d’un anticorps secondaire couplé à la peroxydase qui, en présence d’OPD
(o-phénylènediamine dihydrochloride) va donner une couleur orangée proportionnelle à la
quantité d’anticorps fixés à 490 nm. Le titre correspond à la dilution nécessaire pour obtenir
50% de l’absorbance maximale.
L’immunisation par IFN-K a induit une production d’anticorps anti-huIFNα2b sur
toutes les souris et pour les 3 doses (figure 6A). On n'observe pas de différences significatives
entre ces trois groupes pour les quantités testées. Les variations de titrage sont très
significatives entre l’immunisation par IFNgf ou par IFN-K à dose équivalente.
L’immunisation par IFN-K induit une forte production d’anticorps anti-KLH pour les
trois doses testées (résultats non montrés).
Figure 7 : Réponse immunitaire des cellules de souris transgéniques pour huIFNα immunisée par IFN-K. Les splénocytes de souris immunisées avec 30 µg d’IFN-K ont été stimulées avec IFNα ou KLH. (A) La prolifération cellulaire mesurée via l’incorporation de 3H-thymidine est exprimée comme un index de stimulation (SI=coups par minute des cellules stimulées / coups par minutes des cellules non stimulées). L’activation des lymphocytes T mémoire est évaluée par le relargage d’interleukine 2 (IL-2) (B) ou d’IFNγ (C) dans le milieu de culture.
15
Un test de neutralisation (MDBK-VSV) des huIFNα par les anticorps présents dans les
séra de souris a été réalisé.
Chacun des puits contient une dilution de sérum et une quantité fixe de huIFNα2b
(non précisée). L’incubation est faite une heure à température ambiante. Des puits contrôles
sont effectués en remplaçant les échantillons de sérum par un milieu contenant des anticorps
neutralisants anti-huIFNα. Ensuite, 2×104 cellules MDBK (cellules de rein de bœuf) sont
ensemencées dans ce milieu complet pendant une nuit. Après le retrait du milieu et lavage au
PBS, les cellules sont infectées une nuit par le VSV (virus de la stomatite vésiculaire) avec 10
fois la dose requise pour tuer 50% des cellules. La survie cellulaire est déterminée grâce au
test colorimétrique MTS/PMS (réduit en formazan coloré dans les cellules vivantes). La
NC50 (50% de capacité de neutralisation) de l'activité IFN est la dilution de sérum donnant
50% de l'absorbance maximale.
Les anticorps anti-huIFNα2b présents dans le sérum neutralisent les huIFNα2b qui ne
peuvent donc pas empêcher le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) de tuer les cellules
MDBK.
Toutes les doses d’IFN-K ont généré des anticorps neutralisants anti-huIFNα2b (figure
6B). L’effet semble dose dépendant et maximal pour l'immunisation avec 10µg d'IFN-K. Le
nombre de souris réactive au test paraît aussi être dose dépendant avec 50% des souris
réactives à 3 μg, 90% à 10 μg et 100% pour une dose de 30 μg. Aucune souris immunisée
avec IFNgf ne produit d’anticorps neutralisants anti-huIFNα2b détectables sauf une souris sur
les 10 avec la dose de 30 μg.
Les anticorps induits par l’immunisation avec IFN-K neutralisent huIFNα2b.
2. Y atil activation de la mémoire immunitaire après immunisation
IFN‐K ?
Le but de l'expérience est d'évaluer si après immunisation avec IFN-K, il y a une
réponse immunitaire rapide, avec activation des lymphocytes T (LT) mémoire, lors d'une
exposition à l'IFNα ou au KLH.
Deux lots de 10 souris transgéniques et immunotolérantes pour huIFNα2b sont traitées
avec soit du PBS soit avec 30 µg de IFN-K. Les injections sont effectuées aux jours 0 et 21 et
les souris sont tuées au 49e jour. A ce jour, les splénocytes des deux groupes sont prélevés et
Table 2 : Valeurs d’absorbance des sérums (dilution 1:500) de souris avant et 60 jours après immunisation par IFN-K et du contrôle positif avec l’anticorps monoclonal IFNγ. Le test ELISA est réalisé avec un anticorps primaire anti-huIFNγ et un anticorps secondaire anti-souris couplé à la péroxidase de raifort (HRP). La révélation est réalisé après ajout du substrat de la HRP, l’o-phénylènediamine dihydrochloride (OPD) par mesure de l’absorbance à 490 nm. Aucune souris immunisées par IFN-K ne produit d’anticorps anti-huIFNγ. La valeur de p est calculée grâce au test des rangs signés de Wilcoxon : p = 0,25. Le test est réalisé en duplicate et les valeurs représentent la moyenne de ces deux valeurs. OD : absorbance ; SD : écart-type ; IFN : interféron ; mAb : anticorps monoclonal
Figure 8 : Capacité de neutralisation des sous-types d’IFNα par les séra de souris immunisées par IFN-K. Une quantité de 4U/puit de chaque sous type d’IFNα est ajoutée sur une gamme des séra de souris immunisées par IFN-K. La NC50 (neutralisation 50%) de chaque sérum a été déterminée.
Table 1 : Capacité de neutralisation des sérums de souris FVB/N 60 jours après immunisation avec IFN-K. La capacité de neutralisation est mesurée grâce au test A549-EMCV. Aucune souris immunisée par IFN-K ne produit d’anticorps anti-huIFNβ. Le test est réalisé en duplicate et les valeurs représentent la moyenne de ces deux valeurs. Ab : anticorps ; hu : humain ; IFN : interféron
16
mis en culture soit dans un milieu non supplémenté, soit dans le même milieu supplémenté
avec 10 µg de huIFNα2b (IFNα) ou 10 µg de KLH. Différents tests de réponses des LT
mémoire sont effectués. En effet, lors de l'activation de LT mémoire, il y a prolifération de
ceux-ci et sécrétion d'interleukine 2 (IL-2) et d'interféron γ (IFNγ) qui activent ensuite la
différenciation d'autres lymphocytes.
La prolifération est évaluée par l'incorporation de thymidine tritiée pendant la phase S
après un pulse de 18h (plus la quantité de thymidine tritiée incorporée est importante, plus il y
a prolifération). La production d’IL-2 et d'IFNγ est analysée par test ELISA.
Les résultats des différents tests (figure 7) montrent que l’IFNα n'induit pas de réponse
immunitaire mémoire à la dose testée contrairement au KLH (qui est en fait reconnu comme
un corps étranger) suite à l'immunisation IFN-K. Les souris étant transgéniques pour huIFNα,
il est cohérent de ne pas avoir de réponse immunitaire envers une molécule du "soi", comme
cela se passe chez l'Homme.
3. Les anticorps induits sontils spécifiques de l’IFNα ?
• huIFNα
Dans cet article, les auteurs ont étudié la spécificité des anticorps pour différent sous-
types d’IFN, induits par l’IFN-K chez des souris FVB/N transgéniques huIFNα2b.
Pour cela, ils ont évalué la neutralisation de l’activité de 12 sous-types de l’IFNα par
les anticorps contenus dans les séra de six lots de souris immunisées par IFN-K. (Il a été
confirmé au préalable que les séra de 15 souris contenaient des anticorps anti-huIFNα2b).
Chaque sérum de lot de souris a été testé indépendamment sur les sous-types d’IFNα et a été
évalué par un test MDBK-VSV. Ce test permet de déterminer une NC50 correspondant à la
dilution du sérum neutralisant 50% de l’activité des IFNα.
Tous les sous-types d’IFNα testés sont neutralisés par les séra de 50% des souris
(figure 8). Le sous-type le plus neutralisé est l’IFNα2a (NC50>16 000). Les séra des souris
immunisées par IFN-K ont une activité diminuée pour les autres sous-types par rapport à
l’IFNα2a (IFNα21 est partiellement neutralisé par les séra).
Figure 9 : Capacité de neutralisation des IFNα contenu dans les sera de patient (SLE) par les sera de souris immunisées par IFN-K. Une quantité variable d’IFNα (U/puit) de chaque patient est ajoutée sur une gamme des séra de souris immunisées par IFN-K. La NC50 de chaque sérum a été déterminée.
17
• huIFNβ
Le test de neutralisation A549-EMCV a été réalisé pour montrer que les anticorps
produits par les souris immunisées par IFN-K ne réagissent pas avec l’interféron β (IFNβ). Le
principe de ce test est similaire au test MDBK-VSV. Il est réalisé avec la lignée cellulaire
A549 (cellules de carcinome de poumon humain), le virus de l’encéphalomyocardite (EMCV)
et l’interféron huIFNβ.
Les capacités de neutralisation des séra de différentes souris sont données en
pourcentages pour une dilution d’IFNβ de 1:100 (table 1). On remarque que les séra des
souris immunisées par IFN-K ne sont pas capables de neutraliser l’huIFNβ, ce qui implique
que cette immunisation n’induit pas la production d’anticorps anti-huIFNβ.
• huIFNγ
Les séra de différentes souris immunisées par IFN-K ont été analysés par ELISA pour
tester la présence d’anticorps anti-huIFNγ. Les résultats (table 2) montrent qu’aucune souris
n’a produit d’anticorps anti-huIFNγ suite à l’immunisation par IFN-K.
Les tests de neutralisation ainsi que le test ELISA permettent de mettre en évidence la
spécificité du kinoïde qui induit la production d’anticorps polyclonaux dirigés uniquement
contre la cytokine d’intérêt IFNα.
4. Les anticorps induits peuventils neutraliser les séra de patients atteints
de SLE ?
Les chercheurs ont testé la capacité de six séra (obtenus après immunisation des souris
avec IFN-K) à neutraliser l’IFNα contenu dans les séra de patients ayant le SLE. La NC50 de
chaque sérum des différents lots de souris a été évaluée par un test MDBK-VSV.
Les séra de 139 patients ayant le SLE ont été testés dans cette étude.
Dans tous les cas, les IFNα des patients sont neutralisés par tous les séra testés
(figure 9). De plus, le degré de neutralisation reste identique quelque soit le lot du sérum.
5. Conclusion
Les résultats montrent que l'immunisation active avec le kinoïde IFN-K induit la
production d'anticorps polyclonaux neutralisants tous les sous-types de huIFNα ainsi que
18
l'IFNα des séra de patients atteints de SLE sans induire de réponse mémoire. Cela suggère que
l'immunisation avec IFN-K est une nouvelle stratégie thérapeutique prometteuse pour le
traitement du SLE.
19
III. Projet de recherche
L’objectif de ce projet de trois ans est de mettre en place une preuve de concept
montrant l’efficacité d’un kinoïde trispécifique à inhiber les effets de la neurotrophine NGF
(ainsi que proNGF) via ses deux récepteurs TrkA et p75NTR. Cela permettrait de réduire le
développement tumoral dans le cadre du cancer du sein invasif. Le kinoïde trispécifique
permettra, par une immunisation active des patients, une production d’anticorps anti‐NGF,
anti‐TrkA et anti‐p75NTR directement par le système immunitaire des patients.
Les kinoïdes peuvent être obtenus en greffant sur le KLH une molécule entière ou
seulement des peptides issus de cette molécule. Pour notre projet, nous avons choisi d’utiliser
à la fois la molécule de NGF entière recombinante (R&D Systems, UK) et des peptides
synthétiques de NGF, TrkA et p75NTR afin de pouvoir produire plusieurs kinoïdes
monospécifiques dirigés contre NGF, TrkA ou p75NTR. Après avoir identifié pour chaque
cible le kinoïde présentant les meilleurs effets anti-cancéreux in vitro, nous produirons des
kinoïdes bispécifiques NGF‐TrkA, NGF‐p75NTR et TrkA‐p75NTR ainsi qu’un kinoïde
trispécifique NGF‐TrkA‐p75NTR avec le peptide sélectionné pour chaque molécule. Ces quatre
kinoïdes multispécifiques seront testés in vitro. Celui induisant les effets anti-tumoraux les
plus importants sera utilisé pour les tests in vivo chez la souris. Nous nous attendons à obtenir
les résultats les plus probants avec le kinoïde trispécifique.
1. Production des kinoïdes
Les kinoïdes seront obtenus par conjugaison au glutaraldéhyde entre le KLH et des
peptides, identiques (kinoïdes monospécifiques) ou différents (kinoïdes bi‐ ou trispécifiques).
La méthode de conjugaison utilisée, décrite par Le Buanec et al. en 2006, consiste à faire
réagir les amines primaires du KLH et des peptides afin de coupler ces deux derniers. Le KLH
contient environ une centaine de sites réactifs. L’extrémité N-terminale des peptides n’étant
pas suffisamment réactive pour permettre le couplage, ils doivent contenir à une de leur
extrémité une lysine dont la chaîne latérale contient une amine primaire très réactive.
La conjugaison se fera avec une concentration connue de peptide et de KLH (peptides
en large excès). Nous évaluerons différents ratios peptides/KLH (20:1, 50:1 et 100:1). Le taux
de conjugaison de chaque peptide sera estimé par lecture de la densité optique à 220 nm
(liaison peptidique) avant conjugaison (peptides totaux) et après la conjugaison (peptides non
fixés). Ce calcul nous permettra d’estimer la concentration nécessaire de chaque peptide
Figure 10 : Stratégie de production de kinoïdes multispécifiques. Neuf kinoïdes monospécifiques (trois pour chaque cible) avec la protéine entière et deux peptides pour NGF et trois peptides pour chacun des deux récepteurs seront testés in vitro. Après avoir identifié pour chaque cible le kinoïde présentant les meilleurs effets anti-cancéreux in vitro, des kinoïdes bispécifiques NGF-TrkA, NGF-p75NTR et TrkA-p75NTR ainsi qu’un kinoïde trispécifique NGF-TrkA-p75NTR seront produits avec le peptide sélectionné pour chaque molécule.
20
d’estimer la concentration nécessaire de chaque peptide permettant de produire des kinoïdes
multispécifiques contenant des ratios équivalent de chaque peptide. Les kinoïdes seront
purifiés par centricon (cut-off : 100 kDa) pour dessaler l’échantillon et retirer les peptides non
fixés.
2. Choix des peptides
Les peptides utilisés pour la production des kinoïdes seront synthétisés chimiquement
par la plateforme de l’IPBS. Tous les peptides auront une seule lysine dans leur séquence afin
de permettre le couplage au KLH. Cette lysine pourra être présente dans la séquence primaire
des trois cibles (NGF, TrkA et p75NTR) ou ajouter à l’une des extrémités des peptides lors de
la synthèse.
Dans un premier temps, nous avons décidé de tester neuf kinoïdes monospécifiques
(trois pour chaque cible) avec la protéine entière et deux peptides pour NGF et trois peptides
pour chacun des deux récepteurs.
Afin de générer des anticorps neutralisants, le mieux est de choisir des séquences
uniques d'une dizaine d'acides aminés situés dans une zone d'interaction du facteur de
croissance avec son récepteur (Denis Hudrisier, communication personnelle). Nous avons
donc tenu compte des domaines d’interaction ligand‐récepteur (Wehrman et al, 2007) et des
alignements des séquences NGF, BDNF, NT-3 et NT-4 (annexe 1), TrkA, TrkB et TrkC
(annexe 2) et p75NTR et deux TNF-Rs (annexe 3). Ces alignements nous permettent
d’identifier les séquences pour lesquelles nous avons le minimum d’identité avec les autres
membres de leurs familles respectives. Nous avons donc choisi les peptides ayant pour
séquence 40GEVNINNSVFK et 62NPVDSGCRGIBSK pour NGF, 240KSGGLPSLGLTL, 287SVQLHTAVEMK et 329FTEFLEPAANK pour TrkA et 58GANQTVCEPCK, 84KPCTECVGLQSM et 126RVCEAGSGLVFK pour p75NTR.
Les neufs kinoïdes produits à partir de ces huit peptides et de NGF seront criblés in
vitro (figure 10). Si les kinoïdes n’ont pas les effets escomptés, nous pourrons tester d’autres
peptides, éventuellement plus longs, et envisager de produire en système procaryote (E. coli)
les domaines extracellulaires des deux récepteurs afin de les greffer sur le KLH.
21
3. Immunisation des souris BALB/c
Nous utiliserons l’adjuvant de Freund (Sigma) lors des immunisations et des souris
BALB/c (Charles River, France) de huit semaines.
Dans un premier temps, des études d’optimisation nous permettrons de déterminer le
nombre d’injections nécessaires pour obtenir le meilleur taux d’anticorps dans le sérum. Au
jour zéro, nous prélèverons le sérum pré-immun des souris que nous utiliserons comme
« blanc » lors du titrage par ELISA après la vaccination (conservé à -20°C). Nous réaliserons
des injections avec des doses de 50 μg de kinoïdes (équivalent à 100 μl de mélange
kinoïde-adjuvant) par souris en intramusculaire toutes les deux semaines. Une semaine après
chaque rappel, un test ELISA nous permettra de quantifier la production d’anticorps par les
souris immunisées. Une alternance de rappels et de test ELISA seront réalisée jusqu'à ce
qu'une réponse suffisante soit observée.
Les anticorps totaux (pool IgG) seront purifiés sur colonne couplée aux protéines G
(Pierce). Les tests ELISA seront réalisés avec des protéines G greffées au fond des puits
(Pierce).
Des immunisations contrôles seront faites sur un lot de souris avec du KLH seul ou
des agrégats de peptides.
4. Tests in vitro
Afin de déterminer si les anticorps produits et purifiés sont bloquants, nous allons
vérifier s’ils ont les effets escomptés sur des lignées de cellules de cancer du sein en culture.
En effet, en bloquant TrkA, on attend une diminution de la prolifération, de l’invasion et de la
migration. Pour p75NTR, on attend une augmentation du nombre de cellules apoptotiques. Les
deux effets décrits par le blocage des récepteurs devraient également être retrouvés avec
l’anticorps anti-NGF. Nous réaliserons donc des tests de prolifération, d'apoptose, de
migration et d'invasion.
Les différents tests seront réalisés sur les lignées cellulaires suivantes : MCF-7,
MDA-MB-231, SkBr3, BT-20, T47D (lignées de cancer du sein). Les cellules NBEC (lignée
du sein non cancéreuse) seront utilisées comme contrôle. Toutes les cellules, obtenues auprès
de l'UMR 8527 de Lilles, sont cultivées en milieu EMEM (Eagle’s Minimal Essential
Medium) complémenté avec 10% de SVF (Sérum de Veau Fœtal).
22
Les tests seront réalisés selon les protocoles décrits par Descamps et al. en 2001 et par
Lagadec et al. en 2009.
Pour le test de prolifération, les cellules sont privées de sérum après 24h de culture
puis traitées avec NGF dans un milieu EMEM complémenté avec 0,1% SVF. Les cellules
sont ensuite comptées à 24, 48 et 72h avec un compteur de cellules (Beckman Coulter).
Pour les tests d'apoptose, les cellules sont traitées avec NGF pendant 1h après 12h de
privation en sérum. 5 ng/mL de TRAIL (Tumor-necrosis-factor Related Apoptosis Inducing
Ligand) sont ajoutés, en présence de NGF, pendant 6h. Les cellules sont fixées au
paraformaldéhyde, colorées au Hoechst 33258 (Invitrogen) et les cellules et corps
apoptotiques comptées sous microscope à fluorescence. La présence de facteurs
proapoptotiques (caspases 9 et 3) sera également vérifiée par Western Blot.
Les tests de migration et d'invasion sont réalisés sur une membrane de polycarbonate
(pores de 8 µm) sur les inserts Transwell (BD Biosciences) recouverte de GFR-Matrigel
(Growth Factor Reduced) pour les tests d'invasion. Les cellules sont cultivées sur un milieu
EMEM 0,1% SVF complémenté en NGF. Les cellules migrantes et invasives sont fixées au
méthanol, colorées au Hoechst 33258 et comptées sous microscope à fluorescence.
Chacun des tests sera réalisé avec ajout de 200 ng/mL de NGF (Sigma) ou avec ajout
de DMSO dilué au 1:1000 (point contrôle) et par traitement avec les pools d’IgG purifiés
(10 µg/mL et 30 µg/mL) obtenus après immunisation des souris avec les kinoïdes. On aura
donc les conditions suivantes : anti-NGF seul; anti-TrkA seul ; anti-p75NTR seul pour les
kinoïdes monospécifiques ; anti-NGF et anti-TrkA ; anti-NGF et anti-p75NTR ; anti-TrkA et
anti-p75NTR pour les kinoïdes bispécifiques; anti-NGF, anti-TrkA et anti-p75NTR pour le
kinoïde trispécifique. Des contrôles seront réalisés avec des inhibiteurs connus des cibles :
K-252a (10 nM) pour TrkA (Calbiochem), anti-p75NTR humain (10 µg/mL) pour p75NTR
(Promega) et anti-NGF humain (10 µg/mL) pour NGF (Promega).
De plus, des contrôles d’interaction directe entre les kinoïdes et les cellules seront
réalisés afin de tester de potentiels effets activateurs ou inhibiteurs sur nos cibles.
Table 3 : Récapitulatif des expériences in vivo. Le kinoïde multispécifique induisant les effets anti-tumoraux les plus importants in vitro, est testé in vivo chez la souris. L’efficacité anti-tumorale des anticorps générés chez des souris BALB/c est évaluée in vivo sur des souris SCID xénogreffées avec des cellules cancéreuses humaines (MDA-MB-231 et T-47D).
N° de lot Nombre de
souris Type de test
Concentration
du traitement
Contrôle du
volume
tumoral
Contrôle
histologique de
la tumeur
1 6
Essai : injection des anticorps générés 8 mg/kg
6
2 6
Essai : injection des anticorps générés 40 mg/kg
6
3 6
Contrôle : inhibiteur Trka (K-252a) 20 nM
6
4 6
Contrôle : anti-p75 5 mg/kg
6
5 6
Contrôle : anti-NGF 5 mg/kg
6
6 6
Contrôle : IgG non relevant 5 mg/kg
6
7 6
Contrôle : injection saline 5 mg/kg
6
23
5. Tests in vivo
• Xénogreffes et traitements par le kinoïde
Les tests de criblage in vitro ont permis de sélectionner un kinoïde multispécifique.
Dans l’étape suivante, nous souhaitons évaluer l’effet de notre molécule innovante sur un
modèle animal. Les tests in vivo nous permettrons d’évaluer la capacité des anticorps générés
à agir sur des tumeurs mammaires.
Nous allons mettre en place une expérimentation qui consistera à étudier l’évolution
des tumeurs. Les anticorps polyclonaux produits par les souris BALB/c après immunisation
avec le kinoïde multispécifique seront purifiés et réinjectés à des souris immunodéficientes
(SCID) (IFA Credo, France) préalablement xénogreffées. Afin d’induire des tumeurs chez les
souris, des cellules cancéreuses humaines MDA-MB-231 et T-47D (3.106) seront injectées par
voie sous-cutanée au niveau du flanc des souris SCID de huit semaines (Adriaenssens et al,
2008).
Un premier suivi des xénogreffes sera fait par analyse histochimique. Un deuxième
suivi, consistera en une analyse de l’évolution du volume tumoral par mesure directe des
xénogreffes.
Dix jours après l'injection des cellules cancéreuses (correspondant à un volume de la
xénogreffe d’environ 200 mm3), les anticorps générés seront administrés tous les trois jours
au plus proche de la tumeur. Les traitements se feront systématiquement sur des lots de 12
souris pour les traitements « essais » comme pour les traitements « contrôles ». Après
traitement, chaque lot sera divisé en deux pour le suivi du volume des xénogreffes et pour
l’analyse histologique qui nécessitera de sacrifier l’animal (table 3).
Le sacrifice des souris pour les études histologiques sera fait au bout de 17 jours de
traitement. L’étude du volume tumoral sera poursuivie au-delà des 17 jours afin d’observer
une éventuelle résistance aux traitements.
• Analyse des effets des anticorps générés sur les xénogreffes
Dans un premier temps, nous nous intéresserons à l’effet des traitements sur l’indice
de prolifération. Les cellules en prolifération seront mises en évidence par détection
immunohistochimique de la protéine Ki-67. Le marquage obtenu avec l’anticorps anti-Ki-67
(ImmunoTech) donne un signal nucléaire et marque en brun-rouge toutes les cellules en
24
division. L’indice de prolifération, correspondant au nombre de cellules marquées
positivement pour l’antigène Ki-67, sera évalué pour 1000 cellules comptées et exprimé en
pourcentage.
Dans un deuxième temps, nous évaluerons la capacité des anticorps à induire
indirectement l’apoptose des cellules tumorales. Le nombre de cellules apoptotiques sera
déterminé avec le test TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP Nick End
Labeling) (Roche Molecular Biochemicals, IN, USA). Ce test détecte la fragmentation de
l'ADN résultant de la cascade de signalisation apoptotique.
Puis, nous observerons l’impact du traitement sur la densité microvasculaire. Cette
dernière sera mesurée après marquage immunohistochimique des structures vasculaires avec
l'anticorps anti-CD31 (Novus Biological). La protéine CD-31 est retrouvée à la surface des
cellules endothéliales et est utilisée pour démontrer la présence de cellules endothéliales dans
des sections de tissus afin d'évaluer le degré de l'angiogénèse tumorale.
Pour finir, le volume tumoral sera mesuré tous les trois jours en mesurant la longueur
(l) et la largeur (w) de la tumeur. Il sera déterminé par la formule suivante :
.
25
IV. Perspectives
A travers ce projet de recherche, notre équipe souhaite utiliser la technique innovante
du kinoïde multispécifique pour traiter le cancer du sein invasif. Nous décrivons dans ce
rapport les différentes étapes et méthodes pour mettre en place cette preuve de concept sur
une durée de trois ans. Si les résultats obtenus avec le kinoïde multispécifique sont
satisfaisants, plusieurs perspectives sont envisageables.
Tout d’abord, il serait intéressant de pouvoir immuniser des souris qui reçoivent la
xénogreffe de cellules cancéreuses. On pourrait envisager d’immuniser avec le kinoïde un lot
de souris, qui serait par la suite irradié dans le but de détruire la moelle osseuse. Cela
permettrait de rendre ces souris immunodéficientes et capables de développer une tumeur
après xénogreffe de cellules cancéreuses. Cette expérience permettrait d’étudier l’effet des
anticorps circulants des souris sur l’implantation et le développement de la tumeur et de
mettre ainsi en évidence l’effet préventif du kinoïde.
De plus, les éventuels effets indésirables du kinoïde seront étudiés en contrôlant le
poids, l’activité et l’espérance de vie des souris traitées en comparaison avec les souris non
traitées.
A la suite de toutes ces expériences, il serait intéressant de déterminer les paramètres
pharmacocinétiques et pharmacodynamiques du kinoïde, ainsi que d’étudier la toxicité de ce
vaccin afin d’envisager une étude en phase clinique.
26
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VI. Annexes
Annexe 1 : alignements des séquences des précurseurs: NGF, BDNF, NT-3 et NT-4
Annexe 2 : alignement des séquences TrkA, TrkB et TrkC
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Annexe 3 : alignement des séquences p75NTR et de deux TNF-R