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V.Thibault DU_janv.-11 1

Virus de l'hépatite A et EVirus et marqueurs diagnostiques

Vincent THIBAULTLaboratoire de Virologie

Groupe HospitalierPitié-Salpêtrière

Assistance Publique Hôpitaux de Paris


Hépatites virales

parentéral

non A, non BB1965 D

1977

A1972

féco-oral

mode de transmission préférentiel

F, G, TTV, autres…

C1990

E1991

VaccinVaccin

(Vaccin)



Historique VHAAvant J.C.: “La Jaunisse” (Ikterus / kirrhos)

1745 : Cockayne, hépatites épidémiques

1908 : McDonald, "notion de virus…"

Reproduction de la maladie 1942 :

Volontaires (Voegt, Havens), Paul 1943 ingestion feces/serum

Entité clinique : 17-18ème siècle - 1923 Blumer - 1947 McCallum (VHA "infectious"-VHB "serum")

Transmission nosocomiale (préparation vaccinale : variole, fièvre jaune…)

Visualisation : 1973 (Feinstone)

Développement de la sérologie : épidémiologie

1979 : culture (Provost et Hilleman)

1981... : Clonage, Séquences nucléotidiques

1991… : Vaccination

2006 : Déclaration obligatoire

1995 : Vaccin

1996 : recommandations

1999 : recommandations


Virus de l'hépatite A


Virus de l’Hépatite A

ARN (+)

Vpg

Capside

27-32nm

• Famille : Picornaviridae(entérovirus type 72)

• Genre : hépatovirus• Taille 27-32 nm• Non enveloppé• Structure icosaèdrique• ARN simple brin,

• polarité positive• lié de façon covalente à

une protéine Vpg


VP1VP3VP2VP4 2AProtéines de surface

immunogénicité

3D (POL)3C (PRO)2C2B1D1C1B 3A-B2A

P1 prot. Capside

Vpg2.5kDa

P2 P3

0 7478

1AAAA

Structurales Non structurales

IRESTraduction(eIF-4G)

3D (POL)3C (PRO)2C2BVP1VP3VP2

3A-B

VP4

2Apoly-

protéine2 227 AA

?

Liaison NTPHélicase

Vpg

Protéase

ARNPolymérase

RéplicationVP1VP3VP2VP4 2A

VP0

Maturation finale

X5 – X12


Cycle de multiplication du VHA en culture de cellules

P3

P2

P1

TraductionSynthèse

de la polyprotéine

+-

-

+

Réplication

Maturation

Libérationdu génome

Attachement

Relargage

Mem

bran

e ce

llulaire

Réticulum endoplasmique

Espace de Disse

Canaliculebiliaire

Empaquetage


Seth et al. Cell Research (2006)16: 141-147Fensterl et al. JOURNAL OF VIROLOGY, Sept. 2005, p. 10968–10977Yang et al. (2007) PNAS 104 :7253-7258

Hepatitis A Virus Suppresses RIG-I Mediated IRF-3 Activation To Block Induction of Beta Interferon

*

*


VHA : physiopathologie

Absence d'effet cytopathique direct :cytolyse résultant du processus immun de défense de l'hôte,

médiation cellulairemédiation humorale


Agents Stabilité

ChaleurAutoclavage (121°C, 20')100°C60°Ctempérature ambiante

4°CCongelé

InactivationInactivationStable 1 heureStable 1 mois (selles, eaux, sols)Plusieurs jours sur surface sèche4 h. Sur les mainsStable plusieurs moisStable des mois ou années

Acide-base pH 1 : stable 5 h.PH 3-11 : stable au moins 30'

U.V. InactivationChimiques

Chlore, ozone,glutaraldéhyde, iode

Inactivation

Alcool 70° 3' : inactivation partielle

Propriétés Physiques du VHA


VHA et agents physiques ou chimiques

http://www.invs.sante.fr/publications/2009/guide_hepatite_a


Variabilité génétique

Comparaison nucléotidique

⌦7 Génotypes : IA,B ; II; IIIA,B ; IV-VII⌦Homme : génotype I (90%), (III, II=VII)

⌦Singes : IV, V, VI

Sérotype unique⌦Nombre limité d'épitopes antigéniques VP1, VP3

⌦Tests immunologiques

⌦Vaccination (HM175, CR326)

⌦virus inactivé cultivé sur MRC-5

3D (POL)3C (PRO)2C2B1D1C1B 3A-B2A

P1 prot. Capside

Vpg2.5kDa

P2 P3

0 7478

1AAAA

Structurales Non structurales


IV Nonhuman primate, Philippines V Nonhuman primate, KenyaVI Nonhuman primate, Indonesia

D'après Nainan et al. 2006Clin. Microb. Rev. ; 19:63-79

Génotypes et phylogénie

Phylogenetic analysis of 3,582 HAV isolatesin the VP1/P2B region (315-bp fragment).

VP1/P2AGénotypes : >15% variationsSous types : 7.5% variations


Répartition mondiale des génotypes

Génotypes infectant l'homme en noir , les singes en rouge. Souche PA21 (génotype IIIA), isolée d'un singe Panamanian Owl en vert.

Cristina J, Costa-Mattioli M. Virus Res. 2007 Aug;127(2):151-7.


Application à l'étude de diffusion de

certaines souches

Diffusion du génotype IIA en France à partir d'une origine

Africaine

Diversité génétique d’un génotype rare du virus de l’hépatite APathologie Biologie, In Press, Availableonline 6 September 2010D. Desbois et al.

I

II

III


Symptomes

Ictère

VHA : Paramètres Biologiques

Semaines

Ag foie

VHA Sang

VHA Selles

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24

IgM

IgGprotection contre réinfection

Ac anti-VHA = hépatite A ancienne ou vaccinationIgM anti-VHA = hépatite aiguë A (clinique)


IgM HAV uniquement à bon escient !

Alaska : test "réflexe" si Ig-VHA totales + Ig M HAV⌦32 % de faux + (Castrodale CID 2005:41;e86)

Vaccination : 8 à 20 % d'IgM VHA + dans les 2 à 3 semaines suivant l'injection…

NE RECHERCHER L'IgM anti-VHA QU'EN CAS D'HEPATITE AIGUË

Roque Afonso et al. CID 2006:42 -887

82 %11 %1 %

Faux positifs


Diagnostic

Sérologie +++

IgM anti VHA : infection récente

IgG anti VHA : infection passée ou vaccination

IgM et IgG anti VHA

Diagnostic direct (-) [uniquement dans le cadre d'études]Virémie : techniques sensibles (105 v./mL)

Recherche de virus dans les selles, prolongée, importante (109v./mL), épidémiologie

Marqueurs biochimiques

⌦Transaminases (ALAT, ASAT)

⌦Bilirubine

⌦Phosphatase alcaline

⌦Facteurs de coagulation

Salive : IgG (ELISA)Génome viral (RT-PCR)

V.Thibault DU_janv.-11 20Rezende et al., Hepatology 38:613-618 (2003)

Hépatite fulminante Evolution bénigne

Limite de quantification

50 Hépatites A dont 19 fulminantes (10 OLT)Hépatite fulminante :

-virémie (p=0.03) *-bilirubine -(p=0.04) *-age (p=0.09)-génotype non IA (p=0.09)

Normann et al., Journal of Medical Virology 72:10–16 (2004)

11 Hépatites A

Quantification de la virémie ?

Fujiwara K et al. J. Med Virol. 2011 Feb;83(2):201-7.

Hepatitis A viral load in relation to severity of the infection.

11 patients with fulminant hepatitis10 with severe acute hepatitis70 with self-limited acute hepatitis


Durée de la virémie: conséquences cliniques et biologiques

Duration of viremia in hepatitis A virus infection

Bower et al. Journal of Infectious Diseases2000;182:12–7

6-7 5-6 2-5 Log particules/mL

Suivi de 13 patients : durée moyenne 95 joursdont 2 avec rechute (1-2 mois)

Suivi de 27 patients

High and Persistent Excretion of Hepatitis AVirus in Immunocompetent Patients

Tjon et al. Journal of Medical Virology 78:1398–1405 (2006)


Hépatite A : le vaccinvirus inactivé

AVAXIM 160U suspension injectable seringue préremplie ⌦Virus de l'hépatite A souche GBM cultivée sur cellules diploïdes humaines MRC-

5 , inactivé

HAVRIX 1 440 U Elisa/ml susp inj IM Ad en seringue

HAVRIX 720 U Elisa/0,5 ml susp inj IM Enf/Nour en seringue⌦Souche HM 175 du virus de l'hépatite A cultivée sur cellules humaines

diploïdes MRC5

Le schéma vaccinal habituel comprend 1 dose suivie d'un rappel (1 dose) 6 à 12 mois plus tard.

La persistance des anticorps anti-VHA après vaccination n'est actuellement pas connue . Les données disponibles suggèrent la persistance des anticorps anti-VHA à un niveau protecteur au moins jusqu'à 20 ans après primo-immunisation.

Hepatitis A Vaccine versus Immune Globulin for Post-exposure ProphylaxisVictor et al. 2007 N Engl J Med 357;17


Difficultés diagnostiquesEn routine

Adresser prélèvementsau

Centre national de référence du VHA

Pr E DussaixLaboratoire de virologie

Hôpital Paul Brousse12-14 av Paul Vaillant Couturier

94804 Villejuif cedexTel : 01 45 59 37 21

http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste


Grippe

SRAS ?

Hépatite E ?Hépatite E ? GrippeHépatite E ?


Historique VHEDécouverte dépendante de la connaissance des virus des hépatites⌦1955 : Inde, hépatite chez des personnes immunisées contre le

VHA, épidémie particulière. "NANBH"

Entité clinique 1980 - similitude avec l’hépatite A :Inde : prévalence de l’hépatite A importanteEpidémie : autre virus des hépatites, contamination par l’eau

1983 : reproduction de l’hépatite non A-non B chez un volontaire immunisé contre VHA (Balayan)

Hépatite à J36J28-45, visualisation de particules virales > VHA (27-30nm)Reproduction de l’infection chez le singe (cynomolgus)Hépatite "non A - non B" à transmission entérique (ENANB)

1990 : Reyes et al. clonage et séquençage "VHE"1991 : Tam et al. VHE2000 : Panda et al. cDNA infectieux


Coloured transmission electron micrograph of hepatitis E virus particles (purple)

Holmberg, Lancet Vol 376 September 11, 2010


VHE Virus non enveloppéSphérique (SRV)

Surface irrégulièreCapside 27-34 nm

Symétrie icosaédrique

ARN simple brinhélice droite

polarité +7,5kb

poly-A extrémité 3’

StabilitéAu laboratoire : instable(-70 à +8°C)

Décongélation/congélationTractus GI : stable (pH)

Famille : HepeviridaeGenre : Hepevirus


Organisation génomiqueNon structurales Structurales

28 5109 71245’ NC 3’NCPoly-A

ARN polarité + 7 200 nt

Protéinesimmunogènes DIAGNOSTIC

MeT Y Pro P X Hel RdRp

ORF3

ORF2

Génotypes 1-3

Hétérogénéité génétiqueAu moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés en 24 sous groupes dont homologues animauxEpitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2 Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype⌦ Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre

les différents types ?)⌦ Vaccin : ORF 2 recombinante


Similarités des souches humaines et animalesBilic et al. Journal of General Virology

(2009), 90, 863–873

Unrooted phylogenetic tree of four avian HEV and nine mammalian HEV isolates, based on the complete genome region

aviaireshumaines

Epidémique

Sporadique


Evolution VHE

Purdy MA, Khudyakov YE. Evolutionary history and population dynamics of hepatitis e virus. PLoS One. 2010 Dec 17;5(12):e14376.

Anthropotropic

enzootic

536 to 1344 years ago



Culture et Modèles animaux

• CultureDifficileCulture primaire d’hépatocytes de macaques (cynomolgus)Cellules PLC/PRF/5 hépatocarcinome (Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007)

Cellule embryonnaire

• Modèles animauxPrimates : reproduction de la pathologie humaineVolontaires...VHE du porc, du pouletPrésence d’Ac chez poulet, porc, rat, souris, mouton...

Lapin… Ma H et al. Experimental infection of rabbits with rabbit and genotypes 1

and 4 hepatitis E viruses. PLoS One. 2010 Feb 11;5(2):e9160


Résistance thermique du VHE…

Colson et al. JID 2010:202

VHE dans des suspensions fécales :Inactivation : 70°C 10' ou 95°C 1 min; 56 °C 30 min maintien de l'infectiosité

Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007


VHE et contamination des eaux

J. Rodriguez-Manzano et al. Excretion patterns of HAV and HEV infections in Eastern Spain Journal of Water and Health 08.2 2010

Presence of hepatitis A virus (HAV) and hepatitis E virus (HEV) in urban wastewater

Prédominance du génotype 3


Symptomes

Ictère

VHE : Paramètres Biologiques

Jours

VHE Sang

VHE Selles

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200

IgM

IgG

Titre peu élevéprotection contre réinfection ?

Khuroo MS, Khuroo MS.Seroepidemiology of a second epidemic of hepatitisE in a population that had recorded first epidemic30 years before and has been under surveillance since then. Hepatol Int. 2010 Feb 3;4(2):494-9


Virémie et excrétion fécale

Aggarwal et al. THE LANCET • Vol 356 • September 23, 2000, p1081-1082Détection du RNA-VHE chez 20 patients ayant une hépatite E aiguë

Virémie Selles

Chandra NS et al. Dynamics of HEV viremia, fecal sheddingand its relationship with transaminases and antibodyresponse in patients with sporadic acute hepatitis E. Virol J. 2010 Sep 6;7:213


HEV – virémie-transmission

Matsubayashi K, et al. Transfusion. 2008 Jul;48(7):1368-75.

serum

salive

selle

IgG

IgM

Concentré de plaquettes à J0 Transfusé à un homme de 64 ans traité pour Lymphome non-Hodgkinien par GM autologue


Immunodépression, hépatite chronique et stratégie diagnostique

Kamar et al. American Journal of Transplantation 2008; 8: 1744–1748

Dans le cadre d'une investigation chez un patient immuno déprimé,

La détection du génome viral (RT-PCR) sera privilégiée !

(ceci s'applique pour de nombreux diagnostics viraux - PCR)


Marqueurs non biologiques

circonstances de la maladie (voyage, autres causes, épidémie)A adapter en fonction de la zone géographique ? (Sud versus Nord ?)

clinique : hépatite “classique”, absence de chronicité (chez l'immunocompétent ! ) – Portage prolongé en cas d'immunodépression

Absence de marqueurs biologiques : diagnostic d'exclusion

Absence des marqueurs des virus des autres hépatites (A, B, C, D)

Notions sérologiques pour d’autres virus (EBV, CMV, herpès)

Marqueurs sérologiques spécifiques

IgM anti-HEV

IgG anti-HEV (+++)

RT-PCR : détection du génome viral (sang, selles)ATTENTION : spécificité - performances

Stratégie Diagnostique


Incidence des cas d'hépatite E en France :un gradient Nord-Sud

Nicand et al. Pathol Biol. 2009 Mar;57(2):203-11

Renou et al. 2008 Aliment Pharmacol Ther 27, 1086–1093


Performance des tests

MicroplaqueAdaltis

MicroplaqueMP Diagnostics

941644545Total (n=50)544545Negatif (n=9)437239140Positif (n=41)

négatifpositifnégatifpositifnégatifpositif

Test rapideMP Diagnostics

IgM anti-HEV

anti-HEV IgG

Legrand-Abravanel CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, May 2009, p. 772–774

Panels50 sérums ARN HEV (+), G3406 sérums IgG ARN HEV (-)

Sensibilité 90 88 82Spécificité 100 99.5 100VPP 100 95.7 100VPN 98.8 98.5 97.8


Stratégie DiagnostiqueSe donner les moyens de faire le diagnostic

--+Immunitéancienne

--+++Douteux

+-- ou +Probable

+++++Certain

RT-PCRIgMIgGDiagnostic

Diagnostic DirectRecherche du génome sur prélèvements sang et selles

Diagnostic IndirectRecherche de l'immunité antivirale

IgM anti VHEIgG anti VHE

Huang S et al. 2010 Profile of Acute Infectious Markers in Sporadic Hepatitis E. PLoS ONE 5(10): e13560


VHE et traitement

Efficacité du PEG-IFN

Efficacité de la ribavirine chez les patients

⌦Pas de mécanisme virologique précis décrit

Haagsma EB et al Liver Transpl. 2010 Apr;16(4):474-7Mallet V et al. Ann Intern Med. 2010 Jul 20;153(2):85-9. Kamar N et al. Nephrol Dial Transplant. 2010 Aug;25(8):2792-5.Kamar N et al. Gastroenterology. 2010 Nov;139(5):1612-8.


VHE et vaccination

Risque cumulé d'un premier épisode d'hépatite E

Moyenne géométrique du taux d'anticorps anti-VHE

20 μg d'antigène rHEV (capside exprimée dans baculovirus) dans 0.5 ml de PBS sur 0.5 mg d'hydroxyde d'aluminium.3 injections

Shrestha,et al 2007 N Engl J Med 356;9

Efficacité : 95,5% après 3 doses


VHE et vaccination

Zhu et al Lancet. 2010 Sep 11;376(9744):895-902

HEV 239 (Hecolin; Xiamen Innovax Biotech, Xiamen, China),produced in bacterial cells : safe and efficacious against infection with hepatitis E virus in seronegative participants in a phase 2 trial


Difficultés diagnostiquesEn routine

Adresser les prélèvementsau

Centre national de référence du VHA/VHE

Pr E DussaixLaboratoire de virologie

Hôpital Paul Brousse12-14 av Paul Vaillant Couturier

94804 Villejuif cedexTel : 01 45 59 37 21

http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste