VALIDATION ANALYTIQUE DU DOSAGE DE L’HOMOCYSTEINE PAR

SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM

Mathilde Louis1, C. Tse1, N. Jacob1, C. Jardel1, A. Sprault2, F. Lamari1

1 – Laboratoire de Biochimie, Hopital Pitié Salpétrière2 – Laboratoire de Biochimie, Hopital Kremlin Bicêtre

2011Biochimie

Biochemistry

Poster 3

IntroductionIntroduction

L’Homocystéine plasmatique (Hcy) est un L’Homocystéine plasmatique (Hcy) est un acide aminé soufré ayant un rôle majeur dans acide aminé soufré ayant un rôle majeur dans le cycle de la méthionine. Le dosage de l’Hcy le cycle de la méthionine. Le dosage de l’Hcy totale sert au diagnostic et au suivi des totale sert au diagnostic et au suivi des hyperhomocystéinémies d’origine génétique, hyperhomocystéinémies d’origine génétique, ou carentiellesou carentielles

L’hyperhomocystéinémie est associée à un L’hyperhomocystéinémie est associée à un risque accru de thromboses artérielles et risque accru de thromboses artérielles et veineuses. C’est aussi un facteur de risque veineuses. C’est aussi un facteur de risque athérogène de classe IIbathérogène de classe IIb

ObjectifObjectif Nous avons mis au point un dosage de Nous avons mis au point un dosage de

l’Hcy par spectrométrie de masse, triple l’Hcy par spectrométrie de masse, triple quadripolaire, couplée à une quadripolaire, couplée à une chromatographie liquide, avec dilution chromatographie liquide, avec dilution isotopique (LC-MS)isotopique (LC-MS)

Les résultats sont comparés à ceux Les résultats sont comparés à ceux obtenus par chromatographie liquide haute obtenus par chromatographie liquide haute performance avec détection fluorimétrique performance avec détection fluorimétrique (CLHP-FD)(CLHP-FD)

Validation des résultats Validation des résultats selon le guide de validation selon le guide de validation

technique d’une portée technique d’une portée flexible B de la COFRACflexible B de la COFRAC

Matériel : Matériel :

- TQD : Source Electrospray +- TQD : Source Electrospray +

-UPLC :Colonne HSST3, 60 °CUPLC :Colonne HSST3, 60 °C

- Phase mobile : Phase mobile :

-95% A1 : eau + 0,1 % 95% A1 : eau + 0,1 % acide formiqueacide formique

-5% B1 : méthanol5% B1 : méthanol

-Débit : 0,4 mL/minDébit : 0,4 mL/min

Méthode :Méthode : Dilution isotopique Dilution isotopique

- Standard interne : Standard interne :

D8-homocystineD8-homocystine

Matériel :Matériel :

- TQD : Source Electrospray +- TQD : Source Electrospray +

-UPLC :Colonne HSST3, 60 °CUPLC :Colonne HSST3, 60 °C

- Phase mobile : Phase mobile :

-95% A1 : eau + 0,1 % 95% A1 : eau + 0,1 % acide formiqueacide formique

-5% B1 : méthanol5% B1 : méthanol

-Débit : 0,4 mL/minDébit : 0,4 mL/min

MéthodeMéthode : : Dilution isotopique Dilution isotopique

- Standard interne : Standard interne :

D8-homocystineD8-homocystine

Méthode spécifiqueMéthode spécifique : :

1 transition de 1 transition de quantification quantification m/Z = 136 > 90m/Z = 136 > 90

1 transition de 1 transition de qualificationqualificationm/Z = 136 > 56m/Z = 136 > 56

1 temps de rétention 1 temps de rétention

Méthode sensibleMéthode sensible : : n = 19 blancsn = 19 blancs

Limite de détection (LOD)Limite de détection (LOD)= 3 x = 3 x σσ(blanc)(blanc)

= 0.1 µmol/L= 0.1 µmol/L

Limite de quantification Limite de quantification (LOQ)(LOQ)= 10 x = 10 x σσ(blanc)(blanc)

= 0.5 µmol/L= 0.5 µmol/L

justesse Concentration(µmol/L)

Biais (%)

E 111 117 12.4E 112 48 2.8E 109 13.1 -5.2

Réalisée sur les contrôles de qualités Réalisée sur les contrôles de qualités externes européens ERENDIMexternes européens ERENDIM

Biais < 13%Biais < 13%

Effet Matrice

y = 0,0775x - 0,0124R2 = 0,9956

y = 0,0893x + 0,4679R2 = 0,9948

012345678

0 20 40 60 80

Hcy [µM]

R A

irs

EauPlasma

- 8 mesures pour - 8 mesures pour chaque point de chaque point de gammegamme

- - Linéarité jusqu’à Linéarité jusqu’à 211 µmol/L211 µmol/L

-Comparaison de gamme dans Comparaison de gamme dans l’eau, l’albumine et le plasmal’eau, l’albumine et le plasma

- Effet matrice nigligeableEffet matrice nigligeable

Essai de linéarité

y = 0,0133x + 0,0061R2 = 0,9996

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 50 100 150 200 250

Concentration en Hcy (µmol/L)

Moy

enne

des

rapp

orts

Linéarité

Linéaire (Linéarité)

RésultatsRésultats

RépétabilitéRépétabilité ReproductibilitéReproductibilité

CQ1CQ1 CQ2CQ2 CQ1CQ1 CQ2CQ2

NombreNombre 30, 30, même sériemême série

30, 30, même sériemême série

30, 30, 2 dosages par 2 dosages par

jourjour

30,30,2 dosages par jour2 dosages par jour

Moyenne Moyenne (µmol/L)(µmol/L)

10,410,4 2828 10,410,4 2828

Ecart-typeEcart-type 0,300,30 1,11,1 0,340,34 0,700,70

Coefficient de Coefficient de variationvariation

2,92,9 3,93,9 3,213,21 2,482,48

Réalisé sur les contrôles qualités internes BIORADRéalisé sur les contrôles qualités internes BIORAD

CV < 5 % => ConformeCV < 5 % => Conforme

Recherche d’une contamination inter échantillon : Recherche d’une contamination inter échantillon :

- alternance de 3 mesures d’un plasma avec une homocystéinémie élevée (48 - alternance de 3 mesures d’un plasma avec une homocystéinémie élevée (48 µmol/L) suivi de 3 mesures d’un plasma ayant une homocystéinémie basse (8.4 µmol/L)µmol/L) suivi de 3 mesures d’un plasma ayant une homocystéinémie basse (8.4 µmol/L)

- Contamination inter-échantillons = 0,05 %- Contamination inter-échantillons = 0,05 %

Transférabilité des résultats entre LCMS et CLHPTransférabilité des résultats entre LCMS et CLHP

- 74 échantillons analysés en double sur la 74 échantillons analysés en double sur la LC-MS et CLHPLC-MS et CLHP

-- Graphique des différences : < 20 %Graphique des différences : < 20 %

- Graphiques des rapports : > 70 %- Graphiques des rapports : > 70 %

ConclusionConclusion

1.1. La méthode mise au point est La méthode mise au point est simple, rapide, sensible et simple, rapide, sensible et spécifique.spécifique.

2.2. La comparaison de méthode avec La comparaison de méthode avec la CLHP-FD montre une parfaite la CLHP-FD montre une parfaite transférabilité des résultats transférabilité des résultats