Institut Pasteur de Madagascar, 29 mars 2011

UMR216 ‘Santé de la mère et de l’enfant face aux infections tropicales’

évolution de la résistance de Plasmodium falciparum

aux médicaments antipaludiques

jerome.clain@parisdescartes.fr

histoire de la résistance aux antipaludiques

adapted from Ekland & Fidock, 2008

ART-T

SE Asia

Ato/Pg-R

travellers

principaux gènes de résistance aux médicaments antipaludiques

ART-T

SE Asia

Ato/Pg-R

travellers

• pfcrt (3 SNPs)

• pfmdr1 (SNPs)• pdhfr (3-4 SNPs)

• dhps (1-3 SNPs)• pfmdr1 (CNVs) • pfcytb (1 SNP)

• vacuole digestive

• fonction inconnue• cytoplasme

• synthèse d’ADN • mitochondrie

• transfert d’e-

• combien d’origines de chimiorésistance ?

• comment évoluent les allèles (gènes) de chimiorésistance ?

1- brefs rappels de génétique des populations

2- gène pfdhfr et origine de la résistance à la pyriméthamine

3- gène pfcytb et résistance à la Malarone (atovaquone-proguanil)

les 2 échelles de l’évolution

• au sein d’1 espèce

• au sein/entre populations

• échelle : générations

• entre plusieurs espèces

• échelle : temps géologiques

mutation

migration

dérive génétique

sélection naturelle

évolution des populationschangement des fréquences alléliques au sein d’une population

génération 1

2N tirages

0.75

0.25

0.75

0.25

urne des gamètes

effectifs infinis

N individus diploïdes

♀ ♂

génération 2

Évolution si :

• mutation

• migration

• dérive génétique

• sélection naturelle

2 allèles

N individus diploïdes

marqueurs du polymorphisme génétique (1)

SNP : single nucleotide polymorphism

Mu et al. 2006

• ~ 1 SNP / 300 pdb

• ~ 100 000 SNPs (objectif : 350 000)

allèle sauvage :

allèles mutants :

5’-ATAACATGA-3’

ATAAAATGA ATAAGATGA

« délétère »

« désavantageux »« neutre »

« bénéfique »

« avantageux »

5’-ATAATATGA-3’

• polymorphismes de séquences répétées en tandem : microsatellites

5’-ATCTAGCACACACACACACACATCCTG-3’ (CA)8

5’-ATCTAGCACACACACACACACACACATCCTG-3’ (CA)10

marqueurs moléculaires du polymorphisme (2)

- très polymorphes : nombreux allèles différents dans une population

- neutres le plus souvent

dhfr

-5.3 -0.1-4.4kb

phénotype

sensible

S

S

S

S

S

S

10

8

9

9

6

12

11

12

7

8

9

7

10

11

13

12

10

9

7

8

11

: microsatellite

: séquence codante

(TA)n (TAA)n (CG)n

diversité génétique et origine des mutations

dhfr

-5.3 -0.1-4.4kb

phénotype

résistant

sensible

S

S

S

S

S

10

8

9

9

6

12

11

12

7

8

9

7

10

11

13

12

10

9

7

8

11

: séquences répétées en tandem (microsatellite)

: séquence codante

(TA)n (TAA)n (CG)n 51 59 108

apparition d’un allèle de résistance par mutation

sélection de l’allèle de résistance

10

8

9

9

6

12

11

12

7

8

9

7

10

11

13

12

10

9

7

8

11

10

8

9

9

6

12

11

12

7

8

9

7

10

11

13

12

10

9

7

8

11

traitement

=

sélection

13 12 10

13 12 10

13 12 10

13 12 10

1. fréquence de l’allèle de résistance : sélection directionnelle positive

2. effet « auto-stop » ou hitchhiking

3. déséquilibre de liaison

8

9

9

6

12

11

7

8

9

7

10

11

12

10

9

7

8

11

13 12 10

13 12 10

13 12 10

13 12 10

13 12 10

diversité réduite à proximité de l’allèle sélectionné

application 1 :

recherche de locus sélectionnés par approche genome-scan

identification du gène pfcrt, déterminant de la résistance à la chloroquine

Wooton 2001, Nature

parasites résistants à la chloroquine

chromosomes

parasites sensibles à la chloroquine

Ré

du

ction

de la

div

ers

ité

allé

liqu

e

15

application 2 :

origine de la résistance à la pyrimethamine en Afrique

dhfr ts

51 59 108

wild type

triple mutant

N

I

C

R

S

N

> base génétique : 3 SNPs dans le gène dihydrofolate reductase

> origine unique en Asie du Sud Est

> triple mutant asiatique importé dans le sud

et l’est de l’Afrique

> probabilité élevée d’échec thérapeutique

1978

? généralisation à l’ensemble du continent africain ?

stratégie

allèles dhfr

• sauvage (WT) n = 75

• triple mutant n = 204

-0.1-3.9 51 59 108 +0.5 +1.5 kb

WT

triple mutant

N

I

C

R

S

N

-

-

-

-

-

-

-

-

dhfr ts

: microsatellite : séquence codante

resistant wild-type

-3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5 -3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5 -3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5 -3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5

FCM29 194 147 IRN 105 202 196 - IRN - - - - IRN - - 185 140 NCS 99 -

THAI - - IRN - - - 150 IRN - - - - IRN - - 192 166 NCS 99 -

- 139 IRN - - - - IRN 107 - - - IRN - - 187 145 NCS 109 -

- - IRN 107 - - - IRN 111 - - - IRN - - 190 127 NCS 93

- - IRN 107 - - - IRN 111 - - - IRN - - 191 127 NCS 109 -

- - IRN 107 - - - IRN - - - - IRN - - 191 136 NCS 107 204

- - IRN 109 - - - IRN - - - - IRN - - 192 127 NCS 93 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 136 NCS 107 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 196 127 NCS 99 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 139 NCS 93 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 151 NCS 99 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 214 158 NCS 95 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 127 NCS 93 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 137 NCS 103 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 140 NCS 103 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 154 NCS 103 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 224 142 NCS 95

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 187 141 NCS 93 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 191 127 NCS 97 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 191 163 NCS 95 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 197 - NCS 93 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 150 NCS 85 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 202 160 NCS 93 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 137 NCS 99 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 127 NCS 109 204

- - IRN - - 189 - IRN - - - IRN - - 207 137 NCS 103 -

- - IRN - - - - IRN 103 - - - IRN - - 210 150 NCS 99 204

- - IRN - - - - IRN 103 - - - IRN - - 191 153 NCS 93 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 95 - 201 127 NCS 93 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 146 NCS 97 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 140 NCS 99 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 156 NCS 103 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 202 147 NCS 85 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 140 NCS 97 204

- - IRN - - - - IRN - - 192 152 IRN 103 204 189 153 NCS 95 -

- - IRN - - - - IRN - - 196 - IRN - - 189 154 NCS 95 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 107 204 192 135 NCS 97 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS 103 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS 107 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS - 204

- - IRN - - 200 - IRN - - - - IRN - - 192 140 NCS 99 -

- - IRN - - 202 - IRN - - - - IRN - - 192 144 NCS 102 -

- 154 IRN - - - 150 IRN - - - - IRN - - 192 154 NCS 103 204

- 154 IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 - NCS 101

- - IRN 103 - - - IRN - - - - IRN - - 202 139 NCS - 204

- - IRN - 204 - - IRN - - - - IRN - - 202 143 NCS 85 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 141 NCS 97 195

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 143 NCS - -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 139 NCS 103 204

- - IRN - - - - IRN - - 192 - IRN - - 206 146 NCS 99 -

- - IRN 103 - - - IRN - - 202 - IRN - - 206 151 NCS 97 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 107 - 208 135 NCS 103 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 210 137 NCS 95 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 127 NCS 111 205

- - IRN - - 151 IRN - - - - IRN - - - 139 NCS 99 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 187 143 NCS 93 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 162 NCS 103 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 144 NCS 93 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 140 NCS 99 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 149 NCS 93 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 144 NCS 85 204

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 149 NCS - -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 214 127 NCS 99 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - - 150 NCS 95 -

- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 190 142 NCS 99 204

- - IRN - - - - IRN - - 191 127 NCS 111 204

Maïga, 2007, J Infect Dis

-3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfr -3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfr -3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfr-3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfrFCM29

Thaï

application 3 :

origine de la résistance à l’atovaquone + proguanil

(Ato-PG ou Malarone®)

• traitement et prévention des infections à P. falciparum

• Ato : inhibe le complexe mitochondriale : cytochrome bc1

• proguanil (PG) : augmente l’activité de l’atovaquone (Ato)

résistance à Ato-PG

0 2000 4000 6000 (pb)

codingcox III

cox I cytb

4294a>c → Tyr268Ser

4294a>g → Tyr268Cys

• résistance à Ato

- base génétique simple

- 1 SNP mitochondrial : pfcytbY268S/C/N

- sensibilité in vitro à Ato : x102-103

- perte de la synergie entre Ato et PG synergy

Musset 2007, Microb Inf

paradoxe de la résistance à Ato-PG

• traitement cher (35-60 €)

- pas/peu utilisé dans les zones d’endémies

• allèle de résistance pfcytb268 extrêmement rare dans populations naturelles

- donc probablement non transmis par le moustique

• échecs thérapeutiques chez les voyageurs : 0,1 - 1 % !!

- résistance du parasite

- allèle mutant non détecté au début du traitement

? ces échecs sont-ils dus à un seul ou différents allèles de

résistance pfcytb268 ?

stratégie expérimentale

• 7 isolats provenant d’échecs thérapeutiques (portant l’allèle mutée pfcytb268)

- Ato-PG (6)

- atovaquone seule (1)

• 28 isolats appariés provenant de succès thérapeutiques par Ato-PG (portant

l’allèle mutée pfcytbY268)

• séquençage du génome mitochondrial : analyse de la diversité

moléculaire autour du locus pfcytb268

0 2000 4000 6000 (pb)

cox III

cox I cytb

échantillon : CNR Paludisme (Paris, France)

analyses :

• génotypage de polymorphes nucléaires (microsatellites)

Mitochondrial genome nucleotide position

cox3 cox1 cytb

1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 5

6 7 7 8 8 1 5 6 7 9 6 1 6 2 3 5 6 7 9 4

8 1 1 6 9 6 0 9 7 1 4 6 1 9 8 5 2 8 5 5

4 0 1 9 1 5 9 4 8 3 9 7 9 6 9 2 4 0 4 4

r r r n n s r i i i s s n n n s s i i r

Haplotype Origin n A - - G T G A G T C C C A A G C A G C -

R1 IVC 1 . - - . . . . . . . . . . G . . . . . -

R2 IVC 1 . - - T . . T . . . . . . C . . . . T T

R3 UPV 1 . - - . . . . . . . . T . C . . . . . -

R4 UPV 1 . - - . . . . . . . . . . G A . . . . -

R5 UPV 1 . - - . . . . . . . . . . C . . . . . -

R6 GUI 1 . - - . . A . T . . . . . C . . G . . -

R7 THA 1 . - - . . . . . C . . . . C . . . . . -

S1 IVC/UPV/GUI 13 . - - . . . . . . . . . . . . . . . . -

S2 IVC/UPV/GUI 9 . - - . . . . A . . . . . . . . . . . -

S3 IVC 1 . - - . . . . C . . . . T . . . . . . -

S4 UPV 1 . - - . C . . A . . . . . . . . . . . -

S5 UPV 1 . - - . . . . A . . T . . . . T . . . -

S6 GUI 1 . - - . . . . A . . . . . . . . . T . -

S7 GUI 1 . A T . . . . A . . . . . . . . . . . -

S8 GUI 1 G - - . . . . . . T . . . . . . . . . -

Musset , Mol Biol Evol 2007

relations entre les haplotypes mitochondriaux

minimum-spanning network

S8

R3

R6

R7

R2

S1

S4 S6

S5 S7

S2

S3

R5: pfcytbY268SR

R4

R1

: pfcytbY268CR

• diversité génétique des sauvages et

des résistants comparables

• pas compatible avec une origine

unique et récente de la résistance

variations de séquence avant et après traitement

• 5 patients : identité moléculaire parfaite entre D0 et Déchec

• 1 patient : séquence D0 incomplète, identité nucléaire

• 1 patient : D0 non collecté

Mitochondrial genome nucleotide position Microsatellite

1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 5

6 7 7 8 8 1 5 6 7 9 6 1 6 2 3 5 6 7 9 4

8 1 1 6 9 6 0 9 7 1 4 6 1 9 8 5 2 8 5 5

4 0 1 9 1 5 9 4 8 3 9 7 9 6 9 2 4 0 4 4

Time Hap A - - G T G A G T C C C A A G C A G C -

T

A

A

8

7

T

A

A

6

0

A

R

A

2

P

f

P

K

2

T

A

A

8

1

D22 R4 . - - . . . . . . . . . . G A . . . . - 80 71 98 165 175

D0 . - - . . . . . . . . . . . A . . . . - 80 71 98 165 175

(length, bp)

D0 Déchéc

Ato-PG

interprétation des données

mutation

** * * * * **

traitement

~ 105

~ 108-1012

reproduction

asexuée

*

*

• mutation se produit et est sélectionnée

chez les patients indépendamment

• multiples origines de l’allèle de résistance à Ato-PG

• cas unique : observer en situation naturelle la phase initiale de

l’évolution la résistance, avant la transmission de l’allèle mutant

par le moustique

• Ato-PG non recommandé pour un usage massif en zone

d’endémie

conclusions sur la résistance à Ato-PG

évolution de la résistance aux antipaludiques

• origines rares pour SP et CQ (≥ 3 SNPs)

• sélection intense sur les populations

• migrations intra et intercontinentales

• échecs thérapeutiques liés à la transmission de parasites

chimiorésistants

• origines multiples pour Ato-PG

• échecs thérapeutiques liés à la sélection de mutations de

novo (SP, CQ)

• signatures de sélection naturelle peuvent être recherchées

dans les génomes de populations

- diminution de la diversité génétique

- différenciation génétique entre populations

CNR Paludisme• Pr Jacques Le Bras

• Véronique Hubert

• Dr Sandrine Houzé

UMR216

• Pr Jacques Le Bras

• Dr Oumou Maïga

• Dr Lise Musset

• Emmanuelle Renard

• Dr Jérôme Clain

Collaborateurs

• Dr Abdoulaye Djimdé (MRTC, Bamako)

• Dr Milijaona Randrianarivelojosia (IPM)

• Dr JF Lepère (Bandraboua, Mayotte)

• Dr Agnès Aubouy (Gabon)

• Dr Sabah Omar (Kenya)