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Evolution de la résistance de Plasmodium falciparum aux médicaments antipaludiques - Conférence de la 8e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - CLAIN Jérôme - France - [email protected]
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Institut Pasteur de Madagascar, 29 mars 2011
UMR216 ‘Santé de la mère et de l’enfant face aux infections tropicales’
évolution de la résistance de Plasmodium falciparum
aux médicaments antipaludiques
histoire de la résistance aux antipaludiques
adapted from Ekland & Fidock, 2008
ART-T
SE Asia
Ato/Pg-R
travellers
principaux gènes de résistance aux médicaments antipaludiques
ART-T
SE Asia
Ato/Pg-R
travellers
• pfcrt (3 SNPs)
• pfmdr1 (SNPs)• pdhfr (3-4 SNPs)
• dhps (1-3 SNPs)• pfmdr1 (CNVs) • pfcytb (1 SNP)
• vacuole digestive
• fonction inconnue• cytoplasme
• synthèse d’ADN • mitochondrie
• transfert d’e-
• combien d’origines de chimiorésistance ?
• comment évoluent les allèles (gènes) de chimiorésistance ?
1- brefs rappels de génétique des populations
2- gène pfdhfr et origine de la résistance à la pyriméthamine
3- gène pfcytb et résistance à la Malarone (atovaquone-proguanil)
les 2 échelles de l’évolution
• au sein d’1 espèce
• au sein/entre populations
• échelle : générations
• entre plusieurs espèces
• échelle : temps géologiques
mutation
migration
dérive génétique
sélection naturelle
évolution des populationschangement des fréquences alléliques au sein d’une population
génération 1
2N tirages
0.75
0.25
0.75
0.25
urne des gamètes
effectifs infinis
N individus diploïdes
♀ ♂
génération 2
Évolution si :
• mutation
• migration
• dérive génétique
• sélection naturelle
2 allèles
N individus diploïdes
marqueurs du polymorphisme génétique (1)
SNP : single nucleotide polymorphism
Mu et al. 2006
• ~ 1 SNP / 300 pdb
• ~ 100 000 SNPs (objectif : 350 000)
allèle sauvage :
allèles mutants :
5’-ATAACATGA-3’
ATAAAATGA ATAAGATGA
« délétère »
« désavantageux »« neutre »
« bénéfique »
« avantageux »
5’-ATAATATGA-3’
• polymorphismes de séquences répétées en tandem : microsatellites
5’-ATCTAGCACACACACACACACATCCTG-3’ (CA)8
5’-ATCTAGCACACACACACACACACACATCCTG-3’ (CA)10
marqueurs moléculaires du polymorphisme (2)
- très polymorphes : nombreux allèles différents dans une population
- neutres le plus souvent
dhfr
-5.3 -0.1-4.4kb
phénotype
sensible
S
S
S
S
S
S
10
8
9
9
6
12
11
12
7
8
9
7
10
11
13
12
10
9
7
8
11
: microsatellite
: séquence codante
(TA)n (TAA)n (CG)n
diversité génétique et origine des mutations
dhfr
-5.3 -0.1-4.4kb
phénotype
résistant
sensible
S
S
S
S
S
10
8
9
9
6
12
11
12
7
8
9
7
10
11
13
12
10
9
7
8
11
: séquences répétées en tandem (microsatellite)
: séquence codante
(TA)n (TAA)n (CG)n 51 59 108
apparition d’un allèle de résistance par mutation
sélection de l’allèle de résistance
10
8
9
9
6
12
11
12
7
8
9
7
10
11
13
12
10
9
7
8
11
10
8
9
9
6
12
11
12
7
8
9
7
10
11
13
12
10
9
7
8
11
traitement
=
sélection
13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10
1. fréquence de l’allèle de résistance : sélection directionnelle positive
2. effet « auto-stop » ou hitchhiking
3. déséquilibre de liaison
8
9
9
6
12
11
7
8
9
7
10
11
12
10
9
7
8
11
13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10
diversité réduite à proximité de l’allèle sélectionné
application 1 :
recherche de locus sélectionnés par approche genome-scan
identification du gène pfcrt, déterminant de la résistance à la chloroquine
Wooton 2001, Nature
parasites résistants à la chloroquine
chromosomes
parasites sensibles à la chloroquine
Ré
du
ction
de la
div
ers
ité
allé
liqu
e
15
application 2 :
origine de la résistance à la pyrimethamine en Afrique
dhfr ts
51 59 108
wild type
triple mutant
N
I
C
R
S
N
> base génétique : 3 SNPs dans le gène dihydrofolate reductase
> origine unique en Asie du Sud Est
> triple mutant asiatique importé dans le sud
et l’est de l’Afrique
> probabilité élevée d’échec thérapeutique
1978
? généralisation à l’ensemble du continent africain ?
stratégie
allèles dhfr
• sauvage (WT) n = 75
• triple mutant n = 204
-0.1-3.9 51 59 108 +0.5 +1.5 kb
WT
triple mutant
N
I
C
R
S
N
-
-
-
-
-
-
-
-
dhfr ts
: microsatellite : séquence codante
resistant wild-type
-3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5 -3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5 -3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5 -3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5
FCM29 194 147 IRN 105 202 196 - IRN - - - - IRN - - 185 140 NCS 99 -
THAI - - IRN - - - 150 IRN - - - - IRN - - 192 166 NCS 99 -
- 139 IRN - - - - IRN 107 - - - IRN - - 187 145 NCS 109 -
- - IRN 107 - - - IRN 111 - - - IRN - - 190 127 NCS 93
- - IRN 107 - - - IRN 111 - - - IRN - - 191 127 NCS 109 -
- - IRN 107 - - - IRN - - - - IRN - - 191 136 NCS 107 204
- - IRN 109 - - - IRN - - - - IRN - - 192 127 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 136 NCS 107 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 196 127 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 139 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 151 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 214 158 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 127 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 137 NCS 103 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 140 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 154 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 224 142 NCS 95
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 187 141 NCS 93 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 191 127 NCS 97 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 191 163 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 197 - NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 150 NCS 85 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 202 160 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 137 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 127 NCS 109 204
- - IRN - - 189 - IRN - - - IRN - - 207 137 NCS 103 -
- - IRN - - - - IRN 103 - - - IRN - - 210 150 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN 103 - - - IRN - - 191 153 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 95 - 201 127 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 146 NCS 97 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 140 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 156 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 202 147 NCS 85 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 140 NCS 97 204
- - IRN - - - - IRN - - 192 152 IRN 103 204 189 153 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - 196 - IRN - - 189 154 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 107 204 192 135 NCS 97 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS 107 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS - 204
- - IRN - - 200 - IRN - - - - IRN - - 192 140 NCS 99 -
- - IRN - - 202 - IRN - - - - IRN - - 192 144 NCS 102 -
- 154 IRN - - - 150 IRN - - - - IRN - - 192 154 NCS 103 204
- 154 IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 - NCS 101
- - IRN 103 - - - IRN - - - - IRN - - 202 139 NCS - 204
- - IRN - 204 - - IRN - - - - IRN - - 202 143 NCS 85 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 141 NCS 97 195
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 143 NCS - -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 139 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - 192 - IRN - - 206 146 NCS 99 -
- - IRN 103 - - - IRN - - 202 - IRN - - 206 151 NCS 97 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 107 - 208 135 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 210 137 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 127 NCS 111 205
- - IRN - - 151 IRN - - - - IRN - - - 139 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 187 143 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 162 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 144 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 140 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 149 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 144 NCS 85 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 149 NCS - -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 214 127 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - - 150 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 190 142 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN - - 191 127 NCS 111 204
Maïga, 2007, J Infect Dis
-3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfr -3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfr -3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfr-3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfrFCM29
Thaï
application 3 :
origine de la résistance à l’atovaquone + proguanil
(Ato-PG ou Malarone®)
• traitement et prévention des infections à P. falciparum
• Ato : inhibe le complexe mitochondriale : cytochrome bc1
• proguanil (PG) : augmente l’activité de l’atovaquone (Ato)
résistance à Ato-PG
0 2000 4000 6000 (pb)
codingcox III
cox I cytb
4294a>c → Tyr268Ser
4294a>g → Tyr268Cys
• résistance à Ato
- base génétique simple
- 1 SNP mitochondrial : pfcytbY268S/C/N
- sensibilité in vitro à Ato : x102-103
- perte de la synergie entre Ato et PG synergy
Musset 2007, Microb Inf
paradoxe de la résistance à Ato-PG
• traitement cher (35-60 €)
- pas/peu utilisé dans les zones d’endémies
• allèle de résistance pfcytb268 extrêmement rare dans populations naturelles
- donc probablement non transmis par le moustique
• échecs thérapeutiques chez les voyageurs : 0,1 - 1 % !!
- résistance du parasite
- allèle mutant non détecté au début du traitement
? ces échecs sont-ils dus à un seul ou différents allèles de
résistance pfcytb268 ?
stratégie expérimentale
• 7 isolats provenant d’échecs thérapeutiques (portant l’allèle mutée pfcytb268)
- Ato-PG (6)
- atovaquone seule (1)
• 28 isolats appariés provenant de succès thérapeutiques par Ato-PG (portant
l’allèle mutée pfcytbY268)
• séquençage du génome mitochondrial : analyse de la diversité
moléculaire autour du locus pfcytb268
0 2000 4000 6000 (pb)
cox III
cox I cytb
échantillon : CNR Paludisme (Paris, France)
analyses :
• génotypage de polymorphes nucléaires (microsatellites)
Mitochondrial genome nucleotide position
cox3 cox1 cytb
1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 5
6 7 7 8 8 1 5 6 7 9 6 1 6 2 3 5 6 7 9 4
8 1 1 6 9 6 0 9 7 1 4 6 1 9 8 5 2 8 5 5
4 0 1 9 1 5 9 4 8 3 9 7 9 6 9 2 4 0 4 4
r r r n n s r i i i s s n n n s s i i r
Haplotype Origin n A - - G T G A G T C C C A A G C A G C -
R1 IVC 1 . - - . . . . . . . . . . G . . . . . -
R2 IVC 1 . - - T . . T . . . . . . C . . . . T T
R3 UPV 1 . - - . . . . . . . . T . C . . . . . -
R4 UPV 1 . - - . . . . . . . . . . G A . . . . -
R5 UPV 1 . - - . . . . . . . . . . C . . . . . -
R6 GUI 1 . - - . . A . T . . . . . C . . G . . -
R7 THA 1 . - - . . . . . C . . . . C . . . . . -
S1 IVC/UPV/GUI 13 . - - . . . . . . . . . . . . . . . . -
S2 IVC/UPV/GUI 9 . - - . . . . A . . . . . . . . . . . -
S3 IVC 1 . - - . . . . C . . . . T . . . . . . -
S4 UPV 1 . - - . C . . A . . . . . . . . . . . -
S5 UPV 1 . - - . . . . A . . T . . . . T . . . -
S6 GUI 1 . - - . . . . A . . . . . . . . . T . -
S7 GUI 1 . A T . . . . A . . . . . . . . . . . -
S8 GUI 1 G - - . . . . . . T . . . . . . . . . -
Musset , Mol Biol Evol 2007
relations entre les haplotypes mitochondriaux
minimum-spanning network
S8
R3
R6
R7
R2
S1
S4 S6
S5 S7
S2
S3
R5: pfcytbY268SR
R4
R1
: pfcytbY268CR
• diversité génétique des sauvages et
des résistants comparables
• pas compatible avec une origine
unique et récente de la résistance
variations de séquence avant et après traitement
• 5 patients : identité moléculaire parfaite entre D0 et Déchec
• 1 patient : séquence D0 incomplète, identité nucléaire
• 1 patient : D0 non collecté
Mitochondrial genome nucleotide position Microsatellite
1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 5
6 7 7 8 8 1 5 6 7 9 6 1 6 2 3 5 6 7 9 4
8 1 1 6 9 6 0 9 7 1 4 6 1 9 8 5 2 8 5 5
4 0 1 9 1 5 9 4 8 3 9 7 9 6 9 2 4 0 4 4
Time Hap A - - G T G A G T C C C A A G C A G C -
T
A
A
8
7
T
A
A
6
0
A
R
A
2
P
f
P
K
2
T
A
A
8
1
D22 R4 . - - . . . . . . . . . . G A . . . . - 80 71 98 165 175
D0 . - - . . . . . . . . . . . A . . . . - 80 71 98 165 175
(length, bp)
D0 Déchéc
Ato-PG
interprétation des données
mutation
** * * * * **
traitement
~ 105
~ 108-1012
reproduction
asexuée
*
*
• mutation se produit et est sélectionnée
chez les patients indépendamment
• multiples origines de l’allèle de résistance à Ato-PG
• cas unique : observer en situation naturelle la phase initiale de
l’évolution la résistance, avant la transmission de l’allèle mutant
par le moustique
• Ato-PG non recommandé pour un usage massif en zone
d’endémie
conclusions sur la résistance à Ato-PG
évolution de la résistance aux antipaludiques
• origines rares pour SP et CQ (≥ 3 SNPs)
• sélection intense sur les populations
• migrations intra et intercontinentales
• échecs thérapeutiques liés à la transmission de parasites
chimiorésistants
• origines multiples pour Ato-PG
• échecs thérapeutiques liés à la sélection de mutations de
novo (SP, CQ)
• signatures de sélection naturelle peuvent être recherchées
dans les génomes de populations
- diminution de la diversité génétique
- différenciation génétique entre populations
CNR Paludisme• Pr Jacques Le Bras
• Véronique Hubert
• Dr Sandrine Houzé
UMR216
• Pr Jacques Le Bras
• Dr Oumou Maïga
• Dr Lise Musset
• Emmanuelle Renard
• Dr Jérôme Clain
Collaborateurs
• Dr Abdoulaye Djimdé (MRTC, Bamako)
• Dr Milijaona Randrianarivelojosia (IPM)
• Dr JF Lepère (Bandraboua, Mayotte)
• Dr Agnès Aubouy (Gabon)
• Dr Sabah Omar (Kenya)