Les carboxypeptidases B d’Anopheles gambiae impliquées

dans le développement de Plasmodium falciparum

Catherine Lavazec

Institut Pasteur Paris

Atelier Paludisme 2008

www.msf.fr

Cycle biologique de Plasmodium

14 heures : Formation des ookinètes

24 heures :Pénétration des ookinètes

48 heures : Initiation du développement des oocystes

Développement sporogonique de Plasmodium

D’après Riehle et al, 2003

Stratégies de blocage de la transmission

Moustiques transgéniques Vaccin bloquant la transmission

Homme

Moustique

gamétocytes

gamètes

zygote

ookinète

oocyste

Epitheliumdigestif

Anti-parasite

Anti-moustique

Shin et al, J. Exp. Biol., 2003

Intérêt d’un vaccin bloquant la transmission basé sur un antigène de moustique

- Protéine recombinante plus facile à produire

- Efficace sur différentes souches de parasites, résistantes ou non

- Peut affecter la survie et la fécondité des moustiques

Sélection d’un gèned’Anopheles gambiae

impliqué dans l’interactionavec Plasmodium falciparum

- 1 -

Differential display

1 : sang non parasité2 : sang + formes asexuées3 : sang + gamétocytes

1 2 3

Gene A

Gene B

Gene C

Gene D

Actine

Identification de gènes d’An. gambiae

RT-PCR semi-quantitative

Bonnet et al, 2001

+ argCPB

S arg S

Carboxypeptidase B (CPB)

48,2 kDa

CPBAg1(CarboxyPeptidase B Anopheles gambiae 1)

423 aa

35,9 kDa

Lavazec et al, Insect Mol. Biol., 2005

Protéine recombinante CPBAg1

10080604020

Activité(%

)

0 0 0,1 100 1000 µM

10080604020

Activité(%

)

00 0,1 10 1000 µM

1,10-Phenantroline GEMSA

1

0,8

0,6

0,4

0,2

HipArg HipLys HipPhe

Activité(unités/mg)

0

HipArg :Km = 2,6 mM

kcat = 79,2 sec-1

ACTIVITE CPB

Lavazec et al, Insect Mol. Biol., 2005

Les carboxypeptidases Bd’Anopheles gambiae

- 2 -

5 CPB

5 CPA

13 séquencesFonction?

5 CPB putatives chez An. gambiae

Famille de carboxypeptidases

cpbAg1 VFMDGGIHAREWAGV--WRKNRSPGNVLCYGVDLNRNFP--YLAVHTYGEMIL--NSADILYTASGATDDYAYS-LGVPYSYTLELTGGGSQG--FDL--QTFELLKVFGQHAGTLSVTS

cpbAg2 VFVDAGIHAREWAAP--WRKTRRPAGRNCVGVDGNRNYD--YLSLHTYGQYLL--SSTNVLYAAAGGSDDYAYAVADVPISMTMELPGGGSQG--FNP--ETFVGVRAMALEVARNYS--

cpbAg3 VFIDGGIHAREWAGV--WRKNRFPATILCTGIDLNRNWD--YLAVHTYGDMIL--NSAEILYTANGCSDDYVAGVIGARYAYTLELTGGGRNG--FDL--QTFQIYRTMANNA-------

cpbAg4 IWMDGGIHAREWISP--WRKNRGGLQYGCAGVDLNRNYG--FLTFHSYGQYIL--PSGSTLYPAAGGSDDWARGALNIKYAYTVELRDTGRYG--FVL--EAVAFVDIIAQEV-------

cpbAg5 VFIDGGIHAREWAGV--WRKNRSPGNVLCYGVDLNRNFP--YLAVHTYGEMIL--NSADILYTASGATDDYAYS-LGVPYSYTLELTGGGSQG--FDL--QT------------------

cpaAg1 VFLEGGIHAREWISP--WRKTRKAYGPFCYGADPNRNWD--YIAFHSYSQLLL--NVYDAIYPASGSSVDWSYGAQDVKIAYTYELRPDGDAWNGFVL--ETLDSLITLLEESSARGYYDEKH

cpaAg2 IFIEANIHAREWISS--WRKTRQPVNALCVGADPNRNFD--QFSFHSYGQYLL--NSASVLYTTSGSTVDYFVGVHGTKLGFTFEFRDTGAT--GFVL--ETLNGIIAFVAEAKTLGYV----

cpaAg3 IFIESNIHAREWITS--WRKNRYPHNVLCYGVDMNRNFP--YLSFHSYGQYIL--TTADVLYIASGSSPDWAHGTHGTPVAATFEFRDNGYH--GFIL--EVLDGLVAFCRKGKELGHLTV--

cpaAg4 IVVEGGIHAREWISP--WRKNRKPYG-LCRGVDLNRNFD--YIALHSYSQLLM--SKYETIYPSSGGSIDWAYRPGGVPVSLTFELRGPPDSTDMFIL--ETLAAFVAIVQEAARLGYYDS--

cpaAg5 VFVVANMHAREWAAM--WRKNRAPQQDNALGVDLNRNFG--FVDLHTYGEYIL--TPPQLLYAVSGSSLDYCYSV-GVKACIAIEL---TGD--GFEI--EALAAVQAM--------------

cp-like1 VLVDAGVHAREWASH--WRKNRFAGNVMCVGTDVNRNFP--YLSLHSCGEYIL--ASGLL-YLATGSD-DFIYGAYGVQYAYTLELSCGNR-GYGFII--ETFEMMKVFGVHAGSLKISKRP

cp-like2 VFMEGTIHAREWISA--WRKTRSRQNVLCYGADPNRNWD--YLDFHASGQLLM--IAEII-YVASGSSLDWVKGTLQTPLTFAYELRDTG--EYGFLL--ETLDSVIVILEEGKAMGYH

cp-like3 VFVECGIHAREWISP--WRKNMQPYGVCRGVDL-NRNFA--YFSVHSFSQLVM--MIETI-YPSSGDSVDWVYSALGVPVAYTFELRGPPDSTNMFVL--ELLAAFIAMLGEATRLSYYDGERQEL

cp-like4 IIVVANLHAREWAAT--WRKNR----NSPLGIDLNRNFG--YVDLHTFGETIL--PAERS-FKESGSSIDYCFSLNIKACIAV-EL-TAGSYELQNNT--AVLTMAVYANAGNSPL

cp-like5 ILIDAGIHAREWITV--WRKTRRPLGPRHRRS--NRNFN--YLSLHSYAKAIL--ASTVLNRPVGGSSIDYAHDIEKVPVALVMEVASK-----GFHP--ESWIGIGAMVNCLASSFRSVLKGSGTLHLRZ

cp-like6 VFVVANMHAREWAAM--WRKNRAPQQDNATGVDLNRNFA--YVDLQTFGEYIL--GTLSD-LAHPVSGSSMDYCYFVG--

cp-like7 VFVEAGAHGHEWIGP--WSKNRSNHTQAHPAG--NRNWA--YLSLQAYGQLLA--YALEPVTGPATYGTATGYARYGAGIRYSYTLRLPDRGTHGFLL--DTLELL

cp-like8 IFVVANLNAREWAAM--WRKNRYPQTETEFGTDLNRNFD--YVDLQAYGEYLM--YLVGSAAELTKPAPGSSIDYCLSVGVKACIAMKL-TNRSYEIR--ALAAVQAMADKADEG

cp-like9 IFVVANLNAREWAAM--WRKNRAPQTVIDFGTDLNRNFD--YVDLQAFGEYLM--YLVGSAAE-IMKEASGSSIDYCLSVGVKACIAMKL-TSQGYE--QQALAAVQAMAVKADGG

cp-like10 VLVEAGLRAREWISP--WLKSRSVNGNGCFGVDLNRNFG--YPFSHSATTNPA--SIDFVAGTVQPDLVFTL------------ETGAGGN--YGYD--SETTYGFLTMAEYVANNK

cp-like11 VILVANLHAREWAAM--WSKNRSPQPNSRTFGVDNGNFG--YADMHTFGNHIF--GTSAHLFERTYGSSLDYCHSVGINVCLWFEL-----TNVGFQI--EAWAAITAMAVRANQIVDVFYPE

cp-like12 IFIESNIHAREWITS------

cp-like13 IIVIGNLQAREWVGM--WNKNRSPQSNANFGV--NFNNQ--VDLQGFGQLILM--DVGIASDYFPFAYGVCHDYCNAIGVKTCLTLRQ-TMQEYEIS--AFVAIHAMAEKSNLSNI

H RE R R H Y Y D E F

Expression des CPB chez An. gambiae

cpbAg1 et cpbAg2 sont les seuls gènes de CPB exprimés dans le tube digestif des Anopheles femelles

cpbAg1

cpbAg2

cpbAg3

cpbAg4

cpbAg5

Exprimé

Exprimé

Non Exprimé

Non Exprimé

Non Exprimé

ADNgNG NI Pf H20

Expression en présence de P. falciparum

Sang non parasité

Gamétocytes

Stades asexués14h

Ra tio d

’expre ssio n (%)

300

100

500

700

900

cpbAg1

300

100

500

700

900

24h

500

300

100

700

900

48h

cpbAg1 et cpbAg2 sont surexprimés spécifiquement en présence de gamétocytes

cpbAg2

14h

Ra tio d

’expre ssio n (%)

24h 48h

300

100

200

300

100

200

300

100

200

Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007

Activité CPB in vivo

Activité CPB induitepar le repas de sang

ActivitéCPB

(mU/ TD)

Activité CPB modifiéeen présence de gamétocytesde P. falciparum

0 14h 24h 48h

5

4

3

2

1

0

- Corrélation entre l’expression des gènes et l’activité CPB

- Rôle dans le développement de Plasmodium falciparum?

Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007

Le rôle de l’activité CPB dans le développement de Plasmodium

- 3 -

+ aaCPB

Anticorpsanti-CPBAg11

S aa S

2 S + aa+ Substratssynthétiques

CPB

3 + Arg / Lys

Activité CPB : - limite le developpement du parasite?- facilite le developpement du parasite?

Infections de moustiques sur le terrain

Technique de gorgement sur membrane

+ aaCPB

Anticorpsanti-CPBAg1

1

SS aa

% Inhibition activité CPB

14h PBM 54% +/- 924h PBM 36% +/- 848h PBM 33% +/- 11

M

Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007

+ aaCPB

Anticorpsanti-CPBAg1

1

SS aa

Sérumpréimmun

Sérum anti-CPBAg1

Moustiques infectés (%)

100

80

60

40

20

0

95 % réduction de la prévalence d’infection

Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007

Anticorpsanti-CPBAg1

activité CPB facilitele développementdu parasite?

1

Substrat clivé? Acides aminés libérés?

Le rôle est joué par :

+ aaCPB

SS aa

Hip + aa+ Hip-Arg+ Hip-Lys

2 Substratssynthétiques

+ aaCPB

SS aa

50

40

30

20

10

T - 0,01 mM 0,1 mM 1 mM

Prévalence d’infection(%

) Hippuryl - Arginine

Prévalence d’infection(%

)

50

40

30

20

10

T - 0,1 mM 1 mM 10 mM

Hippuryl - Lysine

L’activité CPB facilite le développement du parasite

aa+ aa

CPBSS aa

3 Acides aminés

+ Arginine

50

40

30

20

10

T - 0,1 mM 1 mM 10 mMPrévalence d’infection(%

) L - Arginine60

L’Arginine serait impliquée dans le développement parasitaire

Voies de synthèse de l’Arginine

Ornithine

Glutamate

Citrulline Argininosuccinate

Arginine

Anopheles gambiae

Plasmodium falciparum

Proline

Pyrroline-5-carboxylate

Apport exogène d’arginine indispensable pour Plasmodium

Le rôle de l’Arginine chez Plasmodium et Anopheles

L-Arginine

urée

Ornithine PolyaminesNO

citrulline

Arginine-phosphate

Défenses immunitaires

Réserves énergétiques

VitellogénèseMoustique

ADN polyméraseplasmodiale

Parasite

Régulation cycle cellulaire

Compétition entre le moustique et le parasite?

ArgArg PROTEINE

CPB

Le rôle des CPB dans l’interaction Plasmodium - Anopheles

-

Arg

ArgArg

+++

Arg

CPBAg1: une nouvelle cible pour un vaccin

bloquant la transmission ?

- 4 -

Immunogénicité de CPBAg1modèle : souris immunisées infectées

par Plasmodium berghei

(Ig)

2

1,5

1

0,5

Concentration (mg/ml)

G1 G2a G2b G3 M0

Total Ig

1/500

1/1000

1/2000

1/4000

1/8000

1/16000

1/32000

1,5

1

0,5

0

O.D.

Anti-CPBAg1 IgG

Control mice

CPBAg1 immunized mice

- CPBAg1 induit une réponse spécifique

-Isotypes G1 / G2b majoritaires

- Anticorps reconnaissent specifiquementCPBAg1 dans des extraits de tube digestifs

Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007

Effet de l’immunisation anti-CPBAg1 sur le développement de P. berghei

Souris nonimmunisées

Souris immunisées

63 % de réduction de la prévalence d’infection

Prévalence d’infection (%

) 100

80

60

40

20

0

CPBAg1 peut induire des anticorps bloquant la transmission chez la souris

Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007

Effet des anticorps anti-CPBAg1 sur la fécondité des moustiques

Anticorps anti-CPBAg1 réduisent la fécondite des moustiques

Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007

Conclusions

1) CPBAg1 : 1ère CPB caractérisée chez An. gambiae

CPB: nouvelles cibles pour un vaccin anti-transmission de Plasmodium

2) Activité CPB dans le tube digestif : CPBAg1 et CPBAg2

3) En libérant de l’arginine, l’activité CPB facilite le développement de P.falciparum

4) Anticorps anti-CPBAg1 inhibent le développement de Plasmodium et réduisent la fécondité des anophèles

Unité de Biologie et Génétique du Paludisme

Bertrand BoissonIsabelle ThieryRachida TaharSabine Thiberge

Catherine BourgouinRobert Ménard

Paludologie AfrotropicaleUnité 77, IRD, Dakar

Christian Boudin

Unité d’immunologie moléculaire des parasites

Sarah Bonnet

PT5 - Production de protéinesrecombinantes et d’anticorps

Stéphane Petres

Unité d’immuno-physiopathologie infectieuse

Alain Cosson

CEPIA

Francois LacosteFondations des Treilles

CANAM, VIH/PAL