Résistance et réponse thérapeutique

Jacques Le Bras

Centre National de RéférenceChimiosensibilité du Paludisme

Cnrcp

2

Classification des antimalariques selon leur point d’impact

GAMETOCYTOCIDES : Formes sexuées et formes hépatiques

SCHIZONTICIDES : Formes endoérythrocytaires asexuées

- lysosomotropes

- antimétabolites

- inhibiteurs de la respiration parasitaire

- antibiotiquesCnrcp

3

Des médicaments efficaces, sans danger, de faible coût

= la chloroquine et les antifoliniques (proguanil et pyriméthamine) ... jusqu’à ce que la résistance de P. falciparum se soit généralisée dans les années 80 ;

• seules alternatives accessibles en 2003 pour le traitement des résistances : pyriméthamine-sulfadoxine, amodiaquine, artémisinine ;

• urgence : évaluer de nouveaux antipaludiques.

Cnrcp

4

Chimiorésistance : définition• Capacité d’une souche d ’agent pathogène à se multiplier ou à survivre en présence de concentrations d’un médicament qui détruit normalement les parasites de la même espèce ou prévient leur multiplication.

• Résistance de P falciparum aux antipaludiques : toute fièvre après 72h de traitement avec une persistance de la même souche de P. falciparum que la souche initiale.

Cnrcp

5

Pourquoi le paludisme (à falciparum) est chimiorésistant ?

• Production de la chimio-resistance : mutation(s),

• Usage massif des antipaludiques : 2 x 109 cp de chloroquine en 1978 en Afrique,

• Le profil pharmacocinétique individuel d ’un médicament contribue à la sélection des parasites résistants (MQ > QU)

Cnrcp

6

Particularités du génome de Plasmodium falciparum

- Forte divergence du génome nucléaire : utilisation de A/T dans les codons : 82% (P. vivax : 67%).

- Génome mitochondrial conservé : 90% d ’identité entre les espèces plasmodiales.

- Eucaryote à cycle haploïde mais méiose normale (la progénie est distribuée selon Hardy-Weinberg ).

- Polymorphisme de séquences répétées.

Cnrcp

7

Utilisation des antipaludiques

Centres de santéCentres de santé

Quinine Injection Quinine Injection (2 millions)(2 millions)

Sulfadoxine Sulfadoxine -- Pyrimethamine Pyrimethamine (18 millions)(18 millions)

Chloroquine Chloroquine (134 millions)(134 millions)

autoauto--traitementtraitement

? ?

? ?

8

Le profil pharmacocinétique individuel d ’un médicament contribue à la sélection

des parasites résistants

[quinine] [méfloquine]

CI90

CI10

1 2 3 - - - - 7 14 21 jours

Cnrcp

9

Résistance aux médicaments dans le paludisme

• Deux mécanismes de base de résistance ont été

décrits chez P. falciparum :l’altération de l’affinité de liaison des enzymes

du parasite (pyriméthamine).

le transport altéré du médicament (chloroquine),

Cnrcp

10

vacuole digestive

cytoplasme parasitaire

cytosolérythrocytaire

pH 7,4 CQ = 1

pH 6,8 CQ + CQH+ = 5

pH 7,2CQ + CQH+ = 20

pH 5,2 CQ + CQH+ = 600

plasma

noyauPfcrt k76

Pfcrt muté détermine la CQ-R

Accumulation de CQ, inhibition de la digestion de l’hémoglobine

CnrcpCQ

Pfcrt 76t

CQ

11

Voies des Pyrimidines des Plasmodiumhumains

CO2 + aspartate

dihydroorotate

orotate

UDP dUTP

dUDP

dUMP dTMP

GTP

pteridine

dihydropteroate DHF

THF

N5,N10-CH3THF

ubiquinone H2

ubiquinone

cytochrome

cytochrome H2

1/2 O2

H2O

ADN

DHPS

DHFR

TS

DHOD

pABA

sulfadoxine

atovaquone

pyriméthamine, cycloguanilCnrcp

12

Ser108Asn

P. falciparumDi Hydro Folate Reductase

Cys59Arg

Asn51Ile

Ile164LeuAla16Val

Cnrcp

13

Mutations de la DHFR de P. falciparum, performances de l’enzyme et résistances

Mutation Cinétique Kinhib (nM) (Kcat/Km) pyrim. cyclog.

Sirawaraporn, 1997

sauvage 6,8 1,5 2,6

S108N 3,7 13 15

S108N + C59R 0,18 72 82

S108N + C59R + I164L 0,17 383 1141

14

Fitness (potentiel reproducteur)

• Utiliser des antipaludiques qui forcent Plasmodium à accumuler 2 mutations ou plus pour survivre pourrait restreindre le développement de la résistance.

• L’idée d’accumulation progressive de mutations de résistance correspond à ce qu’on observe in vitro mais sa réalité et son intérêt clinique restent à confirmer.

Cnrcp

15

Mortalité du paludisme & chloroquino-résistance

L’émergence de la chloroquino-R dans une zonesous chimio-prophylaxie de masse a un impact démontré

sur la mortalité attribuable au paludisme

Taux de mortalité attribuable au paludismeà Mlomp, Sénégal (Trape et al., 1998)

0

2

4

6

1985-89 1990-92 1993-95

Mortalité du paludisme (pour mille par an)

0-4 ans

5-9 ans

Cnrcp

16

Spread of chloroquine resistance

17

Nécessité de la surveillance de la résistance

Surveiller quoi ? (résistances cliniques, de souche, génétiques)

Surveiller qui ?(malades ou porteurs, résidents ou voyageurs)

Surveiller où ? (Pays, région, ville, quartier)

Surveiller quand ?(périodicité) Cnrcp

18

CHIMIOSENSIBILITE

Tests in vivo

Dosages

Tests de culture in vitro

Tests in silico (PCR)

Cnrcp

19

Tests in vivo OMS 01 : interprétationEchec thérapeutique précoce (ETP) : apparition d'un paludisme grave à J1, 2 ou 3 + parasitémie ; fièvre à J2 avec une parasitémie > à J0 ; fièvre à J3 + parasitémie ; parasitémie J3 = ou > 25% de J0.

Echec parasitologique tardif (EPT) : parasites sans fièvre entre J4 et 14 sans ETP ni ECTRéponse clinique et parasitol. adéquate (RCPA).

Echec thérapeutique tardif (ETT) : paludisme grave + parasitémie entre J4 et 14, sans ETP ; fièvre + parasitémie entre J4 et 14 sans ETP.

Cnrcp

20

Efficacité de la chloroquine en fonction de l ’âge à Madagascar

10 mg/kg en une dose

0

20

40

60

0-5 ans 5-14 ans 15 ans+

N° cas

RCPA

ETT

ETP

Cnrcp

21Cnrcp

22Cnrcp

23

marqueurs génétiques opérationnels de la résistance de P. falciparum

pyriméthamine : Ser -> Asn au codon 108 de la DHFR ;

cycloguanil : Ser -> Asn au niveau du codon 108 + Cys -> Arg au niveau du codon 59 de la DHFR (S108N + C59R) ;

pyriméthamine-sulfadoxine : DHFR S108N + C59R + N51I + mutations en 437 et 540 de la DHPS présentes dans 70% des échecs cliniques à SP ;

chloroquine : K -> T au codon 76 de la CRT (nécessaire mais pas suffisant ; ex. au Mali, diviser par 2,1-2,8 pour prédire la R clinique). Cnrcp

24

Proportions de mutants pyriméthamine-R et chloroquine-R à Dielmo, Sénégal, 1990 - 1999

010203040506070

90 91 92 93 94 95 96 97 98 99

Traitement quinine

Traitement chloroquine puissdx-pyriméthamine

IP & Cnrcp

%S108N%S108N%S108N (%S108N (pyrimpyrim--R)R)

%K76T (CQ%K76T (CQ--R)R)

25

Diversité génétique des populations de P. falciparum

• Les hôtes hébergent souvent plusieurs génotypes plasmodiaux

• Cette complexité est un obstacle important pour le contrôle du paludisme, en particulier pour :– les traitements– les vaccins– l’épidémiologie – les études physio-pathologiques

Cnrcp

26

• sans bénéfice individuel direct,• mettre en évidence l'existence de différents clones de P.

falciparum chez des patients avant la prise de l'antipaludique et au cours du traitement,

• étudier leur évolution à l'aide des techniques de biologie moléculaire adaptées (PCR quantitative).

Evaluation de la polyclonalité de P.falciparum au cours du traitement de

voyageurs par la quinine

Cnrcp

27

Problématique

1- Pouvoir comparer l’isolat avant et après traitement

2- Pouvoir détecter et quantifier un clone résistant minoritaire ou temporaire

Cnrcp

28

Patients

- 21 adultes fébriles, P.f au retour de pays endémique,

- protocole IMEA, agréé CCPPRB,

- hospitalisation courte,

- quinine 8 mg/kg/8h en IV,

- 10 prélèvements Hi, H2, H4, H12, H24, H36, H48, H60, H72 et H96

- Hi (diagn.) et H2 sont séparés de 6 à 8h

Cnrcp

29

À chaque prélèvement,

• Frottis et goutte épaisse,

• Extraction de l’ADN à partir de 100 µl de culot,

• Amplification msp-2 et analyse de fragments

Cnrcp

30

Ratio du mélange de parasites PfHB3+Pf3D7 : 98/2

HB3 3D7marqueur de taille interne

Analyse quantitative de fragments d ’ADN :electrophorégrammes

98 ± 0.3

2,2 ± 0.44

Ratio du mélange PfHB3/Pf3D7 : 2/98

amorces MSP2

31

Patient 18

0

1

2

3

4

5

6

Heures de prélèvements

Log(

Nbre

de

para

site

s/µl

)

Clone a

Hi H0H4 H24 H48 H72 H96

Camerounais, 3 sem au pays

Réponse thérapeutique à la quinine : infection à 1 clone

Cnrcp

32

Réponse thérapeutique à la quinine : infections à 3 clones

P a tie n t 1 7 : F lu c tu a t io n s d e s c lo n e s

0

1

2

3

4

5

6

He u r e s d e p r é lè v e me n ts

Log

(Nbr

e de

par

asite

s/µl

)

C lo n e a

Clo n e b

Clo n e c

Hi H4 H12 H2 4 H3 6 H4 8 H6 0 H72 H9 6

Ivoirien, 4 sem au paysPatient 13 : Fluctuations des clones

0

1

2

3

4

5

6

Heures de prélèvements

Log(

Nbr

e de

par

asite

s/µl

)

Clone aClone b

Clone c

Hi H2H4 H12 H24 H36 H48 H60 H72 H96

Malien, 2 sem au pays

Patient 15 : Fluctuations des clones

0

1

2

3

4

5

6

Heures de prélèvements

Log(

Nbre

de

para

site

s/µl

) Clone aClone bClone c

Hi H4 H36 H96

Comorien, 2 sem au paysPatient 19 : Fluctuations des clones

0

1

2

3

4

5

6

Heures de prélèvements

Log(

Nbre

de

para

site

s/µl

) Clone aClone bClone c

Hi H4 H24 H96

Camerounais, 2 sem au pays

Cnrcp

33

Patient 10

0

1

2

3

4

5

6

Heures de prélèvements

Log(

Nbr

ede

par

asite

s/µl

)

Hi H4 H24 H48 H96

Clone a : mutant dhfr & crt

H72

Clone b : mutant dhfr & crtClone c : mutant dhfr, sauvage crt

Clone d : sauvage dhfrClone e : sauvage dhfr, sauvage crt

Quantification des fragments MSP2 sous traitement à la quinine : infection ≥ 6 clones

Plasma :chloroq=67ng/mlproguan=0

→

Cnrcp

34

• Le mono-parasitisme est l’exception,• l'inoculation de souches S et R est fréquente,• impossible d’exclure la présence d’une souche

résistante sur le prélèvement avant traitement,• intérêt potentiel d’analyser les parasites résiduels

en cours de traitement,• s’il est démontré que la gravité est liée à la charge

de parasites séquestrés : → la chimioprophylaxie diminue le risque de

gravité si un partie de l’inoculum est sensible

Conclusion 1

Cnrcp

35

• Dans toute l’Afrique tropicale :différences significatives de fréquence et niveaux de résistance

• Dans les forêts d’Asie du Sud-Est et de Papouasie:faible n° d’épisodes par individu et forte

pression médicamenteuse,• En Amérique, en bordure des rivières d’Amazonie,

pas de résistance en Amérique Centrale

Où est le paludisme (à falciparum) chimiorésistant ?

Cnrcp

36

Stratégies

• Vieux méicaments– Rotation ? – Association ?

• nouveaux– Seuls ?– Associés ?

Cnrcp

37

Antimalariques disponibles face à la résistance• sulfadoxine -pyriméthamine (Fansidar®) 1 • amodiaquine (Camoquin®, Flavoquine®) 2 • méfloquine (Lariam®) 10• artéméther (Paluther®) 10• quinine 50• halofantrine (Halfan®) 300• associations :–méfloquine + artémether (ou artesunate) 10–dapsone+proguanil (ou chlorproguanil-LapDap®) 10–quinine + cycline (ou clindamycin) 100–artémether + luméfantrine (Riamet®,coartem®) 300, 20–atovaquone + proguanil (Malarone®) 300

Cnrcp

38

L’Afrique après la chloroquine :

amodiaquine ousulfadoxine-pyriméthamine (SP, Fansidar®)

• À peine plus coûteuses que la chloroquine,• les autres traitements antipaludiques coûtent plus

que la dépense annuelle en médicament par individu dans beaucoup de pays africains,

• SP première ligne thérapeutique dans 5 pays d ’Afrique de l ’Est,

• seconde ligne dans les autres pays d ’Afrique.

NN

NH2

SN

H

OO

OCH3

OCH3

SULFADOXINE

N

NC l N H 2

NH 2

CH 2C H 3

P Y R IM E T H A M IN E

Cnrcp

39

Amodiaquine-artésunatevs. Amodiaquine chez 941 enfants en Afrique

<0,000128,8%41%70%Kenya J28<0,000117,1%74%91%Kenya J140,04311,4%77%89%Gabon J280,152,3%98%100%Gabon J140,71,8%81%82%Sénégal J280,91-0,3%95%94%Sénégal J14

p∆Amodiaquine*Amodiaquine*-artésunate**

% guérison

Adjuik, Lancet, 2002

*10mg/kg/j x 3j; **4 mg/kg/j x3j

40

atovaquone • Hydroxynaphthoquinone (1982), large spectre

d'activité antiprotozoaire;• biodisponibilité 22%, clairance plus lente dans les populations

africaines (t1/2 73h) que dans les populations asiatiques (t1/231h), action schizonticide lente (TDP 60h) ;

• sélection de mutants résistants très rapide chez P. falciparum: 30% de rechutes, d'autant plus fréquentes que la charge parasitaire était élevée ;

• potentialisation avec le proguanil (indépendamment de l’action de son métabolite) ;

• association atovaquone-proguanil en traitement (1g + 400 mg/jx3) ou prophylaxie (250 mg + 100 mg/j) (Malarone®).

Cl

O

O

O

H

Cnrcp

41

Atovaquone-proguanil (A-P) taux de guérison à J28 ou J35

Halofantrine 100%100%France 95*< 0,02Méfloquine 86%100%Thaïlande

< 0,05Chloroq.-sulfad.-pyrim. 87,5%

100%PhilippinesNSQ-tétrac. 100%98,7%BrésilNSSulfad.-pyrim. 99%100%Zambie

0,02Amodiaquine 72%87%GabonPcomparateurA-PPays

*TDP A-P 63h, H 48h (p=0,02), vomissts A-P > H (p=0,001) Cnrcp

42

artémisinine (=O) → dihydroartémisinine (-OH) → artémether (-OCH3) → artésunate (-O-succinyl)

• Sesquiterpène-lactone (qinghaosu), absorption rapide mais incomplète par voie orale ou IM (biodisponibilité32%); clairance rapide (t1/2 = 3-10h) ;

• dosage d’artémether : 1,5 mg/kg/j IM x 5 (noncuratif chez les non immuns) ;

• action rapide ;• bien tolérée chez l’homme ;• Pas de chimiorésistance demontrée.

CNRCP

43

luméfantrine• Benflumétol (1993). Pas absorbée chez le sujet à jeun

(t1/2 72-120h). La débutyl-luméfantrine, 5 à 8 fois plus active que la molécule parente, est produite par la CYP3A4 des microsomes hépatiques. La cinétique du métabolite n’est pas connue.

• Action similaire à la méfloquine et l’halofantrine (TDP 54h).

• Allongement de l’espace QTc, ne semble pas dose dépendant.

• Association artémether-luméfantrine en traitement 80mg+480mg x2/j x 3 (Riamet®, Coartem®, 2000).

Cnrcp

44

Chimio-prophylaxie des groupes à risque

Cnrcp