SP Tests antipaludogrammes

1

Travaux pratiquesTravaux pratiques

Test de chimiosensibilitTest de chimiosensibilitéé in vitro pour in vitro pour ll’é’évaluation de la sensibilitvaluation de la sensibilitéé de de Plasmodium Plasmodium

falciparumfalciparum aux extraits de plantesaux extraits de plantes

Marie Ange Rason, Laetitia Morin, Michel RatsimbasonMarie Ange Rason, Laetitia Morin, Michel Ratsimbason

et Milijaona Randrianarivelojosiaet Milijaona Randrianarivelojosia

Atelier Paludisme Atelier Paludisme –– 5eme 5eme ééditiondition19 F19 Féévrier au 30 Mars 2007vrier au 30 Mars 2007

2

Phot

o: R

andr

iana

rivel

ojos

ia &

Tal

l, N

ov.

Phot

o: R

andr

iana

rivel

ojos

ia &

Tal

l, N

ov.

2003

2003

…… il y a un besoin permanent en nouveaux antipaludiquesil y a un besoin permanent en nouveaux antipaludiques

Antipaludiques, outil de lutte contre le paludisme : Antipaludiques, outil de lutte contre le paludisme : nombre limitnombre limitéé et det dééfifiéés par la rs par la réésistance des parasitessistance des parasites

3ÉÉtapes cltapes cléé dans le ddans le dééveloppement de mveloppement de méédicamentsdicaments

4

N

N

OH

HOMe

QuinineQuinine

N

CF 3

CF 3

N

H

OH

H

MefloquineMefloquine

N

NHN(CH 2CH 3)2

Cl

ChloroquineChloroquine

O

CH3

CH3

O

O

OOCH3

H

H

H

ArtemisinineArtemisinine

N

NH OH

CH 2-N(CH 2CH 3)2

Cl

AmodiaquineAmodiaquine

Structure Structure chimiqueschimiques dd’’antipaludiquesantipaludiques majeursmajeurs

5

MMéédecine traditionnelle : traitement des symptômesdecine traditionnelle : traitement des symptômes

(page 73)

TazoTazo (fi(fièèvre, frisson, cvre, frisson, cééphalphaléée, lombalgie, fatigue e, lombalgie, fatigue ……) ) nn’’est pas forcement du paludismeest pas forcement du paludisme

6

Plantes, paludisme et antipaludiquesPlantes, paludisme et antipaludiques

AmAméérique latine :rique latine :QuinineQuinine

Asie :Asie :ArtemisinineArtemisinine

7

Phot

o :

Rand

riana

rivel

ojos

ia, 2

003

?

PaludismePaludisme et et plantesplantesafricainesafricaines

Plantes mPlantes méédicinales en Afrique : dicinales en Afrique : superstition ? rsuperstition ? rééalitalitéé ??

Comment dComment déécouvrir des couvrir des molmoléécules antipaludiques cules antipaludiques ààpartir des plantes ?partir des plantes ?

MMéédicaments obtenus dicaments obtenus àà partir partir des plantes de Madagascardes plantes de Madagascar

CatharanthusCatharanthus roseusroseus donne des donne des antianti--leucleucéémiquesmiques

CentellaCentella asiaticaasiatica donne un cicatrisantdonne un cicatrisant

8

Plantes de Madagascar et de lPlantes de Madagascar et de l’’Afrique, Afrique, éétuditudiéées rigoureusement es rigoureusement par des grands laboratoirespar des grands laboratoires

9

Premier pas :Premier pas : identifier des extraits ou des molidentifier des extraits ou des moléécules cules antiplasmodiales antiplasmodiales àà partir des plantespartir des plantes

CCHHIIMMIIEE

PlantesPlantes BiologieBiologie

10


CCHHIIMMIIEE

EthnobotaniqueEthnobotaniquechimiotaxonomiechimiotaxonomie

Collection de Collection de plantesplantes

Test antiplasmodial in vitroTest antiplasmodial in vitro


11


CCHHIIMMIIEE

EthnobotaniqueEthnobotaniquechimiotaxonomiechimiotaxonomie

Collection de Collection de plantesplantes


Test de cytotoxicitTest de cytotoxicitéé in vitroin vitro

Test in vivo chez la Test in vivo chez la sourissouris((antipaludiqueantipaludique, , toxicittoxicitéé))


12


CCHHIIMMIIEE

Collection de Collection de plantesplantesTest antiplasmodial in vitroTest antiplasmodial in vitro


Test in vivo chez la Test in vivo chez la sourissouris((antipaludiqueantipaludique, , toxicittoxicitéé))


13

Premiers pas : Premiers pas : Identification des extraits actifs in vitro Identification des extraits actifs in vitro contre contre Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum

SSéélection lection des plantesdes plantes

Collecte Collecte des plantesdes plantes

PrPrééparation paration des ddes déécoctcoctééss

14

Premiers pas :Premiers pas : Identification des extraits actifs in vitro Identification des extraits actifs in vitro contre contre Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum


Culture dePlasmodium falciparum



15





Test anti-Plasmodium

in vitro


Evaluationde l’activité

antiplasmodiale

(Extrait aqueux ou organique) (Extrait aqueux ou organique)

16




in vitro


antiplasmodiale

SSéélection des lection des extraits extraits àà fractionnerfractionner

Fractionnement Fractionnement (chromatographie)(chromatographie)

(fractions (fractions ou molou moléécules pures)cules pures)

17




in vitro

Chimie de planteChimie de plante(purification)(purification)


antiplasmodiale

(mol(moléécules isolcules isoléées) es)

18

ActivitActivitéé intrinsintrinsèèque antique anti--Plasmodium Plasmodium des extraits des extraits

de plantesde plantes

Effet des extraits de Effet des extraits de plantes sur lplantes sur l’’activitactivitéé des des antipaludiques standardantipaludiques standard

Premiers pas : Premiers pas : Que peutQue peut--on chercher on chercher in vitroin vitro ??

19

Cycle biologique des plasmodies infectant lCycle biologique des plasmodies infectant l’’hommehomme

20

Culture continue de Culture continue de Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum(reproduction in vitro du stade (reproduction in vitro du stade erythrocytaireerythrocytaire))

21

Tests antiplasmodial Tests antiplasmodial in vitroin vitro

MicroscopiqueMicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 OMS, CTD/MAL/97.20 RevRev. 2 2001. 2 2001

ColorimColoriméétrique (pLDH, HRPII)trique (pLDH, HRPII)Moreno et Moreno et alal. . MedMed Trop 2001; 61:545Trop 2001; 61:545--5757NoedlNoedl et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2002; 46:16582002; 46:1658--6464

Isotopique (hypoxanthine tritiIsotopique (hypoxanthine tritiéée)e)Desjardins, Clin Desjardins, Clin PharmacolPharmacol TherTher 1979; 26:3271979; 26:327--2929Le Bras, Le Bras, AmAm J Trop J Trop MedMed HygHyg 1983; 32: 4471983; 32: 447--5151

Mise en culture Mise en culture des parasitesdes parasites

CytomCytoméétrie en fluxtrie en fluxPattanapanyasatPattanapanyasat et et alal.. CytometryCytometry 1997; 27: 841997; 27: 84--9191

MicrofluorimetriqueMicrofluorimetrique ((PicoGreenPicoGreen, , SybergreenSybergreen))Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24

22

Contraintes logistique et technique (communes)Contraintes logistique et technique (communes)

•• Clone de parasitesClone de parasites

•• ÉÉquipements de laboratoirequipements de laboratoire

•• Personnel compPersonnel compéétanttant

•• Bonnes pratiques de laboratoireBonnes pratiques de laboratoire

•• Souches de rSouches de rééfféérence de rence de P. falciparum P. falciparum ((3D7, FCM29, D6 3D7, FCM29, D6 ……))

Questionnements : Questionnements : -- laboratoires rlaboratoires réégionaux en Afrique ?gionaux en Afrique ?-- collaborations collaborations sudsud--nordnord ??

23

Tests de chimiosensibilitTests de chimiosensibilitéé in vitroin vitro

MicroscopiqueMicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 OMS, CTD/MAL/97.20 RevRev. 2 2001. 2 2001

ColorimColoriméétrique (pLDH, HRPII)trique (pLDH, HRPII)Moreno et Moreno et alal. . MedMed Trop 2001; 61:545Trop 2001; 61:545--5757NoedlNoedl et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2002; 46:16582002; 46:1658--6464

Isotopique (hypoxanthine tritiIsotopique (hypoxanthine tritiéée)e)Desjardins, Clin Desjardins, Clin PharmacolPharmacol TherTher 1979; 26:3271979; 26:327--2929Le Bras, Le Bras, AmAm J Trop J Trop MedMed HygHyg 1983; 32: 4471983; 32: 447--5151

CytomCytoméétrie en fluxtrie en fluxPattanapanyasatPattanapanyasat et et alal.. CytometryCytometry 1997; 27: 841997; 27: 84--9191

MicrofluorimetriqueMicrofluorimetrique ((PicoGreenPicoGreen, , SybergreenSybergreen))Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24

24

ProcProcéédure:dure:Randrianarivelojosia et Randrianarivelojosia et alal, 2002, 2002Le Bras & Deloron, 1983Le Bras & Deloron, 1983

Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum (synchronis(synchroniséé))

PrPrééparation de la suspension parasitaire dans du RPSH (200paration de la suspension parasitaire dans du RPSH (200µµl l par puits sur plaque de 96 puits; 0,5% de parasitpar puits sur plaque de 96 puits; 0,5% de parasitéémie; 1,5% mie; 1,5% dd’’hhéématocrite; hypoxanthine tritimatocrite; hypoxanthine tritiéée 0,5 e 0,5 µµCiCi/puits)/puits)

Incubation 42h Incubation 42h àà 3737°°C (atmosphC (atmosphèère micro are micro aéérophile et humide)rophile et humide)

Evaluation de la radioactivitEvaluation de la radioactivitéé incorporincorporéée et calcul des CI50e et calcul des CI50

Conduite du test isotopique Conduite du test isotopique in vitroin vitro

25

SchSchéématisation de lmatisation de l’’incorporation de lincorporation de l ’’hypoxanthinehypoxanthinetrititritiéée dans le dans l’’ADN du parasiteADN du parasite

+

Hypoxanthine-3H

ADN plasmodial ADN plasmodial (d(déébut du test) but du test) ADN marquADN marquéé au au

tritiumtritium

26

Compteur Compteur àà scintillation liquide pilotscintillation liquide pilotéé par ordinateurpar ordinateur

. Comptage de la radioactivit. Comptage de la radioactivitéé((cpmcpm) ) àà ll ’’aide du aide du MicrobetaMicrobeta

.. Calcul des Calcul des CI50 CI50 (concentration (concentration inhibitrice 50%)inhibitrice 50%)

27

IllustrationIllustrationEvaluationEvaluation de l'activitde l'activitéé antiplasmodiale antiplasmodiale

de plantes malgaches amde plantes malgaches amèères de la famille des res de la famille des Gentianaceae et des Meliaceae Gentianaceae et des Meliaceae

ThThèèse de Pharmaciese de PharmacieLLääetitiaetitia MorinMorin

Le 18 dLe 18 déécembre 2006 cembre 2006

28

SSéélection des Plantes lection des Plantes àà éétudiertudier

Tachiadenus longiflorusTachiadenus longiflorus(Gentianaceae)(Gentianaceae)

felampelanafelampelana ou ou kifelapelanakifelapelana( celle qui a de jolies fleurs)( celle qui a de jolies fleurs)

SSéélectionnlectionnéée sur la base des e sur la base des renseignements ethnobotaniquesrenseignements ethnobotaniques

UtilisUtiliséée contre la fie contre la fièèvre (vre (tazotazo ou ou tazomokatazomoka en malgache) en malgache)

29

Plantes Plantes éétuditudiééeses

Tachiadenus carinatusTachiadenus carinatus(Gentianaceae)(Gentianaceae)

Elle nElle n’’est pas utilisest pas utiliséée contre le e contre le «« tazotazo »»

SSéélectionnlectionnéée sur la base de la e sur la base de la chimiotaxonomiechimiotaxonomie

30


Exacum quinquenerviumExacum quinquenervium(Gentianaceae)(Gentianaceae)

mamoahelymamoahely ( celle qui fructifie en ( celle qui fructifie en éétant petite)tant petite)

UtilisUtiliséée contre le e contre le «« tazotazo »»

31


Malleastrum gracileMalleastrum gracile(Meliaceae)(Meliaceae)

AndriamagnamoraAndriamagnamora

UtilisUtiliséée contre le e contre le «« tazotazo »»

32

Plante antipaludique de rPlante antipaludique de rééfféérencerence

Artemisia annuaArtemisia annua((AsteraceaeAsteraceae))

Fournie gracieusement Fournie gracieusement par la socipar la sociééttéé BionexxBionexx

33

6 g de mat6 g de matéériel vriel vééggéétal + 40 ml dtal + 40 ml d’’eau distilleau distillééeeEbullitionEbullition pendant 5 minpendant 5 minLaisser refroidir 1h Laisser refroidir 1h àà temptempéérature ambianterature ambiante

Centrifugations puis filtrationCentrifugations puis filtrationSSééchage dchage d’’1 ml du d1 ml du déécoctcoctéé (estimation quantit(estimation quantitéé de matide matièère)re)Filtration stFiltration stéérilisante du reste de drilisante du reste de déécoctcoctéé sous hottesous hotteDilutions en cascade (6 concentrations dDilutions en cascade (6 concentrations d’’extraits de plantes)extraits de plantes)

PrPrééparation des dparation des déécoctcoctééss

34

Points importants :Points importants :

Entretenir quotidiennement les culturesEntretenir quotidiennement les cultures

Eviter les contaminations (bactEviter les contaminations (bactééries ou champignons)ries ou champignons)

Surveiller les charges parasitairesSurveiller les charges parasitaires

Respecter les bonnes pratiquesRespecter les bonnes pratiquesde laboratoirede laboratoire

Culture continue de Culture continue de Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum

35

Test de sensibilitTest de sensibilitéé sur 2 souches :sur 2 souches :P. falciparum P. falciparum FCM29FCM29 (r(réésistant sistant àà la chloroquine)la chloroquine)P. falciparum P. falciparum 3D7 (sensible 3D7 (sensible àà la chloroquine)la chloroquine)

MMééthode isotopiquethode isotopiqueBasBaséée sur le sur l’’inhibition de linhibition de l’’incorporation de lincorporation de l’’hypoxanthine hypoxanthine trititritiééee

Conditions du testConditions du testSynchronisation au sorbitol Synchronisation au sorbitol àà 5% 5%


36

RRéépartition sur la plaque 96 puitspartition sur la plaque 96 puits

RPMI-1640 glucoséPuits TémoinT

(extrait aqueux brut)(extrait aqueux brut)(extrait aqueux brut)

Plante A. fruitsPlante A. tigesPlante A. racines

H

TS1S1TS1S1TS1S1G

TS2S2TS2S2TS2S2F

S3S3S3S3S3S3S3S3S3E

S4S4S4S4S4S4S4S4S4D

S5S5S5S5S5S5S5S5S5C

TS6S6TS6S6TS6S6B

A

121110987654321

37

Comptage de la radioactivitComptage de la radioactivitéé((cpmcpm) ) àà ll’’aide du compteur aide du compteur MicrobetaMicrobeta

Calcul des Calcul des CI50 CI50 (concentration inhibitrice (concentration inhibitrice 50%)50%)

Incubation des plaques Incubation des plaques pendant 24 h pendant 24 h àà 3737°°C;C;atmosphatmosphèère humidere humidemicroamicroaéérophilerophile

CongCongéélationlation--ddéécongcongéélationlation des des plaquesplaques

Collecte des parasites sur filtre Collecte des parasites sur filtre en fibre de verreen fibre de verre

38

Illustration des résultats de test antiplasmodialavec les extraits de plantes

Décocté de feuilles de Artemisia annua contre la souche chloroquinorésistante Plasmodium falciparum FCM29

956613,48966291,74937550,877317860,433537350,22652080,11

0,0055150*

Inhibition de croissance de parasite

en 24 h (%)

Moyenne de radioactivité(coups/min)

Concentration de l’extrait(en µg/ml dans le puits)

CI50

39

Inhibition de croissance de parasite

en 24 h (%)

Moyenne de radioactivité(coups/min)

Concentration de l’extrait(en µg/ml dans le puits)

9414081418,7872685709,4676375354,73711717177,3191493888,7221446444,30185570*

Illustration des résultats de test antiplasmodialavec les extraits de plantes

Décocté d’écorce de tiges de Malleastrum gracile contre la souche chloroquinorésistante Plasmodium falciparum FCM29

CI50

40

Activités anti-Plasmodium

Exacum quinquenervium407,2374,6Fruits

386,2359,8Racines

504,1416,3Tiges

Tachiadenus longiflorus

422,0409,4Racines

548,0474,7Tiges

Artemisia annua (référence)

0,32 0,31 Feuilles

Tachiadenus carinatus309,1350,6Fruits

651,8540,0Racines

512,0627,1Tiges

276,1280,2Ecorce de tiges

445,4475,8Branches

Malleastrum gracile

P. falciparum 3D7P. falciparum FCM29Plantes testées

Moyenne des CI50 (µg/ml)

x900

41

ActivitActivitéé antianti--Plasmodium Plasmodium des fractions obtenuesdes fractions obtenues

àà partir des extraits aqueux des plantes testpartir des extraits aqueux des plantes testééeses

Parasite utilisParasite utiliséé : :

Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum FCM29 (FCM29 (chloroquinorchloroquinoréésistantsistant))

42

Obtention des fractions Obtention des fractions àà partir partir des extraits aqueuxdes extraits aqueux

Culture deP. falciparum


DDéécoctcoctééss


antiplasmodiale

extraits extraits àà fractionnerfractionner

FractionsFractions

ChromatographieChromatographie

Colonne de chromatographie

Cuve de CCM

43

Front de solvant

Ligne de dépôt

AE/MeOH/H2O

77/15/8Plante X

T A B C D E F

UV à 365nm

UV à 254nm

Acide sulfurique 50%

Regroupement des fractions Regroupement des fractions mmééthanoliquesthanoliques similaires obtenues similaires obtenues àà partir des partir des extraits aqueuxextraits aqueux

A et B fraction F1

C et D fraction F2

E et F fraction F3

44

2424> 100> 100F2F2--MeOH sans tanninsMeOH sans tannins2626> 100> 100F2F2--MeOHMeOH3030> 100> 100F1F1--MeOH sans tanninsMeOH sans tannins1919> 100> 100F1F1--MeOHMeOH4949> 100> 100DichloromDichloromééthanethane3636> 100> 100HexaneHexaneFractionsFractions

504,1 504,1 ±± 112.9112.9Extrait aqueux brutExtrait aqueux brutàà 100 100 µµg/ml (%)g/ml (%)((µµg/ml)g/ml)Produits testProduits testééss

Inhibition maximale Inhibition maximale CI50CI50

ActivitActivitéés antis anti--Plasmodium Plasmodium des fractions obtenues des fractions obtenues àà partir du partir du ddéécoctcoctéé de tiges de de tiges de Exacum quinquenervium Exacum quinquenervium

45

Que pouvonsQue pouvons--nous tirer de cette nous tirer de cette éétude ?tude ?

Les extraits des quatre plantes malgaches sLes extraits des quatre plantes malgaches séélectionnlectionnéées et es et testtestéées nes n’’ont pas dont pas d’’activitactivitéé antiplasmodialeantiplasmodiale

Pourtant les Meliaceae et les Gentianaceae sont aussi connues poPourtant les Meliaceae et les Gentianaceae sont aussi connues pour ur leurs vertus antipaludiques dans dleurs vertus antipaludiques dans d’’autres paysautres pays

KhayaKhaya grandifoliagrandifolia (Meliaceae), utilis(Meliaceae), utiliséée au Cameroune au Cameroun

AzadirachtaAzadirachta indicaindica (Meliaceae)(Meliaceae)

Mais extraction avec des solvants organiques.Mais extraction avec des solvants organiques.

46


Nos rNos réésultats ne justifient pas lsultats ne justifient pas l’’utilisation des plantes utilisation des plantes éétuditudiéées pour traiter le paludismees pour traiter le paludisme

«« TazoTazo »» ddéésigne plutôt signe plutôt «« la fila fièèvrevre »»

Donc ces plantes pourraient soitDonc ces plantes pourraient soit

-- agir agir sur la fisur la fièèvrevre, activit, activitéé antipyrantipyréétiquetique

-- ou agir ou agir sur dsur d’’autres pathogautres pathogèènesnes pouvant donner des maladies pouvant donner des maladies dont les signes cliniques comprennent la fidont les signes cliniques comprennent la fièèvre vre

47


Pour notre laboratoire d’accueil, nous avons contribué àll’é’établissement de proctablissement de procééduresdurespour tester les décoctés des plantes dites « antipaludiques »

Inutile (perte de temps et Inutile (perte de temps et dd’’argent) de fractionner les argent) de fractionner les extraits aqueux avec des extraits aqueux avec des CI50> CI50> 1010µµg/mlg/ml

48

CCHHIIMMIIEE

Ethnobotanique, Ethnobotanique, taxonomietaxonomie

SSéélection de plantelection de plante

Test antiTest anti--PlasmodiumPlasmodium


Test antipaludique Test antipaludique in vivoin vivo (souris) (souris)

Autres modAutres modèèlesles (inhibition de la (inhibition de la polympolyméérisation de hrisation de héématine, stade matine, stade

hepatiquehepatique……))

PlantesPlantesBiologie Biologie ((efficacité? Innocuité?)

Chercher des molChercher des moléécules actives = cribler un grand nombre cules actives = cribler un grand nombre de plantes, criblage de plantes, criblage àà haut dhaut déébit, et bit, et éélargir les tests largir les tests biologiquesbiologiques

Perspectives Perspectives ……

49

Conclusion gConclusion géénnééralerale

50DDéécouverte de nouveaux mcouverte de nouveaux méédicaments : processus long et cherdicaments : processus long et cher

51

Travaux pratiquesTravaux pratiques

Test de chimiosensibilitTest de chimiosensibilitéé in vitro pour in vitro pour ll’é’évaluation de la sensibilitvaluation de la sensibilitéé de de Plasmodium Plasmodium

falciparumfalciparum aux extraits de plantesaux extraits de plantes

Marie Ange Rason, Laetitia Morin, Michel RatsimbasonMarie Ange Rason, Laetitia Morin, Michel Ratsimbason

et Milijaona Randrianarivelojosiaet Milijaona Randrianarivelojosia

Atelier Paludisme Atelier Paludisme –– 5eme 5eme ééditiondition19 F19 Féévrier au 30 Mars 2007vrier au 30 Mars 2007

Health & Medicine

SP Tests antipaludogrammes