Technique Karyolite BoBs : bilan d’un an d’utilisation en routine pour le diagnostic prénatal direct

U.F.R Médicale de Paris Ile-de-France Ouest

Année 2013

Mémoire

pour l’obtention du Diplôme d’Étude Spécialisé Complémentaire

de Cytogénétique Humaine

Technique Karyolite BoBs : bilan d’un an d’utilisation en routine

pour le diagnostic prénatal direct

Dr. Capucine Hyon

Service de Génétique et d’Embryologie Médicales

Hôpital Trousseau

2

TABLE DES MATIERES RÉSUMÉ ............................................................................................................................................................. 3

I. INTRODUCTION ......................................................................................................................................... 4

II. OBJECTIF DU TRAVAIL ................................................................................................................................ 4

III. MATÉRIEL ET MÉTHODES ...................................................................................................................... 5

A. Organisation .......................................................................................................................................... 5

B. Matériel d’étude .................................................................................................................................... 5

C. Technique BAC on Beads Karyolite ........................................................................................................ 5

1. Principe général ................................................................................................................................. 5

2. Déroulement de la technique ............................................................................................................ 7

D. Vérification en FISH ............................................................................................................................... 8

IV. RÉSULTATS ............................................................................................................................................. 9

A. Prélèvements ......................................................................................................................................... 9

1. Nombre de prélèvement ................................................................................................................... 9

2. Indications des prélèvements ............................................................................................................ 9

4. Indications des FISH ......................................................................................................................... 11

B. Résultats des examens directs ............................................................................................................ 12

C. Profils des anomalies ........................................................................................................................... 13

1. Profils des trisomies autosomiques ................................................................................................. 13

2. Profils des gonosomes anormaux .................................................................................................... 15

3. Anomalies particulières ................................................................................................................... 17

D. Faux Positifs et faux négatifs ............................................................................................................... 28

1. Faux positif : madame K, échantillon 585 ....................................................................................... 28

2. Faux négatif ..................................................................................................................................... 30

3. Faux négatif et faux positif : madame C, échantillon 987 ............................................................... 32

V. DISCUSSION ............................................................................................................................................. 34

A. Général ................................................................................................................................................ 34

B. Avantages ............................................................................................................................................ 34

C. Limites ................................................................................................................................................. 35

D. Coût de la technique............................................................................................................................ 36

VI. CONCLUSION ....................................................................................................................................... 37

Bibliographie .................................................................................................................................................... 38

Annexes ........................................................................................................................................................... 39

3

RÉSUMÉ Les méthodes de diagnostic rapide des aneuploïdies se sont largement développées avec notamment

l’utilisation de la FISH directe sur liquide non cultivé. De nombreux laboratoires utilisent maintenant la

technologie Prenatal BoBs qui permet non seulement le diagnostic des aneuploïdies les plus fréquentes

mais également celui de certains syndromes microdélétionnels. Nous avons mis en place dans notre

laboratoire le diagnostic rapide par la méthode Karyolite BoBs qui repose sur la même méthode mais qui

permet de faire le diagnostic des aneuploïdies de l’ensemble des chromosomes en rendant possible

également celui des anomalies de structures déséquilibrées de plus ou moins grande taille.

L’objectif du travail a été d’évaluer l’apport de cette méthode pour le diagnostic prénatal rapide en routine

des aneuploïdies et des remaniements chromosomiques de grande taille pendant un an au laboratoire de

cytogénétique.

Sur les 997 prélèvements reçus au laboratoire, nous avons effectué 717 examens BoBs et 211 FISH directes

ou examens directs de villosités choriales. Nous avons eu un taux d’échec <1% pour la technique de BoBs.

Elle nous a permis d’identifier tous les cas d’aneuploïdies 13, 18 et 21 mais également les deux cas de

trisomie 16. Nous avons mis en évidence cinq anomalies de structures déséquilibrées dont une anomalie

qui n’était pas visible au caryotype. Nous avons eu deux faux positifs et cinq faux négatifs pour certains liés

à une des limites de la technique, à savoir l’impossibilité de détecter les triploïdies. Le coût de cette

technique est évalué à 90€ par diagnostic.

Cette méthode nous offre la possibilité de réaliser un diagnostic rapide pour un grand nombre d’échantillon

avec une diminution du temps technique et médical nécessaire. Elle nous permet également de faire le

diagnostic de certaines anomalies de structure permettant ainsi une prise en charge plus rapide des

patientes. Malgré son coût plus élevé, la technique Karyolite BoBs est une alternative intéressante à la

pratique de la FISH grâce à son automatisation et au nombre de diagnostics qu’elle autorise. Son évaluation

doit être poursuivie, notamment par rapport à d’autres techniques moléculaires susceptibles d’être

utilisées de façon routinière en cytogénétique prénatale.

Mots-clés : Karyolite BoBs, Prenatal BoBs, Diagnostic prénatal, Diagnostic rapide.

4

I. INTRODUCTION La mise en place du diagnostic prénatal en France remonte au début des années 70. Ce sont les travaux

d’André et Joëlle Boué à la fin des années 60 et au début des années 70 qui ont permis le développement

du diagnostic prénatal chromosomique1. En effet leurs travaux ont mené à la mise au point des techniques

de cultures de cellules amniotiques. La possibilité de cultiver les cellules amniotiques a ensuite permis de

réaliser des caryotypes à partir de ces cellules fœtales. Cette avancée importante a permis le

développement du diagnostic prénatal pour les femmes ayant un risque élevé d’anomalie chromosomique,

en particulier les femmes âgées puisque l’implication de l’âge dans la survenue de la trisomie 21 était à

cette époque-là déjà bien connue2.

Par la suite, le développement du prélèvement des villosités choriales à un stade plus précoce de la

grossesse a également été un grand pas dans l’histoire du diagnostic prénatal. En effet, en cas d’anomalie

chromosomique, le prélèvement de villosité choriale offrait la possibilité de réaliser une interruption

médicale de la grossesse à un stade plus précoce et souvent moins traumatisant pour la patiente et le

couple. Cependant, la réalisation du caryotype à partir de cellules amniotiques, ou bien à partir de villosités

choriales, nécessitait toujours un temps de culture de 7 à 10 jours pouvant parfois paraître long pour la

patiente et le couple. C’est pourquoi, au début des années 90 s’est développé le diagnostic rapide des

principales aneuploïdies3.

Ce développement a été rendu possible grâce à l’évolution des techniques de cytogénétique moléculaire.

En effet, au cours des années 80 la cytogénétique moléculaire s’est développée avec l’utilisation de sondes

permettant d’identifier des régions spécifiques du génome répétées ou uniques. Les premières sondes

utilisées étaient des sondes radioactives donc difficiles à manier puis les sondes fluorescentes ont été mises

au point permettant l’hybridation in situ fluorescente ou FISH (Fluorescente In Situ Hybridization). La FISH a

tout d’abord été réalisée sur chromosome métaphasique et au début des années 90, l’utilisation sur noyau

en diagnostic post natal puis en diagnostic prénatal s’est développée.

Les premiers diagnostics rapides sur noyaux non cultivés ont été rapportés en 1992 par Klinger et al3. La

FISH sur noyau interphasique comportait plusieurs avantages : elle permettait d’obtenir un résultat rapide

en 24 à 48h pour les principales aneuploïdies (21, 18, 13, X et Y) et elle nécessitait peu de matériel, puisque

2 à 3 ml de LA étaient suffisants pour obtenir un résultat fiable. Cette technique a été utilisée dans de

nombreux laboratoires pour le diagnostic rapide des aneuploïdies en anténatal. Puis progressivement, des

techniques de biologie moléculaires se sont développées pour le diagnostic rapide des aneuploïdies :

QMPSF, PCR quantitative en temps réel, MLPA4...

La technique de FISH s’est largement développée et est maintenant la technique de référence pour le

diagnostic rapide des aneuploïdies les plus fréquentes 13, 18 et 21 ainsi que pour l’étude des chromosomes

sexuels. En revanche, elle ne permet d’explorer que quelques chromosomes et ne met en évidence que

certaines aneuploïdies.

II. OBJECTIF DU TRAVAIL L’objectif principal du travail est d’évaluer l’apport du kit Karyolite BoBs (BAC on Beads) en anténatal pour

le diagnostic rapide des aneuploïdies et des remaniements chromosomiques de grande taille pendant un an

au laboratoire de cytogénétique de l’hôpital Armand Trousseau.

5

III. MATÉRIEL ET MÉTHODES

A. Organisation

La mise en place de la technique Karyolite BoBs dans le service a été discutée au préalable avec les

membres du Centre Pluridisciplinaire de Diagnostic Prénatal (CPDP) de l’Est Parisien. Le choix de réaliser

deux séries par semaine en fonction des jours de prélèvements a été fait. Nous réalisons donc une série le

lundi avec rendu du résultat le mardi et une série le jeudi avec rendu des résultats le vendredi. Tous les

prélèvements de liquide amniotique ou de villosité choriale arrivant au laboratoire entre juillet 2012 et

juillet 2013 ont eu un examen BoBs sauf pour les cas particuliers rapportés dans le tableau 1. En effet, le

souhait de conserver un délai de réponse inférieur à 48h et d’utiliser un minimum de matériel pour

l’examen direct a conduit à poursuivre la FISH directe dans certaines situations.

Indication BoBs FISH

Demande de FISH spécifique associée (4p, 5p, 12p)

+

Grossesse gémellaire +

LA > 25SA Arrivée Lundi - Mardi - Jeudi + Arrivée Mercredi - Vendredi +

B. Matériel d’étude

L’ADN a été extrait à partir de 3 ml de liquide amniotique ou bien à partir d’une villosité choriale avec le kit

d’extraction QIAamp DNA Mini Kit de chez QIAGEN selon la procédure recommandée par le fabricant.

C. Technique BAC on Beads Karyolite

1. Principe général

La technique de BoBs repose sur les propriétés de dénaturation et de

réassociation spécifique des acides nucléiques utilisées en cytogénétique

moléculaire en particulier pour la réalisation d’Hybridation In Situ (FISH)

ou bien de puces à ADN. Dans le cas de la technique de BoBs, les BACs

(Bacterial Artificial Chromosomes) d’une taille d’environ 150 kb sont

fixés sur des billes de polystyrènes (Figure 1).

La technique Karyolite BoBs est une technique quantitative qui permet la recherche d’aneuploïdie mais

également l’étude d’un bras entier ou bien des régions télomériques d’un chromosome. Chaque bille est

colorée selon un gradient de concentration de deux colorants luminescents permettant d’obtenir un code

couleur différenciant 100 types de billes différents (Figure 2).

Tableau 1. Indications de la méthode d’examen direct en fonction de la demande des cliniciens.

Figure 1. Aperçu de la bille de polystyrène avec les BACs fixés à la surface.

6

Sur chaque bille sont fixés trois BACs correspondant à la région d’intérêt. Pour un chromosome, il y a donc

quatre billes correspondant à quatre régions d’intérêt : une bille pour chaque télomère (bras court et bras

long) et une bille pour chaque région péricentromérique de chaque bras (Figure 3), sauf pour les

chromosomes acrocentriques où il n’y a que trois billes correspondant aux régions péricentromériques,

intercalaires et terminales.

Figure 2. Principe de la méthode de marquage des billes fluorescentes par deux fluorochromes différents permettant de différencier 100 billes.

Figure 3. Représentation schématique de la localisation des BACs correspondant à la région d’intérêt pour chaque bille.

7

2. Déroulement de la technique

Pour chaque technique, l’ADN des patients et des ADN de références masculins et féminins sont analysés.

Pour les ADN de référence, nous utilisons un pool d’ADN de patient du laboratoire ayant eu une Analyse

Chromosomique sur Puce à ADN et qui était normale. Le déroulement de la technique est résumé dans

l’annexe 1.

a) Marquage

Pour chaque échantillon et référence, 240 ng d’ADN (soit 24µl) sont marqués par une technique de

« random priming » : 20 µl de Random Primers Mix sont ajoutés au 24 µl puis l’ensemble est chauffé à 98°C

pendant 5 minutes et redescendu à 37°C. Ensuite, 5µl de Biotin-dNTP Mix et 1 µl de polymérase sont

ajoutés à chaque échantillon et référence et incubé à 37°C pendant 60 à 90 min. L’ADN marqué est ensuite

purifié sur une plaque de purification NucleoFast (Macherey-Nagel). L’ADN marqué est remis en suspension

avec 25 µl de TE puis agité pendant 5 minutes. La concentration est ajustée à 175 ng/µl si nécessaire.

b) Hybridation

Pendant que l’ADN marqué est remis en suspension, un mix d’hybridation est préparé en mélangeant 11 µl

d’Hybridization Buffer et 1 µl de Karyolite BoBs Mix pour un échantillon. Le mix est fortement vortexé pour

mélanger parfaitement les billes. L’ADN de chaque échantillon est ensuite transféré dans une plaque PCR et

11 µl de mix d’hybridation sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est ensuite agitée pendant 5 min à

58°C puis la dénaturation est effectuée à 85°C pendant 5 min et l’hybridation se fait sur la nuit à 52°C et

sous agitation continue.

c) Révélation

Après 16h à 20h d’incubation, chaque puits est lavé une première fois pendant 20 min à 50°C. En parallèle,

le mix de reporter est préparé en mélangeant 0.45 µl de Reporter Concentrate qui contient la streptavidine

avec 112.5 µl de Reporter Diluent par échantillon. Après une nouvelle étape de lavage, 100 µl de mix

reporter est ajouté à chaque puits et la plaque est incubée à 37°C pendant 30 min avec une agitation à

1200 rpm. La plaque est à nouveau lavée pour éliminer l’excès de streptavidine.

d) Lecture

La lecture s’effectue à l’aide d’unautomate Luminex : un premier laser rouge excite les deux colorants de

chaque bille permettant d’identifier chacune d’entre elles tandis qu’un second laser vert excite la

streptavidine permettant ensuite la quantification d’ADN fixée sur la bille.

La fixation de trois BACs différents pour une seule région d’étude permet l’utilisation d’ADN de moins

bonne qualité.

e) Analyse

L’analyse est faite avec le logiciel BoBsoft® - 2.0 (Perkin Elmer). L’interprétation des résultats se fait en

comparant, pour une bille donnée, l’intensité de fluorescence du patient (P) par rapport aux témoins

masculin (TM) ou féminin (TF). On obtient alors pour chaque bille un ratio P/TM et P/TF.

Différents références sont disponibles pour l’interprétation des résultats. En effet, le logiciel peut utiliser

les références M et F de la technique pour les appliquer à chaque échantillon ou bien il peut déterminer

des références artificielles Mcomp et Fcomp. Le logiciel sépare tous les échantillons de la technique selon leur

sexe (défini par le ratio des intensités de fluorescence (IFM) moyen de l’X/ IFM moyen de l’Y) et crée deux

références Mcomp et Fcomp et les applique ensuite à l’ensemble des échantillons. Enfin une référence

artificielle cumulée peut être calculée. Elle repose sur l’accumulation des références artificielles sur

plusieurs techniques et, dans ce cas, les techniques doivent avoir été réalisées avec le même lot de billes.

8

D. Vérification en FISH

Pour les premières techniques, une vérification en FISH a été effectuée pour les cas d’aneuploïdies.

Durant toute la période d’inclusion, une vérification en FISH a été effectuée lorsqu’il y avait un profil

anormal portant sur une ou deux billes d’un même chromosome.

9

IV. RÉSULTATS

A. Prélèvements

1. Nombre de prélèvement

Durant la période d’étude entre juillet 2012 et juillet 2013, 997 prélèvements effectué en prénatal ont été

reçus au laboratoire. Sur ces prélèvements, 719 ont eu un examen direct avec la technique de BoBs. Le

détail du type de prélèvement ainsi que le type et le nombre d’examens directs effectués est rapporté dans

le tableau 2.

Type de prélèvement Prélèvements BoBs FISH directes BT directes

LA 737 531 180 0

VC 210 177 23 8

SF 39 0 0 0

Tissus 11 11 0 0

Total 997 719 203 8

2. Indications des prélèvements

L’indication principale ayant conduit à la réalisation d’un prélèvement de liquide amniotique est le

dépistage maternel (45%) effectué soit au premier trimestre de la grossesse avec l’évaluation du risque

combiné soit au 2ème trimestre avec le dosage des marqueurs sériques seuls. La deuxième indication la plus

fréquente est la présence de signes d’appel échographiques (Figure 4).

Tableau 2. Répartition des prélèvements reçus au laboratoire durant la période d’étude, nombre et type d’examen pratiqué. LA : liquide amniotique ; VC : Villosités choriales ; SF : Sang fœtal ; Tissus : villosités choriales récupérées lors d’une fausse couche spontanée précoce.

Figure 4. Indications ayant conduit à la réalisation d’un diagnostic prénatal invasif par ponction de liquide amniotique.

10

Dans le cas des prélèvements de villosités choriales, la présence de signes d’appel échographique tels qu’un

hygroma, une ou plusieurs malformations associées ou bien un anasarque est l’indication la plus fréquente

(30%). Puis le dépistage du premier trimestre qui place la patiente dans un groupe à risque (22%). Les

indications complémentaires qui regroupent les prélèvements pour diagnostic en génétique moléculaire

représentent 21% des cas (Figure 5).

Figure 5. Indications ayant conduit à la réalisation d’un diagnostic prénatal par prélèvement de villosités choriales.

11

4. Indications des FISH

Le tableau 3 présente les indications et le nombre de FISH directes effectuées selon le schéma de prise en

charge des prélèvements en diagnostic prénatal, mis en place au début de l’étude (cf Tableau 1). Dans

environ la moitié des cas, une FISH directe a été réalisée car le prélèvement avait été effectué au-delà de

25SA. Dans 20% des cas, c’est la demande de réalisation d’une FISH complémentaire qui a motivé la

réalisation d’une FISH directe

Indications FISH

FISH spécifique associée 41

4p 16

4p + 5p 2

TBX1 20

SNRPN 1

Hernie diaphragmatique (8p, 12p, 15q) 1

FISH spécifique 1

Convenance personnelle 1

Autre 161

LA > 25SA

105

LA < 25SA

32

Nuque ou SAE 9

Jours fériés 3

Jumeaux 2

? 4

Dépistage maternel 22

Jours fériés 10

? 12

2ème prélèvement 1

? 1

BT

23

Dépistage combiné 6

Jours fériés 3

? 3

Nuque ou SAE 16

Jours fériés 7

Rendu + rapide pour IMG chirurgicale 2

? 6

Forte suspicion clinique 1

Jumeau 1

Total 203

Tableau 3. Indications ayant conduit à la réalisation d’une FISH directe.

12

B. Résultats des examens directs

Résultats BT directe

Normaux 4 Aneuploïdies autosomiques 0

Trisomie 21 0

Trisomie 18 0

Trisomie 13 0

Anomalies autosomes 2

45,XY,der(14; 21)(q10 ;q10)pat 1

46, XY,t(4;10)(q23;p13)mat 1

Anomalies autosomes + gonosomes 1

46, XYY, rob(13;14)(q10,q10)pat 1

Autres anomalies 1 Triploïdie XXX 1

Total 8

Résultats FISH

Normaux 178 Aneuploïdies autosomiques 21

Trisomie 21 15

Trisomie 18 6

Trisomie 13 0

Anomalies des gonosomes 2

Monosomie X 2

Autres anomalies 2

Triploïdie XXX 1

der(6)t(6 ;16) 1

Total 203

Résultats BoBs

Normaux 639 Echec 6 Contamination maternelle 1 Aneuploïdies autosomiques 57

Trisomie 21 35

Trisomie 18 16

Trisomie 13 3

Trisomie 16 2

Mosaique Trisomie 22 1

Anomalies des gonosomes 5

Monosomie X 3

Klinefelter 1

Double Y 1

Anomalies des autosomes 5

Ségrégation 3:1 t(11;22) 1

Ségrégation 3:1 t(5;12) 1

Duplication 4qter 1

Délétion 22qter 1

Trisomie 18qter 1

Faux positifs 1

Duplication 22qter, XXY

Faux négatifs 4

XXX 1

Triploïdie XXX 2

Triploïdie XXY 1

Faux positif et faux négatif 1

Délétion 8p, Duplication 8q

Total 719

Tableau 4. Résultats obtenus pour les échantillons ayant eu un diagnostic direct par technique de BoBs.

Tableau 5. Résultats obtenus pour les échantillons ayant eu un diagnostic direct par technique de FISH.

Tableau 6. Résultats obtenus pour les échantillons ayant eu une analyse de trophoblaste par technique directe.

13

Les tableaux 4, 5 et 6 présentent les résultats pour les trois techniques de diagnostics directs. Pour la

technique de BoBs (tableau 4), le nombre d’échantillons pour lesquels il n’a pas été possible de rendre un

résultat est de 6 sur les 719 échantillons testés ce qui correspond à un taux d’échec <1%. Nous avons

également eu un cas de contamination maternelle pour lequel nous avons dû effectuer une vérification en

FISH.

Nous avons mis en évidence 7.9% d’aneuploïdies impliquant principalement les chromosomes 21, 18 et 13

mais également deux cas d’aneuploïdie impliquant le chromosome 16. Des anomalies des gonosomes ont

été mises en évidence dans cinq cas : trois cas de monosomie X, un cas de syndrome de Klinefelter et un

cas de double Y.

Par ailleurs, nous avons mis en évidence 6 anomalies de structure déséquilibrées qui concernaient des

autosomes que nous détaillerons plus loin.

Enfin, nous avons mis en évidence un faux positif, quatre faux négatifs et un cas qui présentait à la fois un

faux positif et un faux négatif que nous détaillerons également plus loin.

C. Profils des anomalies

1. Profils des trisomies autosomiques

La figure 6 reprend un exemple des profils obtenus pour les aneuploïdies concernant le chromosome 21.

Dans la totalité des cas, l’identification de la trisomie est aisée. Il existe une déviation franche des trois

billes du chromosome 21 par rapport au témoin masculin et au témoin féminin. Nous avons effectué une

vérification du résultat en FISH pour les deux premiers échantillons de la cohorte.

Figure 6. Exemple de profils obtenus pour les cas de trisomie 21.

14

Les profils obtenus pour les aneuploïdies impliquant le chromosome 13 sont également faciles à interpréter

(Figure 7). Il existe une déviation significative pour les 3 billes du chromosome aussi bien avec le témoin

masculin qu’avec le témoin féminin.

En revanche, les profils obtenus dans les cas de trisomie 18 sont plus difficile à interpréter (Figure 8). En

effet, la bille télomérique du bras court est souvent dans les limites de la normale. Mais le fait que toutes

les billes soient déviées facilite l’interprétation. Cette difficulté d’interprétation peut s’explique par le fait

que la séparation totale de l’X pour ces techniques était faible (<0.5%).



15

Dans certaines situations, nous avons analysé les résultats avec les différentes références : références M et

F de la technique, références artificielles Mcomp et Fcomp et références artificielles cumulées. La figure 9

montre un exemple de profils obtenus pour le même échantillon trisomique 18 (échantillon 730) avec les

différentes références. On peut noter que la déviation des billes varie plus ou moins en fonction de la

référence utilisée.

2. Profils des gonosomes anormaux

La figure 10 reprend les profils des gonosomes obtenus pour les monosomies X et la figure 11 les profils

obtenus pour le cas de syndrome de Klinefelter (à gauche) et le cas de double Y (à droite).

Figure 10. Profils obtenus pour les cas de monosomie X. On note une discordance entre le profil de l’X et le profil de l’Y.

Figure 9.

Figure 9. Profils obtenus pour l’échantillon 730 avec les différentes références. À gauche : références M et F ; au centre : références artificielles Mcomp et Fcomp ; à droite : références artificielles cumulées.

16

Figure 11. Profil d’un syndrome de Klinefelter à gauche et d’un homme double Y à droite.

17

3. Anomalies particulières

a) Madame M, échantillon 139

Madame M est une patiente âgée de 37 ans. Elle a déjà accouchée d’un premier garçon en 1999 en bonne

santé. La grossesse actuelle a été obtenue par FIV avec un nouveau conjoint. Le début de grossesse a été

sans particularité avec à l’échographie du premier trimestre effectuée à 12SA +2j une nuque mesurée à

1.3 mm pour une LCC à 58 mm. Les marqueurs sériques du 2ème trimestre ont montré un risque à 1/39,

motivant la réalisation d’une amniocentèse à 18SA.

L’examen direct en BoBs a montré la présence d’une déviation significative de la bille terminale du bras

long du chromosome 22 (ratio à 0.79 par rapport au témoin féminin et 0.87 par rapport au témoin

masculin) en faveur d’une délétion 22qter (Figure 12). Cette délétion a été confirmée par FISH directe sur

liquide amniotique avec la sonde couvrant le locus du gène SHANK3 (Figure 13).

Le caryotype a confirmé la délétion 22qterminale.

Figure 12. Profil de l’échantillon 139 montrant une déviation significative de la bille terminale du chromosome 22.

Figure 13. Confirmation de la délétion 22qter avec la sonde TBX1/SHANK3 (Kreatech) montrant la présence d’un seul signal vert dans l’ensemble des noyaux étudiés.

TBX1 SHANK3

18

Figure 14. Caryotypes obtenus après culture des cellules amniotiques confirmant la délétion 22qter.

19

b) Madame Y, échantillon 703

Madame Y est une patiente âgée de 39 ans, G3P1. Elle a accouchée d’une première fille en 2007, bien

portante. La grossesse a été marquée par la présence d’un dépistage combiné du 1er trimestre à 1/38 avec

une clarté nucale à 2.8 mm pour une LCC à 68.7 mm, une hCGβ libre à 1.7 MoM et une PAPP-A à 1.33

MoM. La patiente a donc eu une biopsie de villosités choriales au terme de 13SA +6j avec une demande de

réalisation d’un caryotype et d’un examen direct.

L’examen direct a mis en évidence une déviation significative de la bille 11qter et de la bille 22q proximale

en faveur d’une trisomie 11qter et 22q proximale (Figure 15).

Un examen FISH a été réalisé sur un lysat de villosités choriales avec une sonde Tel11q qui a confirmé la

présence de 3 signaux pour la région 11qter dans les 50 cellules observées (Figure 16). La présence d’un

marqueur surnuméraire dérivé d’une translocation t(11;22) a alors été évoqué.

Le caryotype après culture a confirmé la présence du marqueur surnuméraire dans l’ensemble des cellules

dérivé d’une translocation t(11;22)(q23;q11) (Figure 17).

Tel11q 11c

Figure 15. Profil obtenu pour l’échantillon 703 montrant la présence d’une trisomie 11qter et une trisomie 22qproximale.

Figure 16. Confirmation de la duplication 11qter avec une sonde télomérique tel11q montrant 3 signaux dans l’ensemble des noyaux observés.

20

Le caryotype des parents a été réalisé. Le caryotype du père était normal. Le caryotype de la mère a montré

la présence d’une translocation t(11;22)(q23;q11) (Figure 18)

Figure 17. Caryotype obtenu après culture des cellules trophoblastiques montrant la présence d’un élément surnuméraire dans l’ensemble des cellules.

Figure 18. Caryotype sanguin réalisé chez Madame Y lors de l’enquête familiale.

21

c) Madame L, échantillon 742

Madame L est une patiente de 33 ans. Il s’agissait de la première grossesse du couple. Le début de

grossesse s’est déroulé sans particularité. Le dépistage du premier trimestre ne la plaçait pas dans un

groupe à risque. L’échographie du 2ème trimestre était sans particularité. Enfin à l’échographie du 3ème

trimestre il a été noté la présence d’un profil particulier ayant motivé la réalisation d’une amniocentèse

pour une étude cytogénétique. La patiente ayant parlé de cet examen à sa mère, celle-ci l’a informée

qu’elle avait eu elle-même une amniocentèse pour elle et qu’il existait une translocation entre un

chromosome 5 et un chromosome 12, sans autre précision. La patiente a donc eu un prélèvement de

liquide amniotique à 33SA +6j ainsi qu’un prélèvement de sang pour analyser la translocation chez elle.

L’examen BoBs a montré la présence d’une déviation significative pour la bille terminale du bras court du

chromosome 5 et pour les deux billes du bras court du chromosome 12 évoquant une trisomie partielle du

bras court du chromosome 5 et une trisomie 12p complète (Figure 19). Cette image en BoBs a fait évoquer

la présence d’un dérivé surnuméraire t(5;12) par malségrégation 3:1 d’une translocation t(5;12). La trisomie

5ptel et la trisomie 12ptel a été confirmée par une FISH directe sur du LA conservé avec des sondes contig

télomériques (Figure 20).

Figure 19. Profil de l’échantillon 742 en faveur d’une duplication 5p terminale et d’une duplication 12p complète.

Contig 5pter Contig 5qter


Figure 20. Confirmation de la présence de trois signaux verts avec la sonde contig 5ptel (à gauche) et de trois signaux rouges avec la sonde contig 12ptel (à droite).

22

Le caryotype fœtal obtenu après culture des cellules amniotiques et l’examen FISH avec les sondes

télomériques des bras cours des chromosomes 5 et 12 a confirmé la présence d’un élément surnuméraire

dans l’ensemble des cellules (Figure 21).

Le caryotype de la mère a également été effectué et a confirmé la présence de la translocation

t(5;12)(Figure 22). Les FISH complémentaires ont montré que seuls ces deux chromosomes étaient

impliqués dans la translocation (Figure 23).

Le résultat obtenu avec la technique BoBs a permis de préciser les points de cassure. En effet, les sondes

proximales du bras court du chromosome 5 n’étant pas déviées, on peut supposer que le point de cassure

est situé en 5p13.2 ou 5p13.3 (Figure 24). Sur le chromosome 12, les sondes proximales du bras long du

chromosome 12 n’étant pas déviées, le point de cassure est situé au niveau de la bande q13.11 ou au-

dessus.

Figure 21. A. Caryotype montrant la présence du der(5 ;12) surnuméraire. B. Hybridation avec les sondes contig télomérique 5p (rouge) et 12p (vert). La flèche blanche indique le dérivé surnuméraire.

Contig 5pter Contig 12pter

Figure 22. Caryotype montrant la présence du de la translocation t(5 ;12).

wcp5 wcp12

Figure 23. Hybridation avec les sondes De peinture wcp5 et wcp12 montrant l’implication des chromosomes 5 et 12 uniquement.

A B

23

d) Madame MK, échantillon 909

Madame MK est une patiente âgée de 34 ans. La grossesse s’est déroulée sans particularité. A

l’échographie du 3ème trimestre, il a été noté la présence de petits signes à contrôler par un référent du

CPDPN à savoir une « éversion des cils », un rein droit peu différencié et un hydramnios. Concernant le pôle

céphalique, le corps calleux était étiré avec le 3ème ventricule et les cornes frontales trop visibles et au

niveau de la fosse postérieur, les dimensions du cervelet étaient à recontrôler. La grande citerne n’était pas

visualisée. Une ponction de liquide amniotique a été réalisée au terme de 32SA et 1j pour la réalisation

d’un caryotype et d’un examen direct.

L’examen direct avec la technique de BoBs a montré la présence d’une déviation significative des deux

billes du bras long du chromosome 18 alors que les deux billes du bras court étaient normales (Figure 25).

L’interprétation des profils des trisomies 18 étant difficiles, l’anomalie a été confirmée en FISH avec les

sondes subtélomèriques 18p et 18q. La FISH directe sur LA a montré trois signaux avec la sonde

subtélomèrique 18q (en rouge sur la figure 26) et seulement deux signaux avec la sonde subtélomèrique

18p. il a donc confirmé la présence d’une trisomie du bras long du chromosome 18.

Figure 24. Délimitation de la région (en orange) contenant les BACs des billes proximales des bras court du chromosome 5 (en haut) et du chromosome 12 (en bas) permettant d’avoir une indication sur le point de cassure sur chacun des bras.

Figure 26. Hybridation avec les sondes contig télomériques 18p et 18q montrant la présence de trois signaux pour la région 18qter (rouge) et deux signaux pour la région 18pter (vert) confirmant la présence d’une trisomie 18qter et l’absence de trisomie 18pter.

Figure 25. Profil de l’échantillon 909 montrant une déviation des billes du bras long du chromosome 18.


24

Le caryotype a montré la présence de deux chromosomes 18 normaux et un chromosome 12 remanié avec

un dérivé 12 d’une translocation t(12;18)(p13.33;q12.2)(Figure 27). Des examens complémentaires en FISH

ont montré la présence de signaux asymétriques avec la sonde du contig 12p faisant évoquer une délétion

terminale de la région télomèrique 12p (Figure 28).

Le caryotype de la mère a été réalisé et était normal. Le caryotype du père n’a pas pu être fait.

Figure 27. Caryotype après culture de cellules amniotiques montrant le dérivé 12.

wcp12 wcp18

Contig12p Contig18p

Figure 28. A. Hybridation avec les sondes de peinture wcp12 et wcp18 montrant le dérivé der(12) de la translocation t(12;18). B. Hybridation avec la sonde contig 12p (en rouge) montrant une asymétrie de signal et la sonde contig 18q montrant la présence de trois signaux.

A B

25

e) Madame G, échantillon 934

Madame G est une patiente âgée de 38 ans G2P1. Elle a eu une petite fille avec un premier conjoint en

2005 qui était décrite comme ayant quelques difficultés. A l’échographie du 1er trimestre la clarté nucale a

été mesurée à 3.1 mm pour une LCC à 78.8 mm. Le dépistage combiné du 1er trimestre était de 1/70. La

patiente a été adressée au CPDPN de l’hôpital Trousseau pour la prise en charge. Une ponction de liquide

amniotique a été faite pour la réalisation d’un caryotype et d’un diagnostic direct.

L’examen BoBs a montré une déviation significative de la bille de l’extrémité terminale du bras long du

chromosome 4 en faveur d’une duplication 4qter (Figure 29). Un examen FISH direct sur liquide amniotique

a confirmé le résultat avec la présence de trois signaux pour la région 4qter.

Le caryotype obtenu après culture a montré des chromosomes 4 apparemment normaux (Figure 30).

Figure 29. Profil obtenu pour l’échantillon 934 montrant la présence d’une déviation significative de la bille terminale du bras long d’un chromosome 4.

Figure 30. Caryotype après culture de cellules amniotiques ne montrant pas de chromosome 4 remanié.

26

Les examens complémentaires en FISH ont montré la présence d’un signal 4q sur un chromosome du

groupe E (Figure 31). En reprenant le profil BoBs il a été effectivement remarqué une déviation de la bille

de l’extrémité du bras court du chromosome 18 en faveur d’une délétion de la région terminale du bras

court du chromosome 18. Le résultat a donc été confirmé en FISH avec des sondes télomériques 4qter et

18pter

.

Le caryotype de la maman a ensuite été réalisé et n’a pas montré de chromosomes remaniés. En revanche,

l’examen en FISH a révélé la présence d’une translocation t(4;18) apparemment équilibrée et n’impliquant

que ces chromosomes (Figure 32).

La patiente a été revue en consultation et l’histoire familiale a été reprise. En raison de difficultés scolaires

chez la première fille, un caryotype a été réalisé chez celle-ci.. Le caryotype était normal mais l’examen en

FISH a montré la présence d’un dérivé 4 de la translocation t(4;18).

Après une consultation de conseil génétique avec l’ensemble des résultats, le couple a fait la demande

d’une interruption médicale de la grossesse qui a été acceptée par le CPDPN.

Figure 31. Hybridation avec la sonde contig 4q télomèrique (en rouge) montrant trois signaux (flèche pleine) et la sonde contig 18q télomèrique (en vert) montrant un seul signal (flèche pointillée).

Contig4q Contig18p

Figure 32. A. Hybridation avec la sonde wcp4 et wcp18 montrant la translocation t(4;18). B. Hybridation avec les sondes contig 4q (en rouge) montrant le dérivé 18 (flèche bleue) et la sonde contig 18p (en vert) montrant le dérivé 4 (flèche jaune).

Contig4q Contig18p

wcp4 wcp18

A B

27

RP11-22C6

Figure 33. Hybridation avec la sonde RP11-22C6 (18p11.3) montrant la présence de trois signaux avec un signal supplémentaire sur le dérivé 4.

28

D. Faux Positifs et faux négatifs

1. Faux positif : madame K, échantillon 585

Madame K est une patiente de 36 ans G2P1 sans antécédents particuliers. L’échographie du premier

trimestre était sans particularité avec une nuque fine (pas de résultat dans le dossier). Les marqueurs

sériques du 2ème trimestre ont montré la présence d’un risque à 1/49 motivant la réalisation d’une

amniocentèse.

L’examen direct par technique BoBs a montré la présence d’une déviation significative pour la bille

terminale du chromosome 22 en faveur d’une duplication ainsi qu’un profil de l’X et de l’Y en faveur d’un

Klinefelter (Figure 34). Cependant, le CV des autosomes pour cet échantillon était >6% qui est la limite fixée

dans le laboratoire. Le résultat a donc été vérifié par FISH directe sur liquide conservé, il a montré la

présence de deux signaux dans tous les noyaux pour la région terminale du chromosome 22 ainsi que des

signaux féminins (Figure 35). Le résultat n’a donc pas été confirmé par la FISH.

La technique de BoBs a été refaite pour cet échantillon pour voir le résultat dans une deuxième technique.

Dans cette nouvelle technique, le contrôle de qualité de l’échantillon était meilleur avec un CV à 2,20%. Il a

montré un examen normal (Figure 36).

Le caryotype après culture était féminin sans particularité.

Figure 34. Profil montrant la déviation de la bille terminale du chromosome 22 et un profil des gonosomes en faveur d’un syndrome de Klinefelter.

Figure 35. Hybridation avec les sondes Aneuvysion montrant la présence de deux signaux pour le chromosome X (en vert) et l’absence de signaux avec la sonde de l’Y (en rouge).

CEP18 CEPX CEPY

29

Figure 36. Deuxième profil obtenu pour l’échantillon 585 en le testant à nouveau dans une deuxième technique.

30

2. Faux négatif

a) Madame T, échantillon 744

Madame T est une patiente de 43 ans. Elle a bénéficié d’un diagnostic prénatal par biopsie de villosités

choriales au terme de 13SA +2j pour la réalisation d’un diagnostic moléculaire de maladie génique.

L’examen direct en BoBs a été rendu normal (Figure 37). Le caryotype a mis en évidence la présence d’une

trisomie X (Figure 38). En reprenant le résultat rétrospectivement, l’anomalie était visible et aurait dû être

diagnostiquée. Il ne s’agit donc pas d’un faux-négatif à proprement parler mais d’une erreur

d’interprétation des BoBs.

b) Triploïdies XXX

Madame D, échantillon 462 est une patiente de 32 ans. L’échographie du 1er trimestre a mis en évidence un

syndrome polymalformatif avec la présence d’un hygroma à 4.6 mm, une hernie ombilicale, un

épanchement pleural droit, une image kystique de la fosse postérieure et un placenta vasculaire très épais.

Elle a été adressée au CPDP de l’hôpital Trousseau pour la réalisation d’une biopsie de villosités choriales au

terme de 12SA +6j. L’examen direct en BoBs a montré un profil féminin normal.

Madame C, échantillon 513 est une patiente de 27 ans. L’échographie réalisée au 1er trimestre a suspecté la

présence d’un RCIU précoce avec un placenta de structure normale. La patiente a alors été adressée au

CPDP de l’hôpital Trousseau à 17SA. Le jour du prélèvement, la grossesse était arrêté. Un examen BoBs a

été réalisé et a montré un profil féminin normal.

Dans les deux cas, le caryotype après culture a montré la présence d’une triploïdie XXX homogène.

Figure 37. Profil obtenu pour l’échantillon 744 montrant une discrète déviation des billes pour le chromosome X.

Figure 38. Caryotype obtenu après culture de cellules trophoblastiques montrant un triple X dans l’ensemble des cellules examinées.

31

c) Triploïdie XXY

Madame L, échantillon 170 est une patiente âgée de 32 ans. A l’échographie du 1er trimestre, il existait un

hygroma à 4 mm avec présence d’un ventricule cérébral antérieur unique faisant évoquer une

holoprosencépahlie probable et un placenta sans particularité. Une biopsie de villosités choriales a été

réalisée au terme de 12SA pour la réalisation d’un caryotype et d’un examen direct.

L’examen en BoBs a montré la présence d’un profil atypique pour les gonosomes mais faisant évoquer un

profil masculin (Figure 39). Il n’a pas été vérifié par FISH. Le caryotype a montré la présence d’une triploïdie

69,XXY dans l’ensemble des cellules (Figure 40).

Figure 39. Profil obtenu pour l’échantillon 170 montrant un profil anormal pour les chromosomes X et Y.

Figure 40. Caryotype obtenu après culture de cellules trophoblastiques pour l’échantillon 170.

32

3. Faux négatif et faux positif : madame C, échantillon 987

Madame C est une patiente 28 ans G2P0. Elle a eu une première grossesse interrompue pour la présence

d’un tératome sacro-coccygien. Pour la grossesse actuelle, une échographie précoce réalisée à 9 SA a

montré la présence d’une grossesse intra-utérine avec quelques images de vésicules faisant suspecter une

môle. Une aspiration a été effectuée à 9SA avec réalisation d’un examen fœtopathologique et réalisation

d’un caryotype.

Un examen direct a été réalisé par une technique de BoBs et a montré une déviation significative pour la

bille terminale de l’extrémité terminale du bras court du chromosome 8 en faveur d’une délétion

terminale et une déviation significative de la bille terminale du bras court du chromosome 9 en faveur

d’une duplication 9p (Figure 41). La présence d’un dérivé 8 d’une translocation t(8;9) a été évoquée.

Le caryotype a confirmé la présence d’un dérivé d’un chromosome 8 mais les images n’étaient pas en

faveur d’un fragment 9p (Figure 42). Un examen FISH a été réalisé sur les cultures. Il a montré que le dérivé

8 était constitué uniquement du chromosome 8 et qu’il existait une délétion 8p terminale et une

duplication 8q terminale (Figure 43 et 44). En revanche les hybridations avec les sondes du chromosome 9

étaient normales.

Figure 41. Profil obtenu pour l’échantillon 987 faisant évoquer la présence d’un dérivé de translocation der(9) d’une translocation t(8;9) avec une délétion de la région 8p terminale et une duplication de la région 9p terminale.

Figure 42. Caryotype obtenu après culture de cellules trophoblastiques montrant la présence d’un dérivé 8.

33

Figure 43. Hybridation avec les sondes de peinture chromosomique wcp8 (en vert) et wcp9 (en rouge) montrant que le dérivé 8 est constitué uniquement de chromosome 8.

Figure 44. Hybridation avec les sondes télomériques 8pter (en vert) et 8qter (en rouge) montrant la présence de deux signaux rouge au niveau des régions télomériques du dérivé 8 en faveur d’une duplication 8qter.

wcp8 wcp9

8ptel 8qtel

34

V. DISCUSSION

A. Général

Les méthodes permettant un diagnostic rapide des aneuploïdies se sont largement développées depuis la

mise en place du diagnostic prénatal. Différentes méthodes sont à disposition : Aneuvysion, PCR

quantitative mais également des technologies qui permettent d’identifier d’autres anomalies

chromosomiques comme la technologie Prenatal BoBs ou Karyolite BoBs. Plusieurs laboratoires utilisent la

technique Prenatal BoBs car elle permet le diagnostic des principales aneuploïdies 13, 18, 21, X et Y ainsi

que le diagnostic de neuf syndromes microdélétionnels. Au laboratoire, nous avons considéré que la

recherche systématique de syndromes microdélétionnels en l’absence de données médicales suspectes

(malformation cardiaque, hypotonie fœtale, RCIU, etc…), et notamment dans le cadre d’un diagnostic

prénatal fait au titre du dépistage systématique de la trisomie 21, n’était pas justifiée. Nous avons donc fait

le choix d’utiliser la technique Karyolite BoBs car elle permet de faire une analyse globale rapide de

l’ensemble des chromosomes et permet de mettre en évidence à la fois des aneuploïdies mais aussi des

délétions ou des duplications terminales de plus ou moins grande taille.

B. Avantages

L’utilisation de cette technique nous a permis de réaliser un diagnostic rapide, par un examen BoBs le plus

souvent ou bien par la technique de FISH directe dans certaines situations, pour tous les prélèvements que

nous avons reçus au laboratoire pour un diagnostic prénatal, mis à part les sangs fœtaux. En effet, le temps

nécessaire à la réalisation d’une technique de BoBs, qu’il y ait quelques prélèvements ou de nombreux

prélèvements, n’est pas plus long que le temps nécessaire à la réalisation d’une FISH directe. En revanche,

le temps médical consacré au rendu des résultats est beaucoup plus court pour les techniques de BoBs.

L’interprétation des profils est plus rapide que la lecture au microscope de deux fois 50 noyaux pour la

technique de FISH directe.

Sur les 997 prélèvements inclus, les 2/3 ont eu un examen BoBs à la place d’une FISH directe. Le taux

d’échec dans notre sérié était de <1% ce qui est plus faible que dans la série rapportée précédemment avec

la technique Karyolite BoBs5. Cette différence peut s’expliquer par le type de prélèvements que nous avons

testés. En effet, la série précédente concernait des prélèvements de produits de fausses couches. Dans

notre série les échantillons arrivent au plus tard dans les 6 heures suivant le prélèvement et peut donc être

conservé dans les conditions optimales jusqu’à la réalisation de la technique. Un deuxième facteur qui peut

expliquer ce résultat est que lorsque la quantité de prélèvement paraissait insuffisante pour la réalisation

d’un examen direct la mise en culture était privilégiée pour l’obtention du caryotype.

Concernant le diagnostic des aneuploïdies autosomiques, la valeur prédictive positive dans notre série est

de 100%. En effet, la technique n’a pas été mise en défaut pour le diagnostic des aneuploïdies les plus

fréquentes 21, 18 et 13. De plus nous avons pu mettre en évidence une trisomie 16 sur deux prélèvements,

résultats qui n’auraient pas pu être détectés par la technique de FISH directe. Ceci est d’autant plus

important que dans un des cas, il n’a pas été possible d’obtenir un caryotype sur les cultures (Échantillon

44, annexe 2, p.40). La réalisation de la technique BoBs dans ce cas a vraiment été un avantage pour la

patiente car un résultat a pu être rendu. Dans le deuxième cas, le diagnostic aurait été corrigé avec le

résultat du caryotype.

L’avantage d’utiliser la technique Karyolite BoBs par rapport à la technique Prenatal BoBs est la possibilité

d’examiner les régions télomériques des chromosomes qui sont de plus ou moins grande taille selon les

chromosomes. En effet, les sondes situées sur la bille couvrant la région terminale du bras court du

chromosome 1 sont situées à 4Mb du télomère pour la plus distale et à 15.5Mb pour la plus proximale

35

tandis que sur l’extrémité terminale du bras long du chromosome 22, les trois sondes sont situées à moins

de 4Mb du télomère permettant de mettre en évidence des microdélétions terminales. C’est le cas de

l’échantillon 934 pour lequel une microduplication de la région terminale du bras long du chromosome 4 a

été identifiée et a permis de mettre en évidence une translocation cryptique t(4;18). Ce cas est

particulièrement intéressant car il a été retrouvé chez une patiente ayant eu un diagnostic prénatal pour un

risque combiné à 1/79. Si elle avait eu une FISH directe, celle-ci aurait été normale ainsi que le caryotype et

le déséquilibre chromosomique chez le fœtus serait passé inaperçu. Aucune exploration complémentaire

n’aurait été effectuée. Par ailleurs, pour la patiente, sa fille aînée ayant des difficultés peu invalidantes, il ne

lui semblait pas nécessaire de faire des explorations et le diagnostic de la translocation serait resté

méconnu. C’est donc le résultat du BoBs qui a permis de faire le diagnostic pour la grossesse actuelle et qui

a permis d’orienter le diagnostic chez la fille aînée de la patiente lors de l’enquête familiale.

Un autre avantage de l’utilisation des BoBs est la possibilité de faire un diagnostic plus rapide par rapport

au délai de rendu du caryotype. En effet, pour les cinq autres anomalies que nous avons mises en évidence,

le diagnostic aurait pu être fait sur le caryotype. Cependant, la possibilité de rendre un résultat précoce est

à prendre en compte pour les patientes. C’est particulièrement le cas pour l’échantillon 742 dont le

prélèvement a été effectué à 33SA +6j, pour lequel, la translocation chez la patiente n’était pas

parfaitement connue. Les seuls renseignements étaient la présence d’une translocation impliquant les

chromosomes 5 et 12. Il aurait été possible de réaliser une FISH directe avec les sondes des extrémités

terminales des bras courts et des bras longs des chromosomes 5 et 12 mais dans ce cas, on avait une

analyse plus globale qui donnait un aperçu des points de cassure de la translocation. Un résultat a pu être

rendu à la patiente et une interruption médicale de la grossesse a pu être proposée rapidement.

Dans le cas de l’échantillon 703, présentant un dérivé surnuméraire d’une translocation t(11;22)

maternelle, la translocation chez la patiente n’était pas connue. Dans ce cas, la méthode BoBs apporte un

avantage sur la technique de FISH car la patiente aurait été faussement rassurée.

Nous avons mis en évidence 5 anomalies de structures qui n’auraient pas pu être identifiée en FISH directe

et une anomalie qui n’aurait pas non plus été identifiée au caryotype.

C. Limites

Nous avons décidé de réaliser deux techniques par semaine, une première débutant le lundi matin avec

rendu des résultats le mardi en fin de matinée et la deuxième débutant le jeudi matin avec un rendu des

résultats le vendredi matin. Cette organisation est très appréciée par les cliniciens. En effet, dans certains

centres, il n’y a qu’une seule technique de BoBs par semaine. Cependant, dans certaines situations, le

temps de rendu du résultat risque d’être trop long en particulier en cas de menace d’accouchement

prématuré et nécessite de réaliser un examen en FISH directe. La technique de BoBs est difficilement

applicable en situation d’urgence et la FISH est donc encore souvent utilisée pour ces situations (environ

10% des prélèvements).

Nous avons réalisé une FISH directe à la place d’une technique de BoBs pour environ 1/3 des prélèvements.

Ceci est lié à différentes raisons. Tout d’abord comme nous venons de le voir, il n’est pas possible de

réaliser une technique en urgence dans le cas de MAP. Par ailleurs, dans les cas où les patientes sont

prélevées après 25SA les obstétriciens préfèrent avoir un résultat rapide au cas où la patiente entrerait en

travail suite à l’amniocentèse. Cette situation est à l’origine de la réalisation de la moitié des FISH directe

(Voir tableau 3). Ceci est un des inconvénients de notre fonctionnement. En effet, certains échantillons

n’ont pas d’examen BoBs alors qu’il serait plus intéressant de le faire. C’est le cas de l’échantillon 981 pour

lequel une FISH directe a été faite car le prélèvement avait été fait à 33SA +4j. Le caryotype a mis en

évidence un dérivé 12 d’une translocation t(1;12)(q42;p13) qui aurait pu être mise en évidence par la

36

technique de BoBs (Annexe 3, p.42). Actuellement, nous reconsidérons notre manière de faire et nous

proposons de réaliser une FISH directe uniquement en cas de MAP avérée ou de demande spécifique de la

part des obstétriciens.

Concernant l’interprétation des profils, nous avons eu quelques difficultés. En effet, nous l’avons vu, par

exemple pour les trisomies 18, les billes du bras court ne sont pas toujours déviées de manière significative.

Un autre problème que nous avons rencontré est la présence de faux positifs et de faux négatifs. Nous

avons vu que concernant la trisomie X, le résultat faux négatif était lié à l’interprétation de la technique. En

effet, rétrospectivement, l’anomalie était tout à fait identifiable. Les autres cas de faux négatifs concernent

les résultats de triploïdie. C’est une des limites majeure de la technique6. Tout comme la CGH array, la

technique de BoBs ne permet pas d’identifier les triploïdies en particulier lorsque le caryotype est 69,XXX.

Dans le cas des triploïdies 69,XXY, le profil des gonosomes évoque un profil de contamination maternelle

comme nous l’avons vu pour l’échantillon 170. Ceci nous a montré qu’il était indispensable de réaliser une

vérification en FISH des résultats faisant évoquer une contamination maternelle, dans le but de quantifier

cette contamination mais également d’éliminer une triploïdie XXY.

En revanche, nous avons eu deux cas de faux positifs (échantillon 585 et 987). Pour l’échantillon 585, les

critères de qualité de la technique étaient bon avec un CV des autosomes des références <6% et une

séparation totale de l’X > 0.6. En revanche, le CV des autosomes pour l’échantillon était à 7.27% ce qui est

supérieur aux critères du laboratoire puisque nous nous étions fixés comme limite 6%. Cependant, dans les

recommandations du fabricant la limite étant fixée à 8% nous avons tenu compte du résultat du BoBs tout

en effectuant tout de même une vérification en FISH. Les discussions avec la société Perkin Elmer n’ont pas

permis d’identifier l’origine de ce faux positif. De plus lorsque nous avons repassé l’échantillon dans une

nouvelle technique, le résultat était cette fois-ci normal. Ceci nous a amenés à retenir la limite de 6% pour

le critère de qualité du CV des autosomes comme nous l’avions fixé initialement.

Pour l’échantillon 987 en revanche, nous avons eu à la fois un faux positif et un faux négatif (mise en

évidence d’une délétion 9pter et l’absence de duplication 8qter). Lorsque nous l’avons testé à nouveau

dans une seconde technique, le résultat était normal pour la région 9pter mais la duplication 8qter n’avait

toujours pas été mise en évidence. Dans les deux cas, les critères de qualité étaient corrects avec un CV des

autosomes des témoins et des échantillons <6%. L’échantillon a été réanalysé par la société Perkin Elmer et

le résultat était celui attendu soit une duplication 8qter et une délétion 8pter alors que la technique était

de moins bonne qualité. Nous n’avons pas d’explication à cet évènement.

Le kit Karyolite BoBs analyse les régions péricentromériques et terminales de l’ensemble des chromosomes.

Il est dommage que la bille couvrant la région péricentromérique du chromosome 22 ne soit pas située sur

la région de TBX1 impliquée dans le syndrome de DiGeorge, d’autant plus qu’une telle bille serait facile à

inclure puisque ce syndrome microdélétionnel est identifiable dans le kit Prenatal BoBs. Ceci nous

permettrait de réaliser une technique de BoBs plutôt qu’une technique de FISH directe lorsque qu’une FISH

complémentaire 22q11 est demandée. La demande d’une FISH 22q11 complémentaire est l’indication la

plus fréquente des FISH complémentaire (Voir tableau 2).

D. Coût de la technique

Le coût unitaire de la technique de BoBs est de 90 euros environ ce qui est trois fois plus élevé que le coût

d’un examen en FISH directe (environ 33 euros) car il est possible de diluer les sondes de FISH directe

permettant de diminuer le coût unitaire. Cependant, cette technique permet un gain de temps de

technicienne et de médecin important, ce qui est un avantage majeur dans la période de restriction

budgétaire actuelle. Elle nous a également permis de mettre en évidence une anomalie de structure qui

n’aurait pas été identifiée ni par la FISH directe ni par le caryotype. Ce réarrangement aurait très

37

probablement été viable à terme entraînant donc la naissance d’un enfant qui aurait présenté ensuite des

difficultés dans les acquisitions et probablement un retard mental par la suite. D’un point de vue

strictement économique, sa prise en charge aurait été très coûteuse pour la société.

A l’heure actuelle cet examen est côté en BHN 1100 (cotation B049 « CGH sur bille » selon la nomenclature

de Montpellier) et n’est donc pas facturé à la patiente.

VI. CONCLUSION L’utilisation de la technique Karyolite BoBs pour le diagnostic rapide au laboratoire est une technique tout à

fait adaptée. Elle permet un diagnostic rapide des aneuploïdies mais également le diagnostic d’anomalies

de structure de plus ou moins grande taille. Il permet de proposer un résultat rapide pour toutes les

patientes. Le coût de cette technique est bien sûr plus élevé que le coût de la FISH directe mais cette

technique nous a permis d’identifier une anomalie qui n’aurait pas été détectée avec les autres techniques

de cytogénétique disponibles au laboratoire.

38

Bibliographie 1. Peter Harper. Interview André et Joelle Boué. (2005). at

<http://www.genmedhist.info/interviews/Boue%20A%20and%20J> 2. Penrose, L. S. The relative effects of paternal and maternal age in mongolism. 1933. J. Genet. 88, 9–14

(2009). 3. Klinger, K. et al. Rapid detection of chromosome aneuploidies in uncultured amniocytes by using

fluorescence in situ hybridization (FISH). Am. J. Hum. Genet. 51, 55–65 (1992). 4. Mansfield, E. S. Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase

chain reaction and small tandem repeat polymorphisms. Hum. Mol. Genet. 2, 43–50 (1993). 5. Grati, F. R. et al. Application of a new molecular technique for the genetic evaluation of products of

conception: KaryoLiteTM BoBsTM for genetic analysis of products of conception. Prenat. Diagn. 33, 32–41 (2013).

6. Paxton, C. N., Brothman, A. R. & Geiersbach, K. B. Rapid aneusomy detection in products of conception using the KaryoLiteTM BACs-on-BeadsTM assay. Prenat. Diagn. 33, 25–31 (2013).

39

Annexes Annexe 1. Protocole simplifié de la réalisation de la technique de BoBs.

40

41

Numéro Vérification FISH Caryotype Corrélation

échantillon Autosomes Gonosomes

2 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 +

7 Nl Double Y 47,XYY +

24 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 +

33 Nl XXY 47,XXY +


44 Trisomie 16 Masculin Echec Bénéfice du BoBs


55 Trisomie 18 Féminin Confirmation T18 F mos +

84 Nl Masculin 46,XY,del(2)(q31q32) Limite du BoBs

92 Trisomie 18 Féminin 47,XY,+18 +




139 Délétion 22qter Masculin Confirmation 46,XY,del(22q) Bénéfice du BoBs


170 Nl Masculin 69,XXY Limite du BoBs



208 Nl Monosomie X 45,X +



229 Nl Masculin 47,XY,+mar[6]/46,XY[24] Limite du BoBs

232 Nl Féminin Echec Bénéfice du BoBs

267 Contamination

maternelle probable

Contamination

maternelle

probable

Confirmation

contamination

maternelle

46,XY Limite du BoBs







356 Trisomie 18 XXX 48,XXX,+18 +







404 Echec Echec 46,XY Limite du BoBs

408 Echec Echec Echec Limite du BoBs et du caryotype




451 Echec Echec 46,XX Limite du BoBs


458 Nl Masculin 46,XY,t(4;10)mat Bénéfice du BoBs

462 Nl Féminin 69,XXX Limite du BoBs




513 Nl Féminin 69,XXX Limite du BoBs


553 Trisomie 22 mosaïque Féminin F mosT22 +



585 Duplication 22qter XXY XX Nl 46,XX Faux positif BoBs

599 Nl Masculin Contamination maternelle Bénéfice du BoBs

600 Echec Echec 46,XY Limite du BoBs





703 Duplication 11qter,

Duplication 22qprox

Masculin Confirmation 47,XY,+der(22)t(11;22)(q23;q11)mat Bénéfice du BoBs

Résultat BoBs

Annexe 2. Tableau montrant la corrélation entre le résultat BoBs et le caryotype avec les avantages du BoBs

et les limites.

40

42





742 Duplication 5pter, Duplication 12pter et 12p proxFéminin Confirmation 47,XX,+der(12)t(5:12)(p10;p10)mat Bénéfice du BoBs

744 Nl Féminin 47,XXX Faux négatif




785 Echec Echec 46,XX Limite du BoBs

834 Trisomie 13 masculin 47,XY,+13 +




909 Trisomie 18q Féminin Confirmation 46,XX,der(12)t(12;18)(p13.32;q12.2) Bénéfice du BoBs


934 Trisomie 4qter Féminin Confirmation 46,XX,der(18)t(4;18)(q?;p?) Bénéfice du BoBs


947 Nl Masculin Contamination maternelle Bénéfice du BoBs




978 Nl Masculin 46,XY,t(13;16)(q14;q22)mat Bénéfice du BoBs

987 Délétion 8pter,

duplication 9pter

Féminin + / Délétion

8pter, délétion

8qter et 9pter

normal

46,XX,der(8)inv(8)(p23?;q23?) Faux négatif + Faux positif

Numéro Vérification FISH Caryotype Corrélation

échantillon Autosomes Gonosomes

Résultat BoBs

Annexe 2. Suite

43

Numero Caryotype Corrélation




173 Trisomie 21 Masculin Echec Bénéfice du BoBs

182 Nl Féminin 46,XX,inv(5)(p13,2q13) +

233 Nl Masculin Echec Bénéfice du BoBs



360 Nl Masculin 45,X[9]/46,XY[15] Limite de la FISH directe





543 Nl Féminin 46,XX,ins(2 ;8)(q21 ;q21.2q24.1)dn Diagnostic sur caryotype


605 Nl Monosomie X

en mosaïque

Contamination maternelle

probable

Intérêt du caryotype



649 Délétion 6qter,

Duplication 16qter

46,XY,der(6)t(6 ;16)(q25 ;q24)mat +











981 Nl Masculin M add(12) Bénéfice du BoBs

Résultat FISH

Annexe 3. Corrélation entre la technique de FISH directe et le caryotype et le bénéfice si un examen BoBs

avait été réalisé.

44

Numero Caryotype Corrélation

37 45,XY,der(14;21)(q10;q10)pat +

67 46,XYY,der(13;14)(q10,q10)pat +

179 69,XXX Limite du BoBs

262 46,XY,t(4;10)(q23;p13)mat +

316 69,XXX Limite du BoBs

46,XY,t(4;10)(q23;p13)mat

69,XXX

Résultat BT directe

45,XY,der(14;21)(q10;q10)pat

46,XYY,der(13;14)(q10,q10)pat

69,XXX

Annexe 4. Corrélation entre la technique directe et le caryotype et les limites si une technique de BoBs

avait été réalisée à la place de la technique directe.

Health & Medicine

Technique Karyolite BoBs : bilan d’un an d’utilisation en routine pour le diagnostic prénatal direct