Présentée par: Mme LIAMANI OuafiaDoctorante en biologie

Option: biologie de la reproduction

Technique de cryodécapage« Technique des répliques »

Cryodécapage

Technique moderne de

cytologie

Etude des membranes cellulaires

l'observation avec un (MET)

• congélation ou utilisation de froid

Cryo

• élimination de la partie superficielle d’un objet

Décapage

Enlever la partie superficielle d’un objet par congélation

éviter une fixation chimique

éviter tout artefact

étudier la morphologie ou l’ultra-structure

Intérêt

Congélation Coupe ou cryofracture Décapage Ombrage

métalliqueIsolement des

répliquesObservation

au MET

ETAPES DE CRYODECAPAGE

1- Congélation

Définition:• Un processus de fixation très rapide• Action de soumettre au froid un échantillon

But:• Assure une bonne conservation de la moindre petite structure.

Méthode:• congelé dans l’azote liquide à -196°C jusqu'à

-200°C par le biais du fréon

Azote liquide

Congélation dans l’azote liquide

2- Coupe ou cryofracture

Définition:• Coupe au froid.

But:• Une légère cryodessiccation ou cryofracture décape la surface de l’échantillon

Méthode:• Lame d’acier refroidie par l’azote liquide, permet

une coupe faite de manière à obtenir une surface lisse

Détails des 2 feuillets membranaires dénudés

3-Décapage

Définition:• élimination de la partie superficielle d’un objet

But:• Augmenter le pouvoir de résolution• une étape de sublimation

Méthode:• se fait sous vide élevé (10-6 Barr).En approchant à 2 mm

environ de la surface de l’échantillon qui est à -100°C une plaque portée elle-même à une température de 126°C

La glace est éliminée de la surface par sublimation

Membrane nucléaire à nu, avec ses protéines et ses particules

Plaque chauffante à 126°C

-100°C

2mm

4- Ombrage métallique

Définition:• Transformation d'un élément transparent en

un élément opaque pour l'observation au microscope

But:• Faire ressortir tous les détails superficiels de la cellule

Méthode:• 1ère vaporisation verticale d’une mince couche de carbone, c’est

la réplique carbonée ; cette dernière est ombrée par 2ème vaporisation oblique de platine

carbone

Dépôt d’un film continu de carbone à la surface

platine

Ombrage de la surface par un film de platine

5- Isolement des répliques

•H2SO4

•HCL

Elimination de la partie organique par un acide minéral

Isolement de la réplique

Réplique carbone-métal

6- Observation au MET

Microscope électronique à transmission

Cellule végétale (Euglena gracilis )observer au MET après cryodécapage

Appareil de Golgie observer au MET après cryodécapage

Une portion de chloroplaste de chlamydomonas (algue unicellulaire) observer au MET après cryodécapage