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2. Les vecteurs de2. Les vecteurs declonageclonage

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Dfinitions : transgense et transgneDfinitions : transgense et transgne

Transgense :

p rocessus de transformation gntique

introduction de caractres nouveaux dans une cellule

absence de barrire entre les es pces

Transgne : gne

transfr un organisme laide de :

vecteurs naturels ou artificielsmoyens ph ysiques ou c h imiques

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2. Les vecteurs de clonage2. Les vecteurs de clonage

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2.1. Structure des vecteurs2.1. Structure des vecteurs

ORI : origine derplication

sites de restrictiongne de rsistance

une substancechimique

vecteur

z one de sites de restriction

une origine de rplication

utilisation de gne rsistant des substances c h imiques(ex: antibiotiques)

utilisation du gne de la B - galactosidase

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2.3. Les plasmides2.3. Les plasmides

molcule dADN circulaire double brin

3 100 kb

unit de r p lication autonome :

ORI : origine de r p licationr p lication ind pendante du gnome de la celluleh te

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2.3. Les plasmides2.3. Les plasmides

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2.3.1. Le vecteur pBR 3222.3.1. Le vecteur pBR 322

sites multi p les et uniques pour enzymes de restriction connues "polylinker " = rgion sites multi p le de clonage.

Un gne de rsistance lam p icilline (antibiotique)

Un gne de rsistance la ttracycline (antibiotique)

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2.3.1. Le vecteur pBR 3222.3.1. Le vecteur pBR 322

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2.3.2. L2.3.2. Lee Plasmide pUCPlasmide pUC

des sites multi p les et uniques des enzymes de restriction connues

Un gne de rsistance lam p icilline

Le gne lac Z qui code pour la B - galactosidase dans lo pronlactose

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a . Lopron lactosea . Lopron lactose

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b . Le gne lacZb . Le gne lacZ

Le gne Z (a pp el lacZ) gne code pour la B - galactosidase

Insertion du fragment dADN dans le p lasmide pUC :

zone du gne codant pour la B - galactosidaseinactivation du gne

Donc

pas insertion ADN = activit enzymatiqueinsertion ADN = perte de lactivit enzymatique

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b . Le gne lacZb . Le gne lacZ

V rification de la p rsence ou labsence de lactivit enzymatiquede la B - galactosidase :

com pos X - galsi cliv par la B - galactosidase = X - gal passe de lincolore au bleu

pour mtaboliser le X - gal, la cellule doit tre ex pose uninducteur : IP TG (isopropylthio- B -D-galactoside).

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b . Le gne lacZb . Le gne lacZ

Colonies bleues = clones non recombinants ( pas de fragmentdADN insr)

Colonies blanc h es = clones recombinants, insertion du fragmentdADN

Slection visuelle des bactries transformes par les p lasmidesrecombinants

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LLee Plasmide pUCPlasmide pUC

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2.3.3. Avantages et inconvnients des plasmides

Inconvnients :

faible efficacit pour la transformation des bactriesim possibilit dinsrer des larges fragments dADN

A vantages :

petite taille du vecteur

slection des p lasmides recombinants

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2.4. Les bactriophages

virus qui infectent les bactries

ADN double brin

gnome : 50 et 150 kb

les extrmits de lADN = sim p les brins sur une longueur rduite

forment des extrmits cohsives = squences cos (cohsives)

5-G AATTC-33-CTTAA G-5

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2.4.1. Le phage L

ADN double brin

gnome : 50 kb

squences cos

tte du virus

queue du virus

deux parties individualises :

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2.4.2. Multiplication du phage2.4.2. Multiplication du phage L L

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2.4.3. Avantages et inconvnients des phages

Inconvnients :

nombre de sites de restriction restreintsobligation dem paqueter lADN

le maniement des ph ages est p lus com p lexe

A vantages :

taille des fragments dADN insrs su prieure aux p lasmidestransformation des bactries par les ph ages p lus efficace que

pour les p lasmides

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22.5. Les cosmides.5. Les cosmides

vecteurs artificiels hybrides

un gne de rsistance aux antibiotiques (am p icilline)

une origine de r p lication

site cos dun ph age L

em paquet dans la tte dun virus L

infecte les bactries

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22.5.1. Les cosmides.5.1. Les cosmides

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2.5.2. Avantages et inconvnients des cosmides2.5.2. Avantages et inconvnients des cosmides

A vantages :

taille des fragments insrables peut atteindre 50 kb

transformation des bactries par les cosmides p lusefficace que pour les p lasmides

Inconvnients :

Obligation dem paqueter lADN

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2.6. Autres types de vecteurs2.6. Autres types de vecteurs

2.6.1. Les BAC

(c h romosomes artificiels de bactries)

fragments d'ADN de taille 100 350 kb.

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2.6.2. Les YAC2.6.2. Les YAC

ch romosome artificiel de levure

I nconvnient :

fragments insrs subissent parfois des rarrangements(insertions, dltions)

pas absolument re p rsentatifs de la rgion initiale introduite

analyse des grands gnomes (gnome humain)

utiliss pour insrer de lADN tranger dans les cellules eucaryotes

clonage de fragments de grande taille (jusqu' 1500kb)