Cellules souches et cellules proliférantes. Régulation de la différenciation cellulaire Master...

Cellules souches et cellules proliférantes.

Régulation de la différenciation cellulaire

Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire  29 septembre 2010 L.Mauvieux

Concept de la cellule souche

• Cellule à longue durée de vie• Capable d’auto-renouvellement (duplication sans perte des

capacités de développement)• Pouvant donner naissance à de multiples types cellulaires

(différenciation)• Dans les conditions adéquates, peuvent se différencier en

cellules originaires normalement des 3 couches embryonnaires: endoderme, mésoderme ectodermes

• Capables de Prolifération• De régénérer des tissus après blessure• De plasticité dans ces différentes options

Hierarchie des cellules souches

Epiderme

Jargon des cellules souches

Potence définit la capacité à se différencier en différents types cellulaires

Pluripotent pouvant donner naissance à tous les types cellulaires adultes Les cellules souches embryonnaires sont pluri-potentes

Multipotent pouvant se différencier en de multiples types de cellules spécialisées, mais pas toutes

les cellules souches tissulaires (adultes) sont multipotentes

Cellules souches embryonnaires:

– 1) Cellules ES• Dérivées du blastocyste en culture• Par transfert nucléaire d’une cellule somatique dans

un œuf énucléé

– 2) Cellules somatiques « reprogrammées »• « induced pluripotent stem cells » (iPS)

– TFs, Oct4, Sox2, cMyc and Klf4– Sox2 et Hox4

Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines

J0 J1 J2

J3J4J5

compactionblastocyste

Feeder de fibroblastes murins

Colonie de cellules ES

Critères pour caractériser le caractère de cellule souche

(« stemness ») • Auto-renouvellement:

– Potentiel de renouvellement illimité in vitro– Expression de facteurs de transcription

caractérisant la cellule souche (nanoG, oct4, SOX2, TERT…)

• Pluripotence in vitro:– Formation de tératomes dans la souris

imunocompétente (potentiel tumoral)– Pluripotence in vitro

Formation de Tératome

• Tumeur hétérogène composée de cellules issues des trois feuillets embryonnaires– Ectoderme (peau, poils, dents…)– Mésoderme (os, cartilage, muscle…)– Endoderme (épithélium gastro-intestinal, bronchique…)

Pluripotence des cellules ES in vitro

Cellules souches embryonnaires:

– 1) Cellules ES• Dérivées du blastocyste en culture• Par transfert nucléaire d’une cellule somatique

dans un œuf énucléé

– 2) Cellules somatiques « reprogrammées »• « induced pluripotent stem cells » (iPS)

– TFs, Oct4, Sox2, cMyc and Klf4– Sox2 et Hox4

Chez l’homme

Cellules souches « adultes »

Tissus à renouvellement rapide=cellules souches

cheveux Épithélium digestif

Moelle osseuse

Cellules souches adultes• Les cellules souches adultes sont cruciales pour le

renouvellement tissulaire• Ces cellules sont capables d’auto-renouvellement

et de différenciation• L’homéostasie d’un organisme adulte résulte de

l’équilibre entre:– l’état quiescent de ces cellules souches (pool de réserve) – et leur mise en cycle (amplification cellulaire pour le

renouvellement tissulaire)• Modèle des cellules souches hématopoïétiques

(CSH)

Modèle CSH

• Durent toute la vie…

• Hématopoïèse

• À la base des greffes de moelle allogéniques: thérapie cellulaire de loin la plus utilisée

Expérience princeps: Till et Mc Culloch, 1961

Irradiation sub-léthale1000Gy

+ Greffe de moelle (IV)

CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUESTRANSFERT ADOPTIF=>GREFFE DE MOELLE

J10: colonies de cellules hématopoïétiques clonales, multi-linéales, dans la rate (CFU-S)

CARACTERISATION DES CSH : reconstitution de l’hématopoïèse à long terme

Suda et coll, Trends in immunology Vol.26 August 2005

Traitement par le 5-fluoro-uracileAnti-métabolite incorporé dans l’ADN et l’ARN

Tri des cellules par cytomètre en flux

• Identification d’une fraction cellulaire capable de reconstituer l’hématopoïèse : contient les cellules souches

– Cellules quiescentes

– Très rares: ~1/10.000 cellules

– Indifférenciées: « lineage negatives » (Lin-)

– Capables d’effluer des colorants (Rhodamine, Hoechst)

par des transporteurs ABC: ABSG2 et MDR1

– Expriment (CD34+), CD133, c-kit

Caractéristiques des CSH• Dans la M.O , le nombre de CSH reste relativement constant en l’absence de perte de sang ou d’autres traumatismes

• L’état de quiescence corrèle avec leur caractère multipotent

• 2 modèles pour expliquer l’homéostasie de l’hématopoïèse

Modèle A:• Dans des conditions normales, ces CSH sont

quiescentes (G0 du cycle cellulaire), mais se divisent régulièrement,– pour assurer la maintenance du pool de CSH– Permet d’éviter d’acquérir des mutations conduisant à

leur transformation maligne– Division asymétrique:

• 1CSH => 1CSH + 1 cellule qui va s’engager dans la différencation

Linheng

– 1 pool de CSH

« dormantes », qui gardent

la capacité de d’activité de

cellule souche

multipotentes

– réagissant aux besoins

suscités par l’organisme

– revenant à l’état dormant

une fois les lésions

réparées

Linheng

Modèle B:

Wilson cell 2008

Population capable de reconstituer l’hématopoïèse: Différents sous types, plus ou moins en cycle

Wilson, Cell décembre 2008

-Injection de BrdU dans les souris à un instant donné-Le BrdU s’intercale dans l’ADN qui devient fluorescent-Suivi du contenu en BrdU par cytométrie en flux

Modèle B: synthèse

Linheng

Organisation de la moelle hématopoïétique

À l’interface os/moelle: Les ostéoblastes:

-fabriquent la trame osseuse

-supportent le développement des CSH:

*Un déficit ostéoblastique entraîne une

diminution importante de l’hématopoïèse (Visnjic, 2004)

*La co-transplantation de d’ostéoblastes avec les cellules souches augmente la prise de greffe (Tachman, Hematology 2000)

Cellules souches Lin- :-marquées à la fluorescéine- Injectée à une souris témoin-analyse 15h après

Localisation des cellules souches au niveau de l’endostéum, au contact des ostéoblastes=> Interactions préférentielles

Nilsson, S. K. et al. Blood 2001

Niche ostéoblastique

La niche hématopoiétique « adulte »-contacts physiques-

La niche hématopoiétique « adulte »-contacts physiques-

La niche hématopoiétique « adulte »

Ang1

La niche hématopoiétique « adulte »

La niche hématopoiétique « adulte »

La niche hématopoiétique « adulte »

CXCL12

CXCL12

SYSTEME NERVEUX SYMPATHIQUE

Noradrénaline

pleraxifor

« Synapse » ostéoblaste - CSH

Synthèse• Les CSH intègrent des signaux qui

proviennent de l’interaction avec:– les ostéoblastes, les cellules réticulaires

(mésenchymateuses)– mais aussi du micro-environnement médullaire

qui est ouvert notamment en raison de la riche vascularisation de la moelle osseuse

– Les cellules en cours de différenciation

• comment peut s’opérer la différenciation et l’expansion des cellules hématopoïétiques?

Etapes de la régulation de l’hématopoïèse

CSH indifférenciéemultipotente

QuiescenceAuto-renouvellement

Engagement

DifférenciationMaturation

Cellules hématopoïétiques différenciées

Hierarchie de l’hématopoïèse

Cultures à long termeCultures à long terme

(5 semaines)

Formation de coloniesFormation de colonies

(10-21 jours)

in vitroin vitro

in vivoin vivo

Reconstitution lympho-myéloïde.Reconstitution lympho-myéloïde.Cellules souchesCellules souches

Progéniteurs déterminésProgéniteurs déterminés

ProgéniteursProgéniteursimmaturesimmatures

MyéloïdesMyéloïdes LymphoïdesLymphoïdes

in vitroin vitro

Le système hématopoïétique

≥ (4 mois)

CD

34C

D34

++

Cellules identifiables Cellules identifiables morphologiquementmorphologiquement

99%99%

0,5 à 1%0,5 à 1%

0,01%0,01%

0,0001%0,0001%

*: Facteurs decroissance

*

*

SCID-RC

LTC-IC

CFC

Cultures à long termeCultures à long terme

(5 semaines)

Formation de coloniesFormation de colonies

(10-21 jours)

in vitroin vitro

in vivoin vivo

Reconstitution lympho-myéloïde.Reconstitution lympho-myéloïde.Cellules souchesCellules souches

Progéniteurs déterminésProgéniteurs déterminés

ProgéniteursProgéniteursimmaturesimmatures

MyéloïdesMyéloïdes LymphoïdesLymphoïdes

in vitroin vitro

Le système hématopoïétique

≥ (4 mois)

CD

34C

D34

++

Cellules identifiables Cellules identifiables morphologiquementmorphologiquement

99%99%

0,5 à 1%0,5 à 1%

0,01%0,01%

0,0001%0,0001%

*: Facteurs decroissance

*

*

SCID-RC

LTC-IC

CFC

Cultures à long termeCultures à long terme

(5 semaines)

Formation de coloniesFormation de colonies

(10-21 jours)

in vitroin vitro

in vivoin vivo

Reconstitution lympho-myéloïde.Reconstitution lympho-myéloïde.Cellules souchesCellules souches

Progéniteurs déterminésProgéniteurs déterminés

ProgéniteursProgéniteursimmaturesimmatures

MyéloïdesMyéloïdes LymphoïdesLymphoïdes

in vitroin vitro

Le système hématopoïétique

≥ (4 mois)

CD

34C

D34

++

Cellules identifiables Cellules identifiables morphologiquementmorphologiquement

99%99%

0,5 à 1%0,5 à 1%

0,01%0,01%

0,0001%0,0001%

*: Facteurs decroissance

*

*

SCID-RC

LTC-IC

CFC

Cultures à long termeCultures à long terme

(5 semaines)

Formation de coloniesFormation de colonies

(10-21 jours)

in vitroin vitro

in vivoin vivo

Reconstitution lympho-myéloïde.Reconstitution lympho-myéloïde.Cellules souchesCellules souches

Progéniteurs déterminésProgéniteurs déterminés

ProgéniteursProgéniteursimmaturesimmatures

MyéloïdesMyéloïdes LymphoïdesLymphoïdes

in vitroin vitro

Le système hématopoïétique

≥ (4 mois)

CD

34C

D34

++

Cellules identifiables Cellules identifiables morphologiquementmorphologiquement

99%99%

0,5 à 1%0,5 à 1%

0,01%0,01%

0,0001%0,0001%

*: Facteurs decroissance

*

*

SCID-RC

LTC-IC

CFC

Comment ces mécanismes se mettent-ils en place?

• Régulation simultanée:– Auto-renouvellement de la CSH– Engagement dans la différenciation– Spécification de la lignée– Homéostasie

• Mécanismes:– Machinerie transcriptionnelle (intrinsèque)– Signaux extrinsèques: cytokines, facteurs de

croissance

INDUCTION ET MISE EN ROUTE DU PROGRAMME

DE DIFFERENTIATION

microRNAs

Engagement cellulaire

Contrôle intra-cellulaire: facteurs de transcriptionContrôle extra-cellulaire: facteurs de croissance, cytokines

CSH

CLPCMP

NOTCH-1, Bmi-1 GATA-2, HOX-B4

PU-1, GATA-1

Régulation transcriptionnelle au cours des premiers stades de l’hématopoïèse.

Progéniteur myéloidecommun

Progéniteur lymphoïdecommun

Facteurs de transcription et cytokines

• PU.1: facteur de transcription myéloïde

• PU.1 réprimé par MafB

• La fixation de M-CSF induit l’expression de PU-1, sous l’influence de nombreux événements:– Intinsèques

– Épigénétiques

– externesSarrazin et al., Cell, 2009

Rôle prépondérant de certains facteurs de transcription

De la cellule souche à la cellule différenciée

Kaushansky, NEJM, 2006, 2034-45

De la cellules souche

De la cellule souche

à la cellule différenciée

Rôle prépondérant de certains facteurs de croissance

Facteurs de croissance hématopoïétiques• glycoprotéines monomères (sauf IL-5 et M-CSF, dimères)

• synthèse par un grand nombre de cellules (sauf l'érythropoïétine ou EPO, qui n'est élaborée que par le rein): Lymphocytes, fibroblastes, monocytes, cellules endothéliales, lymphocytes T et B, d' ou leur nom « cytokines »

• Redondance

• Synergies : – Nécessité de plusieurs signaux différents pour la mise en cycle des

progéniteurs

– Réponses prolifératives additives

– Effets distincts et multiples d'une cytokines sur des cibles cellulaires différentes.

• action locale ( hormone): endocrine, paracrine, autocrine.

• Agissent sur un récepteur spécifique: – Niveau d'expression des récepteurs régulé (+ ou -).

– dimérisation du récepteur

– transduction d ’un signal via la phosphorylation du récepteur et des protéines associées vers le noyau

– activation de la transcription de gènes donnés

• Facteurs de promotion et de survie cellulaire, ex:– Stem cell factor (SCF) = kit ligand:

– Viabilité des progéniteurs immatures et myéloïdes– Croissance des progéniteurs immatures myéloides

et erythroblastiques avec d’autres cytokines– Indispensable à l’erythropoièse fœtale (foie)

– FLT-3 ligand:– Croissance des progéniteurs immatures myéloides

et mégacaryocytaires

Facteurs de croissance Hématopoïétiques (1)

• Facteurs de prolifération et de différenciation, ex:– Non spécifiques de lignée:

– Interleukine -3 (IL-3) : action sur toute la myélopoïèse– Interleukine 6 sur tous les progéniteurs

– Spécifiques de lignée:– Granuleux/macrophagiques: GM-CSF, G-CSF, M-CSF– lignée éosinophile : IL-5– lignée érythroïde : érythropoïétine (Epo)– lignée méga : thrombopoïétine (Tpo)– lignée lymphocytaire :

– maturation : IL-2, IL-4,– croissance : IL-7 – différenciation plasmocytaire : IL-6

Facteurs de croissance Hématopoïétiques (2)

Kaushansky, NEJM, 2006, 2034-45

Modèle de l’hématopoïèse

De la cellules souche

De la cellule souche

à la cellule différenciée

Régulation négative de l’hématopoièse

• TGF b (Transforming Growth Factor b ): un inhibiteur de l'entrée en cycle cellulaire des progéniteurs primitifs

• TNF a (Tumour Necrosis Factor a ) agit en fait de manière différente (action inhibitrice ou stimulante) suivant les facteurs de croissance

• MIP 1a (Macrophage-Inflammatory Protein 1a ) ne limite pas son action au tissu hématopoïétique et se trouve impliqué dans de nombreux processus inflammatoires.

• Protéines SOCS (Suppressors Of Cytokine Signaling: SOCS 1-3, CIS)– La synthèse des SOCS est induite très rapidement in vivo et in vitro

(apparition de mRNA) en réponse à la stimulation des cellules cibles par les cytokines comme IL2, IL-3, IL-4, IL-6, interferon-, EPO, G-CSF, GM-CSF, Prolactine, Hormone de croissance.

Mode d’action des protéines SOCS

Synthèse de la différenciation des CSH

• CSPH médullaires qui vont se différentier vers– polynucléaires PNN ou PNE ou PNB,– Globules rouges (GR)– Mégacaryocytes (plaquettes)– Lymphocytes (B,T, NK)

• action intriquée de nombreux facteurs– Facteurs de croissance, interleukines– Molécules d’adhésion– Facteurs de transcription

• 2 modèles d’étude:– Par les gènes spécifiques de la lignée– Par les déficits

• Pathologies• Souris KO