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Developpement de methodes danalyse de lADN par
clivage dune chimere ARN/ADN et par spectrometrie
de masse MALDI-TOF
Florence Mauger
To cite this version:
Florence Mauger. Developpement de methodes danalyse de lADN par clivage dune chimereARN/ADN et par spectrometrie de masse MALDI-TOF. Genetique. Universite Pierre et MarieCurie - Paris VI, 2012. Francais. .
HAL Id: tel-00833267
https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00833267
Submitted on 12 Jun 2013
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https://hal.archives-ouvertes.frhttps://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00833267
THESE DE DOCTORAT DE LUNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
Spcialit Chimie Molculaire ED406
Prsente par
Florence Mauger
Pour obtenir le grade de Docteur de luniversit Pierre et Marie Curie
Dveloppement de mthodes danalyse de lADN
par clivage
dune chimre ARN/ADN
et par spectromtrie de masse MALDI-TOF
Soutenue le 10 Juillet 2012 devant le jury compos de :
Mme. Jeanine Tortajada Universit EVRY Val dEssonne Rapporteur
M. Codjo Hountondji Universit Pierre et Marie Curie Rapporteur
M. Christian Rolando Universit Lille 1 Examinateur
M. Germain Trugnan Universit Pierre et Marie Curie Examinateur
M. Jean-Claude Tabet Universit Pierre et Marie Curie Directeur de thse
M. Ivo Gut CNAG Barcelona co-Directeur de thse
Remerciements
2
Remerciements
Ce projet de thse prsent dans ce mmoire a t ralis au Laboratoire de Dveloppement et
de Production au sein du CEA/DSV/Institut de Gnomique/Centre National de Gnotypage. Il
a t effectu sous la direction du Professeur Jean-Claude Tabet, Professeur mrite de
lUniversit Pierre et Marie Curie et du Docteur Ivo Gut, Directeur du Centro Nacional de
Analisis Genomico Barcelona et responsable du projet READNA.
Je tiens remercier le Docteur Mark Lathrop, ancien Directeur du CNG, et les membres de la
commission de formation du CEA pour mavoir permis deffectuer cette thse dans le cadre
dune formation professionnelle. Je tiens plus particulirement remercier le Professeur Jean-
Claude Tabet et le Docteur Ivo Gut davoir accept dtre mes directeurs de thse, pour le
temps quils ont consacr mes recherches et pour leurs disponibilits.
Je remercie vivement la Professeur Jeanine Tortajada et le Professeur Codjo Hountondji
davoir accept dtre rapporteurs ainsi que le Directeur de recherche Christian Rolando et le
Professeur Germain Trugnan davoir bien voulu tre examinateurs du jury de cette thse.
Je tiens galement remercier le Docteur David Gelfang, le Docteur Keith Bauer et le
Docteur Thomas Myers, de la socit ROCHE MOLECULAR pour leur collaboration
essentielle concernant le dveloppement des ADN polymrases.
Je remercie galement Jrmy Semhoun pour llaboration du logiciel de calcul des masses,
Caroline Horgues, Steven Mcginn, Jorg Tost et Alexandre How Kit pour leur collaboration
sur le projet de lanalyse de la mthylation de lADN et Ekatherina Darii pour son aide pour
les expriences par ESI-ITMSn. Je tiens galement remercier, Cline Besse, Christian
Daviaud, Cline Lacrouts davoir eu la gentillesse et la patience de corriger mon mmoire.
Enfin, je remercie la Communaut europenne pour le financement de cette tude au sein du
projet READNA 2008-2012.
Sommaire
3
Sommaire
Remerciements 2
Sommaire 3
Abrviation 11
Introduction gnrale 12
1. Les modifications de lADN 13
1.1. LADN 13
1.2. Les modifications de lADN 15
1.2.1. Les modifications de la squence 15
1.2.2. Les modifications pigntiques 16
2. Les mthodes danalyse de lADN 17
2.1. Le squenage de premire gnration 18
2.1.1. Le squenage de Sanger 18
2.1.2. Le squenage de Maxam et Gilbert 20
2.2. Le squenage de seconde gnration 20
2.2.1. Le squenage sur phase solide 20
2.2.2. Le squenage par hybridation sur puce 21
2.2.3. Le squenage cyclique sur puce 22
2.2.4. Le squenage par microlectrophorse 23
2.2.5. Le squenage par nanopore 23
2.3. Le squenage de nouvelle gnration NGS 24
3. Les mthodes danalyse de lADN par spectromtrie de masse 25
3.1. La spectromtrie de masse ESI-IT et MALDI-TOF 25
3.1.1. La spectromtrie de masse ESI-IT 25
3.1.2. La spectromtrie de masse MALDI-TOF 31
3.2. Les mthodes danalyse de lADN 42
3.2.1. Les mthodes directes 43
3.2.2. Les mthodes indirectes 45
Sommaire
4
4. Dveloppement de mthodes danalyse de lADN par clivage dune chimre
ARN/ADN et par spectromtrie de masse MALDI-TOF 47
4.1. Le principe 47
4.1.1. La chimre ARN/ADN 48
4.1.2. Le clivage de la chimre ARN/ADN 49
4.1.3. Lanalyse par MALDI-TOF MS 50
4.2. Les mthodes 51
4.2.1. Les mthodes actuelles 51
4.2.2. Le dveloppement de nouvelles mthodes 53
Chapitre 1. Analyse de la chimre ARN/ADN par spectromtrie de masse en tandem 55
1. Introduction 56
2. Matriels et Mthodes 58
2.1. Matriels 58
2.2. Mthodes 60
2.2.1. Le clivage 60
2.2.2. Le dessalage 60
2.2.3. Lanalyse par spectromtrie de masse MALDI-TOF/TOF 60
2.2.4. Lanalyse spectromtrie de masse ESI-IT 61
2.2.5. Les ions fragments 61
3. Rsultats 62
3.1. La chimre ARN/ADN 62
3.1.1. La formation de la chimre ARN/ADN 62
3.1.2. La nomenclature des ions fragments 62
3.1.3. Le seuil de dtection des chimres ARN/ADN par MALDI-TOF/TOF 63
3.2. Lanalyse des chimres ARN/ADN de 4-mer par MALDI-TOF/TOF 65
3.2.1. Les fragmentations en mode CID des chimres avec une base B4(A) 65
3.2.2. Les fragmentations en mode CID des chimres avec une base B4(C) 69
3.2.3. Les fragmentations en mode CID des chimres avec une base B4(G) 72
3.2.4. Les fragmentations en mode CID des chimres avec une base B4(U) 74
3.2.5. Le bilan des fragmentations en mode CID 76
Sommaire
5
3.3. Les fragmentations en phase gazeuse de la chimre GCTA 79
3.3.1. Limpact de la fluence du laser 79
3.3.2. Les fragmentations en mode CID par MALDI-TOF/TOF 83
3.3.3. Les fragmentations en mode CID par ESI-ITMSn 84
3.3.4. Le bilan des fragmentations en mode CID 95
3.4. Les fragmentations en mode CID des chimres ARN/ADN suprieures 4-mer par
MALDI-TOF/TOF 97
3.4.1. Les fragmentations en mode CID des chimres ARN/ADN de 5-mer 97
3.4.2. Les fragmentations en mode CID des chimres ARN/ADN de 7-mer 102
3.4.3. Les fragmentations en mode CID des chimres ARN/ADN de 10-mer 104
4. Discussion 106
4.1. Les conditions exprimentales 106
4.1.1. La prparation de la chimre ARN/ADN 106
4.1.2. Lanalyse par MALDI-TOF/TOF 107
4.2. Les fragmentations par MALDI-TOF-TOF de la chimre ARN/ADN 109
4.2.1. La dtection des ions 109
4.2.2. Les fragmentations en mode CID 110
4.2.3. Le squenage 114
4.3. Les fragmentations en mode CID de la chimre GCTA 114
4.3.1. Lanalyse par ESI-ITMSn 115
4.3.2. Les ions multichargs 115
4.3.3. Les fragmentations par spectromtrie de masse en tandem 116
5. Conclusion 117
Chapitre 2. Multiplex microhaplotypage par clivage dune chimre ARN/ADN simple-
brin et par MALDI-TOF MS 120
1. Introduction 121
2. Matriels et Mthodes 123
2.1. Matriels 123
2.2. Mthodes 125
2.2.1. PCR 125
Sommaire
6
2.2.2. Llongation linaire par lADN polymrase G46E CS6R 126
2.2.3. Le clivage 126
2.2.4. Le dessalage 126
2.2.5. Lanalyse par spectromtrie de masse MALDI-TOF 127
3. Rsultats 127
3.1. La PCR 128
3.2. La chimre ARN/ADN simple-brin 129
3.3. Le clivage de la chimre ARN/ADN 130
3.4. Le dessalage des fragments de clivage 130
3.5. Lanalyse des spectres de masse MALDI-TOF 130
3.5.1. La matrice HCCA 131
3.5.2. Les paramtres danalyse 131
3.5.3. Les microhaplotypes 131
3.5.4. Le microhaplotype ASTW du locus HLA-DRB1-227 132
3.5.5. Les microhaplotypes HCACH du locus HLA-A-98 et MGAR du locus HLA-A-453 134
3.6. Lanalyse des individus 135
4. Discussion 137
4.1. La PCR 137
4.2. La chimre ARN/ADN simple-brin 138
4.2.1. LADN polymrase G46E CS6R 138
4.2.2. Les amorces 138
4.3. Lanalyse des microhaplotypes 139
4.3.1. Le clivage 139
4.3.2. Le dessalage 139
4.3.2. Lanalyse par MALDI-TOF MS 140
4.3.3. Les caractristiques de la mthode 140
5. Conclusion 141
Chapitre 3. Analyse de la mthylation de lADN par clivage dune chimre ARN/ADN
simple-brin et par MALDI-TOF MS 143
1. Introduction 144
Sommaire
7
2. Matriels et Mthodes 146
2.1. Matriels 146
2.2. Mthodes 148
2.2.1. La conversion au bisulfite 148
2.2.2. Les mlanges dADN 149
2.2.3. La PCR 149
2.2.4. La purification de la PCR 150
2.2.5. Llongation linaire par lADN polymrase KB17 150
2.2.6. Le clivage 151
2.2.7. Le dessalage 151
2.2.8. Lanalyse par spectromtrie de masse MALDI-TOF 151
3. Rsultats 153
3.1. Le principe de la mthode 153
3.1.1. La conversion au bisulfite 154
3.1.2. La PCR 154
3.1.3. Llongation linaire par lADN polymrase KB17 155
3.1.4. Les fragments de clivage des CpGs 157
3.1.5. Lanalyse par spectromtrie de masse MALDI-TOF 162
3.1.6. Lanalyse de la mthylation de lADN 162
3.2. Lanalyse du locus CDKN2A-msp1 163
3.2.1. Les fragments de clivage du locus 163
3.2.2. Llongation linaire ATP 166
3.2.3. Llongation linaire GTP 168
3.3. La quantification de la mthylation de lADN 169
3.3.1. La courbe dtalonnage du locus CDKN2A-msp1 170
3.3.2. La courbe dtalonnage du locus CDKN2A-msp3b 171
3.4. Lanalyse des individus 175
3.4.1. Les loci des gnes CDKN2A et RASSF1A 175
3.4.2. Lanalyse des loci des gnes CDKN2A et RASSF1A 175
Sommaire
8
3.4.3. Le pourcentage de mthylation de lADN des loci CDKN2A-msp1et msp3b 176
4. Discussion 178
4.1. La conversion au bisulfite 179
4.2. La PCR 179
4.2.1. Les amorces 179
4.2.2. Le biais de PCR 179
4.3. Lanalyse de la mthylation de lADN 181
4.3.1. Le re-squenage 181
4.3.2. Lanalyse des CpGs 182
4.3.3. La quantification de la mthylation de lADN 183
4.4. Lanalyse des individus 186
4.5. Lavantage de cette mthode 186
5. Conclusion 187
Chapitre 4. Re-squenage de lADN par clivage dune ribo-PCR et par MALDI-TOF
MS 189
1. Introduction 190
2. Matriels et Mthodes 192
2.1. Matriels 192
2.2. Mthodes 193
2.2.1. La ribo-PCR par lADN polymrase KB17 193
2.2.2. Le clivage 195
2.2.3. Le dessalage 195
2.2.4. Lanalyse par spectromtrie de masse MALDI-TOF 195
3. Rsultats 196
3.1. La ribo-PCR par lADN polymrase KB17 197
3.2. Les fragments de clivage 197
3.3. Lanalyse des spectres de masse MALDI-TOF 201
3.3.1. Lanalyse du locus NOS1 201
3.3.2. Lanalyse du locus H19 204
3.3.3. Lanalyse du duplex des loci NOS1 et H19 207
Sommaire
9
3.3.4. Lanalyse du locus SLCO1B1 208
3.4. Lanalyse des individus 210
4. Discussion 213
4.1. LADN polymrase KB17 213
4.1.1. Les proprits 213
4.1.2. La squence spcifique damplification 213
4.1.2. Le multiplexage des ribo-PCRs 214
4.2. Lanalyse par MALDI-TOF MS 215
4.2.1. Le mode linaire 215
4.2.2. Ltalonnage 215
4.2.3. Lanalyse du double-brin 216
4.2.4. La dtection des fragments de clivage 216
4.3. Les avantages de la mthode 217
5. Conclusion 218
Chapitre 5. Multiplex allle-spcifique gnotypage par clivage dune riboPAP-PCR et
par MALDI-TOF MS 220
1. Introduction 221
2. Matriels et Mthodes 223
2.1. Matriels 223
2.2. Mthodes 225
2.2.1. La riboPAP-PCR par lADN polymrase FP-1 225
2.2.2. Le clivage 226
2.2.3. Le dessalage 226
2.2.4. Lanalyse par spectromtrie de masse MALDI-TOF 226
3. Rsultats 227
3.1. Le principe de la mthode 227
3.2. La riboPAP-PCR par lADN polymrase FP-1 229
3.3. Les fragments de clivage 230
3.4. Lanalyse des spectres de masse MALDI-TOF 232
3.4.1. Lanalyse du locus NOS1 232
Sommaire
10
3.4.2. Lanalyse du locus H19 234
3.4.3. Lanalyse du duplex des loci SLCO1B1 235
3.4.4. Les flags du duplex des loci SLCO1B1 236
3.5. Lanalyse des individus 243
4. Discussion 244
4.1. La raction PAP 245
4.2. Les amorces 245
4.3. LADN polymrase FP-1 246
4.4. Les tags et les flags 247
4.5. Lavantage de la mthode 248
5. Conclusion 248
Conclusion gnrale et perspectives 250
Annexes 259
Annexe 1. SNP genotyping using alkali cleavage of RNA/DNA chimeras and MALDI-TOF
MS 260
Annexe 2. DNA sequencing by MALDI-TOF MS using alkali cleavage of RNA/DNA
chimeras 271
Annexe 3. Ribo-PCR. A facile method for the preparation of chimeric RNA/DNA applied to
DNA sequencing 283
Annexe 4. Ribonucleotide tag nucleic acid detection 297
Annexe 5. High specificity single tube multiplex genotyping using ribo-PAP PCR, tag
primers, alkali cleavage of RNA/DNA chimeras and MALDI-TOF MS 319
Rfrences bibliographiques 331
Abrviations
11
Abrviations
A : Adnine
ADN : Acide dsoxyribonuclique
ATP: Adnosine5triphosphate
ARN : Acide ribonuclique
C : Cytosine
CMe
: 5-mthylecytosine
CDKN2A :cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
CpG : dinuclotide cytosine guanine
CEPH : Centre dEtude du polymorphisme Humain
- Fondation Jean DAUSET
CID : Collision-induced dissociation
CMH : Complexe dhistocompatibilit chez
lhumain
CTP : Cytidine 5triphosphate
Da : Dalton unit de masse molculaire des
biologistes
dATP : dsoxyadnosine 5triphosphate
dCTP : dsoxycytidine 5triphosphate
dGTP : dsoxyguanosine 5triphosphate
dNTP : dsoxynucloside 5 triphosphate
dTTP : dsoxythymidine 5triphosphate
ESI : dsorption/ionisation par lectronbulisation
Flag : brin dADN complmentaire de la Tag
G : Guanine
GTP : Guanosine 5triphosphate
H : Adnine ou Cytosine ou Thymine
H19 :gne situ sur le chromome 11
HCCA : acide -cyano 4-hydroxycinnamique
HLA : Antigne des leucocytes humains
HPA : acide 3-hydroxypicolinique
IT : Trappe ionique
kV : kilovolt
M : Adnine ou Cytosine
MALDI : Matrix-assisted laser
desorption/ionization
MS : Spectromtrie de masse
MS/MS : Spectromtrie de masse en tandem
NTP : ribonucloside 5triphospahte
NOS1 :oxyde nitrique acide neuronale
PAP : Polymrisation active par
pyrophosphorolyse
Pb : paire de bases
PCR : Raction de polymrisation en chane
R : Adnine ou Guanine
RASSF1A :Rass association domain-containing
protein 1
riboPAP-PCR : PCR active par
pyrophosphorolyse de chimre ARN/ADN
ribo-PCR : PCR de chimre ARN/ADN
S : Cytosine ou Guanine
SCLO1B1: Solute carrier organic anion transporter
family member 1B1
SNP : Single nucleotide polymorphisms
T : Thymine
Tag: squence rptitive
THAP : Trihydroxyactophnone
TOF : Time of Flight : temps de vol
Tris : tris(hydroxymethyl)aminomethane
U : Uracile
UMe
: 5-mthyluracile
UNG : Uracile-N-glycosylase
UTP : Uridine 5triphosphate
W : Adnine ou Thymine
Y : Thymine ou Cytosine
Introduction gnrale
12
Introduction gnrale
Introduction gnrale
13
Introduction gnrale
En 1990, le projet du gnome humain a eu pour but le squenage du gnome entier. Il sest
achev en 2004 grce un consortium public international (Lander et al. 2001) et une
compagnie prive Celera Genomics (Venter et al. 2001). Il a permis ltude de linformation
gntique porte par lensemble du gnome humain qui contient environ 20 000 gnes.
Depuis, les projets de recherche se focalisent sur lanalyse des modifications de la squence
de lADN, notamment ltude des polymorphismes ou de la mthylation de lADN. Les
mthodes de squenage actuellement dveloppes visent au re-squenage de lADN afin
dtudier les polymorphismes pouvant servir de marqueurs pour didentification de maladies
hrditaires. Le dveloppement de nouvelles mthodes efficaces, rapides, rentables, est donc
une ncessit pour lavance de la biologie molculaire.
Les travaux raliss au cours de ce projet de thse ont pour but la mise au point de mthodes
danalyse de lADN par clivage dune chimre ARN/ADN et par spectromtrie de masse
MALDI-TOF. Ce projet rentre dans le cadre du projet europen, READNA (REvolutionary
Approaches and Devices for Nucleic Acid analysis), 2008-2012, visant dvelopper de
nouvelles mthodes danalyse de lADN.
Tout dabord, les modifications de lADN seront exposes. Puis, les principales mthodes
danalyses de lADN et celles par spectromtrie de masse MALDI-TOF seront dcrites.
Enfin, le principe de ce travail, qui est le dveloppement de mthodes danalyse des
modifications de lADN par clivage chimique dune chimre ARN/ADN et par spectromtrie
de masse MALDI-TOF sera dtaill.
1. Les modifications de lADN
1.1. LADN
LADN est une macromolcule qui est compose de nuclotides. Sa structure a t dcouverte
en 1953 par Watson et Crick (Watson et Crick. 1953). LADN gnomique humain est
constitu de 23 paires de chromosomes et contient 3,3 milliards de nuclotides.
Introduction gnrale
14
Les nuclotides sont composs dun groupement phosphate (ou acide phosphorique), dun
aldopentose (2-doxy-D-ribose pour lADN et D-ribose pour lARN) et dune base
htrocyclique azote (purine ou pyrimidine).
La molcule dADN est constitue de quatre bases. La cytosine (C), la thymine (T) (pour
lADN et luracile (U) pour lARN) drivent de la pyrimidine tandis que ladnine (A) et la
guanine (G) drivent de la purine (figure 1).
Figure 1 : Les diffrentes bases de lADN: ladnine, la guanine, la thymine (luracile pour lARN) et
la 5-mthylcytosine et la 5-hydroxymthylcytosine qui drivent de la cytosine.
De plus, chez les mammifres, la cytosine adjacente base guanine formant ainsi un
dinuclotide CpG, peut tre mthyle. La 5-mthylcytosine est considre comme tant la
cinquime base mais sa frquence dans le gnome humain nest que denviron 1%. Enfin, la
5-hydroxymthylcytosine a t rcemment dcouverte dans les neurones et les cellules
Introduction gnrale
15
souches embryonnaires de mammifres et elle est synthtise partir de la 5-mthylcytosine
par une raction doxydation catalyse par la protine TET (Kriaucionis et Heintz. 2009;
Tahiliani et al. 2009).
Les bases sont relies par la liaison entre la liaison N osidique entre le 9-N des purines ou 1-
N des pyrimidines et le 1- du sucre. Une liaison ester relie le groupement phosphate au sucre
en position 3. Les nuclotides sont lis entre eux par lintermdiaire du groupement
phosphate en position 5 du nucloside adjacent.
LADN est compos dun double-brin formant une hlice. Ces deux brins, orients dans le
sens 5 vers 3, sont relis entre eux par des liaisons hydrognes entre les bases purines dun
brin et les bases pyrimidines de lautre brin. Les bases sont complmentaires deux deux,
deux liaisons hydrognes relient ladnine et la thymine tandis que trois liaisons hydrognes
relient la cytosine et la guanine. Les deux brins sont complmentaires et antiparallles.
1.2. Les modifications de lADN
La nature, lordre de la squence des bases A, C, G, T constitue un code gntique qui
dtermine le caractre phnotypique de chaque individu. Il existe deux catgories de
modifications de lADN : des modifications de la squence et les modifications pigntiques.
1.2.1. Les modifications de la squence
Tout dabord, un SNP (Single Nucleotide Polymorphism) est une modification dun
nuclotide une position donne du gnome, comprenant en gnrale deux allles. Il
reprsente la forme la plus abondante de variations gntiques : sa frquence est suprieure
1 % dans la population et il est prsent environ toutes les 1000 pb dans le gnome humain. Il
est considr comme un marqueur idal pour tudier la diversit des populations, les maladies
et le traitement adquat administrer au patient.
Un microsatellite est une squence rptitive de 2 10 nuclotides. Un motif donn peut tre
prsent des milliers dexemplaire dans le gnome. Il est prsent dans tout le gnome et le
plus frquemment au niveau des introns et des exons du gne. La localisation des squences
tant bien conserve, le nombre de rptition constitue un marqueur gntique.
Introduction gnrale
16
Il peut y avoir galement une dltion ou insertion dun ou plusieurs nuclotides.
Enfin, les mutations dune ou plusieurs bases sont gnralement spontanes mais des facteurs
mutagnes, comme la radioactivit, lenvironnement et certains produits chimiques peuvent
les provoquer. Leurs frquences sont infrieures 1 % dans le gnome.
1.2.2. Les modifications pigntiques
1.2.2.1. La mthylation de lADN
LADN peut tre galement modifi autour de sa squence, cest une modification
pigntique. Ces modifications interviennent sur la structure de lADN et nimpliquent
aucun changement de la squence primaire. Ces mutations pigntiques sont plus frquentes
que les mutations classiques de lADN.
Dans le gnome humain, lADN est mthyl sous la forme de la 5-mthycytosine dun
dinuclotide CpG. Cette modification post-rplicative, est un transfert, par lADN
mthyltransfrase (DNMT), du mthyle de la S-adnosyl-L-mthionine (SAM) alors convertie
en S-adnosylhomocystine (SAH) sur une cytosine dun dinuclotide CpG (Smith et al. 1992;
Svedruzi 2008).
1.2.2.2. Les lots CpGs
De 60 90% des dinuclotides CpGs sont mthyls et sont localiss dans les rgions de
chromatines condenses. Ils sont par consquent inaccessibles au processus de transcription.
Cependant, des regroupements de dinuclotide CpGs denvirons 1 4 kb, sont appels lots
CpG et constituent des marqueurs pigntiques.
Les lots CpGs ont une teneur en dinuclotide CpGs de plus de 50%, une longueur suprieure
200 pb et un ratio suprieur 0,6 du nombre observ de dinuclotides CpG par rapport au
nombre de bases C et G prsentes dans le segment (Gardiner-Garden et Frommer. 1987). Ils
sont concentrs en majorit dans les rgions promotrices et celles du premier exon de la
plupart des gnes. Environ 30 000 lots CpG, se rpartissent en moyenne tous les 100 kb
recouvrant ainsi environ 1 2 % du gnome (Antequera et Bird. 1993). 75 % des sites de
Introduction gnrale
17
transcription et 88 % des promoteurs actifs sont associs des lots CpGs et pourraient tre
rguls par la mthylation de lADN.
Les rgions diffrentiellements mthyles (DMR) vont essentiellement agir sur la rgulation
de lexpression du gne. Elles peuvent se produire spontanment ou en rponse
lenvironnement et conduisent des changements des tats dactivation ou dinhibition des
gnes. Leurs tudes suscites depuis plusieurs annes un grand intrt car elles permettent
notamment ltude de maladies comme les syndromes lis la perte dempreinte parentale et
certains cancers dtiologie non identifis (Robertson 2005).
1.2.2.3. Les marqueurs pigntiques potentiels
Par ailleurs, les rgions situes proximit (environ 2 kb) des lots CpGs qui contiennent une
plus faible densit sont appels lots CpG Shore. Ils seraient en relation dans certains cancers
avec les DMR (Irizarry et al. 2009). Ces rgions prsentent une forte corrlation inverse entre
la mthylation et l'tat de l'expression des gnes. Les DMR associs ces lots CpGs Shore
peuvent distinguer diffrents types de cancers (Hansen et al. 2011).
Ltude des marqueurs pigntiques pourrait donc tre tendue ltude du mthylome
entier, plutt de se concentrer que sur ltude seule des lots CpGs. Le mthylome contient des
rgions de moins en moins denses dlots CpGs : les lots CpGs Shore (adjacents aux lots
CpGs), les lots CpGs Shelf (adjacents aux lots CpGs shore) et les lots Open-sea ou Ocean
(isols dans le gnome).
Enfin, des tudes rcentes suggrent que la 5-hydroxymthylcytosine pourrait tre galement
un marqueur pigntique (Ruzov et al. 2011) et avoir un rle biochimique en tant
qu'intermdiaire dans le procd de dmthylation de l'ADN (He et al. 2011; Maiti et Drohat
2011).
2. Les mthodes danalyse de lADN
Diffrentes mthodes de squenage de l'ADN ont t dveloppes : le squenage de
premire gnration : par la mthode de Sanger et par la mthode de Maxam et Gilbert ; le
squenage de deuxime gnration : sur phase solide, par hybridation, par spectromtrie de
Introduction gnrale
18
masse (partie 3.2), cyclique sur puce, par microlectrophorse et par nanopore et le
squenage de nouvelle gnration NGS (Next Generation Sequencing) est galement en
cours de dveloppement car ce domaine est en pleine mutation (Shendure et al. 2011).
Par ailleurs, il est difficile d'affirmer avec certitude quelle sera la mthode la plus adapte
pour une problmatique donne. Toutefois, certains paramtres sont importants pour le choix
de la mthode adquate, comme le cot, l'exactitude des donnes, la fiabilit de la mthode, la
capacit haut-dbit et la longueur des squences. Le dveloppement de protocoles robustes,
simples pour la construction de bibliothque et la cration d'outils bio-informatiques pour
l'interprtation des quantits massives de donnes sont des dfis majeurs pour lessor de
nouvelles mthodes danalyse de lADN.
2.1. Le squenage de premire gnration
Dans les annes 1970, les deux premires mthodes de squenage de lADN ont t
dveloppes indpendamment. Lapproche de Sanger est une synthse enzymatique tandis
que celle de Maxam et Gilbert est une dgradation chimique. Frederik Sanger et Walter
Gilbert ont obtenus le prix Nobel de chimie en 1980 pour cette dcouverte.
2.1.1. Le squenage de Sanger
Le squenage par didsoxy de Sanger ou squenage enzymatique (Sanger et al. 1977;
Sanger et al. 1977; Sanger 1988) implique une ADN polymrase , ADN dpendant,
synthtisante une copie complmentaire du simple-brin d'ADN partir de lextrmit 3 de
lamorce. Le principe de la mthode est illustr dans la figure 2.
http://fr.wikipedia.org/wiki/Prix_Nobel_de_chimie
Introduction gnrale
19
Figure 2 : Schma de principe du squenage didsoxy de Sanger, reproduit et modifi dApplied
Biosystems ladresse internet suivant : (http: // www3.appliedbiosystems.com/ cms/ groups/
mcb_support/ documents/ generaldocuments/ cms_041003.pdf).
Lors de llongation linaire, le dsoxynuclotide ajout est complmentaire du nuclotide du
brin d'ADN. La cration d'un pont phosphodiester entre le groupement 3-OH de l'extrmit
de l'amorce et le groupement 5-phosphate du dsoxynuclotide incorpor allonge la chane.
Les quatre dsoxyribonuclotides (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) sont ajouts, ainsi quune
faible concentration de l'un des quatre didsoxyribonuclotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou
ddTTP). Les didsoxyribonuclotides incorpors dans le brin synthtis empchent la
poursuite de llongation. La faible concentration du didsoxynuclotide par rapport au
dsoxynuclotide entrane statistiquement un mlange de fragments dADN de tailles
diffrentes se terminant tous par un didsoxynuclotide. Cette terminaison permet didentifier
la position de la base du nuclotide dans la squence dADN. Plusieurs longations sont
ralises en parallle avec les quatre didsoxynuclotides diffrents.
Ces fragments sont ensuite spars par lectrophorse sur gel de polyacrylamide ou sur
squenceur capillaire. La dtection des fragments est ralise par lintermdiaire dun
marqueur radioactif ou fluorescent. Le marqueur radioactif (isotopes 32
P, 33
P ou 35
S) est port
http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_041003.pdfhttp://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_041003.pdfhttp://fr.wikipedia.org/wiki/DNTPhttp://fr.wikipedia.org/wiki/Did%C3%A9soxyribonucl%C3%A9otidehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Did%C3%A9soxyribonucl%C3%A9otidehttp://fr.wikipedia.org/wiki/%C3%89lectrophor%C3%A8se_sur_un_gel_de_polyacrylamide
Introduction gnrale
20
par le dsoxynuclotide ou le didsoxynuclotide (Tabor et al. 1987). Le marqueur
fluorescent est fix soit sur lamorce soit sur les didsoxynuclotides.
Le squenage enzymatique a t le plus rpandu pendant de nombreuses annes et a permis
le squenage du projet du gnome humain.
2.1.2. Le squenage de Maxam et Gilbert
La mthode de Maxam et Gilbert est une mthode de dgradation chimique de lADN.
Chaque base A, C, G et T possdent des ractivits diffrentes et peuvent donc tre modifies
afin dtre clives slectivement (Maxam et Gilbert 1977). La squence du brin dADN est
dtermine laide de lassemblage de lordre de coupure des bases des fragments de clivage.
Cette mthode est constitue de 6 tapes. Un marquage radioactif par le 32
P est ralis sur les
extrmits des deux brins d'ADN. Le fragment dADN tudier est alors slectionn et les
deux brins dADN sont ensuite spars. Les bases dADN sont modifies spcifiquement et
paralllement : les bases G sont alkyles, les bases A et G sont dpurines et les bases C et T
sont hydrolyses. La pipridine permet alors de cliver le brin dADN aprs chaque base
modifie. Lanalyse des fragments de clivage est similaire celle de la mthode de Sanger.
Les fragments dADN sont spars par lectrophorse capillaire afin de reconstituer la
squence dADN.
Les inconvnients de cette mthode sont lanalyse de fragments d'ADN de moins de 250 pb et
lutilisation de ractifs chimiques toxiques.
2.2. Le squenage de seconde gnration
2.2.1. Le squenage sur phase solide
Linnovation de cette mthode est de gnrer des simple-brins dADN (Hultman et al. 1989;
Jones et al. 1991; Kaneoka et al. 1991; Zimmerman et al. 1992.) par la capture sur une phase
solide. Un des deux brins d'ADN est biotinyl via une raction de PCR pour laquelle une des
deux amorces est biotinyle. La molcule d'ADN hmi-biotinyl est alors fixe sur des billes
http://fr.wikipedia.org/wiki/Did%C3%A9soxyribonucl%C3%A9otide
Introduction gnrale
21
magntiques de streptavidine, formant un complexe spcifique avec la biotine. Les brins sont
spars par lavage des billes par une solution basique. Les brins biotinyls sont alors spars
par lintermdiaire dun aimant. Les ractions de squenage peuvent tre effectues
indpendamment : par le brin biotinyl, par le brin non biotinyl ou par les deux.
Le squenage chimique sur phase solide par capture au niveau des terminaisons
didsoxynuclotides limine les inconvnients du marquage chimique de l'amorce et des
terminaisons, les amorces fluorescentes tant couples la phase solide par capture des
terminaisons didsoxynuclotides (Ju. 1999). Aprs la raction de squenage, les fragments
d'ADN biotinyls sont capturs par les billes magntiques recouvertes de streptavidine, tandis
que les autres composants de la raction de squenage sont lavs. Seuls les brins constitus
de la terminaison didsoxynuclotide sont librs des billes magntiques et donc squencs.
Cette mthode permet dviter llongation possible de lautre brin complmentaire de lADN
par lamorce et ainsi damliorer la fiabilit des rsultats.
2.2.2. Le squenage par hybridation sur puce
Le principe du squenage par hybridation (SBH) repose sur lutilisation de puces ADN.
Elles sont constitues de multiples sondes, utilises pour dcoder la squence d'ADN. LADN
est fractionn en de multiples fragments et hybrid sur la puce laide de sondes
complmentaires. La puce dADN est ensuite analyse par la dtection des oligonuclotides
hydrids. Lanalyse par informatique des diffrentes portions de la squence dADN permet
ensuite de reconstituer la squence entire de lADN.
Le principal avantage de cette approche est le re-squenage du gnome de lindividu par la
comparaison de sa squence avec celle dune squence de rfrence. Le mme concept est
utilis par plusieurs plates-formes de gnotypage (Affymetrix et Perlegen-Pfizer) sur puce
mais seuls les polymorphismes prdfinis peuvent tre dtects alors quavec cette mthode
tous les polymorphismes sont identifis.
Labsence de recouvrements redondants de la squence pour assurer la fiabilit des analyses
contrairement dautres mthodes de squenage constitue une limitation de cette mthode. Il
peut en rsulter un taux lev de faux positif (3 %) (Patil et al. 2001).
Introduction gnrale
22
Cette mthode est trs prcise pour ltude de petits gnomes haplodes (Gresham et al. 2006)
contrairement ltude des grands gnomes diplodes du fait de leur htrognit. Une
approche en deux tapes a t dveloppe pour ltude des gnomes bactriens (Albert et al.
2005; Herring et al. 2006) : la dcouverte de lemplacement approximatif des mutations et
suivie de la cartographie plus prcise des mutations.
2.2.3. Le squenage cyclique sur puce
Les plates-formes actuelles de squenage (de 454/Roche, Illumina, Applied Biosystems / Life
Technologies, Dover, Helicos Biosciences, et Ion Torrent-Life Technologie) ne reposent pas
sur le squenage de Sanger mais sur le principe dun squenage cyclique sur puce (figure 3)
( Shendure et Ji 2008; Metzker 2009).
Figure 3 : Schma de principe du squenage cyclique sur puce, reproduit et modifi du site internet
ladresse suivante : http:/ /www.currentprotocols.com/protcol/mb0701.
Il permet de faibles cots par le dcodage bidimensionnel sur puce de millions
(potentiellement de milliards) de bases de diffrents fragments dADN. Ces fragments
dADN, de squences individuelles, peuvent tre squencs.
Le squenage est clonal car chaque fragment contient une seule espce d'ADN (une seule
molcule ou plusieurs identiques) immobilise sur la puce. Les fragments peuvent tre
disposs de faon ordonn ou alatoire. Chaque squence d'ADN comprend gnralement une
squence inconnue d'intrt corrle avec celles des adaptateurs universels. Un point
important de cette approche est de pouvoir utiliser un volume de ractif unique sur la puce et
de tout raliser en parallle grce aux fragments analyss sur une mme surface.
Introduction gnrale
23
Le squenage est cyclique car chaque cycle une tape enzymatique identifie la nature et la
position de la base de chaque squence en parallle. Lidentification seffectue par
fluorescence dun groupement fix, ou par la mesure de la libration de proton. la fin de
chaque cycle, les donnes sont acquises par un capteur CCD (Charged Coupled Device) ou
par une puce semi-conducteur agissant comme un pH-mtre (Torrent Ion). Les cycles
suivants dterminent les positions des bases. Une squence pour chaque fragment d'ADN peut
tre dtermine par l'analyse de la srie complte des donnes couvrant sa position.
Les diffrentes plates-formes du squenage cyclique sur puce reposent sur le mme principe
de base mais diffrent par la mthode utilise pour gnrer les fragments d'ADN, par la
biochimie utilise pour effectuer le squenage cyclique et par la mthode de dtection.
2.2.4. Le squenage par microlectrophorse
Le squenage classique de Sanger est ralis avec des volumes de ractifs de lordre du
microlitre. Un des objectifs de la microlectrophorse est lutilisation de la miniaturisation
dveloppe dans l'industrie des semi-conducteurs pour permettre une miniaturisation du
squenage classique didsoxy (Paegel et al. 2003). Par exemple, une nanolectrophorse sur
gel par canaux sur la surface d'une plaquette de silicium (Emrich et al. 2002) a t
dveloppe.
Lobjectif le plus important est l'intgration d'une srie dtapes de squenage lies (par
exemple, l'amplification par PCR, la purification du produit, et le squenage) dans un lab-on-
a-chip (Blazej et al. 2006; Forster et al. 2008.).
Lavantage de cette approche est lapplication du squenage classique ayant prouv sa
robustesse et son efficacit pour des squences de plus de 1000 bases. Cependant, le
squenage par microlectrophorse peut s'avrer critique pour la poursuite de la tendance
la rduction des cots.
2.2.5. Le squenage par nanopore
Une nouvelle approche de squenage, initialement propos dans les annes 1980, consiste
dans le passage dun seul brin dADN travers un nanopore (Deamer et Akeson 2000) (figure
4).
Introduction gnrale
24
Figure 4 : Image dun nanopore reproduite avec laccord dOxford Nanopore Technologies.
Un nanopore est une protine membranaire : l'-hmolysine (Kasianowicz et al. 1996), la
MspA (Mycobacterium smegmatis porin A) (Derrington et al. 2010) ou une protine
synthtique (Fologea et al. 2005). Il est modifi chimiquement par fixation covalente dune
cyclodextrine sur sa surface intrieure. Cette modification constitue un site de liaison pour les
bases de l'ADN simple-brin et permet une mesure prcise de son passage travers le
nanopore.
Deux mthodes sont en cours de dveloppement, une mthode exonuclase (Hornblower et al.
2007) et une mthode de polymrisation (Lieberman et al. 2010). Les quatre nuclotides
obstruent le nanopore de manire spcifique. La variation de la conductance travers le
nanopore peut alors tre mesure pour en dduire la squence d'ADN.
Le squenage par nanopore prsente un grand potentiel dans le squenage rapide et rentable
de mlanges dADN par lintermdiaire de prparations dchantillons relativement simple.
Cependant, le dveloppement technologique de cette mthode sera ncessaire pour garantir
l'exactitude de lanalyse de grandes squences dADN partir d'un mlange complexe
d'ADN.
2.3. Le squenage de nouvelle gnration NGS
Introduction gnrale
25
De nouvelles mthodes sont en cours de dveloppement. Il s'agit notamment du squenage
par microscopie lectronique transmission (TEM) (Thomas et al. 2008.; Tanaka et Kawai
2009) et du squenage optique (Xiao et Kwok. 2008; Zhou et al. 2008).
Dans la mthode de squenage TEM, de longs fragments d'ADN sont disposs sur les grilles
des puces ayant incorpors diffrents nuclotides contenant un nombre diffrents de protons.
Le diffrentiel de charge est dtect et analys.
Dans le squenage optique, de grands fragments d'ADN sont disposs sur des lames de verre.
Des tapes enzymatiques permettent la cration de trou de 20 50 pb dans l'ADN ou l'ADN
peut tre galement tendu en raison de son lasticit. Les trous peuvent tre combls par une
ADN polymrase et des nuclotides marqus par fluorescence qui sont ensuite analyss par
microscopie.
3. Les mthodes danalyse de lADN par spectromtrie de masse
Au cours de la dernire dcennie, la spectromtrie de masse s'est impose pour lanalyse du
domaine mergeant de la protomique mais elle est galement utilise dans le domaine de la
gnomique.
Les acides nucliques, sont des biopolymres polaires et sont analyss notamment par une
source ESI (Electrospray Ionization) ou par une source MALDI (Matrix-Assisted
Desorption/Ionisation). Ces deux techniques dionisation/dsorption permettent danalyser
des molcules de quelques dizaines de femtomoles quelques picomoles. Les
oligonuclotides sont plus difficiles analyser que les protines. Tout dabord, ils ont
tendance former des adduits cationiques avec les ions sodium ou potassium prsents dans
lchantillon, formant des liaisons ioniques avec les groupements phosphodiesters. De plus,
ils ont tendance se fragmenter facilement en perdant les bases nucliques. La stabilit des
oligonuclotides est plus importante par ionisation MALDI que par ionisation ESI. Enfin, les
oligonuclotides peuvent tre analyss en mode positif et ngatif mais, en mode ngatif, le
pouvoir rsolutif et la sensibilit sont bien meilleurs surtout par ESI.
3.1. La spectromtrie de masse ESI-IT et MALDI-TOF
3.1.1. La spectromtrie de masse ESI-IT
Introduction gnrale
26
La source ESI est gnralement couple un analyseur pige ionique (ou trappe) (IT : Ion
Trap) (figure 5).
Figure 5 : Schma de principe dun Esquire
TM ESI-ITMS
n reproduit et modifi de Bruker Daltonics
.
3.1.1.1. La source ESI
La source ESI a t dveloppe par Fenn (Yamashita et Fenn 1984; Fenn et al. 1989). Elle
permet danalyser des macromolcules telles que les polymres et les biopolymres mais
aussi des petites molcules polaires. Elle est la plus rpandue car elle est trs sensible et
quelle peut-tre couple la chromatographie liquide ou llectrophorse capillaire
permettant ainsi ltude de mlanges complexes.
3.1.1.1.1. Le principe
Lors de lionisation/dsorption par ESI, une diffrence de potentiel de 3 6 kV entre le
capillaire et la contre-lectrode, spars de 0,3 2 cm, gnre un champ lectrique. Ce champ
est appliqu, pression atmosphrique, sur une solution nbulise partir dun tube capillaire
faible dbit (1 100 L/min). Il engendre une accumulation de charges la surface du
liquide lextrmit du capillaire, produisant ainsi un brouillard (ou spray) (Yamashita et
Fenn 1984; Smith et al. 1990; Loo et al. 1989; Ikonomou et al. 1990).
Lorsque la tension lectrique est faible les gouttelettes semblent sphriques mais lorsque la
force exerce est suprieure la tension superficielle, la surface se rompt pour former un cne
de taylor et un spray de gouttelettes. Fortement charges, elles sont constitues notamment de
Introduction gnrale
27
lanalyte et de llectrolyte de la solution introduite dans le capillaire et des ions en excs. La
charge de ces ions dpend du potentiel appliqu au capillaire par rapport la contre-lectrode
(ions positifs correspond une diffrence de potentiel positif) et des proprits des
solvants.
Lvaporation du solvant de chaque gouttelette provoque leur rtrcissement et augmente leur
densit de charge jusqu leur explosion coulombienne conduisant la dsorption des ions
(Kebarle et Tang 1993). Ces ions solvats possdent un grand nombre de charges, dpendant
des sites ionisables de la molcule qui permettent les changes de protons ou la formation
dions cationiques ou anioniques.
Le flux dions produit dans llectrospray doit tre compens par un courant dlectrons au
niveau du capillaire (Kebarle et Tang 1993). Llectrospray est donc un processus
lectrochimique qui produit un courant doxydation ou de rduction lextrmit du capillaire
permettant ainsi de fixer la quantit dions forms. Le courant ionique total atteint
gnralement environ 1 A.
3.1.1.1.2. Les facteurs influenant lionisation/dsorption ESI
Llectrospray est une source dions courant constant (Van Berkel et Zhou. 1995). Le
courant est donc partag par tous les constituants de la solution engendrant ainsi une
diminution du signal de lanalyte. Par consquent, la solution doit tre dessale afin de
permettre une meilleure ionisation.
Le flux et la concentration dions doivent tre suffisants afin dassurer un courant ionique
constant. Si le flux nest pas suffisant, il faudra produire plus dions par oxydation (en mode
positif) ou par rduction (en mode ngatif). Sil est trop important, le signal diminue car le
courant est constant et il devient difficile de maintenir un bon spray dans ce cas.
Le courant d lanalyte varie linairement avec sa concentration jusqu se rapprocher de
celui du courant constant. Comme le courant reste constant, le courant de lanalyte rentre en
comptition avec celui des autres ions pour le partage de ce mme courant cause du facteur
cintique de chaque espce. Le courant des autres ions va donc dcrotre quand la
concentration de lanalyte augmente.
Introduction gnrale
28
De plus, sil y a comptition entre deux espces, celle qui est la plus hydrophobe permet une
meilleure dsorption. Il peut en rsulter une disparition dune des deux espces du spectre de
masse mais en diminuant la concentration elle pourra tre de nouveau dtectable.
Ce mme phnomne de comptition entre deux espces est observ en maintenant la
concentration mais un trs faible flux (nanospray).
3.1.1.1.3. Les ions multichargs
Lionisation/dsorption par ESI de grosses molcules possdant des sites ionisables produit
des ions multichargs (une charge pour environs 500 Da). La formation de ces ions de rapport
m/z faible permet damliorer la sensibilit et ainsi analyser des masses molculaires trs
importantes allant au-del des limites en masse (m/z avec z=5) de linstrument.
Les spectres de masse ESI de grosses molcules correspondent gnralement une
distribution de pics conscutifs caractrisant des espces molculaires multicharges par
protonation (M+zH)Z+
ou dprotonation ( M-zH)Z+
de rapport m/z. Les rapports m/z de deux
ions dune mme molcule, multicharge mais qui diffrent par un tat de charge, permettent
de dterminer la masse de la molcule. Des algorithmes permettent la dconvolution du
spectre de masse en transformant les pics des ions qui correspondent aux molcules
multicharges en formes molculaires monocharges afin den dterminer la masse
molculaire.
De plus, seuls les mlanges simples peuvent tre directement analyss cause des nombreux
ions multichargs qui se superposent et rendent le spectre de masse ininterprtable. Seuls les
instruments trs hautes rsolutions permettent de lever les ambiguts. Les mlanges plus
complexes sont analyss par couplage avec la chromatographie liquide afin de sparer les
diffrentes molcules.
3.1.1.2. Lanalyseur pige ionique
Il existe trois types danalyseur pige ionique (ou trappe) : le pige ionique classique (ou
3D), le pige ionique linaire (ou 2D) et le pige ionique quadrologarithmique transforme
de Fourrier (FT) lectrostatique (ou orbitrap).
Introduction gnrale
29
3.1.1.2.1. Le pige ionique classique
3.1.1.2.1.1. Le principe
Le pige ionique classique, 3D, est le plus ancien et le plus rpandue. Il est constitu dune
lectrode circulaire ferme aux extrmits par deux calottes sphriques (Stafford et al. 1984)
(figure 5). La superposition de tensions continue et alternative (RF) permet de crer un champ
quadripolaire trois dimensions o les ions sont pigs sur des trajectoires complexes (3 D).
Tous les ions prsents simultanment dans le pige ionique, sont ensuite jects en fonction
de leur masse par augmentation de lamplitude de la tension RF. Ljection rsonante des ions
se fait par application sur les calottes de la frquence de lion. Lamplitude du mouvement de
lion augmente donc jusqu absorber une quantit dnergie suffisante pour tre ject du
pige ionique. Lors de lenregistrement du spectre de masse, les ions sont toujours jects
une frquence rsonante qui correspond un champ particulier. Pour une faible gamme de
rapport m/z, ils sont jects au champ quadripolaire qui correspond en gnrale la moiti de
la frquence de la tension RF tandis que pour une gamme de rapport m/z plus leve, ils sont
jects au champ hexapolaire qui correspond une frquence djection plus faible.
Deux approches mathmatiques complmentaires sont proposes pour expliquer le
fonctionnement du pige ionique. Lapproche base sur la recherche des solutions de
lquation de Mathieu qui conduit aux quations suivantes (valables si =2
:
az
qz
Une autre approche mathmatique base sur les mthodes de Floquet et de Fourrier dcrit le
mouvement des ions laide dun terme e (avec =+i) pour trouver les conditions dune
trajectoire stable. Les conditions =0 et compris entre 0 et 1 ( nombre non entier pour
maintenir les ions dans le pige ionique) doivent tre remplies simultanment suivant r et z. Si
=1, cest ljection quadripolaire.
3.1.1.2.1.2. La source ESI et le pige ionique 3D
Introduction gnrale
30
Lutilisation dune source ESI et de ljection rsonante permet danalyser des ions de
rapports m/z maximum de 6000 Th pour un EsquireTM
de Bruker et dtudier les
fragmentations en phase gazeuse des ions par expriences MSn
squentielles.
Pour que les ions restent stocks dans le pige ionique, ils doivent tre ramens au centre du
pige ionique malgr les rpulsions coulombiennes au sein du nuage dions. Si les ions sont
trop loigns du centre, la rencontre de rsonance non linaire apparait et conduit ljection
non contrle des ions. Le gaz, dhlium est introduit dans le pige ionique pour engendrer de
multiples collisions avec les ions afin de les ramener au centre du pige ionique par une
relaxation cintique.
La prsence dhlium dans le pige ionique permet galement dexister un ion donn en lui
appliquant sa frquence propre au niveau des calottes. Lamplitude des ions augmentent sans
modifier leur frquence permettant ainsi daugmenter leur nergie cintique. Les ions
acquirent donc de lnergie interne afin de favoriser le processus CID (Collison Induced
Dissociation).
En les expulsant slectivement, lanalyse MS/MS dun ion de rapport m/z par processus
conscutifs choisis est ralise. Des ions prcurseurs peuvent tre slectionns. La
spectromtrie de masse en tandem est donc ralise par squences temporelles et pas dans
lespace comme pour lanalyseur temps de vol ou multiple quadriple.
3.1.1.2.2. Les autres piges ioniques
Le pige ionique linaire ou 2D est constitu de 4 barres analogues celle dun quadriple,
ferm par des lectrodes dentre et de sortie permettant de repousser les ions vers lintrieur
du quadriple afin de diminuer les rpulsions coulombiennes (Douglas et al. 2005). Il possde
les mmes caractristiques que le pige ionique classique avec quelques modifications des
tensions dentre et de sortie afin dviter les effets de champs aux limites (fringe fields).
Lorbitrap est compos dune lectrode externe en forme de tonneau qui est spare par un
espace troit en deux parties gales (Makarov. 2000). Llectrode centrale a une forme de
fuseau. Les ions sont injects dans le pige ionique au niveau dune des extrmits par un
champ quadrologarithmique. Ce champ conduit la rotation des ions autour du fuseau avec
un mouvement axial daller et retour formant ainsi une spirale. Pour une gamme de rapport
Introduction gnrale
31
m/z leve, la spirale est constitue dun grand rayon et dune faible amplitude tandis que
pour une gamme de rapport m/z faible, la spirale possde un plus faible rayon et une
amplitude plus grande. Les ions de rapport m/z faible ont donc une frquence plus grande que
ceux de rapport m/z plus levs.
Le signal est analys au niveau du signal transitoire. Le signal transitoire doit durer le plus de
temps possible afin dobtenir une meilleure rsolution. Le pouvoir rsolutif, aprs transforme
de fourrier, peut tre suprieur 100000 Rs. Ce pige ionique, peu sensible aux effets de
charge de lespace permet danalyser un grand nombre dions.
3.1.2. La spectromtrie de masse MALDI-TOF
La source MALDI est une dsorption-ionisation laser assiste par matrice (Karas et al. 1985;
Karas et al. 1987; Karas et Hillenkamp 1988; Karas et Bahr. 1990). Historiquement, elle est
principalement associe un analyseur temps de vol (TOF) car il ncessite une source
dionisation pulse.
Cette technique de dsorption et dionisation douce permet lanalyse des biomolcules
(oligonuclotides, peptides, protines et oligosaccharides) de haute masse molculaire (MDa)
(Tanaka et al. 1988). Facile mettre en uvre, elle prsente une certaine tolrance aux sels et
aux tampons utiliss en biologie molculaire. Elle est donc adapte ltude de biomolcules
comme lADN et aux mlanges.
Le spectromtrie de masse MALDI-TOF se compose: dune source MALDI produisant les
ions en phase gazeuse, dun analyseur temps de vol sparant les ions en fonction de leur
rapport m/z, dun dtecteur convertissant un signal ionique en signal lectrique et du
traitement du signal pour obtenir un spectre de masse des ions en fonction du rapport m/z
(figure 6).
Figure 6 : Schma de principe de la spectromtrie de masse MALDI-TOF.
Introduction gnrale
32
3.1.2.1. La source MALDI
Le principe de lionisation/dsorption MALDI repose sur le mlange en solution de lanalyte
et de la matrice. La matrice, molcule organique de faible masse molculaire, absorbe la
longueur donde du laser utilis. Le mlange est dpos sur une cible mtallique sur laquelle
le mlange sche afin de co-cristalliser (figure 7).
Figure 7 : Schma de principe de la source MALDI (Livadaris 2002).
La cible est ensuite place dans la source MALDI, sous vide (10-6
10-7
torr). La matrice et
lanalyte sont irradis par un court impact (environ 5 ns) dun faisceau laser impulsion afin
de les dsorber de la surface de la cible et de les jecter en phase gazeuse. Il se forme alors, en
phase gazeuse, des agrgats de molcules de matrice et danalyte appel panache au sein
duquel se forment les ions. Lanalyte est donc ionis, sous forme protone ou dprotone ou
de cations alcalins. Il se forme majoritairement des ions monochargs.
3.1.2.1.1. La matrice
La matrice est un lment essentiel car elle intervient dans le processus de formation des ions
en phase gazeuse. Elle absorbe la longueur donde du laser par excitation lectronique
laide dun rayonnement avec un laser ultraviolet dimpulsion ou par excitation vibrationnelle
par utilisation dun laser infrarouge. Le choix de la matrice approprie est fonction de
lanalyte tudier car les interactions matrice-analyte jouent un rle dans le processus
dionisation et de dsorption.
Introduction gnrale
33
Le choix de la matrice repose sur diffrents critres empiriques. Elle doit absorber la
longueur donde du laser, tre chimiquement inerte et ne doit pas sublimer dans les conditions
de vide pouss. La prparation du mlange matrice-analyte est aussi trs importante afin
dobtenir une bonne cristallisation. Lanalyte doit tre dilu dans une grande quantit de
matrice (rapport molaire de matrice/analyte de 103 10
5) afin que les interactions entre les
molcules danalyte soient rduites, facilitant ainsi leur transfert en phase gazeuse (Horneffer
et al. 2006). Elle doit possder une fonction acide permettant le transfert de proton dans
ltape dionisation.
La matrice peut jouer un rle plus ou moins important dans la fragmentation des ions
mtastables mode PSD (Post Source Decay) (Karas et al. 2000). Il existe des matrices
dites froides induisant facilement des fragmentations faible fluence du laser et des matrices
dites chaudes induisant peu de fragmentation (Karas et al. 1995; Luo et al. 2002).
Le choix de la matrice la mieux adapte lanalyte tudi est crucial. Elles peuvent tre
solides, solides ioniques ou liquides. Les matrices solides sont les plus utilises. Ce sont des
composs simples de petite taille portant un chromophore UV et qui possdent le plus souvent
des groupements aromatiques. Cependant, elles engendrent une mauvaise reproductibilit du
spectre de masse entre deux impacts du laser conscutifs d la cristallisation du dpt. Il est
donc trs important de choisir la mthode de prparation de lchantillon la mieux adapte. De
plus, les dpts ont une trs courte dure de vie. Les matrices solides ioniques sont constitues
dune matrice solide et dune base organique comme la pyridine (Armstrong et al. 2001; Li &
Gross 2004; Tholey & Heinzle 2006). Les solutions de matrice sont donc plus homognes que
celles des matrices solides, permettant ainsi une meilleure reproductibilit des spectres de
masse obtenus entre deux impacts du laser sur le mme dpt. Les matrices liquides montrent
galement une bonne reproductibilit des spectres de masse obtenus entrent deux impact de
laser conscutifs. Cependant, elles nabsorbent pas ou peu dans lultraviolet et le visible, elles
sont donc utilises avec un laser absorbant des longueurs dondes infrieures 300 nm.
Les matrices utilises pour lanalyse des oligonuclotides ne le sont gnralement pas pour
lanalyse des peptides et protines et des polymres de synthse (tableau 1).
Introduction gnrale
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Matrices Abrviations
Acide-3 hydroxypicolinique HPA
2,4,6 trihydroxyactophnone THAP
Acide anthranilique AA
Acide picolinique PA
Acide nicotinique NA
-cyano-4-hydroxycinnamoate de mthyle CNMeAcide 2,5-dihydroxybenzoque DHB
Acide quinaldique QA
3,4-diaminobenzophenone DABP
Acide 5-methoxysalicylique MSA
6-aza-2-thiothymine ATT
3-Hydroxycoumarin 3-HC
Acide -cyano-4-hydroxycinnamique HCCA
Tableau 1 : Quelques matrices utilises en MALDI-UV pour lanalyse des oligonuclotides (Wu &
McLuckey 2004; Tang et al. 1993; Krause et al. 1996; Zhang et al. 2006; Song 2003; Fu et al. 2006;
Distler & Allison 2001).
Pour lanalyse des oligonuclotides, les matrices 3-HPA et THAP sont les plus utilises. Les
acides nucliques, tant riches en groupements phosphodiester, favorisent la formation
dadduits de mtaux alcalins (Na+, K
+ par exemple) perturbant la mesure de la masse de
loligonuclotide. Pour parer ce phnomne, les solutions de matrice contiennent
gnralement un additif (par exemple le citrate dammonium) afin damliorer la dtection
des ions. Lion ammonium permet dune part, de dessaler lanalyte et dautre part, de
rgnrer les formes protones dans lagrgat.
3.1.2.1.2. La prparation de lchantillon
La prparation de lchantillon est donc une tape cruciale lors de lanalyse par MALDI-TOF
MS. Elle dpend de la nature de lanalyte, de la sensibilit requise et du type dinformation
recherch. Le choix de la matrice, des solvants et du type de dpt, doivent donc tre
optimiss pour chaque prparation dchantillon. Diffrentes mthodes de prparation existent
selon la matrice et lanalyte : la mthode de la goutte sche, la mthode de la couche mince
et la mthode du dpt en sandwich.
Lors de la mthode de la goutte sche, la matrice est solubilise le plus souvent dans
lactonitrile. La solution de matrice est ensuite mlange lchantillon et une goutte de
cette prparation est dpose sur la surface de la cible mtallique. Le mlange est soit ralis
Introduction gnrale
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au pralable (pre-mix), soit effectu sur la cible elle-mme. La cristallisation obtenue par
schage de la goutte temprature ambiante peut-tre acclre par chauffage, ventilation
force ou aspiration sous vide. Cette mthode est la plus simple mettre en uvre et fournit
de bons rsultats pour de nombreux types dchantillons, en particulier pour lanalyse des
oligonuclotides, peptides et protines. Le principal inconvnient de cette mthode de dpt
est le phnomne de sgrgation. La distribution irrgulire des cristaux la priphrie de la
goutte, effet Marangoni (Amado et al. 1997) conduit une grande variabilit des ions dtects
sur le dpt. Lacclration du schage sous vide permet de rduire leffet de sgrgation en
rduisant la taille et en augmentant lhomognit des cristaux.
Lors de la mthode de la couche mince, la matrice est solubilise dans un solvant volatil
(actone ou mthanol) (Vorm et al. 1994). Une goutte de solution de matrice est dpose sur
la cible et lvaporation rapide du solvant produit une couche mince et homogne de cristaux.
Puis, lchantillon est dpos sur cette prparation, permettant ainsi un dpt de faible
dimension. Les cristaux de matrice de la premire couche servent ainsi de site de nuclation
pour lchantillon dpos ensuite. Ce type de dpt peut tre lav afin dliminer les
contaminants (sels, dtergents..). Un solvant aqueux est ajout sur le dpt et rapidement r-
aspir laide dune pipette. Cette mthode permet dobtenir des cristaux plus petits et plus
homognes que ceux de la mthode de la goutte sche (Dai et al. 1996; Onnerfjord et al.
1999). Cette homognit permet une meilleure reproductibilit (sensibilit, rapport signal sur
bruit, rsolution) des analyses. Cependant, la couche mince de matrice et dchantillons est
rapidement dtruite aprs quelques tirs du laser. La reproductibilit des dpts dchantillons
est rendu difficile par lutilisation de solvants volatiles.
Lors de la mthode du dpt en sandwich, une premire couche de matrice est dpose selon
la mthode de la couche mince ( Li et al. 1996) . Une goutte danalyte est dpose sur la
couche mince et enfin une goutte de solution de matrice est dpose sur la deuxime couche.
Le dpt est alors sch temprature ambiante. Un lavage du dpt peut galement tre
effectu avec ce type de mthode. Lanalyte se retrouve dispos entre deux couches de
matrice.
3.1.2.1.3. Le laser
Introduction gnrale
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Le laser le plus rpandu est un laser azote mettant 337 nm. Les autres lasers les plus
courants sont les lasers Nd :YAG (1060mm, frquence triplet, 353 nm) et les lasers
infrarouges comme celui dioxyde de carbone 10,6 m ( Zenobi & Knochenmuss 1998).
Comme les matrices absorbent gnralement moins bien dans linfrarouge, la puissance du
laser IR applique lanalyte doit tre plus importante que pour celle dun laser UV. Les
spectres de masse obtenus par un laser IR ou UV sont globalement similaires. Le laser IR
montre juste une plus grande tendance former des ions multichargs et des adduits.
Limpact du laser sur lanalyte ntant que de quelques nanosecondes, le phnomne de
dsorption/ionisation dpend donc de la fluence du laser (J/cm2) (Zenobi & Knochenmuss
1998; Dreisewerd et al. 1995).
3.1.2.1.4. Les modles dionisation
Le mcanisme de formation des ions issus dune source MALDI est compos de deux tapes :
la dsorption et lionisation. Tout dabord, labsorption de photons du laser par le mlange co-
critallis de matrice et danalyte entrane la dsorption. Il se forme alors un panache par
dcompression du solide vers la phase gazeuse. Puis, les molcules danalyte et la matrice
sionisent. Lionisation MALDI reste encore un phnomne mal connu aujourdhui car il ne
peut sexpliquer par un phnomne unique. Un grand nombre de paramtres exprimentaux
influencent la formation des ions tels que la longueur donde du laser, les conditions de
prparation des chantillons (et la cible), la nature de lanalyte, le mlange de matriceanalyte
et le mode de dtection des ions (positif ou ngatif).
Trois modles dcrivent le processus MALDI. Le premier modle est celui du contrle
thermodynamique de Zenobi et Knochenmuss (Zenobi & Knochenmuss 1998; Breuker et al.
2003; Knochenmuss et al. 2000.; Knochenmuss 2002; Knochenmuss 2003; Knochenmuss &
Zenobi 2003). Lionisation est compose de deux vnements distincts : lionisation primaire
et secondaire o se droulent diffrentes ractions ion-molcule. Les processus en phase
gazeuse ont lieu un quilibre thermodynamique au sein du panache aprs un dlai de
plusieurs centaines de nanosecondes dexpansion de celui-ci.
Le second modle, est celui propos par Karas, du Lucky Survivor Ions (Karas et al. 2000;
Karas et al. 2003; Karas & Krger 2003; Krger & Karas 2002; Glckmann et al. 2001). Il est
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le premier considrer les agrgats comme des prcurseurs des ions forms en MALDI. Les
espces sont des survivants de processus de neutralisation par capture dlectrons.
Le troisime modle, est celui propos par le groupe Tabet, des espces agrgats
prcurseurs, proche de celui de Karas mais qui prsente une analogie avec les processus
dionisation ESI (Fournier et al. 2002; Fournier et al. 2003; Livadaris et al. 2000). Ce modle
considre des ractions de dsolvatation par perte de matrice neutre ou charge.
Lensemble de ces modles, surtout les deux derniers, impliquent un processus de production
dagrgats qui dsorbent de la surface au moins pendant les premires 6 nanosecondes de la
fluence du laser. La taille de ses agrgats est variable mais elle peut grossir ou se former dans
le panache aprs limpact laser. Les ions issus de ces agrgats apparaissent donc des temps
et des endroits diffrents de la source. Il en rsulte une perte du pouvoir rsolutif de
linstrument. Les ions nont pas exactement la mme nergie cintique (dpend de leur
position dans la source) et peuvent tre dcals dans le temps car ils sont mis des temps
diffrents partir de la surface. Lnergie interne des ions ainsi libre dpend de la taille des
agrgats. Plus la taille des agrgats est grande plus lnergie sera relaxe. Si cette nergie
interne est suffisante, elle peut tre la cause de fragmentation. Comme il sagit de distribution
de lnergie des ions, les ions riches en nergie vont conduire des fragmentations promptes
dans la source tandis que les ions de plus faible nergie se dcomposent dans la rgion de
libre champ du tube de vol.
3.1.2.2. Lanalyseur temps de vol
La source MALDI est le plus gnralement couple un analyseur temps de vol. Cependant,
elle peut tre galement couple un pige ionique (Jonscher & Yates 1997), un analyseur
rsonnance ionique cyclotronique transforme de Fourier ( Li et al. 1994) ou un analyseur
secteur magntique (Bordoli et al. 1994). Il existe aussi des instruments hybrides :
quadriple/TOF, pige ionique/TOF ou TOF/TOF.
Le principe de lanalyseur temps de vol (TOF Time-of-Flight) a t dcrit par Stephens en
1946 et largement tudi par la suite par Cotter (Stephens 1946; Cotter 1989; Cotter 1992;
Cotter 1999).
Lanalyseur temps de vol mesure la dure de transfert des ions aprs le tir du laser pour
arriver au dtecteur au travers de la rgion libre de champ. Le rapport m/z est donc
Introduction gnrale
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directement dduit de la dure de vol de lion. Lutilisation dune impulsion laser permet
lmission dions trs localiss dans lespace et le temps. Le couplage du MALDI avec
lanalyseur de temps de vol est donc ida
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