DIAGNOSTIC D'UNE INFECTION BACTERIENNE. Généralités DIAGNOSTIC DIRECT : mise en évidence...

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DIAGNOSTIC D'UNE INFECTION BACTERIENNE

Généralités

DIAGNOSTIC DIRECT : mise en évidence de la bactérie elle-

même, donc finalement de sa culture ou isolement qui permettra

l'identification ultérieure ainsi que de préciser sa sensibilité aux

antibiotiques (antibiogramme).

DIAGNOSTIC INDIRECT : mis en évidence de la réponse de

l'organisme à l'infection par la présence d'anticorps spécifiques, le

plus souvent sériques ou plus rarement par une réponse

d’hypersensibilité, dite allergique.

Examen direct : Demande

Important: Identification du patient par son nom, son prénom, sa date de naissance...

Il existe une procédure standard de recherche de cellules et de germes, d'où l'appellation suivante : "Examen cytobactériologique des urines ou ECBU".

Le clinicien ne devra jamais oublier d'indiquer toute demande ou recherche particulière, en raison de l'utilisation de milieux spéciaux.

Examen direct : Examen macroscopique

Toute infection bactérienne s'accompagne, outre la présence de bactéries, de signes biologiques liés à l'inflammation avec l'éventuelle présence de leucocytes.

Ces éléments peuvent entrainer au delà d'un seuil, une modification visuelle, clairement perceptible à l'oeil nu, qui signe une anomalie patente. Divers éléments sont alors obtenus comme le montrent les exemples suivants: Trouble, hématurique, coloration

anormale, odeur et consistance.

Examen direct : Examen microscopique, état frais

Etat frais: une préparation est obtenue avec le

dépôt d'une goutte entre lame et lamelle, puis on observe au microscope:

Présence éventuelle de bactéries (coque, diplocoque, chainette, coccobacille, bacille...),

le type de mobilité.

Evaluation des cellules avec une appréciation semi-quantitative (rares, peu nombreux, nombreux, très nombreux...) ou mieux quantitative, exprimée par nombre d'éléments / mm3 ou ml.

Examen direct : Examen microscopique, après coloration

Coloration de Gram permet de distinguer les bactéries colorées en violet (G+) de celles en rose (G-).

Examen direct : premières conclusions

Les éléments récoltés de l'examen macroscopique et surtout microscopique fournissent souvent des arguments diagnostiques de très forte présomption.

La culture ou l'isolement de l'agent causal sera, cependant, essentielle. Elle permettra l'identification ultérieure mais aussi de préciser sa sensibilité aux antibiotiques (Antibiogramme).

Le diagnostic indirect sera quelquefois le seul recours diagnostique possible dans quelques maladies comme la syphilis.

Culture - Isolement

Divers milieux sont utilisés qui doivent satisfaire les besoins nutritifs et énergétiques des bactéries à cultiver. En pratique, sont utilisés

plusieurs milieux solides (gélosés) avec une technique particulière d'ensemencement (isolement orthogonal ou en cadran) permettant l'isolement de clones bactériens sous la forme de colonies (de l'ordre de 106 bactéries).

Culture: Exemples de milieux solides coulés en boîte de pétri selon le produit pathologique et la demande

Pus, liquides de ponction : milieux enrichis au sang, milieu sélectif (Chapman, ou sur demande: Loewenstein-Jensen)

Expectoration : milieux enrichis au sang (frais, cuit), milieu sélectif (Chapman; Drigalski ou sur demande: Lowenstein-Jensen)

Urines : milieu sélectif (Drigalski), milieu polyvalent pour bactéries G+ et G- .

Selles (coproculture): milieux sélectifs (Drigalski et SS pour entérobactéries telles Salmonella et Shigella,

Culture: Exemples de milieux liquides

L'usage de milieux liquides est limité en raison de l'absence possible d'isolement.

Sang, pus, liquides de ponction : milieux enrichis (flacons pour hémoculture,.....

Selles (coproculture): milieu sélectif (Muller-Kauffman).

Culture : Incubation

Après ensemencement, mise en incubation dans une étuve ou une chambre chaude à 37°C: en atmosphère ambiante

(culture aérobie),

en l'absence d'oxygène (culture anaérobie.

Culture : délai d’incubation

De très nombreuses espèces bactériennes cultivent après 18 à 24 H d'incubation à 37°C.

D'autres espèces ont des délais d'incubation plus longs telles Mycobacterium tuberculosis (temps moyen d'isolement de l'ordre de 21 jours)

Les cultures sont examinées en notant la quantité de colonies obtenues de manière : Semi-quantitative (rares, peu nombreuses, nombreuses, très nombreuses)

pour les liquides de ponction. Quantitative (104, 105, 106 ..../ml) pour les prélèvements urinaires et

pulmonaires. Autres éléments pris en compte sont :

Culture en aérobiose et/ou en anérobiose. Aspect des colonies: la taille, la bordure et la coloration Présence d'une

hémolyse (alpha, béta).

Culture : exemple d’isolementPus sur une gélose au sang frais

Culture : Identification - Antibiogramme

L'identification et l'antibiogramme de la majorité des bactéries habituelles est alors précisé dans un délai de 18-24 h. A l'aide de tests d'orientation rapide : oxydase, catalase, coagulase... Par ensemencement d'une galerie biochimique adaptée :

Identification de Escherichia coli et Proteus mirabilis par un ensemble de réactions du métabolisme intermédiaire.

Quelquefois cette procédure est insuffisante pour l'identification d'une

bactérie

Il convient de faire appel : soit à des modalités classiques de recherche d'autres

caractères bactériens tels la croissance sur certains milieux pour l'identification des sources de carbone permettant la croissance, le type respiratoire, le type fermentaire, le type antigénique…

soit à des modalités modernes telles l'amplification génique de certains gènes ou encore le séquencage d'autres (ARNr 16S).

Les autres moyens diagnostiques

Produits bactériens

Recherche d'antigène soluble

Exemple d'une pneumopathie à Legionella pneumophila.

Le test immunochromatographique aide au diagnostic présomptif des infections à Legionella en parallèle avec la culture ou d'autres tests. 

Les avantages de ce test sont : précocité (dès le début des signes), simplicité (sur urine), rapidité (en 30 minutes), diagnostic tardif (> 2 mois après les signes cliniques), même après un traitement antibiotique adapté, Donc bonne valeur prédictive mais ce test ne détecte pas les autres sérogroupes de L. pneumophila

Méthode moléculaire

Le principe en est simple puisqu'il consiste à amplifier un gène entier ou non avec des amorces spécifiques ou encore séquencé et comparé avec ceux déposés dans des banques.

L'intérêt de ces diverses méthodes se résume: Gain de sensibilité (X 2 par rapport aux méthodes

classiques) pour la recherche notamment des Chlamydia génitaux.

Simplicité et la rapidité d'exécution.

Un appareil de PCR et la révêlation UV d'un produit amplifié après électrophorèse sur gel.

Biologie moléculaire : PCR = "Polymerase chain reaction" ou l'amplification génique

La PCR est la technique la plus utilisée pour la détection (amplification) de l’ADN et de l’ARN.

A partir d’une simple copie d’une séquence particulière d’acides nucléiques, cette séquence peut être spécifiquement amplifiée et détectée.

Couramment utilisée pour le diagnostic à partir du produit pathologique de germes de culture difficile, voire impossible, tel Chlamydia trachomatis.

1. Lyse des bactéries

2. Fixation de l ’ADN sur des billes de silice

3. Lavages

4. Elution de l ’ADN par de l ’eau ou du tampon

EXTRACTION DE L’ADN BACTERIEN

EXTRACTION AUTOMATISEE SUR MAGNAPURE

EXTRACTION DE L ’ADN BACTERIEN

R = reporter et Q = quencher

Dénaturation de l’ADN à 95 °CLa sonde se fixe vers 68-72 °CLes amorces se fixent vers 60 °C

La Taq ajoute des nucléotides etdétruit la sonde. Le reporter seretrouve dans le milieu et émetune fluorescence qui est détectée.

DETECTION DE L’ADN AVEC DES SONDES D’HYDROLYSE TAQMAN

AMPLIFICATION PAR PCR

Marqueur Marqueur depoids moléculaire

Témoinnégatif

Témoinpositif

Echantillons

Biologie moléculaire : Séquençage

ADN: Séquence de 4 nucléotides Purines: Adénine (A),

Guanine (G) Pyrimidines: Cytosine (C ),

Thymine (T)

Cellule

Noyau Chromosome

ADN

Matériel génétique

Un chromosome est comme une pelote de lainedont le fil est l’ADN

Cellule

Noyau Chromosome

ADN

L’information génétique est stockée dans les chromosomes

Cellule

Noyau Chromosome

ADN

AT G

C TA AT

Un chromosome est comme une pelote de lainedont le fil est l’ADN

Cellule

Noyau Chromosome

ADN L’ADN est une chaîne composée de 4 « molécules » différentes

symbolisées par les lettres A T G C

AT G

C TA AT

AT G

C TA AT

Cellule

Noyau Chromosome

ADN

tgctgccatctacatttttgggactcgggaattatgtgagtaccgaaactacttagcttatggtaggtgtaccacacgcacagggaaagaattgcgtttatgtgggacagtgaaaacaatcgcaaaaaagcaatggaaagggctttgagagtaatttatcttctgacatatgcaatatggcaacttctaaatggtgagagggagtctctctaaagcaatcatttgaagattggttggacaaacaatgggaaagtcattgtcttagcagaattaagtcatactttttttttttttttttttttgctaactctagaagcttttctgttatctctgtagctcagacgaaaatgcattctcaccagatgactgtttttggttaatcgatctgaatgcgctttgtgtggactgtcgaatttcaaagatttaccgtatgaccaagagcacctgatgctacaagtataaataggggaacaaatgctttctgttcttcctcggtaaggaggtagaggtggaggcggagccggatgtcagaggtcctgaaatagtcacctgggggaaaatgatccgcctgctgttgaagcccccttctcattccgatcgcttttggccttgatgatttgaaaataagtcctgttgcaccaggtaagtggacccaggtgagactctgtgatttctgcccataccctcatgtaggtgaccaatgtgactagctgtcctgtgggggaaatatctccccagccattctgacacccacaggctggacacctgcattccctagatctgcagaatctcagggagaaggggcattggagaggggatcgtttcttaagccctttgctctctccctggagaccggtgttttcttctcttgttggaggtttcagagactggggctccacaattgtcctgtcaatcctgaaggaggtcagatcctggccaggaaatctctgagtcctccaggaagtcctgagaagcagtggccac

3 milliards de « caractères »…

CA

T GC TA A

T

tgctgccatctacatttttgggactcgggaattatgtgagtaccgaaactacttagcttatggtaggtgtaccacacgcacagggaaagaattgcgtttatgtgggacagtgaaaacaatcgcaaaaaagcaatggaaagggctttgagagtaatttatcttctgacatatgcaatatggcaacttctaaatggtgagagggagtctctctaaagcaatcatttgaagattggttggacaaacaatgggaaagtcattgtcttagcagaattaagtcatactttttttttttttttttttttgctaactctagaagcttttctgttatctctgtagctcagacgaaaatgcattctcaccagatgactgtttttggttaatcgatctgaatgcgctttgtgtggactgtcgaatttcaaagatttaccgtatgaccaagagcacctgatgctacaagtataaataggggaacaaatgctttctgttcttcctcggtaaggaggtagaggtggaggcggagccggatgtcagaggtcctgaaatagtcacctgggggaaaatgatccgcctgctgttgaagcccccttctcattccgatcgcttttggccttgatgatttgaaaataagtcctgttgcaccaggtaagtggacccaggtgagactctgtgatttctgcccataccctcatgtaggtgaccaatgtgactagctgtcctgtgggggaaatatctccccagccattctgacacccacaggctggacacctgcattccctagatctgcagaatctcagggagaaggggcattggagaggggatcgtttcttaagccctttgctctctccctggagaccggtgttttcttctcttgttggaggtttcagagactggggctccacaattgtcctgtcaatcctgaaggaggtcagatcctggccaggaaatctctgagtcctccaggaagtcctgagaagcagtggccac

Chez l’homme, L’information génétique est formée parun texte de 3 milliards de caractères

unique pour chaque individu:

« le génome humain »

une séquence d’ADN…

Cellule

Noyau Chromosome

ADN Un gène

mRNA virtuel

Traduction en ‘protéine’

Séquençage de l’ADN

Définition : Technique permettant de déterminer la séquence (ordre

des nucléotides) d’une molécule d’ADN.

Séquençage selon Sanger

Polymérisation de l’ADN

5’ATGGCTATGCCGAGACCATATTACGACCAG 3’

3’TACCGATACGGCTCTGGTATAATGCTGGTC 5’

Matrice

A G T C C G A C G

Polymérase

Amorce

Nucléotides (dNTP)

Didésoxyribo-nucléotides

Désoxyribo-nt Didésoxyribo-nt

1’

2’3’

4’

5’

Séquençage selon Sanger

Réaction de séquençage (ddGTP)

5’ATGGCTATGCCGAG

3’TACCGATACGGCTCTGGTATAATGCTGGTC 5’

Matrice

A G T C G C A C GPolymérase

Amorce

dNTP + ddGTP

Séquençage selon Sanger

Réaction de séquençage (ddGTP)

5’ATGGCTATGCCGAG3’TACCGATACGGCTCTGGTATA 5’

5’ATGGCTATGCCG3’TACCGATACGGCTCTGGTATA 5’

5’ATGGCTATG3’TACCGATACGGCTCTGGTATA 5’

Gel d’Agarose

Séquençage selon Sanger

Séparation des produits

5’ATGGCTATGCCGAG5’ATGGCTATGCCG5’ATGGCTATG

Electrode -

Electrode +

Migration

Electrophorèse

Séquençage selon Sanger

Gel d’Agarose

Migration

Electrode -

Electrode +

ddA ddG ddC ddT

AGGCTATCTGAC

5’3’

Ordinateur

Séquençage automatique

Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

Liaison de l’amorce avec l’ADN à séquencer.

La fixation des ddNTP (désoxyNucléotide TriPhosphate) aux brins d’ADN va créer des brins de différentes tailles.

Les brins vont migrer sur un gel d’électrophorèse selon leur taille : le plus petit migre le plus vite.

Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

Automatisation de la méthode : Ajout sur les ddNTP de fluorochrome de différentes

couleurs. 1 seul tube regroupant les ddNTP. Lecture par un laser des fragments qui migrent sur le gel. Stockage des données dans la mémoire de l’ordinateur.

Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

Diagnostic indirect ou sérologique Le principe se base sur les conséquences induites chez l'hôte à

savoir la production d'anticorps. La réaction immunitaire ne se développe qu'à partir d'un délai, de

l'ordre de 8 à 10 jours. Techniques : Les anticorps sont recherchés, le plus souvent, dans

le sang circulant après prise de sang, de l'ordre de 5 à 10 ml sur tube sec sans anti-coagulant.

Il existe diverses techniques pour déceler la présence d'anticorps: Réaction d'agglutination. Recherche d'anticorps par ELISA. Recherche d'anticorps par immunofluorescence. Recherche d'anticorps par une technique de révêlation

utilisant les globules rouges

Une protéine: comment c’est fabriqué ?

Noyau de la cellule=

Bibliothèque

Chromosomes (ADN)=

Livres de recettes(23 x 2 chez l’homme)

Une cellule

Noyau = Bibliothèque

1 recette pour 1 protéine =

1 gène

Chromosomes (ADN) =

Livres de recettes

Une cellule

Noyau = Bibliothèque

Chromosomes (ADN)= Livres

1 gène = 1 recette

Photocopie de la recette (ARN)

Une cellule

Noyau

Chromosomes (ADN)

1 gène = 1 recette

Photocopie de la recette (ARN)

Une cellule

NoyauChromosomes (ADN)

1 gène

Photocopie (ARN)

Machine à fabriquer les protéines (ribosomes)

Une cellule

Photocopie (ARN)

Machine à fabriquer les protéines

Une cellule

Photocopie de la recette

Machine à fabriquer les protéines

Une cellule

transcription traduction

Gènes: parties codantes de l’ADN

Un gène est formé d’introns et d’exons

Transcription et traduction

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