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DIAGNOSTIC D'UNE INFECTION BACTERIENNE
Généralités
DIAGNOSTIC DIRECT : mise en évidence de la bactérie elle-
même, donc finalement de sa culture ou isolement qui permettra
l'identification ultérieure ainsi que de préciser sa sensibilité aux
antibiotiques (antibiogramme).
DIAGNOSTIC INDIRECT : mis en évidence de la réponse de
l'organisme à l'infection par la présence d'anticorps spécifiques, le
plus souvent sériques ou plus rarement par une réponse
d’hypersensibilité, dite allergique.
Examen direct : Demande
Important: Identification du patient par son nom, son prénom, sa date de naissance...
Il existe une procédure standard de recherche de cellules et de germes, d'où l'appellation suivante : "Examen cytobactériologique des urines ou ECBU".
Le clinicien ne devra jamais oublier d'indiquer toute demande ou recherche particulière, en raison de l'utilisation de milieux spéciaux.
Examen direct : Examen macroscopique
Toute infection bactérienne s'accompagne, outre la présence de bactéries, de signes biologiques liés à l'inflammation avec l'éventuelle présence de leucocytes.
Ces éléments peuvent entrainer au delà d'un seuil, une modification visuelle, clairement perceptible à l'oeil nu, qui signe une anomalie patente. Divers éléments sont alors obtenus comme le montrent les exemples suivants: Trouble, hématurique, coloration
anormale, odeur et consistance.
Examen direct : Examen microscopique, état frais
Etat frais: une préparation est obtenue avec le
dépôt d'une goutte entre lame et lamelle, puis on observe au microscope:
Présence éventuelle de bactéries (coque, diplocoque, chainette, coccobacille, bacille...),
le type de mobilité.
Evaluation des cellules avec une appréciation semi-quantitative (rares, peu nombreux, nombreux, très nombreux...) ou mieux quantitative, exprimée par nombre d'éléments / mm3 ou ml.
Examen direct : Examen microscopique, après coloration
Coloration de Gram permet de distinguer les bactéries colorées en violet (G+) de celles en rose (G-).
Examen direct : premières conclusions
Les éléments récoltés de l'examen macroscopique et surtout microscopique fournissent souvent des arguments diagnostiques de très forte présomption.
La culture ou l'isolement de l'agent causal sera, cependant, essentielle. Elle permettra l'identification ultérieure mais aussi de préciser sa sensibilité aux antibiotiques (Antibiogramme).
Le diagnostic indirect sera quelquefois le seul recours diagnostique possible dans quelques maladies comme la syphilis.
Culture - Isolement
Divers milieux sont utilisés qui doivent satisfaire les besoins nutritifs et énergétiques des bactéries à cultiver. En pratique, sont utilisés
plusieurs milieux solides (gélosés) avec une technique particulière d'ensemencement (isolement orthogonal ou en cadran) permettant l'isolement de clones bactériens sous la forme de colonies (de l'ordre de 106 bactéries).
Culture: Exemples de milieux solides coulés en boîte de pétri selon le produit pathologique et la demande
Pus, liquides de ponction : milieux enrichis au sang, milieu sélectif (Chapman, ou sur demande: Loewenstein-Jensen)
Expectoration : milieux enrichis au sang (frais, cuit), milieu sélectif (Chapman; Drigalski ou sur demande: Lowenstein-Jensen)
Urines : milieu sélectif (Drigalski), milieu polyvalent pour bactéries G+ et G- .
Selles (coproculture): milieux sélectifs (Drigalski et SS pour entérobactéries telles Salmonella et Shigella,
Culture: Exemples de milieux liquides
L'usage de milieux liquides est limité en raison de l'absence possible d'isolement.
Sang, pus, liquides de ponction : milieux enrichis (flacons pour hémoculture,.....
Selles (coproculture): milieu sélectif (Muller-Kauffman).
Culture : Incubation
Après ensemencement, mise en incubation dans une étuve ou une chambre chaude à 37°C: en atmosphère ambiante
(culture aérobie),
en l'absence d'oxygène (culture anaérobie.
Culture : délai d’incubation
De très nombreuses espèces bactériennes cultivent après 18 à 24 H d'incubation à 37°C.
D'autres espèces ont des délais d'incubation plus longs telles Mycobacterium tuberculosis (temps moyen d'isolement de l'ordre de 21 jours)
Les cultures sont examinées en notant la quantité de colonies obtenues de manière : Semi-quantitative (rares, peu nombreuses, nombreuses, très nombreuses)
pour les liquides de ponction. Quantitative (104, 105, 106 ..../ml) pour les prélèvements urinaires et
pulmonaires. Autres éléments pris en compte sont :
Culture en aérobiose et/ou en anérobiose. Aspect des colonies: la taille, la bordure et la coloration Présence d'une
hémolyse (alpha, béta).
Culture : exemple d’isolementPus sur une gélose au sang frais
Culture : Identification - Antibiogramme
L'identification et l'antibiogramme de la majorité des bactéries habituelles est alors précisé dans un délai de 18-24 h. A l'aide de tests d'orientation rapide : oxydase, catalase, coagulase... Par ensemencement d'une galerie biochimique adaptée :
Identification de Escherichia coli et Proteus mirabilis par un ensemble de réactions du métabolisme intermédiaire.
Quelquefois cette procédure est insuffisante pour l'identification d'une
bactérie
Il convient de faire appel : soit à des modalités classiques de recherche d'autres
caractères bactériens tels la croissance sur certains milieux pour l'identification des sources de carbone permettant la croissance, le type respiratoire, le type fermentaire, le type antigénique…
soit à des modalités modernes telles l'amplification génique de certains gènes ou encore le séquencage d'autres (ARNr 16S).
Les autres moyens diagnostiques
Produits bactériens
Recherche d'antigène soluble
Exemple d'une pneumopathie à Legionella pneumophila.
Le test immunochromatographique aide au diagnostic présomptif des infections à Legionella en parallèle avec la culture ou d'autres tests.
Les avantages de ce test sont : précocité (dès le début des signes), simplicité (sur urine), rapidité (en 30 minutes), diagnostic tardif (> 2 mois après les signes cliniques), même après un traitement antibiotique adapté, Donc bonne valeur prédictive mais ce test ne détecte pas les autres sérogroupes de L. pneumophila
Méthode moléculaire
Le principe en est simple puisqu'il consiste à amplifier un gène entier ou non avec des amorces spécifiques ou encore séquencé et comparé avec ceux déposés dans des banques.
L'intérêt de ces diverses méthodes se résume: Gain de sensibilité (X 2 par rapport aux méthodes
classiques) pour la recherche notamment des Chlamydia génitaux.
Simplicité et la rapidité d'exécution.
Un appareil de PCR et la révêlation UV d'un produit amplifié après électrophorèse sur gel.
Biologie moléculaire : PCR = "Polymerase chain reaction" ou l'amplification génique
La PCR est la technique la plus utilisée pour la détection (amplification) de l’ADN et de l’ARN.
A partir d’une simple copie d’une séquence particulière d’acides nucléiques, cette séquence peut être spécifiquement amplifiée et détectée.
Couramment utilisée pour le diagnostic à partir du produit pathologique de germes de culture difficile, voire impossible, tel Chlamydia trachomatis.
1. Lyse des bactéries
2. Fixation de l ’ADN sur des billes de silice
3. Lavages
4. Elution de l ’ADN par de l ’eau ou du tampon
EXTRACTION DE L’ADN BACTERIEN
EXTRACTION AUTOMATISEE SUR MAGNAPURE
EXTRACTION DE L ’ADN BACTERIEN
R = reporter et Q = quencher
Dénaturation de l’ADN à 95 °CLa sonde se fixe vers 68-72 °CLes amorces se fixent vers 60 °C
La Taq ajoute des nucléotides etdétruit la sonde. Le reporter seretrouve dans le milieu et émetune fluorescence qui est détectée.
DETECTION DE L’ADN AVEC DES SONDES D’HYDROLYSE TAQMAN
AMPLIFICATION PAR PCR
Marqueur Marqueur depoids moléculaire
Témoinnégatif
Témoinpositif
Echantillons
Biologie moléculaire : Séquençage
ADN: Séquence de 4 nucléotides Purines: Adénine (A),
Guanine (G) Pyrimidines: Cytosine (C ),
Thymine (T)
Cellule
Noyau Chromosome
ADN
Matériel génétique
Un chromosome est comme une pelote de lainedont le fil est l’ADN
Cellule
Noyau Chromosome
ADN
L’information génétique est stockée dans les chromosomes
Cellule
Noyau Chromosome
ADN
AT G
C TA AT
Un chromosome est comme une pelote de lainedont le fil est l’ADN
Cellule
Noyau Chromosome
ADN L’ADN est une chaîne composée de 4 « molécules » différentes
symbolisées par les lettres A T G C
AT G
C TA AT
AT G
C TA AT
Cellule
Noyau Chromosome
ADN
tgctgccatctacatttttgggactcgggaattatgtgagtaccgaaactacttagcttatggtaggtgtaccacacgcacagggaaagaattgcgtttatgtgggacagtgaaaacaatcgcaaaaaagcaatggaaagggctttgagagtaatttatcttctgacatatgcaatatggcaacttctaaatggtgagagggagtctctctaaagcaatcatttgaagattggttggacaaacaatgggaaagtcattgtcttagcagaattaagtcatactttttttttttttttttttttgctaactctagaagcttttctgttatctctgtagctcagacgaaaatgcattctcaccagatgactgtttttggttaatcgatctgaatgcgctttgtgtggactgtcgaatttcaaagatttaccgtatgaccaagagcacctgatgctacaagtataaataggggaacaaatgctttctgttcttcctcggtaaggaggtagaggtggaggcggagccggatgtcagaggtcctgaaatagtcacctgggggaaaatgatccgcctgctgttgaagcccccttctcattccgatcgcttttggccttgatgatttgaaaataagtcctgttgcaccaggtaagtggacccaggtgagactctgtgatttctgcccataccctcatgtaggtgaccaatgtgactagctgtcctgtgggggaaatatctccccagccattctgacacccacaggctggacacctgcattccctagatctgcagaatctcagggagaaggggcattggagaggggatcgtttcttaagccctttgctctctccctggagaccggtgttttcttctcttgttggaggtttcagagactggggctccacaattgtcctgtcaatcctgaaggaggtcagatcctggccaggaaatctctgagtcctccaggaagtcctgagaagcagtggccac
3 milliards de « caractères »…
CA
T GC TA A
T
tgctgccatctacatttttgggactcgggaattatgtgagtaccgaaactacttagcttatggtaggtgtaccacacgcacagggaaagaattgcgtttatgtgggacagtgaaaacaatcgcaaaaaagcaatggaaagggctttgagagtaatttatcttctgacatatgcaatatggcaacttctaaatggtgagagggagtctctctaaagcaatcatttgaagattggttggacaaacaatgggaaagtcattgtcttagcagaattaagtcatactttttttttttttttttttttgctaactctagaagcttttctgttatctctgtagctcagacgaaaatgcattctcaccagatgactgtttttggttaatcgatctgaatgcgctttgtgtggactgtcgaatttcaaagatttaccgtatgaccaagagcacctgatgctacaagtataaataggggaacaaatgctttctgttcttcctcggtaaggaggtagaggtggaggcggagccggatgtcagaggtcctgaaatagtcacctgggggaaaatgatccgcctgctgttgaagcccccttctcattccgatcgcttttggccttgatgatttgaaaataagtcctgttgcaccaggtaagtggacccaggtgagactctgtgatttctgcccataccctcatgtaggtgaccaatgtgactagctgtcctgtgggggaaatatctccccagccattctgacacccacaggctggacacctgcattccctagatctgcagaatctcagggagaaggggcattggagaggggatcgtttcttaagccctttgctctctccctggagaccggtgttttcttctcttgttggaggtttcagagactggggctccacaattgtcctgtcaatcctgaaggaggtcagatcctggccaggaaatctctgagtcctccaggaagtcctgagaagcagtggccac
Chez l’homme, L’information génétique est formée parun texte de 3 milliards de caractères
unique pour chaque individu:
« le génome humain »
une séquence d’ADN…
Cellule
Noyau Chromosome
ADN Un gène
mRNA virtuel
Traduction en ‘protéine’
Séquençage de l’ADN
Définition : Technique permettant de déterminer la séquence (ordre
des nucléotides) d’une molécule d’ADN.
Séquençage selon Sanger
Polymérisation de l’ADN
5’ATGGCTATGCCGAGACCATATTACGACCAG 3’
3’TACCGATACGGCTCTGGTATAATGCTGGTC 5’
Matrice
A G T C C G A C G
Polymérase
Amorce
Nucléotides (dNTP)
Didésoxyribo-nucléotides
Désoxyribo-nt Didésoxyribo-nt
1’
2’3’
4’
5’
Séquençage selon Sanger
Réaction de séquençage (ddGTP)
5’ATGGCTATGCCGAG
3’TACCGATACGGCTCTGGTATAATGCTGGTC 5’
Matrice
A G T C G C A C GPolymérase
Amorce
dNTP + ddGTP
Séquençage selon Sanger
Réaction de séquençage (ddGTP)
5’ATGGCTATGCCGAG3’TACCGATACGGCTCTGGTATA 5’
5’ATGGCTATGCCG3’TACCGATACGGCTCTGGTATA 5’
5’ATGGCTATG3’TACCGATACGGCTCTGGTATA 5’
Gel d’Agarose
Séquençage selon Sanger
Séparation des produits
5’ATGGCTATGCCGAG5’ATGGCTATGCCG5’ATGGCTATG
Electrode -
Electrode +
Migration
Electrophorèse
Séquençage selon Sanger
Gel d’Agarose
Migration
Electrode -
Electrode +
ddA ddG ddC ddT
AGGCTATCTGAC
5’3’
Ordinateur
Séquençage automatique
Séquençagenucléotide : méthode de Sanger
Liaison de l’amorce avec l’ADN à séquencer.
La fixation des ddNTP (désoxyNucléotide TriPhosphate) aux brins d’ADN va créer des brins de différentes tailles.
Les brins vont migrer sur un gel d’électrophorèse selon leur taille : le plus petit migre le plus vite.
Séquençagenucléotide : méthode de Sanger
Séquençagenucléotide : méthode de Sanger
Automatisation de la méthode : Ajout sur les ddNTP de fluorochrome de différentes
couleurs. 1 seul tube regroupant les ddNTP. Lecture par un laser des fragments qui migrent sur le gel. Stockage des données dans la mémoire de l’ordinateur.
Séquençagenucléotide : méthode de Sanger
Séquençagenucléotide : méthode de Sanger
Diagnostic indirect ou sérologique Le principe se base sur les conséquences induites chez l'hôte à
savoir la production d'anticorps. La réaction immunitaire ne se développe qu'à partir d'un délai, de
l'ordre de 8 à 10 jours. Techniques : Les anticorps sont recherchés, le plus souvent, dans
le sang circulant après prise de sang, de l'ordre de 5 à 10 ml sur tube sec sans anti-coagulant.
Il existe diverses techniques pour déceler la présence d'anticorps: Réaction d'agglutination. Recherche d'anticorps par ELISA. Recherche d'anticorps par immunofluorescence. Recherche d'anticorps par une technique de révêlation
utilisant les globules rouges
Une protéine: comment c’est fabriqué ?
Noyau de la cellule=
Bibliothèque
Chromosomes (ADN)=
Livres de recettes(23 x 2 chez l’homme)
Une cellule
Noyau = Bibliothèque
1 recette pour 1 protéine =
1 gène
Chromosomes (ADN) =
Livres de recettes
Une cellule
Noyau = Bibliothèque
Chromosomes (ADN)= Livres
1 gène = 1 recette
Photocopie de la recette (ARN)
Une cellule
Noyau
Chromosomes (ADN)
1 gène = 1 recette
Photocopie de la recette (ARN)
Une cellule
NoyauChromosomes (ADN)
1 gène
Photocopie (ARN)
Machine à fabriquer les protéines (ribosomes)
Une cellule
Photocopie (ARN)
Machine à fabriquer les protéines
Une cellule
Photocopie de la recette
Machine à fabriquer les protéines
Une cellule
transcription traduction
Gènes: parties codantes de l’ADN
Un gène est formé d’introns et d’exons
Transcription et traduction
