Étude structurale dun complexe de trois protéines de la division de S. pneumoniae, DivIB, DivIC et...

Étude structurale d’un complexe de trois protéines de la division de S. pneumoniae,

DivIB, DivIC et FtsL

Soizic MASSON

Directeurs de thèse : André Zapun, Frank Gabel et Thierry Vernet

Thèse pour l’obtention du grade de Docteur de l’Université Joseph Fourier

Grenoble 1

Préparée au Laboratoire d’Ingénierie des Macromolécules

Présentation du plan

IntroductionContexte biologique

Présentation du modèle utilisé

RésultatsI. Le complexe contraint EC/KLII. La partie extracellulaire de DivIBIII. L’interaction entre le complexe EC/KL et la partie extracellulaire de DivIB

Conclusion, perspectives, collaborations

Les règnes du vivantIntroduction / Contexte biologique

Eucaryote: « à noyau » Procaryote

Sarcodina (Amibe)

Streptococcus pneumoniae

Methanococcus jannischii

Les bactériesIntroduction / Contexte biologique

Une bactérie est un organisme unicellulaire

Membrane plasmique

Peptidoglycane

Membrane externe (Gram négatif)

Les bactériesIntroduction / Contexte biologique

Gram positif

Une bactérie est un organisme unicellulaire

Membrane plasmique

Peptidoglycane

La division bactérienneIntroduction / Contexte biologique

Les bactéries se reproduisent par division:

une cellule mère donne 2 cellules filles identiques

FtsZ FtsA FtsK DivIB DivIC FtsL FtsW FtsI

Constriction membrane

Ségrégation chromosome

Synthèse paroi septale

Fonction inconnue

Plusieurs protéines impliquées dans la division :

FtsZ FtsA FtsK DivIB

FtsW FtsI

Ordre de recrutement chez E. coli

Ordre de recrutement similaire chez B. subtilis,

supposé équivalent chez S. pneumoniae

Constriction membrane Ségrégation chromosome Synthèse paroi septale

FtsLIntroduction / Contexte biologique

Chez S. pneumoniae:

FtsL57 aa

Le gène est

-présent dans la plupart de génomes bactériens,

-transcrit avec FtsI (synthèse de la paroi septale).

La protéine est

-essentielle à la survie de la plupart des bactéries,

-peu stable face à la dégradation in vivo,

-un substrat de la protéase YluC.N-ter

Introduction / Contexte biologique

Chez S. pneumoniae:

Le gène est

-présent dans la plupart de génomes bactériens.

La protéine est

-essentielle à la survie de la plupart des bactéries.

FtsL et DivICIntroduction / Contexte biologique

Les deux protéines

-se protègent mutuellement de la dégradation,

-se co-localisent mutuellement,

-présentent un motif de « coiled-coil »,

-interagissent in vivo et in vitro.

DivIBIntroduction / Contexte biologique

Chez S. pneumoniae:

Le gène est

-présent dans la plupart de génomes bactériens.

La protéine est

-n’est pas essentielle à la survie du pneumocoque

-protége FtsL de la dégradation,

-semble liée à la synthèse du peptidoglycane.

248 aa

125 aa

La partie extracellulaire est

-composée de 3 domaines (2 structures proposées).

N-ter 9/44

La partie extracellulaire de DivIBIntroduction / Contexte biologique

Chez E. coli:Chez G. stearothermophilus:

Code PDB: 1YR1

Code PDB: 2VH1Robson et al., 2006 Van den Ent et al., 2008 10/44

FtsL, DivIC et DivIBIntroduction / Contexte biologique

Très peu de conservation dans les séquences primaires

Les trois protéines interagissent :

-protection de FtsL par DivIB,

-co-localisation mutuelle,

-interaction prouvée in vitro et in vivo

FtsW FtsI

Structure supposée en « coiled-coil »

Topologie déterminée

Structures résolues Structure résolue

Constriction membrane

FtsZ FtsA FtsK

Ségrégation chromosomes Synthèse paroi septale

2 structures proposées du domaine extracellulaire

Objectifs du travailIntroduction / Objectif du travail

But de cette thèse:

apporter des informations structurales sur

- DivIB, DivIC et FtsL,

- les complexes qu’elles forment,

- l’arrangement de chacune dans ces complexes,

- leur interface d’interaction.

Présentation du modèle utiliséIntroduction / Présentation du modèle utilisé

DivIB, DivIC, FtsL de S. pneumoniae :

Très peu de conservation dans les séquences primaires,

notamment dans les parties cytoplasmiques

=> Étude sur les parties extracellulaires seules

Pas d’interaction

Rôle des segments transmembranaires de DivIC et FtsL ?

14/44N-ter

Formation d’un complexe entre la partie extracellulaire de DivIC et celle de FtsL

DivIB, DivIC, FtsL de S. pneumoniae

Interaction avec la partie extracellulaire de DivIB

Validation du système modèle

Noirclerc-Savoye et al., 2005

Outils utilisésIntroduction / Objectif du travail

Outils biophysiques utilisés:

- RMN (étude structurale préliminaire et analyse de structuration),

- SANS et SAXS (détermination du degré d’oligomérisation et modélisation basse résolution),

- BIA par SPR (cartographie de zone d’interaction et détermination de constantes cinétiques).

EC/KL, un hétéro complexeI. Le complexe contraint EC/KL

E CStrep

K LHis6

Les protéines EC et KL:

Co-élution :

SDS-PAGE

EC/KL, un hétéro complexeI. Le complexe contraint EC/KL

Spectre HSQC de KL 15N dans le complexe EC/KL:

Peu de pics se distinguent du bruit, problème de sensibilité

EC/KL, un hétéro complexe, tétramériqueI. Le complexe contraint EC/KL

Etude par SANS:

Le complexe EC/KL est un tétramère, (EC/KL)2

Conc (mg/ml) Mapp (kDa)

10 57 ± 6

4 42 ± 9

1,5 50 ± 14

M (EC/KL)1 = 25 kDa

Détermination de la masse:

I(0) = f1. M. c

EC/KL, un hétéro complexe, allongéI. Le complexe contraint EC/KL

Etude par SANS:

Le complexe (EC/KL)2 a une forme allongée, similaire à un bâton long

Estimation de la fonction de distribution de distances:

EC/KLCylindreSphère

EC/KL, un hétéro complexe, en équilibreI. Le complexe contraint EC/KL

Etude par SAXS:

Le complexe (EC/KL)2 se dissocie en (EC/KL)1, avec un KD d’environ 25 M

Détermination de la masse:

I(0)= f2. M. c

Conclusions sur le complexe contraint EC/KLI. Le complexe contraint EC/KL

• Le tétramère à la forme d’un bâton allongé;

• Le complexe EC/KL est en équilibre entre un tétramère et un dimère;

• La constante de dissociation du tétramère en dimère est environ 25 µM.

Le tétramère de EC/KL reflète-t-il une réalité physiologique?

II. La partie extracellulaire de DivIB

La partie extracellulaire de DivIB

Spectre HSQC de IB 15N :

La partie extracellulaire de DivIB est structurée, en partie

IB est composée de trois domaines II. La partie extracellulaire de DivIB

Protéolyse limitée de IB:

La partie extracellulaire de DivIB est organisée en trois domaines, dont le domaine central est résistant à la trypsine

+ séquençage N-Ter et analyse en spectrométrie de masse

Spectre HSQC de β 15N :

Étude du domaine β par RMN

=> Bon candidat pour une étude par RMN

Les constructions utilisées pour étudier IB II. La partie extracellulaire de DivIB

Élaboration de différentes constructions d’étude:

Les constructions utilisées pour étudier IB II. La partie extracellulaire de DivIB

Élaboration de différentes constructions d’étude:

Étude comparée par SAXS

Trop peu stable face à la dégradation

Étude par RMN

Étude du domaine β par SAXSII. La partie extracellulaire de DivIB

Courbe de diffusion de β de S. pneumoniae:

Courbe de diffusion de β :

β de G. stearothermophilusβ de E. coli

Courbe de diffusion de β :

Le domaine β de S. pneumoniae est structuralement proche du domaine β d’E. coli

β G. stearothermophilusβ E. coliβ S. pneumoniae

Étude des domaines βγ par SAXS

Courbe de diffusion de βγ:

Modélisation ab initio

Modèle ab initio de βγ:

Le domaine β de S. pneumoniae enveloppe bien celui d’E. coli1. Le domaine γ est modélisé par une boule en C-Ter du domaine β

1 La structure représentée du domaine β d’E. coli comprend les acides aminés de la valine 127 à la proline 260 de la structure 2VH1 29/44

Étude des domaines αβγ (IB) par SAXS

Courbe de diffusion de αβγ:

Étude des domaines αβγ (IB) par SAXS

Courbe de diffusion de αβγ:

La présence d’oligomères dans les échantillons de αβγ empêche la modélisation de la partie extracellulaire de DivIB

β S. pneumoniaeβγ S. pneumoniaeαβγ S. pneumoniae

Conclusions sur la partie extracellulaire de DivIB

• Le domaine central (β) est structuralement proche du domaine d’E. coli;

• Le domaine C-ter (γ) est modélisé par une petite boule accrochée à une extrémité du domaine centrale;

• Le domaine N-ter (α) est peu stable face à la dégradation et induit des oligomères.

• La partie extracellulaire de DivIB est organisée en trois domaines;

Discussion sur la partie extracellulaire de DivIB

Quelle est la longueur réelle du domaine central, β, de la partie extracellulaire de DivIB?

La partie extracellulaire de DivIB complexée avec EC/KL

III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL

Spectre HSQC de IB (ou αβγ) 15N :

Le complexe est de grande taille et le domaine β est impliqué dans l’interaction

Addition de EC/KL non marqué

Spectre HSQC de IB (ou αβγ) 15N :

La partie extracellulaire de DivIB complexée avec EC/KL

Détermination de l’épitope d’interaction sur β

Spectre HSQC de β 15N et 2H :

Addition de EC/KL non marqué

Des résidus de β impliqués dans l’interaction avec EC/KL sont identifiés

Spectre HSQC de β 15N et 2H :

Représentation de l’épitope d’interaction de β de S. pneumoniae avec EC/KL, sur la structure de β d’E. coli1:

1 Cette représentation repose sur un alignement des séquences primaires de DivIB de S. pneumoniae, de G. stearothermophilus et d’E. coli réalisé par alignement des éléments structuraux des protéines de G. stearothermophilus et d’E. coli 35/44

L’interaction de EC/KL avec la partie extracellulaire de DivIB

Faible sensibilité des spectres HSQC

=> anisotropie importante du complexe ?

Délimitation de régions C-terminales de DivIC et de FtsL : (sur la base de la prédiction de la formation d’un « coiled-coil »)

IBE CLK

Test d’interaction des complexes tronqués avec βγ:

EC/KL EC*/KL

Les régions C-terminales de DivIC et FtsL sont essentielles à l’interaction avec βγ

Cartographie des régions d’interaction de EC/KL par Biacore

EC/KL*

Détermination des constantes d’interaction par Biacore

La constante de dissociation du complexe βγ/EC/KL est de 220 nM

Interaction de βγ à différentes concentrations avec EC/KL:

Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS

Détermination de la masse de mélange de βγ et EC/KL:

I(0) = f1. M. c

βγ : EC/KL 0 : 1 1 : 1 1 : 0

I(0) = f1. M. c

βγ : EC/KL 0 : 1 1 : 1 1 : 0

I(0) (.10-3) 201 ± 10 305 ± 10 85 ± 9

I(0) = f1. M. c

βγ : EC/KL 0 : 1 1 : 1 1 : 0

I(0) (.10-3) 201 ± 10 305 ± 10 85 ± 9

Mapp (kDa) 55,4 ± 8,3 46,2 ± 6,1 22,3 ± 4,6

Mdimère = 25

55,4 ± 8,3 22,3 ± 4,6 46,2 ± 6,1

=> l’association de βγ avec le complexe EC/KL dissocie le tétramère ?

Simulation de composition des échantillons:

0,27 mM

=> Courbe de diffusion de βγ/EC/KL !

Courbe de diffusion de βγ/EC/KL:

=> Modelisation ab initio

Modélisation basse résolution de βγ/EC/KL:

βγ semble se localiser à l’extrémité du complexe EC/KL

Conclusions sur l’interaction entre IB et EC/KL

• Les régions C-terminales de DivIC et de FtsL sont essentielles à l’interaction avec la partie extracellulaire de DivIB

• Des résidus du domaine central de la partie extracellulaire de DivIB sont impliqués dans l’interaction avec les parties extracellulaires de DivIC et de FtsL

• Les domaines central et C-terminal se localisent à l’extrémité du complexe EC/KL

Conclusion générale et perspectives

DivIB : - tester l’importance relative des résidus de l’épitope d’interaction,

DivIB/DivIC/FtsL: - augmenter la résolution du modèle basse résolution.

DivIC/FtsL : - identifier les résidus critiques des régions C-terminales,

Collaborations

Institut de Biologie Structurale:

LRMN: Jean-Pierre Simorre LEM: Nicole ThielensThomas Kern Jean-Pierre AndrieuCécile Guistini

LBM: Christine Ebel LSMP: Bernard DubletAline Appourchaux Eric Forest

LPM: Isabelle Petit RoBioMol: Benoit Gallet Marjolaine Noirlerc-Savoye

LIM: tous!

Institut Laue Langevin:

D-Lab: Michael HaertleinMartine Moulin

D22: Phill Callow

European Synchrotron Radiation Facility:

ID02: Anuj ShuklaTheyencheri NarayananStéphanie Finet

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Documents

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