View
0
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
La protéomique
1. La séparation des protéines et les gels
2D-PAGE
2. La spectrométrie de masse et
l’identification des protéines
La protéomique
1. La séparation des protéines et les gels
2D-PAGE
2. La spectrométrie de masse et
l’identification des protéines
Sommaire1. Introduction
2. Principe
3. Protocole
- Première dimension: Séparation selon la charge
- Deuxième dimension: Séparation selon la masse
4. Résultats
5. Banques de données
6. Discussion
Sommaire1. Introduction
2. Principe
3. Protocole
- Première dimension: Séparation selon la charge
- Deuxième dimension: Séparation selon la masse
4. Résultats
5. Banques de données
6. Discussion
Introduction
Séparation des protéines afin de déterminer leuridentité et, si possible, leur proportion
Une séparation basée sur la charge suivied’une séparation basée sur la masse
Ne garantie la séparation de toutes les protéines
Une détection pas coloration du gel parargentine, fluorochromes ou par incorporationde groupement radioactifs
Sommaire1. Introduction
2. Principe
3. Protocole
- Première dimension: Séparation selon la charge
- Deuxième dimension: Séparation selon la masse
4. Résultats
5. Banques de données
6. Discussion
Principe
Sommaire1. Introduction
2. Principe
3. Protocole
- Première dimension: Séparation selon la charge
- Deuxième dimension: Séparation selon la masse
4. Résultats
5. Banques de données
6. Discussion
Première dimension:
Séparation selon la charge
Séparation selon le point isoéléctrique (pI)
Ampholytes: utilisés pour établir le pH
Gel avec gradient de pH immobilisés (IPG) bande de focalisation isoélectrique
Diffusion des protéines le long du gradient jusqu’à leur pI
Sommaire1. Introduction
2. Principe
3. Protocole
- Première dimension: Séparation selon la charge
- Deuxième dimension: Séparation selon la masse
4. Résultats
5. Banques de données
6. Discussion
Deuxième dimension:
Séparation selon la masse
Migration des échantillons du
gel d’électrofocalisation dans
un gel mince de
polyacrylamide dénaturant
(SDS-PAGE)
Le SDS sert à masquer les
différences de charge et à la
dénaturation des protéines
Sommaire1. Introduction
2. Principe
3. Protocole
- Première dimension: Séparation selon la charge
- Deuxième dimension: Séparation selon la masse
4. Résultats
5. Banques de données
6. Discussion
Résultat
Sommaire1. Introduction
2. Principe
3. Protocole
- Première dimension: Séparation selon la charge
- Deuxième dimension: Séparation selon la masse
4. Résultats
5. Banques de données
6. Discussion
Banques de données
Télécharger des documents et des images de gels 2D
caractéristiques des différents tissus chez différentes
espèces dans des conditions définies
Exemple: Expert Protein Analysis System «Expasy»:
propose la banque SWISS-2DPAGE
Comparaison difficile: variations de migration, distorsions
locales… http://ca.expasy.org/melanie
Sommaire1. Introduction
2. Principe
3. Protocole
- Première dimension: Séparation selon la charge
- Deuxième dimension: Séparation selon la masse
4. Résultats
5. Banques de données
6. Discussion
Erreurs possibles?
Extraction non stœchiométrique des protéines à
partir des différents constituants cellulaires
Impossibilité pour certaines protéines d’entrer à
l’intérieur ou de ressortir du gel
d’isoélectrofocalisation
Réponse non linéaire du colorant utilisé pour la
détection
Des améliorations…
Une estimation semi-quantitative possible: intégration de
l’intensité des pixels sur la surface d’une tache
Comparaison de gels entre tissus similaires
Caractérisation fine du protéome et isolement de
complexes de protéines natives par chromatographie
d’affinité
Chromatographie d’affinité
Cible
Anticorps
Colonne
Co-immunoprécipitation
Streptavidine
Biotine
Chromatographie d’affinité sur biotine
Glutathion
GST
Chromatographie après fusion à la GST
Complexe multiprotéique
Purification directe
Merci
***
Recommended