La protéomique

1. La séparation des protéines et les gels

2D-PAGE

2. La spectrométrie de masse et

l’identification des protéines

La protéomique

1. La séparation des protéines et les gels

2D-PAGE

2. La spectrométrie de masse et

l’identification des protéines

Sommaire1. Introduction

2. Principe

3. Protocole

- Première dimension: Séparation selon la charge

- Deuxième dimension: Séparation selon la masse

4. Résultats

5. Banques de données

6. Discussion

Sommaire1. Introduction

2. Principe

3. Protocole

- Première dimension: Séparation selon la charge

- Deuxième dimension: Séparation selon la masse

4. Résultats

5. Banques de données

6. Discussion

Introduction

Séparation des protéines afin de déterminer leuridentité et, si possible, leur proportion

Une séparation basée sur la charge suivied’une séparation basée sur la masse

Ne garantie la séparation de toutes les protéines

Une détection pas coloration du gel parargentine, fluorochromes ou par incorporationde groupement radioactifs

Sommaire1. Introduction

2. Principe

3. Protocole

- Première dimension: Séparation selon la charge

- Deuxième dimension: Séparation selon la masse

4. Résultats

5. Banques de données

6. Discussion

Principe

Sommaire1. Introduction

2. Principe

3. Protocole

- Première dimension: Séparation selon la charge

- Deuxième dimension: Séparation selon la masse

4. Résultats

5. Banques de données

6. Discussion

Première dimension:

Séparation selon la charge

Séparation selon le point isoéléctrique (pI)

Ampholytes: utilisés pour établir le pH

Gel avec gradient de pH immobilisés (IPG) bande de focalisation isoélectrique

Diffusion des protéines le long du gradient jusqu’à leur pI

Sommaire1. Introduction

2. Principe

3. Protocole

- Première dimension: Séparation selon la charge

- Deuxième dimension: Séparation selon la masse

4. Résultats

5. Banques de données

6. Discussion

Deuxième dimension:

Séparation selon la masse

Migration des échantillons du

gel d’électrofocalisation dans

un gel mince de

polyacrylamide dénaturant

(SDS-PAGE)

Le SDS sert à masquer les

différences de charge et à la

dénaturation des protéines

Sommaire1. Introduction

2. Principe

3. Protocole

- Première dimension: Séparation selon la charge

- Deuxième dimension: Séparation selon la masse

4. Résultats

5. Banques de données

6. Discussion

Résultat

Sommaire1. Introduction

2. Principe

3. Protocole

- Première dimension: Séparation selon la charge

- Deuxième dimension: Séparation selon la masse

4. Résultats

5. Banques de données

6. Discussion

Banques de données

Télécharger des documents et des images de gels 2D

caractéristiques des différents tissus chez différentes

espèces dans des conditions définies

Exemple: Expert Protein Analysis System «Expasy»:

propose la banque SWISS-2DPAGE

Comparaison difficile: variations de migration, distorsions

locales… http://ca.expasy.org/melanie

Sommaire1. Introduction

2. Principe

3. Protocole

- Première dimension: Séparation selon la charge

- Deuxième dimension: Séparation selon la masse

4. Résultats

5. Banques de données

6. Discussion

Erreurs possibles?

Extraction non stœchiométrique des protéines à

partir des différents constituants cellulaires

Impossibilité pour certaines protéines d’entrer à

l’intérieur ou de ressortir du gel

d’isoélectrofocalisation

Réponse non linéaire du colorant utilisé pour la

détection

Des améliorations…

Une estimation semi-quantitative possible: intégration de

l’intensité des pixels sur la surface d’une tache

Comparaison de gels entre tissus similaires

Caractérisation fine du protéome et isolement de

complexes de protéines natives par chromatographie

d’affinité

Chromatographie d’affinité

Cible

Anticorps

Colonne

Co-immunoprécipitation

Streptavidine

Biotine

Chromatographie d’affinité sur biotine

Glutathion

GST

Chromatographie après fusion à la GST

Complexe multiprotéique

Purification directe

Merci

***