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Les gènes Les gènes PR-10PR-10 du du pommier :pommier :
identification, identification, caractérisation et caractérisation et
analyse de l’expression analyse de l’expression spatio-temporelle en spatio-temporelle en
réponse à une induction réponse à une induction par l'acibenzolar-S-par l'acibenzolar-S-
methyl (ASM).methyl (ASM). Presentation, PhD Thesis, Biology, Ecole doctorale de Rennes 1, France.Smaïl Ziadi © 2001
PR-10 genes in apple seedlings (Malus domestica): identification, characterization and spatio-temporal expression after induction by acibenzolar-S-methyl (ASM), a functional analogue of salicylic acid.
Les gènes Les gènes PR-10PR-10 du pommier : du pommier : identification, caractérisation et analyse de l’expression identification, caractérisation et analyse de l’expression
spatio-temporelle spatio-temporelle en réponse à une induction par l'acibenzolar-S-methyl (ASM).en réponse à une induction par l'acibenzolar-S-methyl (ASM).
1-1- Situation du sujet. Situation du sujet.
3-3- Objectifs. Objectifs.
5-5- Conclusion générale. Conclusion générale.
2-2- Présentation du modèle d’étude. Présentation du modèle d’étude.
4-4- Résultats obtenus. Résultats obtenus.
6-6- Perspectives. Perspectives.
Ziadi © 2001
Réponse de la plante aux stressRéponse de la plante aux stress
Plante
Bactéries Champignons
Virus
Facteurs physiques et/ou chimiquesFacteurs de virulence et d’avirulence
Eliciteurs abiotiquesEliciteurs biotiques
SalinitéSécheresse
Eliciteurs chimiques Blessure
Stress
11 : Défense constitutive
22 : Défense inductible
Ziadi © 2001
RReprésentation spatio-temporelle des réponses de défense de la planteeprésentation spatio-temporelle des réponses de défense de la plante
Flux d’ions Burst oxydatifCascade de phospho- rylation
Mort cellulaire
Temps relatifTemps relatif
Rap
ide
Point de stress
Rap
ide/
inte
rméd
iair
eIn
term
édia
ire/
lon
g
Défense locale Défense systémique
Distance/site de stressDistance/site de stress
Voies des phényl- propanoïdes Protéines PR
HRHR
ProtéinesProtéines
PRPR ProtéinesProtéines
PRPR
Ziadi © 2001
Principales voies de signalisationPrincipales voies de signalisation
BlessureInfection par un agent pathogène
Production de l’AS Production de l’AJ et C2H4-
+
Protéines PRnon inductibles
par l’AS
Protéines PRinductibles
par l’AS
Protéines PRinductibles par toutes
les voies de signalisation
Ziadi © 2001
Définition des protéines PR*Définition des protéines PR*
Protéines de la plante induites dans des :Protéines de la plante induites dans des :
ouou
- Situations de pathologie.- Situations de pathologie.
- Situations liées à la pathologie.- Situations liées à la pathologie.
l’application des éliciteurs chimiques.l’application des éliciteurs chimiques.
* van Loon et al., 1994
Ziadi © 2001
Classification des protéines PRClassification des protéines PR
Famille Propriétés Symboles des gènesPR-1 Inconnue Ypr1
PR-2 -1,3-glucanase. Ypr2, [Gns2 (‘Glb’)]
PR-3 Chitinases type I, II, III, IV, V, VI, VII Ypr3, Chia
PR-4 Chitinase type I, II Ypr4, Chid
PR-5 Thaumatin-like Ypr5
PR-6 Inhibiteur de protéinases Ypr6, Pis (‘Pin’)
PR-7 Endoprotéinase Ypr7
PR-8 Chitinase type III Ypr8, Chib
PR-9 Peroxydase Ypr9, Prx
PR-10 "Ribonuclease-like" Ypr10
PR-11 Chitinase type I Ypr11, Chic
PR-12 Défensine Ypr12
PR-13 Thionine Ypr13, Thi
PR-14 Protéine de transfert de lipides Ypr14, Ltp
Famille Propriétés Symboles des gènesPR-1 Inconnue Ypr1
PR-2 -1,3-glucanase. Ypr2, [Gns2 (‘Glb’)]
PR-3 Chitinases type I, II, III, IV, V, VI, VII Ypr3, Chia
PR-4 Chitinase type I, II Ypr4, Chid
PR-5 Thaumatin-like Ypr5
PR-6 Inhibiteur de protéinases Ypr6, Pis (‘Pin’)
PR-7 Endoprotéinase Ypr7
PR-8 Chitinase type III Ypr8, Chib
PR-9 Peroxydase Ypr9, Prx
PR-10 "Ribonuclease-like" Ypr10
PR-11 Chitinase type I Ypr11, Chic
PR-12 Défensine Ypr12
PR-13 Thionine Ypr13, Thi
PR-14 Protéine de transfert de lipides Ypr14, Ltp
van Loon et van Strien., 1999Ziadi © 2001
La famille PR-10La famille PR-10
2-2- Identification basée sur l’homologie de séquences. Identification basée sur l’homologie de séquences.
3-3- Particularités : Particularités :
4-4- Induction : Induction :
- Protéines PR acides intracellulaires - Protéines PR acides intracellulaires
- Pouvoir allergène- Pouvoir allergène
1-1- Poids moléculaire : 16 – 18 kDa. Poids moléculaire : 16 – 18 kDa.
- - Stress biotiques Stress biotiques - - Stress abiotiquesStress abiotiques- Stades physiologiques- Stades physiologiques
5-5- Activité enzymatique suspectée : Activité enzymatique suspectée :
- Ribonucléase- Ribonucléase
Ziadi © 2001
Modèle d’étudeModèle d’étude
1-1- Gènes candidats : Gènes candidats :
Gènes Gènes PR-10.PR-10.
2-2- Matériel végétal : Matériel végétal :
Pommier, semis du cv. Golden Delicious.Pommier, semis du cv. Golden Delicious.
3-3- Activateur de la résistance : Activateur de la résistance :
acibenzolar-S-methyl (ASM).acibenzolar-S-methyl (ASM).
Ziadi © 2001
Les protéines PR-10 du pommier : Les protéines PR-10 du pommier : connaissances actuellesconnaissances actuelles
1-1- Famille multigénique Famille multigéniqueaa..
3-3- La majorité des travaux sont de type allergologique. La majorité des travaux sont de type allergologique.
4-4- Analyse de la régulation du gène Analyse de la régulation du gène AP15 AP15 dd..
d Pühringer et al., 2000.
2-2- Identification de 2 gènes : Identification de 2 gènes : AP15AP15 bb et et Mal d 1Mal d 1cc..
b Atkinson et al., 1996. c Vanek-Krebitz et al., 1995.a Walter et al., 1996.
Ziadi © 2001
Le pommierLe pommier
1-1- Modèle de référence. Modèle de référence.
- Mécanismes de défense- Mécanismes de défenseaa..
- Cartographie du génome du pommier- Cartographie du génome du pommierbb..
2-2- Intérêt agronomique. Intérêt agronomique.
a Laboratoire du Feu Bactérien, UMR PaVé, Angers. b European Apple Linkage Map : Prima x Fiesta.
Ziadi © 2001
acibenzolar-S-methyl (ASM) acibenzolar-S-methyl (ASM)
1- Analogue fonctionnel de l’acide salicylique1- Analogue fonctionnel de l’acide salicyliqueaa..
2- Activateur de la résistance de plusieurs plantes.2- Activateur de la résistance de plusieurs plantes.
4- Nombreuses qualités pratiques.4- Nombreuses qualités pratiques.
3- Protège le pommier contre le feu bactérien.3- Protège le pommier contre le feu bactérien.
a Wendehenne et al., 1997.
1- Analogue fonctionnel de l’acide salicylique1- Analogue fonctionnel de l’acide salicyliqueaa..
Ziadi © 2001
acibenzolar-S-methyl (ASM):acibenzolar-S-methyl (ASM):analogue fonctionnel de l’acide salicyliqueanalogue fonctionnel de l’acide salicylique
Acide salicyliqueAcide salicyliqueASAS
o oH
oH
Acide 2, 6-dichloroisonicotiniqueAcide 2, 6-dichloroisonicotiniqueINAINA
o oH
oH
NCl Cl
Acibenzolar-S-methylAcibenzolar-S-methylASMASM
o s
N
N
S
CH3
Ziadi © 2001
Mode d’action de l’acibenzolar-S-methyl Mode d’action de l’acibenzolar-S-methyl (ASM)(ASM)
Tissus non infectés
Tissus infectés
NécrosesExpression des
gènes de défense
Résistance Acquise
Locale
AcideAcideSalicyliqueSalicylique
Signal systémique
NahG
NahG
Expression desgènes de la SAR
RésistanceSystémique
Acquise
nim1npr1
nim1npr1
AcideAcideSalicyliqueSalicylique
ASM
cpr1?lsd2lsd4
ndr1?cpr1?cim2cim3
Interaction plante-agentpathogène
D’après Ryals et al., 1996Ziadi © 2001
acibenzolar-S-methyl (ASM) acibenzolar-S-methyl (ASM)
1-1- Analogue fonctionnel de l’acide salicylique Analogue fonctionnel de l’acide salicyliqueaa..
2-2- Activateur de la résistance de plusieurs plantes Activateur de la résistance de plusieurs plantesbb..
4-4- Nombreuses qualités pratiques Nombreuses qualités pratiquesdd..
3-3- Protège le pommier contre le feu bactérien Protège le pommier contre le feu bactériencc..
c Brisset et al., 2000.b Ruess et al., 1996.a Wendehenne et al., 1997. d Godard et al., 1999.
Ziadi © 2001
Objectifs de l’étudeObjectifs de l’étude
1-1- Identification et caractérisation des Identification et caractérisation des gènes gènes PR-10.PR-10.
2-2- Analyse de l’expression spatio-temporelle des Analyse de l’expression spatio-temporelle des gènes gènes PR-10PR-10 après application de l'acibenzolar-S- après application de l'acibenzolar-S-methyl (ASM).methyl (ASM).
3-3- Analyse de l’expression des gènes Analyse de l’expression des gènes PR-10PR-10 après après application application d’autres stress abiotiques.d’autres stress abiotiques.
4-4- Localisation Localisation in situin situ des produits des gènes des produits des gènes PR-PR-10.10.
Les gènes Les gènes PR-10PR-10 du du pommierpommier
Ziadi © 2001
Résultats obtenusRésultats obtenus
Identification et caractérisation Identification et caractérisation des gènes des gènes PR-10PR-10 du pommier du pommier
Ziadi © 2001
Recherche des transcrits PR-10Recherche des transcrits PR-10
RACE avec des amorces dégénéréesRACE avec des amorces dégénérées
Série de restrictionsSérie de restrictions
4 classes d’inserts 4 classes d’inserts
Séquençage d’un insert de chaque classe Séquençage d’un insert de chaque classe
AP1, AP2, AP3, AP4 AP1, AP2, AP3, AP4
Ziadi © 2001
Analyse phylogénétiqueAnalyse phylogénétique
Séquences PR-10 du pommier
Séquences PR-10 du bouleau
Séquences PR-10 cv. Golden Delicious
Séquences PR-10 proches du pommier
pru022521
Pyr065200
pru050001
Bet v 1-Sc1
Q9SYV6
Q9SYW3
Q9SYV3
P43211/Mal d 1Q40280/AP15
Q9SYV2 Q9SYV4 Q9SYV5
Q9SYV7 Q9SYV8 Q9SYV9
Q9S7M5 Q43549 Q43550
Q43551 Q43552
Séquences AP
AP1
AP3
AP4
AP2
Ziadi © 2001
Analyse phylogénétiqueAnalyse phylogénétique
APbAPb
APaAPa
Ziadi © 2001
RReprésentation des séquences génomiques eprésentation des séquences génomiques
E
E
MJ
Ei
Ei
W
W
W
W
ET
T
T T
500 pb 1000 pb 1500 pb
AP2
AP3
AP4
tataaat
-502 +1
tataaat
-592 +1
-861
tataaat
+1
AP1
tataaat
+1-885+78atg
+555taa
+790
+80atg
+557taa
+816
+84atg
+732taa +993
+438aggc
+268aggt
+73atg
+717taa
+997+423aggc
+256aggt
APbAPb APaAPa
Ziadi © 2001
Résultats obtenusRésultats obtenus
Analyse de l’expression Analyse de l’expression spatio-temporelle spatio-temporelle
des gènes des gènes PR-10PR-10 du pommier du pommier
Ziadi © 2001
RReprésentation des séquences génomiques eprésentation des séquences génomiques
500 pb 1000 pb 1500 pb
AP2
AP3
AP4
AP1
tataaat
+1-885+78atg
+555taa
+790
-861
tataaat
+1+80atg
+557taa
+816
tataaat
-502 +1+84atg
+732taa +993
+438aggc
+268aggt
tataaat
-592 +1+73atg
+717taa
+997+423aggc
+256aggt
APbAPb APaAPa
Ziadi © 2001
Expression constitutive des gènes Expression constitutive des gènes PR-10PR-10
F P T R
APa
APb
Feuilles TigePétioles RacinesRacines
R
Ziadi © 2001
Analyse de l’expression inductible des gènes Analyse de l’expression inductible des gènes PR-10PR-10
Pulvérisation:-ASM (1 mM)-H2O
Prélèvement :
0 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 48 h 120 h
Prélèvement
Ziadi © 2001
Expression inductible des gènes Expression inductible des gènes PR-10PR-10
Expression localeExpression locale
Au niveau transcriptionnel Au niveau traductionnel
18 kDa17 kDa
Bet v 1 8 h 24 h 48 h 8 h 24 h 48 h
17 kDa
H2O ASM
H H H AAA
8 h 24 h 48 h
APa
APb
Ziadi © 2001
1 159AP3
Signature PR-10
Représentation schématique des séquences protéiquesReprésentation schématique des séquences protéiques
Hypothèse d’une modification post-traductionnelleHypothèse d’une modification post-traductionnelle
1
1
1
159
159
159
AP1
AP4
APaAPa
AP2
APbAPb
Ck Ck
Ck CkPk
Pk
Pk
Pk
Ck
Ck
Ck
Ck
Ck
Ck
CkSignature PR-10
Signature PR-10
Signature PR-10
P-loop
P-loop
P-loop
P-loop
Ziadi © 2001
Expression inductible des gènes Expression inductible des gènes PR-10PR-10
Analyse de l’expression systémiqueAnalyse de l’expression systémique
Pulvérisation:-ASM (1 mM)-H2O
Prélèvement :
Protection des deux jeunes feuilles
FNT
FT
- FT: feuilles traitées
- FNT: feuilles non traitées
0 h 48 h 120 h
Ziadi © 2001
Expression inductible des gènes Expression inductible des gènes PR-10PR-10
Expression systémiqueExpression systémique
FT FT FTFTFNT FNT
H HA A
48 h 120 h
APa
APb
Ziadi © 2001
Résultats obtenusRésultats obtenus
Analyse de l’expression Analyse de l’expression des gènes des gènes PR-10PR-10 après application après application
d’autres stress abiotiquesd’autres stress abiotiques
Ziadi © 2001
Résultats obtenusRésultats obtenus
1-1- Éthylène. Éthylène.
2-2- Acide jasmonique. Acide jasmonique.
3-3- Blessure. Blessure.
4-4- Capsicéine. Capsicéine.
Ziadi © 2001
Application d’autres stress abiotiquesApplication d’autres stress abiotiques
ÉthylèneÉthylène
H H H 1 1010101 1
8 h 24 h 48 h
APa
APb
Ziadi © 2001
Application d’autres stress abiotiquesApplication d’autres stress abiotiques
Acide jasmonique (0,1 mM) Acide jasmonique (0,1 mM) etet Capsicéine (1 µg.mlCapsicéine (1 µg.ml-1-1))
H HCap AJ AJCap
48 h 120 h
APa
APb
Ziadi © 2001
Application d’autres stress abiotiquesApplication d’autres stress abiotiques
BlessureBlessure
T
APa
APb
TB BB T
8 h 24 h 48 h
Ziadi © 2001
Résultats obtenusRésultats obtenus
Localisation des produits Localisation des produits des gènes des gènes PR-10PR-10 du pommier du pommier
Ziadi © 2001
Localisation Localisation in situin situ des transcrits PR-10 des transcrits PR-10
XyXy
Barre d’échelle : 25 µm
EiEi
PpPp
EsEsPlPl
Barre d’échelle : 25 µm
Ziadi © 2001
Localisation Localisation in situin situ des protéines PR-10 des protéines PR-10
EiEi
XyXy
EESS
Barre d’échelle : 25 µm
EiEi
EESS
PPLLPpPp
Barre d’échelle : 25 µm
PHPH
Ziadi © 2001
ConclusionsConclusionsetet
PerspectivesPerspectives
Conclusions et PerspectivesConclusions et Perspectives
Ziadi © 2001
ConclusionsConclusions
Identification et caractérisation des gènes Identification et caractérisation des gènes PR-10PR-10
2-2- Deux sous-classes : APa (AP1, AP4) et APb (AP2, AP3). Deux sous-classes : APa (AP1, AP4) et APb (AP2, AP3).
4-4- Chacun de ces gènes a une régulation complexe et différente. Chacun de ces gènes a une régulation complexe et différente.
3-3- Les gènes APa sont considérés comme nouvellement identifiés. Les gènes APa sont considérés comme nouvellement identifiés.
1-1- Quatre transcrits Quatre transcrits PR-10PR-10 ont été identifiés ont été identifiésaa dans les feuilles. dans les feuilles.
a GeneBank data base:
AY026909 (Ypr10*Md.d).
AY026908 (Ypr10*Md.b)AY026911 (Ypr10*Md.a)
AY026910 (Ypr10*Md.c)
Ziadi © 2001
ConclusionsConclusions
Expression spatio-temporelle des gènes Expression spatio-temporelle des gènes PR-10PR-10
2-2- Expression après application de l’ASM :Expression après application de l’ASM :
4-4- Aucune expression après application de l’AJ et la capsicéine. Aucune expression après application de l’AJ et la capsicéine.
3-3- Expression suite à des blessures et l’application de l’éthylène. Expression suite à des blessures et l’application de l’éthylène.
1-1- Expression constitutive uniquement au niveau des racines. Expression constitutive uniquement au niveau des racines.
1-1- Très forte au niveau local.Très forte au niveau local.
2-2- Significative au niveau systémique.Significative au niveau systémique.
Ziadi © 2001
ConclusionsConclusions
Localisation Localisation in situin situ des produits des gènes des produits des gènes PR-10PR-10
1-1- Les tissus conducteurs. Les tissus conducteurs.
2-2- Les parenchymes palissadiques. Les parenchymes palissadiques.
Les tissus du phloème.Les tissus du phloème.
SMAÏL ZIADI, PASCAL POUPARD, MARIE-NOËLLE BRISSET, JEAN-PIERRE PAULIN and PHILIPPE SIMONEAU.
Characterization in apple leaves of two subclasses of PR-10 transcripts inducible by acibenzolar-S-methyl, a functional analogue of salicylic acid
Physiological and Molecular Plant Pathology (2001) 58, 33-43.
Ziadi © 2001
Rôles suggérés pour les protéines PR-10Rôles suggérés pour les protéines PR-10
2-2- Rôle dans le développement de la plante. Rôle dans le développement de la plante.
1-1- Rôle dans les mécanismes de défense. Rôle dans les mécanismes de défense.
Ziadi © 2001
PerspectivesPerspectives
Fonction biologiqueFonction biologique
1- 1- Analyse de l’expression des gènes Analyse de l’expression des gènes PR-10PR-10 du pommier du pommier après un stress biotique.après un stress biotique.
2- 2- Localisation cellulaire des produits des gènes Localisation cellulaire des produits des gènes PR-10.PR-10.
3- 3- Cartographie des gènes Cartographie des gènes PR-10.PR-10.
4- 4- Analyse de l’activité enzymatique des protéines PR-10.Analyse de l’activité enzymatique des protéines PR-10.
Ziadi © 2001
Aspect allergénique des protéines PR-10Aspect allergénique des protéines PR-10
Breiteneder et Ebner, 2000Ziadi © 2001
Allergènes des aliments homologues aux protéines PRAllergènes des aliments homologues aux protéines PR
Allergènes
homologues àSources d’allergènes
PR-2 fruits et légumes.
PR-3 avocat (Pers a 1), châtaigne, banane.
PR-4 navet.
PR-5 cerise (Pru av 2), pomme (Mal d 2), poivron (P23).
PR-10 Pomme (Mal d 1), cerise (Pru av 1), abricot (Pru ar 1), poire (Pyr c 1), céleri (Api g 1), carotte (Dau c 1), persil (pcPR), pomme de terre (pSTH).
PR-14 pêche (Pru p 3), pomme (Mal d 3), graine de soja (Gly m 1), orge.
Breiteneder et Ebner., 2000; Hoffmann-Sommergruber, 2000
Allergènes
homologues àSources d’allergènes
PR-2 fruits et légumes.
PR-3 avocat (Pers a 1), châtaigne, banane.
PR-4 navet.
PR-5 cerise (Pru av 2), pomme (Mal d 2), poivron (P23).
PR-10 Pomme (Mal d 1), cerise (Pru av 1), abricot (Pru ar 1), poire (Pyr c 1), céleri (Api g 1), carotte (Dau c 1), persil (pcPR), pomme de terre (pSTH).
PR-14 pêche (Pru p 3), pomme (Mal d 3), graine de soja (Gly m 1), orge.
Ziadi © 2001
Aspect allergénique des protéines PR-10Aspect allergénique des protéines PR-10
H A50 A100 A200
APa
APb
ASM
Ziadi © 2001
Question ouverte Question ouverte
Protection des cultures par l’application des éliciteurs chimiquesProtection des cultures par l’application des éliciteurs chimiques
Induction des protéines allergènesInduction des protéines allergènes
Risques pour les consommateurs ? Risques pour les consommateurs ?
ÉÉvaluation des risques allergéniquesvaluation des risques allergéniques
Ziadi © 2001
PerspectivesPerspectives
Évaluation des risques allergéniquesÉvaluation des risques allergéniques
1-1- Vérification de l’allergénicité des protéines AP.Vérification de l’allergénicité des protéines AP.
3-3- Recherche d’autres activateurs de la résistance qui Recherche d’autres activateurs de la résistance qui n’induisent pas ou faiblement les gènes n’induisent pas ou faiblement les gènes PR-10.PR-10.
2-2- Suivi de l’expression des gènes Suivi de l’expression des gènes PR-10PR-10 dans les fruits dans les fruits avant et après application de l’ASM.avant et après application de l’ASM.
Ziadi © 2001
EncadrementEncadrement
- M. SIMONEAU P.- M. SIMONEAU P. Laboratoire de Microbiologie Végétale
- M. POUPARD P.- M. POUPARD P. Laboratoire de Microbiologie Végétale
- Melle. BRISSET M. –N.- Melle. BRISSET M. –N. Équipe du Feu Bactérien, Station de Pathologie Végétale
- M. PAULIN J. –P.- M. PAULIN J. –P. Équipe du Feu Bactérien, Station de Pathologie Végétale
Ziadi © 2001
MerciMerci pour votre pour votre attentionattention
Ziadi © 2001
Les gènes Les gènes PR-10PR-10 du du pommier :pommier :
identification, identification, caractérisation et caractérisation et
analyse de l’expression analyse de l’expression spatio-temporelle en spatio-temporelle en
réponse à une induction réponse à une induction par l'acibenzolar-S-par l'acibenzolar-S-
methyl (ASM).methyl (ASM). Ziadi © 2001
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