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1- Bases azotées A- 2 sortes de bases : purines et pyrimidines
B- Absorbance dans l’U.V.
C- Densité de charge
2- Nucléosides et nucléotides A- Liaison avec 2 types de sucres
B- Modification avec l’acide phosphorique
C- Nomenclature
3- Structures spatiales A- Association des nucléotides dans un acide nucléique
B- Complémentarité des bases
C- Double hélice/Propriétés
D- Modifications chimiques des acides nucléiques
4- Des nucléotides remarquables : ATP, AMPc et GMP
5- Séquençage de l’ADN et PCR
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
IV – Les Acides Nucléiques
Selon une célèbre marque de cosmétique française :
« Principe premier de chaque
cellule vivante, l'ADN détient le
pouvoir de croissance et de vie.
Extrait sous sa forme native
grâce à un procédé 100% naturel,
l'ADN Végétal natif est capable
de transférer son exceptionnel
pouvoir de renaissance et de
revitalisation aux cellules de la
peau (test in vitro). »
Mais l’ADN…. C’est quoi ?
À quoi cela ressemble-t-il ?
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
INTRODUCTION
INTRODUCTION
Les acides nucléiques (ADN, ARN) sont constitués par des molécules
de structure "simple" appelés nucléotides.
Les nucléotides sont les briques élémentaires de la transmission de
l’information génétique.
Les acides nucléiques jouent également un rôle fondamental :
- dans le métabolisme cellulaire sous forme di- et tri-phosphorylée
- dans la transmission de l’information dans la cellule (AMP et GMP
cyclique).
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
Nucléotide :
- base azotée
- sucre
- acide phosphorique
Fishel Levin
(1869-1940)
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
Il existe 2 sortes de bases azotées hétérocycliques :
bases pyrimidiques
(noyau pyrimidine)
bases puriques
(noyau purine)
N
N 1
2
3
4
5
6
N
N
N
N
1
2
3
4
5
6 7
8
9
a- Celles retrouvées dans l’ADN et l’ARN
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
1- Bases azotées A- 2 sortes de bases : purines et pyrimidines
cytosine (C) thymine (T) 5-méthyl-uracile
uracile (U)
ADN/ARN ADN ARN
N
N H
1 2
3 4
5
6
NH2
HN
N H
1 2
3 4
5
6
O
O
CH3 HN
N H
1 2
3 4
5
6
O
O O H
H
H
H
H
fonction amide fonction amide fonction imino-amine
a- Celles retrouvées dans l’ADN et l’ARN
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
1- Bases azotées A- 2 sortes de bases : purines et pyrimidines
a- Celles retrouvées dans l’ADN et l’ARN
Il existe 2 sortes de bases azotées hétérocycliques :
bases pyrimidiques
(noyau pyrimidine)
bases puriques
(noyau purine)
N
N 1
2
3
4
5
6
N
N
N
N
1
2
3
4
5
6 7
8
9
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
1- Bases azotées A- 2 sortes de bases : purines et pyrimidines
adénine (A)
NH2
N
N
N
NH
1
2 3
4
5 6
7
8
9
ADN/ARN
HN
N
N
NH
1
2 3
4
5 6
7
8
9
H2N
O
guanine (G)
ADN/ARN
a- Celles retrouvées dans l’ADN et l’ARN
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
1- Bases azotées A- 2 sortes de bases : purines et pyrimidines
fonction amide fonction imino-amine
1- Bases azotées A- 2 sortes de bases : purines et pyrimidines
b- D’autres bases aux rôles variés
acide urique
caféine
théophylline
théobromine
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
220 240 280 300 320 260 0,0
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Longueur d’onde (nm)
Abs
orba
nce
ADN protéine
A260/A280 = 1,8
Si A260/A280 < 1,8
Contamination protéique
ADN/ARN pur le ratio
Pureté
Quantité
Une solution avec A260 = 1
correspond à une concentration :
de 50 µg/mL d’ADN db
de 40 µg/mL d’ARN ou ADN sb
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
1- Bases azotées B- Absorbance dans l’U.V.
1- Bases azotées B- Absorbance dans l’U.V.
QUIZZ Quelle est la concentration en ADN de la solution de départ ?
A260 = 0,6 Volume final dans la cuve = 1 mL
20 µL d’ADN q.s.p. 1 mL avec tampon
A- 3 µg/mL
B- 1500 mg/L
C- 15 mg/L
D- 3 mg/L
E- 1500 µg/mL
REPONSE
Concentration dans la cuve
0,6 x 50 µg/mL
Calcul dilution
1000 µl/ 20 µL = 50
A260/A280 = 1,8
A260 = 1 50 µg/mL d’ADN
Concentration solution d’ADN de départ
30 µg/mL x 50
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
La répartition des électrons à la surface des bases azotées n’est pas uniforme
molécules polarisées.
N
N
R
1 2
3 4
5
6
O
O
CH3/H
H
H
T/U
-0,49
-0,45
+0,19
C
H
N
N
R
1 2
3 4
5
6
N
O H
H
H -0,4
+0,22
-0,65
-0,51
+0,2
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
1- Bases azotées C- Densité de charge
N
N
N
N
N
R
1
2 3
4
5 6
7
8
9
H H
A
N
N
N
N
R
1
2 3
4
5 6
7
8
9 N
O
H
H
G
H
-0,55
-0,64 -0,4
+0,2
+0,2
+0,2 -0,51
+0,22
-0,52
-0,51
-0,4
-0,55
+0,2
La répartition des électrons à la surface des bases azotées n’est pas uniforme
molécules polarisées.
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
1- Bases azotées C- Densité de charge
Les densités de charges déterminent les positions et les orientations des liaisons
hydrogène.
La liaison hydrogène est directionnelle i.e. l’interaction est optimale quand les 3 atomes
sont dans l’axe.
Possibilité avec un angle interaction plus faible.
N H O d+ d-
Les flèches expliquent la complémentarité A=T et G≡C. Cependant plusieurs possibilités
de liaisons hydrogène existent : dans la nature, seules certaines interactions sont
retrouvées.
A côté de l’appariement classique A/T et C/G existent des couples G=A ou G=T.
d-
1- Bases azotées C- Densité de charge
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
Nucléotide :
- base azotée
- sucre
- acide phosphorique
Fishel Levin
(1869-1940)
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
2- Nucléosides et nucléotides
A- Liaison avec 2 types de sucres
pentoses sous forme furanique (5 atomes dans le cycle)
D-ribose
1’
2’ 3’
4’
5’
D-désoxyribose (2’-désoxyribose)
HOH2C
OH OH
OH
1’
2’ 3’
4’
HOH2C
OH H
OH
5’
ARN ADN
O O
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
2- Nucléosides et nucléotides
A- Liaison avec 2 types de sucres
O3’
O4’
O5’
C1’ O1
C2’
C3’
C4’
C5’
b
g
d
e
c
H’5’ H5’
n1
n2
n3
n4 n5
C5’ OH
C3’ exo
C3’ endo
C5’ OH
C2’ exo
C5’ OH
C5’
OH
C2’ endo
C2 (pyrimidine)
C4 (purine)
Formes du désoxyribose retrouvées dans l’ADN
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
2- Nucléosides et nucléotides
A- Liaison avec 2 types de sucres
Liaison base-sucre
on obtient une liaison carbone-azote : liaison N-glycosidique
N
N
H
1 2
3 4
5
6
H2O
nucléoside
1’
2’ 3’
4’
5’
O HOH2C
OH OH / H
OH
N
N N
H
1
2 3
4
5 6
8
9
N 7
H2O
OH OH / H
1’
2’ 3’
4’
5’ HOH2C OH O
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2- Nucléosides et nucléotides
A- Liaison avec 2 types de sucres
unité
nucléotidique
O2’
O3’
O4’
O5’
C1’ N
C2’
C3’
C4’
C5’
P
P
a
b
g
d
e
z
c
H’5’ H5’
C
C2 (pyrimidine)
C4 (purine)
n1
n2
n3
n4 n5
2- Nucléosides et nucléotides
A- Liaison avec 2 types de sucres
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
Nucléotide :
- base azotée
- sucre
- acide phosphorique
Fishel Levin
(1869-1940)
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
2- Nucléosides et nucléotides
B- Modification avec l’acide phosphorique
O P OH
HO
O -
H2O
1’
2’ 3’
4’
5’
O HOH2C
OH OH / H
OH
HO
1’
2’ 3’
4’
5’
O CH2
OH OH / H
OH O P O
O -
Liaison phosphoester
2- Nucléosides et nucléotides
B- Modification avec l’acide phosphorique
pKa = 2
pKa = 7
pKa = 10
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désoxycytidine-5’-monophosphate (dCMP) désoxythymidine-5’-monophosphate (dTMP)
1’
2’ 3’
4’
5’
CH2
HO H
O P O
OH
O
1
2 3
4
5 6
H3C
O
1’
2’ 3’
4’
5’
CH2
HO H
O P O
OH
O
3
2 1
6
5 4
NH2
O O
H
- -
N
N O
N
N O
1’
2’ 3’
4’
5’
CH2
HO H
O P O
OH
O
1
2 3
4
5 6
7
8
9
NH2
désoxyadénosine-5’-monophosphate (dAMP) désoxyguanosine-5’-monophosphate (dGMP)
1’
2’ 3’
4’
CH2
HO H
1
2 3
4
5 6 7
8
9
NH2
O
- O
N N
N N
N
N N
NH
O P O
OH
O -
O
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
2- Nucléosides et nucléotides
B- Modification avec l’acide phosphorique
purine
purine
pyrimidine
pyrimidine
pyrimidine
adénine (ADN/ARN)
guanine (ADN/ARN)
thymine (ADN)
uracile (ARN)
cytosine (ADN/ARN)
adénosine
guanosine
thymidine
uridine
cytidine
adénylate
guanylate
thymidylate
uridylate
cytidylate
base azotée type de base nucléoside nucléotide
Le préfixe désoxy- ou désoxyribo- est ajouté aux nucléosides ou nucléotides qui comportent du désoxyribose. Le préfixe ribo- est ajouté aux nucléosides ou nucléotides qui comportent du ribose.
2- Nucléosides et nucléotides
C- Nomenclature
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
3- Structure spatiale
A- Association des nucléotides dans un acide nucléique
5’ pTpGpApC 3’
TgAC
TGAC
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
Francis Crick
(1916 - 2004)
James Watson
(1928- )
Rosalind Franklin
(1920-1958)
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
3- Structure spatiale
B- Complémentarité des bases
3- Structure spatiale
B- Complémentarité des bases
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Appariement de Watson et Crick
A T C G
10 pb
3,4 nm
0,34 nm
ADN B
petit
sillon
grand
sillon
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
3- Structure spatiale
C- Double hélice/Propriétés
grand sillon
petit
sillon
phosphate
ADN B
Vue de dessous
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
3- Structure spatiale
C- Double hélice/Propriétés
QUIZZ Quelle est la longueur d’une molécules d’ADN humaine?
Nombre de paires de base dans un génome humain : 3 milliards.
L’Homme est un être diploïde.
Distance entre 2 paires de bases successives : 0,34 nm.
A- 2 km
B- 200 m
C- 2 m
D- 20 cm
E- 20 mm
REPONSE
Longueur d’une molécule d’ADN
3 109 pb x 0,34 10-9 m/pb
Longueur totale
2 copies x 1 m
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
3- Structure spatiale
C- Double hélice/Propriétés
DENATURATION
Chauffer un ADN double brin rompt les liaisons
hydrogène et modifie la capacité d’absorption de
la lumière des bases azotées.
dénaturation renaturation
5’P- A T C G T A -3’OH
3’OH - T A G C A T - 5’P
5’P- A T C G T A -3’OH
3’OH - T A G C A T - 5’P
La séparation est réversible, la molécule d’ADN
peut se reformer à l’identique en faisant diminuer
lentement la température du milieu.
Une augmentation de l’absorption de lumière U.V.
(effet hyperchrome) permet le suivi du phénomène
par spectrophotométrie.
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
3- Structure spatiale
C- Double hélice/Propriétés
3- Structure spatiale
C- Double hélice/Propriétés
DENATURATION
230 240 250 260 270 280 290 300 0,0
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
ADN E. coli 25°C ADN E. coli 80°C
Longueur d’onde (nm)
Abs
orba
nce
hyperchromicité
ADN E. coli
10 20 50 60 70 80 90 100 0,40
0,50
0,48
0,46
0,44
0,42
Température (°C)
Abs
orba
nce
(260
nm
)
30 40
Tm = 48°C
L’ADN double brin chauffé à 100°C est dénaturé sous forme de 2 ADN simples brins.
1- On laisse la température du tube redescendre lentement, puis à température
ambiante, on remesure l’absorbance à 260 nm : on retrouve la valeur d’absorbance
initiale avant chauffage.
2- On dépose le tube sur de la glace, l’absorbance à 260 nm n'a pas changé : on
retrouve la valeur d’absorbance après chauffage.
L'ADN s'est ré-apparié, il s'est renaturé.
L'ADN est resté dénaturé.
10 20 50 60 70 80 90 100 0,40
0,50
0,48
0,46
0,44
0,42
Température (°C)
Abs
orba
nce
(260
nm
)
30 40
Le Tm augmente avec le pourcentage de GC
ADN1 ADN2 ADN3
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3- Structure spatiale
C- Double hélice/Propriétés
RESPIRATION DE L’ADN
A des températures inférieures au Tm, l’ADN double brin est
globalement stable. Cependant, il se produit des dissociations sur un
nombre limité de paires de bases.
Ces dissociations sont dues à des rotations de liaisons au sein du
cycle furane des désoxyriboses ou des liaisons N-glycosidiques.
Ces phénomènes sont rapides (1 µs environ) et permettent les
interactions entre molécules, insertions de molécules intercalantes,
transitions locales ADN B et autres types d’hélice.
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
3- Structure spatiale
D- Modifications chimiques des acides nucléiques
La cytosine peut être méthylée sur son carbone 5.
La désamination de la cytosine méthylée donne une thymine, base
normale de l’ADN.
Ceci peut entrainer l’apparition d’une mutation.
Chez les eucaryotes, les ARN messagers,
subissent une modification de leur extrémité 5‘ afin
de les protéger contre la dégradation par des
exonucléases.
L’addition d'une 7-méthylguanosine sur le premier nucléotide de l'ARN, par
une liaison 5'-5' triphosphate s’appelle la coiffe. Les deux premiers riboses de
l'ARN transcrit subissent aussi une méthylation de leur fonction alcool en 2‘.
O
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
4- Des nucléotides remarquables : ATP, AMPc et GMPc
liaison phosphoester
Dans les cellules, les nucléosides sont retrouvés sous formes mono, di- et triphosphates.
adénine
adénosine
AMP ou adénylate
ADP
ATP
pKa = 7
La valeur du pKa de la seconde fonction acide du dernier acide phosphorique est de 7,
donc à pH 7, on a 50% de forme protonée, 50% de forme déprotonée.
liaisons anhydride d’acide
1’
2’ 3’
4’
5’
CH2
HO OH
O
O
1
2 3
4
5 6
7
8
9
NH2
- O
N N
N N
O
O -
O
O -
pKa = 2
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
HO P O P O P O
1 5 6
NH2
N 7
8
N
1’
2’ 3’
4’
5’
O OH
2 3
4 9
O N N
O
P
O
O =
- AMPc
1 5 6
NH2
N
H 7
8
N
1’
2’ 3’
4’
5’
O OH
2 3
4 9
O N N
O
P
O
O =
- GMPc
O
L'AMP cyclique (AMPc) et le GMP cyclique (GMPc), font
partie des messagers secondaires.
L'AMPc est produit à partir d'ATP par l'adénylate cyclase, le
GMPc dérive du GTP grâce à la guanylate cyclase.
AMPc et GMPc activent des enzymes comme les Protéines
Kinases A ou G qui sont des activateur du métabolisme
cellulaire.
AMPc et GMPc sont dégradés par certaines
phosphodiestérases qui sont inhibées par la caféine et la
théine.
4- Des nucléotides remarquables : ATP, AMPc et GMPc
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
3’
5’
1’
2’
4’
CH2
OH H
O P O
OH
O - O
3
2
1
6
5
4 CH3
H
N
N O
O
H
Thymine (T)
3’
5’
1’
2’
4’
- O-P-O-P-O-P-O-CH2
OH H
O
1
2
3
4
5
6 7
8
9
O
H
H
H
H
N
N
N
N N
Guanine (G) O - O - O -
O O O
a b g
3’
5’
1’
2’
4’
CH2
O H
O P O
OH
O
3’
5’
1’
2’
4’
CH2
OH H
O P O
O
-
- O
O
1
2
3
4
5
6 7
8
9
O
H
H
H
H
N
N
N
N N
3
2
1
6
5
4 CH3
H
N
N O
H
Thymine (T)
Guanine (G)
O
PPi a
On a vu l’addition d’un nucléotide en 3’-OH…
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
3’
5’
1’
2’
4’
CH2
H H
O P O
OH
O - O
3
2
1
6
5
4 CH3
H
N
N O
O
H
Thymine (T)
3’
5’
1’
2’
4’
- O-P-O-P-O-P-O-CH2
OH H
O
1
2
3
4
5
6 7
8
9
O
H
H
H
H
N
N
N
N N
Guanine (G) O - O - O -
O O O
a b g
3’
5’
1’
2’
4’
CH2
O H
O P O
OH
O
3’
5’
1’
2’
4’
CH2
OH H
O P O
O
-
- O
O
1
2
3
4
5
6 7
8
9
O
H
H
H
H
N
N
N
N N
3
2
1
6
5
4 CH3
H
N
N O
H
Thymine (T)
Guanine (G)
O
PPi a
Que se passe-t-il si il n’y a pas de 3’-OH ?
La réaction ne peut avoir lieu….
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
O -O-CH2
OH
H H
H
H
B O
-O-CH2
H
H H
H
H
B
ddATP
ADN à séquencer
ADN polymérase I
amorce complémentaire (excès)
mélange des 4 dNTPs (dont 1 radioactif)
1 ddNTP différent selon le tube
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
L’idée…
ddTTP ddCTP ddGTP
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
G C A T G G G C A T G A G C T 5’ 3’
C C T T C T C C C G A G A G A 5’ 3’
G C A T G G G C A T G A G C T 5’ 3’
C C T T C T C C C G A G A G A 5’ 3’
5’ 3’ amorce
Chauffage
Diminution de température
Excès!!
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif. Regardons le tube contenant du ddCTP (ddCTP/dCPT = 0,01).
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
5 amorce
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
’ 3 ’
ddCTP
5 ’
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
5 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
5 ’ G
ddCTP
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
C
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
5 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
5 ’ G
Si le tube contient 1% de ddCTP et 99 % de dCTP :
- Dans 1 % des molécules, un ddCTP sera incorporé, puis le brin ne
s’allongera plus
- Dans 99 % des molécules, un dCTP sera incorporé : la réaction peut
continuer
dd G
ddCTP
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
C
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
G A
dd G
ddCTP
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
5 ’ 5 ’
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
T C
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
G A
dd G
ddCTP
5 ’ 5 ’
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
T C
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
G A G
G dd
dd T C G A G
ddCTP
5 ’ 5 ’
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
C T C
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
G A G
G dd
dd T C G A G
ddCTP
5 ’ 5 ’
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
C C T C
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
G A G
G dd
dd T C G A G
dd C T C G A G
ddCTP
5 ’ 5 ’
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
C C C T C
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
G A G
G dd
dd T C G A G
dd C T C G A G C C T C G A G dd
ddCTP
5 ’ 5 ’
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
C C C T C
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
G A G
G dd
dd T C G A G
dd C T C G A G C C T C G A G dd
A
ddCTP
5 ’ 5 ’
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
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5- Séquençage de l’ADN et PCR
C T C C C T C
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
G A G
G dd
dd T C G A G
dd C T C G A G C C T C G A G dd
A
ddCTP
dd T C C C T C G A G A
5 ’ 5 ’
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
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5- Séquençage de l’ADN et PCR
C T C C C T C
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
G A G
G C
C T C G A G
C C T C G A G C C T C G A G C
A A
ddCTP
G dd
dd T C G A G
dd C T C G A G C C T C G A G dd
dd T C C C T C G A G A
5 ’ 5 ’
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
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5- Séquençage de l’ADN et PCR
T C T C C C T C
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
G A G
G C
C T C G A G
C C T C G A G C C T C G A G C
A A
ddCTP
G dd
dd T C G A G
dd C T C G A G C C T C G A G dd
dd T C C C T C G A G A
5 ’ 5 ’
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
T C T C C C T C
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
G A G
G C
C T C G A G
C C T C G A G C C T C G A G C
A A G
ddCTP
G dd
dd T C G A G
dd C T C G A G C C T C G A G dd
dd T C C C T C G A G A
5 ’ 5 ’
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
C T C T C C C T C
Seul le brin synthétisé (bleu) sera radioactif.
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G C A T G G G C A T G A G C T 5 ’ 3 ’
G G C C A A T T G G G G G G C C A A T T G G A A G G C C T T 5 ’ 3 ’
G A G
G dd
dd T C G A G
dd C T C G A G C C T C G A G dd
A A G
ddCTP
dd T C C C T C G A G A
dd T C T C C C T C G A G A A G
5 ’ 5 ’
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
G 5’
dd
C T G A G 5’
dd
C T T C T C C C G A G A G A 5’
dd
G 5’
dd G G
5’
dd
C T G A G 5’
dd C C T T G G A A G G
5’
dd
C T T C T C C C G A G A G A 5’
dd C C T T T T C C T T C C C C C C G G A A G G A A G G A A
5’
dd
C T A G 5’
dd
T C T C C C A G A G 5’
dd
C T T C T C C C A G A G A 5’
dd
C T A G 5’
dd
C C T T A A G G 5’
dd
T C T C C C A G A G 5’
dd
T T C C T T C C C C C C A A G G A A G G 5’
dd
C T T C T C C C A G A G A 5’
dd
C C T T T T C C T T C C C C C C A A G G A A G G A A 5’
dd
C T C C C A G A G 5’
dd
C T C T C C C A G A G A 5’
dd
C A G dd
5’
C T C C C A G A G 5’
dd C C T T C C C C C C A A G G A A G G
5’
dd
C T C T C C C A G A G A 5’
dd C C T T C C T T C C C C C C A A G G A A G G A A
5’
dd
C A G dd
5’ C C A A G G
dd
5’
C G 5’
dd
C T C G A G 5’
dd
C T C C G A G 5’
dd
C T C C C G A G 5’
dd
C T C T C C C A G A G 5’
dd
C C T T C T C C C G A G A G A 5’
dd
C G 5’
C C G G 5’
C T C G A G 5’
dd
C T C G A G 5’
C C T T C C G G A A G G 5’
dd
C T C C G A G 5’
dd
C C T T C C C C G G A A G G 5’
dd
C T C C C G A G 5’
dd
C C T T C C C C C C G G A A G G 5’
dd
C T C T C C C A G A G 5’
dd
C C T T C C T T C C C C C C A A G G A A G G 5’
dd
5’
dd
5’
dd
C C T T C T C C C G A G A G A C C C C T T T T C C T T C C C C C C G G A A G G A A G G A A
dd
Séquences obtenues dans chaque tube.
ddATP ddTTP ddCTP ddGTP
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
V- Séquençage de l’ADN et PCR
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5’
3’ G T A C T A C
C C
G T A
C
C G
A T C G -
+
C C T T C T C C C G A G A G A 5’
Séquence du brin complémentaire Autoradiogramme d’un gel de séquence
d’ADN (polyacrylamide)
≈3-400 bases / gel
Lec
ture
du
bri
n c
om
plé
men
tair
e d
e 5’
vers
3’
Séparation des molécules
marquées par PAGE.
Méthode enzymatique de Frederick Sanger
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
LA PCR : LA PHOTOCOPIEUSE A ADN
Sur une scène de crime parfois les quantités de matériel biologiques sont
faibles.
Comment arriver à avoir suffisamment de matériel pour en tirer des
empreintes génétiques?
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
Il a reçu le prix Nobel de chimie de 1993 pour la découverte de la réaction de polymérisation en chaîne .
Kary Bank Mullis
LA PCR : LA PHOTOCOPIEUSE A ADN
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
La PCR comment ca marche?
LA PCR : LA PHOTOCOPIEUSE A ADN
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
D
H A
1 cycle
LA PCR : LA PHOTOCOPIEUSE A ADN
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
A chaque cycle, la quantité d’ADN présente dans le tube est doublée.
N cycles : quantité initiale x 2N
En fin de PCR l’enzyme (Taq polymérase) a de moins en moins de substrat pour fonctionner
et le rendement de réaction diminue (<2).
LA PCR : LA PHOTOCOPIEUSE A ADN
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
EMPRUNTES GENETIQUES
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
L'empreinte génétique repose sur le fait suivant : bien que deux humains aient une large
majorité de leur patrimoine génétique identique, un certain ensemble de séquences dans
leur ADN reste spécifique à chaque individu (en raison du polymorphisme).
PCR en temps réel utilisant du SYBR Green comme sonde.
LA PCR QUANTITATIVE
M1 Radiophysique Médicale et Génie Biomédical
5- Séquençage de l’ADN et PCR
Méthode des DD Ct
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