Outils biologiques hématologiques 1) Morphologie 2) Cytométrie en flux –immunophénotype...

Outils biologiques hématologiques

• 1) Morphologie

• 2) Cytométrie en flux– immunophénotype– cycle cellulaire

• 3) Cytogénétique conventionnelle et moléculaire

• 4) Biologie moléculaire

1) Morphologie

• Frottis sanguin

• myélogramme

• cytochimie

2) Cytométrie en flux• Technologie permettant de faire défiler des cellules à

grande vitesse dans le faisceau d ’un laser• la lumière ré émise (diffusion ou fluorescence)

permet de classer la population suivant différents critères et de les trier

• la lumière diffusée renseigne sur le contenu de la cellule (granularité)

• la lumière absorbée proportionnellement au diamètre de la cellule (taille)

• la fluorescence est apportée par un fluorochrome qui absorbe l ’énergie du laser et émet une fluorescence dans une longueur d ’onde différente– fluorochrome avec affinité pour l ’ADN (contenu en

ADN)– fluorochrome fixé sur un anticorps

Cytomètre en flux

• De 1 à 8 Ac incubés avec les cellules

Applications de la cytométrie en flux: 1) immunophénotypage

• Couplage d ’un fluorochrome sur un Ac• si l ’ Ac se fixe sur une cellule: mise en

évidence de l ’expression de l ’antigène• il existe une batterie de fluorochromes émettant

à des longueurs d ’onde différentes (couleurs)• les analyseurs peuvent étudier jusqu ’à 8

couleurs simultanément, donc 8 marqueurs potentiellement

• permet de déterminer la densité antigénique à la surface (ou intracytoplasmique) des cellules

Spécificité des marqueurs

• Marqueur pan-leucocytaire: CD45• cellules immatures: CD34, CD117, HLA-DR,

TdT• cellules myélo/monocytaires: CD13, CD33,

CD11b, CD15, CD65• lignée plaquettaire: CD4, CD61, CD42b• lymphocytes B: CD19, CD20, CD22, CD10• plasmocytes: CD38, CD138• lymphocytes T: CD3, CD4, CD8, CD5, CD2,

CD7• cellules NK: CD16, CD56, CD57

• Permet le diagnostic des formes pour lesquelles la morphologie seule est insuffisante:– cellules indifférenciées (blastes)– cellules lymphoïdes (score de Matutes)

• appartenance à une lignée• Évalue le degré de différenciation cellulaire• diagnostic des HPN (expression CD55 et CD59 sur GR et

PN)• étude des sous-populations lymphocytaires (CD4 / CD8)• sensibilité 1/1000: maladie résiduelle• recherche des cibles thérapeutiques:

– rituximab – Mabthera® (anti-CD20)– Alembtuzumab –Campath® (anti-CD52)– gemtuzumab (anti-CD33)

Exemple d ’une leucémie lymphoïde chronique:

CD5+ CD19+ kappa

Applications de la cytométrie en flux: 2) Contenu en ADN

• Utilisation de précurseurs fluorescents des bases nucléaires s'incorporant dans le DNA – 5-bromo-deoxyuridine ou BrdU– 5-iodo-deoxyuridine ou IdUrd

Cytogénétique

• Conventionnelle: caryotype

• moléculaire: – FISH– multi-FISH– peinture chromosomique

Cytogénétique: 1) Caryotype• réalisé sur sang, moelle ou ganglion• mise en culture de l’échantillon en milieu

nutritif (avec ou sans agents mitotiques)• durée variable 24H ou 48H, parfois 72H• blocage des métaphases• choc hypotonique des cellules: éclatement

de la membrane nucléaire• fixation étalement sur lame, coloration et

analyse au microscope: bandes chromosomiques

• au moins 20 métaphases analysées

ORIGINE GENETIQUE ACQUISE DES LEUCEMIES :REMANIEMENTS

CHROMOSOMIQUES (DE L'ADN)

CONSEQUENCES MOLECULAIRES DESREMANIEMENTS

CHROMOSOMIQUES :MODIFICATION DE GENES CIBLES

=>ACTIVATION D'ONCOGENES =>INACTIVATION DE GENES SUPPRESSEURS DE TUMEUR -(ANTIONCOGENES)

2) Cytogénétique moléculaire:FISH

• Hybridation in situ fluorescente (FISH)• Visualisation de la région chromosomique

couverte par la sonde: – à l ’échelle d ’un gène (qq dizaines de kilobases)– à l'échelle d ’un chromosome: peinture

chromosomique

• plusieurs couleurs possibles: permet de mettre en évidence des anomalies précises au niveau génomique: ex bcr-abl

Caryotype (cytogénétique conventionnelle)

IGH/MALT1 t(14;18)(q32;q21) IGH/CCND1

Peinture chromosomique

Multi-FISH

Outils moléculaires: PCR +++

• PCR standard • PCR quantitative

sonde fluorescente

Place des analyses moléculaires

• A la différence du caryotype, chaque PCR ne détecte qu ’une et une seule anomalie

• intérêt: pas tant sur le diagnostic (cytogénétique) que sur le suivi: maladie résiduelle

• problème: plusieurs centaines d’anomalies caractérisées

• PCR développées sur les anomalies les plus fréquentes

• examens guidés par les données de la cytogénétique (partenaires de MLL par ex)

Fin du diaporama, des exemples suivent

Hémopathies lymphoides chroniques

LLCLLC

Manteau

Burkitt

L. Folliculaire L. Grandes cell

1) Hémopathies chroniques lymphoïdes B

Tous ont réarrangé leur Ig + anomalies spécifiques

Identification du réarrangement clonal IgH:

•Différentes familles de segments V•Différentes familles de segments J:Plusieurs types de PCR nécéssaires (séquences consensus)

•variabilité clonale

(mutations): absence de détection (10%)Perte du clone pendant l’évolution

LNH du manteau et expression de la cycline D1

• Non exprimée dans les lymphocytes normaux

• Conséquence moléculaire de la t(11;14)(q12; q32) (70% des cas au caryotype)

• Non spécifique du lymphome du manteau:– Leucémie

Prolymphocytaire B

– Myélome

– SLVL

CCND1CCND2CCND3

02-0

20

02-0

21

02-0

22

NE

G C

TR

LP

OS

CT

RL

Sa positivité (taux significatifs) élimine le diagnostic de LLC

Hémopathies lymphoïdes chroniques T: Détection des RR du TCR

• Chronologie des réarrangement TCR– TCR , puis TCR,

TCR en dernier

• Stratégies diagnostiques biologique: – Détection RR et

• Détection d’un clone T (minoritaire)– faux positif?– Clone Réactionnel?– Faible variabilité (V

gamma du sujet agé)Pas de translocations analysables par PCR

Intérêt de la bio. mol. au diagnostic

• 1) mise en évidence d ’une anomalie génétique– en cas de classification difficile:

• Mise en évidence d’une translocation spécifique– IgH-Bcl2, NPM-ALK, …

• Détection de l’expression anormale d’un gène– CCND1

– Point de départ pour l’étude de la maladie résiduelle

• 2) étude de la clonalité lymphoïde:– Étude du profil des réarrangements IgH/TCR

– doute sur une hyperplasie réactionnelle

– pathologies inflammatoires

Syndromes myéloprolifératifs

•LMC

•Splénomégalie myéloïde

•Maladie de Vaquez

•Thrombocytémie essentielle

•LMMC

•t(9;22)(q34;q11): fusion

entre extrémité 5’ de BCR

et 3’ d’ABL•Points de cassure:-dans ABL: intron 1 ou 2-dans bcr:

M-bcr: p210 (b2a2 b3a2)

m-bcr p190 (e1a2)

µ-bcr: p230 (e19a2)•Récemment:

- p200 (e8-int-a2)

Leucémie myéloïde chronique

Utilité de la biologie moléculaire dans la LMC

• Diagnostique (+/-) dans les formes complexes– SMP atypique cytologiquement

– Phi masqué (CG conventionnelle)

• Pronostique: quantification– cinétique de disparition du transcrit: pronostique?

– Maladie résiduelle

– nouvelles thérapeutiques (STI)

– greffes

Bio. Mol des autres syndromes méloprolifératifs

• Pas de marqueur clonal (cellules non lymphoïdes) <=> nouveau marqueur JAK2– >90% des polyglobulies primitives– 50% de TE et des MF

• Analyse de l ’inactivation de l ’X peu (pas) employée:– techniques lourdes– réalisables uniquement chez la femme– démontré dans 70% des cas de SMP– faux positifs 25-50% des femmes agées

Leucémies aigues

Lymphoblastiques

Myéloblastiques

LA myéloblastiques• Classification WHO:

– anomalies récurrentes: translocations +++

• t(15;17) (PML RARA) 5 - 8% / (LAM3)

• t(8;21) (AML1- ETO) 5 - 12% / (LAM2)

• inversion du 16 (CBF-MYH11) 10-12% (LAM4)

• anomalies du 11q23: MLL 5-6% (LAM0-5)

– Autres: classification FAB– + dysplasie– LA de lignée ambiguë

RT-PCRs spécifiques développées

LA lymphoblastiquesanomalies chromsomiques

(oncogéniques)• LAL-B

– t(9;22) BCR-ABL

– t(4;11) AF4- MLL

– t(5,14) IL3-IgH

• LAL-T– HOX11 / HOX11L2

– TAL deletion, SIL-TAL

– CALM-AF10

– t(1;19) E2A-PBX1

– t(8;14) cMyc-IgH

– t(12;21) ETV6-AML1

– t(11;14) LMO1/2

– t(1;7) LCK

– Inv14: TCL1

– …

LA lymphoblastiques : réarrangement clonal du récepteur à l ’Ag

• Lignée lymphoïde:– B: réarrangement IgH– T: réarrangement TCR

• Réarrangements illégitimes– Lignée B: réarrangements TCR+++

• = Marqueurs de clonalité, en dehors (ou en plus) d’anomalies détectables

Clonalité lymphoïde et LAL

• Pas d’intérêt diagnostique mais identification au diagnostic+++

• Suivi = maladie résiduelle = quantification– Genescan

– RQ-PCR

• Protocole GOELAL pilote:– Décisionnel à 10-3

Clonalité TCR