Purification, propriétés et spécificité d'une hétéroglycosidase des graines de sarrasin

BIOCHIMIE, 1974, 56, 1305-1313.

Purification, propridtds et spdcificit6 d'une hdtdroglycosidase des graines de sarrasin.

R i c h a r d BOUREOUZE, F l o r e P R A T V l E L - S O S A et F r a n c o i s PERCHERON <~ .

Laboraloire de Chimie Biologique, E.R.A. n ° 99 du C.N.R.S., Facultd des Sciences Pharmaceatiques et Biologiques,

Universitd Ren~ Descartes, 4, Avenue de l'Observatoire, 75006 Paris.

(28-6-1974).

Summary. - - A heteroglycosidase f rom s~edlings of saracen corn has been isolated and purified abou t 1,000 fold. Such a glycosidase ( rhamnodias tase- l ike enzyme) hydrolyses t u r in to rutin.ose (a-L-rhamnosyl 1 - - ) - 6 glucose) and quercetin, the enzymat ic act ivi ty was thus de te rmined w i th p-nitroph6nyl-[3-D-rutinoside as substra te .

The pur i f icat ion involved extract ion, a m m o n i u m sulfa te f rac t iona t ion , eh romatograph ies on hydroxylapa t i t e , DEAE-Sephadex and acryl.amide-agarose Ac-A 4/4. The enzyme hydro- lyzing p-n i t roph~nyl -~-o- ru t inos ide was only pa r t i a l ly purified, bu t successive steps of co lumn ch roma tography and t h e r m a l dena tu ra t i on provided a clear d i s t inc t ion beetween th i s heteroglycosidase and the other glycosidases, especially ~-glucosidases and ~Ngalacto- sidases of ge rmina t ing kernels of saracen corn.

The molecula r weight of th i s heteroglycosidase, calculated f rom data obta ined by disc gel e lect rophoresis was about 85,000. Isoelectric focusing es tab l i shed the isoelectric poin t to be 3.7.

Heteroglycosidase exibi ts a b road speci f ic i ty ; the catalyt ic act ivi ty was observed to be specific for holosidic and heterosidic bonds w i th the same configurat ion as ~-a-glucosyI residue for carbon atom, s 1, 2 and 3. The Km at pH 5 was calculated to be 2.6 X 10-4 M for p-n i t rophenyl -~-D-rut inos ide ; 8.8 × 10-5 M for p-ni t rophenyl-~-n-glucos ide and 8.6 × 1'0-5 M for p-ni trophenyl-~-D-galactoside. The range of ac t iv i ty was very broad, ex tending to the cleavage of disaceharides, var ious flavonoid and re la ted phenol ic glycosides, and amyloids .

At the present t ime the func t ions of th i s heteroglycosidase can on ly be a m a t t e r of conjectures.

I N T R O D U C T I O N .

E n 1926, B r i d e l e t C h a r a u x [1] chez d i v e r s Rhamnus s i g n a l ~ r e n t la p r 6 s e n c e d ' u n e ac t i v i t 6 ~ - g l u c o s i d a s i q u e p a r t i c u l i 6 r e , h y d r o l y s a n t c e r t a i n s h 6 t 6 r o s i d e s n a t u r e l s a v e c l i b 6 r a t i o n d ' u n d i s a c c h a - r i d e ; p a r e x e m p l e , le r u t o s i d e es t h y d r o l y s 6 e n q u e r c 6 t o l e t r u t i n o s e ( a - L - r h a m n o s y l 1 - - ~ - 6 g lucose ) .

La ¢ r h a m n o d i a s t a s e >> de B r i d e l e t C h a r a u x se r6v61a u t i l e en p h y t o c h i m i e p o u r la r e c h e r c h e des h 6 t 6 r o s i d e s h s u c r e s c o m p l e x e s , c o r r e s p o n d a n t e n ce la h la m 6 t h o d e de B o u r q u e l o t et H 6 r i s s e y p o u r la r e c h e r c h e de s ,~-glucosides a v e c la ~ - g l u c o s i d a s e d ' a m a n d e . E n d e h o r s d u g e n r e Rhamnus, des ac t i - v i t6s h 6 t 6 r o g l y c o s i d a s i q u e s o n t 6t6 d6ce l6es c h e z u n g r a n d n o m b r e d ' e s p ~ c e s v~g6 ta les [2-5] ; les << r u t i n a s e s >> [6, 7] et << a n t h o c y a n a s e s >> [8-10] de d i v e r s AspergiIlus s o n t 6 g a l e m e n t h r a p p r o c h e r de la << r h a r n n o d i a s t a s e >>. C e p e n d a n t ce t y p e d ' a c t i - v i t6 e n z y m a t i q u e d e m e u r a i t rea l c o n n u ; en p a r t i -

A qui route correspondance doit ~tre adress6e.

cu l i e r , m a l g r 6 les t r a v a u x de S u z u k i en 1962 [2], u n p r o b l b m e n o n r 6 s o l u r e s t a i t de s a v o i r si les e x t r a i t s e n z y m a t i q u e s b r u t s r e n f e r m a i e n t u n e h6t6- r o g l y c o s i d a s e s t r i c t e , r e s p o n s a b l e de l ' h y d r o l y s e de s u b s t r a t s te ls le r u t o s i d e , ou u n e ~ -g lucos ida se de l a r g e sp6ci f ic i t6 .

N~ous a v o u s d6ce ld u n e ac t i v i t 6 h 6 t 6 r o g l y c o s i - d a s i q u e d a n s les g r a i n e s g e r m 6 e s de s a r r a s i n . Afin de s u i v r e la p u r i f i c a t i o n de ce t t e a c t i v i t 6 e n z y m a - t ique , n o u s a v o n s e f fec tu6 la s y n t h 6 s e d ' u n sub- s t r a t p l u s s o l u b l e que les h 6 t 6 r o s i d e s n a t u r e l s : le p - n i t r o p h 6 n y l ~ 8 - D - r u t i n o s i d e [11], h o m o l o g u e d u r u t o s i d e p o u r la p a r t i e g l u c i d i q u e . Le b u t de ce t r a v a i l a 6t6 l ' i s o l e m e n t .el la c a r a c t 6 r i s a t i o n de ce t te h 6 t 6 r o g I y c o s i d a s e , p u t s l ' 6 t ude de q u e l q u e s - u n e s de ses p r o p r i 6 t 6 s .

M A T E R I E L E T M E T H O D E S .

Produits: l es g r a i n e s de s a r r a s i n (Fagopyrum esculentum, M., P o l y g o n a c 6 e s ) o n t 6t6 f o u r n i e s p a r la m a i s o n V i l m o r i n , P a r i s .

130.6 R. Bourbouze, F. Pratviel -Sosa el F. Percheron.

Le DEAE-Sephadex A50 p.rovient de Pha rma c i a , l ' a c ry l amide -aga rose AcA 4/4 de l ' I ndus t r i e Bio- logique F ranca i se .

Les s u b s t r a t s : p -n i t roph6nyl~-D-g lucos ide et p-ni t roph6nyl-~-D-galactoside sont des p rodu i t s Sigma.

Mesure des activit~s enzgmatiques : le mi l ieu d ' i ncuba t ion c o m p r e n d : 0,1 ml de subs t ra t 5 mM (ary lg lycos ides nitr6s du commerce ou synth6- tis6s),, 0,025 ml de t ampon phospha te dis odique 0,2 M-acide c i t r ique 0,1 M de pH 5, 0,05 ml de p r6pa ra t ion enzymat ique . Aprbs un temps d ' incu- bar ton ~t 37°C varian¢ suivant le subst ra t util is6 et le s tade de la pur i f ica t ion , la r6act ion enzyma- t ique est arr~t6e p a r add i t i on de 1 ml de Na2CO 3 0,2 M e t l ' in tensi t6 de la co lo ra t ion jaune que d6- ve loppe le p -n i t roph6no l est mesur6e h 400 nm.

L 'ac t iv i t6 sp6cifique est expr im6e en unit6s cor- r e spondan t aux !~moles de subst ra t t rans form6 / m n ~rag de prot6ines .

Dosage des protdines : pa r la m6thode de L o w r y [12], l '6 ta lonnage 6tant r6alis6 avee de ia s6rum a lbumine bovine.

Aprbs 24 h d ' i ncuba t ion h 45°C, le mi l ieu r6ac- t ionnel est ch roma tog raph i6 sur p a p i e r (Schle icher et Schfill) avec le systbme solvant n -bu tano l -pyr i - d ine-eau ( 9 : 5 : 4 v /v) .

Les oses l ib6r6s sont r6v616s p a r pu lv6r i sa t ion d 'un m61ange d 'une solut ion 6thanol ique d 'o-ph6- ny lbned iamine (200 mg dans 30 ml) et d 'une solu- t ion aqueuse d ' ac ide oxal ique (1 g dans 20 ml), et chauffage ~ 80°C.

Pour p r6c i se r la c in6t ique de l ' a t taque de cer- rains h6t6rosides, des pr61bvements h des temps var iab les du mi l ieu r6ac t ionne l sont ch romatogra - phi6s sur p,laques. Chromatograph ie sur p laques de gel de s i l ice (Schle icher et Schiill) avec le syst~me solvant ac6tate d '6 thy le -ac ide ac~tique- m6thanol-eau (60 : 15 : 15 : 10 v /v) ; r6v61ation p a r une solut ion 6 lhanol ique d ' ac ide sul fur ique 5 p. cent et chauffage fi 80°C. Chroma tog raph ie sur p laques de m i c r o p o l y a m i d e (Schle icher et Schiil l F 1 500) avec le syst~me so]vant m6thanol- ac ide ac6t ique-eau ( 1 9 : 1 : 1 v /v ) ; r6v61ation p a r une solut ion de ch lo ru re d ' a lumin ium fi 5 p. cent darts le m6thanol et lcs p laques sont observ6es sous une lampe U.V.

Chromatographle sur colonne d'hgdroxylapa- tire: l ' h y d r o x y l a p a t i t e a 6t6 pr6par6e selon un pro toco le d6riv6 de celui de TiseIius, Hjer ten et Levin [13].

Electrophor~se en gel de polyacr~llamide : selon Ia m6thode d 'Orns te in et Davis [14, 15], pour une concen t ra t ion finale en a c r y l a m i d e d.e 7,5 p. cent clans le t amoon Tr i s -g lyc ine de pH 8,5, appa re i l A c r y l o o h o r (Ets. Pleuger , Par is ) : 160 volts, 5 mA p a r tube, 20 mn ~ + 4°C. B6v61ation pa r le bl'eu de Coomassie.

Les gels dest in6s au reD6rage de l 'act ivi t6 enzy- mat ique sont sect ionn6s ~ l ' a ide d 'un d6coupeur , e n disques de 1,5 mm d '6ua isseur ; ceux-ci sont ensui te in t rodu i t s darts le mi l ieu d ' i ncuba t ion hab i - tuel.

Electrofocalisation: la d6 te rmina t ion du po in t iso-61ectrique a 6t6 effectu6e dans une colonne LKB 8 100 de 110 ml de capaci t6 avec un g rad ien t d ' ampho ly t e s de pH 3,0 ~ 6,0 ~ la concen t ra t ion de 2 p. cent.

Essais enzymatiques: l~our les essais d ' h y d r o - lyse enzymat ique des subs t ra ts naturels , le m6- lange r6ac t ionnel c o m p r e n d : 1 mg d 'h6tbros ide en suspens ion dans 0,075 ml d 'eau, 0,025 ml de t ampon phospha te d i sodique 0,2 M - ac ide c i t r ique f l l M de nH 5, 0:1 m! de p r b p a r a t i o n enzymat ique .

RESULTATS EXPERIMENTAUX.

I . - - PURIFICATION ET CARACTERISATION DE L'ENZYME

HYDROLYSANT LE p-NITROPH]~NYL-~-D-RUTINOSIDE.

Extraction et preparation de l'extrait enzyma- tique.

La p r6pa ra t i on de l ' ex t ra i t enzymat ique com- p rend les phases suivantes : gonflement d.es gra ines (600 g) darts l ' eau p e n d a n t 24 h, puts ge rmina t ion sur coton humide p e n d a n t 3 jours fi la ]umibre et t emp6ra tu re du labora to i re . Les gra ines germ6es sont broy6es dans du t ampon acide ac6tique-ac6- rate de sodimn 0,1 M de pH 5. Aprbs agi ta t ion pe nda n t 2 h le b r o y a t est centr i fug6 & 1000 g p e n d a n t 15 mn et le surnageant abandonn6 une nuit ~ d- 4°C. Apr~s une cen i r i fuga t ion de 30 mn

5 000 g le surn.ageant est amen6 fi 80 p. cent de sa tura t ion en (NH4)2SO 4.

:Les pro t6 ines pr6cipi t6es , r epr i ses p a r de l 'eau disti l l6e, dialys6es et centr i fug6es 45 mn fi 20 000 g cons t i tuent l ' ex t ra i t enzymat ique (162 ml).

L ' ex t r a i t bru~ ainsi obtenu l ibbre du ru t inose p a r t i r du ru tos ide et du p-ni t roph6nyN~-D-rut ino- side, cette act ivi t6 h6 t6roglycos idas ique 6rant asso- ci6e ~ plus~eurs autres glycosidases . Nous notons en p a r t i c u l i e r de trbs fortes act ivi t6s ~-glucosi- das iques et ~-galactosidasiques, estim6es ~ l ' a ide des a ry lg lycos ides ni t r6s co r respondan t s .

BIOCHIMIE, 1974 , 56, n ° 10.

H d t d r o g l y c o s i d a s e d e s

F r a c t i o n n e m e n t sur co tonne d ' h y d r o x y l a p a t i t e .

Les prot6ines de l ' ex t ra i t brut sont adsorb6es sur deux colonnes d 'hydroxy lapa t i t e (2,6 × 20 cm) 6quilibr6es avec un tampon phosphate monopo- tass ique-phosphate dipotassique 0,01 M de pH 6,8, puis f ract ionn6es par 61ution par pa l ie rs /i l 'a ide de tampon phosphate de molari t6s croissantes (fig. 1).

o

\ Eluat (m!)

FIG. 1. - - Chromatographie sur eolonne d'hydroxyl- apatite.

Elution par paliers h l'aide de tampon phosphate monopotassique-phosphate dipotassique pH 6,8 de mo- larit~s croissantes.

Les f ract ions 61u6es par le tampon 0,05 M e t actives sur le p-nitroph6nyN~-D-rutinoside, sont rassembl6es, dialys6es et concentr6es sur mem- brane Diaflo (PM 30. Amicon) jusqu'h un volume de 25 ml.

C h r o m a t o g r a p h i e sur co lonne de D E A E - S e p h a - d e x A50.

L'61uat des colonnes d 'hydroxy lapa t i t e est 6qui- libr6 par dialyse contre du tampon acide ac6tique-

10 3o 50 F rac t ions (N ° )

Fro. 2. - - Chromalographie sur colonne de DEAE- Sephadex A50 dquilibrde avec un tampon acdtate 0,1 M de pH 5.

Elution par un gradient de O h 0,5 Men NaG1 ( - - - ). A - A Activit6 sur le p-nitroph6nylq~-o-rutinoside. n - O Aetivit~ sur le p-nitroph6nyl-~-n-galaetoside. (l'activit6 envers le rutinoside a 6t6 multipli6e par 4).

BIOCHIM1E, 1974, 66, n ° 10.

g r a i n s de s a r r a s i n . 1307

ac6tate de sodium 0,1 M de pH 5, puis pass6 sur une colonne de DEAE-Sephadex A50 (1,6 × 15 cm) 6quilibr6e avec le m6me tampon (fig. 2).

Une f rac t ion de prot6ines non re tenues passe avec le tampon d '6quil ibrage, puis nous instal lons un gradient l in6aire de 0 h 0,5 M e n NaG1 (200 ml dans chaque flacon) et recuei l lons des f rac t ions de 5 ml.

Les f ract ions hydro lysan t le p-nitroph6nyl-B-D- ru t inos ide sont 61u6es pour une molari t6 en NaC1 vois ine de 0,3. Celles-ci sont r6unies, dialys6es et concentr6es jusqu'h un volume de 15 ml.

C h r o m a t o g r a p h i e sur co lonne d 'acry lamide-aga-

rose A c A 4/4 .

Les 15 ml de la f rac t ion DEAE-Sephadex A50 sont concentr6s sur membrane fi l trante (Ultra- gaine Selectron) jusqu'h un volume vois in de 2 ml

/ ,i , \ -x

7 a l o0 150 22e Eluat (ml)

Fro. 3. - - Chromatographie sur colonne d'lndubiose Ac-A ~/~.

Elution par un tampon ac6tate 0,1 M de pH 5. A - A Activit~ sur le p-nitroph6nyl-~-D-rutinoside. A--A Activit~ sur le p-nitroph6nyl-a-L-rhamnoside.

et d6pos6s sur une colonne d ' Indubiose AcA 4/4 (1,5 × 80). L'61ution s 'effectue par un tampon acide ac6tique-ac6tate de sodium 0,1 M de pH 5 avec un d6bit de 10 ml par h, et nous recuei l lons des f ract ions de 3 ml.

Les f ract ions cor respondan t h la plus forte acti- vit6 envers le p-nitroph6nyl-~l-D-rutinoside sont r6unies (21 ml) et const i tuent la f rac t ion h6t6ro- glycosidasique la plus purifi6e (fig. 3). Celle-ci avec une activit6 sp6citique de 1 it~M/mg/mn avec le p-nitroph6nyl-B-D-rutinoside comme substrat, a 6t6 purifi6e 1 040 fois par r appor t h l ' ex t ra i t aqueux, et ceci avec un rendement de l ' o rd re de 2 p. cent.

Les donn6es quant i ta t ives de la pur i f ica t ion sont rassembl6es dans le tableau L

1308 R. Bourbouze , F. Pra tv i e l -Sosa el F. Percheron .

Caractdrisation de l'hdtdroglgcosidase de sar- rasin.

Malgr6 l '61imination au cours des diff6rentes 6tapes de la pur i f ica t ion d 'une ~-glucosidas,e sp6- cifique par passage sur hydroxy lapa t i t e (pic 0,5 M phosphate) [16], et de deux formes mo16culaires de ~-galactosidases par chromatograph ie sur DEAE-Sephadex (fig. 2), nous notons au n iveau de

r6siduelle pr6sentant une constante de d6natura- t ion the rmique iden t ique pour les trois substrats : p-ni t roph6nyl~-D-glucoside, -~-n-galactoside et B-D- ru t inos ide (Ifrg. 4), il est pe rmis de penser que la m6me prot6ine enzymat ique est le suppor t des trois activit6s observ6es.

Cette 6tude met en 6vidence le caract6re non h6t6roglycosidasique strict de l 'h6t6roglycosidase

TABLEAU I .

Principales dlapes de la purif ication de l'h~t~roglgcosidase de sarrasin.

Etapes Prot6ines Facteur Readement totales de purification p. cent

Extractum aqueux . . . . . . . . . . . . . . .

Protdines relargudes par (NH,).,SO 4 h 80 p. cent de saturation . . . . . .

8500 mg

1846 mg

i Activit6 spgci _.._

10,96 x 10 -~ 100

2,37 X I0 -:~ 2,5 53

Hydroxylapatite P ic0 ,5 M Phos- phate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 mg 5,8 X 10 .3 6 9

DEAE-Sephadex A50 . . . . . . . . . . . . 4,8 mg 79 X 10 -:~ 82 6

Indubiose AcA 4/4 . . . . . . . . . . . . . . . 0,105 mg 1 1040 2

la f rac t ion h6t6roglycosidasique la plus purifi6e, une activit6 h~drolysante envers le p-ni t roph6nyl- ~-D-glucoside et le p-ni troph6nyl-~-o-galactoside.

Une exp6r ience de d6naturat ion thernl ique 60°C en fonct ion du temps laisse appara i t re avec le p-nitroph6nyl-~-D-glucoside une rupture de pente caract6r is t ique dans la droi te de d6natu- ra t ion qui met en 6vidence l 'hydro lyse de ce sub- strat par deux prot6ines diff6rentes (fig. 4). A c e stade de la pur i f ica t ion la majeure par t ie de l 'act i- vit6 enwers le p-nitroph6nyl-~-D-glucoside est sup- p ort6e par une :~-glucosidase thermolabi le , rapi- dement d6natur6e h 60°C. L 'act ivi t6 enzymat ique

Los~ 2,3

i i i a t f j

5 10 2 0 3 0 4 5 ~;0 t

FI6. 4. - - Ddnaturation thermique (60°C) en [onetion du temps de la fraction Indubiose Ac-A 4/4.

A - A ActiviSd sur le p-nitrophdnyl~-D-rutinoside. u - - i Activit6 sur le p-nitrophdnyl~-D-glucoside. O--[3 Activit6 sur le p-nitroph6nyl-~-D-galactoside.

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

de sarrasin, et son activit6 catalyt ique envers les glucosides et galactosides ph6noliques.

L,'extrait brut enzymat ique avait laiss6 appa- rai tre, seconda i rement h la l ib6rat ion de rut inose h par t i r du rutoside, un.e hydro lyse du disaccha- r ide en glucose et rhamnose .

Pour suivre cette activit6 a - rhamnosidas ique nous avons pr6par6 du p-ni t roph6nyl-a-L-rhamno- side selon la m6tllode de Westphal et Fe ier [17].

L 'a - rhamnos idase pr6sente le m6me comporte- ment ch romatograph ique que l 'h6t6roglycosidase sur hydroxylapa t i t e et DEAE-Sephadex. Le che- vauctrement des pics d'61ution de ces deux osi- dases sur Indubiose AcA 4/4 n,e pe rmet pas une 61imination totale de l '~-rhamnosidase au dern ie r stade de la pur i f ica t ion (fig. 3).

:Des tentat ives de s6parat ion h l 'a ide d 'autres supports chromatograph iques se sont r6v616es infructueuses, l 'h6t6roglycosidase et l ' a - rhamno- sidase pr6sentant un point iso61ectrique ident ique et des poids mol6culaires t rop proches. En outre, ces deux prot6ines enzymat iques se r6vblent rela- t ivement thermostables [18].

En r6sum6, la f rac t ion h6t6roglycosidasique obtenue la plus purifi6e se t rouve donc contami- n6e par une $-glucosidase et une a-rhamnosidase. La ~-glucosidase, thermolabi le , peut 6tre totale-

Hdtdroglycos idase des grains de sarras in . 13,09

ment d6natur6e par un t ra i tement the rmique de 10 mn h 50°C. Le taux de contamina t ion par l 'a- rhamnos idase est de l ' o rd re de 40 p. cent (vitesses d 'hydro lyse compar6es du p-ni troph6nyl-a-L-rham- noside et du p-nitroph6nyl-~-D-rutinoside), et aucun proc6d6 ne nous a permis de s6parer les deux prot6ines.

H. - - P R O P R I E T E S PHYSICOCHIMIQUES D E L ' H E T I ~ R O G L Y C O S I D A S E D E S A R R A S I N .

Eleetrophor~se en gel de polyacrylamide.

Un contr61e 61ectrophor6tique en gel de poly- ac ry lamide ne laisse appara i t re ~ chaque 6tape de

"I- A

"I- B

"I- B

+

C

7,57. 5,5"/.

FIG. 5 . - Analyse dlectrophordtique des diffdrentes ~tapes de la purification.

Explications dans le texte. - - ~ - Aetivit6 sur le p-nitroph6nyl~-D-rutinoside. ...... )~ Origine.

la pur i f ica t ion qu 'une seule bande active envers le p-nitroph6nyl-~-D-rutinoside ~fig. 5).

Aprbs passage sur DEAE-Sephadex, l 'homog6- n6it6 de la bande prot6ique co r respondan t h l 'acti- vit6 h6t6roglycosidasique est illustr6e par une migra t ion pour des gels h une concent ra t ion finale en acry lamide de 5,5 p. cent ; nous n 'observons pas de d6doublement de eette bande par rappor t aux gels ~ 7,5 p. cent (fig. 5-B).

La f ract ion Indubiose ne r6v~le h l '61ectropho- rbse qu 'une seule bande prot6ique cor respondan t h rae l iv i t6 h6t6roglycosidasique ; bien que cette f ract ion renfe rme une cer ta ine quantit6 d'tt-rham- nosidase (de plus grande migra t ion anodique), la quantit6 de cette dernibre prot6ine est t rop faible pour 6tre r6v616e (fig. 5-C).

Ddtermination dtt poids moldculaire.

Nous avons suivi la m6thode d 'Hedr ick et Smith ~19], les prot6ines servant de r6f6rence 6tant la s6rum albumine sous diff6rents 6tals de polym6ri- sation, l 'ova lbumine et l ' apoferr i t ine .

:~ Log R m

t i * i i | •

10 20 30 40 5 0

FIG. 6 . - D~termination de la masse moldculaire de l'hdtdroglycosidase de sarrasin par analyse dleetro- phor~tique.

A (Log de R~I) : pente des droites repr~sentant la variation du logarithme de Rm en fonction de la con- centration en acrylamide des gels.

Prot6ines servant h l'6talonnage : 10valbumine. 2 S6rum albumine (monombre). 3 S6rum albumine (dim6re). 4 S6rum albumine (trim6re). 5 S6rum albumine (t6tram~reJ. 6 Apoferritine.

Comme l ' ind ique la figure 6, le poids mol6culaire ainsi d6termin6 est vois in de 85.000. Cette esti- mat ion est en accord avec la derni~re 6tape chro- matographique de la purif icat ion. L 'act ivi t6 h6t6- roglycos idas ique a 6t6 61u6e de la colonne d ' Indu- biose AcA 4/4 sous forme d 'un seul pic sym6tr ique dont le coefficient de par tage Kay calcul6 corres- pond h la posi t ion d 'une prot6ine globulaire d 'une masse moldculai re d ' env i ron 90.000 [211].

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

1310 R. Bourbouze , F. Pra tv i e l -Sosa el F. Percheron .

Electrophorbse par focalisation ionique.

En ut i l i sant un gradient de pH 3,0 h 6,0, l 'acti- vit6 envers le p-nitroph6nyl-~-D-rutinoside se foca- lise en un seul pic, dont le po in t iso61ectrique est de 3,7.

III. - - PROPRII~TI~S DE L~HI~T]~ROGLYCOSIDASE

D E S A R R A S I N .

Les propri~t6s de l 'h~t6roglycosidase de sar ras in ont ~t6 6tudi6es sur une prepara t ion ,enzymatique par t ie l lement purifi6e en raison du faible rende- ment des diverses 6tapes chromatographiques.

V

5O

c

3O

10

~00 300 500 700 v/s

Fro. 7. - - Influence de la concentration en substrat sur la oitesse d'hydrolyse des p-nitrophdnyl-~-D-ruti- noside (A) ; p-nitrophdnyl-i~3-D-galactoside (B) ; p-nitro- phdnyl~-D-glucoside (C), par l'hdtdroglycosidase de sarrasin.

Cette puri f icat ion partieHe comprend : passage de l 'extrai t enzymatique sur DEAE-Sephadex dans les condi t ions d6crites pr6c6demment , suivi d ' nn t ra i tement thermique de 10 mn h 50°C. Nous obte- nons ainsi nne pr6para t ion h activit6 h6t6roglyco- sidasique purifi6e c inquante lois, et avec un ren- dement proche de 40 p. cent. Cette pr6para t ion est e:cemp~e des fi-glucosidases et ~-galactosidases sp6cifiques 6galement pr6sentes dans les graines germ6es de sarrasin, et ne renferme que l 'activit6 hydroly t ique propre de l 'h6t6roglycosidase envers

les p-nitroph6nyl-~-D-glucoside et -~-D-galactoside (la ~-glucosidase 61imin6e par passage sur hydro- xylapati te n 'est pas retenue sur DEAE-Sephadex 6quilibr6 avec un tampon ac6tate 0,1 M de pH 5 [16]).

Les impuret6s prot6iques inact ives et l 'a-rham- nosidase pr6sentes dans cette pr6para t ion ne peuvent interf6rer dans l '6tude des propri6t6s cin6- t iques et de la sp6cificit6 de l 'h6t6roglycosidase.

Effecteurs de l'activit~ enzgmatique.

Avec le tampon phosphate-acide ci t r ique l e pH opt imum de t 'hydrolyse du p-nitroph6nyl-~-D-ruti- noside se situe h pH 5,5 ; le syst6me tampon acide ac6tique-ac6tate de sodium ne modifie pas ce pH optimum.

L'E.D.T.A. et le 2-mercapto6thanol h des concen- t ra t ions de 1'0 ~a M ne modif ient pas la vitesse d 'hy- drolyse du p-nitroph6nyI-~-D-rutinoside, et aucun cat ion m6tall ique b ivalent ne semble indispensable

l 'activit6 h6t6roglycosidasique.

Activit~ enzymatique envers les arylglycosides nitr~s.

5~ous avons ~tudi6 l ' inf luence de la concentra- t ion en s.ubstrat sur la vitesse d 'hydrolyse des p-nitroph6nyl-~-D-rutinoside, ~-D-glucoside, et -~-D-galactoside par l 'h6t6roglycosidase h son pH optimum.

La figure 7 rassemble les droites calcul6es ~ par- t ir des points exp6r imentaux selon Ia repr6senta- t ion de Eadie.

Nous n 'avons pu d~terminer la constante cataly- t ique de l 'h6t~roglycosidase pour chaque substrat puisque celle-ci n ' a pas 6t6 obtenue totalement purifi6e ; cependant les parambtres cin6tiques (tableau II) d6termin6s h par t i r d 'un m~me lot enzymatique permet tent des comparaisons rela- tives puisqu ' i ls se rappor ten t h la m6me quanti t6 d 'enzyme.

Les Km obtenus reflbtent une affi~nit6 ident iqne pour le glucoside et le galactoside, celle-ci 6tan[ sup@ieure h celle observ6e pour le rut inoside.

TABLEAU II.

Param~tres cindtiques de l'h~t~roglycosidase de sarrasin.

Substrat V m Km (tO-3,u M/mn) /M) Vm/Km

p-nitroph6nyl-,~-D-glucoside . . . . . . . . . 66 8.8 X 10 -~ 750

p-nitroph6nyl-~-D-galactoside . . . . . . .

p - n i t r o p h ~ n y l - , ~ -D-rut inos ide . . . . . . . .

29 8,6 X 10 -'~ 337

30 2 , 6 /-< 10 -4 112

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

Hdtdrog l ycos ida se des g ra in s de sa r ras in . 1311

Les r a p p o r t s Vm/Km, mei l leurs reflets de la sp6cificit6 d 'une enzyme, la issent a p p a r a i t r e une sp6cificit6 h activit6 no tab lement plus 61ev6e pour les g lycos ides s imples et en p a r t i c u l i e r pou r le p -n i t roph6nyl@D-glucos ide .

Nous soul ignerons l 'act ivi t6 ca ta ly t ique remar - quable de l 'hd t6roglycos idase de sa r ras in pour le p-ni t roph6nyl-g-D-glucoside ; la g-glucosidase sp6cifique 61imin6e p a r passage sur h y d r o x y l a p a - t i te et p r6c6demment purifi6e [16] nous pe rme t t an t sur ce po in t des compara i sons .

L 'h6 tdroglycos idase r6v61e une affinit6 pour ce subs t ra t sup6r ieure/~ celle de la ~-glucosidase dont

Un 6ventai l aussi large que poss ib le d'l16t6ro- s ides na ture ls pe rme t de va r i e r darts l.e substrat , aussi b ien la pa r t i e g luc id ique que r a g l y c o n e ( tableau III) .

Hdtdrosides de monosacchar ides : le sa l icos ide et le v ic ios ide sont hydrolys6s .

Hdt~rosides de disaccharides : l ' a t taque de l ' amygda los ide s 'effectue pr6f~rent ie l lement p a r le glucose t e rmina l . On d6c61e du p runasos ide darts le mi l ieu r6ac t ionne l ; celui-ci est ensui te hyd ro - lys6 ainsi que le gent iobiose a p p a r u h l '6tat de t races.

TABLEAU III.

Hdt~rt~sides naturels utilis~s.

Nom commun Aglycone et subs t i tuants osidiques

Salicoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vicios ide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Amygdaloside . . . . . . . . . . . . . . . . Prunasoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . Querc6tol-3-sophoroside . . . . . . . Peltatoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gfoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vicianoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Robinoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rutoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Naeingoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . Hesp6ridoside . . . . . . . . . . . . . . . . . Anthoeyanoside . . . . . . . . . . . . . . . Xanthorhamnoside . . . . . . . . . . . . Catharticoside . . . . . . . . . . . . . . . . H6tdroside de Populns . . . . . . . . .

Salig6nol- a~-D-glucoside Diamino-2,4-oxy-f-pyrimidine-5-~-D- glucoside Mand¢lonitrile-[~-D-glueosyl (1--~-6)] ~-D-glucoside Mand61onitrile-~-D-glucoside Querc6tol-3-[ ~-D-glucosyl (1-~,-2)]-~-D-glucoside Quercfitol-3-[a-L-arabinosyl (1--)-6)]-~-D-glucoside Eug6nol-[a-L-arabinosyl (1--~ 6)l-~-D-glucoside Manddlonitrile-[a-L-arabinosyl (1--~6)] ~-D-glucoside Kempf6rol-3-[a-L-rhamnosyl (1--~-6)] ~-D-galactoside Querc6tol-3-La-L-rhamnosyl (1-~6)] ~'--D-glucoside Naring6nol-7-[a-L-rhamnosyl (1--~2)] ~-D-glucoside Hesp6r6tol-7-[a-L-rhamnosyl (1 --~,- 6)]- ~D-glucoside Cyanidol-3-[ ~-D- xylosyl (1--~.2)]-~-D-g[ucoside-5-~-D-glucoside Rhamn6tol-3-[rhamnosyl (1- ~4 ou 5)]-~-L-rhamnosyl-(1-~.6)-galactoside Rhamnocitrol-4'-[rhamnosyl (1--i~4 ou 5)]-rhamnosyl-(1--~f)-galactoside Kempfdrol-3-[,~-D-glueosyl (1--~,.3)1 [a-L-rhamnosyl-(1--~-2)] ~-D-glueoside

le Km pour le p-ni troph6nyl-f i -D-glucoside fut 6va- l u 6 h 4 X 10 -4M.

L'h6t6roglycosidas,e, b ien que non ent i6rement purifi6e, pr6sente une activi t6 sp6cifique p roche de celle de la ~-glucosidase obtenue h l '6tat homo- gbne. L 'h6 t6rog lycos idase ayan t d ' au t re pa r t un po ids mol6cnla i re double, cela suppose doric pou r cel le-ci une Kcat~e¢-I sup6r ieure h celle de la $-glucosidase sp6cifique pour lc p-ni troph6nyl-8-D- glucoside.

Sp~ci[icitd d' action envers les substrats naturels.

Nous avons 6tudi6 l ' ac t ion de l 'h6 t6roglycos idase de sa r ras in sur d ivers substra ts na ture ls afin de mieux ce rne r sa sp~cificit6.

Le gent iobiose, le lactose .et le v ic ianose sont hydro lys6s ; avec les deux de rn ie r s d i saccha- r ides nous notons l ' a p p a r i t i o n de p rodu i t s de t ransosy la t ion .

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

Le querc6to l -3-sophoros ide est attaqu6 p a r le glucose t e rmina l ; le monoglucos ide du querc6tol est ensui te 6gal.ement hydro lys6 . Les h6t6rosides du v ic ianose : pe l ta tos ide , g6oside et v i c i anos ide sont hydro lys6s avec l ib6ra t ion de glucose et d ' a ra - binose. Nous n 'avons pas d6cel6 de v ic ianose ; c ependan t la p r6sence d 'un p r o d u i t de t ransosyla- t ion de Rf mo ind re que celui du v ic ianose , a insi que l ' a p p a r i t i o n pr6coce de querc6tol dans le cas du pe l ta tos ide , nous inc i ten t h envisager la l ib6ra- t ion dans un p r e m i e r t emps du d i s a c c ha r ide qui sera i t ensui te hydro lys6 . Avec le rob inos ide et le ru tos ide on obt ien t les deux d i s accha r ide s corres- p o n d a n t s : rob inob iose et rut inose .

Nous n 'avons pas d6cel6 de rhamnos ido-g lucose dans les h y d r o l y s a t s du na r ingos ide et de l 'hesp6- r idos ide . La pr6sence d 'une a - rhamnos idase dans la p r6pa ra t i on enzymat ique p e r m e t la l ib6ra t ion des monoglucos ides co r r e spondan t s qui peuven t

1312 R. Bourbouze, F. Pratviel-Sosa et F. Percheron.

seulement ensui te 6tre h y d r o l y s i s p a r l 'h6t6rogly- cosidase.

Seul le glucose combin6 en pos i t ion 5 de l 'agly- cone d 'un an thocyanos ide est lib6r6.

Hdtdrosides de trisaccharides : le x a n t h o r h a m - nos ide [21] est hydro lys6 avec l ib6ra t ion du tr i - sacchar ide , p a r cont re le cathart i .coside [21] n 'es t pas attaqu6.

Avec le t~empf6rol -3-rhamnodiglucoside de Populus 6galement, l ' a t taque p r imi t i ve p a r l ' . , - rhamnos idase p e r m e t la l ib6ra t ion du glucose devenu t e rmina l p a r l 'h6 t6roglycos idase ; nous n ' avons pas d6cel6 de t races de l amina r ib iose ni d ' ag lycone .

L ' ana lyse de ces r6sultats expdr imen taux d6mont re le manque de spbcificit6 de l'h6t6r.o- glycos4dase envers l ' ag lycone des substra ts uti l i- s6s ; elle l ib~re les glucoses ]i6s h une aglycone ph6nol ique, f lavonique et an thocyan ique (pyr imi - dique m6me dans le cas du v ic ios ide) . L 'a t taque c~es o l igasaccha r ides li6s h une aglycone s 'effectue pr6f6rentiel l .ement p a r la l ib6ra t ion successive, p a r t i r de l 'extr6mit6 non r6duct r ice , des r6s idus de glucose. Nous n 'avons not6 la l ib6ra t ion d 'un ho los ide que dans ie cas d 'un r ad i ca l ~-D-glucosyl ou ~-D-galactosyl substi tu6 en pos i t ion 6, celui-ci devant 6tre imp6ra t ivemen t ti6 en pos i t ion 3 su r l ' ag lycone dans le cas des f lavonosides. La charge nette pos i t ive por t6e p a r l 'h6 t6rocycle des agly- cones an thocyan iques emp6che route at taque des subs t i tuan ts en 3 de ce noyau.

Le Dizet avai t s ignal6 l ' hyd ro ly se d 'un a m y t o i d e p a r l ' ex t r a i t enzymat ique de sar ras in . L ' amy lo ide de capuc ine est d6polym6ris6 avec l ib6ra t ion d 'ol i - gasacchar ides , de galactose et d 'un d i s accha r ide ; l 'a-D-xylosyl 1 - - - > 6 D-glucose [22].

Nous avons voulu v6rif ier si la f r ac t ion h act ivi t6 h6 t6roglycos idas ique la plus purif i6e man i fes ta i t des propr i6 t6s hyd ro ly t i ques enwers ce po lysaccha - r i4e.

La f rac t ion purif i6e sur Indub iose AcA 4/4 l ib~re un iquement du D-xylosyl-D-glucose ; nous avons 6galement mis en 6vidence sa l ib6ra t ion h p a r t i r des amylo~des de ba l samine et de t amar in . La l ib6ra t ion de ce d i s accha r ide sans d6polym6ri - sa t ion des amyloides , nous inc i te h envisager en fonc t ion des s t ruc tures p ropos6es [23, 24] une a t taque s61ective, p a r l 'h6t6roglycosidase , des uni- t6s de glucose t e rmina les subst i tu6es p a r un rad i - cal a-D-xylosyl.

DISCUSSION.

Un type p a r t i c u l i e r d 'ac t iv i t6 g lycos idas ique s ' exer~ant sur des h6t6roglycosid,es complexes avec

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

l ib6ra t ion d 'un d i s a c e ha r ide avai t 6t6 d6cel6 d~s 1926 p a r Br ide l e t Charaux chez d ivers Rhamnus, puts u l t6 r ieurement chez d ' au t res espbces v6g6tales et diff6rentes vari6t6s d'Aspergillus.

Nous avons mis en 6vidence une act ivi t6 h6t6ro- g lycos idas ique dans les g ra ines germ6es de sar- ras in , et ckerch6 h ob ten i r une p r6pa ra t i on hau- tement purif i6e afin de l ' iden t i f i e r et de p r6c i se r ses propr i6 t6s ca ta ly t iques .

Les diff6rentes 6tapes de la pur i f i ca t ion ont per- mis d ' i so le r la p ro t6 ine .enzymatique responsab le de l ' h y d r o l y s e du p-ni t roph6nyl-~-D-rut inos ide a ins i que de d ivers h6t6ros ides na ture ls avee lib6- ra t ion poss ib le d 'un ho los ide ; cel le-ci est b ien dis- t inc te des aut res g lycos idases 6galement pr6sentes dans les g ra ines germ6es .de sar ras in .

La d6na tura t ion the rmique de la f rac t ion la plus purif i6e met en 6vidence son act ivi t6 h y d r o - ly t ique 6galement envers les ~l-glucosides et i~l-galac- tosides.

La not ion d 'h6 t6rog lycos idase est beaucoup t rop res t r i c t ive p o u r ce type d ' enzyme qui se compor te comme une g lycos idase tr~s peu sp6ci~que, tant en ce qui concerne l ' ag lycone que la pa r t i e gluci- d ique des subs t ra ts na ture ls ou synth6t iques ; elle hy4 ro lyse les l ia isons holos id iques et h6t6rosi- diques engagean t un r ad i ca l isostbre du ~-D-glu- cose en C1, C. 2 et C a (~-D-glucosyl ; ~-D-galactosyl ; t t-L-arabinosyl). Elle s 'oppose ainsi ne t tement aux ~-glucosidases et ~-galactos idases rencont r6es au cours de la pur i f ica t ion , et dont les sp6cificit6s sont trbs r es t r i c t ives envers l.es l ia i sons engageant res- pec t ivement un r a d i c a l ~-D-glucosyl OU ~-D-galac- tosyl.

N6anmoins la propr i6 t6 la plus r emarquab l e de cette h6t6roglycos idase r6s ide dans les d imens ions de son site ca ta lyt ique, lui p.ermettant d ' a c c e p t e r 6ventuel lement un d i s a c c ha r ide et m6me un tr i - s accha r ide dans le cas d 'oses substi tu6s en pos i t ion 6 ; notons que dans le cas des f lavonosides, celui-ci dol t 6tre imp6ra t ivemen t li6 en pos i t ion 3 sur l ' ag lycone . Lorsque cette subs t i tu t ion c o r r e s p o n d h une l ia i son os id ique non h y d r o l y s a b l e p a r l 'h6t6- rog lycos idase (a-L-rhamnosyl , c¢-D-xylosyl), la lib6- ra t ion d 'un ho los ide est d6celable dans le mi l ieu r6act ionnel . L ' ex tens ion de l ' ac t iv i t6 enzymat ique de l 'h6 t6roglycos idase de sa r ras in des f lavonosides aux amylo ides , pe rme t d ' env i sager son usage pos- sibl.e dans la d6 te rmina t ion de la s6quence et de la conf igura t ion anom6r ique des s t ruc tures oligo- sacchar id iques .

Aucune fonc t ion phy tob io log ique d6finie ne nous pa ra i t pouvo i r 6tre a t t r ibu6e d 'une fa~on cer- ta ine h cette ,enzyme. Ce type de g lycos idase

Hdtdroglycosidase des

semble cependan t tr~s r6pandu chez les v6g6taux sup6r ieurs , en corr61ation avec la large d i s t r ibu- t ion des f lavonosides ; i l est in t6ressant de noter q u e s i l ' i s o e n z y m e A de la ~ - g l u c o s i d a s e d ' a m a n d e pu r i f i 6e p a r L a l 6 g e r i e est i n a c t i v e e n v e r s le p- n i t r o p h 6 n y l ~ - D - r u t i n o s i d e [25], n o u s a v o n s c o n s - ta t6 q u e ce lu i - c i ~ t a i t h y d r o l y s 6 p a r les p r o t 6 i n e s r e l a r g u 6 e s h 40-80 p. c e n t de s a t u r a t i o n , c o r r e s - p o n d a n t e n g r o s ~t l ' a n c i e n n e 6 m u l s i n e .

R e m a r q u o n s t o u t e f o i s que l ' i m p o r t a n c e p o n d 6 - r a t e de ce t y p e d ' e n z y m e es t m i n i m e , e x p l i q u a n t q u e ce m o d e d'a, c t i o n e n z y m a t i q u e r e s t e d i s c r e t e n c o m p a r a i s o n des a u t r e s a c t i v i t 6 s g l y c o s i d a s i q u e s ( l ' h 6 t 6 r o g l y c o s i d a s e de s a r r a s i n n e r e p r 6 s e n t e env i - r o n que 1 p. m i l l e d e s p r o t 6 i n e s e x t r a i t e s s o l u b l e s

p H 5, e t cec i au s t a d e de g e r m i n a t i o n h ac t i v i t 6 m a x i m a l e ; l a ~ - g l u c o s i d a s e sp6c i f i que 6 I imin6e p a r p a s s a g e s u r h y d r o x y l a p a t i t e e n r e p r 6 s e n t a n t 2 p. c e n t ) .

E n f i n l ' h 6 t 6 r o g l y c o s i d a s e de s a r r a s i n m a n i f e s t e sa sp6c i f i c i t6 p a r t i c u l i b r e p o u r les s u b s t r a t s d o n t la p a r t i e g l u c i d i q u e c o m p o r t e l ' e n c h a i n e m e n t r h a m n o s i d o - g l u c o s e , x y l o s i d o - g l u c o s e e t r h a m n o - s i d o - g a l a c t o s e . Cet te sp6c i f i c i t6 assez r e s t r i c t i v e e s t /~ r a p p r o c h e r d u fa i r que le r u t o s i d e est le seu l f l a v o n o s i d e p r 6 s e n t d a n s les g r a i n e s n o n g e r m 6 e s de s a r r a s i n et u l t 6 r i e u r e m e n t ~ t o u s l e s s t a d e s de la g e r m i n a t i o n [26].

Remerciemen ts.

Nous adressons tous nos remere iements h Mon- sieur Ie Professeur J. E. Courtois pour l ' int~r~t qu ' i l a port6 h e e t ravai l .

Nous remercions vivemen,t M. le Professeur R. Par is pour ses 6ehant i l lons de x a n t h o r h a m n o s i d e et de eathar t ieoside, M. le Professeur P. Lebreton pour son dehant i l lon de pel ta tos ide et M. le Professeur L. Bir- koffer pour son ~ehant i l lon d 'an thoeyanos ide .

Nous remere ions 6galement tr~s v ivement M. F. Bau- m a n n pour l '61eetrofoealisation.

R~SUM~.

Nous avons isol6 et purifi6 envi ron 1 000 fois une h~t6roglycosidase h p a r t i r des graines germ6es de sarrasin . Ce type par t ieu l ie r de glycosidase (ancien- nemen t << rhamnod i a s t a s e >>) hydro lyse cer ta ins h6t6- roside.s na tu re l s tel le ru tos ide en ru t inose ((t-L-rham- nosyl 1 ~ 6 glucose) et quere6tol ; aussi l 'aet ivi t6 enzymat ique a-t-elle 6t6 suivie avec le p -n i t roph~nyl - [~-D-rutinoside eomme subst ra t .

La purif icat ion comprend les dtapes suivantes : extract ion, relar~age pa r le sul fa te d ' am m on i um , ehro- matog~aphies sur hydroxylapa t i t e , DEAE-Sephadex A50 et acry lamide-agarose AeA 4/4. Bien que par t ie l - l ement purifide, 1'enzyme hydro lysan t le p -n i t roph6nyl - ~-n-rut inos ide es~t h ien individual is~e des au t res gly-

grains de sarrasin. 1313

cosidases ; en par t i cu l ie r les diff6rentes 6tapes ehroma- tographiques et la d~na tu ra t ion t he rmique me t t en t en ~videnee son identi t~ propre vis-h-vis des [3-glucosi- dases et (J-galaetosidases 6galement pr~sentes dans les gra ines germbes de sarras in . Le poids mol6eulaire de cette h6t6roglycosidase, est im6 pa r ~lectrophor~se sur gel de po lyacry lamide est d ' env i ron 85 000. Le poin t iso~lectrique est de 3,7.

L'h~t6roglycosidase r~v~le une large sp6cifieit~ ; elle hydrolyse les liaison's holos idiques et h6t6rosidiques isost~res du ~-n-glueose en C~, Ca et C~. Le Km h pH 5 est de 2,6 × 10-4 M pour le p -n i t roph~nyl -~-n- ru t ino- side ; 8,8 × 10-5 M pour le p-ni t roph~nyl-9-n-glucos ide et de 8,6 × 10-5 M pour le p-ni t roph6nyl-~-D-galaeto- side.

L'aetivit6 enzymat ique de l 'h~t6roglyeosidase de sa r ras in est t rbs ~tendue ; elle hydro lyse des disaeeha- rides, des h6t~roglyeosides complexes et des amyloides.

Aucune fonet ion bien d6finie n 'a encore pu ~tre a t t r i - bu te h ce type d 'enzyme.

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