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BIOCHIMIE, 1974, 56, 1305-1313. Purification, propridtds et spdcificit6 d'une hdtdroglycosidase des graines de sarrasin. Richard BOUREOUZE, Flore PRATVlEL-SOSA et Francois PERCHERON <~ . Laboraloire de Chimie Biologique, E.R.A. n ° 99 du C.N.R.S., Facultd des Sciences Pharmaceatiques et Biologiques, Universitd Ren~ Descartes, 4, Avenue de l'Observatoire, 75006 Paris. (28-6-1974). Summary. -- A heteroglycosidase from s~edlings of saracen corn has been isolated and purified about 1,000 fold. Such a glycosidase (rhamnodiastase-like enzyme) hydrolyses turin to rutin.ose (a-L-rhamnosyl 1 --)- 6 glucose) and quercetin, the enzymatic activity was thus determined with p-nitroph6nyl-[3-D-rutinoside as substrate. The purification involved extraction, ammonium sulfate fractionation, ehromatographies on hydroxylapatite, DEAE-Sephadex and acryl.amide-agarose Ac-A 4/4. The enzyme hydro- lyzing p-nitroph~nyl-~-o-rutinoside was only partially purified, but successive steps of column chromatography and thermal denaturation provided a clear distinction beetween this heteroglycosidase and the other glycosidases, especially ~-glucosidases and ~Ngalacto- sidases of germinating kernels of saracen corn. The molecular weight of this heteroglycosidase, calculated from data obtained by disc gel electrophoresis was about 85,000. Isoelectric focusing established the isoelectric point to be 3.7. Heteroglycosidase exibits a broad specificity; the catalytic activity was observed to be specific for holosidic and heterosidic bonds with the same configuration as ~-a-glucosyI residue for carbon atom, s 1, 2 and 3. The Km at pH 5 was calculated to be 2.6 X 10-4 M for p-nitrophenyl-~-D-rutinoside ; 8.8 × 10-5 M for p-nitrophenyl-~-n-glucoside and 8.6 × 1'0-5 M for p-nitrophenyl-~-D-galactoside. The range of activity was very broad, extending to the cleavage of disaceharides, various flavonoid and related phenolic glycosides, and amyloids. At the present time the functions of this heteroglycosidase can only be a matter of conjectures. INTRODUCTION. En 1926, Bridel et Charaux [1] chez divers Rhamnus signal~rent la pr6sence d'une activit6 ~-glucosidasique particuli6re, hydrolysant certains h6t6rosides naturels avec lib6ration d'un disaccha- ride ; par exemple, le rutoside est hydrolys6 en querc6tol et rutinose (a-L-rhamnosyl 1--~-6 glucose). La ¢ rhamnodiastase >> de Bridel et Charaux se r6v61a utile en phytochimie pour la recherche des h6t6rosides h sucres complexes, correspondant en cela h la m6thode de Bourquelot et H6rissey pour la recherche des ,~-glucosides avec la ~-glucosidase d'amande. En dehors du genre Rhamnus, des acti- vit6s h6t6roglycosidasiques ont 6t6 d6cel6es chez un grand nombre d'esp~ces v~g6tales [2-5] ; les << rutinases >> [6, 7] et <<anthocyanases >> [8-10] de divers AspergiIlus sont 6galement h rapprocher de la << rharnnodiastase >>. Cependant ce type d'acti- vit6 enzymatique demeurait real connu ; en parti- A qui route correspondance doit ~tre adress6e. culier, malgr6 les travaux de Suzuki en 1962 [2], un problbme non r6solu restait de savoir si les extraits enzymatiques bruts renfermaient une h6t6- roglycosidase stricte, responsable de l'hydrolyse de substrats tels le rutoside, ou une ~-glucosidase de large sp6cificit6. N~ous avous d6celd une activit6 h6t6roglycosi- dasique dans les graines germ6es de sarrasin. Afin de suivre la purification de cette activit6 enzyma- tique, nous avons effectu6 la synth6se d'un sub- strat plus soluble que les h6t6rosides naturels : le p-nitroph6nyl~8-D-rutinoside [11], homologue du rutoside pour la partie glucidique. Le but de ce travail a 6t6 l'isolement .el la caract6risation de cette h6t6rogIycosidase, puts l'6tude de quelques- unes de ses propri6t6s. MATERIEL ET METHODES. Produits: les graines de sarrasin (Fagopyrum esculentum, M., Polygonac6es) ont 6t6 fournies par la maison Vilmorin, Paris.

Purification, propriétés et spécificité d'une hétéroglycosidase des graines de sarrasin

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Page 1: Purification, propriétés et spécificité d'une hétéroglycosidase des graines de sarrasin

BIOCHIMIE, 1974, 56, 1305-1313.

Purification, propridtds et spdcificit6 d'une hdtdroglycosidase des graines de sarrasin.

R i c h a r d BOUREOUZE, F l o r e P R A T V l E L - S O S A et F r a n c o i s PERCHERON <~ .

Laboraloire de Chimie Biologique, E.R.A. n ° 99 du C.N.R.S., Facultd des Sciences Pharmaceatiques et Biologiques,

Universitd Ren~ Descartes, 4, Avenue de l'Observatoire, 75006 Paris.

(28-6-1974).

Summary. - - A heteroglycosidase f rom s~edlings of saracen corn has been isolated and purified abou t 1,000 fold. Such a glycosidase ( rhamnodias tase- l ike enzyme) hydrolyses t u r in to rutin.ose (a-L-rhamnosyl 1 - - ) - 6 glucose) and quercetin, the enzymat ic act ivi ty was thus de te rmined w i th p-nitroph6nyl-[3-D-rutinoside as substra te .

The pur i f icat ion involved extract ion, a m m o n i u m sulfa te f rac t iona t ion , eh romatograph ies on hydroxylapa t i t e , DEAE-Sephadex and acryl.amide-agarose Ac-A 4/4. The enzyme hydro- lyzing p-n i t roph~nyl -~-o- ru t inos ide was only pa r t i a l ly purified, bu t successive steps of co lumn ch roma tography and t h e r m a l dena tu ra t i on provided a clear d i s t inc t ion beetween th i s heteroglycosidase and the other glycosidases, especially ~-glucosidases and ~Ngalacto- sidases of ge rmina t ing kernels of saracen corn.

The molecula r weight of th i s heteroglycosidase, calculated f rom data obta ined by disc gel e lect rophoresis was about 85,000. Isoelectric focusing es tab l i shed the isoelectric poin t to be 3.7.

Heteroglycosidase exibi ts a b road speci f ic i ty ; the catalyt ic act ivi ty was observed to be specific for holosidic and heterosidic bonds w i th the same configurat ion as ~-a-glucosyI residue for carbon atom, s 1, 2 and 3. The Km at pH 5 was calculated to be 2.6 X 10-4 M for p-n i t rophenyl -~-D-rut inos ide ; 8.8 × 10-5 M for p-ni t rophenyl-~-n-glucos ide and 8.6 × 1'0-5 M for p-ni trophenyl-~-D-galactoside. The range of ac t iv i ty was very broad, ex tending to the cleavage of disaceharides, var ious flavonoid and re la ted phenol ic glycosides, and amyloids .

At the present t ime the func t ions of th i s heteroglycosidase can on ly be a m a t t e r of conjectures.

I N T R O D U C T I O N .

E n 1926, B r i d e l e t C h a r a u x [1] chez d i v e r s Rhamnus s i g n a l ~ r e n t la p r 6 s e n c e d ' u n e ac t i v i t 6 ~ - g l u c o s i d a s i q u e p a r t i c u l i 6 r e , h y d r o l y s a n t c e r t a i n s h 6 t 6 r o s i d e s n a t u r e l s a v e c l i b 6 r a t i o n d ' u n d i s a c c h a - r i d e ; p a r e x e m p l e , le r u t o s i d e es t h y d r o l y s 6 e n q u e r c 6 t o l e t r u t i n o s e ( a - L - r h a m n o s y l 1 - - ~ - 6 g lucose ) .

La ¢ r h a m n o d i a s t a s e >> de B r i d e l e t C h a r a u x se r6v61a u t i l e en p h y t o c h i m i e p o u r la r e c h e r c h e des h 6 t 6 r o s i d e s h s u c r e s c o m p l e x e s , c o r r e s p o n d a n t e n ce la h la m 6 t h o d e de B o u r q u e l o t et H 6 r i s s e y p o u r la r e c h e r c h e de s ,~-glucosides a v e c la ~ - g l u c o s i d a s e d ' a m a n d e . E n d e h o r s d u g e n r e Rhamnus, des ac t i - v i t6s h 6 t 6 r o g l y c o s i d a s i q u e s o n t 6t6 d6ce l6es c h e z u n g r a n d n o m b r e d ' e s p ~ c e s v~g6 ta les [2-5] ; les << r u t i n a s e s >> [6, 7] et << a n t h o c y a n a s e s >> [8-10] de d i v e r s AspergiIlus s o n t 6 g a l e m e n t h r a p p r o c h e r de la << r h a r n n o d i a s t a s e >>. C e p e n d a n t ce t y p e d ' a c t i - v i t6 e n z y m a t i q u e d e m e u r a i t rea l c o n n u ; en p a r t i -

A qui route correspondance doit ~tre adress6e.

cu l i e r , m a l g r 6 les t r a v a u x de S u z u k i en 1962 [2], u n p r o b l b m e n o n r 6 s o l u r e s t a i t de s a v o i r si les e x t r a i t s e n z y m a t i q u e s b r u t s r e n f e r m a i e n t u n e h6t6- r o g l y c o s i d a s e s t r i c t e , r e s p o n s a b l e de l ' h y d r o l y s e de s u b s t r a t s te ls le r u t o s i d e , ou u n e ~ -g lucos ida se de l a r g e sp6ci f ic i t6 .

N~ous a v o u s d6ce ld u n e ac t i v i t 6 h 6 t 6 r o g l y c o s i - d a s i q u e d a n s les g r a i n e s g e r m 6 e s de s a r r a s i n . Afin de s u i v r e la p u r i f i c a t i o n de ce t t e a c t i v i t 6 e n z y m a - t ique , n o u s a v o n s e f fec tu6 la s y n t h 6 s e d ' u n sub- s t r a t p l u s s o l u b l e que les h 6 t 6 r o s i d e s n a t u r e l s : le p - n i t r o p h 6 n y l ~ 8 - D - r u t i n o s i d e [11], h o m o l o g u e d u r u t o s i d e p o u r la p a r t i e g l u c i d i q u e . Le b u t de ce t r a v a i l a 6t6 l ' i s o l e m e n t .el la c a r a c t 6 r i s a t i o n de ce t te h 6 t 6 r o g I y c o s i d a s e , p u t s l ' 6 t ude de q u e l q u e s - u n e s de ses p r o p r i 6 t 6 s .

M A T E R I E L E T M E T H O D E S .

Produits: l es g r a i n e s de s a r r a s i n (Fagopyrum esculentum, M., P o l y g o n a c 6 e s ) o n t 6t6 f o u r n i e s p a r la m a i s o n V i l m o r i n , P a r i s .

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130.6 R. Bourbouze, F. Pratviel -Sosa el F. Percheron.

Le DEAE-Sephadex A50 p.rovient de Pha rma c i a , l ' a c ry l amide -aga rose AcA 4/4 de l ' I ndus t r i e Bio- logique F ranca i se .

Les s u b s t r a t s : p -n i t roph6nyl~-D-g lucos ide et p-ni t roph6nyl-~-D-galactoside sont des p rodu i t s Sigma.

Mesure des activit~s enzgmatiques : le mi l ieu d ' i ncuba t ion c o m p r e n d : 0,1 ml de subs t ra t 5 mM (ary lg lycos ides nitr6s du commerce ou synth6- tis6s),, 0,025 ml de t ampon phospha te dis odique 0,2 M-acide c i t r ique 0,1 M de pH 5, 0,05 ml de p r6pa ra t ion enzymat ique . Aprbs un temps d ' incu- bar ton ~t 37°C varian¢ suivant le subst ra t util is6 et le s tade de la pur i f ica t ion , la r6act ion enzyma- t ique est arr~t6e p a r add i t i on de 1 ml de Na2CO 3 0,2 M e t l ' in tensi t6 de la co lo ra t ion jaune que d6- ve loppe le p -n i t roph6no l est mesur6e h 400 nm.

L 'ac t iv i t6 sp6cifique est expr im6e en unit6s cor- r e spondan t aux !~moles de subst ra t t rans form6 / m n ~rag de prot6ines .

Dosage des protdines : pa r la m6thode de L o w r y [12], l '6 ta lonnage 6tant r6alis6 avee de ia s6rum a lbumine bovine.

Aprbs 24 h d ' i ncuba t ion h 45°C, le mi l ieu r6ac- t ionnel est ch roma tog raph i6 sur p a p i e r (Schle icher et Schfill) avec le systbme solvant n -bu tano l -pyr i - d ine-eau ( 9 : 5 : 4 v /v) .

Les oses l ib6r6s sont r6v616s p a r pu lv6r i sa t ion d 'un m61ange d 'une solut ion 6thanol ique d 'o-ph6- ny lbned iamine (200 mg dans 30 ml) et d 'une solu- t ion aqueuse d ' ac ide oxal ique (1 g dans 20 ml), et chauffage ~ 80°C.

Pour p r6c i se r la c in6t ique de l ' a t taque de cer- rains h6t6rosides, des pr61bvements h des temps var iab les du mi l ieu r6ac t ionne l sont ch romatogra - phi6s sur p,laques. Chromatograph ie sur p laques de gel de s i l ice (Schle icher et Schiill) avec le syst~me solvant ac6tate d '6 thy le -ac ide ac~tique- m6thanol-eau (60 : 15 : 15 : 10 v /v) ; r6v61ation p a r une solut ion 6 lhanol ique d ' ac ide sul fur ique 5 p. cent et chauffage fi 80°C. Chroma tog raph ie sur p laques de m i c r o p o l y a m i d e (Schle icher et Schiil l F 1 500) avec le syst~me so]vant m6thanol- ac ide ac6t ique-eau ( 1 9 : 1 : 1 v /v ) ; r6v61ation p a r une solut ion de ch lo ru re d ' a lumin ium fi 5 p. cent darts le m6thanol et lcs p laques sont observ6es sous une lampe U.V.

Chromatographle sur colonne d'hgdroxylapa- tire: l ' h y d r o x y l a p a t i t e a 6t6 pr6par6e selon un pro toco le d6riv6 de celui de TiseIius, Hjer ten et Levin [13].

Electrophor~se en gel de polyacr~llamide : selon Ia m6thode d 'Orns te in et Davis [14, 15], pour une concen t ra t ion finale en a c r y l a m i d e d.e 7,5 p. cent clans le t amoon Tr i s -g lyc ine de pH 8,5, appa re i l A c r y l o o h o r (Ets. Pleuger , Par is ) : 160 volts, 5 mA p a r tube, 20 mn ~ + 4°C. B6v61ation pa r le bl'eu de Coomassie.

Les gels dest in6s au reD6rage de l 'act ivi t6 enzy- mat ique sont sect ionn6s ~ l ' a ide d 'un d6coupeur , e n disques de 1,5 mm d '6ua isseur ; ceux-ci sont ensui te in t rodu i t s darts le mi l ieu d ' i ncuba t ion hab i - tuel.

Electrofocalisation: la d6 te rmina t ion du po in t iso-61ectrique a 6t6 effectu6e dans une colonne LKB 8 100 de 110 ml de capaci t6 avec un g rad ien t d ' ampho ly t e s de pH 3,0 ~ 6,0 ~ la concen t ra t ion de 2 p. cent.

Essais enzymatiques: l~our les essais d ' h y d r o - lyse enzymat ique des subs t ra ts naturels , le m6- lange r6ac t ionnel c o m p r e n d : 1 mg d 'h6tbros ide en suspens ion dans 0,075 ml d 'eau, 0,025 ml de t ampon phospha te d i sodique 0,2 M - ac ide c i t r ique f l l M de nH 5, 0:1 m! de p r b p a r a t i o n enzymat ique .

RESULTATS EXPERIMENTAUX.

I . - - PURIFICATION ET CARACTERISATION DE L'ENZYME

HYDROLYSANT LE p-NITROPH]~NYL-~-D-RUTINOSIDE.

Extraction et preparation de l'extrait enzyma- tique.

La p r6pa ra t i on de l ' ex t ra i t enzymat ique com- p rend les phases suivantes : gonflement d.es gra ines (600 g) darts l ' eau p e n d a n t 24 h, puts ge rmina t ion sur coton humide p e n d a n t 3 jours fi la ]umibre et t emp6ra tu re du labora to i re . Les gra ines germ6es sont broy6es dans du t ampon acide ac6tique-ac6- rate de sodimn 0,1 M de pH 5. Aprbs agi ta t ion pe nda n t 2 h le b r o y a t est centr i fug6 & 1000 g p e n d a n t 15 mn et le surnageant abandonn6 une nuit ~ d- 4°C. Apr~s une cen i r i fuga t ion de 30 mn

5 000 g le surn.ageant est amen6 fi 80 p. cent de sa tura t ion en (NH4)2SO 4.

:Les pro t6 ines pr6cipi t6es , r epr i ses p a r de l 'eau disti l l6e, dialys6es et centr i fug6es 45 mn fi 20 000 g cons t i tuent l ' ex t ra i t enzymat ique (162 ml).

L ' ex t r a i t bru~ ainsi obtenu l ibbre du ru t inose p a r t i r du ru tos ide et du p-ni t roph6nyN~-D-rut ino- side, cette act ivi t6 h6 t6roglycos idas ique 6rant asso- ci6e ~ plus~eurs autres glycosidases . Nous notons en p a r t i c u l i e r de trbs fortes act ivi t6s ~-glucosi- das iques et ~-galactosidasiques, estim6es ~ l ' a ide des a ry lg lycos ides ni t r6s co r respondan t s .

BIOCHIMIE, 1974 , 56, n ° 10.

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H d t d r o g l y c o s i d a s e d e s

F r a c t i o n n e m e n t sur co tonne d ' h y d r o x y l a p a t i t e .

Les prot6ines de l ' ex t ra i t brut sont adsorb6es sur deux colonnes d 'hydroxy lapa t i t e (2,6 × 20 cm) 6quilibr6es avec un tampon phosphate monopo- tass ique-phosphate dipotassique 0,01 M de pH 6,8, puis f ract ionn6es par 61ution par pa l ie rs /i l 'a ide de tampon phosphate de molari t6s croissantes (fig. 1).

o

\ Eluat (m!)

FIG. 1. - - Chromatographie sur eolonne d'hydroxyl- apatite.

Elution par paliers h l'aide de tampon phosphate monopotassique-phosphate dipotassique pH 6,8 de mo- larit~s croissantes.

Les f ract ions 61u6es par le tampon 0,05 M e t actives sur le p-nitroph6nyN~-D-rutinoside, sont rassembl6es, dialys6es et concentr6es sur mem- brane Diaflo (PM 30. Amicon) jusqu'h un volume de 25 ml.

C h r o m a t o g r a p h i e sur co lonne de D E A E - S e p h a - d e x A50.

L'61uat des colonnes d 'hydroxy lapa t i t e est 6qui- libr6 par dialyse contre du tampon acide ac6tique-

10 3o 50 F rac t ions (N ° )

Fro. 2. - - Chromalographie sur colonne de DEAE- Sephadex A50 dquilibrde avec un tampon acdtate 0,1 M de pH 5.

Elution par un gradient de O h 0,5 Men NaG1 ( - - - ). A - A Activit6 sur le p-nitroph6nylq~-o-rutinoside. n - O Aetivit~ sur le p-nitroph6nyl-~-n-galaetoside. (l'activit6 envers le rutinoside a 6t6 multipli6e par 4).

BIOCHIM1E, 1974, 66, n ° 10.

g r a i n s de s a r r a s i n . 1307

ac6tate de sodium 0,1 M de pH 5, puis pass6 sur une colonne de DEAE-Sephadex A50 (1,6 × 15 cm) 6quilibr6e avec le m6me tampon (fig. 2).

Une f rac t ion de prot6ines non re tenues passe avec le tampon d '6quil ibrage, puis nous instal lons un gradient l in6aire de 0 h 0,5 M e n NaG1 (200 ml dans chaque flacon) et recuei l lons des f rac t ions de 5 ml.

Les f ract ions hydro lysan t le p-nitroph6nyl-B-D- ru t inos ide sont 61u6es pour une molari t6 en NaC1 vois ine de 0,3. Celles-ci sont r6unies, dialys6es et concentr6es jusqu'h un volume de 15 ml.

C h r o m a t o g r a p h i e sur co lonne d 'acry lamide-aga-

rose A c A 4/4 .

Les 15 ml de la f rac t ion DEAE-Sephadex A50 sont concentr6s sur membrane fi l trante (Ultra- gaine Selectron) jusqu'h un volume vois in de 2 ml

/ ,i , \ -x

7 a l o0 150 22e Eluat (ml)

Fro. 3. - - Chromatographie sur colonne d'lndubiose Ac-A ~/~.

Elution par un tampon ac6tate 0,1 M de pH 5. A - A Activit~ sur le p-nitroph6nyl-~-D-rutinoside. A--A Activit~ sur le p-nitroph6nyl-a-L-rhamnoside.

et d6pos6s sur une colonne d ' Indubiose AcA 4/4 (1,5 × 80). L'61ution s 'effectue par un tampon acide ac6tique-ac6tate de sodium 0,1 M de pH 5 avec un d6bit de 10 ml par h, et nous recuei l lons des f ract ions de 3 ml.

Les f ract ions cor respondan t h la plus forte acti- vit6 envers le p-nitroph6nyl-~l-D-rutinoside sont r6unies (21 ml) et const i tuent la f rac t ion h6t6ro- glycosidasique la plus purifi6e (fig. 3). Celle-ci avec une activit6 sp6citique de 1 it~M/mg/mn avec le p-nitroph6nyl-B-D-rutinoside comme substrat, a 6t6 purifi6e 1 040 fois par r appor t h l ' ex t ra i t aqueux, et ceci avec un rendement de l ' o rd re de 2 p. cent.

Les donn6es quant i ta t ives de la pur i f ica t ion sont rassembl6es dans le tableau L

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1308 R. Bourbouze , F. Pra tv i e l -Sosa el F. Percheron .

Caractdrisation de l'hdtdroglgcosidase de sar- rasin.

Malgr6 l '61imination au cours des diff6rentes 6tapes de la pur i f ica t ion d 'une ~-glucosidas,e sp6- cifique par passage sur hydroxy lapa t i t e (pic 0,5 M phosphate) [16], et de deux formes mo16culaires de ~-galactosidases par chromatograph ie sur DEAE-Sephadex (fig. 2), nous notons au n iveau de

r6siduelle pr6sentant une constante de d6natura- t ion the rmique iden t ique pour les trois substrats : p-ni t roph6nyl~-D-glucoside, -~-n-galactoside et B-D- ru t inos ide (Ifrg. 4), il est pe rmis de penser que la m6me prot6ine enzymat ique est le suppor t des trois activit6s observ6es.

Cette 6tude met en 6vidence le caract6re non h6t6roglycosidasique strict de l 'h6t6roglycosidase

TABLEAU I .

Principales dlapes de la purif ication de l'h~t~roglgcosidase de sarrasin.

Etapes Prot6ines Facteur Readement totales de purification p. cent

Extractum aqueux . . . . . . . . . . . . . . .

Protdines relargudes par (NH,).,SO 4 h 80 p. cent de saturation . . . . . .

8500 mg

1846 mg

i Activit6 spgci _.._

10,96 x 10 -~ 100

2,37 X I0 -:~ 2,5 53

Hydroxylapatite P ic0 ,5 M Phos- phate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 mg 5,8 X 10 .3 6 9

DEAE-Sephadex A50 . . . . . . . . . . . . 4,8 mg 79 X 10 -:~ 82 6

Indubiose AcA 4/4 . . . . . . . . . . . . . . . 0,105 mg 1 1040 2

la f rac t ion h6t6roglycosidasique la plus purifi6e, une activit6 h~drolysante envers le p-ni t roph6nyl- ~-D-glucoside et le p-ni troph6nyl-~-o-galactoside.

Une exp6r ience de d6naturat ion thernl ique 60°C en fonct ion du temps laisse appara i t re avec le p-nitroph6nyl-~-D-glucoside une rupture de pente caract6r is t ique dans la droi te de d6natu- ra t ion qui met en 6vidence l 'hydro lyse de ce sub- strat par deux prot6ines diff6rentes (fig. 4). A c e stade de la pur i f ica t ion la majeure par t ie de l 'act i- vit6 enwers le p-nitroph6nyl-~-D-glucoside est sup- p ort6e par une :~-glucosidase thermolabi le , rapi- dement d6natur6e h 60°C. L 'act ivi t6 enzymat ique

Los~ 2,3

i i i a t f j

5 10 2 0 3 0 4 5 ~;0 t

FI6. 4. - - Ddnaturation thermique (60°C) en [onetion du temps de la fraction Indubiose Ac-A 4/4.

A - A ActiviSd sur le p-nitrophdnyl~-D-rutinoside. u - - i Activit6 sur le p-nitrophdnyl~-D-glucoside. O--[3 Activit6 sur le p-nitroph6nyl-~-D-galactoside.

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

de sarrasin, et son activit6 catalyt ique envers les glucosides et galactosides ph6noliques.

L,'extrait brut enzymat ique avait laiss6 appa- rai tre, seconda i rement h la l ib6rat ion de rut inose h par t i r du rutoside, un.e hydro lyse du disaccha- r ide en glucose et rhamnose .

Pour suivre cette activit6 a - rhamnosidas ique nous avons pr6par6 du p-ni t roph6nyl-a-L-rhamno- side selon la m6tllode de Westphal et Fe ier [17].

L 'a - rhamnos idase pr6sente le m6me comporte- ment ch romatograph ique que l 'h6t6roglycosidase sur hydroxylapa t i t e et DEAE-Sephadex. Le che- vauctrement des pics d'61ution de ces deux osi- dases sur Indubiose AcA 4/4 n,e pe rmet pas une 61imination totale de l '~-rhamnosidase au dern ie r stade de la pur i f ica t ion (fig. 3).

:Des tentat ives de s6parat ion h l 'a ide d 'autres supports chromatograph iques se sont r6v616es infructueuses, l 'h6t6roglycosidase et l ' a - rhamno- sidase pr6sentant un point iso61ectrique ident ique et des poids mol6culaires t rop proches. En outre, ces deux prot6ines enzymat iques se r6vblent rela- t ivement thermostables [18].

En r6sum6, la f rac t ion h6t6roglycosidasique obtenue la plus purifi6e se t rouve donc contami- n6e par une $-glucosidase et une a-rhamnosidase. La ~-glucosidase, thermolabi le , peut 6tre totale-

Page 5: Purification, propriétés et spécificité d'une hétéroglycosidase des graines de sarrasin

Hdtdroglycos idase des grains de sarras in . 13,09

ment d6natur6e par un t ra i tement the rmique de 10 mn h 50°C. Le taux de contamina t ion par l 'a- rhamnos idase est de l ' o rd re de 40 p. cent (vitesses d 'hydro lyse compar6es du p-ni troph6nyl-a-L-rham- noside et du p-nitroph6nyl-~-D-rutinoside), et aucun proc6d6 ne nous a permis de s6parer les deux prot6ines.

H. - - P R O P R I E T E S PHYSICOCHIMIQUES D E L ' H E T I ~ R O G L Y C O S I D A S E D E S A R R A S I N .

Eleetrophor~se en gel de polyacrylamide.

Un contr61e 61ectrophor6tique en gel de poly- ac ry lamide ne laisse appara i t re ~ chaque 6tape de

"I- A

"I- B

"I- B

+

C

7,57. 5,5"/.

FIG. 5 . - Analyse dlectrophordtique des diffdrentes ~tapes de la purification.

Explications dans le texte. - - ~ - Aetivit6 sur le p-nitroph6nyl~-D-rutinoside. ...... )~ Origine.

la pur i f ica t ion qu 'une seule bande active envers le p-nitroph6nyl-~-D-rutinoside ~fig. 5).

Aprbs passage sur DEAE-Sephadex, l 'homog6- n6it6 de la bande prot6ique co r respondan t h l 'acti- vit6 h6t6roglycosidasique est illustr6e par une migra t ion pour des gels h une concent ra t ion finale en acry lamide de 5,5 p. cent ; nous n 'observons pas de d6doublement de eette bande par rappor t aux gels ~ 7,5 p. cent (fig. 5-B).

La f ract ion Indubiose ne r6v~le h l '61ectropho- rbse qu 'une seule bande prot6ique cor respondan t h rae l iv i t6 h6t6roglycosidasique ; bien que cette f ract ion renfe rme une cer ta ine quantit6 d'tt-rham- nosidase (de plus grande migra t ion anodique), la quantit6 de cette dernibre prot6ine est t rop faible pour 6tre r6v616e (fig. 5-C).

Ddtermination dtt poids moldculaire.

Nous avons suivi la m6thode d 'Hedr ick et Smith ~19], les prot6ines servant de r6f6rence 6tant la s6rum albumine sous diff6rents 6tals de polym6ri- sation, l 'ova lbumine et l ' apoferr i t ine .

:~ Log R m

t i * i i | •

10 20 30 40 5 0

FIG. 6 . - D~termination de la masse moldculaire de l'hdtdroglycosidase de sarrasin par analyse dleetro- phor~tique.

A (Log de R~I) : pente des droites repr~sentant la variation du logarithme de Rm en fonction de la con- centration en acrylamide des gels.

Prot6ines servant h l'6talonnage : 10valbumine. 2 S6rum albumine (monombre). 3 S6rum albumine (dim6re). 4 S6rum albumine (trim6re). 5 S6rum albumine (t6tram~reJ. 6 Apoferritine.

Comme l ' ind ique la figure 6, le poids mol6culaire ainsi d6termin6 est vois in de 85.000. Cette esti- mat ion est en accord avec la derni~re 6tape chro- matographique de la purif icat ion. L 'act ivi t6 h6t6- roglycos idas ique a 6t6 61u6e de la colonne d ' Indu- biose AcA 4/4 sous forme d 'un seul pic sym6tr ique dont le coefficient de par tage Kay calcul6 corres- pond h la posi t ion d 'une prot6ine globulaire d 'une masse moldculai re d ' env i ron 90.000 [211].

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

Page 6: Purification, propriétés et spécificité d'une hétéroglycosidase des graines de sarrasin

1310 R. Bourbouze , F. Pra tv i e l -Sosa el F. Percheron .

Electrophorbse par focalisation ionique.

En ut i l i sant un gradient de pH 3,0 h 6,0, l 'acti- vit6 envers le p-nitroph6nyl-~-D-rutinoside se foca- lise en un seul pic, dont le po in t iso61ectrique est de 3,7.

III. - - PROPRII~TI~S DE L~HI~T]~ROGLYCOSIDASE

D E S A R R A S I N .

Les propri~t6s de l 'h~t6roglycosidase de sar ras in ont ~t6 6tudi6es sur une prepara t ion ,enzymatique par t ie l lement purifi6e en raison du faible rende- ment des diverses 6tapes chromatographiques.

V

5O

c

3O

10

~00 300 500 700 v/s

Fro. 7. - - Influence de la concentration en substrat sur la oitesse d'hydrolyse des p-nitrophdnyl-~-D-ruti- noside (A) ; p-nitrophdnyl-i~3-D-galactoside (B) ; p-nitro- phdnyl~-D-glucoside (C), par l'hdtdroglycosidase de sarrasin.

Cette puri f icat ion partieHe comprend : passage de l 'extrai t enzymatique sur DEAE-Sephadex dans les condi t ions d6crites pr6c6demment , suivi d ' nn t ra i tement thermique de 10 mn h 50°C. Nous obte- nons ainsi nne pr6para t ion h activit6 h6t6roglyco- sidasique purifi6e c inquante lois, et avec un ren- dement proche de 40 p. cent. Cette pr6para t ion est e:cemp~e des fi-glucosidases et ~-galactosidases sp6cifiques 6galement pr6sentes dans les graines germ6es de sarrasin, et ne renferme que l 'activit6 hydroly t ique propre de l 'h6t6roglycosidase envers

les p-nitroph6nyl-~-D-glucoside et -~-D-galactoside (la ~-glucosidase 61imin6e par passage sur hydro- xylapati te n 'est pas retenue sur DEAE-Sephadex 6quilibr6 avec un tampon ac6tate 0,1 M de pH 5 [16]).

Les impuret6s prot6iques inact ives et l 'a-rham- nosidase pr6sentes dans cette pr6para t ion ne peuvent interf6rer dans l '6tude des propri6t6s cin6- t iques et de la sp6cificit6 de l 'h6t6roglycosidase.

Effecteurs de l'activit~ enzgmatique.

Avec le tampon phosphate-acide ci t r ique l e pH opt imum de t 'hydrolyse du p-nitroph6nyl-~-D-ruti- noside se situe h pH 5,5 ; le syst6me tampon acide ac6tique-ac6tate de sodium ne modifie pas ce pH optimum.

L'E.D.T.A. et le 2-mercapto6thanol h des concen- t ra t ions de 1'0 ~a M ne modif ient pas la vitesse d 'hy- drolyse du p-nitroph6nyI-~-D-rutinoside, et aucun cat ion m6tall ique b ivalent ne semble indispensable

l 'activit6 h6t6roglycosidasique.

Activit~ enzymatique envers les arylglycosides nitr~s.

5~ous avons ~tudi6 l ' inf luence de la concentra- t ion en s.ubstrat sur la vitesse d 'hydrolyse des p-nitroph6nyl-~-D-rutinoside, ~-D-glucoside, et -~-D-galactoside par l 'h6t6roglycosidase h son pH optimum.

La figure 7 rassemble les droites calcul6es ~ par- t ir des points exp6r imentaux selon Ia repr6senta- t ion de Eadie.

Nous n 'avons pu d~terminer la constante cataly- t ique de l 'h6t~roglycosidase pour chaque substrat puisque celle-ci n ' a pas 6t6 obtenue totalement purifi6e ; cependant les parambtres cin6tiques (tableau II) d6termin6s h par t i r d 'un m~me lot enzymatique permet tent des comparaisons rela- tives puisqu ' i ls se rappor ten t h la m6me quanti t6 d 'enzyme.

Les Km obtenus reflbtent une affi~nit6 ident iqne pour le glucoside et le galactoside, celle-ci 6tan[ sup@ieure h celle observ6e pour le rut inoside.

TABLEAU II.

Param~tres cindtiques de l'h~t~roglycosidase de sarrasin.

Substrat V m Km (tO-3,u M/mn) /M) Vm/Km

p-nitroph6nyl-,~-D-glucoside . . . . . . . . . 66 8.8 X 10 -~ 750

p-nitroph6nyl-~-D-galactoside . . . . . . .

p - n i t r o p h ~ n y l - , ~ -D-rut inos ide . . . . . . . .

29 8,6 X 10 -'~ 337

30 2 , 6 /-< 10 -4 112

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

Page 7: Purification, propriétés et spécificité d'une hétéroglycosidase des graines de sarrasin

Hdtdrog l ycos ida se des g ra in s de sa r ras in . 1311

Les r a p p o r t s Vm/Km, mei l leurs reflets de la sp6cificit6 d 'une enzyme, la issent a p p a r a i t r e une sp6cificit6 h activit6 no tab lement plus 61ev6e pour les g lycos ides s imples et en p a r t i c u l i e r pou r le p -n i t roph6nyl@D-glucos ide .

Nous soul ignerons l 'act ivi t6 ca ta ly t ique remar - quable de l 'hd t6roglycos idase de sa r ras in pour le p-ni t roph6nyl-g-D-glucoside ; la g-glucosidase sp6cifique 61imin6e p a r passage sur h y d r o x y l a p a - t i te et p r6c6demment purifi6e [16] nous pe rme t t an t sur ce po in t des compara i sons .

L 'h6 tdroglycos idase r6v61e une affinit6 pour ce subs t ra t sup6r ieure/~ celle de la ~-glucosidase dont

Un 6ventai l aussi large que poss ib le d'l16t6ro- s ides na ture ls pe rme t de va r i e r darts l.e substrat , aussi b ien la pa r t i e g luc id ique que r a g l y c o n e ( tableau III) .

Hdtdrosides de monosacchar ides : le sa l icos ide et le v ic ios ide sont hydrolys6s .

Hdt~rosides de disaccharides : l ' a t taque de l ' amygda los ide s 'effectue pr6f~rent ie l lement p a r le glucose t e rmina l . On d6c61e du p runasos ide darts le mi l ieu r6ac t ionne l ; celui-ci est ensui te hyd ro - lys6 ainsi que le gent iobiose a p p a r u h l '6tat de t races.

TABLEAU III.

Hdt~rt~sides naturels utilis~s.

Nom commun Aglycone et subs t i tuants osidiques

Salicoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vicios ide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Amygdaloside . . . . . . . . . . . . . . . . Prunasoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . Querc6tol-3-sophoroside . . . . . . . Peltatoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gfoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vicianoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Robinoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rutoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Naeingoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . Hesp6ridoside . . . . . . . . . . . . . . . . . Anthoeyanoside . . . . . . . . . . . . . . . Xanthorhamnoside . . . . . . . . . . . . Catharticoside . . . . . . . . . . . . . . . . H6tdroside de Populns . . . . . . . . .

Salig6nol- a~-D-glucoside Diamino-2,4-oxy-f-pyrimidine-5-~-D- glucoside Mand¢lonitrile-[~-D-glueosyl (1--~-6)] ~-D-glucoside Mand61onitrile-~-D-glucoside Querc6tol-3-[ ~-D-glucosyl (1-~,-2)]-~-D-glucoside Quercfitol-3-[a-L-arabinosyl (1--)-6)]-~-D-glucoside Eug6nol-[a-L-arabinosyl (1--~ 6)l-~-D-glucoside Manddlonitrile-[a-L-arabinosyl (1--~6)] ~-D-glucoside Kempf6rol-3-[a-L-rhamnosyl (1--~-6)] ~-D-galactoside Querc6tol-3-La-L-rhamnosyl (1-~6)] ~'--D-glucoside Naring6nol-7-[a-L-rhamnosyl (1--~2)] ~-D-glucoside Hesp6r6tol-7-[a-L-rhamnosyl (1 --~,- 6)]- ~D-glucoside Cyanidol-3-[ ~-D- xylosyl (1--~.2)]-~-D-g[ucoside-5-~-D-glucoside Rhamn6tol-3-[rhamnosyl (1- ~4 ou 5)]-~-L-rhamnosyl-(1-~.6)-galactoside Rhamnocitrol-4'-[rhamnosyl (1--i~4 ou 5)]-rhamnosyl-(1--~f)-galactoside Kempfdrol-3-[,~-D-glueosyl (1--~,.3)1 [a-L-rhamnosyl-(1--~-2)] ~-D-glueoside

le Km pour le p-ni troph6nyl-f i -D-glucoside fut 6va- l u 6 h 4 X 10 -4M.

L'h6t6roglycosidas,e, b ien que non ent i6rement purifi6e, pr6sente une activi t6 sp6cifique p roche de celle de la ~-glucosidase obtenue h l '6tat homo- gbne. L 'h6 t6rog lycos idase ayan t d ' au t re pa r t un po ids mol6cnla i re double, cela suppose doric pou r cel le-ci une Kcat~e¢-I sup6r ieure h celle de la $-glucosidase sp6cifique pour lc p-ni troph6nyl-8-D- glucoside.

Sp~ci[icitd d' action envers les substrats naturels.

Nous avons 6tudi6 l ' ac t ion de l 'h6 t6roglycos idase de sa r ras in sur d ivers substra ts na ture ls afin de mieux ce rne r sa sp~cificit6.

Le gent iobiose, le lactose .et le v ic ianose sont hydro lys6s ; avec les deux de rn ie r s d i saccha- r ides nous notons l ' a p p a r i t i o n de p rodu i t s de t ransosy la t ion .

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

Le querc6to l -3-sophoros ide est attaqu6 p a r le glucose t e rmina l ; le monoglucos ide du querc6tol est ensui te 6gal.ement hydro lys6 . Les h6t6rosides du v ic ianose : pe l ta tos ide , g6oside et v i c i anos ide sont hydro lys6s avec l ib6ra t ion de glucose et d ' a ra - binose. Nous n 'avons pas d6cel6 de v ic ianose ; c ependan t la p r6sence d 'un p r o d u i t de t ransosyla- t ion de Rf mo ind re que celui du v ic ianose , a insi que l ' a p p a r i t i o n pr6coce de querc6tol dans le cas du pe l ta tos ide , nous inc i ten t h envisager la l ib6ra- t ion dans un p r e m i e r t emps du d i s a c c ha r ide qui sera i t ensui te hydro lys6 . Avec le rob inos ide et le ru tos ide on obt ien t les deux d i s accha r ide s corres- p o n d a n t s : rob inob iose et rut inose .

Nous n 'avons pas d6cel6 de rhamnos ido-g lucose dans les h y d r o l y s a t s du na r ingos ide et de l 'hesp6- r idos ide . La pr6sence d 'une a - rhamnos idase dans la p r6pa ra t i on enzymat ique p e r m e t la l ib6ra t ion des monoglucos ides co r r e spondan t s qui peuven t

Page 8: Purification, propriétés et spécificité d'une hétéroglycosidase des graines de sarrasin

1312 R. Bourbouze, F. Pratviel-Sosa et F. Percheron.

seulement ensui te 6tre h y d r o l y s i s p a r l 'h6t6rogly- cosidase.

Seul le glucose combin6 en pos i t ion 5 de l 'agly- cone d 'un an thocyanos ide est lib6r6.

Hdtdrosides de trisaccharides : le x a n t h o r h a m - nos ide [21] est hydro lys6 avec l ib6ra t ion du tr i - sacchar ide , p a r cont re le cathart i .coside [21] n 'es t pas attaqu6.

Avec le t~empf6rol -3-rhamnodiglucoside de Populus 6galement, l ' a t taque p r imi t i ve p a r l ' . , - rhamnos idase p e r m e t la l ib6ra t ion du glucose devenu t e rmina l p a r l 'h6 t6roglycos idase ; nous n ' avons pas d6cel6 de t races de l amina r ib iose ni d ' ag lycone .

L ' ana lyse de ces r6sultats expdr imen taux d6mont re le manque de spbcificit6 de l'h6t6r.o- glycos4dase envers l ' ag lycone des substra ts uti l i- s6s ; elle l ib~re les glucoses ]i6s h une aglycone ph6nol ique, f lavonique et an thocyan ique (pyr imi - dique m6me dans le cas du v ic ios ide) . L 'a t taque c~es o l igasaccha r ides li6s h une aglycone s 'effectue pr6f6rentiel l .ement p a r la l ib6ra t ion successive, p a r t i r de l 'extr6mit6 non r6duct r ice , des r6s idus de glucose. Nous n 'avons not6 la l ib6ra t ion d 'un ho los ide que dans ie cas d 'un r ad i ca l ~-D-glucosyl ou ~-D-galactosyl substi tu6 en pos i t ion 6, celui-ci devant 6tre imp6ra t ivemen t ti6 en pos i t ion 3 su r l ' ag lycone dans le cas des f lavonosides. La charge nette pos i t ive por t6e p a r l 'h6 t6rocycle des agly- cones an thocyan iques emp6che route at taque des subs t i tuan ts en 3 de ce noyau.

Le Dizet avai t s ignal6 l ' hyd ro ly se d 'un a m y t o i d e p a r l ' ex t r a i t enzymat ique de sar ras in . L ' amy lo ide de capuc ine est d6polym6ris6 avec l ib6ra t ion d 'ol i - gasacchar ides , de galactose et d 'un d i s accha r ide ; l 'a-D-xylosyl 1 - - - > 6 D-glucose [22].

Nous avons voulu v6rif ier si la f r ac t ion h act ivi t6 h6 t6roglycos idas ique la plus purif i6e man i fes ta i t des propr i6 t6s hyd ro ly t i ques enwers ce po lysaccha - r i4e.

La f rac t ion purif i6e sur Indub iose AcA 4/4 l ib~re un iquement du D-xylosyl-D-glucose ; nous avons 6galement mis en 6vidence sa l ib6ra t ion h p a r t i r des amylo~des de ba l samine et de t amar in . La l ib6ra t ion de ce d i s accha r ide sans d6polym6ri - sa t ion des amyloides , nous inc i te h envisager en fonc t ion des s t ruc tures p ropos6es [23, 24] une a t taque s61ective, p a r l 'h6t6roglycosidase , des uni- t6s de glucose t e rmina les subst i tu6es p a r un rad i - cal a-D-xylosyl.

DISCUSSION.

Un type p a r t i c u l i e r d 'ac t iv i t6 g lycos idas ique s ' exer~ant sur des h6t6roglycosid,es complexes avec

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

l ib6ra t ion d 'un d i s a c e ha r ide avai t 6t6 d6cel6 d~s 1926 p a r Br ide l e t Charaux chez d ivers Rhamnus, puts u l t6 r ieurement chez d ' au t res espbces v6g6tales et diff6rentes vari6t6s d'Aspergillus.

Nous avons mis en 6vidence une act ivi t6 h6t6ro- g lycos idas ique dans les g ra ines germ6es de sar- ras in , et ckerch6 h ob ten i r une p r6pa ra t i on hau- tement purif i6e afin de l ' iden t i f i e r et de p r6c i se r ses propr i6 t6s ca ta ly t iques .

Les diff6rentes 6tapes de la pur i f i ca t ion ont per- mis d ' i so le r la p ro t6 ine .enzymatique responsab le de l ' h y d r o l y s e du p-ni t roph6nyl-~-D-rut inos ide a ins i que de d ivers h6t6ros ides na ture ls avee lib6- ra t ion poss ib le d 'un ho los ide ; cel le-ci est b ien dis- t inc te des aut res g lycos idases 6galement pr6sentes dans les g ra ines germ6es .de sar ras in .

La d6na tura t ion the rmique de la f rac t ion la plus purif i6e met en 6vidence son act ivi t6 h y d r o - ly t ique 6galement envers les ~l-glucosides et i~l-galac- tosides.

La not ion d 'h6 t6rog lycos idase est beaucoup t rop res t r i c t ive p o u r ce type d ' enzyme qui se compor te comme une g lycos idase tr~s peu sp6ci~que, tant en ce qui concerne l ' ag lycone que la pa r t i e gluci- d ique des subs t ra ts na ture ls ou synth6t iques ; elle hy4 ro lyse les l ia isons holos id iques et h6t6rosi- diques engagean t un r ad i ca l isostbre du ~-D-glu- cose en C1, C. 2 et C a (~-D-glucosyl ; ~-D-galactosyl ; t t-L-arabinosyl). Elle s 'oppose ainsi ne t tement aux ~-glucosidases et ~-galactos idases rencont r6es au cours de la pur i f ica t ion , et dont les sp6cificit6s sont trbs r es t r i c t ives envers l.es l ia i sons engageant res- pec t ivement un r a d i c a l ~-D-glucosyl OU ~-D-galac- tosyl.

N6anmoins la propr i6 t6 la plus r emarquab l e de cette h6t6roglycos idase r6s ide dans les d imens ions de son site ca ta lyt ique, lui p.ermettant d ' a c c e p t e r 6ventuel lement un d i s a c c ha r ide et m6me un tr i - s accha r ide dans le cas d 'oses substi tu6s en pos i t ion 6 ; notons que dans le cas des f lavonosides, celui-ci dol t 6tre imp6ra t ivemen t li6 en pos i t ion 3 sur l ' ag lycone . Lorsque cette subs t i tu t ion c o r r e s p o n d h une l ia i son os id ique non h y d r o l y s a b l e p a r l 'h6t6- rog lycos idase (a-L-rhamnosyl , c¢-D-xylosyl), la lib6- ra t ion d 'un ho los ide est d6celable dans le mi l ieu r6act ionnel . L ' ex tens ion de l ' ac t iv i t6 enzymat ique de l 'h6 t6roglycos idase de sa r ras in des f lavonosides aux amylo ides , pe rme t d ' env i sager son usage pos- sibl.e dans la d6 te rmina t ion de la s6quence et de la conf igura t ion anom6r ique des s t ruc tures oligo- sacchar id iques .

Aucune fonc t ion phy tob io log ique d6finie ne nous pa ra i t pouvo i r 6tre a t t r ibu6e d 'une fa~on cer- ta ine h cette ,enzyme. Ce type de g lycos idase

Page 9: Purification, propriétés et spécificité d'une hétéroglycosidase des graines de sarrasin

Hdtdroglycosidase des

semble cependan t tr~s r6pandu chez les v6g6taux sup6r ieurs , en corr61ation avec la large d i s t r ibu- t ion des f lavonosides ; i l est in t6ressant de noter q u e s i l ' i s o e n z y m e A de la ~ - g l u c o s i d a s e d ' a m a n d e pu r i f i 6e p a r L a l 6 g e r i e est i n a c t i v e e n v e r s le p- n i t r o p h 6 n y l ~ - D - r u t i n o s i d e [25], n o u s a v o n s c o n s - ta t6 q u e ce lu i - c i ~ t a i t h y d r o l y s 6 p a r les p r o t 6 i n e s r e l a r g u 6 e s h 40-80 p. c e n t de s a t u r a t i o n , c o r r e s - p o n d a n t e n g r o s ~t l ' a n c i e n n e 6 m u l s i n e .

R e m a r q u o n s t o u t e f o i s que l ' i m p o r t a n c e p o n d 6 - r a t e de ce t y p e d ' e n z y m e es t m i n i m e , e x p l i q u a n t q u e ce m o d e d'a, c t i o n e n z y m a t i q u e r e s t e d i s c r e t e n c o m p a r a i s o n des a u t r e s a c t i v i t 6 s g l y c o s i d a s i q u e s ( l ' h 6 t 6 r o g l y c o s i d a s e de s a r r a s i n n e r e p r 6 s e n t e env i - r o n que 1 p. m i l l e d e s p r o t 6 i n e s e x t r a i t e s s o l u b l e s

p H 5, e t cec i au s t a d e de g e r m i n a t i o n h ac t i v i t 6 m a x i m a l e ; l a ~ - g l u c o s i d a s e sp6c i f i que 6 I imin6e p a r p a s s a g e s u r h y d r o x y l a p a t i t e e n r e p r 6 s e n t a n t 2 p. c e n t ) .

E n f i n l ' h 6 t 6 r o g l y c o s i d a s e de s a r r a s i n m a n i f e s t e sa sp6c i f i c i t6 p a r t i c u l i b r e p o u r les s u b s t r a t s d o n t la p a r t i e g l u c i d i q u e c o m p o r t e l ' e n c h a i n e m e n t r h a m n o s i d o - g l u c o s e , x y l o s i d o - g l u c o s e e t r h a m n o - s i d o - g a l a c t o s e . Cet te sp6c i f i c i t6 assez r e s t r i c t i v e e s t /~ r a p p r o c h e r d u fa i r que le r u t o s i d e est le seu l f l a v o n o s i d e p r 6 s e n t d a n s les g r a i n e s n o n g e r m 6 e s de s a r r a s i n et u l t 6 r i e u r e m e n t ~ t o u s l e s s t a d e s de la g e r m i n a t i o n [26].

Remerciemen ts.

Nous adressons tous nos remere iements h Mon- sieur Ie Professeur J. E. Courtois pour l ' int~r~t qu ' i l a port6 h e e t ravai l .

Nous remercions vivemen,t M. le Professeur R. Par is pour ses 6ehant i l lons de x a n t h o r h a m n o s i d e et de eathar t ieoside, M. le Professeur P. Lebreton pour son dehant i l lon de pel ta tos ide et M. le Professeur L. Bir- koffer pour son ~ehant i l lon d 'an thoeyanos ide .

Nous remere ions 6galement tr~s v ivement M. F. Bau- m a n n pour l '61eetrofoealisation.

R~SUM~.

Nous avons isol6 et purifi6 envi ron 1 000 fois une h~t6roglycosidase h p a r t i r des graines germ6es de sarrasin . Ce type par t ieu l ie r de glycosidase (ancien- nemen t << rhamnod i a s t a s e >>) hydro lyse cer ta ins h6t6- roside.s na tu re l s tel le ru tos ide en ru t inose ((t-L-rham- nosyl 1 ~ 6 glucose) et quere6tol ; aussi l 'aet ivi t6 enzymat ique a-t-elle 6t6 suivie avec le p -n i t roph~nyl - [~-D-rutinoside eomme subst ra t .

La purif icat ion comprend les dtapes suivantes : extract ion, relar~age pa r le sul fa te d ' am m on i um , ehro- matog~aphies sur hydroxylapa t i t e , DEAE-Sephadex A50 et acry lamide-agarose AeA 4/4. Bien que par t ie l - l ement purifide, 1'enzyme hydro lysan t le p -n i t roph6nyl - ~-n-rut inos ide es~t h ien individual is~e des au t res gly-

grains de sarrasin. 1313

cosidases ; en par t i cu l ie r les diff6rentes 6tapes ehroma- tographiques et la d~na tu ra t ion t he rmique me t t en t en ~videnee son identi t~ propre vis-h-vis des [3-glucosi- dases et (J-galaetosidases 6galement pr~sentes dans les gra ines germbes de sarras in . Le poids mol6eulaire de cette h6t6roglycosidase, est im6 pa r ~lectrophor~se sur gel de po lyacry lamide est d ' env i ron 85 000. Le poin t iso~lectrique est de 3,7.

L'h~t6roglycosidase r~v~le une large sp6cifieit~ ; elle hydrolyse les liaison's holos idiques et h6t6rosidiques isost~res du ~-n-glueose en C~, Ca et C~. Le Km h pH 5 est de 2,6 × 10-4 M pour le p -n i t roph~nyl -~-n- ru t ino- side ; 8,8 × 10-5 M pour le p-ni t roph~nyl-9-n-glucos ide et de 8,6 × 10-5 M pour le p-ni t roph6nyl-~-D-galaeto- side.

L'aetivit6 enzymat ique de l 'h~t6roglyeosidase de sa r ras in est t rbs ~tendue ; elle hydro lyse des disaeeha- rides, des h6t~roglyeosides complexes et des amyloides.

Aucune fonet ion bien d6finie n 'a encore pu ~tre a t t r i - bu te h ce type d 'enzyme.

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